CN112888440A - Akt抑制剂在眼科中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了Akt抑制剂用于治疗眼部血管疾病，特别是年龄相关性黄斑变性的用途。

Description

Akt抑制剂在眼科中的用途
本发明涉及Akt抑制剂在治疗眼部血管疾病，特别是年龄相关性黄斑变性(AMD)中的用途。
年龄相关性黄斑变性(AMD)是一种进行性变性黄斑疾病，攻击视敏度(VA)最高的区域即黄斑，并且是60岁或以上美国人失明的主要原因(NIH Medline Plus(2008),Leading cause of blindness,NIH Medline Plus 3(2)14-15.www.nlm.nih.gov/medlineplus/magazine/issues/summer08/articles/summer08pgl4-15.html)。该疾病的新生血管“湿性”形式(nAMD或湿生AMD)的特征在于脉络膜新生血管形成，其标志为血管和细胞的增生，包括视网膜色素上皮(RPE)的血管和细胞的增生(Carmeliet(2005)Nature438:932-936)。最终，光感受器死亡和疤痕形成导致严重的中心视力丧失和不能阅读、书写和识别面部或驾驶。许多患者不再能够维持有酬的工作、进行日常活动并因此报告生活质量下降(Mitchell and Bradley(2006),Health Qual Life Outcomes 4:97)。预防性疗法已证明收效甚微，并且治疗策略主要集中在治疗新生血管病变上。
一些当前可用于湿性AMD的治疗包括激光光凝术、使用维替泊芬(verteporfin)的光动力疗法以及使用血管内皮生长因子(VEGF)抑制剂诸如培加尼布(pegaptanib)、兰尼单抗(ranibizumab)、贝伐单抗(bevacizumab)或阿柏西普(aflibercept)的玻璃体内(IVT)注射(Schmidt-Erfurth,(2014)Guidelines for the management of neovascular age-related macular degeneration by the European Society of Retina Specialists(EURETINA)Br J Ophthalmol 98:1144-1167)。虽然这些疗法对最佳矫正视敏度(BCVA)具有一些效果，但它们在恢复视敏度和持续时间方面的效果可能是有限的(Schmidt-Erfurth，如上所述，2014,AAO PPP(2015)Preferred Practice Patterns:Age RelatedMacular Degeneration.American Academy of Ophthalmology)。
市场上用于治疗湿性AMD的几种药物依赖于抑制VEGF的机制，并且必须进行玻璃体内注射。虽然据报道这些疗法成功地阻止了疾病的进展，但是它们需要频繁地注射药物。
发明内容
AKT是一种在小鼠白血病病毒中被鉴定为癌基因的丝氨酸-苏氨酸激酶，并且已经揭示其活性对于多种功能诸如细胞增殖、存活、代谢、转移和侵入是重要的(Cell,129,第1261-1274页(2007)；Cell Cycle.7.第2991-2996页(2008))。在人类中，已经报道了三种同工型(AKT1/PKBα、AKT2/PKBβ和AKT3/PKBγ)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84.第5034-5037页(1987)；J.Biol Chem.274.第9133-9136页(1999))。AKT的活化涉及通过与PI3激酶生成的磷脂酰肌醇3-磷酸结合而定位到质膜，并被多种激酶磷酸化(FEBS Letters.546.第108-112页(2003))。在许多癌症(例如乳腺癌、胰腺癌、肝癌、前列腺癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、头颈癌、尿道癌和子宫内膜癌)中，据报道活化的AKT的表达通过由于突变等引起的PI3激酶的活化或其负调节因子PTEN的失活而增强(Nature Reviews Drug Discovery,8,第627-644页(2009))。另外，据报道，在各种癌症(例如乳腺癌、胰腺癌、肝癌、前列腺癌、胃癌和子宫内膜癌)中，活化的AKT的表达增强与不良预后有关(Anticancer Research,18,第861-874页(2007))。
在本发明中，Akt抑制剂是指能够在核酸水平和/或蛋白质水平上抑制AKT的表达和/或活性的分子。本领域可用的Akt抑制剂可用于本发明。例如，合适的小分子Akt抑制剂在EP2698372、US20070185152、US20080255143、US20080269131、US20090227616、US20100056523、US20100137338、US20110053972、US20110071182、WO2005046678、WO2006113837、WO2007076320、WO2007076423、WO2008121685、WO2009032651、WO2009032652、WO2009032653、WO2009158371、WO2009158372、WO2009158373、WO2009158374、WO2009158376、WO2010019637和George Mihai Nitulescu等人,International Journal of Oncology 48:869-885,2016中进行了公开。
另选地，Akt抑制剂可以是mRNA干扰RNA分子；或者可以是Akt蛋白质的拮抗剂，例如配体、适体或抗体。在一个实施方案中，Akt抑制剂是针对Akt蛋白质的抗体。在另一个实施方案中，Akt抑制剂是双链RNA(dsRNA)，例如，短干扰RNA(siRNA)或短发夹RNA(shRNA)。双链RNA可以是任何类型的RNA，包括但不限于mRNA、snRNA、微小RNA和tRNA。RNA干扰(RNAi)对于特异性抑制特定RNA和/或蛋白质的产生是特别有用的。适用于本发明的dsRNA分子的设计和生产在本领域技术人员的技术范围内，特别是参考Waterhouse等人(1998)、Smith等人(2000)、WO 99/32619、WO 99/53050、WO 99/49029和WO 01/34815。优选地，siRNA分子包含具有与靶mRNA相同的约19至23个连续核苷酸的核苷酸序列。术语“shRNA”是指这样的siRNA分子，其中少于约50个核苷酸与同一RNA分子上的互补序列配对，该序列和互补序列被至少约4至15个核苷酸的未配对区域隔开(在由两个碱基互补区域产生的茎结构上形成单链环)。存在公认的siRNA设计标准(参见例如，Elbashire等人，2001)。
在本发明的另一个方面，Akt抑制剂可以是反义寡核苷酸，其能够通过与靶核酸，特别是与靶核酸上的连续序列杂交来调节靶基因的表达。反义寡核苷酸基本上不是双链的，因此不是siRNA或shRNA。优选地，反义寡核苷酸是单链的。应当理解，单链寡核苷酸可以形成发夹或分子间双链体结构(同一寡核苷酸的两个分子之间的双链体)，只要其内部或相互间自身互补性的程度在寡核苷酸全长上小于50％。
在本发明的一个实施方案中，Akt抑制剂是Akt2选择性或特异性抑制剂。在本发明中，当用于抑制剂时，术语“选择性”和“特异性”可互换使用，意指该抑制剂仅对靶标具有抑制作用，或对靶标具有比对其他化合物或分子更高的抑制作用，例如高至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、500、1000、10000倍等。例如，CCT128930(Selleckchem)是一种有效的ATP竞争性选择性Akt2抑制剂，其在无细胞测定中的ICSO值为6nM，对Akt2的选择性是密切相关的PKA激酶的28倍。
术语“眼部血管疾病”和“血管眼病”在本文中可互换使用，并且包括但不限于眼内新生血管综合征诸如糖尿病性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、早产儿视网膜病、新生血管性青光眼、视网膜静脉闭塞、视网膜中央静脉闭塞、黄斑变性、年龄相关性黄斑变性、色素性视网膜炎、视网膜血管瘤增生、黄斑毛细血管扩张、缺血性视网膜病、虹膜新生血管形成、眼内新生血管形成、角膜新生血管形成、视网膜新生血管形成、脉络膜新生血管形成和视网膜变性。(Garner,A.,Vascular diseases,In:Pathobiology of ocular disease,A dynamicapproach,Garner,A.,and Klintworth,G.K.,(编),第2版,Marcel Dekker,New York(1994),第1625-1710页)。如本文所用，眼部血管障碍是指以新血管的改变或不受调节的增生和侵入到诸如视网膜或角膜的眼部组织的结构中为特征的任何病理状况。在一个实施方案中，眼部血管疾病选自由以下项组成的组：湿性年龄相关性黄斑变性(湿性AMD)、干性年龄相关性黄斑变性(干性AMD)、糖尿病性黄斑水肿(DME)、黄斑囊样水肿(CME)、非增生性糖尿病性视网膜病变(NPDR)、增生性糖尿病性视网膜病变(PDR)、黄斑囊样水肿、血管炎(例如视网膜中央静脉闭塞)、视乳头水肿、视网膜炎、结膜炎、葡萄膜炎、脉络膜炎、多灶性脉络膜炎、眼组织胞浆菌病、睑缘炎、干眼症(舍格伦氏病)和其他眼科疾病，其中眼病或障碍与眼部新生血管形成、血管渗漏和/或视网膜水肿有关。因此，根据本发明的Akt抑制剂可用于预防和治疗湿性AMD、干性AMD、CME、DME、NPDR、PDR、睑缘炎、干眼症和葡萄膜炎，还优选地湿性AMD、干性AMD、睑缘炎和干眼症，还优选地CME、DME、NPDR和PDR，还优选地睑缘炎和干眼症，特别是湿性AMD和干性AMD，还特别是湿性AMD。在一些实施方案中，眼部疾病选自由以下项组成的组：湿性年龄相关性黄斑变性(湿性AMD)、黄斑水肿、视网膜静脉闭塞、早产儿视网膜病和糖尿病性视网膜病变。
与角膜新生血管形成相关的其他疾病包括但不限于流行性角膜结膜炎、维生素A缺乏症、隐形眼镜过戴、特应性角膜炎、上边缘性角膜炎、翼状胬肉干性角膜炎、舍格伦综合征、玫瑰痤疮、疱性角结膜病、梅毒、分枝杆菌感染、脂质变性、化学灼伤、细菌性溃疡、真菌性溃疡、单纯疱疹感染、带状疱疹感染、原生动物感染、卡波西肉瘤、蚕食性角膜溃疡、Terrien角膜边缘变性、周边溃疡性角膜炎、类风湿性关节炎、系统性狼疮、多动脉炎、创伤、韦格纳结节病、巩膜炎、史蒂文斯-约翰逊病、类天疱疮放射状角膜切开术和角膜移植排斥。
与视网膜/脉络膜新生血管形成相关的疾病包括但不限于糖尿病性视网膜病变、黄斑变性、镰状细胞性贫血、结节病、梅毒、弹性假黄瘤、佩吉特氏病、静脉闭塞、动脉闭塞、颈动脉阻塞性疾病、慢性葡萄膜炎/玻璃体炎、分枝杆菌感染、莱姆病、系统性红斑狼疮、早产儿视网膜病、色素性视网膜炎、视网膜水肿(包括黄斑水肿)、伊尔斯病、白塞病、引起视网膜炎或脉络膜炎的感染、假定眼组织胞浆菌病、白斯特氏病、近视、视凹、斯塔加特氏病、睫状体平坦部炎、慢性视网膜脱离、高粘滞综合症、弓形虫病、创伤和激光手术后并发症。其他疾病包括但不限于与虹膜红变(角的新生血管形成)有关的疾病和由纤维血管或纤维组织的异常增生引起的疾病，包括所有形式的增生性玻璃体视网膜病变。
早产儿视网膜病(ROP)是一种影响早产儿的眼病。据认为是由于视网膜血管生长紊乱引起的，可能导致瘢痕形成和视网膜脱离。ROP可以是温和的并且可自发地消退，但在严重的情况下可导致失明。因此，所有早产儿都有发生ROP的风险，并且极低的出生体重是另外的风险因素。氧毒性和相对低氧均可能促进ROP的发展。
黄斑变性是一种主要在老年人中发现的医学病症，其中被称为视网膜黄斑区域的眼内层的中心会变薄、萎缩，并且在一些情况下出血。这可能导致中心视力丧失，这使得无法看到精细的细节、阅读或识别面部。据American Academy of Ophthalmology称，它是当今美国五十岁以上人群中心视力丧失(失明)的主要原因。尽管影响年轻个体的一些黄斑营养不良有时被称为黄斑变性，但该术语一般是指年龄相关性黄斑变性(AMD或ARMD)。
年龄相关性黄斑变性开始于视网膜色素上皮和下层脉络膜之间的称为玻璃疣的黄斑(提供详细的中心视力的视网膜中央区域，称为中央凹)中的特征性黄色沉积。大多数具有这些早期变化的人(称为年龄相关性黄斑病)具有良好的视力。患有玻璃疣的人可继续发展为晚期AMD。当玻璃疣大且多并且与黄斑下的色素细胞层中的紊乱相关时，风险显著更高。大而软的玻璃疣与升高的胆固醇沉积有关，并且可能对胆固醇降低剂或Rheo规程有反应。
造成深度视力丧失的晚期AMD有两种形式：干性和湿性。中央地图状萎缩，即晚期AMD的干性形式，是由视网膜下的视网膜色素上皮层的萎缩引起的，这种萎缩通过眼中心部分的光感受器(视杆和视锥)的损失而导致视力丧失。尽管尚无针对这种病症的治疗方法，但美国国立眼科研究所和其他机构已证明，维生素补充剂和高剂量的抗氧化剂，黄体素和玉米黄质可减缓干性黄斑变性的进展，并在一些患者中改善视敏度。
色素性视网膜炎(RP)是一组遗传性眼病症。在RP症状的进展中，夜盲症通常先于管状视力数年或甚至数十年。许多患有RP的人直到40多岁或50多岁才在法律上变得失明，并终生都保持一些视力。其他人对RP完全视而不见，在某些情况下甚至早在儿童时期也是如此。RP的进展在每种情况下是不同的。RP是一种遗传性视网膜营养不良，是一组遗传性障碍，其中视网膜的光感受器(视杆和视锥)或视网膜色素上皮细胞(RPE)的异常导致进行性视力丧失。受影响的个体首先经历有缺陷的暗适应或夜视(夜盲症)，其次是周围视野降低(称为管状视力)，并且有时在病程后期丧失中心视力。
当流体和蛋白质沉积物聚集在眼的黄斑上或黄斑下(视网膜的黄色中心区域)，导致其变厚和肿胀时，发生黄斑水肿。由于黄斑位于眼球后部视网膜中心附近，因此肿胀可能扭曲人的中心视力。该区域保持紧密排列的视锥，其提供清晰、清楚的中心视力，以使人能够看到直接在视线中的形式、颜色和细节。黄斑囊样水肿是一种包括囊肿形成的黄斑水肿。
联合疗法：在某些实施方案中，根据本发明的Akt抑制剂或药物组合物单独施用(不与另外的治疗剂一起)以用于治疗本文所述的一种或多种眼部血管疾病。
在其他实施方案中，根据本发明的Akt抑制剂或药物组合物与一种或多种另外的治疗剂或方法组合施用以用于治疗本文所述的一种或多种眼部血管疾病。
在其他实施方案中，根据本发明的Akt抑制剂或药物组合物与一种或多种另外的治疗剂组合配制并施用以用于治疗本文所述的一种或多种眼部血管疾病。
在某些实施方案中，本文所提供的联合治疗包括施用根据本发明的Akt抑制剂或药物组合物与一种或多种另外的治疗剂顺序施用，以用于治疗本文所述的一种或多种眼部血管疾病。
另外的治疗剂包括但不限于色氨酰-tRNA合成酶(TrpRS)、Eye001(抗VEGF聚乙二醇化适体)、角鲨胺、RETAANE(TM)(用于贮库悬浮液的醋酸阿奈可他；Alcon,Inc.)、考布他汀A4前药(CA4P)、MACUGEN(TM)、MIFEPREX(TM)(米非司酮-ru486)、筋膜囊下曲安奈德、玻璃体内结晶曲安奈德、普啉司他(AG3340-合成基质金属蛋白酶抑制剂，Pfizer)、醋酸氟轻松(包括氟轻松眼内植入物，Bausch&Lomb/Control Delivery Systems)、VEGFR抑制剂(Sugen)、VEGF-Trap(Regeneron/Aventis)、VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂(诸如4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(l-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(ZD6474)、4-(4-氟-2-甲基吲哚-5-基氧基)-6-甲氧基-7-(3-吡咯烷-1-基丙氧基)喹唑啉(AZD2171)、瓦他拉尼(vatalanib)(PTK787)和SU1 1248(舒尼替尼))、利诺胺(linomide)以及整联蛋白v.β.3功能和血管生成抑素(angiostatin)的抑制剂。
施用可与根据本发明的Akt抑制剂或药物组合物联合施用的其他药物疗法，包括但不限于使用非热激光器的VISUDYNE(TM)、PKC 412、Endovion(NeuroSearch A/S)、神经营养因子(包括例如神经胶质来源的神经营养因子和睫状神经营养因子)、diatazem、多佐胺、向光素(Phototrop)、9-顺式-视黄醛、包括碘依可酯(phospholine iodide)或依可酯(echothiophate)或碳酸酐酶抑制剂的眼用药物(包括回声疗法)、AE-941(AEternaLaboratories,Inc.)、Sirna-027(Sima Therapeutics,Inc.)、培加尼布(NeXstarPharmaceuticals/Gilead Sciences)、神经营养蛋白(仅作为示例，包括NT-4/5，Genentech)、Cand5(Acuity Pharmaceuticals)、INS-37217(Inspire Pharmaceuticals)、整联蛋白拮抗剂(包括来自Jerini AG and Abbott Laboratories的那些)、EG-3306(ArkTherapeutics Ltd.)、BDM-E(BioDiem Ltd.)、沙利度胺(例如由EntreMed,Inc.使用)、心肌营养素-1(Genentech)、2-甲氧基雌二醇(Allergan/Oculex)、DL-8234(TorayIndustries)、NTC-200(Neurotech)、四硫代钼酸盐(University of Michigan)、LYN-002(Lynkeus Biotech)、微藻化合物(Aquasearch/Albany,Mera Pharmaceuticals)、D-9120(Celltech Group pic)、ATX-S10(Hamamatsu Photonics)、TGF-β2(Genzyme/Celtrix)、酪氨酸激酶抑制剂(Allergan,SUGEN,Pfizer)、NX-278-L(NeXstar Pharmaceuticals/GileadSciences)、opt-24(OPTIS France SA)、视网膜细胞神经节神经保护剂(CogentNeurosciences)、N-硝基吡唑衍生物(Texas A&M University System)、KP-102(KrenitskyPharmaceuticals)、环孢菌素A、局限性视网膜转位术、光动力疗法(仅作为示例，包括受体靶向的PDT，Bristol-Myers Squibb,Co.；注射用PDT的卟吩姆钠；维替泊芬，QLT Inc.；用于PDT的罗培泊芬，Miravent Medical Technologies；用于PDT的他拉泊芬钠，NipponPetroleum；莫特沙芬镥(motexafin lutetium)，Pharmacyclics,Inc.)、反义寡核苷酸(包括例如由Novagali Pharma SA测试的产品和ISIS-13650，Isis Pharmaceuticals)、激光光凝术、玻璃疣激光术、黄斑裂孔手术、黄斑转位手术、可植入微型望远镜、Phi-运动血管造影术(也称为微激光治疗和滋养血管(Feeder Vessel)治疗)、质子束治疗、微刺激治疗、视网膜脱离和玻璃体手术、巩膜扣带术(Scleral Buckle)、黄斑下手术(Submacular Surgery)、经瞳孔热疗、光系统I治疗、使用RNA干扰(RNAi)、体外流变术(也称为膜分化过滤和流变疗法)、微芯片植入、干细胞疗法、基因替代疗法、核酶基因疗法(包括用于缺氧反应元件的基因疗法，Oxford Biomedica；Lentipak，Genetix；PDEF基因疗法，GenVec)、光感受器/视网膜细胞移植(包括可移植的视网膜上皮细胞，Diacrin,Inc.；视网膜细胞移植，Cell Genesys,Inc.)和针灸。
任何抗血管生成剂可与根据本发明的Akt抑制剂或药物组合物组合使用，包括但不限于Carmeliet and Jain,2000,Nature 407:249-257所列的那些。在某些实施方案中，抗血管生成剂是VEGF拮抗剂或VEGF受体拮抗剂，诸如VEGF变体、可溶性VEGF受体片段、能够阻断VEGF或VEGFR、中和抗VEGFR抗体的适体、VEGFR酪氨酸激酶的低分子量抑制剂、以及它们的任何组合，并且这些包括抗VEGF适体(例如培加尼布)、可溶性重组诱饵受体(例如VEGFTrap)。在某些实施方案中，抗血管生成剂包括皮质类固醇、血管抑制性类固醇、醋酸阿奈可他、血管抑素、内皮抑素、降低VEGFR或VEGF配体表达的小干扰RNA、用酪氨酸激酶抑制剂进行的VEGFR后阻断、MMP抑制剂、IGFBP3、SDF-1阻断剂、PEDF、γ-分泌酶、δ-样配体4、整联蛋白拮抗剂、HIF-1α阻断剂、蛋白激酶CK2阻断剂，以及使用血管内皮钙粘着蛋白(CD-144)和基质衍生因子(SDF)-I抗体抑制干细胞(即内皮祖细胞)归巢至新生血管形成部位。也可使用靶向VEGF受体的小分子RTK抑制剂，包括PTK787。也可使用具有抗新生血管形成活性的药剂，其不一定是抗VEGF化合物，并且包括抗炎药、m-Tor抑制剂、雷帕霉素、依维莫司、替西罗莫司、环孢素、抗TNF剂、抗补体剂和非甾体抗炎剂。也可使用具有神经保护作用并可能潜在地减缓干性黄斑变性进展的药剂，例如称为“神经甾体”的药物类别。这些药物包括诸如脱氢表雄酮(DHEA)(商标名称：Prastera(R)和Fidelin(R))、硫酸脱氢表雄酮和硫酸孕烯醇酮。任何AMD(年龄相关性黄斑变性)治疗剂均可与根据本发明的Akt抑制剂或药物组合物组合使用，包括但不限于维替泊芬与PDT、培加尼布钠、锌或抗氧化剂的组合，单独或以任何组合使用。
术语“受试者”和“患者”可互换使用，并且是指哺乳动物诸如人类患者和非人灵长类，以及实验动物诸如兔、大鼠和小鼠，以及其他动物。动物包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，诸如狗、猫、羊、牛、猪、兔、鸡等。用于实施本发明的治疗方法的优选受试者是人。需要治疗的受试者包括已经患有眼部血管疾病或障碍的患者以及易于发展该障碍的那些患者。
Akt抑制剂和Akt抑制剂的药用盐可用作药物，例如，以药物制剂的形式。药物制剂可例如以片剂、包衣片剂、糖衣丸、硬和软明胶胶囊、溶液、乳液或悬浮液的形式经口施用。但是，施用也可经直肠(例如以栓剂的形式)、经肠胃外(例如以注射溶液的形式)实施。施用也可局部(例如经皮施用)或以滴眼剂或滴耳剂的形式实施。
可将Akt抑制剂与药学惰性的无机或有机载剂一起加工以生产药物制剂。例如，乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、硬脂酸或其盐等可作为此类载剂用于片剂、包衣片剂、糖衣丸和硬明胶胶囊。用于软明胶胶囊的合适载剂是例如植物油、蜡、脂肪、半固体和液体多元醇等。然而，根据活性物质的性质，在软明胶胶囊的情况下通常不需要载剂。用于生产溶液和糖浆的合适载剂是例如水、多元醇、甘油、植物油等。用于栓剂的合适载剂是例如天然或硬化的油、蜡、脂肪、半液体或液体多元醇等。
此外，药物制剂可包含防腐剂、增溶剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、甜味剂、着色剂、调味剂、用于改变渗透压的盐、缓冲剂、掩蔽剂或抗氧化剂。它们还可包含其他具有治疗价值的物质。
包含Akt抑制剂或其药用盐和治疗惰性载剂的药物也是本发明的目的，它们的制备方法也是本发明的目的，该方法包括将一种或多种Akt抑制剂和/或药用酸加成盐和(如果需要)一种或多种其他治疗上有价值的物质与一种或多种治疗惰性载剂一起制成盖伦制剂施用形式。
剂量可在宽范围内变化，当然必须根据每种特定情况的个体需求调节。在口服施用的情况下，成人的剂量可在每天约0.01mg至约1000mg通式I的化合物或相应量的其药用盐的范围内变化。日剂量可作为单剂量或以分剂量施用，此外，当发现需要时，也可超出上限。
片剂配方(湿法制粒)
Figure BDA0003022471690000121
制造工序
1.混合项目1、2、3和4并用纯化水制粒。
2.在50℃干燥颗粒。
3.令颗粒通过合适的研磨设备。
4.添加项目5并混合三分钟；在合适的压机上压制。
胶囊配方
Figure BDA0003022471690000122
制造工序
1.将项目1、2和3在合适的混合器中混合30分钟。
2.添加项目4和5并混合3分钟。
3.填充到合适的胶囊中。
本发明还提供了试剂盒，其包括Akt抑制剂和说明书(例如，在标签或包装插页上，诸如对受试者或对临床医生的说明书)，用于向受试者施用Akt抑制剂以治疗、预防和/或延迟AMD的发展或进展。
有效量是足以提供医学上期望结果的Akt抑制剂剂量。有效量将随所治疗的特定病症、所治疗的受试者的年龄和身体状况、病症的严重程度、治疗的持续时间、并行治疗(如果有的话)的性质、具体的施用途径以及在健康从业者的知识和专长范围内的类似因素而变化。
附图说明
图1：嗜中性粒细胞浸润到具有衰老相关的非新生血管性AMD样表型的小鼠模型和人早期AMD供体组织的视网膜中。
图1a：流式细胞术分析揭示，与年龄匹配的对照(Cryba1fl/fl)相比，在老龄(15月龄)的Cryba1 cKO小鼠视网膜中的白细胞(CD45+；FITC细胞)门控群体中，嗜中性粒细胞(Ly6G+；V450和CD11b(Alexa Fluor 700)，Ly6G双阳性细胞)的百分比增加。在3个月大时，在Cryba1fl/fl和cKO视网膜之间未观察到此类变化。平均值±标准差针对n＝4个生物学重复样。
图1b：用针对NE(嗜中性粒细胞特异性标志物-Alexa fluor 488；绿色)和MPO(活化的嗜中性粒细胞标志物-Alexa fluor 555；红色)的抗体对来自早期AMD供体的组织切片的免疫荧光标记显示，嗜中性粒细胞(i)与视网膜血管(星号)的内皮细胞(白色箭头)显著缔合，并且(ii)位于视网膜下的玻璃疣沉积物(白色箭头)的表面上。然而，在对照样品(iii)中，检测到的嗜中性粒细胞(星号)较少，并且它们对MPO呈阴性。n＝3；比例尺：50μm。
图1c：ELISA揭示，与年龄匹配的Cryba1fl/fl对照相比，在15月龄Cryba1 cKO小鼠的RPE-脉络膜组织匀浆中，(i)CXCL1、(ii)IFNα和(iii)IFNλ的水平(pg ml-1)增加。在3月龄的小鼠中未观察到统计学上的显著变化。平均值±标准差，n＝4。
图1d：代表性免疫印迹和柱状图显示，与年龄匹配的对照相比，CXCL1和IFNλ在来自早期AMD供体样品的RPE裂解物中的表达升高。平均值±标准差；n＝3。*P<0.05；**P<0.01。所有P值均通过单向ANOVA和Tukeys事后检验进行评估。Ly6G：淋巴细胞抗原6复合物基因座G6D；CD11b：分化簇11b；CD45：分化簇45；fl/fl：floxed/floxed；cKO：条件性敲除；NE：嗜中性粒白细胞弹性蛋白酶；MPO：髓过氧化物酶；DAPI：4',6-二脒基-2-苯基吲哚；AMD：年龄相关性黄斑变性；CXCL1：趋化因子(C-X-C基序)配体1，IFNα：干扰素α；IFNλ：干扰素λ。
图2：AMD患者中干扰素(IFN)和活化的IL-28R1+嗜中性粒细胞的水平升高。通过多重ELISA测量的来自早期AMD受试者(无地图状萎缩或新生血管形成；n＝50)和对照(无AMD或糖尿病；n＝26)的血浆中IFNα(a)、IFNβ(b)、IFNγ(c)、IFNλ1(d)和IFNλ2/3(e)的水平。
与对照(无任何视网膜病变的白内障受试者；n＝7)相比来自早期AMD受试者(具有小玻璃疣和视网膜色素沉着改变的白内障受试者；n＝6)房水(Aq.H)中IFNα(f)和IFNλ1(g)的水平。对外周血(PB)和Aq.H(50μL)中的免疫细胞群进行CD45(白细胞)、CD66b(嗜中性粒细胞)和IL-28R1(IFNλ受体1)的抗体染色，并对以下亚群体进行门控：PB中的CD45+CD66b+(h)；PB中的CD45+IL-28R1+(i)；PB中的CD45+CD66b高IL-28R1+(j)和Aq.H中的CD45+CD66b高IL-28R1+(k)。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001，曼惠特尼检验。ELISA：酶联免疫吸附测定；CD：分化簇；IL-28R1：白细胞介素28受体1。
图3：LCN-2/Dab2/整联蛋白β1轴的活化引起嗜中性粒细胞向视网膜中的迁移，从而导致视网膜变性。
图3a：嗜中性粒细胞暴露于(6h)来自过表达IFNλ的RPE细胞的条件培养基或暴露于重组IFNλ(2h)，显示出相对于对照细胞LCN-2和pSTAT1表达的增加。平均值±标准差，n＝3；
图3b：来自玻璃体内注射施用(i)媒介物(HBSS)或(ii)对照嗜中性粒细胞的NOD-SCID小鼠的视网膜的代表性眼底图像和光谱OCT图像显示正常的视网膜结构。相比之下，注射了(iii)重组LCN-2(10pg ml-1)、或用(iv)来自过表达IFNλ的小鼠RPE细胞的条件培养基(1:1稀释)或(v)重组IFNλ(200U ml-1)预处理的嗜中性粒细胞的小鼠显示，RPE与IS/OS层(星号)、GCL/IPL层中的大病灶结节(黄色箭头)和IS/OS/RPE层中延伸至ONL的病灶突起(白色箭头)明显融合。
图3c：来自如图3b处理的小鼠骨髓来源的培养的嗜中性粒细胞的细胞裂解物的下拉测定显示LCN-2(免疫沉淀)和Dab2(免疫印迹)之间的缔合增加。阴性对照：兔IgG；每个样品的输入对照显示在未免疫沉淀的嗜中性粒细胞裂解物中存在Dab2。平均值±标准差；n＝3。
图3d：暴露于上述条件培养基的小鼠嗜中性粒细胞的流式细胞术分析显示整联蛋白β1的细胞外表达增加(FITC-A中位数荧光)；然而，与对照shRNA转染的嗜中性粒细胞相比，LCN-2 shRNA转染后8h整联蛋白β1减少。平均值±标准差；n＝3。
图3e：如图3d所示，用重组IFNλ处理的嗜中性粒细胞显示整联蛋白β1的显著增加，这在很大程度上被LCN-2 shRNA转染所阻止。平均值±标准差；n＝3。*P<0.05，P值通过单向ANOVA和Tukeys事后检验进行评估。LCN-2：脂质运载蛋白-2；shRNA：小/短发夹RNA；NOD-SCID：NOD-重度联合免疫缺陷；IFNλ：干扰素λ，IS：光感受器内段；OS：光感受器外段；GCL：神经节细胞层；IPL：内丛状层；OLM：外界膜；ONL：外核层；Dab-2：失效同源物2；V450：紫色450；FITC：异硫氰酸荧光素。
图4：AKT2磷酸化的选择性抑制剂阻止嗜中性粒细胞浸润到视网膜中，中和炎症信号并挽救Cryba1 cKO小鼠中的早期RPE变化。
图4a：流式细胞术分析显示，与媒介物处理(PBS，含2.5％DMSO的PBS溶液)或未处理的年龄匹配的Cryba1 cKO相比，在用AKT2抑制剂(CCT128930)以500M/2 l的剂量每周一次持续三周玻璃体内处理后的Cryba1 cKO小鼠(雄性；12月龄)的视网膜中，白细胞(CD45+；FITC细胞)门控群体中浸润性嗜中性粒细胞(Ly6G+；V450和CD11b(Alexa fluor 700)；Ly6G双阳性细胞)减少。代表性图表示对于n＝3个生物学重复样的％Ly6G+和％CD11b+Ly6G+细胞(平均值±标准差)。
图4b：来自1岁Cryba1fl/fl小鼠的视网膜的代表性组织切片(H&E)显示正常结构c。注射媒介物(如上)的Cryba1 cKO小鼠(1岁)显示光感受器和RPE病变，伴有色素沉着变化(箭头)。插图示出了RPE病变的更高放大倍率，指示布鲁赫膜与RPE之间可能的碎片积聚以及光感受器与RPE的分离(箭头)d。相比之下，注射CCT128930的Cryba1 cKO小鼠在2周后表现出正常结构。原始放大倍率：(b、c、d)20×；(插图)40×。e：底图。*P<0.05，所有P值均通过单向ANOVA和Tukeys事后检验进行评估。Ly6G：淋巴细胞抗原6复合物基因座G6D；CD：分化簇11b；fl/fl：floxed/floxed；cKO：条件性敲除；AKT2：AKT丝氨酸/苏氨酸激酶2；GCL：神经节细胞层；IPL：内丛状层；INL：内核层；OPL：外丛状层；ONL：外核层；IS/OS：光感受器内段和外段；RPE/BrM/CC：视网膜色素上皮、布鲁赫膜、脉络膜毛细血管层复合体。
图5：嗜中性白细胞粘附分子在具有AMD样病理的小鼠视网膜中的表达增加。ICAM-1(Alexa fluor 555；红色)(嗜中性粒细胞归巢至发炎组织所需的细胞粘附分子)的免疫荧光显示出与年龄匹配的Cryba1fl/fl(对照)小鼠相比在老年(18月龄)Cryba1 cKO小鼠的视网膜中表达升高，但在7月龄小鼠中表达未升高(上图)。在老年Cryba1 cKO小鼠的神经视网膜(箭头)和RPE/脉络膜(星号)中观察到强烈的ICAM-1染色(右下图)。图像代表三个生物学重复样。比例尺：50μm。ICAM-1：细胞间粘附分子1；DAPI：4',6-二脒基-2-苯基吲哚；GCL：神经节细胞层；INL：内核层；ONL：外核层；RPE：视网膜色素上皮。
图6：人AMD患者视网膜中嗜中性粒细胞胞外诱捕网(NET)的表达增加。
图6a：在来自人供体眼睛的切片中(有关详细信息，参见“方法”)，免疫荧光表明，与年龄匹配的对照相比，AMD视网膜具有增加数量的对为嗜中性粒细胞特异性标志物的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(NE：Alexa Fluor 555；红色)和为NET的组成部分的H3瓜氨酸化组蛋白(Alexa Fluor 488；绿色)阳性的细胞。
图6b：来自人AMD视网膜的切片还揭示，MPO(Alexa fluor 555；红色)和H3瓜氨酸化组蛋白(Alexa fluor 488；绿色)双阳性细胞(箭头)增加，它们是活化的嗜中性粒细胞的标志物并且是NET的组成部分。在对照样品中未观察到此类染色(数据未示出)。n＝3；比例尺：50μm。AMD：年龄相关性黄斑变性；H3：组蛋白3；MPO：髓过氧化物酶；DAPI：4',6-二脒基-2-苯基吲哚；GCL：神经节细胞层；INL：内核层；ONL：外核层；RPE：视网膜色素上皮。
图7：在具有AMD样病理的小鼠的RPE/脉络膜中嗜中性粒细胞调节分子的RNA表达增加。RNASeq分析揭示，与年龄匹配的Cryba1fl/fl(对照)相比，来自10月龄的Cryba1 cKO小鼠的RPE/脉络膜提取物中嗜中性粒细胞调节分子如CXCL1、CXCL9和IFNγ、IFNα和IFNλ的RNA水平显著增加。在5月龄的小鼠中未观察到此类变化。所有值表示每个基因的每百万映射读段的每千碱基转录本读段数(RPKM)，并表示为log10(每百万计数)；n＝6。**P<0.01，并且ns：相对于10月龄的Cryba1fl/fl组不显著。所有P值均通过单向ANOVA和Tukeys事后检验进行评估。CXCL1：趋化因子(C-X-C基序)配体1；CXCL9：趋化因子(C-X-C基序)配体9；IFNγ：干扰素γ；IFNα：干扰素α；IFNλ：干扰素λ。
图8：AMD患者房水和血浆中的IFNβ、IFNλ2/3和VEGF。
通过多重ELISA测量的早期AMD受试者(n＝6)和对照(n＝7)的房水中IFNβ(图8a)和IFNλ2/3(图8b)的水平没有显示出显著变化。类似地，通过多重ELISA测量的早期AMD受试者和对照(有关详细信息，参见“方法”)的外周血(图8c)和房水(图8d)中的VEGF水平没有显示出差异。INFβ：干扰素β；IFNλ：干扰素λ；VEGF：血管内皮生长因子。
图9：房水和血浆中的免疫细胞分析。对来自AMD受试者(n＝6)和对照(n＝7)的房水中的免疫细胞群进行CD45(白细胞)和CD66b(嗜中性粒细胞)染色，并对以下亚群进行门控：CD45+CD66b+(图9a-房水)、CD45+CD66b高(图9b-房水)、CD45+(图9c-房水和图9d-血浆)和CD45+IL28R1+(图9e-血浆和图f-房水)。
图10：未处理和经嗜中性粒细胞处理的NOD-SCID小鼠的IS/OS和GCL/IPL厚度测量。使用仪器随附的FIJI-ImageJ(NIH)插件连同Diver 2.4软件(Bioptigen)，对每只眼睛相对于视神经乳头(ONH)在-2.0mm至+2.0mm范围内的光学切片(每个视网膜100个切片)进行厚度分析。与注射媒介物和未处理(对照)嗜中性粒细胞的组相比，玻璃体内注射重组LCN-2、暴露于条件培养基的嗜中性粒细胞或暴露于重组IFNλ的嗜中性粒细胞引起：图10a：IS+OS厚度(μm)减少，以及图10b：GCL+IPL厚度(μm)增加。值是平均值±标准差；n＝10。*P<0.05，**P<0.01。所有P值均通过单向ANOVA和Tukeys事后检验进行评估。LCN-2：脂质运载蛋白-2；IFNλ：干扰素λ；IS：內段；OS：外段；GCL：神经节细胞层；IPL：内丛状层。
图11：注射过表达重组IFNλ的嗜中性粒细胞的NOD-SCID小鼠眼睛中的组织病理学变化。由在出生后第45天显示正常结构的(图1a)野生型视网膜组织示出代表性苏木精和伊红染色切片。相比之下，(图1b)注射过表达重组IFNλ的嗜中性粒细胞的NOD-SCID小鼠视网膜显示出神经节细胞层和玻璃体中的浸润细胞(箭头部)、INL和弥漫性光感受器损伤(箭头)以及(图1c)重度外视网膜和RPE/BrM复合体损伤(BrM破坏、RPE损失、CC变化)。a-b：X10放大倍率，c：X20。BrM：布鲁赫膜；CC：脉络膜毛细血管层；GCL：神经节细胞层；IFNλ：干扰素λ；INL：内核层；RPE：视网膜色素上皮。
图12：Dab-2与LCN-2相互作用。人蛋白质组学阵列显示，以1μg/ml的浓度在HuProtTM阵列上探测到的LCN-2的结合配偶体(包括Dab-2)(红色框)。数据代表三个生物学重复样，并表示为z-得分(每个探针命中)，其截止值为6并且值范围为28到65。
图13：IFNλ促进小鼠骨髓来源的嗜中性粒细胞中的粘附和迁移增加。用对照shRNA或LCN-2shRNA转染小鼠骨髓来源的嗜中性粒细胞8h，然后分别暴露于来自对照载体或过表达IFNλ的RPE细胞的条件培养基(1:1稀释)6h和重组IFNλ(200U ml-1)2h，显示：图13a：对纤维蛋白原(20μg ml-1)包被的板的粘附增加(箭头)，图表示使用计算机辅助计数在0.2mm2中计数的粘附细胞，以及图13b：在对照shRNA转染+IFNλ(条件培养基或重组体)嗜中性粒细胞中，跨纤维蛋白原(150μg ml-1)包被的板的嗜中性粒细胞迁移增加(箭头)，图表示代表使用计算机辅助细胞计数器系统在插页底部细胞计数的细胞相对迁移率(％)。LCN-2 shRNA转染的细胞显示甚至在暴露于IFNλ后图13a：粘附(星号)和图13b：迁移(星号)减少。所有值均为平均值±标准差，n＝4；比例尺：30μm。*P<0.05，**P<0.01。所有P值均通过单向ANOVA和Tukeys事后检验进行评估。LCN-2：脂质运载蛋白-2；shRNA：小/短发夹RNA；IFNλ：干扰素λ；RPE：视网膜色素上皮；fMLP：N-甲酰基甲硫酰基-亮氨酰-苯丙氨酸。
图14a：免疫印迹和光密度测定的总结显示，来自1岁Cryba1 cKO小鼠视网膜中AKT2(p-AKT2S474)的磷酸化显著增加。用CCT128930处理显著降低了Cryba1 cKO视网膜中pAKT2的水平，但没有降低媒介物对照中的水平。此外，样品中的总AKT水平没有变化。图14b和图14c：ELISA测定显示，与年龄匹配的媒介物和未处理的Cryba1 cKO动物相比，AKT2抑制剂处理的Cryba1 cKO小鼠的RPE-脉络膜中CXCL1(c)和IFNλ(d)的水平(pg ml-1)降低。图将值表示为n＝3个生物学重复样的平均值±标准差。
具体实施方式
年龄相关性黄斑变性(AMD)引起的视力丧失是由人口老龄化导致的不断扩大的主要未解决问题1-3。炎症的作用已经成为AMD的潜在病因，但炎症如何导致AMD的视力丧失仍然难以捉摸4-7。在高通量阵列中，我们识别了在早期AMD患者和具有衰老相关的非新生血管性AMD样表型的小鼠模型中驱动嗜中性粒细胞浸润到视网膜中的炎症信号。我们观察到早期AMD中IFNλ和活化的IL-28R1+嗜中性粒细胞的水平升高。IFNλ触发嗜中性粒细胞中脂质运载蛋白-2(LCN-2)的活化。LCN-2通过与失效同源物-2(Dab2)相互作用而增强嗜中性粒细胞向视网膜中的迁移并调节整联蛋白b1，促进慢性炎症引起的病理，从而导致视网膜变性。在小鼠模型中抑制AKT2依赖性信号传导中和炎症信号，阻止嗜中性粒细胞浸润到视网膜中，并逆转早期AMD样表型改变，从而为早期AMD提供潜在的治疗靶点。
嗜中性粒细胞在先天免疫应答中起核心作用8-12。现在清楚的是，功能异常的循环嗜中性粒细胞促成阿尔茨海默病(AD)13-16和AMD的发病17-18。在我们的具有年龄依赖性AMD样表型19-21的小鼠模型(Cryba1 cKO)中，流式细胞术表明，与floxed对照相比，视网膜积聚嗜中性粒细胞(图1a)。我们先前观察到，与年龄相匹配的对照相比，浸润早期AMD患者的黄斑下脉络膜和视网膜的嗜中性粒细胞数量增加22。在本文中，相对于年龄匹配的对照(图1biii)，我们在来自非新生血管性AMD患者的视网膜组织切片中发现了与视网膜血管腔相关的较大数量的嗜中性粒细胞(图1bi)和周围的玻璃疣，这是AMD的标志性病变(图1bii)。嗜中性粒细胞通过粘附到内皮细胞表面而从外周血经内皮层向炎症部位迁移，并迁移直至它们沿周细胞爬行，这表明它们通过血管壁离开23-27。嗜中性粒细胞对内皮细胞的粘附是通过与它们的整联蛋白和免疫球蛋白超家族成员28(诸如ICAM-129)在内皮细胞上的相互作用而介导的。在我们的动物模型中，粘附分子被上调(ICAM-1；图5)。一旦进入炎症区，嗜中性粒细胞可释放嗜中性粒细胞胞外诱捕网(NET)30，最近已表明其在免疫介导的疾病中损伤宿主组织31、32。在慢性炎症障碍中，已知增强的NET形成和/或降解在器官损伤的起始中起关键作用33-36。实际上，AMD供体眼睛对包括髓过氧化物酶(MPO)、弹性蛋白酶和瓜氨酸化组蛋白H3的NET染色呈阳性(图1b i和ii以及图6)37-40。
为了识别从RPE/视网膜释放的可导致嗜中性粒细胞浸润到神经感觉视网膜和RPE/脉络膜中的可溶性因子诸如细胞因子或趋化因子，我们在5个月和10个月时对从Cryba1 cKO小鼠19-21和Floxed对照41获得的视网膜组织进行了RNAseq分析。cKO视网膜中干扰素(IFN)以及CXCL1和CXCL9的表达也增加(图7)。ELISA证实了这些发现(图1ci-iii)。通过Western分析，与年龄匹配的对照相比，人AMD视网膜中INFl和CXCL1也被上调(图1d)。此外，与对照(n＝26)相比，来自无地图状萎缩或新生血管形成的AMD患者(n＝50)的外周血中的IFNα、IFNβ、IFNγ、IFNλ1和IFNλ2/3增加(图2a-e；补充表1a)。此外，与年龄匹配的对照(n＝7)相比，一小批来自早期AMD受试者的房水样品(n＝6；补充表1b)显示出较高的IFNα和IFNλ1(图2f和g)。IFNβ和IFNλ2/3与对照相比轻度升高，但可能由于样品量小而不具有统计学显著性(图8a和b)。有趣的是，患者和对照中的VEGF水平没有差异(图8c和d)。AMD患者的外周血中的总嗜中性粒细胞(CD45+/CD66b+)和活化的嗜中性粒细胞(CD66b高)显著升高(分别为图2h和图2i)，但房水中的未升高(图9a和b)。然而，与对照相比，来自AMD受试者的外周血(图2j)和房水(图2k)两者中，IFNλ受体阳性(IL-28R1)活化的嗜中性粒细胞的数量在嗜中性粒细胞群体中显著更高。此外，IL28R1阳性细胞的总数在房水中没有改变，但在外周血中升高(图9e和f)。值得注意的是，与对照相比，AMD患者的血浆或房水中的总白细胞数也没有改变(图9c和d)。总之，IFNλ很可能是促进嗜中性粒细胞向视网膜和可能的眼房中迁移的触发因子。
这些观察促使我们研究嗜中性粒细胞浸润视网膜并促成AMD发病的可能机制。在最近的研究中，我们表明，LCN-2有助于Cryba1 cKO小鼠中的慢性视网膜炎症42，并且在早期AMD供体眼睛的神经感觉视网膜和黄斑下脉络膜中的浸润性嗜中性粒细胞对LCN-222免疫染色。此外，用重组IFNλ或用来自过表达IFNλ的原代培养RPE细胞的条件培养基处理的小鼠骨髓来源的嗜中性粒细胞具有增加的LCN-2和磷酸化STAT1(图3a)。为了证实我们的假设，即迁移嗜中性粒细胞中的LCN-2引起外视网膜变性，我们用正常嗜中性粒细胞、重组LCN-2、或用INFl或用来自过表达INFl的RPE细胞的原代培养物的条件培养基处理的嗜中性粒细胞注射NOD-SCID免疫缺陷小鼠。7天后，使用光学相干断层扫描(OCT)发现，暴露于用INFl(图3b iv-v和图10)或重组LCN-2(图3b iii)处理的嗜中性粒细胞的小鼠的外视网膜结节增厚，而在用正常嗜中性粒细胞或仅媒介物(图3b i和ii)处理的小鼠中没有观察到变化。在这些外视网膜结节中，RPE似乎与内段(IS)/外段(OS)层融合，后者局部突出到外核层中(图3b v；白色箭头)。神经节细胞/内丛状层(GCL/IPL)中也存在病灶结节。这些变化与外视网膜的严重破坏有关，包括光感受器、RPE和布鲁赫膜，以及GCL和玻璃体中的浸润细胞(图11)。这些体内发现使人联想到在人类疾病中观察到的视网膜变化，并证实活化的嗜中性粒细胞在AMD患者的眼内区室和视网膜中的病理作用。基于来自NOD-SCID小鼠和来自早期AMD的房水样品的数据，试图推测在早期AMD期间活化的嗜中性粒细胞也可通过眼内淋巴引流系统迁移到视网膜中。
我们接下来进行了蛋白质组高通量阵列，发现LCN-2与Dab2相互作用(图12)，已知后者通过与整联蛋白b1结合来调节细胞迁移43。Dab2的去除抑制细胞迁移43。增加的整联蛋白b1在嗜中性粒细胞迁移44、45和粘附46、47中起关键作用。我们观察到与对照相比，经IFNλ处理的嗜中性粒细胞中LCN-2与Dab2之间的缔合增加(图3c)。我们假设在经IFNλ处理的嗜中性粒细胞中LCN-2与Dab2之间的缔合增加调节胞外整联蛋白b1表达并伴随嗜中性粒细胞的粘附和迁移。为了探索LCN-2在调节Dab2/整联蛋白b1轴中的这种尚未知的作用，我们用对LCN-2特异的shRNA沉默培养的嗜中性粒细胞中的LCN-2，并用重组IFNλ或来自过表达IFNλ的RPE细胞的条件培养基处理这些细胞。我们发现，在LCN-2沉默后，与用对照shRNA处理的细胞相比，胞外整联蛋白b1表达(图3d和e)以及嗜中性粒细胞粘附和迁移(图13)显著降低。这些结果表明，LCN-2调节b1整联蛋白依赖性嗜中性粒细胞的粘附和迁移。
总之，我们的数据表明，浸润视网膜的嗜中性粒细胞释放LCN-2，产生促炎性病症42，其促成AMD病理学的要素22、48。我们先前已报道在早期AMD患者中视网膜LCN-2水平急剧增加，其持续到晚期疾病阶段22。由于我们之前还证明了AKT2是LCN-222的上游调节因子，并且此处LCN2协调嗜中性粒细胞向视网膜中的迁移，因此我们接下来使用CCT128930(一种AKT249的有效且选择性的抑制剂)来确定在我们的小鼠模型中它是否能够阻止嗜中性粒细胞向视网膜中的浸润。Cryba1 cKO小鼠表现出惊人的AMD样表型，伴有RPE和光感受器变性，这是早期AMD的主要变化50、51。在12个月大时RPE轻度变性，到20个月时进展为重度RPE和光感受器变性19-21。在RPE变性早期，玻璃体内注射CCT128930的Cryba1 cKO小鼠(12个月)与仅给予媒介物的那些小鼠相比，视网膜中的嗜中性粒细胞显著更少(图4a)。重要的是，该药物逆转这些早期RPE异常(图4b-d)。此外，通过CCT128930处理降低了pAKT2、IFNλ和CXCL1水平(图14)。虽然抗氧化剂微量营养素减缓AMD的中期进展52、53，并且抗VEGF注射治疗新血管疾病54、55，但没有针对疾病早期阶段的疗法。我们设想AKT2抑制剂是预防或延迟早期AMD进展的有效、新颖手段(图4e)。
材料和方法
抗体
FITC标记的CD45(目录号553080)、APC Cy7标记的CD45(目录号560178)、FITC标记的CD66b(目录号555724)、V450标记的Ly6G(目录号560603)和Alexa fluor 700标记的CD11b(目录号557960)购自BD Biosciences,USA，并且PE标记的IL-28AR抗体(目录号337804)购自Biolegend,USA。抗嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(目录号ab68672)、抗GROα(CXCL1)(目录号ab86436)、抗STAT1(phosphor S727)(目录号ab109461)、抗瓜氨酸化组蛋白H3(目录号ab219407)和IL28+IL29(目录号ab191426)抗体购自Abcam,USA。抗ICAM-1(目录号SC-107)。抗STAT1(目录号9172T)、抗AKT(目录号4685S)、抗AKT2(目录号2964S)和抗Dab-2(目录号12906S)购自Cell Signaling Technologies,USA。使用的其他抗体包括：Alexa Fluor 488标记的β1整联蛋白(Santa Cruz Biotechnology,USA；目录号sc-374429AF488)、抗IL-28A/IFNλ2(Antibodies online；目录号ABIN357173)、抗IFNα抗体(Thermo Fisher,USA；目录号221001)、抗髓过氧化物酶/MPO(R&D Systems,USA；目录号AF3667-SP)、抗LCN-2(EMD Milipore；目录号AB2267)和抗肌动蛋白(Sigma Aldrich,USA；目录号A2066)。
动物
如先前所述1，使用Cre-LoxP系统和Best1启动子制备βA3/A1-晶状体蛋白条件性基因敲除小鼠(Cryba1 cKO)。将Cryba1 floxed小鼠2与在RPE中特异性表达Cre重组酶的Best1-cre小鼠交配。随后将确定为cKO+和Cre+的后代交配在一起以产生F2代。PCR分析识别了敲除等位基因纯合的F2后代。随后分析这些cKO/cKO小鼠中Cre的存在。将cKO/cKO和Cre+两者的动物交配以产生F3和后续世代。floxed小鼠最初被培育成携带rd8突变的C57BL/6N品系，但这种视网膜变性突变是在进行该研究之前从集落中培育出来的。NOD-SCID小鼠(NOD.CB17-Prkdescid/J；4-5周龄)购自The Jackson Laboratory,USA。所有动物研究均根据Guide for the Care and Use of Animals(动物护理和使用指南)(NationalAcademy Press)进行，并得到University of Pittsburgh Animal Care and UseCommittee的批准。
人眼
如先前所述3，对人供体眼睛中的AMD进行诊断和分类。对于免疫染色，人供体眼睛在死亡12h-35h内从National Disease Research Interchange(NDRI；Philadelphia,Pennsylvania,USA)获得。研究了来自5名AMD受试者(年龄范围79岁-95岁；平均年龄85.8岁)和三名年龄对照(年龄范围77岁-89岁；平均年龄82.5岁)的白种人供体眼睛，其中没有黄斑疾病的证据。该研究遵循了《赫尔辛基宣言》中有关人体组织研究的规范。如先前所述3，进行AMD的诊断和分类。
对于来自人外周血和房水的免疫分型和可溶性因子定量实验，从人供体收集样品，报告给Narayana Nethralaya,Bangalore,India。所有受试者均进行眼科检查，包括视敏度测试和视网膜检查。当认为必要时，通过眼底成像、Amsler网格测试和光学相干断层成像诊断AMD患者。患有并存青光眼或任何其他退行性视网膜障碍的受试者被排除在外。对照组由没有任何AMD、糖尿病、心血管障碍或视网膜疾病病史的个体组成。通过在EDTA管中静脉穿刺从26名对照和80名AMD受试者收集4ml-6ml血液样品。在无菌条件下，通过前房穿刺术从接受白内障手术的受试者(n＝7例对照，n＝6例AMD)收集房水样品(约50μL)。在这一组中，根据AREDS分类，通过玻璃疣和RPE异常(特征在于视网膜色素沉着改变)的存在来识别没有手术禁忌的早期AMD受试者4。群组的人口统计学特征描述于补充表1中。立即将所有收集的样品存储在生物存储库中以用于进一步处理。在获得Narayana Nethralaya机构审查委员会(IRB)的批准并征得患者的书面知情同意后，收集所有患者样品和相关的临床信息。
免疫染色
按照前述方法，将人供体眼睛(AMD眼睛；n＝5，年龄匹配对照；n＝3)和来自小鼠的新鲜摘除的眼睛(n＝4/组)在2％多聚甲醛(PFA)中固定、处理并切片(8m切片；每只眼睛4个切片)5。如先前所述6，使用针对髓过氧化物酶/MPO(1:100)、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(1:100)、ICAM-1(1:100)、VCAM-1(1:100)或H3瓜氨酸化组蛋白(1:100)的一抗进行免疫染色，然后用适当的二抗(1:300)与DAPI(5M)一起染色。使用DAKO Paramount(DAKOCorporation,USA)安装切片。图像通过Zeiss LSM 710共焦工作站采集。
可溶性因子定量
通过静脉穿刺术获得外周静脉血(n＝80名AMD患者和n＝26名对照受试者)，并通过前房穿刺术在AMD患者(n＝6)和对照受试者(n＝7)中收集房水(AH)。使用流式细胞仪(BDFACS Canto II，FACS DIVA软件，BD Biosciences,USA)，通过基于微珠的多重ELISA(BioLegend,Inc,USA)测量血浆和AH中IFNα、IFNβ、IFNγ、IFNλ1-3、VEGF和CXCL1的水平。基于标准曲线计算每种分析物的绝对浓度。
免疫分型
使用对白细胞(CD45)、嗜中性粒细胞(CD66b)和IFNλ受体特异性的荧光染料缀合的抗人抗体，在室温下标记来自外周血(n＝80名AMD患者和n＝26名对照受试者)和来自对照受试者(n＝7)和AMD患者(n＝6)的房水(AH)的细胞45分钟。将红细胞在1X BD裂解缓冲液中裂解10分钟(用于外周血样品)，并将来自外周血和AH的细胞洗涤并重悬于1X磷酸盐缓冲盐水中，然后基于流式细胞术(BD FACS Canto II，FACS DIVA软件，BD Biosciences,USA)进行采集和分析。使用FCS Express 6Flow Research Edition软件分析数据。通过使用SSC/CD45+配置文件进行手动门控来识别白细胞群体。随后在SSC/CD66b FITC上进行门控以识别嗜中性粒细胞。基于CD66b细胞表面表达确定嗜中性粒细胞活化状态。CD45+ CD66b+高细胞被认为是活化的嗜中性粒细胞，而CD45+ CD66b+低被认为是非活化的嗜中性粒细胞。CD45+ CD66b+高/低IL-28RI+表示IFNλ受体阳性嗜中性粒细胞。计算每个染色组的阳性细胞事件的数量。
RPE分离和培养
从对照C57BL/6J小鼠(3周龄，n＝9；Jackson Laboratories,USA)分离小鼠RPE。取出眼睛并在含有高葡萄糖的5ml DMEM中洗涤两次，并与5ml 2％(重量/体积)Dispase(Sigma Aldrich,USA)在DMEM中于37℃温育45分钟。按照前述方法7进行RPE分离和培养，其中每孔使用两只眼以用于细胞的适当融合(90％)。
IFNλ在体外RPE细胞中的过表达
pLV-C-IL28A-GFPSpark和对照载体购自北京义翘神州科技有限公司(中国北京，MG51305-ACGLN)。使用X-tremeGENE转染试剂(Roche,Switzerland)，按照制造商的说明1，用相应的载体转染原代小鼠RPE细胞(单层；90％融合)。通过ELISA评估相对于对照载体转染的细胞由过表达转染的RPE细胞释放(到无细胞上清液中)的IL-28A/IFNλ水平来估计转染效率；IL-28A/IFNλ水平的最小三倍增加被认为适合于用条件培养基进行进一步的实验。
嗜中性粒细胞的分离和培养
小鼠嗜中性粒细胞通过如下分离：离心骨髓细胞，从股骨和胫骨中冲洗，并如先前所述8在不含Ca2+和Mg2+的HBSS中通过Percoll不连续密度梯度纯化。如通过流式细胞术确定的，超过90％的分离细胞是Ly6G+嗜中性粒细胞(数据未示出)。将分离的嗜中性粒细胞以5×106个细胞/mL的密度培养，在37℃以5％CO2在含有20mM HEPES的HBSS中用100或200U ml-1的重组IFNλ(R&D Biosystems,USA)或用过表达IFN-λ的RPE细胞的条件培养基(用培养基1:1或1:5稀释)处理。
LCN-2 shRNA转染
LCN-2 shRNA慢病毒和对照shRNA颗粒购自Santa Cruz Biotechnology,USA(sc-60044-V)。将小鼠骨髓来源的嗜中性粒细胞(含有20mM HEPES的HBSS中的5×106个细胞/mL)铺板，然后根据制造商的方案用LCN-2shRNA慢病毒或对照shRNA颗粒转染8h，随后将转染的细胞在37℃以5％CO2用200U ml-1重组IFNλ(R&D Biosystems,USA)处理2h，或用过表达IFN-λ的RPE的条件培养基(用培养基1:1稀释)处理。
快速嗜中性粒细胞粘附测定
在4℃，将玻璃底35mm板(Corning,USA)用人纤维蛋白原(Sigma Aldrich,USA)的无内毒素PBS溶液以20g/孔包被16h。将如前一节所述先前用对照shRNA或NGAL shRNA转染的小鼠骨髓来源的嗜中性粒细胞(含有20mM HEPES培养基的HBSS中的5×106个细胞/mL)用fMLP(1mM)、重组IFNλ(200U ml-1)或来自过表达IFN-λ的RPE细胞的条件培养基处理。将经处理的细胞添加至包被的板中，并在37℃温育10分钟，用PBS洗涤，在冰上用4％多聚甲醛固定30分钟。使用计算机辅助计数8在0.2mm2中对粘附细胞进行计数。
嗜中性粒细胞迁移测定
将小鼠骨髓来源的嗜中性粒细胞(含有20mM HEPES培养基的HBSS中的5×106个细胞/mL)铺板，然后用慢病毒LCN-2shRNA或对照shRNA转染8h(参见上文)。将转染的细胞在37℃以5％CO2用200U ml-1重组IFNλ(R&D Biosystems,USA)或用来自过表达IFN-λ的RPE细胞的条件培养基(用培养基1:1稀释)处理。从板中收获细胞，在培养基中洗涤，然后在具有预先用150μg/ml人纤维蛋白原(Sigma Aldrich,USA)包被的3 m插入物(Corning,USA)的Transwell板上铺板。在用Giemsa染色后，通过使用计算机辅助细胞计数器9，在transwell的底部计数迁移的细胞。
小鼠视网膜中嗜中性粒细胞百分比估计
从摘除的眼睛中解剖小鼠视网膜，并用0.05％胶原酶D在37℃消化30分钟，用钝头镊子梳理并用移液器吸取以释放细胞，通过70μm细胞滤器，在1,300g、4℃离心20分钟10。将整个沉淀用以在含有1％BSA的PBS中的1μg/ml浓度的FITC标记的细胞表面标志物CD45、V450标记的Ly6G和Alexa Fluor 700标记的CD11b(BD PharmigenTM,USA)染色1h。将细胞洗涤并在流式细胞仪(BD Aria III，FACS DIVA软件，Biosciences,USA和FlowJo软件-版本7.6.5)上分析，对SSC-A/CD45+(FITC)细胞进行手动门控并在该细胞群中定量％Ly6G+和％CD11b+Ly6G+细胞。
β1-整联蛋白表达估计
将新鲜培养的嗜中性粒细胞与以在含有1％BSA的PBS中的1μg/ml浓度的V450标记的Ly6G(BD PharmigenTM,USA)和Alexa Fluor 488标记的β1-整联蛋白(Santa CruzBiotechnology,USA)抗体一起温育1h。用PBS洗涤细胞，通过使用流式细胞仪(BD AriaIII，FACS DIVA软件，BD Biosciences,USA和FlowJo软件-版本7.6.5)进行分析。在总细胞群中门控Ly6G+细胞，并在Ly6G+细胞中评估β1-整联蛋白的细胞表面表达(FITC荧光)11。
SDS-PAGE和蛋白质印迹分析
如先前所述12，进行SDS-PAGE和蛋白质印迹分析。一抗以1:1000的稀释度使用，而所有二抗以1:3000的稀释度使用。
重组脂质运载蛋白-2(LCN-2)蛋白质的制备
全长LCN-2cDNA由GeneScipt,USA合成。将其亚克隆到pET28a载体的NdeI和XhoI位点处。将构建体转化到大肠杆菌(E.coli)DH5-α细胞中进行扩增，并转化到大肠杆菌Rosetta中进行表达。使单个集落生长过夜作为母种培养物。接种10％的母种培养物，使其生长至0.8-1.0OD，并在37℃用0.5mM IPTG诱导2h。然后将细胞通过在微量离心机中在4℃以6000rpm离心10分钟而沉淀，重悬于10％体积的含有300mM NaCl和10％甘油的20mM TrispH 8.0中。将混合物分别进行超声处理30秒，每次进行6个循环，然后在4℃以12000rpm离心30分钟。按照制造商的方案，将上清液级分通过镍NTA(BioVision,USA)柱。将该柱用10倍床体积的20mM Tris pH 8.0、300mM NaCl、10％甘油和20mM咪唑洗涤两次。将蛋白质用约5倍床体积的20mM Tris pH 8.0、300mM NaCl、10％甘油和300mM咪唑的多个级分洗脱。将蛋白质在1X PBS和50％甘油中于4℃透析过夜，并以等分试样的形式存储在-20℃。
蛋白质-蛋白质相互作用
人蛋白质组微阵列2.0分析作为来自CDI NextGen Proteomics,MD,USA的付费服务进行。在HuProtTM v3.1人蛋白质组阵列上分析重组脂质运载蛋白-2的蛋白质-蛋白质相互作用谱，并在阵列板上以1μg/ml探测样品，其中使用GenePix软件分析数据。将命中识别评估为微阵列上每种蛋白质探针的前景中位数值与周围背景中位数值的比率，然后通过9×9×9窗口大小内所有相邻探针的中位数值进行标准化，并表示为探针结合信号与随机噪声的差异的显著性(Z-得分)。对于一式三份分析，该研究中的截止Z-得分为6；仅考虑具有高于6的Z-得分的蛋白质相互作用12。
ELISA
将从新鲜摘除的小鼠眼睛中收获的RPE脉络膜复合体保持在冰上，然后以每5mg组织300μL完全提取缓冲液(Abcam,USA)进行匀化。将匀化的组织在4℃保持恒定搅拌2h，然后在4℃以13,000rpm离心20分钟。将上清液等分并储存在-80℃，然后用于进行ELISA以评估IFNλ和CXCL1的水平，如先前所述13。
RNAseq分析
如先前所述12，分别对来自5月龄和10月龄的Cryba1fl/fl和Cryba1 cKO小鼠(n＝4)的摘除眼睛的RPE-脉络膜进行总RNA分离。作为来自DNA Link,USA的付费服务，使用约30ngμl-1总RNA进行RNA测序。使用CLC Genomics Workbench中包括的RNA-seq映射算法，将所有序列读段定位到参考基因组(NCBI37/mm9)上。将映射所允许的最大错配数目设置为2。为了估计基因表达水平并分析不同组之间差异表达的基因，如先前所述14计算RPKM。
免疫共沉淀
为了评估在不同实验条件下LCN-2与Dab-2之间的缔合，如先前所述12，将用重组IFNλ(200U ml-1)或用过表达IFN-λ的RPE细胞的条件培养基(1:1稀释)处理的培养的嗜中性粒细胞使用PierceTM免疫共沉淀试剂盒(Thermo Fisher,USA,26149)进行免疫公沉淀(Co-IP)。
AKT2抑制剂的玻璃体内注射剂
将Cryba1fl/fl和Cryba1 cKO小鼠(雄性，12月龄；n＝4)通过腹膜内注射0.15ml氯胺酮(2.5mg/ml)+甲苯噻嗪(0.5mg/ml)的混合物进行麻醉。对眼睛进行局部麻醉(盐酸丙美卡因)，并用一滴局部2.5％盐酸去氧肾上腺素眼用溶液扩张瞳孔。用钝的弯曲镊子轻轻压下下眼睑，使眼睛突出，并用无菌盐水洗涤。对于玻璃体内注射，使用30号针头在眼角膜缘紧后的位置形成孔，然后通过使用气密注射器(Hamilton robotics,USA)将2μl抑制剂(2.5％DMSO的PBS溶液中的500μM CCT128930)或仅媒介物(2.5％DMSO的PBS溶液)注射到玻璃体内，每周一次，持续三周。所有仪器均用蒸汽高压灭菌器灭菌。术后施用杆菌肽眼用软膏6。在第一次注射后四周，用CO2气体对动物实施安乐死，并收获视网膜。
NOD-SCID小鼠玻璃体内注射嗜中性粒细胞和光学相干断层扫描(OCT)
NOD-SCID小鼠(NOD.CB17-Prkdescid/J，Jackson Laboratories,USA，雄性，4-5周龄)用于研究。采用n＝10的大样品量以消除任何实验异常。如上所述进行小鼠麻醉和玻璃体内注射。将HBSS(媒介物对照)、重组LCN-2(10pg ml-1)、或者未处理或用重组IFNλ(200Uml-1)或来自过表达IFN-λ的RPE细胞的过表达IFN-λ的RPE条件培养基处理的新鲜培养的嗜中性粒细胞(在含有5×104个细胞的HBSS中)分别注射到每只眼睛的玻璃体中，每周一次，持续两周6,15。
在第一次注射后三周，将NOD-SCID小鼠通过腹膜内注射氯胺酮和甲苯噻嗪混合物进行麻醉，然后使用Bioptigen Envisu R2210系统进行眼底成像以及光学相干断层扫描(OCT)分析。使用仪器随附的FIJI-ImageJ(NIH)插件连同Diver 2.4软件(Bioptigen)，在来自每只眼睛的相对于视神经乳头(ONH)在-2.0mm至+2.0mm范围内的光学切片(每个视网膜100个切片)上分析OCT图像16。实验后，用CO2气体对动物实施安乐死，并收获眼睛以用于进一步实验。
苏木精-伊红染色
对于苏木精和伊红(H&E)染色，将NOD-SCID小鼠(n＝10)的眼睛摘除，并最初在2.5％戊二醛中固定72h，然后用10％缓冲福尔马林固定。如先前所述17，将眼睛包埋在甲基丙烯酸甲酯中、切片并染色。
统计分析
通过使用单向ANOVA，使用Microsoft Excel和GraphPad Prism 6Windows版软件进行统计分析。使用Tukey事后检验对组平均值进行比较，显著性设为p<0.05。对于人样品实验，对照组和AMD组之间的比较通过Mann Whitney检验进行，显著性设为p＜0.05，通过Shapiro-Wilk正态性检验确定数据分布。箱线图中的中心线和边缘线分别表示中位数和四分位数间距，而须表示最极端的数据点。对一式三份的技术重复样进行分析。结果表示为平均值±标准差(SD)3。
参考文献
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Claims (9)

1.一种Akt抑制剂，其用于治疗眼部血管疾病。
2.根据权利要求1所述的Akt抑制剂，其中所述眼部血管疾病是年龄相关性黄斑变性、湿性年龄相关性黄斑变性、色素性视网膜炎、糖尿病性视网膜病变和地图状萎缩。
3.根据权利要求1或2所述的Akt抑制剂，其中所述Akt抑制剂是Akt2抑制剂。
4.根据权利要求1至3所述的Akt抑制剂，其中所述Akt抑制剂是小分子。
5.一种用于治疗眼部血管疾病的方法，其包括向有此需要的受试者施用有效量的Akt抑制剂。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述眼部血管疾病是年龄相关性黄斑变性、湿性年龄相关性黄斑变性、色素性视网膜炎、糖尿病性视网膜病变和地图状萎缩。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其中所述Akt抑制剂是Akt2抑制剂。
8.根据权利要求5至7所述的方法，其中所述Akt抑制剂是小分子。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述Akt抑制剂经口施用。
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