JP2022512706A - 眼科におけるＡｋｔ阻害剤の使用 - Google Patents

眼科におけるＡｋｔ阻害剤の使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、眼血管疾患、特に加齢性黄斑変性症の処置のためのＡｋｔ阻害剤の使用を提供する。

Description

本発明は、眼血管疾患、特に加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）の処置のためのＡｋｔ阻害剤の使用に関する。
加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）は、視力（ＶＡ）の最も高い領域である黄斑を攻撃する進行性の変性黄斑疾患であり、６０歳以上のアメリカ人の失明の主な原因である（ＮＩＨ Ｍｅｄｌｉｎｅ Ｐｌｕｓ（２００８），Ｌｅａｄｉｎｇ ｃａｕｓｅ ｏｆ ｂｌｉｎｄｎｅｓｓ，ＮＩＨ Ｍｅｄｌｉｎｅ Ｐｌｕｓ ３（２）１４－１５．ｗｗｗ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｅｄｌｉｎｅｐｌｕｓ／ｍａｇａｚｉｎｅ／ ｉｓｓｕｅｓ／ ｓｕｍｍｅｒ０８／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ｓｕｍｍｅｒ０８ｐｇｌ４－１５．ｈｔｍｌ）。血管新生を伴う「滲出（ｗｅｔ）」型の疾患（ｎＡＭＤまたは滲出型ＡＭＤ）は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）を含む血管および細胞の増殖を特徴とする脈絡膜血管新生を特徴とする（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ（２００５）Ｎａｔｕｒｅ ４３８：９３２－９３６）。最終的に、光受容体の死と瘢痕形成により、中心視力の深刻な喪失と、顔または運転の読み取り、書き込み、および認識の不能がもたらされる。多くの患者は、もはや有給の雇用を維持できず、日常生活を営むことができず、その結果、生活の質の低下を報告している（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ａｎｄ Ｂｒａｄｌｅｙ（２００６），Ｈｅａｌｔｈ Ｑｕａｌ Ｌｉｆｅ Ｏｕｔｃｏｍｅｓ ４：９７）。予防療法はほとんど効果を示さず、治療戦略は主に血管新生病変の処置に焦点を合わせてきた。
滲出型ＡＭＤの現在利用可能な処置には、レーザー光凝固、ベルテポルフィンによる光線力学療法、およびペガプタニブ、ラニビズマブ、ベバシズマブ、またはアフリベルセプトなどの血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤の硝子体内（ＩＶＴ）注射が含まれる（Ｓｃｈｍｉｄｔ－Ｅｒｆｕｒｔｈ，（２０１４）Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒ ａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｒｅｔｉｎａ Ｓｐｅｃｉａｌｉｓｔｓ（ＥＵＲＥＴＩＮＡ）Ｂｒ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ９８：１１４４－１１６７）。これらの治療法は、最良矯正視力（ＢＣＶＡ）に対していくらかの効果があるが、その効果は視力の回復と持続時間に制限があり得る（Ｓｃｈｍｉｄｔ－Ｅｒｆｕｒｔｈ、上記引用、２０１４年、ＡＡＯ ＰＰＰ（２０１５）Ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｐａｔｔｅｒｎｓ：Ａｇｅ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｍａｃｕｌａｒ Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ）。
滲出型ＡＭＤの処置に使用される市場に出回っているいくつかの薬剤は、ＶＥＧＦを阻害するメカニズムに依存しており、硝子体内注射する必要がある。これらの処置は、疾患の進行を防ぐことに成功したと報告されているが、頻繁に薬剤を注射する必要がある。
ＡＫＴは、マウス白血病ウイルスの癌遺伝子として同定されたセリン－スレオニンキナーゼであり、その活性が細胞増殖、生存、代謝、転移、および浸潤などのさまざまな機能に重要であることが明らかになっている（Ｃｅｌｌ，１２９，ｐ．１２６１－１２７４（２００７）；Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ．７．ｐ．２９９１－２９９６（２００８））。ヒトでは、３つのアイソフォーム（ＡＫＴ１／ＰＫＢα、ＡＫＴ２／ＰＫＢβ、およびＡＫＴ３／ＰＫＢγ）が報告されている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４．ｐ．５０３４－５０３７（１９８７）；Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７４．ｐ．９１３３－９１３６（１９９９））。ＡＫＴの活性化には、ＰＩ３キナーゼによって生成されたホスファチジルイノシトール３－リン酸への結合による原形質膜への局在化、および複数のキナーゼによるリン酸化が含まれる（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ．５４６．ｐ．１０８－１１２（２００３））。多くの癌（例えば、乳癌、膵臓癌、肝臓癌、前立腺癌、胃癌、肺癌、卵巣癌、頭頸部癌、尿路癌、および子宮内膜癌）において、活性化されたＡＫＴの発現は、変異などによるＰＩ３キナーゼの活性化、またはその負の調節因子であるＰＴＥＮの不活性化によって増強されることが報告されている（Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，８，ｐ．６２７－６４４（２００９））。さらに、活性化されたＡＫＴの発現の増強は、さまざまな癌（例えば、乳癌、膵臓癌、肝臓癌、前立腺癌、胃癌、および子宮内膜癌）の予後不良と関連していることが報告されている（Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８，ｐ．８６１－８７４（２００７））。
本発明において、Ａｋｔ阻害剤は、核酸レベルおよび／またはタンパク質レベルでＡＫＴの発現および／または活性を阻害することができる分子を指す。当技術分野で利用可能なＡｋｔ阻害剤を本発明で使用することができる。例えば、適切な小分子Ａｋｔ阻害剤は、欧州特許第２６９８３７２号明細書、米国特許出願公開第２００７０１８５１５２号明細書、米国特許出願公開第２００８０２５５１４３号明細書、米国特許出願公開第２００８０２６９１３１号明細書、米国特許出願公開第２００９０２２７６１６号明細書、米国特許出願公開第２０１０００５６５２３号明細書、米国特許出願公開第２０１００１３７３３８号明細書、米国特許出願公開第２０１１００５３９７２号明細書、米国特許出願公開第２０１１００７１１８２号明細書、国際公開第２００５０４６６７８号パンフレット、国際公開第２００６１１３８３７号パンフレット、国際公開第２００７０７６３２０号パンフレット、国際公開第２００７０７６４２３号パンフレット、国際公開第２００８１２１６８５号パンフレット、国際公開第２００９０３２６５１号パンフレット、国際公開第２００９０３２６５２号パンフレット、国際公開第２００９０３２６５３号パンフレット、国際公開第２００９１５８３７１号パンフレット、国際公開第２００９１５８３７２号パンフレット、国際公開第２００９１５８３７３号パンフレット、国際公開第２００９１５８３７４号パンフレット、国際公開第２００９１５８３７６号パンフレット、国際公開第２０１００１９６３７号パンフレットおよびＧｅｏｒｇｅ Ｍｉｈａｉ Ｎｉｔｕｌｅｓｃｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ４８：８６９－８８５，２０１６に開示されている。
または、Ａｋｔ阻害剤はｍＲＮＡ干渉ＲＮＡ分子であり得、または、Ａｋｔタンパク質のアンタゴニスト、例えば、リガンド、アプタマーまたは抗体であり得る。一実施形態では、Ａｋｔ阻害剤は、Ａｋｔタンパク質に対する抗体である。別の実施形態では、Ａｋｔ阻害剤は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、例えば、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。二本鎖ＲＮＡは、限定するものではないが、ｍＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、およびｔＲＮＡを含む任意のタイプのＲＮＡであり得る。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、特定のＲＮＡおよび／またはタンパク質の産生を特異的に阻害するのに特に有用である。本発明に適したｄｓＲＮＡ分子の設計および製造は当業者の技術の範囲内であり、特にＷａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８），Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（２０００）、国際公開第９９／３２６１９号パンフレット、国際公開第９９／５３０５０，国際公開第９９／４９０２９号パンフレット、および国際公開第０１／３４８１５号パンフレットを参照されたい。好ましくは、ｓｉＲＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡと同一の約１９～２３の連続したヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を含む。「ｓｈＲＮＡ」という用語は、約５０ヌクレオチド未満が同じＲＮＡ分子上の相補配列と対になり、その配列および相補配列が、（２つの塩基相補領域によって生成されるステム構造上で一本鎖ループを形成する）少なくとも約４～１５ヌクレオチドの対になっていない領域によって分離されているｓｉＲＮＡ分子を指す。十分に確立されたｓｉＲＮＡ設計基準がある（例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，２００１を参照されたい）。
本発明のさらなる態様において、Ａｋｔ阻害剤は、標的核酸、特に標的核酸上の隣接配列にハイブリダイズすることによって標的遺伝子の発現を調節することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは本質的に二本鎖ではなく、したがってｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡではない。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは一本鎖である。本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの完全長にわたって内部（ｉｎｔｒａ）または相互（ｉｎｔｅｒ）の自己相補性の程度が５０％未満である限り、ヘアピンまたは分子間二重鎖構造（同じオリゴヌクレオチドの２分子間の二重鎖）を形成できることが理解されよう。
本発明の一実施形態では、Ａｋｔ阻害剤は、Ａｋｔ２選択的または特異的阻害剤である。本発明では、阻害剤に使用される場合、「選択的」および「特異的」という用語は交換可能に使用することができ、阻害剤が標的に対してのみ阻害効果を有するか、または他の化合物または分子に対するよりも標的に対して例えば、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、５００、１０００、１００００倍高い阻害効果を有することを意味する。例えば、ＣＣＴ１２８９３０（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）は、効果的なＡＴＰ競合選択的Ａｋｔ２阻害剤であり、無細胞アッセイで６ ｎＭのＩＣＳＯ値を有し、密接に関連するＰＫＡキナーゼよりもＡｋｔ２に対して２８倍高い選択性を示す。
「眼血管疾患」および「血管眼疾患」という用語は、本明細書で交換可能に使用され、限定するものではないが、眼内新生血管症候群、例えば、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、未熟児網膜症、新生血管緑内障、網膜静脈閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、黄斑変性症、加齢性黄斑変性症、網膜色素変性症、網膜血管腫増殖、黄斑部毛細血管拡張症（ｍａｃｕｌａｒ ｔｅｌａｎｇｅｃｔａｓｉａ）、虚血性網膜症、虹彩血管新生、眼内血管新生、角膜血管新生、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、および網膜変性を含む。（Ｇａｒｎｅｒ，Ａ．，Ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｉｎ：Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｏｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅ，Ａ ｄｙｎａｍｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｇａｒｎｅｒ，Ａ．，ａｎｄ Ｋｌｉｎｔｗｏｒｔｈ，Ｇ．Ｋ．，（ｅｄｓ．），２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４），ｐｐ．１６２５－１７１０）。本明細書で使用される場合、眼血管障害は、網膜または角膜などの眼組織構造への、新しい血管の変化した、または無秩序な増殖および浸潤を特徴とする任意の病的状態を指す。一実施形態では、眼血管疾患は、滲出型加齢性黄斑変性症（滲出型ＡＭＤ）、萎縮型加齢性黄斑変性症（萎縮型ＡＭＤ）、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、嚢胞様黄斑浮腫（ＣＭＥ）、非増殖性糖尿病性網膜症（ＮＰＤＲ）、増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）、嚢胞様黄斑浮腫、血管炎（例えば、網膜中心静脈閉塞症）、視神経乳頭浮腫、網膜炎、結膜炎、ブドウ膜炎、脈絡膜炎、多病巣性脈絡膜炎、眼ヒストプラズマ症、眼瞼炎、ドライアイ（シェーグレン病）、ならびに眼の疾患または障害が眼の血管新生、血管漏出、および／または網膜浮腫に関連する他の眼疾患からなる群から選択される。したがって、本発明によるＡｋｔ阻害剤は、滲出型ＡＭＤ、萎縮型ＡＭＤ、ＣＭＥ、ＤＭＥ、ＮＰＤＲ、ＰＤＲ、眼瞼炎、ドライアイおよびブドウ膜炎の予防および処置に有用であり、さらに好ましくは滲出型ＡＭＤ、萎縮型ＡＭＤ、眼瞼炎およびドライアイ、さらに好ましくは、ＣＭＥ、ＤＭＥ、ＮＰＤＲおよびＰＤＲ、さらに好ましくは眼瞼炎およびドライアイ、特に滲出型ＡＭＤおよび萎縮型ＡＭＤ、さらに詳細には滲出型ＡＭＤの予防および処置に有用である。いくつかの実施形態では、眼疾患は、滲出型加齢性黄斑変性症（滲出型ＡＭＤ）、黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、および糖尿病性網膜症からなる群から選択される。
角膜血管新生に関連する他の疾患には、限定するものではないが、流行性角結膜炎、ビタミンＡ欠乏症、コンタクトレンズオーバーウェア、アトピー性角膜炎、上輪部角膜炎、翼状片、乾性角膜炎、シェーグレン症候群、酒さ性ざ瘡（ａｃｎｅ ｒｏｓａｃｅａ）、フリクテン症（ｐｈｙｌｅｃｔｅｎｕｌｏｓｉｓ）、梅毒、マイクバクテリア感染症、脂肪変性症、化学的火傷、細菌性潰瘍、真菌性潰瘍、単純ヘルペス感染症、帯状疱疹感染症、原虫感染症、カポシ肉腫、モーレン潰瘍、テリエン周辺角膜変性、周辺角質溶解、リウマチ性関節炎、全身性紅斑、多発性動脈炎、外傷、ウェゲナーサルコイドーシス、強膜炎、スティーブンジョンソン病、類天疱瘡、角膜放射状切開、および角膜移植後拒絶反応が含まれる。
網膜／脈絡膜血管新生に関連する疾患には、限定するものではないが、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、鎌状細胞貧血、サルコイド、梅毒、弾性線維性仮性黄色腫、パジェット病、静脈閉塞、動脈閉塞、頸動脈閉塞性疾患、慢性ブドウ膜炎／硝子体炎、マイコバクテリア感染症、ライム病、全身性紅斑性狼瘡、未熟網膜症、網膜色素変性症、網膜浮腫（黄斑浮腫を含む）、イールズ病、ベーチェット病、網膜炎または脈絡膜炎を引き起こす感染症、推定眼ヒストプラズマ症、ベスト病、近視、眼陥凹、シュタルガルト病、周辺部ブドウ膜炎、慢性網膜剥離、過粘稠度症候群、トキソプラズマ症、外傷およびレーザー後の合併症が含まれる。他の疾患には、限定するものではないが、虹彩ルベオーシス（隅角の血管新生）に関連する疾患、およびあらゆる形態の増殖性硝子体網膜症を含む線維血管または線維組織の異常増殖によって引き起こされる疾患が含まれる。
未熟児網膜症（ＲＯＰ）は、未熟児を冒す目の疾患である。これは、網膜血管の無秩序な成長によって引き起こされ、瘢痕化および網膜剥離を引き起こす可能性があると考えられている。ＲＯＰは軽度で自然に解消する場合があるが、深刻な場合は失明につながる可能性がある。そのため、すべての未熟児はＲＯＰのリスクがあり、出生体重が非常に低いことが追加の危険因子である。酸素毒性および相対的な低酸素症の両方がＲＯＰの発症に寄与する可能性がある。
黄斑変性症は、主に高齢者に見られる病状であり、網膜の黄斑領域として知られる眼の内層の中心が薄くなり、萎縮し、場合によっては出血する。これにより、中心視力が失われる可能性があり、詳細を確認したり、顔を読み取ったり、認識したりすることができなくなる。米国眼科学会によると、これは、５０歳以上の人々にとって、今日の米国における中心視力喪失（失明）の主な原因である。若い人を冒す黄斑ジストロフィーの一部には黄斑変性症と呼ばれることもあるが、この用語は一般に加齢性黄斑変性症（ＡＭＤまたはＡＲＭＤ）を指す。
加齢性黄斑変性症は、黄斑（中心窩と呼ばれる、詳細な中心視力を提供する網膜の中心領域）における網膜色素上皮とその下にある脈絡膜の間への、ドルーゼンと呼ばれる特徴的な黄色の沈着物から始まる。これらの初期の変化（加齢性黄斑症と呼ばれる）を有するほとんどの人は、視力が良好である。ドルーゼンを有する人は、進行性ＡＭＤを発症し続ける可能性がある。ドルーゼンが大きくて数が多く、黄斑の下の色素細胞層の障害に関連している場合、リスクはかなり高くなる。大きくて柔らかいドルーゼンはコレステロール沈着の上昇に関連しており、コレステロール低下剤またはレオ手技（Ｒｈｅｏ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）に応答する場合がある。
重度の視力喪失の原因となる進行性ＡＭＤには、滲出型と萎縮型の２つの形態がある。進行性ＡＭＤの萎縮型である中心地図状萎縮は、網膜下の網膜色素上皮層への萎縮に起因し、眼の中心部分の光受容体（桿体および錐体）の喪失による視力喪失を引き起こす。この状態に利用可能な処置はないが、高用量の抗酸化物質であるルテインとゼアキサンチンを含むビタミンサプリメントは、国立眼病研究所などによって、萎縮型黄斑変性症の進行を遅らせ、一部の患者では視力を改善することが実証されている。
網膜色素変性症（ＲＰ）は、遺伝的な眼状態のグループである。ＲＰの症状の進行において、夜盲症が、一般に視野狭窄症（ｔｕｎｎｅｌ ｖｉｓｉｏｎ）に数年または数十年先行して起こる。ＲＰを患う多くの人々は、４０代または５０代になるまで法的に盲目にならず、生涯にわたって一部の視力を維持する。他の人々は、症例によっては幼少期に、ＲＰから完全に盲目に進行する。ＲＰの進行はそれぞれの症例によって異なる。ＲＰは、遺伝性網膜ジストロフィーの一種であり、光受容体（桿体および錐体）または網膜の網膜色素上皮（ＲＰＥ）の異常が進行性の視覚喪失を引き起こす遺伝的障害のグループである。罹患した個人は、最初に暗順応の不良または鳥目（夜盲症）を経験し、続いて周辺視野の減少（視野狭窄症として公知）、そして時には、疾患の経過の後半に中心視力の喪失を経験する。
黄斑浮腫は、網膜の黄色い中心領域である眼の黄斑の上または下に体液やタンパク質の沈着物がたまり、黄斑が肥厚してむくんだときに発生する。黄斑は眼球の後ろの網膜の中心近くにあるため、むくみは人の中心視力を歪める可能性がある。この領域は、人が直接視線にある形、色、および詳細を見ることができるように、鋭くて明確な中心視力を提供する密集した錐体を保持している。嚢胞様黄斑浮腫は、嚢胞形成を含む黄斑浮腫の一種である。
併用療法：特定の実施形態では、本発明によるＡｋｔ阻害剤または医薬組成物は、本明細書に記載の１種以上の眼血管疾患の処置のために単独で（追加の治療薬なしで）投与される。
他の実施形態では、本発明によるＡｋｔ阻害剤または医薬組成物は、本明細書に記載の１種以上の眼血管疾患の処置のための、１種以上の追加の治療薬または方法と組み合わせて投与される。
他の実施形態では、本発明によるＡｋｔ阻害剤または医薬組成物は、１種以上の追加の治療薬と組み合わせて製剤化され、本明細書に記載の１種以上の眼血管疾患の処置のために投与される。
特定の実施形態では、本明細書で提供される併用処置は、本発明によるＡｋｔ阻害剤または医薬組成物の投与が、本明細書に記載の１種以上の眼血管疾患の処置のための１種以上の追加の治療薬と連続して投与されることを含む。
追加の治療薬には、限定するものではないが、トリプトファニル－ｔＲＮＡシンテターゼ（ＴｒｐＲＳ）、Ｅｙｅ００１（抗ＶＥＧＦペグ化アプタマー）、スクアラミン、ＲＥＴＡＡＮＥ（商標）（デポー懸濁液用の酢酸アネコルタブ；Ａｌｃｏｎ、Ｉｎｃ．）、コンブレタスタチンＡ４プロドラッグ（ＣＡ４Ｐ）、ＭＡＣＵＧＥＮ（商標）、ＭＩＦＥＰＲＥＸ（商標）（ミフェプリストン－ｒｕ４８６）、サブテノントリアムシノロンアセトニド、硝子体内結晶性トリアムシノロンアセトニド、プリノマスタット（ＡＧ３３４０－合成マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤、Ｐｆｉｚｅｒ）、フルオシノロンアセトニド（フルオシノロン眼内レンズ、Ｂａｕｓｃｈ＆Ｌｏｍｂ／Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓを含む）、ＶＥＧＦＲ阻害剤（Ｓｕｇｅｎ）、ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ／Ａｖｅｎｔｉｓ）、４－（４－ブロモ－２－フルオロアニリノ）－６－メトキシ－７－（ｌ－メチルピペリジン－４－イルメトキシ）キナゾリン（ＺＤ６４７４）、４－（４－フルオロ－２－メチルインドール－５－イルオキシ）－６－メトキシ－７－（３－ピロリジン－１－イルプロポキシ）キナゾリン（ＡＺＤ２１７１）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７）およびＳＵ１ １２４８（スニチニブ）などのＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害剤、リノミド、ならびにインテグリンｖβ３機能の阻害剤およびアンギオスタチンが含まれる。
本発明により投与されるＡｋｔ阻害剤または医薬組成物と組み合わせて使用することができる他の医薬療法には、限定するものではないが、非熱レーザーとともに使用するビスダイン（商標）、ＰＫＣ ４１２、Ｅｎｄｏｖｉｏｎ（ＮｅｕｒｏＳｒｕｃｅ Ａ／Ｓ）、グリア由来神経栄養因子および繊毛様神経栄養因子などの神経栄養因子、ジアタゼム、ドルゾラミド、フォトトロプ（Ｐｈｏｔｏｔｒｏｐ）、９－シス－レチナール、ヨウ化ホスホリンまたはエコーチオフェートまたは炭酸アンヒドラーゼ阻害剤を含む眼薬（エコー療法を含む）、ＡＥ－９４１（ＡＥｔｅｒｎａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、Ｓｉｒｎａ－０２７（Ｓｉｍａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｉｎｃ．）、ペガプタニブ（ＮｅＸｓｔａｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ／Ｇｉｌｅａｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ニューロトロフィン（例としてのみ、ＮＴ－４／５、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈを含む）、Ｃａｎｄ５（Ａｃｕｉｔｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＩＮＳ－３７２１７（Ｉｎｓｐｉｒｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、インテグリン拮抗薬（Ｊｅｒｉｎｉ ＡＧおよびＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからのものを含む）、ＥＧ－３３０６（Ａｒｋ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｌｔｄ．）、ＢＤＭ－Ｅ（ＢｉｏＤｉｅｍ Ｌｔｄ．）、サリドマイド（例えば、ＥｎｔｒｅＭｅｄ、Ｉｎｃ．により使用される）、カルジオトロフィン－１（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、２－メトキシエストラジオール（Ａｌｌｅｒｇａｎ／Ｏｃｕｌｅｘ）、ＤＬ－８２３４（Ｔｏｒａｙ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、ＮＴＣ－２００（Ｎｅｕｒｏｔｅｃｈ）、テトラチオモリブデート（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｃｈｉｇａｎ）、ＬＹＮ－００２（Ｌｙｎｋｅｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、微細藻類化合物（Ａｑｕａｓｅａｒｃｈ／Ａｌｂａｎｙ、Ｍｅｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、Ｄ－９１２０（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ Ｇｒｏｕｐ ｐｉｃ）、ＡＴＸ－Ｓ１０（Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ）、ＴＧＦ－ベータ２（Ｇｅｎｚｙｍｅ／Ｃｅｌｔｒｉｘ）、チロシンキナーゼ阻害剤（Ａｌｌｅｒｇａｎ、ＳＵＧＥＮ、Ｐｆｉｚｅｒ）、ＮＸ－２７８－Ｌ（ＮｅＸｓｔａｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ／Ｇｉｌｅａｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｏｐｔ－２４（ＯＰＴＩＳ Ｆｒａｎｃｅ ＳＡ）、網膜細胞神経節神経保護剤（Ｃｏｇｅｎｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｎ－ニトロピラゾール誘導体（Ｔｅｘａｓ Ａ＆Ｍ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｙｓｔｅｍ）、ＫＰ－１０２（Ｋｒｅｎｉｔｓｋｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、シクロスポリンＡ、Ｔｉｍｉｔｅｄ ｒｅｔｉｎａｌ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ」、光力学的療法（例としてのみ、受容体標的化ＰＤＴ、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ，Ｃｏ．；ＰＤＴを注射するためのポルフィマーナトリウム；ベルテポルフィン、ＱＬＴ Ｉｎｃ．；ロスタポルフィンおよびＰＤＴ、Ｍｉｒａｖｅｎｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；タラポルフィンナトリウムおよびＰＤＴ、日本石油；モテキサチンルテチウム、Ｐｈａｒｍａｃｙｃｌｉｃｓ，Ｉｎｃ．を含む）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（例として、Ｎｏｖａｇａｌｉ Ｐｈａｒｍａ ＳＡによって試験された製品およびＩＳＩＳ－１３６５０、Ｉｓｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓを含む）、レーザー光凝固、ドルーセンレーザー療法、黄斑円孔手術、黄斑移動手術、埋め込み型ミニチュア望遠鏡、ファイモーション血管造影（マイクロレーザー療法およびフィーダー血管処置としても知られる）、プロトンビーム療法、微小刺激療法、網膜剥離および硝子体手術、強膜バックル、黄斑下手術、経瞳孔熱療法、光化学系Ｉ療法、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の使用、体外レオフェレーシス（膜示差濾過およびレオセラピーとしても知られる）、マイクロチップ移植、幹細胞療法、遺伝子置換療法、リボザイム遺伝子療法（低酸素応答要素の遺伝子療法、Ｏｘｆｏｒｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ；Ｌｅｎｔｉｐａｋ、Ｇｅｎｅｔｉｘ；ＰＤＥＦ遺伝子療法、ＧｅｎＶｅｃを含む）、光受容体／網膜細胞移植（移植可能な網膜上皮細胞、Ｄｉａｃｒｉｎ，Ｉｎｃ．；網膜細胞移植、Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｓｙｓ，Ｉｎｃ．を含む）、および鍼治療が含まれる。
限定するものではないが、Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ ａｎｄ Ｊａｉｎ，２０００，Ｎａｔｕｒｅ ４０７：２４９－２５７に記載のものを含む任意の抗血管新生剤を、本発明によるＡｋｔ阻害剤または医薬組成物と組み合わせて使用することができる。特定の実施形態では、抗血管新生剤は、ＶＥＧＦアンタゴニストまたはＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト、例えば、ＶＥＧＦ変異体、可溶性ＶＥＧＦ受容体フラグメント、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲを遮断することができるアプタマー、中和抗ＶＥＧＦＲ抗体、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼの低分子量阻害剤およびそれらの任意の組み合わせであり、これらには、抗ＶＥＧＦアプタマー（例えば、ペガプタニブ）、可溶性組換えデコイ受容体（例えば、ＶＥＧＦトラップ）が含まれる。特定の実施形態では、抗血管新生剤には、コルチコステロイド、血管新生抑制ステロイド、酢酸アネコルタブ、アンギオスタチン、エンドスタチン、ＶＥＧＦＲまたはＶＥＧＦリガンドの発現を減少させる低分子干渉ＲＮＡ、チロシンキナーゼ阻害剤によるＶＥＧＦＲ後遮断、ＭＭＰ阻害剤、ＩＧＦＢＰ３、ＳＤＦ－１ブロッカー、ＰＥＤＦ、ガンマセクレターゼ、デルタ様リガンド４、インテグリンアンタゴニスト、ＨＩＦ－１アルファ遮断、プロテインキナーゼＣＫ２遮断、および血管内皮カドヘリン（ＣＤ－１４４）を使用した血管新生部位への幹細胞（すなわち内皮前駆細胞）ホーミングの阻害および間質由来因子（ＳＤＦ）－Ｉ抗体が含まれる。ＰＴＫ７８７を含むＶＥＧＦ受容体を標的とする小分子ＲＴＫ阻害剤も使用することができる。必ずしも抗ＶＥＧＦ化合物ではない血管新生に対して活性を有する薬剤も使用することができ、抗炎症薬、ｍ－Ｔｏｒ阻害剤、ラパマイシン、エベロリスムス、テムシロリスムス、シクロスポーン、抗ＴＮＦ剤、抗補体剤、および非ステロイド性抗炎症剤が含まれる。「神経ステロイド」と呼ばれるクラスの薬剤など、神経保護作用があり、萎縮性黄斑変性症の進行を抑える可能性のある薬剤も使用することができる。これらには、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）（商品名：プラステラ（登録商標）およびフィデリン（登録商標））、硫酸デヒドロエピアンドロステロン、および硫酸プレグネノロンなどの薬剤が含まれる。任意のＡＭＤ（加齢性黄斑変性症）治療薬を、Ａｋｔ阻害剤または本発明による医薬組成物と組み合わせて使用することができ、例えば、限定するものではないが、ベルテポルフィンをＰＤＴ、ペガプタニブナトリウム、亜鉛、または抗酸化剤と単独または任意の組み合わせで使用することができる。
「対象」および「患者」という用語は交換可能に使用され、ヒト患者および非ヒト霊長類などの哺乳動物、ならびにウサギ、ラット、およびマウスなどの実験動物、ならびに他の動物を指す。動物には、すべての脊椎動物、例えば、哺乳動物および非哺乳動物、例えば、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、ブタ、ウサギ、ニワトリなどが含まれる。本発明の治療法を実施するための好ましい対象はヒトである。処置を必要とする対象には、すでに眼血管疾患または障害を患っている患者、ならびに該障害を発症しやすい患者が含まれる。
Ａｋｔ阻害剤およびＡｋｔ阻害剤の薬学的に許容される塩は、例えば医薬製剤の形態で医薬品として使用することができる。医薬製剤は、例えば、錠剤、コーティング錠、糖衣錠、ハードおよびソフトゼラチンカプセル、溶液、乳濁液または懸濁液の形態で経口投与することができる。ただし、投与は、例えば坐剤の形態で直腸に、例えば注射液の形態で非経口的に行うこともできる。投与は、例えば経皮投与、または点眼薬もしくは点耳薬の形態で局所的に行うこともできる。
Ａｋｔ阻害剤は、医薬製剤の製造のために、薬学的に不活性な無機または有機担体とともに加工することができる。ラクトース、コーンスターチまたはその誘導体、タルク、ステアリン酸またはその塩などを、例えば、錠剤、コーティング錠、糖衣錠およびハードゼラチンカプセルのためのこのような担体として使用することができる。ソフトゼラチンカプセルに適した担体は、例えば、植物油、ワックス、油脂、半固形および液体ポリオールなどである。しかし、活性物質の性質に応じて、ソフトゼラチンカプセルの場合、通常、担体は必要とされない。溶液およびシロップ剤の製造に適した担体材料は例えば、水、ポリオール、グリセロール、植物油などである。坐剤に適した担体は、例えば、天然油または硬化した油、ワックス、油脂、半液体または液体ポリオールなどである。
さらに、本発明の医薬製剤は、防腐剤、可溶化剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、甘味料、着色剤、香料、浸透圧を変化させるための塩類、緩衝剤、マスキング剤または酸化防止剤を含有してもよい。本発明の医薬製剤はさらに、他の治療上価値のある物質を含むことができる。
Ａｋｔ阻害剤またはその薬学的に許容される塩と治療的に不活性な担体とを含有する医薬品もまた、本発明の目的であり、１種以上のＡｋｔ阻害剤および／または薬学的に許容される酸付加塩、および必要に応じて、１種以上の他の治療的に価値のある物質を、１種以上の治療的に不活性な担体と一緒にガレン投与形態で含む医薬品の製造方法も本発明の目的である。
投与量は、広範囲内で変化させることができ、当然、それぞれの具体的な症例において個々の要件に対して調整されなければならない。経口投与の場合、成人の投与量は、一般式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩の対応する量で１日あたり約０．０１ｍｇ～約１０００ｍｇまで変化させることができる。１日投与量は、単回用量または分割用量で投与することができ、さらに、必要であると判明した場合、上限を超えることもできる。
Figure 2022512706000001
製造手順
１．材料１、２、３および４を混合して、精製水で造粒する。
２．顆粒を５０℃で乾燥させる。
３．顆粒を適切な粉砕装置に通す。
４．成分５を加えて３分間混合し、適切なプレス機で圧縮する。
Figure 2022512706000002
製造手順
１．材料１、２および３を適切なミキサーで３０分間混合する。
２．成分４および５を加え、３分間混合する。
３．適切なカプセルに充填する。
本発明はさらに、Ａｋｔ阻害剤と、ＡＭＤの発症または進行を処置、予防、および／または遅延するためにＡｋｔ阻害剤を対象に投与するための（例えば、対象または臨床医への指示などの、ラベル上または添付文書の）説明書とを含むキットを提供する。
有効量は、医学的に望ましい結果を提供するのに十分なＡｋｔ阻害剤の投与量である。有効量は、処置される特定の状態、処置される対象の年齢および身体的状態、状態の重症度、処置の期間、（もしあれば）同時療法の性質、特定の投与経路などの、医療従事者の知識と専門知識の範囲内の要因に応じて変化する。
加齢性非血管新生型ＡＭＤ様表現型のマウスモデルの網膜、およびヒト初期ＡＭＤドナー組織への好中球浸潤を示す図。 フローサイトメトリー分析により、加齢（１５ヶ月齢）の Ｃｒｙｂａ１ｃＫＯマウス網膜の白血球（ＣＤ４５＋；ＦＩＴＣ細胞）ゲート集団における好中球（Ｌｙ６Ｇ＋；Ｖ４５０およびＣＤ１１ｂ（Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ７００）、Ｌｙ６Ｇ二重陽性細胞）の割合が、年齢を一致させた対照（Ｃｒｙｂａ１ｆｌ／ｆｌ）と比較して増加したことが明らかとなった図。３ヶ月齢のＣｒｙｂａ１ｆｌ／ｆｌの網膜とｃＫＯの網膜との間でそのような変化は観察されなかった。ｎ＝４の生物学的反復実験の平均値±標準偏差。 ＮＥ（好中球特異的マーカー－Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ４８８；緑色）およびＭＰＯ（活性化好中球マーカー－Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ５５５；赤色）に対する抗体を用いた初期ＡＭＤドナーの組織切片の免疫蛍光標識は、好中球の、（ｉ）網膜血管（アスタリスク）の内皮細胞（白い矢印）との、および（ｉｉ）網膜下のドルーゼン沈着物の表面（白い矢印）上への顕著な関連性を示した図。ただし、対照サンプル（ｉｉｉ）では、検出された好中球が少なく（アスタリスク）、ＭＰＯ陽性ではなかった。ｎ＝３；スケールバー：５０μｍ。 ＥＬＩＳＡにより、１５ヶ月齢のＣｒｙｂａ１ｃＫＯマウスのＲＰＥ脈絡膜組織ホモジネート中の、（ｉ）ＣＸＣＬ１、（ｉｉ）ＩＦＮαおよび（ｉｉｉ）ＩＦＮλのレベル（ｐｇ ｍｌ－１）が、年齢を一致させたＣｒｙｂａ１ｆｌ／ｆｌ対照と比較して増加したことが明らかとなった図。３ヶ月齢のマウスでは統計的に有意な変化は観察されなかった。平均値±標準偏差、ｎ＝４。 初期ＡＭＤドナーサンプル由来のＲＰＥ溶解物中のＣＸＣＬ１およびＩＦＮλの、年齢を一致させた対照と比較した発現上昇を示す代表的なイムノブロットおよび棒グラフ。平均値±標準偏差；ｎ＝３。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１。すべてのＰ値は、一元配置分散分析およびテューキーの事後検定によって評価した。Ｌｙ６Ｇ：リンパ球抗原６複合遺伝子座Ｇ６Ｄ；ＣＤ１１ｂ：分化抗原群１１ｂ；ＣＤ４５：分化抗原群４５；ｆｌ／ｆｌ：ｆｌｏｘｅｄ／ｆｌｏｘｅｄ；ｃＫＯ：条件付きノックアウト；ＮＥ：好中球エラスターゼ；ＭＰＯ：ミエロペルオキシダーゼ；ＤＡＰＩ：４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール；ＡＭＤ：加齢性黄斑変性症；ＣＸＣＬ１：ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド１、ＩＦＮα：インターフェロンアルファ；ＩＦＮλ：インターフェロンラムダ。 ＡＭＤ患者におけるインターフェロン（ＩＦＮ）および活性化ＩＬ－２８Ｒ１＋好中球のレベルの上昇を示す図。マルチプレックスＥＬＩＳＡによって測定された、初期ＡＭＤ被験者（地図状萎縮または血管新生なし；ｎ＝５０）および対照（ＡＭＤまたは糖尿病なし；ｎ＝２６））由来の血漿中のＩＦＮα（ａ）、ＩＦＮβ（ｂ）、ＩＦＮγ（ｃ）、ＩＦＮλ１（ｄ）およびＩＦＮλ２／３（ｅ）のレベル。 初期ＡＭＤ被験者（網膜に少量のドルーゼンおよび色素変化を伴う白内障被験者；ｎ＝６）由来の房水（Ａｑ．Ｈ）中の、対照（網膜病変のない白内障被験者；ｎ＝７）と比較したＩＦＮα（ｆ）およびＩＦＮλ１（ｇ）のレベル。末梢血（ＰＢ）およびＡｑ．Ｈ（５０μＬ）中の免疫細胞集団を、ＣＤ４５（白血球）、ＣＤ６６ｂ（好中球）、ＩＬ－２８Ｒ１（ＩＦＮλ受容体１）に対する抗体で染色して、以下の亜集団に対してゲートした。ＰＢ中ＣＤ４５＋ＣＤ６６ｂ＋（ｈ）；ＰＢ中ＣＤ４５＋ＩＬ－２８Ｒ１＋（ｉ）；ＰＢ中ＣＤ４５＋ＣＤ６６ｂＨｉｇｈ ＩＬ－２８Ｒ１＋（ｊ）およびＡｑ．Ｈ中ＣＤ４５＋ＣＤ６６ｂＨｉｇｈ ＩＬ－２８Ｒ１＋（ｋ）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、マンホイットニー検定。ＥＬＩＳＡ：酵素結合免疫吸着測定法；ＣＤ：分化抗原群；ＩＬ－２８Ｒ１：インターロイキン２８受容体１。 ＬＣＮ－２／Ｄａｂ２／インテグリンβ１軸の活性化が、網膜への好中球の遊走を誘発し、網膜変性を引き起こすことを示す図。 ＩＦＮλ過剰発現ＲＰＥ細胞由来の馴化培地（６時間）または組換えＩＦＮλ（２時間）に曝露された好中球が、対照細胞と比較してＬＣＮ－２およびｐＳＴＡＴ１の発現が上昇したことを示す図。平均値±標準偏差、ｎ＝３； （ｉ）ビヒクル（ＨＢＳＳ）または（ｉｉ）対照好中球を硝子体内注射したＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスの網膜の代表的な眼底およびスペクトルＯＣＴ画像により明らかとなった、正常な網膜構造の図。対照的に、（ｉｉｉ）組換えＬＣＮ－２（１０ ｐｇ ｍｌ－１）または（ｉｖ）ＩＦＮλ過剰発現マウスＲＰＥ細胞由来の馴化培地（１：１に希釈）または（ｖ）組換えＩＦＮλ（２００Ｕｍｌ－１）のいずれかで前処理した好中球を注射されたマウスは、ＲＰＥとＩＳ／ＯＳ層（アスタリスク）、ＧＣＬ／ＩＰＬ層の大きな局所的結節（黄色の矢印）、およびＯＮＬに伸びるＩＳ／ＯＳ／ＲＰＥ層の局所的突起（白い矢印）の明らかな融合を示している。 図３ｂのように処理された、マウス骨髄由来の培養好中球由来の細胞溶解物のプルダウンアッセイにより、ＬＣＮ－２（免疫沈降）とＤａｂ２（免疫ブロット）の間の関連性の増加を示した図。陰性対照ウサギＩｇＧ；各サンプルのインプット対照は、免疫沈降されていない好中球溶解物中にＤａｂ２が存在することを示している。平均値±標準偏差；ｎ＝３。 上記のように馴化培地に曝露されたマウス好中球のフローサイトメトリー分析により、インテグリンβ１の細胞外発現の上昇が示されたが（ＦＩＴＣ－Ａ 中央値蛍光）、ＬＣＮ－２ ｓｈＲＮＡトランスフェクションの８時間後、インテグリンβ１が、対照のｓｈＲＮＡトランスフェクト好中球と比較して減少した図。平均値±標準偏差；ｎ＝３。 図３ｄでは、組換えＩＦＮλで処理された好中球はインテグリンβ１の顕著な増加を示しているが、このことがＬＣＮ－２ ｓｈＲＮＡのトランスフェクションによって大幅に防止された図。平均値±標準偏差；ｎ＝３。＊Ｐ＜０．０５、Ｐ値は、一元配置分散分析およびテューキーの事後検定によって評価した。ＬＣＮ－２：リポカリン－２；ｓｈＲＮＡ：低分子／短鎖ヘアピンＲＮＡ；ＮＯＤ－ＳＣＩＤ：ＮＯＤ－重症複合免疫不全症；ＩＦＮλ：インターフェロンラムダ、ＩＳ：視細胞内節；ＯＳ：視細胞外節；ＧＣＬ：神経節細胞層；ＩＰＬ：内網状層；ＯＬＭ：外境界膜；ＯＮＬ：外顆粒層；Ｄａｂ－２：無効化されたホモログ２；Ｖ４５０：バイオレット４５０；ＦＩＴＣ：フルオレセインイソチオシアネート。 ＡＫＴ２リン酸化の選択的阻害剤が、網膜への好中球の浸潤を遮断し、炎症シグナルを中和し、Ｃｒｙｂａ１ マウスの初期のＲＰＥ変化を救う図。 フローサイトメトリー分析により、Ｃｒｙｂａ１ ｃＫＯマウス（雄；１２ヶ月齢）の網膜において、５００μＭ／２μｌの用量で週に１回、３週間、ＡＫＴ２阻害剤（ＣＣＴ１２８９３０）で硝子体内処理した後、白血球（ＣＤ４５＋；ＦＩＴＣ細胞）ゲート集団内の好中球（Ｌｙ６Ｇ＋；Ｖ４５０およびＣＤ１１ｂ（Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ７００）、Ｌｙ６Ｇ二重陽性細胞）の浸潤が、ビヒクル処理（ＰＢＳ中２．５％のＤＭＳＯを含有するＰＢＳ）された、または未処理の、年齢を一致させたＣｒｙｂａ１ ｃＫＯと比較して減少したことが示された図。代表的なグラフは、ｎ＝３の生物学的反復実験のＬｙ６Ｇ＋の％およびＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋細胞の％（平均値±標準偏差）を示している。 正常な構造を示す１歳のＣｒｙｂａ１ｆｌ／ｆｌマウスの網膜の代表的な組織切片（Ｈ＆Ｅ）を示す図ｃ．ビヒクル（上記のように）を注射したＣｒｙｂａ１ ｃＫＯマウス（１歳）は、色素沈着の変化を伴う光受容体およびＲＰＥの病変（矢印）を示している図。挿入図は、ブルッフ膜とＲＰＥとの間のデブリの蓄積、およびＲＰＥと光受容体との分離の可能性を示す（矢印）ＲＰＥ病変の拡大図を示しているｄ。対照的に、ＣＣＴ１２８９３０を注射されたＣｒｙｂａ１ ｃＫＯマウスが、２週間後に正常な構造を示した図。元の倍率：（ｂ、ｃ、ｄ）２０倍；（挿入図）４０倍。ｅ：描画。＊Ｐ＜０．０５、すべてのＰ値は、一元配置分散分析およびテューキーの事後検定によって評価した。Ｌｙ６Ｇ：リンパ球抗原６複合遺伝子座Ｇ６Ｄ；ＣＤ：分化抗原群１１ｂ；ｆｌ／ｆｌ：ｆｌｏｘｅｄ／ｆｌｏｘｅｄ；ｃＫＯ：条件付きノックアウト；ＡＫＴ２：ＡＫＴセリン／スレオニンキナーゼ２；ＧＣＬ：神経節細胞層；ＩＰＬ：内網状層；ＩＮＬ：内顆粒層；ＯＰＬ：外網状層；ＯＮＬ：外顆粒層；ＩＳ／ＯＳ：視細胞内節および視細胞外節；ＲＰＥ／ＢｒＭ／ＣＣ：網膜色素上皮、ブルッフ膜、脈絡毛細管板複合体。 ＡＭＤ様の病状を有するマウスの網膜における好中球接着分子の発現上昇を示す図。好中球の炎症組織へのホーミングに必要な細胞接着分子であるＩＣＡＭ－１の免疫蛍光（Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ５５５；赤色）により、７ヶ月齢のマウス（上部パネル）ではなく、加齢（１８ヶ月齢）のＣｒｙｂａ１ ｃＫＯマウスの網膜で、年齢を一致させたＣｒｙｂａ１ｆｌ／ｆｌ（対照）マウスと比較した発現の上昇が示されている。強いＩＣＡＭ－１染色が、加齢Ｃｒｙｂａ１ ｃＫＯマウス（右下）の神経網膜（矢印）およびＲＰＥ／脈絡膜（アスタリスク）で認められた。画像は３つの生物学的反復実験の代表である。スケールバー：５０μｍ。ＩＣＡＭ－１：細胞間接着分子１；ＤＡＰＩ：４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール；ＧＣＬ：神経節細胞層；ＩＮＬ：内顆粒層；ＯＮＬ：外顆粒層；ＲＰＥ：網膜色素上皮。 ヒトＡＭＤ患者の網膜における好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）の発現増加を示す図。 ヒトドナーの眼の切片（詳細は方法を参照）において、免疫蛍光法により、ＡＭＤ網膜が、好中球特異的マーカーである好中球エラスターゼ（ＮＥ：Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ５５５；赤色）、およびＮＥＴの成分であるＨ３シトルリン化（ｃｉｔｒｕｎｉｌａｔｅｄ）ヒストン（Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ４８８；緑色）に対する陽性細胞の数が、年齢を一致させた対照と比較して増加していることが示されている図。 ヒトＡＭＤ網膜の切片では、活性化好中球のマーカーでありＮＥＴの構成要素であるＭＰＯ（Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ５５５；赤色）およびＨ３シトルリン化（ｃｉｔｒｕｎｉｌａｔｅｄ）ヒストン（Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ４８８；緑色）の二重陽性細胞（矢印）の増加も明らかになった図。対照サンプルではそのような染色は観察されなかった（データ非掲載）。ｎ＝３；スケールバー：５０μｍ。ＡＭＤ：加齢性黄斑変性症；Ｈ３：ヒストン３；ＭＰＯ：ミエロペルオキシダーゼ；ＤＡＰＩ：４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール；ＧＣＬ：神経節細胞層；ＩＮＬ：内顆粒層；ＯＮＬ：外顆粒層；ＲＰＥ：網膜色素上皮。 ＡＭＤ様の病状を有するマウスのＲＰＥ／脈絡膜における好中球調節分子のＲＮＡ発現の上昇を示す図。ＲＮＡＳｅｑ分析により、１０ヶ月齢のＣｒｙｂａ１ マウス由来のＲＰＥ／脈絡膜抽出物におけるＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ９、およびＩＦＮγ、ＩＦＮα、ＩＦＮλなどの好中球調節分子のＲＮＡレベルの、年齢を一致させたＣｒｙｂａ１ｆｌ／ｆｌ（対照）と比較した有意な増加が明らかになった。５ヶ月齢のマウスではそのような変化は観察されなかった。すべての値は、各遺伝子の１００万マップリードあたりの転写物のキロベースあたりのリード数（ＲＰＫＭ）を表し、ｌｏｇ１０（１００万あたりのカウント）；ｎ＝６として表される。＊＊Ｐ＜０．０１およびｎｓ：生後１０ヶ月齢のＣｒｙｂａ１ｆｌ／ｆｌ群に関しては有意ではない。すべてのＰ値は、一元配置分散分析およびテューキーの事後検定によって評価した。ＣＸＣＬ１：ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド１；ＣＸＣＬ９：ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド９；ＩＦＮγ：インターフェロンガンマ；ＩＦＮα：インターフェロンアルファ；ＩＦＮλ：インターフェロンラムダ。 ＡＭＤ患者の房水および血漿中のＩＦＮβ、ＩＦＮλ２／３およびＶＥＧＦを示す図。マルチプレックスＥＬＩＳＡによって測定された初期ＡＭＤ被験者（ｎ＝６）および対照（ｎ＝７）の房水中のＩＦＮβ（図８ａ）およびＩＦＮλ２／３（図８ｂ）のレベルは、有意な変化を示さなかった。同様に、マルチプレックスＥＬＩＳＡによって測定された初期ＡＭＤ被験者および対照（詳細については方法を参照）の末梢血（図８ｃ）および房水（図８ｄ）中のＶＥＧＦレベルは差を示さなかった。ＩＮＦβ：インターフェロンベータ；ＩＦＮλ：インターフェロンラムダ；ＶＥＧＦ：血管内皮増殖因子。 房水および血漿中の免疫細胞分析を示す図。ＡＭＤ被験者（ｎ＝６）および対照（ｎ＝７）由来の房水中の免疫細胞集団をＣＤ４５（白血球）およびＣＤ６６ｂ（好中球）について染色し、以下の亜集団に関してゲートした。ＣＤ４５＋ＣＤ６６ｂ＋（図９ａ－房水）、ＣＤ４５＋ＣＤ６６ｂＨｉｇｈ（図９ｂ－房水）、ＣＤ４５＋（図９ｃ－房水および図９ｄ－血漿）およびＣＤ４５＋ＩＬ２８Ｒ１＋（図９ｅ－血漿およびｆ－房水。 未処置および好中球処置のＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスのＩＳ／ＯＳおよびＧＣＬ／ＩＰＬの厚さの測定図。厚さ分析は、視神経乳頭（ＯＮＨ）に対して－２．０～＋２．０ ｍｍの範囲の各眼の光学的切片（網膜あたり１００切片）について、機器に付属のＦＩＪＩ－ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）プラグイン、およびＤｉｖｅｒ ２．４ソフトウェア（Ｂｉｏｐｔｉｇｅｎ）を使用して実行された。組換えＬＣＮ－２、馴化培地に曝露された好中球、または組換えＩＦＮλに曝露された好中球の硝子体内注射は、ビヒクルおよび未処理（対照）好中球注射群と比較した、図１０ａ：：ＩＳ＋ＯＳの厚さ（μｍ）の減少、および図１０ｂ：ＧＣＬ＋ＩＰＬの厚さ（μｍ）の増加を引き起こした。値は平均±標準偏差；ｎ＝１０である。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。すべてのＰ値は、一元配置分散分析およびテューキーの事後検定によって評価した。ＬＣＮ－２：リポカリン－２；ＩＦＮλ：インターフェロンラムダ；ＩＳ：内節；ＯＳ：外節；ＧＣＬ：神経節細胞層；ＩＰＬ：内網状層。 組換えＩＦＮλを過剰発現する好中球を注射したＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスの眼の組織病理学的変化を示す図。生後４５日目の正常な構造を示す野生型網膜組織由来の代表的なヘマトキシリンおよびエオシン染色切片が示されている（図１ａ）。対照的に、（図１ｂ）組換えＩＦＮλを過剰発現する好中球を注射したＮＯＤ－ＳＣＩＤマウス網膜は、神経節細胞層および硝子体（矢じりの印）、ＩＮＬ中に細胞の浸潤、およびびまん性光受容体損傷（矢印）を示し、（図１ｃ）では、網膜外層およびＲＰＥ／ＢｒＭ複合体の重度の損傷（ＢｒＭの破壊、ＲＰＥの喪失、ＣＣの変化）を示している。ａ－ｂ：１０倍、ｃ：２０倍。ＢｒＭ：ブルッフ膜；ＣＣ：脈絡毛細管板（Ｃｈｏｒｉｏｃａｐｉｌａｒｉｓ）；ＧＣＬ：神経節細胞層；ＩＦＮλ：インターフェロンラムダ；ＩＮＬ：内顆粒層；ＲＰＥ：網膜色素上皮。 Ｄａｂ－２がＬＣＮ－２と相互作用することを示す図。ＨｕＰｒｏｔ（商標）アレイにおいて１μｇ／ｍｌでプローブされたＤａｂ－２（赤いボックス）を含むＬＣＮ－２の結合パートナーを示すヒトプロテオームアレイ。データは３つの生物学的反復実験の代表であり、カットオフが６で、値が２８～６５の範囲のｚスコア（各プローブのヒット）で表されている。 ＩＦＮλが、マウス骨髄由来好中球の接着および遊走の増加を促進することを示す図。対照ｓｈＲＮＡまたはＬＣＮ－２ ｓｈＲＮＡを８時間トランスフェクトした後、対照ベクターまたはＩＦＮλ過剰発現ＲＰＥ細胞由来の馴化培地（１：１に希釈）に６時間、および組換えＩＦＮλ（２００Ｕ ｍｌ－１）に２時間、それぞれ曝露したマウス骨髄由来好中球を示した；図１３ａ：フィブリノーゲン（２０μｇ ｍｌ－１）でコーティングされたプレートへの接着の増加（矢印）、グラフは、コンピューター支援列挙を使用して、０．２ ｍｍ２中にカウントされた接着細胞を示す、および図１３ｂ：対照ｓｈＲＮＡトランスフェクト＋ＩＦＮλ（馴化培地または組換え）好中球の、フィブリノーゲン（１５０μｇ ｍｌ－１）コーティングプレートにわたった好中球遊走の増加（矢印）、グラフは、コンピューター支援セルカウンターシステムを使用したインサート下部の細胞数を表す細胞の相対移動（％）を示す。ＬＣＮ－２ ｓｈＲＮＡトランスフェクト細胞は減少を示した。図１３ａ：接着（アスタリスク）、および図１３ｂ：ＩＦＮλへの曝露後でも遊走（アスタリスク）。すべての値は平均±標準偏差、ｎ＝４である；スケールバー：３０μｍ。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。すべてのＰ値は、一元配置分散分析およびテューキーの事後検定によって評価した。ＬＣＮ－２：リポカリン－２；ｓｈＲＮＡ：低分子／短鎖ヘアピンＲＮＡ；ＩＦＮλ：インターフェロンラムダ；ＲＰＥ：網膜色素上皮；ｆＭＬＰ：Ｎ－ホルミルメチオニル－ロイシル－フェニルアラニン。 １歳のＣｒｙｂａ１ ｃＫＯマウスの網膜におけるＡＫＴ２（ｐ－ＡＫＴ２Ｓ４７４）のリン酸化の有意な増加を示すイムノブロットおよびデンシトメトリーの要約図。ＣＣＴ１２８９３０による処置は、Ｃｒｙｂａ１ ｃＫＯ網膜中のｐＡＫＴ２のレベルを有意に低下させたが、ビヒクル対照では低下させなかった。さらに、総ＡＫＴのレベルはサンプルにおいて変化しなかった。 ＥＬＩＳＡアッセイが、ＡＫＴ２阻害剤で処置したＣｒｙｂａ１ ｃＫＯマウスのＲＰＥ脈絡膜におけるＣＸＣＬ１（ｃ）およびＩＦＮλ（ｄ）の、年齢を一致させたビヒクルおよび未処置のＣｒｙｂａ１ ｃＫＯ動物と比較したレベル低下（ｐｇ ｍｌ－１）を示している図。グラフは、値を、ｎ＝３の生物学的反復実験についての平均±標準偏差として示す。 ＥＬＩＳＡアッセイが、ＡＫＴ２阻害剤で処置したＣｒｙｂａ１ ｃＫＯマウスのＲＰＥ脈絡膜におけるＣＸＣＬ１（ｃ）およびＩＦＮλ（ｄ）の、年齢を一致させたビヒクルおよび未処置のＣｒｙｂａ１ ｃＫＯ動物と比較したレベル低下（ｐｇ ｍｌ－１）を示している図。グラフは、値を、ｎ＝３の生物学的反復実験についての平均±標準偏差として示す。
加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）による視力喪失は、人口の高齢化により拡大する主要な未解決の問題である１－３。炎症の役割はＡＭＤの潜在的な原因として浮上しているが、炎症がＡＭＤでの視力喪失をどのように引き起こすかはわかりにくいままである４－７。ハイスループットアレイで、本発明者らは、初期ＡＭＤ患者および加齢性非血管新生ＡＭＤ様表現型のマウスモデルにおいて、網膜への好中球浸潤を促進する炎症性シグナルを特定した。初期ＡＭＤではＩＦＮλと活性化ＩＬ－２８Ｒ１＋好中球のレベルの上昇が観察された。ＩＦＮλは、好中球におけるリポカリン－２（ＬＣＮ－２）活性化を誘発する。ＬＣＮ－２は、無効化されたホモログ－２（Ｄａｂ２）と相互作用することにより、好中球の網膜への遊走を促進し、インテグリンｂ１を調節し、慢性炎症により誘発される病状を促進して網膜変性をもたらす。マウスモデルにおけるＡＫＴ２依存性シグナル伝達の阻害は、炎症性シグナルを中和し、網膜への好中球の浸潤を停止させ、初期ＡＭＤ様表現型の変化を逆転させるので、初期ＡＭＤの治療標的候補となる。
好中球は自然免疫応答において中心的な役割を果たす８－１２。機能不全の循環好中球がアルツハイマー病（ＡＤ）１３－１６およびＡＭＤ１７－１８の病因に寄与することは今や明らかである。年齢依存性のＡＭＤ様表現型を有する我々のマウスモデル（Ｃｒｙｂａ１ ｃＫＯ）１９－２１では、フローサイトメトリーにより、ｆｌｏｘｅｄ対照と比較して網膜に好中球が蓄積されることが示された（図１ａ）。本発明者らは以前、初期ＡＭＤ患者の黄斑下脈絡膜および網膜に浸潤する好中球の数が、年齢を一致させた対照と比較して増加することを観察した２２。本明細書において、本発明者らは、非血管新生型ＡＭＤ患者由来の網膜組織切片で、網膜血管の内腔（図１ｂｉ）および周囲のドルーゼン（特徴的なＡＭＤ病変（図１ｂｉｉ））に関連する好中球の数が、年齢を一致させた対照と比較して多いことを見出した（図１ｂｉｉｉ）。好中球は、内皮細胞表面に付着することにより、末梢血から内皮層を通って炎症部位に向かって遊走し、周皮細胞に沿って這うまで遊走し、血管壁を通って出るようにシグナルを送る２３－２７。内皮細胞への好中球の接着は、内皮細胞上でのインテグリンおよびＩＣＡＭ－１２９などの免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー２８との相互作用によって媒介される。本発明者らの動物モデル（ＩＣＡＭ－１；図５）では接着分子がアップレギュレートされている。炎症領域に入ると、好中球は好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）を放出する可能性があり３０、近年、これが免疫性疾患において宿主組織に損傷を与えることが示されている３１、３２。慢性炎症性障害では、ＮＥＴの形成および／または分解の強化が臓器損傷の開始に重要な役割を果たすことが知られている３３－３６。実際、ＡＭＤドナーの眼は、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、エラスターゼ、シトルリン化ヒストンＨ３などのＮＥＴについて陽性に染色された（図１ｂｉ＆ｉｉ、および図６）３７－４０。
神経感覚網膜およびＲＰＥ／脈絡膜への好中球浸潤を引き起こす可能性のある、ＲＰＥ／網膜から放出されるサイトカインまたはケモカインなどの可溶性因子を特定するために、ＲＮＡｓｅｑ分析を、５ヶ月および１０ヶ月においてＣｒｙｂａ１ ｃＫＯマウスから得られた網膜組織１９－２１、およびｆｌｏｘｅｄ対照から得られた網膜組織４１に対して実施した。インターフェロン（ＩＦＮ）ならびにＣＸＣＬ１およびＣＸＣＬ９の発現もｃＫＯ網膜で上昇した（図７）。これらの発見はＥＬＩＳＡによって確認された（図１ｃｉ～ｉｉｉ）。ＩＮＦｌおよびＣＸＣＬ１は、ウエスタン分析によれば、ヒトＡＭＤ網膜でも年齢を一致させた対照と比較してアップレギュレートされた（図１ｄ）。さらに、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＦＮλ１およびＩＦＮλ２／３は、地図状萎縮または血管新生を伴わないＡＭＤ患者由来の末梢血において対照（ｎ＝２６）と比較して、（ｎ＝５０）上昇した（図２ａ～ｅ；補足表１ａ）。さらに、初期ＡＭＤ被験者由来の房水サンプルの小さなセット（ｎ＝６；補足表１ｂ）は、年齢を一致させた対照（ｎ＝７）と比較してＩＦＮαおよびＩＦＮλ１の上昇を示した（図２ｆおよびｇ）。ＩＦＮβおよびＩＦＮλ２／３は対照と比較してわずかに上昇したが、おそらくサンプルサイズが小さいため、統計的に有意ではなかった（図８ａおよびｂ）。興味深いことに、患者と対照のＶＥＧＦレベルに差はなかった（図８ｃおよびｄ）。総好中球（ＣＤ４５＋／ＣＤ６６ｂ＋）および活性化好中球（ＣＤ６６ｂＨｉｇｈ）は、ＡＭＤ患者の末梢血で有意に高かった（それぞれ図２ｈおよび２ｉ）が、房水ではそうではなかった（図９ａおよびｂ）。しかし、ＩＦＮλ受容体陽性（ＩＬ－２８Ｒ１）の活性化好中球の数は、ＡＭＤ被験者の末梢血（図２ｊ）と房水（図２ｋ）との両方で、好中球集団内で対照と比較して有意に多かった。さらに、ＩＬ２８Ｒ１陽性細胞の総数は房水では変化しなかったが、末梢血では上昇した（図９ｅおよびｆ）。特に、総白血球数もまた、ＡＭＤ患者の血漿または房水で、対照と比較して変化しなかった（図９ｃおよびｄ）。まとめると、ＩＦＮλが好中球の網膜およびおそらく子嚢への遊走を促進するトリガーである可能性が高い。
これらの観察が、好中球が網膜に浸潤し、ＡＭＤの病因に寄与する可能性のあるメカニズムの調査を促した。最近の研究では、本発明者らは、ＬＣＮ－２がＣｒｙｂａ１ ｃＫＯマウスの慢性網膜炎症に寄与すること４２、およびＬＣＮ－２２２に対して免疫染色された初期ＡＭＤドナーの眼の神経感覚網膜および黄斑下脈絡膜への好中球浸潤を示した。さらに、組換えＩＦＮλ、またはＩＦＮλを過剰発現する初代培養ＲＰＥ細胞由来の馴化培地のいずれかで処理されたマウス骨髄由来好中球は、ＬＣＮ－２およびリン酸化ＳＴＡＴ１を増加させた（図３ａ）。遊走する好中球のＬＣＮ－２が網膜外層変性を引き起こすという我々の仮説を立証するために、ＮＯＤ－ＳＣＩＤ免疫不全マウスに、正常な好中球、組換えＬＣＮ－２、またはＩＮＦｌもしくはＩＮＦｌを過剰発現するＲＰＥ細胞の初代培養由来の馴化培地で処理した好中球を注射した。７日後、ＩＮＦｌ（図３ｂ ｉｖ～ｖおよび図１０）または組換えＬＣＮ－２（図３ｂ ｉｉｉ）のいずれかで処理された好中球に曝露されたマウスの網膜外層は結節性肥厚を示したが、正常な好中球またはビヒクルのみで処理されたマウス（図３ｂ ｉ＆ｉｉ）では、光干渉断層撮影（ＯＣＴ）の使用による変化は観察されなかった。これらの網膜外層結節では、ＲＰＥは、外顆粒層内に局所的に突出した内節（ＩＳ）／外節（ＯＳ）層と融合しているように見える（図３ｂ ｖ；白い矢印）。局所的な結節は、神経節細胞／内網状層（ＧＣＬ／ＩＰＬ）にも存在していた。これらの変化は、光受容体、ＲＰＥ、ブルッフ膜などの網膜外層の重度の破壊、およびＧＣＬと硝子体中の浸潤細胞と相関していた（図１１）。これらのインビボ所見は、ヒトの疾患で観察された網膜の変化を連想させ、ＡＭＤ患者の眼内区画および網膜における活性化された好中球の病理学的役割が確認される。ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスのデータおよび初期ＡＭＤの房水サンプルに基づいて、活性化好中球がＡＭＤの初期に眼内リンパドレナージシステムを介して網膜に遊走する可能性があると推測することは魅力的である。
次に、プロテオームハイスループットアレイを実行し、ＬＣＮ－２がＤａｂ２と相互作用する（図１２）ことを見出した。インテグリンｂ１との結合を通じて細胞移動を調節することは公知である４３。Ｄａｂ２を除去すると、細胞移動が阻害される４３。インテグリンｂ１の増加は、好中球の遊走４４、４５および接着４６、４７において重要な役割を果たす。ＩＦＮλで処理した好中球ではＬＣＮ－２とＤａｂ２の関連性が、対照と比較して増加していることが観察された（図３ｃ）。本発明者らは、ＩＦＮλで処理された好中球におけるＬＣＮ－２とＤａｂ２の間の関連性の増加が、細胞外インテグリンｂ１の発現と、それに伴う好中球の接着および遊走を調節すると仮定した。Ｄａｂ２／インテグリンｂ１軸の調節におけるＬＣＮ－２のこのまだ未知の役割を探求するために、ＬＣＮ－２に対する特異的ｓｈＲＮＡを用いて培養好中球のＬＣＮ－２をサイレンシングし、これらの細胞を組換えＩＦＮλまたはＩＦＮλを過剰発現するＲＰＥ細胞由来の馴化培地で処理した。ＬＣＮ－２サイレンシングにより、細胞外インテグリンｂ１の発現（図３ｄおよびｅ）および好中球の接着と遊走（図１３）が、対照ｓｈＲＮＡで処理された細胞と比較して有意に減少することがわかった。これらの結果は、ＬＣＮ－２がｂ１インテグリン依存性の好中球の接着と遊走を調節していることを示唆している。
まとめると、本発明者らのデータは、網膜に浸潤している好中球がＬＣＮ－２を放出し、炎症促進状態を生成して４２、ＡＭＤ病理生物学の要素に寄与することを示唆している２２、４８。本発明者らは以前に、初期ＡＭＤ患者において網膜中のＬＣＮ－２レベルが急激に増加し、それが後期の病期まで持続することを報告している２２。また、ＡＫＴ２がＬＣＮ－２２２の上流レギュレーターであり、ＬＣＮ２が網膜への好中球の遊走を調整することも以前に示したので、次に、ＡＫＴ２４９の強力で選択的な阻害剤であるＣＣＴ１２８９３０を使用して、好中球の網膜への浸潤を遮断できるかどうかを本発明者らのマウスモデルで判断した。Ｃｒｙｂａ１ ｃＫＯマウスは、初期ＡＭＤの基本的な変化であるＲＰＥと光受容体の変性を伴う顕著なＡＭＤ様表現型を示す５０、５１。ＲＰＥは１２ヶ月齢で軽度に変性し、２０ヶ月までに重度のＲＰＥと光受容体の変性に進行する１９－２１。初期のＲＰＥ変性段階では、ＣＣＴ１２８９３０を硝子体内注射したＣｒｙｂａ１ ｃＫＯマウス（１２ヶ月）は、ビヒクルのみを投与したマウスよりも網膜中の好中球が有意に少なかった（図４ａ）。重要なことに、この薬剤はこれらの初期のＲＰＥ異常を逆転させる（図４ｂ～ｄ）。さらに、ｐＡＫＴ２、ＩＦＮλおよびＣＸＣＬ１レベルはＣＣＴ１２８９３０処置によって減少した（図１４）。抗酸化微量栄養素は中期ＡＭＤの進行を遅らせ５２、５３、抗ＶＥＧＦ注射は血管新生疾患を処置するが５４、５５、疾患の初期段階を対象とした治療法はない。ＡＫＴ２阻害剤は、初期ＡＭＤの進行を予防または遅延させる効果的で新しい手段であると考えられる（図４ｅ）。
材料および方法
抗体
ＦＩＴＣタグ付きＣＤ４５（カタログ番号５５３０８０）、ＡＰＣ Ｃｙ７タグ付きＣＤ４５（カタログ番号５６０１７８）、ＦＩＴＣタグ付きＣＤ６６ｂ（カタログ番号５５５７２４）、Ｖ４５０タグ付きＬｙ６Ｇ（カタログ番号５６０６０３）、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ７００タグ付きＣＤ１１ｂ（カタログ番号５５７９６０）はＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡから購入し、ＰＥタグ付きＩＬ－２８ＡＲ抗体（カタログ番号３３７８０４）はＢｉｏｌｅｇｅｎｄ、ＵＳＡから購入した。抗好中球エラスターゼ（カタログ番号ａｂ６８６７２）、抗ＧＲＯアルファ（ＣＸＣＬ１）（カタログ番号ａｂ８６４３６）、抗ＳＴＡＴ１（リン酸化Ｓ７２７）（カタログ番号ａｂ１０９４６１）、抗ヒストンＨ３シトルリン化（ｃｉｔｒｕｎｉｌｌａｔｅｄ）（カタログ番号ａｂ２１９４０７）およびＩＬ２８＋ＩＬ２９（カタログ番号ａｂ１９１４２６）抗体はＡｂｃａｍ、ＵＳＡから購入した。抗ＩＣＡＭ－１（カタログ番号ＳＣ－１０７）、抗ＳＴＡＴ１（カタログ番号９１７２Ｔ）、抗ＡＫＴ（カタログ番号４６８５Ｓ）、抗ＡＫＴ２（カタログ番号２９６４Ｓ）、および抗Ｄａｂ－２（カタログ番号１２９０６Ｓ）は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡから購入した。使用する他の抗体は下記のとおりである：Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ４８８タグ付きβ１インテグリン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ；カタログ番号ｓｃ－３７４４２９ ＡＦ４８８）、抗ＩＬ－２８Ａ／ＩＦＮλ２（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｏｎｌｉｎｅ；カタログ番号ＡＢＩＮ３５７１７３）、抗ＩＦＮα抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、ＵＳＡ；カタログ番号２２１００１）、抗ミエロペルオキシダーゼ／ＭＰＯ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ；カタログ番号ＡＦ３６６７－ＳＰ）、抗ＬＣＮ－２（ＥＭＤ Ｍｉｌｉｐｏｒｅ；カタログ番号ＡＢ２２６７）および抗アクチン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ；カタログ番号Ａ２０６６）。
動物
βＡ３／Ａ１－クリスタリン条件付きノックアウトマウス（Ｃｒｙｂａ１ ｃＫＯ）は、前述のようにＣｒｅ－ＬｏｘＰシステムおよびＢｅｓｔ１プロモーターを使用して作製した１。Ｃｒｙｂａ１ ｆｌｏｘｅｄマウス２を、ＲＰＥでＣｒｅリコンビナーゼを特異的に発現するＢｅｓｔ１－ｃｒｅマウスと交配させた。その後、ｃＫＯ＋とＣｒｅ＋であると決定された子孫を交配させて、Ｆ２世代を作製した。ＰＣＲ分析により、ノックアウト対立遺伝子についてホモ接合性のＦ２子孫を同定した。続いて、これらのｃＫＯ／ｃＫＯマウスのＣｒｅの存在を分析した。ｃＫＯ／ｃＫＯとＣｒｅ＋の両方の動物を交配させて、Ｆ３以降の世代を作製した。ｆｌｏｘｅｄマウスは、もともとｒｄ８変異を持つＣ５７ＢＬ／６Ｎ系統で繁殖させたが、この網膜変性変異は、この研究が行われる前にコロニーの外で繁殖させた。ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウス（ＮＯＤ．ＣＢ１７－Ｐｒｋｄｅｓｃｉｄ／Ｊ；４～５週齢）は、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＵＳＡから購入した。すべての動物実験は、実験動物管理使用に関するガイド（Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌｓ）（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ Ｐｒｅｓｓ）に従って実施し、ピッツバーグ大学の実験動物管理使用委員会（Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認された。
ヒトの眼
ヒトドナーの眼におけるＡＭＤの診断および分類は、前述のように行った３。免疫染色のために、ヒトドナーの眼を、死亡から１２～３５時間以内にＮａｔｉｏｎａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ（ＮＤＲＩ；Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、ＵＳＡ）から入手した。ＡＭＤの５人の被験者（年齢範囲７９～９５歳；平均年齢８５．８歳）および黄斑疾患のエビデンスがない３人の加齢対照（年齢範囲７７～８９歳；平均年齢８２．５歳）からの白人ドナーの眼を研究した。この研究は、ヒトの組織に関する研究に関するヘルシンキ宣言の規範を順守した。ＡＭＤの診断および分類は前述のように行った３。
ヒト末梢血および房水からの免疫表現型検査および可溶性因子定量化実験のために、サンプルをヒトドナーから収集し、Ｎａｒａｙａｎａ Ｎｅｔｈｒａｌａｙａ、Ｂａｎｇａｌｏｒｅ、Ｉｎｄｉａに報告した。すべての被験者は、視力検査および網膜検査を含む眼科検査を受けた。ＡＭＤ患者は、必要に応じて、眼底画像、アムスラーグリッドテスト、および光干渉断層撮影画像によって診断された。緑内障または任意の他の変性網膜障害が併存している被験者は除外した。対照群は、ＡＭＤ、糖尿病、心血管障害、または網膜疾患の病歴のない個人で構成された。４～６ｍｌの血液サンプルは、２６人の対照および８０人のＡＭＤ被験者からＥＤＴＡチューブでの静脈穿刺により、収集した。房水サンプル（約５０μＬ）は、無菌条件下で前房穿刺によって白内障手術を受けた被験者（対照 ｎ＝７、ＡＭＤ ｎ＝６）から収集した。このグループ内で、手術が禁忌ではない初期ＡＭＤ被験者を、ＡＲＥＤＳ分類４に従って、ドルーゼンおよび網膜の色素変化を特徴とするＲＰＥ異常の存在によって特定した。患者コホートの人口統計的特徴を、補足表１に示す。収集されたすべてのサンプルは、さらなる処理のためにすぐにバイオレポジトリに保存した。すべての患者サンプルおよび関連する臨床情報は、Ｎａｒａｙａｎａ Ｎｅｔｈｒａｌａｙａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ（ＩＲＢ）の承認を得た後、患者からの書面によるインフォームドコンセントを得て収集された。
免疫染色
ヒトドナーの眼（ＡＭＤ眼；ｎ＝５、年齢を一致させた対照；ｎ＝３）、およびマウスからの新たに摘出された眼（ｎ＝４／群）を２％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定し、処理し、切片にした（８μｍの切片；４切片／眼、前述の方法に従った）５。ミエロペルオキシダーゼ／ＭＰＯ（１：１００）、好中球エラスターゼ（１：１００）、ＩＣＡＭ－１（１：１００）、ＶＣＡＭ－１（１：１００）、またはＨ３シトルリン化（ｃｉｔｒｕｎｉｌｌａｔｅｄ）ヒストン（１：１００）に対する一次抗体を使用して免疫染色を行い、続いて、前述のように、ＤＡＰＩ（５μＭ）とともに適切な二次抗体（１：３００）で染色した６。切片を、ＤＡＫＯ Ｐａｒａｍｏｕｎｔ（ＤＡＫＯ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＵＳＡ）を使用して載置した。画像を、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ７１０共焦点ワークステーションによって取得した。
可溶性因子の定量化
末梢静脈血を静脈穿刺（ｎ＝８０ ＡＭＤ患者およびｎ＝２６ 対照被験者）によって得、房水（ＡＨ）はＡＭＤ患者（ｎ＝６）および対照被験者（ｎ＝７）で前房穿刺によって収集した。ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＦＮλ１～３、ＶＥＧＦおよびＣＸＣＬ１のレベルは、血漿およびＡＨにおいて、フローサイトメーター（ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ、ＦＡＣＳ ＤＩＶＡソフトウェア、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）を使用してビーズベースのマルチプレックスＥＬＩＳＡ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｉｎｃ、ＵＳＡ）によって測定した。各分析対象物の絶対濃度は、検量線に基づいて計算した。
免疫表現型
末梢血（ｎ＝８０ ＡＭＤ患者およびｎ＝２６ 対照被験者）および房水（ＡＨ）（対照被験者（ｎ＝７）およびＡＭＤ患者（ｎ＝６））からの細胞を、白血球（ＣＤ４５）、好中球（ＣＤ６６ｂ）、およびＩＦＮλ受容体に特異的な蛍光色素結合抗ヒト抗体を使用して、室温で４５分間標識した。赤血球を１×ＢＤ溶解バッファーで１０分間溶解し（末梢血サンプルの場合）、末梢血およびＡＨ由来の細胞を洗浄し、１×リン酸緩衝生理食塩水に再懸濁して、次いでフローサイトメトリー（ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ、ＦＡＣＳ ＤＩＶＡソフトウェア、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）ベースで取得および分析した。データを、ＦＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓ ６ Ｆｌｏｗ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｄｉｔｉｏｎソフトウェアを使用して分析した。白血球集団を、ＳＳＣ／ＣＤ４５＋プロファイルを使用して手動ゲーティングによって識別した。その後のゲーティングは、好中球を特定するためにＳＳＣ／ＣＤ６６ｂ ＦＩＴＣで行った。好中球の活性化状態を、ＣＤ６６ｂの細胞表面発現に基づいて決定した。ＣＤ４５＋ＣＤ６６ｂ＋Ｈｉｇｈ細胞を活性化好中球と見なし、ＣＤ４５＋ＣＤ６６ｂ＋Ｌｏｗを不活性好中球と見なした。ＣＤ４５＋ＣＤ６６ｂ＋Ｈｉｇｈ／Ｌｏｗ ＩＬ－２８ＲＩ＋は、ＩＦＮλ受容体陽性好中球を示した。各染色パネルの陽性細胞イベントの数を計算した。
ＲＰＥの分離と培養
マウスＲＰＥは、対照Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（３週齢、ｎ＝９；Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳＡ）から分離した。眼を摘出し、高グルコースを含む５ｍｌのＤＭＥＭで２回洗浄し、２％（ｗｔ／ｖｏｌ）ディスパーゼ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）を含む５ｍｌのＤＭＥＭ中で３７℃において４５分間インキュベートした。ＲＰＥの分離および培養は、前述の方法７に従って実施し、この方法では、細胞の適切な集密度（９０％）のためにウェルごとに２つの目を使用した。
インビトロでのＲＰＥ細胞におけるＩＦＮλの過剰発現
ｐＬＶ－Ｃ－ＩＬ２８Ａ－ＧＦＰＳｐａｒｋおよび対照ベクターは、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．（Ｂｅｉｊｉｎｇ、Ｃｈｉｎａ、ＭＧ５１３０５－ＡＣＧＬＮ）から購入した。初代マウスＲＰＥ細胞（単層；９０％集密）に、Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を製造元の指示１に従って使用して、それぞれのベクターをトランスフェクトした。トランスフェクション効率を、過剰発現トランスフェクトＲＰＥ細胞から（無細胞上清に）放出されたＩＬ－２８Ａ／ＩＦＮλのレベルを、ＥＬＩＳＡによって対照ベクターをトランスフェクトした細胞と比較して評価することによって推定した。ＩＬ－２８Ａ／ＩＦＮλレベルの最低３倍の増加が、馴化培地でさらに実験を行うために適切であると見なした。
好中球の分離および培養
マウス好中球を、大腿骨と脛骨から洗い流された骨髄細胞の遠心分離によって分離し、前述８のようにＣａ２＋およびＭｇ２＋非含有ＨＢＳＳのパーコール不連続密度勾配で精製した。分離細胞の９０％以上が、フローサイトメトリーによる測定でＬｙ６Ｇ＋好中球であった（データ非掲載）。分離好中球を、５×１０６細胞／ｍＬの密度で、１００または２００Ｕ ｍｌ－１の組換えＩＦＮλ（Ｒ＆Ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）またはＩＦＮ－λ過剰発現ＲＰＥ細胞の馴化培地（培地で１：１または１：５に希釈）のいずれかで処理して、３７℃および５％ＣＯ２で、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含有するＨＢＳＳ中で培養した。
ＬＣＮ－２ ｓｈＲＮＡのトランスフェクション
ＬＣＮ－２ ｓｈＲＮＡレンチウイルスおよび対照ｓｈＲＮＡ粒子は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ（ｓｃ－６００４４－Ｖ）から購入した。マウス骨髄由来好中球（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含有するＨＢＳＳ中５×１０６細胞／ｍＬ）をプレーティングし、ＬＣＮ－２ ｓｈＲＮＡレンチウイルスまたは対照ｓｈＲＮＡ粒子を製造元のプロトコルに従って８時間トランスフェクトし、その後、トランスフェクトした細胞を２００Ｕ ｍｌ－１の組換えＩＦＮλ（Ｒ＆Ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）、またはＩＦＮ－λ過剰発現ＲＰＥの馴化培地（培地で１：１に希釈）のいずれかで３７℃、５％ＣＯ２において２時間処理した。
迅速好中球接着アッセイ
ガラス底の３５ｍｍプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＵＳＡ）を、エンドトキシン非含有ＰＢＳ中、２０μｇ／ウェルのヒトフィブリノーゲン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）で４℃で１６時間コーティングした。マウス骨髄由来好中球（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ培地を含有するＨＢＳＳ中５×１０６細胞／ｍＬ）に、前のセクションで説明したように、まず対照ｓｈＲＮＡまたはＮＧＡＬ ｓｈＲＮＡをトランスフェクトし、ｆＭＬＰ（１ｍＭ）、組換えＩＦＮλ ２００Ｕ ｍｌ－１、またはＩＦＮ－λ過剰発現ＲＰＥ細胞由来の馴化培地で処理した。処理した細胞をコーティングしたプレートに加え、３７℃で１０分間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、氷上において４％パラホルムアルデヒドで３０分間固定した。コンピューター支援列挙８を使用して、０．２ｍｍ２中の接着細胞をカウントした。
好中球遊走アッセイ
マウス骨髄由来好中球（２０ ｍＭ ＨＥＰＥＳを含むＨＢＳＳ培地中５×１０６細胞／ｍＬ）をプレーティングし、次いでレンチウイルスＬＣＮ－２ ｓｈＲＮＡまたは対照ｓｈＲＮＡを８時間トランスフェクトした（上記を参照）。トランスフェクトした細胞を、２００Ｕ ｍｌ－１の組換えＩＦＮλ（Ｒ＆Ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）またはＩＦＮ－λ過剰発現ＲＰＥ細胞由来の馴化培地（培地で１：１に希釈）のいずれかで、３７℃、５％ＣＯ２において処理した。細胞をプレートから回収し、培地で洗浄した後、１５０μｇ／ｍｌのヒトフィブリノーゲン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）でプレコートした、３μｍのインサート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＵＳＡ）を備えたトランズウェルプレートに播種した。ギムザで染色した後、移動した細胞をコンピューター支援細胞カウンター９を使用して、トランズウェルの底でカウントした。
マウス網膜における好中球の割合の推定
マウス網膜を摘出した眼から切除し、０．０５％コラゲナーゼＤで３７℃で３０分間消化し、鈍端鉗子で梳いて、ピペットで細胞を放出し、７０μｍセルストレーナーに通して、１，３００ｇ、４°Ｃで２０分遠心分離にかけた１０。ペレット全体を使用して、ＦＩＴＣタグ付き細胞表面マーカーＣＤ４５、Ｖ４５０タグ付きＬｙ６Ｇ、およびＡｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ７００タグ付きＣＤ１１ｂ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ（商標）、ＵＳＡ）を、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳの１ｍｌあたり１μｇの濃度で用いて１時間染色した。細胞を洗浄し、フローサイトメーター（ＢＤ Ａｒｉａ ＩＩＩ、ＦＡＣＳ ＤＩＶＡソフトウェア、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡおよびＦｌｏｗＪｏソフトウェア－バージョン７．６．５）で分析し、ＳＳＣ－Ａ／ＣＤ４５＋（ＦＩＴＣ）細胞を手動でゲートし、この細胞集団の中のＬｙ６Ｇ＋細胞の％およびＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋細胞の％を定量した。
β１－インテグリンの発現の推定
新たに培養した好中球を、Ｖ４５０タグ付きＬｙ６Ｇ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ（商標）、ＵＳＡ）およびＡｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ４８８タグ付きβ１－Ｉｎｔｅｇｒｉｎ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）抗体とともに、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中１μｇ／ｍｌの濃度で１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、フローサイトメーター（ＢＤ Ａｒｉａ ＩＩＩ、ＦＡＣＳ ＤＩＶＡソフトウェア、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡおよびＦｌｏｗＪｏソフトウェア－バージョン７．６．５）を使用して分析した。Ｌｙ６Ｇ＋細胞を全細胞集団間でゲートし、β１－インテグリンの細胞表面発現（ＦＩＴＣ蛍光）をＬｙ６Ｇ＋細胞間で評価した１１。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットアッセイ
ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析を、先に記載されたように実施した１２。一次抗体は１：１０００の希釈で使用したが、二次抗体はすべて１：３０００の希釈で使用した。
組換えリポカリン－２（ＬＣＮ－２）タンパク質の調製
完全長ＬＣＮ－２ ｃＤＮＡは、ＧｅｎｅＳｃｉｐｔ、ＵＳＡによって合成された。ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ部位でｐＥＴ２８ａベクターにサブクローニングした。構築物は、増幅のためにＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５－α細胞に形質転換され、発現のためにＥ．ｃｏｌｉ Ｒｏｓｅｔｔａに形質転換された。母培養として単一コロニーを一晩増殖させた。母培養物の１０％を接種し、０．８～１．０ ＯＤまで増殖させ、０．５ ｍＭ ＩＰＴＧで２時間３７℃において誘導した。次に、細胞を、マイクロフュージ内で６０００ｒｐｍで１０分間、４℃において遠心分離することによりペレット化し、３００ｍＭのＮａＣｌおよび１０％のグリセロールを含む１０％の容量の２０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０に再懸濁した。混合物をそれぞれ６サイクルの３０秒間オンオフ超音波処理に供し、次に１２０００ｒｐｍで３０分間４℃において遠心分離した。製造元のプロトコルに従って、上清画分をニッケルＮＴＡ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ、ＵＳＡ）カラムに通した。カラムを、３００ ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロールおよび２０ｍＭイミダゾールを含む、ベッドボリュームの１０倍の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８．０で２回洗浄した。タンパク質を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、および３００ ｍＭイミダゾールを用いて、複数の画分でベッドボリュームの約５倍を用いて溶出した。タンパク質を１×ＰＢＳおよび５０％グリセロール中で４℃において一晩透析し、アリコートで－２０℃において保存した。
タンパク質間相互作用
ヒトプロテオームマイクロアレイ２．０分析を、ＣＤＩ ＮｅｘｔＧｅｎ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、ＭＤ、ＵＳＡの有料サービスとして実施した。組換えリポカリン－２を、ＨｕＰｒｏｔ（商標）ｖ３．１ヒトプロテオームアレイでタンパク質間相互作用プロファイリングのために分析し、サンプルを、アレイプレート上で１μｇ／ｍｌでプローブし、ＧｅｎｅＰｉｘソフトウェアを使用してデータを分析した。ヒットの識別は、マイクロアレイ上の各タンパク質プローブのフォアグラウンドの中央値と周囲のバックグラウンドの中央値との比率として評価し、その後、ウィンドウサイズ９×９×９内のすべての隣接プローブの中央値によって正規化して、ランダムノイズからのプローブ結合シグナルの差（Ｚスコア）の有意性として表した。Ｚスコアのカットオフは、この研究では、３連の分析で６であった。６を超えるＺスコアを有するタンパク質相互作用のみを考慮した１２。
ＥＬＩＳＡ
新たに摘出したマウスの眼から採取したＲＰＥ脈絡膜複合体を氷上に保持し、次いで組織５ｍｇあたり３００μＬの完全抽出バッファー（Ａｂｃａｍ、ＵＳＡ）でホモジナイズした。均質化した組織を、４℃で２時間一定の攪拌状態に保ち、１３，０００ ｒｐｍで４℃において２０分間遠心分離した。上清をアリコートにし、－８０℃で保存し、その後、前述のように、ＥＬＩＳＡを実行してＩＦＮλおよびＣＸＣＬ１のレベルを評価するために使用した１３。
ＲＮＡｓｅｑ分析
５ヶ月齢および１０ヶ月齢のＣｒｙｂａ１ｆｌ／ｆｌマウスおよびＣｒｙｂａ１ ｃＫＯマウス（ｎ＝４）からそれぞれ採取した摘出眼からのＲＰＥ－脈絡膜を、前述のように全ＲＮＡ単離に供した１２。約３０ｎｇ μｌ－１の全ＲＮＡを使用して、ＤＮＡ Ｌｉｎｋ、ＵＳＡからの有料サービスとしてＲＮＡシーケンシングを実行した。すべてのシーケンスリードを、ＣＬＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈに含まれているＲＮＡ－ｓｅｑマッピングアルゴリズムを使用して、参照ゲノム（ＮＣＢＩ３７／ｍｍ９）にマッピングした。マッピングで許可されるミスマッチの最大数を２に設定した。遺伝子発現レベルを推定し、異なるグループ間で差次的に発現する遺伝子を分析するために、ＲＰＫＭを前述のように計算した１４。
共免疫沈降
異なる実験条件でのＬＣＮ－２とＤａｂ－２との関連性を評価するために、組換えＩＦＮλ（２００ Ｕ ｍｌ－１）またはＩＦＮ－λ過剰発現ＲＰＥ細胞由来の馴化培地（１：１希釈）のいずれかで処理した培養好中球を、前述のように、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）Ｃｏ－Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、ＵＳＡ、２６１４９）を使用して共免疫沈降（Ｃｏ－ＩＰ）に供した１２。
ＡＫＴ２阻害剤の硝子体内注射
Ｃｒｙｂａ１ｆｌ／ｆｌおよびＣｒｙｂａ１ ｃＫＯマウス（雄、１２ヶ月齢、ｎ＝４）を、０．１５ ｍｌのケタミン（２．５ｍｇ／ｍｌ）＋キシラジン（０．５ ｍｇ／ｍｌ）混合物の腹腔内注射によって麻酔した。局所麻酔（塩酸プロパラカイン）を眼に適用し、瞳孔を局所２．５％塩酸フェニルエフリン点眼液の液滴で散大させた。鈍い湾曲した鉗子で下眼瞼をわずかに押し下げることによって眼を支え、滅菌生理食塩水で洗浄した。硝子体内注射では、３０ゲージの針を使用して、角膜輪部のすぐ後ろの眼に穴を開け、次に気密注射器（Ｈａｍｉｌｔｏｎ ｒｏｂｏｔｉｃｓ、ＵＳＡ）を使用して２μｌの阻害剤（ＰＢＳ中２．５％ＤＭＳＯ中の５００μＭのＣＣＴ１２８９３０）またはビヒクルのみ（ＰＢＳ中２．５％ＤＭＳＯ）を、週に１回、３週間硝子体内に注射した。すべての器具は蒸気オートクレーブで滅菌した。バシトラシン眼軟膏を術後に塗布した６。最初の注射の４週間後に動物をＣＯ２ガスで安楽死させ、網膜を採取した。
ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスへの好中球の硝子体内注射および光干渉断層撮影（ＯＣＴ）
ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウス（ＮＯＤ．ＣＢ１７－Ｐｒｋｄｅｓｃｉｄ／Ｊ，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳＡ、雄、４～５週齢）を研究に使用した。実験的な異常を無効にするために、大きなサンプルサイズ（ｎ＝１０）を取得した。マウスに麻酔をかけ、硝子体内注射を上記のように実施した。ＨＢＳＳ（ビヒクル対照）、組換えＬＣＮ－２（１０ ｐｇ ｍｌ－１）、または未処理か、または組換えＩＦＮλ（２００ Ｕ ｍｌ－１）もしくはＩＦＮ－λ過剰発現ＲＰＥ細胞由来のＩＦＮ－λ過剰発現ＲＰＥ馴化培地のいずれかで処理された新たに培養した好中球（５×１０４ 細胞を含むＨＢＳＳ）を、それぞれ、週に１回、２週間、各眼の硝子体に注射した６、１５。
最初の注射の３週間後、ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスをケタミンとキシラジンとの混合物の腹腔内注射によって麻酔し、次いでＢｉｏｐｔｉｇｅｎ Ｅｎｖｉｓｕ Ｒ２２１０システムを使用して眼底画像および光干渉断層撮影（ＯＣＴ）分析を行った。ＯＣＴ画像を、視神経乳頭（ＯＮＨ）に対して－２．０～＋２．０ ｍｍの範囲の各眼の光学的切片（網膜あたり１００切片）について、機器に付属のＦＩＪＩ－ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）プラグイン、およびＤｉｖｅｒ ２．４ソフトウェア（Ｂｉｏｐｔｉｇｅｎ）を使用して分析した１６。実験後、動物をＣＯ２ガスで安楽死させ、さらなる実験のために眼を採取した。
ヘマトキシリン－エオシン染色
ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色では、ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウス（ｎ＝１０）の眼を摘出し、最初に２．５％グルタルアルデヒドで７２時間固定し、続いて１０％緩衝ホルマリンで固定した。眼をメタクリル酸メチルに包埋し、前述のように切片化および染色した１７。
統計分析
一元配置分散分析を使用して、Ｗｉｎｄｏｗｓ用のＭｉｃｒｏｓｏｆｔ ＥｘｃｅｌおよびＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６ソフトウェアを使用して、統計分析を実行した。群平均を、テューキーの事後検定を使用して比較し、有意性をｐ＜０．０５に設定した。ヒトサンプルを使用した実験では、対照群とＡＭＤ群との比較を、有意性をｐ＜０．０５に設定して、マンホイットニー検定によって実行し、データ分布をシャピロ－ウィルク正規性検定によって決定した。箱ひげ図の中心線と端線は、それぞれ中央値と四分位範囲を示し、ひげは最も極端なデータポイントを示す。分析は、３連の技術的反復実験で実行した。結果を平均±標準偏差（ＳＤ）として表した３。
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１３． Ｂａｉｋ，Ｓ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｍｙｌｏｉｄ ｐｌａｑｕｅｓ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ．３５，１２８６－９２（２０１４）．
１４． Ｚｅｎａｒｏ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ ｐｒｏｍｏｔｅ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ－ｌｉｋｅ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｄｅｃｌｉｎｅ ｖｉａ ＬＦＡ－１ ｉｎｔｅｇｒｉｎ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２１，８８０－８８６（２０１５）．
１５． Ｐｉｅｔｒｏｎｉｇｒｏ，Ｅ．Ｃ．，Ｄｅｌｌａ Ｂｉａｎｃａ，Ｖ．，Ｚｅｎａｒｏ，Ｅ．，Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎ，Ｇ．ＮＥＴｏｓｉｓ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ．Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８，２１１（２０１７）．
１６． Ｄｏｎｇ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．８３，３８７－４０５（２０１８）．
１７． Ｌｅｃｈｎｅｒ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒ Ａｇｅ－Ｒｅｌａｔｅｄ Ｍａｃｕｌａｒ Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．５，１６７５４（２０１５）．
１８． Ｋｒｏｇｈ Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｍ．，Ｈｅｃｔｏｒ，Ｓ．Ｍ．，Ａｌｌｅｎ，Ｋ．，Ｓｕｂｈｉ，Ｙ．，Ｓoｒｅｎｓｅｎ，Ｔ．Ｌ．Ａｌｔｅｒｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｓｔａｔｅ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒ ａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｉｍｍｕｎ．Ａｇｅｉｎｇ．１４，１８（２０１７）．
１９． Ｖａｌａｐａｌａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｗａｓｔｅ ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｉｎ ｒｅｔｉｎａｌ ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｓ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ＣＲＹＢＡ１／βＡ３／Ａ１－ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎ ｖｉａ Ｖ－ＡＴＰａｓｅ－ＭＴＯＲＣ１ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ａｕｔｏｐｈａｇｙ．１０，４８０－４９６（２０１４）．
２０． Ｓｈａｎｇ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ＳＬＣ３６Ａ４ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｐｏｏｌ ｉｎ ｒｅｔｉｎａｌ ｐｉｇｍｅｎｔｅｄ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ｒａｐａｍｙｃｉｎ，ｃｏｍｐｌｅｘ １ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ａｇｉｎｇ Ｃｅｌｌ．１６（２），３４９－３５９（２０１７）．
２１． Ｇｈｏｓｈ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ａ Ｒｏｌｅ ｆｏｒ βＡ３／Ａ１－Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎ ｉｎ Ｔｙｐｅ ２ ＥＭＴ ｏｆ ＲＰＥ Ｃｅｌｌｓ Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｉｎ Ｄｒｙ Ａｇｅ－Ｒｅｌａｔｅｄ Ｍａｃｕｌａｒ Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．５９（４），ＡＭＤ１０４－ＡＭＤ１１３（２０１８）．
２２． Ｇｈｏｓｈ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｔｈｅ ＡＫＴ２－ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ－κＢ－ｌｉｐｏｃａｌｉｎ－２ ａｘｉｓ ｅｌｉｃｉｔｓ ａｎ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．２４１，５８３－５８８（２０１７）．
２３． Ｃｈｏｉ，Ｅ．Ｙ．，Ｓａｎｔｏｓｏ，Ｓ．，Ｃｈａｖａｋｉｓ，Ｔ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｔｒａｎｓｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ．Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ（Ｌａｎｄｍａｒｋ Ｅｄ）．１４，１５９６－６０５（２００９）．
２４．Ｐｒｏｅｂｓｔｌ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｐｅｒｉｃｙｔｅｓ ｓｕｐｐｏｒｔ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｓｕｂｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｃｒａｗｌｉｎｇ ａｎｄ ｂｒｅａｃｈｉｎｇ ｏｆ ｖｅｎｕｌａｒ ｗａｌｌｓ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０９，１２１９－１２３４（２０１２）．
２５． Ｇａｎｅ，Ｊ．，Ｓｔｏｃｋｌｅｙ，Ｒ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｃｒｏｓｓ ｔｈｅ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ ｉｎ ＣＯＰＤ．Ｔｈｏｒａｘ．６７，５５３－６１（２０１２）．
２６． Ｘｕ Ｎ，Ｈｏｓｓａｉｎ Ｍ，Ｌｉｕ Ｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｐ３８ ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅｓ ａｆｆｅｃｔｓ ＫＣ／ＣＸＣＬ１－ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎｔｒａｌｕｍｉｎａｌ ｃｒａｗｌｉｎｇ，ｔｒａｎｓｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ ｏｆ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ．Ｉｎｆｌａｍｍ．２０１３，２９０５６５（２０１３）．
２７． ｄｅ Ｏｌｉｖｅｉｒａ，Ｓ．，Ｒｏｓｏｗｓｋｉ，Ｅ．Ｅ．，Ｈｕｔｔｅｎｌｏｃｈｅｒ，Ａ．Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｗｏｕｎｄ ｒｅｐａｉｒ：ｇｏｉｎｇ ｆｏｒｗａｒｄ ｉｎ ｒｅｖｅｒｓｅ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６，３７８－９１（２０１６）．
２８． Ｌａｎｇｅｒｅｉｓ，Ｊ．Ｄ．Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ａｄｈｅｓｉｏｎ，ｍｉｇｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｌｅａｒａｎｃｅ．Ｃｅｌｌ．Ａｄｈ．Ｍｉｇｒ．７，４７６－８１（２０１３）．
２９． Ｙａｎｇ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．ＩＣＡＭ－１ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｅｌｌｕｌａｒ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＴＮＦ－ａｌｐｈａ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ ｕｎｄｅｒ ｆｌｏｗ．Ｂｌｏｏｄ．１０６，５８４－５９２（２００５）．
３０． Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｒ．Ｋ．，Ａｒｔｈｕｒ，Ｊ．Ｆ．，Ｇａｒｄｉｎｅｒ，Ｅ．Ｅ．Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｐｓ（ＮＥＴｓ）ａｎｄ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ ｉｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．１１２，６５９－６５（２０１４）．
３１． Ｇｅｓｔｅｒｍａｎｎ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｎｅｔｔｉｎｇ Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ Ａｃｔｉｖａｔｅ Ａｕｔｏｒｅａｃｔｉｖｅ Ｂ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｌｕｐｕｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００，３３６４－３３７１（２０１８）．
３２． Ｃｅｒｖａｎｔｅｓ－Ｌｕｅｖａｎｏ，Ｋ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ ｄｒｉｖｅ ｔｙｐｅ Ｉ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｗｉｓｋｏｔｔ－Ａｌｄｒｉｃｈ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１８）．
３３． ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ ａｎｄ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｐｓ ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｅ ｔｏ ｐｒｏｍｏｔｅ ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｓｅｐｓｉｓ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｂｌｏｏｄ．１２９，１３５７－１３６７（２０１７）．
３４． Ｙａｚｄａｎｉ，Ｈ．Ｏ．ｅｔ ａｌ．ＩＬ－３３ ｅｘａｃｅｒｂａｔｅｓ ｌｉｖｅｒ ｓｔｅｒｉｌｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｂｙ ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｐ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．（２０１７）．
３５． Ｐａｕｎｅｌ－Ｇｏｅｒｇｕｅｌｕｅ，Ａ．ｅｔ ａｌ．ｃｆＤＮＡ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｄａｍａｇｅ ａｆｔｅｒ ｃａｒｄｉａｃ ｓｕｒｇｅｒｙ ｗｉｔｈ ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ ｃａｒｄｉｏｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｂｙｐａｓｓ ａｎｄ ａｍｐｌｉｆｉｅｓ ＮＥＴｏｓｉｓ ｉｎ ａｎ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ＴＬＲ９－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍａｎｎｅｒ．Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．７，１７４２１（２０１７）．
３６． ｖａｎ ｄｅｒ Ｗｉｎｄｔ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｐｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｉｎ ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．（２０１８）．
３７． Ｏｄｏｂａｓｉｃ，Ｄ．，Ｋｉｔｃｈｉｎｇ，Ａ．Ｒ．，Ｓｅｍｐｌｅ，Ｔ．Ｊ．，Ｈｏｌｄｓｗｏｒｔｈ，Ｓ．Ｒ．Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｒｅｎａｌ ｉｎｊｕｒｙ ｂｕｔ ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ Ｔ ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｃｒｅｓｃｅｎｔｉｃ ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．１８，７６０－７０（２００７）．
３８． Ｆｕｊｉｅ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｅｌａｓｔａｓｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｏｌｅ ｉｎ ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ：ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｈｅ ｅｌａｓｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ＦＲ１３４０４３．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３７４，１１７－２５（１９９９）．
３９． Ｓａｈｏｏ，Ｍ．，Ｄｅｌ Ｂａｒｒｉｏ，Ｌ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｍ．Ａ．，Ｒｅ，Ｆ．Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｅｌａｓｔａｓｅ ｃａｕｓｅｓ ｔｉｓｓｕｅ ｄａｍａｇｅ ｔｈａｔ ｄｅｃｒｅａｓｅｓ ｈｏｓｔ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ ｌｕｎｇ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐｅｃｉｅｓ．ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ．１０，ｅ１００４３２７（２０１４）．
４０． Ｙａｎｇ，Ｒ．，Ｚｏｕ，Ｘ．，Ｔｅｎｈｕｎｅｎ，Ｊ．，Ｔoｎｎｅｓｓｅｎ，Ｔ．Ｉ．ＨＭＧＢ１ ａｎｄ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｈｉｓｔｏｎｅｓ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ ｔｏ Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｏｒｇａｎ Ｆａｉｌｕｒｅ ｉｎ Ａｃｕｔｅ Ｌｉｖｅｒ Ｆａｉｌｕｒｅ．Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ Ｉｎｆｌａｍｍ．２０１７，５９２８０７８（２０１７）．
４１． Ｖａｌａｐａｌａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｉｍｐａｉｒｅｄ ｅｎｄｏｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｄｉｓｒｕｐｔｓ Ｎｏｔｃｈ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｉｎ ｏｐｔｉｃ ｎｅｒｖｅ ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．４，１６２９（２０１３）．
４２． Ｖａｌａｐａｌａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ Ｌｉｐｏｃａｌｉｎ－２ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｔｉｎａｌ ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ ｏｆ Ｃｒｙｂａ１ ｃＫＯ ｍｉｃｅ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｃｈｒｏｎｉｃ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ａｇｉｎｇ ｃｅｌｌ．１３，１０９１－４（２０１４）．
４３． Ｔｅｃｋｃｈａｎｄａｎｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ａ Ｄａｂ２／ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｍｏｄｕｌｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８６，９９－１１１（２００９）．
４４． ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｂｅｔａ１ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｎ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｂｅｔａ２ ｉｎｔｅｇｒｉｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｔｏ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１（１），２７６－２８４（２００１）．
４５． Ｓｉｌｖｅｉｒａ，Ａ．Ａ．Ａ．ｅｔ ａｌ．ＴＮＦ ｉｎｄｕｃｅｓ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｖｉａ ｆｏｒｍｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ ｒｅｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ β－ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．１０３，８７－９８（２０１８）．
４６． Ｓａｒａｎｇｉ，Ｐ．Ｐ．，Ｈｙｕｎ，Ｙ．Ｍ．，Ｌｅｒｍａｎ，Ｙ．Ｖ．，Ｐｉｅｔｒｏｐａｏｌｉ，Ａ．Ｐ．，Ｋｉｍ，Ｍ．Ｒｏｌｅ ｏｆ β１ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｉｎ ｔｉｓｓｕｅ ｈｏｍｉｎｇ ｏｆ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ ｄｕｒｉｎｇ ｓｅｐｓｉｓ．Ｓｈｏｃｋ．３８，２８１－２８７（２０１２）．
４７．Ｈａｎｌｏｎ，Ｓ．Ｄ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｃ．Ｗ．，Ｓａｕｔｅｒ，Ｍ．Ｎ．，Ｂｕｒｎｓ，Ａ．Ｒ．Ｉｎｔｅｇｒｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｊｕｒｅｄ ｍｏｕｓｅ ｃｏｒｎｅａ．Ｅｘｐ．Ｅｙｅ．Ｒｅｓ．１２０，６１－７０（２０１４）．
４８． Ｐａｒｍａｒ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｌｉｐｏｃａｌｉｎ ２ Ｐｌａｙｓ ａｎ Ｉｍｐｏｒｔａｎｔ Ｒｏｌｅ ｉｎ Ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｉｎ Ｒｅｔｉｎａｌ Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１８ Ｍａｙ １；２００（９）：３１２８－３１４１．
４９． Ｙａｐ，Ｔ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ，ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃ ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｎｏｖｅｌ，ｐｏｔｅｎｔ ＡＫＴ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＣＣＴ１２８９３０．Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．１０（２），３６０－３７１（２０１１）．
５０． Ｂｏｎｉｌｈａ，Ｖ．Ｌ．Ａｇｅ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｔｉｎａｌ ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ．Ｃｌｉｎ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．２，４１３－２４（２００８）．
５１． Ｗａｎｇ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．ＡＴＡＣ－Ｓｅｑ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｖｅａｌｓ ａ ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｏｆ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．９，１３６４（２０１８）．
５２． Ａｇｅ－Ｒｅｌａｔｅｄ Ｅｙｅ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｓｔｕｄｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｒｏｕｐ．Ａ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，ｐｌａｃｅｂｏ－ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ，ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌ ｏｆ ｈｉｇｈ－ｄｏｓｅ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｖｉｔａｍｉｎｓ Ｃ ａｎｄ Ｅ，ｂｅｔａ ｃａｒｏｔｅｎｅ，ａｎｄ ｚｉｎｃ ｆｏｒ ａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｖｉｓｉｏｎ ｌｏｓｓ：ＡＲＥＤＳ ｒｅｐｏｒｔ ｎｏ．８．Ａｒｃｈ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１２６，１２５１（２００８）．
５３． Ｃｈｅｗ，Ｅ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｖｉｔａｍｉｎｓ Ｃ ａｎｄ Ｅ，β－ｃａｒｏｔｅｎｅ，ａｎｄ ｚｉｎｃ ｏｎ ａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：ＡＲＥＤＳ ｒｅｐｏｒｔ ｎｏ．３５．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ．１２０，１６０４－１１．ｅ４（２０１３）．
５４． Ｎｇｕｙｅｎ，Ｃ．Ｌ．，Ｏｈ，Ｌ．Ｊ．，Ｗｏｎｇ，Ｅ．，Ｗｅｉ，Ｊ．，Ｃｈｉｌｏｖ，Ｍ．Ａｎｔｉ－ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｆｏｒ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒ ａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：ａ ｍｅｔａ－ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｒｉａｌｓ．ＢＭＣ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１８，１３０（２０１８）．
５５． Ａｄｒｅａｎ，Ｓ．Ｄ．，Ｃｈａｉｌｉ，Ｓ．，Ｒａｍｋｕｍａｒ，Ｈ．，Ｐｉｒｏｕｚ，Ａ．，Ｇｒａｎｔ，Ｓ．Ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ Ｌｏｎｇ－Ｔｅｒｍ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒ Ａｇｅ－Ｒｅｌａｔｅｄ Ｍａｃｕｌａｒ Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｍａｎａｇｅｄ ｂｙ ５０ ｏｒ Ｍｏｒｅ Ａｎｔｉ－ＶＥＧＦ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｔｒｅａｔ－Ｅｘｔｅｎｄ－Ｓｔｏｐ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ．１２５，１０４７－１０５３（２０１８）．
Figure 2022512706000003

Claims (9)

  1. 眼血管疾患の処置に使用するためのＡｋｔ阻害剤。
  2. 前記眼血管疾患が、加齢性黄斑変性症、滲出型加齢性黄斑変性症、網膜色素変性症、糖尿病性網膜症および地図状萎縮である、請求項１に記載のＡｋｔ阻害剤。
  3. Ａｋｔ２阻害剤である、請求項１または２に記載のＡｋｔ阻害剤。
  4. 小分子である、請求項１から３に記載のＡｋｔ阻害剤。
  5. 有効量のＡｋｔ阻害剤をそれを必要とする対象に投与することを含む、眼血管疾患の処置方法。
  6. 前記眼血管疾患が、加齢性黄斑変性症、滲出型加齢性黄斑変性症、網膜色素変性症、糖尿病性網膜症および地図状萎縮である、請求項５に記載の方法。
  7. 前記Ａｋｔ阻害剤がＡｋｔ２阻害剤である、請求項５または６に記載の方法。
  8. 前記Ａｋｔ阻害剤が小分子である、請求項５から７に記載の方法。
  9. 前記Ａｋｔ阻害剤が経口投与される、請求項８に記載の方法。
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