JP2023062097A - 急性間欠性ポルフィリン症の治療のためのポルホビリノゲン脱アミノ酵素をコードするポリヌクレオチド - Google Patents

急性間欠性ポルフィリン症の治療のためのポルホビリノゲン脱アミノ酵素をコードするポリヌクレオチド Download PDF

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Abstract

【課題】急性間欠性ポルフィリン症（ＡＩＰ）の治療のためのｍＲＮＡ療法を提供する。【解決手段】本発明に使用されるｍＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｖｏで投与される場合、ヒトポルフォビリノゲン脱アミノ酵素（ＰＢＧＤ）、そのアイソフォーム、その機能性断片、及びＰＢＧＤを含む融合タンパク質をコードする。本発明のｍＲＮＡは、対象内の細胞及び／または組織に投与される時に、そこへの効率的な送達に影響を及ぼすために、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に封入されるのが好ましい。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年５月１８日に出願の米国仮出願第６２／３３８，１６１号及び２０１７年５月９日に出願の欧州特許出願公開第ＥＰ１７３８２２５９．４号の優先権を主張するものであり、これらの各々はその全体が、本明細書において参照により組み込まれる。
ｅｆｓ－ｗｅｂ経由で電子的に提出された配列表の参照
電子的に提出された配列表（名称：３５２９．０６９ＰＣ０２ Ｐａｔｅｎｔ－Ｉｎ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、サイズ：２２２，９５８バイト、及び作成日：２０１７年５月１６日）の内容は、その全体が、本明細書において参照により組み込まれる。
急性間欠性ポルフィリン症（ＡＩＰ）は、ヘモグロビンの酸素結合補欠分子族であるヘムの産生障害に関連する常染色体優性代謝障害である。ＡＩＰの原因遺伝子はポルフォビリノゲン脱アミノ酵素（ＰＢＧＤ）（ＮＭ＿０００１９０；ＮＰ＿０００１８１；別称：ヒドロキシメチルビラン合成酵素（ＨＭＢＳ、またはＨＭ－合成酵素）、及びウロポルフィリノゲンＩ合成酵素）であるとされている。Ｓｏｎｇ Ｇ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．２３：３９６－４０４（２００９）。ＰＢＧＤ（Ｅ．Ｃ．２．５．１．６１）は、ポルフィリン－ヘム生合成経路に関与する８つの酵素のうちの１つである。ＰＢＧＤの生物学的機能は、４つのポルフォビリノゲン分子が線状ヒドロキシメチルビランへと頭尾縮合するのを、触媒することである。ＰＢＧＤの主要なアイソフォームとしては、全ての組織内に発現する４４ｋＤａのハウスキーピング酵素（アイソフォーム１）、及び４２ｋＤａの赤血球特異的酵素（アイソフォーム２）の、２つがある。遍在的ＰＢＧＤアイソフォーム１は３６１アミノ酸残基であるのに対し、赤血球特異的バリアント（ＰＢＧＤアイソフォーム２）は３４４アミノ酸である。（同文献）
ＰＢＧＤ遺伝子内の変異は、ＰＢＧＤ機能を完全にまたは部分的に喪失させ、結果として、ヘムの産生に障害を来たし、細胞質、血漿及び尿中にアミノレブリン酸（ＡＬＡ）ならびにポルフォビリノゲン（ＰＢＧ）を異常に蓄積させる恐れがある。（同文献）
徴候及び症状はまちまちであり得るが、ＡＩＰに罹患している患者は神経系の問題（例えば、激越、譫妄、発作、運動機能の喪失、呼吸麻痺）及び胃腸系の問題（例えば、極度の腹痛、嘔吐、排尿痛）を発呈することがしばしばある。それらの徴候及び症状は、薬物、ホルモン及びアルコールなどの様々な要因によって引き起こされ、通例はエピソードまたは発作として発呈し、その発呈は数時間もしくは数日間に及ぶ。Ｈｒｄｉｎｋａ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｓ．２：Ｓ１１９－３６（２００６）。ＡＩＰ患者は、これらのエピソードとエピソードとの間または発作と発作との間は健康そうに見える場合もあるが、未治療のまま放置された場合、ＡＩＰは生命を脅かすことになりかねない合併症の原因となり、死亡に至る場合がある。ＡＩＰの推定罹患率は、世界中で百万人当たり約５．９人に及んでいる（Ｅｌｄｅｒ Ｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｈｅｒｉｔ．Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓ．３６：８４９－５７（２０１２））。ＡＩＰの罹患者は全ての民族集団から報告されているが、この障害はオランダ人及びスウェーデン人集団の両方において特に多く見られる（１万人中１～８人）。Ｔｊｅｎｓｖｏｌｌ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｓ Ｍａｒｋｅｒｓ．１９：４１－６（２００３－２００４）。
これまでのＡＩＰの治療は、主として、生活習慣を改めること（例えば、アルコール、喫煙、及び公知のポルフィリンを生ずる薬物及び食餌の回避）、ならびに個々の徴候及び症状を管理することによるものであった。Ｂａｄｍｉｎｔｏｎ ＭＮ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｒａｃｔ．５６：２７２－８（２００２）。極端な事例では、ヘマチンの定期的注入及び／または肝臓移植が推奨されている。Ｓｅｔｈ ＡＫ ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｖｅｒ Ｔｒａｎｓｐｌ．１３：１２１９－２７（２００７）。
今日、現在のＡＩＰ標準医療（ＳＯＣ）は、「ヘミン」療法としても知られているパンへマチン療法である。このＳＯＣ療法は、ヘム投与を用いた肝臓ヘム合成の下方制御に基づくが、とりわけヘム療法が適応とされるのは、尿中ＰＢＧの顕著な増加によってポルフィリン症の急性発作が立証された場合だけに限られる。しかも、慢性のＡＩＰに対しては効能がないこと、作用期間が短い（１～２日しか持続しない）こと等、いくつかの医療ニーズが存在しているが、依然としてその対応は為されていないままである。そのうえ、肝臓ヘム合成経路の再発性超活性化は、神経学的症状及び代謝的症状、ならびに慢性腎疾患及び特定のＡＩＰ患者における肝細胞癌リスクの増大を含む長期合併症を伴い得る。予防的なヘム注入は、それらの患者の一部において効果的な方策と考えられるが、耐薬性を誘発し、その使用頻度が高いと、血栓塞栓性疾患及び肝鉄症を伴い得る。
酵素補充療法（ＥＲＴ）または遺伝子治療（例えば、ＨＭＢＳ遺伝子導入）をはじめとする新興の療法、及びＡＬＡＳ１遺伝子発現の阻害に基づく将来性ある療法が、開発されている。２００９年の第３相臨床試験において、組み換えヒトＰＢＧＤであるザイメネックス（別称：「ポルフォジム」）の奏効は認められず、この治療では、安全性プロファイルに優れるにもかかわらず、ＰＢＧＤ活性の代理マーカー（すなわち、ＰＢＧ及びＡＬＡ）のレベルを十分に低減させることができなかった。この治験において、ＰＢＧは低減したがＡＬＡの低減は見られず、しかもＰＢＧ酵素は肝細胞を標的としなかった。急性間欠性ポルフィリン症に対する肝臓特異的遺伝子治療の第Ｉ相非盲検試験において、Ｄ’Ａｖｏｌａらは、ＡＩＰの最初の遺伝子治療試験、及びＡＡＶ５のヒトにおける最初の投与試験の結果を報告し、安全性に関する所見を示したが、効能の徴候が現れるかどうかについては定かにされていない。この疾患の生物学的諸相、及び信頼性に優れた読影の欠如が、有効性が欠如していることの原因として考えられており、今日に至るまで、再発性急性発作の患者における根治的治療は、同所性肝臓移植しかないとされている。
それゆえ、肝臓移植以外のほとんどの治療は、完全且つ確実に障害を治療できないことがしばしばであり、このため、ＡＩＰ治療用に改良を施した治療薬に対するニーズが絶えない。
本発明は、急性間欠性ポルフィリン症（ＡＩＰ）治療用のｍＲＮＡ治療薬を提供するものである。本発明のｍＲＮＡ治療剤がとりわけＡＩＰの治療に好適とされる理由は、本テクノロジーが、ＰＢＧＤをコードするｍＲＮＡの細胞内送達、続いて、標的細胞内で機能的ＰＢＧＤタンパク質のデノボ合成を実現するという点にある。本発明は、修飾ヌクレオチドを治療用ｍＲＮＡ内に組み込んだことによって、（１）望ましくない免疫活性化（例えば、外来核酸のｉｎ ｖｉｖｏ導入に関連する自然免疫応答）を最小限に抑えること、及び（２）ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳効率を最適化することを特長とする。本発明の例示的な態様は、先天性免疫応答を低減するためのヌクレオチド修飾と、特に、ＰＢＧＤをコードする治療用ｍＲＮＡのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内の配列最適化の組み合わせによって、タンパク質発現を増強することを特長とする。
更なる実施形態において、本発明のｍＲＮＡ治療技術はまた、ＰＢＧＤをコードするｍＲＮＡを脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）送達系経由で送達することを、特長とする。本発明は、ＰＢＧＤをコードするｍＲＮＡと組み合わせてｉｎ ｖｉｖｏ投与された際に、例えば細胞摂取、細胞内輸送及び／またはエンドソーム放出もしくはエンドソーム脱出などの、改良特性を有する新規なイオン性脂質ベースのＬＮＰを特長とする。また、本発明のＬＮＰ製剤は、ＬＮＰのｉｎ ｖｉｖｏ投与に関連する免疫原性を低減させることが実証されている。
ある特定の態様において、本発明は、ポルフォビリノゲン脱アミノ酵素をコードするポリヌクレオチド（例えばリボ核酸（ＲＮＡ）（メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）など））を含む、組成物及び送達製剤、ならびに、同ポリヌクレオチドを投与することによって急性間欠性ポルフィリン症（ＡＩＰ）を治療することを、それを必要とする対象において行う方法に関する。
本開示は、ポロビリノゲン脱アミノ酵素（ＰＢＧＤ）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む脂質ナノ粒子カプセル化ｍＲＮＡを含む医薬組成物を提供するものであり、本組成物は、急性間欠性ポルフィリン症（ＡＩＰ）の治療を必要とするヒト対象への投与に適したものである。
本開示は更に、（ａ）（ｉ）少なくとも１つの化学修飾された核酸塩基、糖、骨格またはそれらの任意の組み合わせを含む、ポルフォビリノゲン脱アミノ酵素（ＰＢＧＤ）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と（ｉｉ）マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位を含む非翻訳領域（ＵＴＲ）とを含むｍＲＮＡ、及び（ｂ）送達剤を含む医薬組成物を提供し、本医薬組成物は、急性間欠性ポルフィリン症（ＡＩＰ）の治療を必要とするヒト対象への投与に適したものである。
本開示は更に、ヒトポルフォビリノゲン脱アミノ酵素（ＰＢＧＤ）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むｍＲＮＡを含む医薬組成物を提供する。本組成物は、それを必要とする対象に単回静脈内投与した場合に、
（ｉ）アミノレブリン酸（ＡＬＡ）の尿排泄を、投与後少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、または少なくとも１２０時間にわたって、対照標準であるＡＬＡの排泄レベル（例えば、急性ポルフィリン症発作時）と比較して、少なくとも２分の１に、少なくとも５分の１に、少なくとも１０分の１に、少なくとも２０分の１に、または少なくとも５０分の１に低減させる、
（ｉｉ）ポルフォビリノゲン（ＰＢＧ）の尿排泄を、投与後少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、または少なくとも１２０時間にわたって、対照標準であるＰＢＧの排泄レベル（例えば、急性ポルフィリン症発作時）と比較して、少なくとも２分の１に、少なくとも５分の１に、少なくとも１０分の１に、少なくとも２０分の１に、または少なくとも５０分の１に低減させる、及び／または
（ｉｉｉ）ポルフィリンの尿排泄を、投与後少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、または少なくとも１２０時間にわたって、対照標準であるポルフィリンの排泄レベル（例えば、急性ポルフィリン症発作時）と比較して、少なくとも２分の１に、少なくとも５分の１に、少なくとも１０分の１に、少なくとも２０分の１に、または少なくとも５０分の１に低減させるのに十分である。
本開示は更に、ヒトポルフォビリノゲン脱アミノ酵素（ＰＢＧＤ）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むｍＲＮＡを含む医薬組成物を提供する。本組成物は、それを必要とする対象に単回静脈内投与した場合に、
（ｉ）アミノレブリン酸（ＡＬＡ）の尿排泄を、投与後少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、または少なくとも１２０時間にわたって対象のベースラインレベルまたは対照標準であるＡＬＡの排泄レベル（例えば、ＡＩＰに罹患する対象、または急性ポルフィリン症発作時）と比較して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％低減させる、
（ｉｉ）ポルフォビリノゲン（ＰＢＧ）の尿排泄を、投与後少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、または少なくとも１２０時間にわたって対象のベースラインレベルまたは対照標準であるＰＢＧの排泄レベル（例えば、ＡＩＰに罹患する対象、または急性ポルフィリン症発作時）と比較して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％低減させる、及び／または
（ｉｉｉ）ポルフィリンの尿排泄を、投与後少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、または少なくとも１２０時間にわたって対象のベースラインレベルまたは対照標準であるポルフィリンの排泄レベル（例えば、ＡＩＰに罹患する対象、または急性ポルフィリン症発作時）と比較して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％低減させるのに十分である。
本開示は更に、ヒトポルフォビリノゲン脱アミノ酵素（ＰＢＧＤ）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むｍＲＮＡを含む医薬組成物を提供する。本組成物は、それを必要とする対象に単回静脈内投与した場合に、
（ｉ）血清中アラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ）レベルを、少なくとも２４時間以内、少なくとも４８時間以内、少なくとも７２時間以内、少なくとも９６時間以内、または少なくとも１２０時間以内に、対照標準である血清中ＡＬＴレベルの少なくとも１０分の１以内まで、少なくとも５分の１以内まで、少なくとも２分の１以内まで、または少なくとも１．５分の１以内まで、あるいは少なくとも５０％、少なくとも４０％、少なくとも３０％、少なくとも２０％、または少なくとも１０％低減させる、
（ｉｉ）血清中アスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ）レベルを、投与後少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、または少なくとも１２０時間にわたって、対照標準である血清中ＡＳＴレベルの少なくとも１０分の１以内まで、少なくとも５分の１以内まで、少なくとも２分の１以内まで、または少なくとも１．５分の１以内まで、あるいは少なくとも５０％、少なくとも４０％、少なくとも３０％、少なくとも２０％、または少なくとも１０％低減さる、及び／または
（ｉｉｉ）血清中ビリルビンレベルを、投与後少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、または少なくとも１２０時間にわたって、対照標準である血清中ビリルビンレベルの少なくとも１０分の１以内まで、少なくとも５分の１以内まで、少なくとも２分の１以内まで、または少なくとも１．５分の１以内まで；あるいは少なくとも５０％、少なくとも４０％、少なくとも３０％、少なくとも２０％、または少なくとも１０％低減させるのに十分である。
本開示は更に、ヒトポルフォビリノゲン脱アミノ酵素（ＰＢＧＤ）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むｍＲＮＡを含む医薬組成物を提供する。本組成物は、それを必要とする対象に単回静脈内投与した場合に、
（ｉ）血清中アラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ）レベルを、投与後少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、または少なくとも１２０時間以内に、対象のベースラインレベルまたは対照標準である血清中ＡＬＴレベル（例えば、ＡＩＰに罹患する対象、または急性ポルフィリン症発作時）と比較して、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、または少なくとも３０％低減させる、
（ｉｉ）血清中アスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ）レベルを、投与後少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、または少なくとも１２０時間にわたって対象のベースラインレベルまたは対照標準である血清中ＡＳＴレベル（例えば、ＡＩＰに罹患する対象、または急性ポルフィリン症発作時）と比較して、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、または少なくとも３０％低減させる、及び／または
（ｉｉｉ）血清中ビリルビンレベルを、投与後少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、または少なくとも１２０時間にわたって対象のベースラインレベルまたは対照標準である血清中ビリルビンレベル（例えば、ＡＩＰに罹患する対象、または急性ポルフィリン症発作時）と比較して、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、または少なくとも３０％低減させるのに十分である。
本開示は更に、ヒトポルフォビリノゲン脱アミノ酵素（ＰＢＧＤ）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むｍＲＮＡを含む医薬組成物を提供する。本組成物は、それを必要とする対象に単回静脈内投与した場合に、
（ｉ）肝臓のＰＢＧＤ活性レベルを、投与後少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、または少なくとも１２０時間にわたって、対照標準である生理学的レベルまたは超生理学的レベルにもしくはそれより高く維持する、及び／または
（ｉｉ）肝臓のＰＢＧＤ活性レベルを、投与後少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、または少なくとも９６時間にわたって、対照標準である肝臓ＰＢＧＤ活性レベルの５０％にもしくはそれより高く維持するのに十分である。
いくつかの実施形態において、本明細書中に開示される医薬組成物は更に、送達剤を含む。
本開示は、ポルフォビリノゲン脱アミノ酵素（ＰＢＧＤ）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチドを提供する。本ポリヌクレオチドにおいて、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の理論的最小ウラシルまたはチミン含有量に対するＯＲＦのウラシルまたはチミン含有量（％ＵＴＭまたは％ＴＴＭ）は、約１００％～約１５０％である。いくつかの実施形態において、％ＵＴＭまたは％ＴＴＭは、約１０５％～約１４５％、約１０５％～約１４０％、約１１０％～約１４０％、約１１０％～約１４５％、約１１５％～約１３５％、約１０５％～約１３５％、約１１０％～約１３５％、約１１５％～約１４５％、または約１１５％～約１４０％である。いくつかの実施形態において、対応する野生型ＯＲＦのウラシルまたはチミン含有量に対するＯＲＦのウラシルまたはチミン含有量（％ＵＷＴまたは％ＴＷＴ）は、１００％未満である。いくつかの実施形態において、％ＵＷＴまたは％ＴＷＴは、約９５％未満、約９０％未満、約８５％未満、８０％未満、７９％未満、７８％未満、７７％未満、７６％未満、７５％未満、７４％未満、または７３％未満である。いくつかの実施形態において、％ＵＷＴまたは％ＴＷＴは、６５％～７３％である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦ中の総ヌクレオチド含有量に対するＯＲＦ中のウラシルまたはチミン含有量（％ＵＴＬまたは％ＴＴＬ）は、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、または約１９％未満である。いくつかの実施形態において、％ＵＴＬまたは％ＴＴＬは、約１９％未満である。いくつかの実施形態において、％ＵＴＬまたは％ＴＴＬは、約１３％～約１５％である。いくつかの実施形態において、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の理論上の最大グアニン含有量に対するＯＲＦのグアニン含有量（％ＧＴＭＸ）は、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％である。いくつかの実施形態において、％ＧＴＭＸは、約７０％～約８０％、約７１％～約７９％、約７１％～約７８％、または約７１％～約７７％である。
いくつかの実施形態において、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の理論最大シトシン含有量に対するＯＲＦのシトシン含有量（％ＣＴＭＸ）は、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％である。いくつかの実施形態において、％ＣＴＭＸは、約６０％～約８０％、約６２％～約８０％、約６３％～約７９％、または約６８％～約７６％である。いくつかの実施形態において、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列中の理論上の最大グアニン及びシトシン含有量（Ｇ／Ｃ）に対するＯＲＦのＧ／Ｃ含有量（％Ｇ／ＣＴＭＸ）は、少なくとも約８１％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％である。いくつかの実施形態において、％Ｇ／ＣＴＭＸは、約８０％～約１００％、約８５％～約９９％、約９０％～約９７％、または約９１％～約９６％である。いくつかの実施形態において、対応する野生型ＯＲＦ中のＧ／Ｃ含有量に対するＯＲＦ中のＧ／Ｃ含有量（％Ｇ／ＣＷＴ）は、少なくとも１０２％、少なくとも１０３％、少なくとも１０４％、少なくとも１０５％、少なくとも１０６％、少なくとも１０７％、少なくとも１１０％、少なくとも１１５％、または少なくとも１２０％である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦ中の第３のコドン位置における平均Ｇ／Ｃ含有量は、対応する野生型ＯＲＦの第３のコドン位置の平均Ｇ／Ｃ含有量よりも少なくとも２０％、少なくとも２１％、少なくとも２２％、少なくとも２３％、少なくとも２４％、少なくとも２５％、少なくとも２６％、少なくとも２７％、少なくとも２８％、少なくとも２９％、または少なくとも３０％多い。
いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、配列番号９～３３、及び８９～１１７からなる群から選択される配列に対して少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、配列番号９～３３、及び８９～１１７からなる群から選択される核酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、配列番号１０４、１１２、または１１４の核酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、配列番号１０４、１１２、または１１４の核酸配列に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、配列番号１０４、１１２、または１１４の核酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＰＢＧＤポリペプチドは、（ｉ）野生型ＰＢＧＤのアイソフォーム１ポリペプチド配列（配列番号１）、（ｉｉ）野生型ＰＢＧＤのアイソフォーム２ポリペプチド配列（配列番号３）、野生型ＰＢＧＤのアイソフォーム３のポリペプチド配列（配列番号５）、または野生型ＰＢＧＤのアイソフォーム４のポリペプチド配列（配列番号７）に対して少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％もしくは約１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ＰＢＧＤポリペプチドは、ポルフォビリノゲン脱アミノ酵素活性を有する。いくつかの実施形態において、ＰＢＧＤポリペプチドは、ポルフォビリノゲン脱アミノ酵素活性を有するバリアント、誘導体、または変異体（例えば、ＳＭ機能獲得型バリアント、配列番号１５２）である。いくつかの実施形態において、機能獲得型変異体ＰＢＧＤは、Ｉ２９１Ｍ変異、Ｎ３４０Ｓ変異、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、機能獲得型変異体ＰＢＧＤは、配列番号１５２のポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ＰＢＧＤポリペプチドは、ＰＢＧＤ融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、ＰＢＧＤ融合タンパク質は、異種タンパク質残基を含む。いくつかの実施形態において、異種タンパク質残基は、アポリポタンパク質である。いくつかの実施形態において、アポリポタンパク質は、ヒトアポリポタンパク質Ａ１である。いくつかの実施形態において、ヒトアポリポタンパク質Ａ１は、成熟ヒトアポリポタンパク質Ａ１である。いくつかの実施形態において、ＰＢＧＤ及び成熟ヒトアポリポタンパク質Ａ１を含む融合タンパク質は、配列番号１５４のポリペプチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド配列は更に、輸送ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは一本鎖である。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは二本鎖である。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドはＤＮＡである。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドはＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドはｍＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの化学修飾された核酸塩基、糖、主鎖、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの化学修飾された核酸塩基は、シュードウラシル（Ψ）、Ｎ１－メチルシュードウラシル（ｍ１Ψ）、２－チオウラシル（ｓ２Ｕ）、４’－チオウラシル、５－メチルシトシン、５－メチルウラシル、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの化学修飾された核酸塩基は、シュードウラシル（Ψ）、Ｎ１－メチルシュードウラシル（ｍ１Ψ）、１－エチルシュードウラシル、２－チオウラシル（ｓ２Ｕ）、４’－チオウラシル、５－メチルシトシン、５－メチルウラシル、５－メトキシウラシル、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの化学修飾された核酸塩基は、５－メトキシウラシルである。いくつかの実施形態において、ウラシルの少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％は、５－メトキシウラシルである。いくつかの実施形態において、ウラシルまたはチミンの少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％は、化学修飾されている。いくつかの実施形態において、グアニンの少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％は、化学修飾されている。いくつかの実施形態において、シトシンの少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％は、化学修飾されている。いくつかの実施形態において、アデニンの少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％は、化学修飾されている。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは更に、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、少なくとも２つの異なるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）結合部位を含む。
いくつかの実施形態において、マイクロＲＮＡは、造血系統の免疫細胞内に発現するか、あるいはＴＬＲ７及び／もしくはＴＬＲ８を発現し炎症促進性サイトカイン及び／もしくはケモカインを分泌する細胞内に発現し、本マイクロＲＮＡにおいてポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は１つ以上の修飾核酸塩基を含む。
いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、造血系統の免疫細胞内に多く存在するマイクロＲＮＡの少なくとも１つの第１のマイクロＲＮＡ結合部位と、内皮細胞内に多く存在するマイクロＲＮＡの少なくとも１つの第２のマイクロＲＮＡ結合部位とを含む。
いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、第１のマイクロＲＮＡ結合部位の複数コピーと、第２のマイクロＲＮＡ結合部位の少なくとも１つのコピーとを含む。
いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、同じマイクロＲＮＡの第１及び第２のマイクロＲＮＡ結合部位を含む。
いくつかの実施形態において、マイクロＲＮＡ結合部位は、同じマイクロＲＮＡの３ｐアーム及び５ｐアームのものである。
いくつかの実施形態において、マイクロＲＮＡ結合部位は、表３または表４から選択される１つ以上のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、マイクロＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１２６、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１４４、ｍｉＲ－１４６、ｍｉＲ－１５０、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－２７もしくはｍｉＲ－２６ａ、またはそれらの任意の組み合わせに結合する。
いくつかの実施形態において、マイクロＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ１２６－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－５ｐもしくはｍｉＲ－１５５、またはそれらの任意の組み合わせに結合する。
いくつかの実施形態において、マイクロＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１２６結合部位である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１４２結合部位である。いくつかの実施形態において、１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１２６結合部位であり、第２のマイクロＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｍｉＲ－１４６－３ｐ、ｍｉＲ－１４６－５ｐ、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４及びｍｉＲ－２７からなる群から選択されるマイクロＲＮＡ用結合部位である。
いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、少なくとも１つのｍｉＲ－１２６－３ｐ結合部位と、少なくとも１つのｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位とを含む。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、少なくとも１つのｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位と、少なくとも１つの１４２－５ｐ結合部位とを含む。
いくつかの実施形態において、マイクロＲＮＡ結合部位は、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ内、あるいはその５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲの両方に位置する。いくつかの実施形態において、マイクロＲＮＡ結合部位は、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ内に位置する。いくつかの実施形態において、マイクロＲＮＡ結合部位は、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ内に位置する。いくつかの実施形態において、マイクロＲＮＡ結合部位は、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ内の両方に位置する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、ｍＲＮＡのコーディング領域の終止コドンに直接隣接する３’ＵＴＲ内に位置する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部は、ｍＲＮＡのコーディング領域の終止コドンより下流にある３’ＵＴＲ７０～８０塩基内に位置する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、ｍＲＮＡのコーディング領域の開始コドンの直前の５’ＵＴＲ内に位置する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、ｍＲＮＡのコーディング領域の開始コドンに先行する５’ＵＴＲ１５～２０ヌクレオチド内に位置する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、ｍＲＮＡのコーディング領域の開始コドンに先行する５’ＵＴＲ７０～８０ヌクレオチド内に位置する。
いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、互いに直接隣接した、または５ヌクレオチド未満、５～１０ヌクレオチド未満、１０～１５ヌクレオチド未満もしくは１５～２０ヌクレオチド未満のスペーサで位置付けられた、同じマイクロＲＮＡ結合部位の複数のコピーを含む。
いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、３’ＵＴＲに位置する同じマイクロＲＮＡ結合部位の複数のコピーを含み、第１のマイクロＲＮＡ結合部位は終止コドンに直接隣接して位置し、第２及び第３のマイクロＲＮＡ結合部位は、第１のマイクロＲＮＡ結合部位の３’末端残基の３０～４０塩基下流に位置する。
いくつかの実施形態において、マイクロＲＮＡ結合部位は、配列番号３６及び配列番号３８から選択される１つ以上のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位はｍｉＲ－１４２に結合する。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位はｍｉＲ－１４２－３ｐまたはｍｉＲ－１４２－５ｐに結合する。いくつかの実施形態において、ｍｉＲ－１４２は、配列番号３４を含む。
いくつかの実施形態において、マイクロＲＮＡ結合部位は、配列番号１５８及び配列番号１６０から選択される１つ以上のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位はｍｉＲ－１２６に結合する。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位はｍｉＲ－１２６－３ｐまたはｍｉＲ－１２６－５ｐに結合する。いくつかの実施形態において、ｍｉＲ－１２６は、配列番号１５６を含む。
いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１２６、またはそれらの組み合わせに結合するマイクロＲＮＡ結合部位を含んだ３’ＵＴＲを含む。
いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡなどのポリヌクレオチドは更に、３’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態において、３’ＵＴＲは、配列番号５７～８１、８４、１４９～１５１、１６１～１７２、１９２～１９９、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される３’ＵＴＲ配列に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％もしくは１００％同一である核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位は、３’ＵＴＲ内に位置する。
いくつかの実施形態において、３’ＵＴＲは、配列番号５７～８１、８４、１４９～１５１、１６１～１７２、１９２～１９９、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、配列番号１４９～１５１、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される核酸配列を含んだ３’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、配列番号１５０の核酸配列を含んだ３’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、配列番号１５１の核酸配列を含んだ３’ＵＴＲを含む。
いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡなどのポリヌクレオチドは更に、５’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲは、配列番号３９～５６、８３、１８９～１９１、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される５’ＵＴＲ配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一である、核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲは、配列番号３９～５６、８３、１８９～１９１、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、配列番号３９の核酸配列を含んだ５’ＵＴＲを含む。
いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡなどのポリヌクレオチドは更に、５’末端キャップを含む。いくつかの実施形態において、５’末端キャップは、キャップ０、キャップ１、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎ１－メチル－グアノシン、２’－フルオロ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、２－アミノ－グアノシン、ＬＮＡ－グアノシン、２－アジドグアノシン、キャップ２、キャップ４、５’メチルＧキャップ、またはそれらの類似体を含む。いくつかの実施形態において、５’末端キャップは、キャップ１を含む。
いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡなどのポリヌクレオチドは更に、ポリＡ領域を含む。いくつかの実施形態において、ポリＡ領域は、少なくとも約１０ヌクレオチド長、少なくとも約２０ヌクレオチド長、少なくとも約３０ヌクレオチド長、少なくとも約４０ヌクレオチド長、少なくとも約５０ヌクレオチド長、少なくとも約６０ヌクレオチド長、少なくとも約７０ヌクレオチド長、少なくとも約８０ヌクレオチド長、または少なくとも約９０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、ポリＡ領域は、約１０～約２００ヌクレオチド長、約２０～約１８０ヌクレオチド長、約５０～約１６０ヌクレオチド長、約７０～約１４０ヌクレオチド長、約８０～約１２０ヌクレオチド長を有する。
いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡなどのポリヌクレオチドは、１つ以上の異種ポリペプチドに融合されたＰＢＧＤポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、１つ以上の異種ポリペプチドによって、ＰＢＧＤポリペプチドの薬物動態特性が増強される。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、対象に投与された際に、配列番号２、４、６、８、または１５３を含む対応するポリヌクレオチドと比較して（ｉ）血漿半減期が延長するか、（ｉｉ）ＯＲＦによりコードされるＰＢＧＤポリペプチドの発現が増加するか、（ｉｉｉ）発現断片を生ずる翻訳中断頻度が低下するか、（ｉｖ）構造安定性が増強されるか、あるいは（ｖ）それらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ヒトアポリポタンパク質Ａ１に融合されたＰＢＧＤポリペプチドをコードする（例えば、配列番号１５５）。
いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡなどのポリヌクレオチドは、（ｉ）５’末端キャップ、（ｉｉ）５’ＵＴＲ、（ｉｉｉ）ＰＢＧＤポリペプチドをコードするＯＲＦ、（ｉｖ）３’ＵＴＲ、ならびに（ｖ）ポリＡ領域を含む。いくつかの実施形態において、３’ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１１８～１４８、例えば、配列番号１３３、１４１、１４４、または１４５からなる群から選択される核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは更に、５’末端キャップ（例えば、キャップ１）及びポリＡ尾部領域（例えば、約１００ヌクレオチド長）を含む。
本開示ではまた、例えば本発明のｍＲＮＡなどのポリヌクレオチドを産生する方法も提供される。本方法は、少なくとも１つのウラシル核酸塩基をアデニン、グアニン、またはシトシン核酸塩基で置換することによって、あるいは少なくとも１つのアデニン、グアニン、またはシトシン核酸塩基をウラシル核酸塩基で置換することによってＰＢＧＤポリペプチドをコードするＯＲＦを修飾することを含み、ここで、全ての置換は同義置換である。いくつかの実施形態において、本方法は更に、ウラシルの少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または約１００％を５－メトキシウラシルで置換することを含む。
本開示ではまた、（ａ）本発明のポリヌクレオチド、例えばｍＲＮＡと、（ｂ）送達剤とを含む組成物も提供される。いくつかの実施形態において、送達剤は、リピドイド、リポソーム、リポプレックス、脂質ナノ粒子、高分子化合物、ペプチド、タンパク質、細胞、ナノ粒子模倣物、ナノチューブ、またはコンジュゲートを含む。いくつかの実施形態において、送達剤は、脂質ナノ粒子を含む。いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子は、３－（ジドデシルアミノ）－Ｎ１，Ｎ１，４－トリドデシル－１－ピペラジンエタンアミン（ＫＬ１０）、Ｎ１－［２（ジドデシルアミノ）エチル］－Ｎ１，Ｎ４，Ｎ４－トリドデシル－１，４－ピペラジンジエタンアミン（ＫＬ２２）、１４，２５－ジトリデシル－１５，１８，２１，２４－テトラアザ－オクタトリアコンタン（ＫＬ２５）、１，２－ジリノールイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル－４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、１，２－ジオールイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、（１３Ｚ，１６５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－ノニドコサ－１３－１６－ジエン－１－アミン（Ｌ６０８）、２－（｛８－［（３β）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ）、（２Ｒ）－２－（｛８－［（３β）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｒ））、（２Ｓ）－２－（｛８－［（３β）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｓ））、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される脂質を含む。いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子は、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡを含む。
いくつかの実施形態において、送達剤は、式（Ｉ）
Figure 2023062097000001
 （Ｉ）
を有する化合物、またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
Ｒ１は、Ｃ５－３０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立に、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらの結合している原子と一緒になって、複素環または炭素環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１－６アルキルからなる群から選択され、Ｑは、炭素環、複素環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、－及びＣ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは独立に、１、２、３、４及び５から選択され、
各Ｒ５は独立に、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は独立に、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’は独立に、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル及びＨからなる群から選択され、
Ｒ８は、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１－６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
各Ｒは独立に、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は独立に、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立に、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は独立に、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは独立に、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘは独立に、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２及び１３から選択され、
Ｒ４が－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲまたは－ＣＱ（Ｒ）２である場合、（ｉ）ｎが１、２、３、４または５のときに、Ｑは－Ｎ（Ｒ）２ではなく、あるいは（ｉｉ）ｎが１または２のときに、Ｑは５員、６員もしくは７員ヘテロシクロアルキルではない、ことを条件とする。
本開示ではまた、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と送達剤とを含む組成物を提供し、送達剤は、式（Ｉ）
Figure 2023062097000002
 （Ｉ）
を有する化合物、またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
Ｒ１は、Ｃ５－３０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立に、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、あるいはＲ２及びＲ３は、それらの結合している原子と一緒になって、複素環または炭素環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１－６アルキルからなる群から選択され、Ｑは、炭素環、複素環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、－及びＣ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは独立に、１、２、３、４及び５から選択され、
各Ｒ５は独立に、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は独立に、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’は独立に、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル及びＨからなる群から選択され、
Ｒ８は、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１－６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
各Ｒは独立に、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は独立に、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立に、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は独立に、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは独立に、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘは独立に、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２及び１３から選択され、
Ｒ４が－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲまたは－ＣＱ（Ｒ）２である場合、（ｉ）ｎが１、２、３、４または５のときに、ＱはＮ（Ｒ）２ではなく、あるいは（ｉｉ）ｎが１または２のときに、Ｑは５員、６員もしくは７員ヘテロシクロアルキルではない、ことを条件とする。
いくつかの実施形態において、送達剤は、式（Ｉ）を有する化合物、またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
Ｒ１は、Ｃ５-20アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立に、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、あるいはＲ２及びＲ３は、それらの結合している原子と一緒になって、複素環または炭素環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１－６アルキルからなる群から選択され、Ｑは、炭素環、複素環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、及び－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは独立に、１、２、３、４及び５から選択され、
各Ｒ５は独立に、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は独立に、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’は独立に、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル及びＨからなる群から選択され、
各Ｒは独立に、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は独立に、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立に、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は独立に、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは独立に、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘは独立に、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２及び１３から選択され、
Ｒ４が－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲまたは－ＣＱ（Ｒ）２である場合、（ｉ）ｎが１、２、３、４または５のときに、Ｑは－Ｎ（Ｒ）２ではなく、あるいは（ｉｉ）ｎが１または２のときに、Ｑは５員、６員もしくは７員ヘテロシクロアルキルではない、ことを条件とする。
いくつかの実施形態において、本化合物は、式（ＩＡ）
Figure 2023062097000003
 （ＩＡ）、
またはこれらの塩もしくは立体異性体であり、式中
ｌは、１、２、３、４及び５から選択され、
ｍは、５、６、７、８及び９から選択され、
Ｍ１は、結合またはＭ’であり、
Ｒ４は、非置換Ｃ１－３アルキルまたは－（ＣＨ２）ｎＱであり、ここでｎは１、２、３、４または５であり、ＱはＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリール、またはヘテロシクロアルキルであり、
Ｍ及びＭ’は独立に、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立に、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、ｍは、５、７、または９である。
いくつかの実施形態において、本化合物は、式（ＩＡ）、またはその塩もしくは立体異性体であり、式中、
ｌは、１、２、３、４及び５から選択され、
ｍは、５、６、７、８及び９から選択され、
Ｍ１は、結合またはＭ’であり、
Ｒ４は、非置換Ｃ１－３アルキルまたは－（ＣＨ２）ｎＱであり、ここでｎは１、２、３、４もしくは５であり、ＱはＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２または－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２であり、
Ｍ及びＭ’は独立に、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、アリール基及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立に、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、ｍは５、７、または９である。
いくつかの実施形態において、本化合物は、式（ＩＩ）
Figure 2023062097000004
 （ＩＩ）、
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
ｌは、１、２、３、４及び５から選択され、
Ｍ１は、結合またはＭ’であり、
Ｒ４は、非置換Ｃ１－３アルキルまたは－（ＣＨ２）ｎＱであり、そこでｎは２、３もしくは４であり、ＱはＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであり、
Ｍ及びＭ’は独立に、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立に、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、本化合物は、式（ＩＩ）またはその塩もしくは立体異性体であり、式中、
ｌは、１、２、３、４及び５から選択され、
Ｍ１は、結合またはＭ’であり、
Ｒ４は、非置換Ｃ１－３アルキルまたは－（ＣＨ２）ｎＱであり、ここでｎは２、３もしくは４であり、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２または－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２であり、
Ｍ及びＭ’は独立に、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立に、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、Ｍ１はＭ’である。
いくつかの実施形態において、Ｍ及びＭ’は独立に、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－または－ＯＣ（Ｏ）－である。
いくつかの実施形態において、ｌは、１、３または５である。
いくつかの実施形態において、本化合物は、化合物１～化合物２３２、それらの塩及び立体異性体、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、本化合物は、化合物１～化合物１４７、それらの塩及び立体異性体、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、本化合物は、式（ＩＩａ）
Figure 2023062097000005
 （ＩＩａ）、
またはその塩もしくは立体異性体である。
いくつかの実施形態において、本化合物は、式（ＩＩｂ）
Figure 2023062097000006
 （ＩＩｂ）、
またはその塩もしくは立体異性体である。
いくつかの実施形態において、本化合物は、式（ＩＩｃ）または（ＩＩｅ）
Figure 2023062097000007
 （ＩＩｃ）、
Figure 2023062097000008
 （ＩＩｅ）、
またはそれらの塩もしくは立体異性体である。
いくつかの実施形態において、Ｒ４は、本明細書に記載されているとおりである。いくつかの実施形態において、Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎＱ及び－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲから選択される。
いくつかの実施形態において、本化合物は、式（ＩＩｄ）
Figure 2023062097000009
 （ＩＩｄ）、
またはそれらの塩もしくは立体異性体であり、
式中、ｎは２、３、及び４から選択され、ｍ、Ｒ’、Ｒ”及びＲ２～Ｒ６は本明細書に記載されているとおりである。例えば、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立に、Ｃ５－１４アルキル及びＣ５－１４アルケニルからなる群から選択され得る。
いくつかの実施形態において、本化合物は、式（ＩＩｄ）またはその塩もしくは立体異性体であり、
式中、Ｒ２及びＲ３は独立に、Ｃ５－１４アルキル及びＣ５－１４アルケニルからなる群から選択され、ｎは２、３、及び４から選択され、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ５、Ｒ６及びｍは本明細書中に定義されているとおりである。
いくつかの実施形態において、Ｒ２は、Ｃ８アルキルである。
いくつかの実施形態において、Ｒ３は、Ｃ５アルキル、Ｃ６アルキル、Ｃ７アルキル、Ｃ８アルキル、またはＣ９アルキルである。
いくつかの実施形態において、ｍは５、７、または９である。
いくつかの実施形態において、各Ｒ５は、Ｈである。
いくつかの実施形態において、各Ｒ６は、Ｈである。いくつかの実施形態において、送達剤は、式（ＩＩＩ）
Figure 2023062097000010
 （ＩＩＩ）
を有する化合物、またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
環Ａは
Figure 2023062097000011
 または
Figure 2023062097000012
 であり、
ｔは１または２であり、
Ａ１及びＡ２はそれぞれ独立に、ＣＨまたはＮから選択され、
ＺはＣＨ２であるかまたは存在せず、ＺがＣＨ２である場合、破線（１）及び（２）はそれぞれ単結合を表し、Ｚが存在しない場合、破線（１）及び（２）は両方とも存在せず、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は独立に、Ｃ５－２０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ”ＭＲ’、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択され、
各Ｍは独立に、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、アリール基、及びヘテロアリール基からなる群から選択され、
Ｘ１、Ｘ２及びＸ３は独立に、結合、－ＣＨ２－、－（ＣＨ２）２－、－ＣＨＲ－、－ＣＨＹ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－ＣＨ２－、－ＯＣ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＣＨ２－ＯＣ（Ｏ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｃ（Ｓ）－、及び－ＣＨ（ＳＨ）－からなる群から選択され、
各Ｙは独立に、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｒ＊は独立に、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒは独立に、Ｃ１－３アルキル及びＣ３－６炭素環からなる群から選択され、
各Ｒ’は独立に、Ｃ１－１２アルキル、Ｃ２－１２アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立に、Ｃ３－１２アルキル及びＣ３－１２アルケニルからなる群から選択され、
環Ａが
Figure 2023062097000013
 である場合、
ｉ）Ｘ１、Ｘ２及びＸ３のうちの少なくとも１つは、ＣＨ２ではなく、及び／または
ｉｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５のうちの少なくとも１つは、Ｒ”ＭＲ’である。
いくつかの実施形態において、本化合物は、式（ＩＩＩａ１）～（ＩＩＩａ６）のいずれか：
Figure 2023062097000014
 （ＩＩＩａ１）、
Figure 2023062097000015
 （ＩＩＩａ２）、
Figure 2023062097000016
 （ＩＩＩａ３）、
Figure 2023062097000017
 （ＩＩＩａ４）、
Figure 2023062097000018
 （ＩＩＩａ５）、または
Figure 2023062097000019
 （ＩＩＩａ６）
の化合物である。
式（ＩＩＩ）または（ＩＩＩａ１）～（ＩＩＩａ６）のいずれかの化合物は、該当する場合、以下の特徴のうちの１以上を含む。
いくつかの実施形態において、環Ａは
Figure 2023062097000020
 である。
いくつかの実施形態において、環Ａは
Figure 2023062097000021
 である。
いくつかの実施形態において、環Ａは
Figure 2023062097000022
 である。
いくつかの実施形態において、環Ａは
Figure 2023062097000023
 である。
いくつかの実施形態において、環Ａは
Figure 2023062097000024
 である。
いくつかの実施形態において、環Ａは
Figure 2023062097000025
 であり、
環中、Ｎ原子は、Ｘ２に結合されている。
いくつかの実施形態において、ＺはＣＨ２である。
いくつかの実施形態において、Ｚは存在しない。
いくつかの実施形態において、Ａ１及びＡ２のうちの少なくとも１つは、Ｎである。
いくつかの実施形態において、Ａ１及びＡ２の各々は、Ｎである。
いくつかの実施形態において、Ａ１及びＡ２の各々は、ＣＨである。
いくつかの実施形態において、Ａ１はＮであり、Ａ２はＣＨである。
いくつかの実施形態において、Ａ１はＣＨであり、Ａ２はＮである。
いくつかの実施形態において、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３のうちの少なくとも１つは、－ＣＨ２－ではない。例えば、ある特定の実施形態において、Ｘ１は－ＣＨ２－ではない。いくつかの実施形態において、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３のうちの少なくとも１つは、－Ｃ（Ｏ）－である。
いくつかの実施形態において、Ｘ２は、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－ＣＨ２－、－ＯＣ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）Ｏ－または－ＣＨ２－ＯＣ（Ｏ）－である。
いくつかの実施形態において、Ｘ３は、－Ｃ（Ｏ）－、Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－ＣＨ２－、－ＯＣ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、または－ＣＨ２－ＯＣ（Ｏ）－である。他の実施形態において、Ｘ３は－ＣＨ２－である。
いくつかの実施形態において、Ｘ３は、結合または－（ＣＨ２）２－である。
いくつかの実施形態において、Ｒ１及びＲ２は同じである。ある特定の実施形態において、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は同じである。いくつかの実施形態において、Ｒ４及びＲ５は同じである。ある特定の実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は同じである。
いくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５のうちの少なくとも１つは、－Ｒ”ＭＲ’である。いくつかの実施形態において、多くともＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５の１つは、－Ｒ”ＭＲ’である。例えば、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３のうちの少なくとも１つはＲ”ＭＲ’であり得、及び／またはＲ４及びＲ５のうちの少なくとも１つは－Ｒ”ＭＲ’である。ある特定の実施形態において、少なくとも１つのＭは－Ｃ（Ｏ）Ｏ－である。いくつかの実施形態において、各Ｍは－Ｃ（Ｏ）Ｏ－である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＭは－ＯＣ（Ｏ）－である。いくつかの実施形態において、各Ｍは－ＯＣ（Ｏ）－である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＭは－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－である。いくつかの実施形態において、各Ｍは－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲ”は、Ｃ３アルキルである。ある特定の実施形態において、各Ｒ”は、Ｃ３アルキルである。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲ”は、Ｃ５アルキルである。ある特定の実施形態において、各Ｒ”は、Ｃ５アルキルである。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲ”は、Ｃ６アルキルである。ある特定の実施形態において、各Ｒ”は、Ｃ６アルキルである。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲ”は、Ｃ７アルキルである。ある特定の実施形態において、各Ｒ”は、Ｃ７アルキルである。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲ’は、Ｃ５アルキルである。ある特定の実施形態において、各Ｒ’は、Ｃ５アルキルである。他の実施形態において、少なくとも１つのＲ’は、Ｃ１アルキルである。ある特定の実施形態において、各Ｒ’は、Ｃ１アルキルである。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲ’は、Ｃ２アルキルである。ある特定の実施形態において、各Ｒ’は、Ｃ２アルキルである。
いくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５のうちの少なくとも１つは、Ｃ１２アルキルである。ある特定の実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５の各々は、Ｃ１２アルキルである。
いくつかの実施形態において、送達剤は、式（ＩＶ）
Figure 2023062097000026
 （ＩＶ）
を有する化合物、またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
Ａ１及びＡ２はそれぞれ独立にＣＨまたはＮから選択され、Ａ１及びＡ２のうちの少なくとも１つはＮであり、
ＺはＣＨ２であるかまたは存在せず、ＺがＣＨ２である場合、破線（１）及び（２）はそれぞれ単結合を表し、Ｚが存在しない場合、破線（１）及び（２）は両方とも存在せず、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は独立に、Ｃ６－２０アルキル及びＣ６－２０アルケニルからなる群から選択され、
環Ａが
Figure 2023062097000027
 である場合、
（ｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は同じであり、Ｒ１はＣ１２アルキル、Ｃ１８アルキルまたはＣ１８アルケニルではないか、
（ｉｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５のうちの１つのみがＣ６－２０アルケニルから選択されるか、
（ｉｉｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５のうちの少なくとも１つは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５の他の少なくとも１つとは異なる数の炭素原子を有するか、
（ｉｖ）Ｒ１、Ｒ２及びＲ３はＣ６－２０アルケニルから選択され、Ｒ４及びＲ５はＣ６－２０アルキルから選択されるか、あるいは
（ｖ）Ｒ１、Ｒ２及びＲ３はＣ６－２０アルキルから選択され、Ｒ４及びＲ５はＣ６－２０アルケニルから選択される。
いくつかの実施形態において、本化合物は、式（ＩＶａ）
Figure 2023062097000028
 （ＩＶａ）
である。
式（ＩＶ）または（ＩＶａ）の化合物は、適用可能な場合、以下の特徴のうちの１以上を含む。
いくつかの実施形態において、ＺはＣＨ２である。
いくつかの実施形態において、Ｚは存在しない。
いくつかの実施形態において、Ａ１及びＡ２のうちの少なくとも１つはＮである。
いくつかの実施形態において、Ａ１及びＡ２の各々は、Ｎである。
いくつかの実施形態において、Ａ１及びＡ２の各々は、ＣＨである。
いくつかの実施形態において、Ａ１はＮであり、Ａ２はＣＨである。
いくつかの実施形態において、Ａ１はＣＨであり、Ａ２はＮである。
いくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は同じであって、Ｃ１２アルキル、Ｃ１８アルキルまたはＣ１８アルケニルではない。いくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は同じであって、Ｃ９アルキルまたはＣ１４アルキルである。
いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５のうちの１つのみが、Ｃ６－２０アルケニルから選択される。そのようなある特定の実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、同数の炭素原子を有する。いくつかの実施形態において、Ｒ４は、Ｃ５－２０アルケニルから選択される。例えば、Ｒ４は、Ｃ１２アルケニルまたはＣ１８アルケニルであり得る。
いくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５のうちの少なくとも１つは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５の他の少なくとも１つとは異なる数の炭素原子を有する。
ある特定の実施形態において、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３はＣ６－２０アルケニルから選択され、Ｒ４及びＲ５はＣ６－２０アルキルから選択される。他の実施形態において、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３はＣ６－２０アルキルから選択され、Ｒ４及びＲ５はＣ６－２０アルケニルから選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は同数の炭素原子を有し、及び／またはＲ４及びＲ５は同数の炭素原子を有する。例えば、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３、またはＲ４及びＲ５は、６、８、９、１２、１４もしくは１８個の炭素原子を有し得る。いくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３、またはＲ４及びＲ５は、Ｃ１８アルケニル（例えばリノレイル）である。いくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３、またはＲ４及びＲ５は、６、８、９、１２もしくは１４個の炭素原子を有するアルキル基である。
いくつかの実施形態において、Ｒ１の炭素原子数は、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５とは異なる。他の実施形態において、Ｒ３の炭素原子数は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４及びＲ５とは異なる。更なる実施形態において、Ｒ４の炭素原子数は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ５とは異なる。
他の実施形態において、送達剤は、式（Ｖ）
Figure 2023062097000029
 （Ｖ）
を有する化合物、またはそれらの塩もしくは立体異性体を含み、式中、
Ａ３は、ＣＨまたはＮであり、
Ａ４はＣＨ２またはＮＨであり、Ａ３及びＡ４のうちの少なくとも１つはＮまたはＮＨであり、
ＺはＣＨ２であるかまたは存在せず、ＺがＣＨ２である場合、破線（１）及び（２）はそれぞれ単結合を表し、Ｚが存在しない場合、破線（１）及び（２）は両方とも存在せず、
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は独立に、Ｃ５－２０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ”ＭＲ’、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択され、
各Ｍは独立に、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、アリール基及びヘテロアリール基から選択され、
Ｘ１及びＸ２は独立に、－ＣＨ２－、（－ＣＨ２）２－、－ＣＨＲ－、－ＣＨＹ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ２－、－ＯＣ（Ｏ）ＣＨ２－、－ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｃ（Ｓ）－及び－ＣＨ（ＳＨ）－からなる群から選択され、
各Ｙは独立に、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｒ＊は独立に、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒは独立に、Ｃ１－３アルキル及びＣ３－６炭素環からなる群から選択され、
各Ｒ’は独立に、Ｃ１－１２アルキル、Ｃ２－１２アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立に、Ｃ３－１２アルキル及びＣ３－１２アルケニルからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、本化合物は、式（Ｖａ）
Figure 2023062097000030
 （Ｖａ）
の化合物である。
式（Ｖ）または（Ｖａ）の化合物は、適用可能な場合、次の特徴のうちの１つ以上を含む。
いくつかの実施形態において、ＺはＣＨ２である。
いくつかの実施形態において、Ｚは存在しない。
いくつかの実施形態において、Ａ３及びＡ４のうちの少なくとも１つは、ＮまたはＮＨである。
いくつかの実施形態において、Ａ３はＮであり、Ａ４はＮＨである。
いくつかの実施形態において、Ａ３はＮであり、Ａ４はＣＨ２である。
いくつかの実施形態において、Ａ３はＣＨであり、Ａ４はＮＨである。
いくつかの実施形態において、Ｘ１及びＸ２のうちの少なくとも１つは－ＣＨ２－ではない。例えば、ある特定の実施形態において、Ｘ１は－ＣＨ２－ではない。いくつかの実施形態において、Ｘ１及びＸ２のうちの少なくとも１つは、－Ｃ（Ｏ）－である。
いくつかの実施形態において、Ｘ２は、－Ｃ（Ｏ）－、Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－ＣＨ２－、－ＯＣ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、または－ＣＨ２－ＯＣ（Ｏ）－である。
いくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は独立に、Ｃ５－２０アルキル及びＣ５－２０アルケニルからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、同じである。ある特定の実施形態において、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、Ｃ６、Ｃ９、Ｃ１２またはＣ１４アルキルである。他の実施形態において、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、Ｃ１８アルケニルである。例えば、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、リノレイルであり得る。
他の実施形態において、送達剤は、式（ＶＩ）
Figure 2023062097000031
 （ＶＩ）
を有する化合物、またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
Ａ６及びＡ７はそれぞれ独立に、ＣＨまたはＮから選択され、Ａ６及びＡ７のうちの少なくとも１つはＮであり、
ＺはＣＨ２であるかまたは存在せず、ＺがＣＨ２である場合、破線（１）及び（２）はそれぞれ単結合を表し、Ｚが存在しない場合、破線（１）及び（２）は両方とも存在せず、
Ｘ４及びＸ５は独立に、－ＣＨ２－、－（ＣＨ２）２－、－ＣＨＲ－、－ＣＨＹ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－ＣＨ２－、－ＯＣ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＣＨ２－ＯＣ（Ｏ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｃ（Ｓ）－及び－ＣＨ（ＳＨ）－からなる群から選択され、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５はそれぞれ独立に、Ｃ５－２０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ”ＭＲ’、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択され、
各Ｍは独立に、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、アリール基、及びヘテロアリール基からなる群から選択され、
各Ｙは独立に、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｒ＊は独立に、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒは独立に、Ｃ１－３アルキル及びＣ３－６炭素環からなる群から選択され、
各Ｒ’は独立に、Ｃ１－１２アルキル、Ｃ２－１２アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立に、Ｃ３－１２アルキル及びＣ３－１２アルケニルからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５はそれぞれ独立に、Ｃ６－２０アルキル及びＣ６－２０アルケニルからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、Ｒ１及びＲ２は同じである。ある特定の実施形態において、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は同じである。いくつかの実施形態において、Ｒ４及びＲ５は同じである。ある特定の実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は同じである。
いくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５のうちの少なくとも１つは、Ｃ９－１２アルキルである。ある特定の実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５はそれぞれ独立に、Ｃ９、Ｃ１２またはＣ１４アルキルである。ある特定の実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５の各々は、Ｃ９アルキルである。
いくつかの実施形態において、Ａ６はＮであり、Ａ７はＮである。いくつかの実施形態において、Ａ６はＣＨであり、Ａ７はＮである。
いくつかの実施形態において、Ｘ４は－ＣＨ２－であり、Ｘ５は－Ｃ（Ｏ）－である。いくつかの実施形態において、Ｘ４及びＸ５は－Ｃ（Ｏ）－である。
いくつかの実施形態において、Ａ６がＮであり、Ａ７がＮであるとき、Ｘ４及びＸ５のうちの少なくとも１つはＣＨ２ではない（例えば、Ｘ４及びＸ５のうちの少なくとも１つは－Ｃ（Ｏ）－である）。いくつかの実施形態において、Ａ６がＮであり、Ａ７がＮであるとき、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５のうちの少なくとも１つは、－Ｒ”ＭＲ’である。
いくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５のうちの少なくとも１つは、－Ｒ”ＭＲ’ではない。
いくつかの実施形態において、本明細書中に開示される組成物は、ナノ粒子組成物である。いくつかの実施形態において、送達剤は更に、リン脂質を含む。いくつかの実施形態において、リン脂質は、
１，２－ジリノレイル－ｓｎ－グリセロ３ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、
１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロホスホコリン（ＤＭＰＣ）、
１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ３ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、
１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ３ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、
１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ３ホスホコリン（ＤＳｐＣ）、
１，２－ジウンデカノイル－ｓｎ－グリセロホスホコリン（ＤＵＰＣ）、
１パルミトイル２オレオイル－ｓｎ－グリセロ３ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、
１，２－ジオクタデセニル－ｓｎ－グリセロ３ホスホコリン（１８：０ジエーテルＰＣ）、
１オレオイル２コレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ３ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、
１ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ３ホスホコリン（Ｃ１６リゾＰＣ）、
１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ３ホスホコリン、
１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ３ホスホコリン、
１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ３ホスホコリン、
１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ３ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、
１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ３ホスホエタノールアミン（ＭＥ １６：０ ＰＥ）、
１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ３ホスホエタノールアミン、
１，２－ジリノレイル－ｓｎ－グリセロ３ホスホエタノールアミン、
１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ３ホスホエタノールアミン、
１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ３ホスホエタノールアミン、
１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ３ホスホエタノールアミン、
１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ３ホスホラク（１グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、
スフィンゴミエリン、及びそれらの任意の混合物からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、送達剤は更に、構造脂質を含む。いくつかの実施形態において、構造脂質は、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、ウルソル酸、アルファ－トコフェロール、及びそれらの任意の混合物からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、送達剤は更に、ＰＥＧ脂質を含む。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの任意の混合物からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ脂質は、式
Figure 2023062097000032
 を有し、ｒは整数１～１００の間である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ脂質は化合物４２８である。
いくつかの実施形態において、送達剤は更に、
３－（ジドデシルアミノ）－Ｎ１，Ｎ１，４－トリドデシル－１－ピペラジンエタンアミン（ＫＬ１０）、
Ｎ１－［２（ジドデシルアミノ）エチル］－Ｎ１，Ｎ４，Ｎ４－トリドデシル－１，４ピペラジンジエタンアミン（ＫＬ２２）、
１４，２５－ジトリデシル－１５，１８，２１，２４－テトラアザ－オクタトリアコンタン（ＫＬ２５）、
１，２－ジリノールイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＭＡ）、
２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、
ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル－４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、
２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、
１，２－ジオールイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、
２－（｛８－［（３β）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ）、
（２Ｒ）－２－（｛８－［（３β）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｒ））、
及び（２Ｓ）－２－（｛８－［（３β）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｓ））
からなる群から選択される、イオン性脂質を含む。
いくつかの実施形態において、送達剤は更に、リン脂質、構造脂質、ＰＥＧ脂質、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、送達剤は、化合物１８、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物４２８（例えば、モル比を約５０：１０：３８．５：１．５としたもの）を含む。
いくつかの実施形態では、本組成物をｉｎ ｖｉｖｏ送達用に調合する。いくつかの実施形態では、本組成物を、筋肉内投与、皮下投与または皮内送達用に製剤化する。
本開示では更に、（ｉ）５’ＵＴＲ、（ｉｉ）ヒトポルフォビリノゲン脱アミノ酵素（ＰＢＧＤ）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（ＯＲＦは配列番号９～３３及び８９～１１７からなる群から選択される核酸配列を含む）、及び（ｉｉｉ）ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１２６、またはそれらの組み合わせから選択されるマイクロＲＮＡ結合部位を含む３’ＵＴＲ（ｍＲＮＡは少なくとも１つの化学修飾された核酸塩基を含む）を含むｍＲＮＡを含んだポリヌクレオチドも、提供される。
本開示では更に、（ｉ）５’末端キャップ、（ｉｉ）配列番号３９～５６、８３、１８９～１９１及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される配列を含む５’ＵＴＲ、（ｉｉｉ）ヒトポルフィビリノゲン脱アミノ酵素（ＰＢＧＤ）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（ＯＲＦは配列番号９～３３、ならびに８９～１１７からなる群から選択される配列を含み、ｍＲＮＡはシュードウラシル（Ψ）、Ｎ１－メチルシュードウラシル（ｍ１Ψ）、１－エチルシュードウラシル、２－チオウラシル（ｓ２Ｕ）、４’－チオウラシル、５－メチルシトシン、５－メチルウラシル、５－メトキシウラシル及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの選択的に化学修飾された核酸塩基を含む）、及び（ｉｖ）配列番号５７～８１、８４、１４９～１５１、１６１～１７２、１９２～１９９及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される核酸配列を含む３’ＵＴＲ、及び（ｖ）ポリＡ領域を含むｍＲＮＡを含んだポリヌクレオチドも、提供される。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１３３、１４１、１４４、及び１４５からなる群から選択される核酸配列を含む。
本開示では更に、ｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド、及び送達剤を含む医薬組成物が提供される。いくつかの実施形態において、送達剤は、化合物１８、化合物２３６、その塩もしくは立体異性体、またはそれらの任意の組み合わせを含む脂質ナノ粒子である。いくつかの実施形態において、本明細書中に開示されるＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、例えば式（Ｉ）を有する化合物、例えば化合物１～２３２のいずれか（例えば化合物１８）；式（ＩＩＩ）を有する化合物、（ＩＶ）、（Ｖ）もしくは（ＶＩ）、例えば化合物２３３～３４２のいずれか（例えば化合物２３６）；あるいは式（ＶＩＩＩ）を有する化合物、例えば化合物４１９～４２８のいずれか（例えば化合物４２８）；あるいはそれらの任意の組み合わせを含む送達剤を用いて製剤化される。いくつかの実施形態において、送達剤は、化合物１８、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物４２８（例えば、モル比を約５０：１０：３８．５：１．５としたもの）を含む。
本明細書中に開示される実施形態の一態様において、対象は、急性間欠性ポルフィリン症（ＡＩＰ）及び／もしくは急性ポルフィリン症の治療または予防を必要とするヒト対象である。
本明細書中に開示される実施形態の一態様では、対象に投与した場合、ｍＲＮＡは、配列番号２、４、６もしくは８の核酸配列を有する対応するｍＲＮＡと比較して、及び／またはネイキッドｍＲＮＡとして投与した場合と比較して、（ｉ）血漿半減期が延長するか、（ｉｉ）ＯＲＦをによりコードされるＰＢＧＤポリペプチドの発現が増加するか、（ｉｉｉ）発現断片を生ずる翻訳中断頻度が低下するか、（ｉｖ）構造安定性が増強されるか、あるいは（ｖ）それらの任意の組み合わせである。
いくつかの実施形態において、本明細書中に開示される医薬組成物またはポリヌクレオチドは、単一単位用量または複数回の単一単位用量としての投与に好適である。
いくつかの実施形態において、本明細書中に開示される医薬組成物またはポリヌクレオチドは、対象においてＡＩＰの１つ以上のバイオマーカーのレベルを低減させるのに好適である。
いくつかの実施形態において、本明細書中に開示される医薬組成物またはポリヌクレオチドは、対象におけるＡＩＰの徴候もしくは症状の発症を治療、予防または遅延させる際に使用するためのものである。いくつかの実施形態において、徴候もしくは症状としては、疼痛、発作、麻痺、神経障害、死亡、またはそれらの組み合わせが挙げられる。
本開示ではまた、本発明のポリヌクレオチドを含む宿主細胞も提供される。いくつかの実施形態において、宿主細胞は真核生物細胞である。本開示ではまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターも提供される。また、ポリヌクレオチドを酵素的にまたは化学的に合成することを含む、本発明のポリヌクレオチドの製造方法も提供される。本開示ではまた、本発明のポリヌクレオチド、本発明のポリヌクレオチドを含む組成物、本発明のポリヌクレオチドを含む宿主細胞、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、または本明細書に開示される製造方法で生成されるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドも提供される。
本開示ではまた、活性ＰＢＧＤポリペプチドをｉｎ ｖｉｖｏで発現させることを、それを必要とする対象において行う方法も提供される。本方法は、有効量の本発明のポリヌクレオチド、本発明のポリヌクレオチドを含む組成物、本発明のポリヌクレオチドを含む宿主細胞、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを、対象に投与することを含む。また、急性間欠性ポルフィリン症（ＡＩＰ）を治療することを、それを必要とする対象において行う方法も提供される。本方法は、有効量の本発明のポリヌクレオチド、本発明のポリヌクレオチドを含む組成物、本発明のポリヌクレオチドを含む宿主細胞、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のポリヌクレオチドを含む組成物を、対象に投与することを含み、本投与によって、対象のＡＩＰの徴候もしくは症状を緩和するものである。
本開示ではまた、ＡＩＰの徴候もしくは症状の発症を予防または遅延させることを、それを必要とする対象において行う方法も提供される。本方法は、ＡＩＰの徴候もしくは症状が顕在化する前の対象に、予防有効量の本発明のポリヌクレオチド、本発明のポリヌクレオチドを含む組成物、本発明のポリヌクレオチドを含む宿主細胞、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを投与することを含み、本投与によって、対象におけるＡＩＰの徴候もしくは症状の発症を予防または遅延させるものである。また、それを必要とする対象においてＡＩＰの徴候もしくは症状を緩和させる方法も提供される。本方法は、ＡＩＰの徴候もしくは症状が顕在化する前の対象に、治療有効量の本発明のポリヌクレオチド、本発明のポリヌクレオチドを含む組成物、本発明のポリヌクレオチドを含む宿主細胞、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを投与することを含み、本投与によって、対象におけるＡＩＰの徴候もしくは症状を緩和させるものである。
本開示では更に、ポルフォビリノゲン脱アミノ酵素（ＰＢＧＤ）ポリペプチドを発現させることを、それを必要とするヒト対象において行う方法が提供される。本方法は、有効量の本明細書に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド、例えばｍＲＮＡを対象に投与することを含み、本医薬組成物またはポリヌクレオチドは、対象に対し単回用量、または複数回の単一単位用量として投与するのに好適とされる。
本開示では更に、急性間欠性ポルフィリン症（ＡＩＰ）の徴候もしくは症状の発症を治療、予防または遅延させることを、それを必要とするヒト対象において行う方法が提供される。本方法は、有効量の本明細書に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド、例えばｍＲＮＡを対象に投与することを含み、本投与によって、対象におけるＡＩＰの徴候もしくは症状のうちの１つ以上の発症を治療、予防または遅延させるものである。
本開示では更に、急性間欠性ポルフィリン症（ＡＩＰ）の治療方法が提供される。本方法は、本明細書に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド（例えばｍＲＮＡ）をＡＩＰに罹患しているヒト対象に単回静脈内投与することを含む。
本開示では更に、ヒト対象におけるアミノレブリン酸（ＡＬＡ）、ポルフォビリノゲン（ＰＢＧ）及び／またはポルフィリンの尿中排泄レベルを低減させる方法が提供される。本方法は、有効量の本明細書に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド、例えばｍＲＮＡを対象に投与することを含み、本投与によって、対象におけるＡＬＡ、ＰＢＧ及び／またはポルフィリンの尿中排泄レベルを低減させるものである。いくつかの実施形態では、
（ｉ）ＡＬＡの尿中排泄レベルを、投与後少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、または少なくとも１２０時間にわたって対照標準であるＡＬＡ排泄レベル（急性ポルフィリン症発作時）と比較して少なくとも２分の１に、少なくとも５分の１に、少なくとも１０分の１に、少なくとも２０分の１に、または少なくとも５０分の１に低減させる、
（ｉｉ）ＰＢＧの尿中排泄レベルを、投与後少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、または少なくとも１２０時間にわたって対照標準であるＰＢＧ排泄レベル（急性ポルフィリン症発作時）と比較して少なくとも２分の１に、少なくとも５分の１に、少なくとも１０分の１に、少なくとも２０分の１に、または少なくとも５０分の１に低減させる、及び／または
（ｉｉｉ）ポルフィリンの尿中排泄レベルを、投与後少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、または少なくとも１２０時間にわたって対照標準であるポルフィリン排泄レベル（急性ポルフィリン症発作時）と比較して少なくとも２分の１に、少なくとも５分の１に、少なくとも１０分の１に、少なくとも２０分の１に、または少なくとも５０分の１に低減させる。
本開示は更に、ヒト対象におけるアミノレブリン酸（ＡＬＡ）、ポルフォビリノゲン（ＰＢＧ）及び／またはポルフィリンの尿中排泄レベルを低減させる方法を提供する。本方法は、有効量の本明細書に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチドを対象に投与することを含み、本投与によって、対象におけるＡＬＡ、ＰＢＧ及び／またはポルフィリンの尿中排泄レベルを低減させるものである。いくつかの実施形態では、
（ｉ）ＡＬＡの尿中排泄レベルを、投与後少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、または少なくとも１２０時間にわたって対象のベースラインレベルまたは対照標準であるＡＬＡの排泄レベル（例えば、ＡＩＰに罹患する対象、または急性ポルフィリン症発作時）と比較して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％低減させる、
（ｉｉ）ＰＢＧの尿中排泄レベルを、投与後少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、または少なくとも１２０時間にわたって対象のベースラインレベルまたは対照標準であるＰＢＧの排泄レベル（例えば、ＡＩＰに罹患する対象、または急性ポルフィリン症発作時）と比較して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％低減させる、及び／または
（ｉｉｉ）ポルフィリンの尿中排泄レベルを、投与後少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、または少なくとも１２０時間にわたって対象のベースラインレベルまたは対照標準であるポルフィリンの排泄レベル（例えば、ＡＩＰに罹患する対象、または急性ポルフィリン症発作時）と比較して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％低減させる。
本開示では更に、ヒト対象におけるアラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ）及び／または血清中ビリルビンレベルを低減させる方法も提供される。本方法は、有効量の本明細書に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド、例えばｍＲＮＡを対象に投与することを含み、本投与によって、対象におけるＡＬＴ、ＡＳＴ及び／または血清中ビリルビンレベルを低減させるものである。いくつかの実施形態では、
（ｉ）血清中ＡＬＴレベルを、投与後少なくとも２４時間以内、少なくとも４８時間以内、少なくとも７２時間以内、少なくとも９６時間以内、または少なくとも１２０時間以内に、対照標準である血清中ＡＬＴレベルと比較して少なくとも１０分の１以内まで、少なくとも５分の１以内まで、少なくとも２分の１以内まで、または少なくとも１．５分の１以内まで低減させる、
（ｉｉ）血清中ＡＳＴレベルを、投与後少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、または少なくとも１２０時間にわたって、対照標準である血清中ＡＳＴレベルと比較して少なくとも１０分の１以内まで、少なくとも５分の１以内まで、少なくとも２分の１以内まで、または少なくとも１．５分の１以内まで低減させる、及び／または
（ｉｉｉ）血清中ビリルビンレベルを、投与後少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、または少なくとも１２０時間にわたって対照標準である血清中ビリルビンレベルと比較して少なくとも１０分の１以内まで、少なくとも５分の１以内まで、少なくとも２分の１以内まで、または少なくとも１．５分の１以内まで低減させる。
本開示では更に、ヒト対象におけるアラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ）及び／または血清中ビリルビンレベルを低減させる方法が提供される。本方法は、有効量の本明細書に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチドを対象に投与することを含み、本投与によって、対象におけるＡＬＴ、ＡＳＴ及び／または血清中ビリルビンレベルを低減させるものである。いくつかの実施形態では、
（ｉ）血清中ＡＬＴレベルを、投与後少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、または少なくとも１２０時間以内に、対象のベースラインレベルまたは対照標準である血清中ＡＬＴレベル（例えば、ＡＩＰに罹患する対象、または急性ポルフィリン症発作時）と比較して、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、または少なくとも３０％低減させる、
（ｉｉ）血清中ＡＳＴレベルを、投与後少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、または少なくとも１２０時間にわたって対象のベースラインレベルまたは対照標準である血清中ＡＳＴレベル（例えば、ＡＩＰに罹患する対象、または急性ポルフィリン症発作時）と比較して、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、または少なくとも３０％低減させる、且つ／あるいは
（ｉｉｉ）血清中ビリルビンレベルを、投与後少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、または少なくとも１２０時間にわたって対象のベースラインレベルまたは対照標準である血清中ビリルビンレベル（例えば、ＡＩＰに罹患する対象、または急性ポルフィリン症発作時）と比較して、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、または少なくとも３０％低減させる。
いくつかの実施形態では、医薬組成物またはポリヌクレオチドを対象に投与してから１２時間後に、対象におけるＰＢＧＤ活性が、対象のベースラインＰＢＧＤ活性と比較して少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、または少なくとも６００％増加する。
いくつかの実施形態では、対象の肝臓におけるＰＢＧＤ活性が増加する。
いくつかの実施形態において、ＰＢＧＤ活性の上昇は、２４時間超、３６時間超、４８時間超、６０時間超、７２時間超または９６時間超にわたって持続する。
いくつかの実施形態では、急性ポルフィリン症発作時の対象に、医薬組成物またはポリヌクレオチドを投与する。
いくつかの実施形態において、医薬組成物またはポリヌクレオチドを対象に投与した後、例えば２４時間以内に、対象におけるＡＬＡのレベルは、対象のベースラインＡＬＡと比較して、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または１００％低下する。
いくつかの実施形態では、対象の尿、血漿、血清、及び／または肝臓のうちの１以上において、ＡＬＡレベルが低下する。
いくつかの実施形態において、対象への投与後、対象におけるＡＬＡのレベルは、対象におけるベースラインレベルと比較して少なくとも１日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、または少なくとも１か月間にわたって低下する。
いくつかの実施形態において、医薬組成物またはポリヌクレオチドを対象に投与した後、例えば２４時間以内に、対象のＰＢＧレベルは、対象のベースラインＡＬＡと比較して、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または１００％低下する。
いくつかの実施形態では、対象の尿、血漿、血清、及び／または肝臓のうちの１以上において、ＰＢＧレベルが低下する。
いくつかの実施形態において、対象への投与後、対象におけるＰＢＧのレベルは、対象におけるベースラインレベルと比較して少なくとも１日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、または少なくとも１か月間にわたって低下する。
いくつかの実施形態において、医薬組成物またはポリヌクレオチドを対象に投与した後、例えば２４時間以内に、対象におけるポルフィリンレベルは、対象におけるベースラインＡＬＡと比較して少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または１００％低下する。
いくつかの実施形態では、対象の尿、血漿、血清、及び／または肝臓のうちの１以上において、ポルフィリンレベルが低下する。
いくつかの実施形態において、対象への投与後、対象におけるポルフィリンレベルは、対象におけるベースラインレベルと比較して少なくとも１日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、または少なくとも１か月間にわたって低下する。
いくつかの実施形態において、医薬組成物またはポリヌクレオチドを対象に投与した後、例えば２４時間以内に、対象におけるＡＬＴレベルは、対象のベースラインＡＬＴと比較して少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または１００％低下する。
いくつかの実施形態では、対象の尿、血漿、血清、及び／または肝臓のうちの１以上において、ＡＬＴのレベルが低下する。
いくつかの実施形態において、対象への投与後、対象におけるＡＬＴレベルは、対象におけるベースラインレベルと比較して少なくとも１日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、または少なくとも１か月間にわたって低下する。
いくつかの実施形態では、医薬組成物またはポリヌクレオチドを対象に投与した後、例えば２４時間以内に、対象におけるＡＳＴレベルが、対象のベースラインＡＳＴと比較して少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または１００％低下する。
いくつかの実施形態では、対象の尿、血漿、血清、及び／または肝臓のうちの１以上において、ＡＳＴレベルが低下する。
いくつかの実施形態では、対象への投与後、対象におけるＡＳＴレベルは、対象におけるベースラインレベルと比較して少なくとも１日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、または少なくとも１か月間にわたって低下する。
いくつかの実施形態では、医薬組成物またはポリヌクレオチドを対象に投与した後、例えば２４時間以内に、対象におけるビリルビンレベルが、対象のベースラインビリルビンと比較して少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％もしくは１００％低下する。
いくつかの実施形態では、対象の尿、血漿、血清、及び／または肝臓のうちの１以上において、ビリルビンレベルが低下する。
いくつかの実施形態において、対象への投与後、対象におけるビリルビンレベルは、対象におけるベースラインレベルと比較して少なくとも１日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、または少なくとも１か月間にわたって低下する。
いくつかの実施形態において、ＡＩＰは、臨床的に顕性な（明白な）ＡＩＰである。
いくつかの実施形態において、ＡＩＰは、臨床的に発症前（潜伏期）のＡＩＰである。
いくつかの実施形態において、ＰＢＧＤポリペプチド活性レベルは、急性発作の発症リスクの低減、または発症の予防、及び／または急性発作の治療に十分である。
いくつかの実施形態では、医薬組成物またはポリヌクレオチドを、単回用量１．５ｍｇ／ｋｇ未満、１．２５ｍｇ／ｋｇ未満、１ｍｇ／ｋｇ未満、０．７５ｍｇ／ｋｇ未満として投与される。
いくつかの実施形態では、対象への投与を、約１週間に１回、約２週間に１回、または月に約１回行う。
いくつかの実施形態では、医薬組成物またはポリヌクレオチドを静脈内投与する。
図１Ａ～１Ｄは、ＰＢＧＤのアイソフォーム１のタンパク質配列（図１Ａ）、ドメイン特徴が記載されている表（図１Ｂ）、ドメイン構造のグラフィック表現（図１Ｃ）、及び核酸配列（図１Ｄ）を示す。 図２Ａ～２Ｄは、ＰＢＧＤのアイソフォーム２のタンパク質配列（図２Ａ）、ドメイン特徴が記載されている表（図２Ｂ）、ドメイン構造のグラフィック表現（図２Ｃ）、及び核酸配列（図２Ｄ）を示す。 図３Ａ～３Ｄは、ＰＢＧＤのアイソフォーム３のタンパク質配列（図３Ａ）、ドメイン特徴が記載されている表（図３Ｂ）、ドメイン構造のグラフィック表現（図３Ｃ）、及び核酸配列（図３Ｄ）を示す。 図４Ａ～４Ｄは、ＰＢＧＤのアイソフォーム４のタンパク質配列（図４Ａ）、ドメイン特徴が記載されている表（図４Ｂ）、ドメイン構造のグラフィック表現（図４Ｃ）、及び核酸配列（図４Ｄ）を示す。 ＰＢＧＤの野生型アイソフォーム１及び２５個の配列最適化されたＰＢＧＤポリヌクレオチドに対応するウラシル（Ｕ）メトリクスを示す。「Ｕ含有量（％）」と標識された列は、％ＵＴＬパラメータに対応している。「ＷＴに対するＵ含有量（％）」と標識された列は、％ＵＷＴに対応している。「理論的最小値に対するＵ含有量（％）」と標識された列は、％ＵＴＭに対応している。「ＷＴに対するＵＵペア（％）」と標識された列は、％ＵＵＷＴに対応している。 ＰＢＧＤの野生型アイソフォーム１及び２５個の配列最適化されたＰＢＧＤポリヌクレオチドに対応するグアニン（Ｇ）メトリクスを示す。「Ｇ含有量（％）」と標識された列は、％ＧＴＬに対応している。「ＷＴに対するＧ含有量（％）」と標識された列は、％ＧＷＴに対応している。「理論的最大値に対するＧ含有量（％）」と標識された列は、％ＧＴＭＸに対応している。 ＰＢＧＤの野生型アイソフォーム１及び２５個の配列最適化されたＰＢＧＤポリヌクレオチドに対応するシトシン（Ｃ）メトリクスを示す。「Ｃ含有量（％）」と標識された列は、％ＣＴＬに対応している。「ＷＴに対するＣ含有量（％）」と標識された列は、％ＣＷＴに対応している。「理論的最大値に対するＣ含有量（％）」と標識された列は、％ＣＴＭＸに対応している。 ＰＢＧＤの野生型アイソフォーム１及び２５個の配列最適化されたＰＢＧＤポリヌクレオチドに対応するグアニン＋シトシン（Ｇ／Ｃ）メトリクスを示す。「Ｇ／Ｃ含有量（％）」と標識された列は、％Ｇ／ＣＴＬに対応している。「ＷＴに対するＧ／Ｃ含有量（％）」と標識された列は、％Ｇ／ＣＷＴに対応している。「理論的最大値に対するＧ／Ｃ含有量（％）」と標識された列は、％Ｇ／ＣＴＭＸに対応している。 ＰＢＧＤの野生型アイソフォーム１及び２５個の配列最適化されたＰＢＧＤポリヌクレオチドに対応するコドン位置１、２、３のＧ／Ｃ組成バイアス間の比較を示す。 図１０Ａ～１０Ｃは、ＰＢＧＤのアイソフォーム１のＩ２９１Ｍ／Ｎ３４０Ｓ機能獲得型変異体のタンパク質配列（図１０Ａ）、ドメイン特徴が記載されている表（図１０Ｂ）、ドメイン構造のグラフィック表現（図１０Ｃ）を示す。 ＰＢＧＤのアイソフォーム１のＩ２９１Ｍ／Ｎ３４０Ｓ機能獲得型変異体の核酸配列を示す。 図１２Ａ～１２Ｄは、アポリポタンパク質Ａ１（シグナルペプチド及びプロペプチドを含まない配列）の成熟型とＰＢＧＤのアイソフォーム１とを含む、融合コンストラクトのタンパク質配列（図１２Ａ）、ドメイン特徴が記載されている表（図１２Ｂ）、ドメイン構造のグラフィック表現（図１２Ｃ）、ならびに核酸配列（図１２Ｄ）を示す。 野生型ＰＢＧＤをコードする化学修飾されたｍＲＮＡ（ＣＯＶ１及びＣＯＶ２）と、ＰＢＧＤ－ＳＭタンパク質バリアントと、アポＡＩ－ＰＢＧＤ－ＳＭコンジュゲートを、ＡＩＰマウスに静脈内投与した後の、肝臓ＰＢＧＤ活性のレベルを示す。１ｎｍｏｌ／ｋｇにて単回静注用量のｍＲＮＡコンストラクトを投与した。肝臓におけるＰＢＧＤ活性を、産生されたウロポルフィリンのｐｍｏｌ数／タンパク質のｍｇ数／時として定量した。また、野生型マウス及びＡＩＰマウスにおいて観察された肝臓ＰＢＧＤ活性のレベルも、比較用に示す。データは平均±ＳＤとして表す。 腹腔内フェノバルビタール曝露によって引き起こされるポルフィリン症の負荷を受けたＡＩＰマウスに対し、ＰＢＧＤの野生型またはＳＭバリアントをコードする、単回静注用量の修飾ｍＲＮＡを投与した効果を評価するための、薬力学研究のデザインを示す。本試験の時間ライン上に、フェノバルビタールの腹腔内注射、及びＰＢＧＤ ｍＲＮＡの静脈内投与を、矢印で示す。 腹腔内フェノバルビタール曝露によって引き起こされるポルフィリン症の負荷を受けたＡＩＰマウスにおける、尿中ＡＬＡ排泄レベル（クレアチニン１ｍｇ当たりのＡＬＡのマイクログラム数）を示す。図１４に示された研究デザインに従って、ＰＢＧＤ、ＰＢＧＤのＳＭバリアントまたはルシフェラーゼをコードする化学修飾ｍＲＮＡ（いずれの場合もＭＣ３中に製剤化）を、単回静脈内注射０．５ｍｇ／ｋｇにてＡＩＰマウスに投与した。データは平均±ＳＤとして表す。 腹腔内フェノバルビタール曝露によって引き起こされるポルフィリン症の負荷を受けたＡＩＰマウスにおける、尿中ＰＢＧ排泄レベル（クレアチニン１ｍｇ当たりのＰＢＧのマイクログラム数）を示す。図１４に示された研究デザインに従って、ＰＢＧＤ、ＰＢＧＤのＳＭバリアントまたはルシフェラーゼをコードする化学修飾ｍＲＮＡ（いずれの場合もＭＣ３中に製剤化）を、単回静脈内注射０．５ｍｇ／ｋｇにてＡＩＰマウスに投与した。データは平均±ＳＤとして表す。 腹腔内フェノバルビタール曝露によって引き起こされるポルフィリン症の負荷を受けたＡＩＰマウスにおける疼痛測定値を示す。図１４に示された研究デザインに従って、ＰＢＧＤ、ＰＢＧＤのＳＭバリアントまたはルシフェラーゼをコードする化学修飾ｍＲＮＡ（いずれの場合もＭＣ３中に製剤化）を、単回静脈内注射０．５ｍｇ／ｋｇにてＡＩＰマウスに投与した。第１、第２及び第３のフェノバルビタール曝露後に、疼痛レベルを測定した（疼痛スケールを測定する際には、Ｌａｎｇｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．７（６）：４４７－９（２０１０）；Ｍａｔｓｕｍｉｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｌａｂ．Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．５１（１）：４２－９（２０１２））中に報告されている方法を用いた）。データは平均±ＳＤとして表す。 図１８Ａ及び１８Ｂは、ＰＢＧＤ、ＰＢＧＤのＳＭバリアント、またはルシフェラーゼｍＲＮＡ（０．５ｍｇ／ｋｇ）を単回静脈内投与した後の、ロータロッド（図１８Ａ）及び足跡測定（歩行パターン）（図１８Ｂ）にて、図１４に示す研究デザインに準じて判定された末梢神経障害の評価を示す。ベースライン測定値及び各フェノバルビタール曝露後の測定値を示す。データは平均±ＳＤとして表す。 図１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、１９Ｄ、及び１９Ｅは、ＰＢＧＤまたはＰＢＧＤ ｍＲＮＡのＳＭバリアント（０．５ｍｇ／ｋｇ）を単回静脈内投与した後の図１４に示す研究デザインに準じた、ＡＩＰマウスにおける連続３回のフェノバルビタール曝露によって誘発された坐骨神経機能障害の矯正を、ルシフェラーゼｍＲＮＡ（０．５ｍｇ／ｋｇ）と比較して示す。図１９Ａは、ルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡを投与されたＡＩＰマウスに対応する、坐骨神経伝導データを示す。図１９Ｂ及び１９Ｃは、野生型ＰＢＧＤをコードする修飾ｍＲＮＡ（図１９Ｂ）、及びＰＢＧＤ－ＳＭタンパク質バリアントをコードする修飾ｍＲＮＡ（図１９Ｃ）を投与されたＡＩＰマウスに対応する、坐骨神経伝導データを示す。図１９Ｄ及び１９Ｅは、ルシフェラーゼをコードする修飾ｍＲＮＡ、野生型ＰＢＧＤをコードする修飾ｍＲＮＡ、またはＰＢＧＤ－ＳＭバリアントをコードする修飾ｍＲＮＡを投与したＡＩＰマウスに対応する坐骨神経伝導データから得られたレイテンシー及び振幅値を、それぞれ示す。 図２０Ａ、２０Ｂ、２０Ｃ、２０Ｄ、及び２０Ｅは、野生型ＰＢＧＤまたはＡＡＶ－ＰＢＧＤベクターをコードする修飾ｍＲＮＡを静脈内投与した後に観察された、肝臓内でのＰＢＧＤタンパク質の発現を示す。図２０Ａは、ＡＡＶ－ＰＢＧＤを投与した後の、肝臓ＰＢＧＤタンパク質の発現を示す。図２０Ｂは、基底のＰＢＧＤタンパク質の発現レベルを示す。図２０Ｃ、２０Ｄ、及び２０Ｅは、野生型ＰＢＧＤをコードする修飾ｍＲＮＡを投与された後１日目、２日目及び４日目の、肝臓ＰＢＧＤタンパク質レベルをそれぞれ示す。 図２１Ａ及び２１Ｂは、腹腔内のフェノバルビタール曝露によって引き起こされるポルフィリン症の負荷を受けたＡＩＰマウスにおける、尿中ＡＬＡ排泄レベル（クレアチニン１ｍｇ当たりＡＬＡのマイクログラム数）（図２１Ａ）、及び尿中ＰＢＧ排泄レベル（クレアチニン１ｍｇ当たりのＰＢＧのマイクログラム数）（図２１Ｂ）を示す。ＰＢＧＤをコードする化学修飾されたｍＲＮＡ、またはルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡの単回静脈内注射をＡＩＰマウスに投与した。ｍＲＮＡは、ＭＣ３または化合物１８の脂質ナノ粒子内に製剤化されたものであった。ルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡを、０．５ｍｇ／ｋｇにて投与した。ＰＢＧＤをコードするｍＲＮＡを０．５ｍｇ／ｋｇ、及び０．１ｍｇ／ｋｇにて投与した。データは平均±ＳＤとして表す。 腹腔内のフェノバルビタール曝露によって引き起こされるポルフィリン症の負荷を受けたＡＩＰマウスにおける疼痛測定値を示す。第１、第２及び第３のフェノバルビタール曝露後に、Ｌａｎｇｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ．７（６）：４４７－９（２０１０）に報告されている方法を用いて、疼痛レベルを測定した。ＰＢＧＤをコードする化学修飾されたｍＲＮＡ、またはルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡの単回静脈内注射をＡＩＰマウスに投与した。ｍＲＮＡは、ＭＣ３または化合物１８の脂質ナノ粒子内に製剤化されたものであった。ルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡを、０．５ｍｇ／ｋｇにて投与した。ＰＢＧＤをコードするｍＲＮＡを０．５ｍｇ／ｋｇ、及び０．１ｍｇ／ｋｇにて投与した。データは平均±ＳＤとして表してある。 腹腔内のフェノバルビタール曝露によって引き起こされたポルフィリン症の負荷を受けたＡＩＰマウスにおける、ロータロッド測定値を示す。ロータロッドに費やされた時間は、フェノバルビタール曝露前にベースラインとして測定され、第１、第２及び第３のフェノバルビタール曝露後にも測定された。本研究の開始時（第１日）に、ＰＢＧＤをコードする化学修飾されたｍＲＮＡ、またはルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡの単回静脈内注射をＡＩＰマウスに投与した。ｍＲＮＡは、ＭＣ３または化合物１８の脂質ナノ粒子内に製剤化されたものであった。ルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡを、０．５ｍｇ／ｋｇにて投与した。ＰＢＧＤをコードするｍＲＮＡを０．５ｍｇ／ｋｇ、及び０．１ｍｇ／ｋｇにて投与した。データは平均±ＳＤとして表してある。 図２３Ａ～２３Ｂは、野生型ＰＢＧＤをコードする修飾ｍＲＮＡコンストラクトまたは対照としてルシフェラーゼを投与した野生型ＣＤ－１マウスの、ｉｎ ｖｉｖｏでの肝臓ＰＢＧＤ活性（ｎＭウロポルフィリン１濃度として表す）（図２３Ａ）、及びｉｎ ｖｉｖｏでの肝臓ＰＢＧＤタンパク質の発現（図２３Ｂ）を示す。 フェノバルビタール曝露によって誘発される３回の急性ポルフィリン症の負荷を受けたＡＩＰマウスに対し、ヒト野生型ＰＢＧＤをコードする修飾ｍＲＮＡの複数回投与の効果を評価するための多回投与薬力学／用量反応研究のデザインを示す。本試験の時系列上に、フェノバルビタールの腹腔内注射、及びＰＢＧＤ ｍＲＮＡの静脈内投与を、矢印で示す。誘発された各ポルフィリン症の負荷中に、化合物１８脂質ナノ粒子中に調合されたＰＢＧＤ（コンストラクト＃１４）をコードする化学修飾されたｍＲＮＡの静脈内注射をＡＩＰマウスに投与し、各負荷中に隔週０．５ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇまたは０．０５ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。ＰＢＳ、及びルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡを、対照として使用した。 図２４に示す研究デザインに従って、腹腔内フェノバルビタール曝露によって誘発された複数回のポルフィリン症の負荷を受けたＡＩＰマウスにおける、尿中ＡＬＡ排泄レベル（クレアチニン１ｍｇ当たりのＡＬＡのマイクログラム数）を示す。データは平均±ＳＤとして表されている。 図２４に示す研究デザインに従って、腹腔内のフェノバルビタール曝露によって誘発された複数回のポルフィリン症の負荷を受けたＡＩＰマウスにおける、尿中ＰＢＧ排泄レベル（クレアチニン１ｍｇ当たりのＰＢＧのマイクログラム数）を示す。データは平均±ＳＤとして表されている。 図２４に示す研究デザインに従って、腹腔内のフェノバルビタール曝露によって誘発された複数回のポルフィリン症の負荷を受けたＡＩＰマウスにおける、尿中ポルフィリン排泄レベル（クレアチニン１ｍｇ当たりのポルフィリンのマイクログラム数）を示す。データは平均±ＳＤとして表されている。 図２４に示す研究デザインに従って、腹腔内フェノバルビタール曝露によって誘発された複数回のポルフィリン症の負荷を受けたＡＩＰマウスにおける疼痛測定値を示す。第１、第２及び第３のフェノバルビタール曝露後に、Ｌａｎｇｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ，７（６）：４４７－９（２０１０）に報告されている方法を用いて、疼痛レベルを測定した。データは平均±ＳＤとして表す。Ｐ値は、反復測定ＡＮＯＶＡから得られたものである。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１ ロータロッドによって判定された末梢神経障害の評価を示す。ベースライン時の測定値、及び各フェノバルビタール曝露後の測定値を示す。ＡＩＰマウスは、図２４に示す研究デザインに従って、腹腔内フェノバルビタール曝露によって誘発された３回のポルフィリン症の負荷を受けた。この図はまた、未処置の野生型動物（ＷＴ）に対応するデータを示す。データは平均としてＳＤと共に表す。統計分析（アスタリスク参照）の事例では、データを対数変換して、分散を等化してから反復測定ＡＮＯＶＡ分析を実施し、ベースライン及び各誘発後に得られたマークとの間の比較を、ボンフェローニの多重比較を用いて行った。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１ 歩行パターン分析によって判定される末梢神経障害の評価を示す。ベースライン時の測定値、及び各フェノバルビタール曝露後の測定値を示す。ＡＩＰマウスは、図２４に示す研究デザインに従って、腹腔内フェノバルビタール曝露によって誘発された３回のポルフィリン症の負荷を受けた。この図に示すデータはまた、未処置の野生型動物（ＷＴ）に対応するするデータを示す。各動物の２つの後肢における歩長を測定した。棒グラフに、Ｓ．Ｄ．とともに平均値を表す。データを対数変換して、分散等化してから反復測定ＡＮＯＶＡ分析を実施し、ベースライン及び各誘発後に得られた及フットプリントマークとの間の比較を、ボンフェローニの多重比較を用いて行った。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１ 図２４に示す研究デザインに従って、フェノバルビタール曝露によって誘発されたＡＩＰマウスにおける、再発性急性ポルフィリン症による坐骨神経機能不全の評価を示す。坐骨神経伝導データからの振幅値は、対照条件下、または野生型ヒトＰＢＧＤをコードする修飾ｍＲＮＡを（例えば、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、及び０．５ｍｇ／ｋｇの用量にて）投与した後のマウスに対応する。対照測定は、緩衝液で処置されたＡＩＰマウス、ルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡを投与されたＡＩＰマウス、未処置の野生型マウス、及びフェノバルビタールで処置された野生型マウスに対応する。棒グラフに、Ｓ．Ｄ．と共に平均値を表す。Ｐ値は、一元配置ＡＮＯＶＡで得られたものである。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１ 図３２Ａ、３２Ｂ、及び３２Ｃは、図２４に示す研究デザインによるＡＩＰマウスの血清アミノ基転移酵素及びビリルビンレベルの評価を示す。各図は、対照条件下、はたはヒト野生型ＰＢＧＤをコードする修飾ｍＲＮＡの３回のＩＶ（０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、及び０．５ｍｇ／ｋｇの用量での）投与後のマウスからの測定値を示す。対照測定は、緩衝液で処置されたＡＩＰマウス、ルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡで処置されたＡＩＰマウス、未処置の野生型マウス、及びフェノバルビタールで処置された野生型マウスに対応する。棒グラフに、Ｓ．Ｄ．とともに平均値を表す。図３２Ａは、屠殺時の血清ＡＬＴアミノ基転移酵素のレベル（Ｉ．Ｕ．／Ｌ）を示す。図３２Ｂは、屠殺時の血清ＡＳＴアミノ基転移酵素のレベル（Ｉ．Ｕ．／Ｌ）を示す。図３２Ｃは、血清ビリルビンレベル（ｍｇ／ｄＬ）を示す。 図３３Ａ、３３Ｂ、及び３３Ｃは、フェノバルビタール曝露によって誘発されるポルフィリン症の負荷中の、野生型ＰＢＧＤをコードする修飾ｍＲＮＡの投与が、ＡＩＰ尿バイオマーカーレベル（ＡＬＡ、ＰＢＧ及びポルフィリン）の各々に対して及ぼす効果を示す。各図に示す結果は、フェノバルビタールを含まないＰＢＳで処置したＡＩＰマウス、ルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡで処置したマウス、及び野生型ヒトＰＢＧＤをコードする修飾ｍＲＮＡで処置したに対応している。図３３Ａは、尿中ＡＬＡレベルに対する効果を示す。図３３Ｂは、尿中ＰＢＧレベルに対する効果を示す。図３３Ｃは、尿中ポルフィリンレベルに対する効果を示す。 ルシフェラーゼをコードする対照ｍＲＮＡ、またはヒト野生型ＰＢＧＤをコードする修飾ｍＲＮＡ（０．５ｍｇ／ｋｇ）のいずれかを静脈内投与した後の、ＷＴ ＣＤ－１マウスにおける肝臓ＰＢＧＤ活性の薬物動態プロファイルを示す。エラーバーはＳ．Ｄ．を表す。肝臓ＰＢＧＤ活性を、ウロポルフィリンレベル（ｎＭ）を基準にして定量した。マウスにルシフェラーゼ（ビヒクル対照）ｍＲＮＡを投与した場合と、ｈＰＢＧＤ ｍＲＮＡを投与した場合とでは、脾臓ＰＢＧＤ活性に差異が見られなかった（データ不図示）。 図３５Ａは、ヒト野生型ＰＢＧＤをコードする修飾ｍＲＮＡ（０．５ｍｇ／ｋｇ）を静脈内投与した後の、ＷＴＣＤ－１マウスにおける肝臓ＰＢＧＤ活性の減衰を示す。図３５Ｂは、ヒト野生型ＰＢＧＤをコードする修飾ｍＲＮＡを静脈内投与した後の、ＡＩＰマウスにおける肝臓ＰＢＧＤ活性の減衰を示す。両方の事例において、非コンパートメント分析で測定されたＰＢＧＤ活性の終末相ｔ１／２は、８日であった。 ルシフェラーゼをコードする対照ｍＲＮＡ、またはヒト野生型ＰＢＧＤをコードする修飾ｍＲＮＡ（０．５ｍｇ／ｋｇ）のいずれかを静脈内投与した後の、ＷＴ ＣＤ－１マウスにおける肝臓ヒトＰＢＧＤタンパク質濃度の薬物動態を示す。エラーバーはＳ．Ｄ．を表す。ヒト特異的ペプチド（ＡＳＹＰＧＬＱＦＥＩＩＡＭＳＴＴＧＤＫ；配列番号８５）を使用して、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳで肝臓中のヒトＰＢＧＤタンパク質レベルを定量した。 ヒトＰＢＧＤ ｍＲＮＡ（０．５ｍｇ／ｋｇ）を単回静脈内ボーラス投与されたＷＴ ＣＤ１マウスの肝臓における、ＰＢＧＤ活性（ウロポルフィリン産生として測定されたｎＭ；左軸）、及び肝臓におけるｈＰＢＧＤ ｍＲＮＡレベル（右軸））を示す。 図３８Ａ、３８Ｂ、３８Ｃ、３８Ｄ、３８Ｅ、及び３８Ｆは、ヒト野生型ＰＢＧＤをコードする修飾ｍＲＮＡ（０．５ｍｇ／ｋｇ）を静脈内投与した後のＷＴ ＣＤ１マウスにおいて観察された、肝臓内でのＰＢＧＤタンパク質の発現を示す。図３８Ａ、３８Ｂ、３８Ｃ、３８Ｄ、及び３８Ｅは、ヒト野生型ＰＢＧＤをコードする修飾ｍＲＮＡを投与した後２時間、６時間、１０時間、１６時間及び２４時間のそれぞれにおける肝臓でのＰＢＧＤタンパク質レベルを示す。図３８Ｆは、内因性マウスＰＢＧＤタンパク質と交差反応しないＮｏｖｕｓ抗ＰＢＧＤ抗体によって検出された、基底ＰＢＧＤタンパク質の発現レベルを示す。 ５－メトキシウラシルを含む野生型ＰＢＧＤをコードする化学修飾されたｍＲＮＡをＡＩＰマウスに単回静脈内投与した後の、肝臓ＰＢＧＤ活性レベルを示す。単回静注用量のｍＲＮＡコンストラクトを、０．２ｍｇ／ｋｇまたは０．５ｍｇ／ｋｇにて投与した。また、野生型マウス及びＡＩＰマウスにおいて観察された肝臓ＰＢＧＤ活性のレベルも、比較用に示す。データは平均±ＳＤとして表す。 図４０Ａ及び４０Ｂは、ヒトＰＢＧＤ ｍＲＮＡ（０．５ｍｇ／ｋｇ）の単回静脈内注射を投与されたＡＩＰマウスにおける収縮期（図４０Ａ）、及び拡張期（図４０Ｂ）の血圧降下を示す。ＡＩＰマウスに対し腹腔内フェノバルビタールを毎日注射することによって、ポルフィリン症の負荷が誘発された。フェノバルビタールを投与されなかったＷＴ及びＡＩＰマウスの血圧を対照群として示す。 ヒトＰＢＧＤ ｍＲＮＡまたはルシフェラーゼビヒクル対照ｍＲＮＡ（０．５ｍｇ／ｋｇ）をＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットに単回静脈内投与してから１日後及び２日後の、肝臓におけるＰＢＧＤ活性を示す。データは平均±ＳＤとして表す。対照的に、注射後１～２日の処置群では、これらのラットの脾臓内ＰＢＧＤ活性レベルに差異が見られなかった。 図４２Ａは、ヒト野生型ＰＢＧＤをコードする修飾ｍＲＮＡ（１ｍｇ／ｋｇ）を静脈内投与してから２４時間後の、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットにおいて観察された肝臓内でのＰＢＧＤタンパク質の発現を示す。図４２Ｂは、内因性ラットＰＢＧＤタンパク質と有意に交差反応しないＮｏｖｕｓ抗ＰＢＧＤ抗体によって検出された、基底ＰＢＧＤタンパク質の発現レベルを示す。 図４３Ａ－４３Ｂは、野生型ＰＢＧＤをコードする修飾ｍＲＮＡコンストラクトを投与された後のカニクイザル肝臓におけるｉｎ ｖｉｖｏでの肝臓ＰＢＧＤ活性（ウロポルフィリノゲンのｐｍｏｌ数／タンパク質のｍｇ数／時間として表す）（図４３Ａ）、及びｉｎ ｖｉｖｏでの肝臓ＰＢＧＤタンパク質の発現（図４３Ｂ）を示す。
本発明は、急性間欠性ポルフィリン症（ＡＩＰ）治療用のｍＲＮＡ治療薬を提供する。急性間欠性ポルフィリン症（ＡＩＰ）は、ヘモグロビンの酸素結合性プロテーゼ群であるヘムの生成に影響を及ぼす遺伝的代謝障害である。ＡＩＰは、ポルフォビリノゲン脱アミノ酵素（ＰＢＧＤ）という酵素をコードするＨＭＧＢ遺伝子における変異によって引き起こされる。必要な細胞質酵素であるポルフォビリノゲン脱アミノ酵素（ＰＢＧＤ）という無しでは、ヘム合成を完了できず、代謝産物ポルフォビリノゲンが細胞質内に蓄積する。ｍＲＮＡ治療薬は、その技術によって、ＰＢＧＤをコードするｍＲＮＡの細胞内送達、続いて標的細胞内の機能的ＰＢＧＤタンパク質の新規合成を遂行することから、ＡＩＰの治療に特に好適とされる。ｍＲＮＡが標的細胞に送達された後、所望のＰＢＧＤタンパク質が細胞自体の翻訳機構を介して発現し、これにより、完全に機能的なＰＢＧＤタンパク質が、欠損タンパク質または欠落タンパク質に取って換わる。
ｉｎ ｖｉｖｏで核酸ベースの治療薬（例えば、ｍＲＮＡ治療薬）を送達することに関連する１つの課題は、身体の免疫系が外来核酸に遭遇したときに起こる可能性のある生来的な免疫応答に起因する。外来ｍＲＮＡは、トール様受容体（ＴＬＲ）、特に一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）によって活性化されるＴＬＲ７／８を介した認識を通して免疫系を活性化できる。非免疫細胞内では、レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ－Ｉ）を介して外来ｍＲＮＡが認識され得る。外来ｍＲＮＡの免疫認識によって、インターロイキン－１β（ＩＬ－１β）の産生、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）の分布、及び強力なＩ型インターフェロン（Ｉ型ＩＦＮ）の応答をはじめとする望ましくないサイトカイン効果をもたらす可能性がある。本発明は、数種の修飾ヌクレオチドを治療用ｍＲＮＡ内に組み込むことによって、免疫活性化を最小限に抑え、ｍＲＮＡに対するタンパク質の翻訳効率を最適化することを特長とする。本発明の特定の態様は、先天性免疫応答を低減するためのヌクレオチド修飾と、特に、ＰＢＧＤをコードする治療用ｍＲＮＡのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内での配列最適化とを組み合わせて用いることによって、タンパク質の発現を増強することを特長とする。
本発明のｍＲＮＡ治療技術のある特定の実施形態は、ＰＢＧＤをコードするｍＲＮＡを脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）送達系経由で送達することを、特長とする。脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、ｍＲＮＡを標的細胞に安全且つ効率的に送達するための理想的なプラットフォームである。ＬＮＰは、細胞の取り込み、細胞内輸送、及びエンドソーム放出、またはエンドソーム脱出をはじめとするメカニズムを介して核酸を送達するための独特な能力を有する。本発明は、新規なイオン性脂質ベースのＬＮＰを、ｉｎ ｖｉｖｏで投与した場合に改良特性を有するＰＢＧＤをコードするｍＲＮＡと組み合わせたことを、特長とする。理論に束縛されるものではないが、本発明の新規なイオン性脂質ベースのＬＮＰ製剤は、例えば細胞摂取、細胞内輸送及び／またはエンドソーム放出またはエンドソーム脱出などの改良特性を有すると考えられている。例えば初回投与時に全身経路で投与（例えば、静脈内（ＩＶ）投与）されたＬＮＰによって、例えば更なる投与において引き続いて注入されたＬＮＰのクリアランスを加速し得る。この現象は、加速的血中クリアランス（ＡＢＣ）として知られており、特に、治療上の状況において、欠損酵素（例えばＰＢＧＤ）を置換する際の重要な課題である。これは、対象（例えばＡＩＰに罹患している対象）の標的組織において必要な酵素レベルを維持するうえで、ほとんどの場合にｍＲＮＡ治療薬の反復投与が必須とされるためである。反復投与の課題は、複数のレベルで対処できる。ｍＲＮＡ操作及び／またはＬＮＰによる効率的な送達は、投与の第１回投与後に発現するタンパク質（例えばＰＢＧＤ）のレベル増強及び／または持続期間の延長をもたらし、初回投与から以後の投与までの期間を延長することが可能である。ＡＢＣ現象は少なくとも幾分かは本質的に一過性であり、全身的に投与されてから十分な時間が経過した後にＡＢＣの根底にある免疫応答が解決することが知られている。そのため、一態様では、本発明のｍＲＮＡ治療剤が全身に送達された後のタンパク質発現及び／または活性の持続時間を延長することで、ＡＢＣ現象を抑制する。そのうえ、免疫感知及び／または認識が回避されるようにＬＮＰを操作することによって、後続もしくは反復投薬の際にＡＢＣを更に回避することが可能となる。本発明の例示的な態様は、ＡＢＣを軽減するように操作された新規なＬＮＰを、特長とする。
１．ポルフォビリノゲン脱アミノ酵素（ＰＢＧＤ）
ポルフォビリノゲン脱アミノ酵素（ＰＢＧＤ；ＥＣ４．３．１．８）は、ヘムの産生につながる生合成経路の第３の酵素であって、４つのポルフォビリノゲン単位を段階的に縮合することによってヒドロキシメチルビランの合成を触媒する。次いで、ヒドロキシメチルビランは、ウロポルフィリノゲンＩＩＩ合成酵素を介してウロポルフィリノゲンＩＩＩに変換される。４０～４２ｋＤａのポルフォビリノゲン脱アミノ酵素の構造は、生物のなかでも高度に保存され、３つのドメインからなる。ドメイン１及び２は、構造的に類似性が高く、各々が５つのベータシート及び３つのアルファヘリックスから成っている。ドメイン３は、他の２つの間に配置され、平坦なベータシート形状を有する。２つの凝縮されたポルビビリノゲン分子からなるこの酵素の補助因子であるジピロールは、ドメイン３に共有結合し、活性部位（すなわち、ドメイン１とドメイン２との間の溝）へと延在する。いくつかの正に荷電したアルギニン残基が、ドメイン１及び２から活性部位に面するように配置されることで、入来のポルフォビリノゲン上のカルボキシレート官能基ならびに成長中のピロール鎖を安定化することが、明らかにされている。それらの構造的特徴はおそらく、最終的なヒドロキシメチルビラン生成物の形成に有利である。ポルフォビリノゲン脱アミノ酵素は通常、細胞の細胞質の二量体単位で存在する。
ポルフォビリノゲン脱アミノ酵素が関与する健康問題で、最もよく知られているのは、ヒドロキシメチルビランの産生不十分が原因で、細胞質中のポルフォビリノゲンが蓄積し、且つ血漿ならびに尿中のＡＬＡ及びＰＢＧレベルの上昇を来たす、常染色体優性遺伝的疾患である急性間欠性ポルフィリン症（ＡＩＰ）である。９０％の症例においてＡＩＰの病因は、遺伝子変異が発生して酵素量の低減を来たしたことにあるとされ、一方、酵素活性が低く、且つ／またはアイソフォームが多岐にわたる変異も記載されている。Ｇｒａｎｄｃｈａｍｐ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：６６３７－４９、及びＡｓｔｒｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｈｕｍ．Ｍｕｔ．４：２４３－５２を参照のこと。
アイソフォーム１に対応する野生型ＰＢＧＤ標準ｍＲＮＡ配列のコード配列（ＣＤＳ）は、受託番号ＮＭ＿０００１０９．３（「ホモサピエンスヒドロキシメチルビサンシンターゼ（ＨＢＭＳ）、転写バリアント１、ｍＲＮＡ」）にて、ＮＣＢＩ参照配列データベース（ＲｅｆＳｅｑ）に記載されている。アイソフォーム１に対応する野生型ＰＢＧＤ標準タンパク質配列は、登録番号ＮＰ＿０００１８１．２（「ポルフォビリノゲン脱アミノ酵素アイソフォーム１［ホモサピエンス］」としてＲｅｆＳｅｑデータベースに記載されている。ＰＢＧＤアイソフォーム１タンパク質は、３６１アミノ酸長である。Ｒｅｆ Ｓｅｑ配列中の参照タンパク質配列をコードする特定の核酸配列は、それぞれのＲｅｆＳｅｑデータベースエント内に示されているコーディング配列（ＣＤＳ）であることに留意されたい。
アイソフォーム２、３及び４は、代替のスプライシングによって生成される。
ＰＢＧＤのアイソフォーム２に対するＲｅｆＳｅｑタンパク質及びｍＲＮＡ配列の各々は、ＮＰ＿００１０１９５５３．１及びＮＭ＿００１０２４３８２．１である。ＰＢＧＤのアイソフォーム３に対するＲｅｆＳｅｑタンパク質及びｍＲＮＡ配列の各々は、ＮＰ＿００１２４５１３７．１及びＮＭ＿００１２５８２０８．１である。ＰＢＧＤのアイソフォーム４に対するＲｅｆＳｅｑタンパク質及びｍＲＮＡ配列の各々は、ＮＰ＿００１２４５１３８．１及びＮＭ＿００１２５８２０９．１である。アイソフォーム２、３及び４のＰＢＧＤは、上述のｍＲＮＡ ＲｅｆＳｅｑエントリの各々に開示されるＣＤＳによりコードされる。
アイソフォーム２のポリヌクレオチドは、５’コーディング領域内に選択的インフレームエクソンが含有されていて、バリアント１と比較して下流にある開始コドンが使用されており、アイソフォーム１と比較して短いＮ末端を有するＰＢＧＤアイソフォーム２ポリペプチドをコードする。ＰＢＧＤアイソフォーム２タンパク質は、３４４アミノ酸長であり、アイソフォーム１中の１～１７位に対応するアミノ酸を欠いている。
アイソフォーム３ポリヌクレオチドは、バリアント１と比較して、選択的インフレームエキソンが欠けている。結果として得られたＰＢＧＤアイソフォーム３ポリペプチドは、同じＮ末端及びＣ末端を有するが、アイソフォーム１と比較して短い。ＰＢＧＤアイソフォーム３のタンパク質は３２１アミノ酸長であり、且つアイソフォーム１の２１８位～２５７位に対応するアミノ酸が欠けている。
アイソフォーム４のポリヌクレオチドは、第１エキソンの３’末端に選択的スプライスジャンクションを使用し、バリアント１と比較して選択的インフレームエキソンが欠けている。結果として得られたＰＢＧＤアイソフォーム４のポリペプチドはＮ末端にて短くなり、アイソフォーム１と比較して選択的内部セグメントが欠けている。ＰＢＧＤアイソフォーム４のタンパク質は、３０４アミノ酸長であり、アイソフォーム１中の１位～１７位及び２１８位～２５７位に対応するアミノ酸が欠けている。
ある特定の態様において、本発明は、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ））を含むポリヌクレオチド（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のようなリボ核酸（ＲＮＡ））を提供する。いくつかの実施形態において、本発明のＰＢＧＤポリペプチドは、野生型ＰＢＧＤアイソフォーム１、２、３または４タンパク質である。いくつかの実施形態において、本発明のＰＢＧＤポリペプチドはバリアントであり、野生型ＰＢＧＤアイソフォーム１、２、３もしくは４の配列に対する置換、挿入及び／または付加、欠失及び／または共有結合修飾を含むペプチドまたはポリペプチドである。いくつかの実施形態では、配列タグまたはアミノ酸を、例えば局在化させることを目的に、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる配列に（例えば、Ｎ末端またはＣ末端にて）付加することが可能である。いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドのカルボキシ末端、アミノ末端、または内部領域に位置するアミノ酸残基を、任意で欠失させることによって、断片を提供することが可能である。
いくつかの実施形態において、本発明のヌクレオチド配列（例えばＯＲＦ）を含むポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）は、１、２、３または４つ以上の置換を含み得るＰＢＧＤアイソフォーム１、２、３または４配列の置換バリアントをコードする。いくつかの実施形態において、置換バリアントは、１つ以上の保存的アミノ酸置換を含むことができる。他の実施形態において、バリアントは挿入バリアントである。他の実施形態において、バリアントは欠失バリアントである。
当業者に認識されるように、ＰＢＧＤアイソフォーム１、２、３もしくは４タンパク質断片、機能性タンパク質ドメイン、バリアント及び相同タンパク質（オルソログ）もまた、本発明のＰＢＧＤポリペプチドの範囲内にあるとみなされる。本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの非限定を、図１～図４に示す。例えば、図１に示してあるのは、アミノ酸配列のヒトＰＢＧＤの野生型アイソフォーム１である。
本開示において提示される特定の組成物及び方法は、ＰＢＧＤアイソフォーム１のタンパク質またはポリヌクレオチド配列を指す。そのような開示が、当該技術分野において公知のＰＢＧＤの他のアイソフォームに同等に適用可能であることは、当業者に理解されるであろう。
２．ポリヌクレオチド及びオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）
本発明は、ＡＩＰの治療（すなわち、予防的及び／または治療的処置）における使用を用途としたｍＲＮＡを特長とする。本発明における使用を特長とするｍＲＮＡを対象に投与すると、ｉｎ ｖｉｖｏでヒトポルフィビリノゲン脱アミノ酵素（ＰＢＧＤ）タンパク質がコードされる。したがって、本発明は、ポリヌクレオチド（例えば、ヒトポルホビリノゲン脱アミノ酵素（ＰＢＧＤ）をコードする連結ヌクレオシドのオープンリーディングフレームを含むｍＲＮＡ）、それらのアイソフォーム、それらの機能的断片、及びＰＢＧＤを含む融合タンパク質に関する。いくつかの実施形態において、オープンリーディングフレームは配列最適化される。特定の実施形態において、本発明は、配列最適化されたポリヌクレオチドを提供する。本ポリヌクレオチドは、ヒトＰＢＧＤのアイソフォーム１、２、３もしくは４のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド、またはそれらの配列最適化ポリヌクレオチドに対して高度な配列同一性を有する配列を含む。
ある特定の態様において、本発明は、１つ以上のＰＢＧＤポリペプチドをコードするＯＲＦなどのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）を提供する。いくつかの実施形態において、本発明のコードされたＰＢＧＤポリペプチドは、以下：
（ｉ）全長ＰＢＧＤポリペプチド（例えば、野生型ＰＢＧＤアイソフォーム１、２、３もしくは４と長さが同じであるかまたは本質的に同じであるもの）、
（ｉｉ）本明細書に記載のＰＢＧＤアイソフォームのいずれかの機能的断片（例えば、野生型アイソフォーム１，２，３もしくは４のうちの１つより短い短縮型（例えば、カルボキシ末端、アミノ末端または内部領域が欠失した）配列であるが、ＰＢＧＤ酵素活性をなお保持するもの）、
（ｉｉｉ）それらのバリアント、例えば、１つ以上のアミノ酸が置換された完全長または短縮型アイソフォーム１、２、３もしくは４タンパク質（例えば、参照アイソフォームに対してポリペプチドのＰＢＧＤ活性の全てもしくは大部分を保持するバリアント（例えばＴ５９Ｉ、Ｄ１７８Ｎ、または当該技術分野において公知の任意の他の天然もしくは人工バリアント、またはＩ２９１Ｍ変異及びＮ３４０Ｓ変異を含むバリアント）、あるいは
（ｉｖ）（ｉ）全長ＰＢＧＤアイソフォーム１、２、３もしくは４タンパク質、機能的断片またはそのバリアント、及び（ｉｉ）少なくとも１つの異種タンパク質（例えば、アポリポタンパク質Ａ１）を含む融合タンパク質
から選択できる。
ある特定の実施形態において、コードされたＰＢＧＤポリペプチドは、哺乳類のＰＢＧＤポリペプチド、例えばヒトＰＢＧＤポリペプチド、機能的断片またはそのバリアントである。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）は、細胞内でのＰＢＧＤタンパク質の発現レベル及び／または検出可能なＰＢＧＤ酵素活性レベルを、それらの細胞内に導入された場合に、本発明のポリヌクレオチドの投与前の、細胞内でのＰＢＧＤタンパク質の発現レベル及び／または検出可能なＰＢＧＤ酵素活性レベルと比較して、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％増加させる。ＰＢＧＤタンパク質発現レベル及び／またはＰＢＧＤ酵素活性は、当該技術分野において公知の方法に従って測定できる。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞に導入される。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ｉｎ ｖｉｖｏで細胞に導入される。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）は、野生型ヒトＰＢＧＤ、例えばヒトＰＢＧＤの野生型アイソフォーム１（配列番号１、図１を参照）、ヒトＰＢＧＤの野生型アイソフォーム２（配列番号３、図２を参照）、ヒトＰＢＧＤの野生型アイソフォーム３（配列番号５、図３を参照）、またはヒトＰＢＧＤの野生型アイソフォーム４（配列番号７、図４を参照）をコードするＯＲＦなどのヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）は、配列最適化された核酸配列を含み、配列最適化された核酸配列のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、野生型ＰＢＧＤ配列（例えば、野生型アイソフォーム１、２、３または４）に由来するものである。例えば、ＰＢＧＤアイソフォーム２をコードする配列最適化ＯＲＦを含む本発明のポリヌクレオチドに対応する野生型配列は、天然のＰＢＧＤアイソフォーム２である。同様にアイソフォーム１の機能的断片をコードする配列最適化ｍＲＮＡに対応する野生型配列は、ＰＢＧＤアイソフォーム１からの対応する断片である。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）は、ヒトＰＢＧＤアイソフォーム１の全長配列を有するＰＢＧＤアイソフォーム１をコードするヌクレオチド配列を含む（すなわち、イニシエータメチオニンを含む）。成熟ヒトＰＢＧＤアイソフォーム１において、イニシエータメチオニンを除去して、翻訳産物の２～３６１のアミノ酸残基を含む「成熟ＰＢＧＤ」を得ることができる。ヒトＰＢＧＤ（アミノ酸１～３６１）の全配列に対する本開示の教示は、イニシエータメチオニンを欠く成熟形態のヒトＰＢＧＤ（アミノ酸２～３６１）にも適用可能である。いくつかの実施形態において、したがって、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）は、ヒトＰＢＧＤアイソフォーム１の成熟配列を有するＰＢＧＤアイソフォーム１をコードするヌクレオチド配列を含む（すなわち、イニシエータメチオニンを欠く）。いくつかの実施形態において、ヒトＰＢＧＤアイソフォーム１の完全長または成熟配列を有するＰＢＧＤアイソフォーム１をコードするヌクレオチド配列を含む本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）は、配列最適化されている。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）は、例えば二重変異体Ｉ２９１Ｍ／Ｎ３４０Ｓ ＰＢＧＤなどの変異体ＰＢＧＤポリペプチドをコードするＯＲＦなどのヌクレオチド配列を含む。二重変異体Ｉ２９１Ｍ／Ｎ３４０ＳヒトＰＢＧＤアイソフォーム１（「ＳＭ ＰＢＧＤ」）のタンパク質（配列番号１５２）及びポリヌクレオチド（配列番号１５３）は、図１０Ａ及び図１１に図示されている。いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ＰＢＧＤ配列中の少なくとも１つの点変異を含み且つＰＢＧＤ酵素活性を保持するＰＢＧＤポリペプチドをコードするＯＲＦを含む。いくつかの実施形態において、変異体ＰＢＧＤポリペプチドのＰＢＧＤ活性は、対応する野生型ＰＢＧＤ（すなわち、同じＰＢＧＤアイソフォームで、ただし変異の無いもの）のＰＢＧＤ活性の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％の活性を有する。いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）で、変異体ＰＢＧＤポリペプチドをコードするＯＲＦを含むポリヌクレオチドは、配列最適化されている。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）は、ＰＢＧＤ酵素活性を変更しない変異を伴うＰＢＧＤポリペプチドをコードするＯＲＦなどのヌクレオチド配列を含む。そのような変異体ＰＢＧＤポリペプチドは、機能中立と呼ばれ得る。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、１つ以上の機能中立点変異を含む変異ＰＢＧＤポリペプチドをコードするＯＲＦを含む。
いくつかの実施形態において、変異体ＰＢＧＤポリペプチドは、対応する野生型ＰＢＧＤよりもＰＢＧＤ酵素活性が高い。いくつかの実施形態において、変異体ＰＢＧＤポリペプチドのＰＢＧＤ活性は、対応する野生型ＰＢＧＤ（すなわち、同じＰＢＧＤアイソフォームで、ただし変異の無いもの）の活性よりも少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％高い。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）は、例えば、１つ以上の断片が野生型ＰＢＧＤポリペプチドのポリペプチドサブ配列に対応していて且つＰＢＧＤ酵素活性を保持する、機能的ＰＢＧＤ断片をコードするＯＲＦなどのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ＰＢＧＤ断片のＰＢＧＤ活性は、対応する全長ＰＢＧＤのＰＢＧＤ活性の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％である。いくつかの実施形態において、機能的ＰＢＧＤ断片をコードするＯＲＦを含む本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）は、配列最適化されている。
いくつかの実施形態において、ＰＢＧＤ断片をコードするＯＲＦなどのヌクレオチド配列を含む本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）は、対応する全長ＰＢＧＤよりもＰＢＧＤ酵素活性が高い。ゆえに、いくつかの実施形態において、ＰＢＧＤ断片のＰＢＧＤ活性は、対応する全長ＰＢＧＤのＰＢＧＤ活性よりも少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％高い活性を有する。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）は、ＰＢＧＤの野生型アイソフォーム１、２、３もしくは４よりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％または２５％短いＰＢＧＤ断片をコードするＯＲＦなどのヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）は、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするＯＲＦなどのヌクレオチド配列（例えば野生型配列、機能的断片もしくはそれらのバリアント）を含み、このヌクレオチド配列は、配列番号２、４、６または８配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％同一である（例えば、図１、図２、図３及び図４の各パネルＤを参照のこと）。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）は、ＰＢＧＤポリペプチド（例えば、野生型配列、その機能的断片、またはそのバリアント）をコードするＯＲＦなどのヌクレオチド配列を含み、本ヌクレオチド配列は、配列番号９～３３、及び８９～１１７からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の配列同一性を有する。表２を参照のこと。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）は、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするＯＲＦなどのヌクレオチド配列（例えば野生型配列、機能的断片もしくはそれらのバリアント）を含み、本ヌクレオチド配列は、配列番号９～３３、及び８９～１１７からなる群から選択される配列に対して７０％～１００％、７５％～１００％、８０％～１００％、８５％～１００％、７０％～９５％、８０％～９５％、７０％～８５％、７５％～９０％、８０％～９５％、７０％～７５％、７５％～８０％、８０％～８５％、８５％～９０％、９０％～９５％、または９５％～１００％の配列同一性を有する。表２を参照のこと。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）は、ＰＢＧＤポリペプチド（例えば、野生型配列、その機能的断片、またはそのバリアント）をコードするＯＲＦを含み、本ポリヌクレオチドは、配列番号１１８～１４８からなる群から選択される配列に対して７０％～１００％、７５％～１００％、８０％～１００％、８５％～１００％、７０％～９５％、８０％～９５％、７０％～８５％、７５％～９０％、８０％～９５％、７０％～７５％、７５％～８０％、８０％～８５％、８５％～９０％、９０％～９５％、または９５％～１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。表５を参照のこと。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）は、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするＯＲＦなどのヌクレオチド配列（例えば野生型配列、機能的断片もしくはそれらのバリアント）を含み、本ヌクレオチド配列は、配列番号２、４、６または８配列に対して少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％同一である（例えば、図１、図２、図３及び図４の各パネルＤを参照のこと）。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）は、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするＯＲＦなどのヌクレオチド配列（例えば野生型配列、機能的断片もしくはそれらのバリアント）を含み、本ヌクレオチド配列は、配列番号２、４、６または８の配列に対して７０％～９０％同一；７５％～８５％同一、７６％～８４％同一、７７％～８３％同一、７７％～８２％同一、または７８％～８１％同一である（例えば、図１、図２、図３及び図４の各パネルＤを参照のこと）。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）は、約９００～約１００，０００ヌクレオチド（例えば、９００～１，０００、９００～１，１００、９００～１，２００、９００～１，３００、９００～１，４００、９００～１，５００、１，０００～１，１００、１，０００～１，１００、１，０００～１，２００、１，０００～１，３００、１，０００～１，４００、１，０００～１，５００、１，０８３～１，２００、１，０８３～１，４００、１，０８３～１，６００、１，０８３～１，８００、１，０８３～２，０００、１，０８３～３，０００、１，０８３～５，０００、１，０８３～７，０００、１，０８３～１０，０００、１，０８３～２５，０００、１，０８３～５０，０００、１，０８３～７０，０００、または１，０８３～１００，０００）を含む。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）は、ＰＢＧＤポリペプチド、（例えば、野生型配列、その機能的断片、またはそのバリアント）をコードするＯＲＦなどのヌクレオチド配列を含み、このヌクレオチド配列（例えばＯＲＦ）の長さは、少なくとも５００ヌクレオチド長（例えば、少なくとも約５００、６００、７００、８０、９００、１，０００、１，０５０、１，０８３、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，１００、２，２００、２，３００、２，４００、２，５００、２，６００、２，７００、２，８００、２，９００、３，０００、３，１００、３，２００、３，３００、３，４００、３，５００、３，６００、３，７００、３，８００、３，９００、４，０００、４，１００、４，２００、４，３００、４，４００、４，５００、４，６００、４，７００、４，８００、４，９００、５，０００、５，１００、５，２００、５，３００、５，４００、５，５００、５，６００、５，７００、５，８００、５，９００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００であるかまたはそれより長いか、あるいは最高１００，０００ヌクレオチド長である（この値を含む）。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）は、ＰＢＧＤポリペプチド（例えば、野生型配列、その機能的断片、またはそのバリアント）をコードするＯＲＦなどのヌクレオチド配列を含み、更に、例えばｍｉＲＮＡ結合部位のような非コードの少なくとも１つの核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）は更に、５’ＵＴＲ（例えば、配列番号３９～５６、８３、１８９～１９１の配列から選択されるもの）及び３’ＵＴＲ（例えば、配列番号５７～８１、８４、１４９～１５１、１６１～１７２、１９２～１９９の配列から選択されるもの）を含む。いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）は、配列番号１１８～１４８、例えば、配列番号１３３、１４１、１４４もしくは１４５からなる群から選択される配列を含む。更なる実施形態において、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）は、５’末端キャップ（例えば、キャップ０、キャップ１、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎ１－メチル－グアノシン、２’－フルオロ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、２－アミノ－グアノシン、ＬＮＡ－グアノシン、２－アジドグアノシン、キャップ２、キャップ４、５’メチルＧキャップ、またはそれらの類似体）及びポリＡ尾部領域（例えば、約１００ヌクレオチド長）を含む。更なる実施形態において、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）は、配列番号１４９～１５１、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される核酸配列を含んだ３’ＵＴＲを含む。更なる実施形態において、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）は、配列番号１５０の核酸配列を含んだ３’ＵＴＲを含む。更なる実施形態において、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）は、配列番号１５１の核酸配列を含んだ３’ＵＴＲを含む。
いくつかの実施形態において、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするＯＲＦなどのヌクレオチド配列を含む本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）は、一本鎖または二本鎖である。
いくつかの実施形態において、ＰＢＧＤポリペプチド（例えば、野生型配列、その機能的断片、またはそのバリアント）をコードするＯＲＦなどのヌクレオチド配列を含む本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡである。いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡである。いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）であるか、またはｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）として機能する。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、少なくとも１つのＰＢＧＤポリペプチドをコードし、コードされたＰＢＧＤポリペプチドをｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｓｉｔｕまたはｅｘ ｖｉｖｏで産生するように翻訳する機能を有する、ヌクレオチド配列（例えばＯＲＦ）を含む。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）は、ＰＢＧＤポリペプチド（例えば野生型配列、機能的断片、またはそのバリアント）をコードする配列最適化ヌクレオチド配列（例えばＯＲＦ）、を含み、このポリヌクレオチドは、少なくとも１つの化学修飾された核酸塩基、例えば５－メトキシウラシルを含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは更に、ｍｉＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ－１４２に結合するｍｉＲＮＡ結合部位、及び／またはｍｉＲ－１２６に結合するｍｉＲＮＡ結合部位）を含む。いくつかの実施形態において、本明細書中に開示されるポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）、例えば式（Ｉ）を有する化合物、例えば化合物１～２３２のいずれか（例えば化合物１８）；式（ＩＩＩ）を有する化合物、（ＩＶ）、（Ｖ）もしくは（ＶＩ）、例えば化合物２３３～３４２のいずれか（例えば化合物２３６）；あるいは式（ＶＩＩＩ）を有する化合物、例えば化合物４１９～４２８のいずれか（例えば化合物４２８）、またはそれらの任意の組み合わせを含む送達剤を用いて製剤化される。いくつかの実施形態において、送達剤は、化合物１８、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物４２８（例えば、モル比を約５０：１０：３８．５：１．５としたもの）を含む。
３．シグナル配列
また、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）に治療上関連する部位に対するコード済みポリペプチドの輸送を促進する更なる特徴をコードするヌクレオチド配列を含めることができる。そのような特徴（タンパク質の輸送の一助となる特徴）の１つは、シグナル配列または標的配列である。これらのシグナル配列によりコードされるペプチドは、標的ペプチド、輸送ペプチド及びシグナルペプチドを含む様々な名称で知られている。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）は、本明細書に記載のＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたシグナルペプチドをコードするＯＲＦなどのヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において「シグナル配列」または「シグナルペプチド」はそれぞれ、約９～２００ヌクレオチド（３～７０アミノ酸）長のポリヌクレオチドまたはポリペプチドであり、任意でそれぞれコーディング領域またはポリペプチドの５’（またはＮ末端）にて取り込まれる。これらの配列が付加された場合、結果として、コードされたポリペプチドが、１つ以上の標的化経路を介して、小胞体またはミトコンドリアのような所望の部位に輸送される。いくつかのシグナルペプチドは、タンパク質が所望の部位に輸送された後に、例えばシグナルペプチダーゼを介してタンパク質から切断される。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、このヌクレオチド配列は更に、異種シグナルペプチドをコードする５’核酸配列を含む。
４．融合タンパク質
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）は、目的のポリペプチドをコードする２つ以上の核酸配列（例えば、ＯＲＦ）を含むことができる。いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ＰＢＧＤポリペプチド、その機能的断片またはそのバリアントをコードする、単一のＯＲＦを含む。その一方で、いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、２つ以上のＯＲＦ（例えば、ＰＢＧＤポリペプチド（第１の目的ポリペプチド）、その機能的断片またはそのバリアントをコードする第１のＯＲＦと、第２の目的ポリペプチドを発現する第２のＯＲＦ）を含むことができる。いくつかの実施形態では、２つ以上の目的ポリペプチドを遺伝的に融合することが可能である。すなわち、２つ以上のポリペプチドを同じＯＲＦによりコードすることが可能である。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、２つ以上の目的ポリペプチド間のリンカーをコードする核酸配列（例えば、当該技術分野において公知のＧ４Ｓペプチドリンカーまたは別のリンカー）を含むことができる。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）は２つ、３つ、４つまたはそれより多くのＯＲＦを含み、それらの各ＯＲＦは目的ポリペプチドを発現し得る。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）は、ＰＢＧＤポリペプチドをコードする第１の核酸配列（例えば、第１のＯＲＦ）、及び第２の目的ポリペプチドをコードする第２の核酸配列（例えば、第２のＯＲＦ）を含むことができる。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ＰＢＧＤ融合タンパク質をコードする核酸を含み、融合タンパク質は、ＰＢＧＤに融合されたアポリポタンパク質Ａ１を含む。特定の実施形態において、アポリポタンパク質Ａ１（アポＡ１）融合成分は、天然のシグナルペプチド及びプロペプチド配列を有さない成熟形態のヒトアポリポタンパク質Ａ１である。図１２Ａ～図１２Ｄを参照のこと。特定の実施形態において、アポＡ１－ＰＢＧＤ融合タンパク質は、配列番号１５４の配列を含むか、この配列からなるか、または本質的にこの配列からなる（図１２Ａ参照）。特定の実施形態において、本発明のポリペプチドは、アポＡ１－ＰＢＧＤ融合タンパク質をコードする核酸配列によってコードされ、前記核酸が、配列番号１５５の配列を含むか、この配列からなるか、または本質的にこの配列からなる（図１２Ｄ）。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ＰＢＧＤをコードする部分（例えば、野生型ＰＢＧＤ、またはＳＭ機能獲得型バリアントのようなバリアント）、及びいくつかの実施形態では、アポＡ１成分を含むことができる。例えば、本発明のポリヌクレオチド（ｍＲＮＡなど）は、（ｉ）ヒトＰＢＧＤアイソフォーム１（ヒトハウスキーピングＰＢＧＤ）、（ｉｉ）ヒトＰＢＧＤアイソフォーム２（ヒト赤血球特異的ＰＢＧＤ）、（ｉｉｉ）ＰＢＧＤ１のＳＭバリアント（Ｉ２９１Ｍ及びＮ３４０Ｓ二重変異体）、（ｉｖ）ＰＢＧＤ２のＳＭバリアント、（ｖ）ヒトＰＢＧＤ１に融合されたヒトアポリポタンパク質Ａ１、（ｖｉ）ＰＢＧＤ２に融合されたヒトアポリポタンパク質Ａ１、（ｖｉｉ）ＰＢＧＤ１のＳＭバリアントに融合されたヒトアポリポタンパク質Ａ１、（ｖｉｉｉ）ＰＢＧＤ２のＳＭバリアントに融合されたヒトアポリポタンパク質Ａ１、または（ｉｘ）それらの組み合わせ等をコードする、ポリヌクレオチド含み得る。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは配列最適化されている（例えば、表２、及び国際公開ＷＯ２０１０／０３６１１８号に開示される配列を参照のこと。本文献はその全体が本明細書中に参照により組み込まれる）。
５．ＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の配列最適化
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）は、配列最適化されている。いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）は、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするＯＲＦなどのヌクレオチド配列、別の目的ポリペプチドをコードするＯＲＦなどのヌクレオチド配列、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、ｍｉＲＮＡ、リンカーをコードするヌクレオチド配列、またはそれらの任意の組み合わせで、配列最適化されたものを含む。
配列最適化されたヌクレオチド配列、例えば、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするコドン最適化されたｍＲＮＡ配列は、参照配列（例えば、ＰＢＧＤポリペプチドをコードする野生型ヌクレオチド配列）に対して少なくとも１つの同義の核酸塩基置換を含む配列である。
配列最適化されたヌクレオチド配列は、参照配列とは配列が部分的または完全に異なる場合がある。例えば、ＴＣＴコドンによって一様にコードされるポリセリンをコードする参照配列は、その核酸塩基の１００％を置換して（コドンごとに、１位のＴをＡで置換し、２位のＣをＧで置換し、３位のＴをＣで置換して）配列最適化することによって、ＡＧＣコドンをによって一様にコードされるであろうポリセリンをコードする配列を産生できる。参照ポリセリン核酸配列と配列最適化ポリセリン核酸配列との間の全体的なペアワイズアライメントから得られる配列同一性の百分率は０％であるのに対し、両方の配列に由来するタンパク質産物の同一性は１００％である。
配列最適化（時にはコドン最適化と呼ばれることもある）方法の幾つかは、当該技術分野において公知であり（下記詳述）、１つ以上の所望の結果を達成するうえで有用であり得る。それらの結果としては、例えば、ある特定の組織標的及び／または宿主生物におけるコドン頻度を一致させて、適切な折り畳みを確実にすること、Ｇ／Ｃ含有量をバイアスしてｍＲＮＡ安定性を増加させることまたは二次構造を減少させること、遺伝子構築または発現を損ない得るタンデムリピートコドンまたはベースランを最小化すること、転写及び翻訳制御領域をカスタマイズすること、タンパク質トラフィッキング配列を挿入または除去すること、コードされたタンパク質（例えば、グリコシル化部位）中の翻訳後修飾部位を除去／付加すること、及び／またはポリヌクレオチド内にある二次構造問題を軽減または排除することを挙げることができる。配列最適化ツール、アルゴリズム及びサービスは当該技術分野において公知であり、非限定的な例として、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）提供のサービス、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ ＣＡ）及び／または所有権の保持されている方法が挙げられる。
表１に、各アミノ酸のコドン選択肢を示す。
表１コドン選択肢
Figure 2023062097000033
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）は、ＰＢＧＤポリペプチド、その機能的断片、またはそのバリアントをコードする配列最適化ヌクレオチド配列（例えばＯＲＦ）を含み、配列最適化ヌクレオチド配列でコードされたＰＢＧＤポリペプチド、その機能的断片、またはそのバリアントは、（例えば、配列最適化されていない参照ヌクレオチド配列によりコードされるＰＢＧＤポリペプチド、機能的断片、またはそのバリアントと比較して）ｉｎ ｖｉｖｏ投与後の発現効力に関する特性をはじめとする特性が、改良されている。そのような特性としては、限定されるものではないが、核酸安定性（例えばｍＲＮＡ安定性）の改善、標的組織内での翻訳効率の増強、発現した切断タンパク質数の減少、発現したタンパク質の折り畳みの改善または発現タンパク質の折り畳み異常の防止、発現した産物の毒性の低減、発現した産物によって引き起こされる細胞死の低減、タンパク質凝集の増加及び／または低減が挙げられる。
いくつかの実施形態では、配列最適化されたヌクレオチド配列を、ヒト対象における発現用にコドン最適化することによって、当該技術分野における１つ以上の問題を回避する構造的及び／または化学的特徴（例えば、構造的及び機能的完全性を保持しながら、核酸ベースの治療剤の調合及び送達を最適化するうえで有用な特徴）の確保、発現閾値の克服、発現速度の増進、半減期及び／またはタンパク質濃度の最適化、タンパク質局在の最適化、ならびに免疫応答及び／または分解経路などの有害な生体応答の回避を可能にしている。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列（例えば、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするＯＲＦなどのヌクレオチド配列、別の目的ポリペプチドをコードするＯＲＦなどのヌクレオチド配列、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、マイクロＲＮＡ結合部位、リンカーをコードする核酸配列、またはそれらの任意の組み合わせ）を含み、これらは、以下：
（ｉ）参照ヌクレオチド配列中の少なくとも１つのコドン（例えばＰＢＧＤポリペプチドをコードするＯＲＦ）を代替コドンで置換し、ウリジン含有量を増加または減少させて、ウリジン修飾配列を生成すること、
（ｉｉ）参照ヌクレオチド配列中の少なくとも１つのコドン（例えばＰＢＧＤポリペプチドをコードするＯＲＦ）を、同義コドンセット中のコドン頻度が高い代替コドンで置換すること、
（ｉｉｉ）参照ヌクレオチド配列中の少なくとも１つのコドン（例えばＰＢＧＤポリペプチドをコードするＯＲＦ）を代替コドンで置換して、Ｇ／Ｃ含有量を増加させること、あるいは
（ｉｖ）それらの組み合わせ
を含む方法に従って配列最適化される。
いくつかの実施形態において、配列最適化されたヌクレオチド配列（例えばＰＢＧＤポリペプチドをコードするＯＲＦ）は、参照ヌクレオチド配列に関して少なくとも１つの改良特性を有する。
いくつかの実施形態において、配列最適化方法は、多パラメータを用いたものであり、本明細書中に開示される１、２、３、４もしくはそれより多くの方法、及び／または当該技術分野において公知の他の最適化方法を含む。
本発明のいくつかの実施形態において有益と見なされ得る特徴は、ポリヌクレオチドの領域によってコードされるか、またはポリヌクレオチドの領域内にあり得、そのような領域は、ＰＢＧＤポリペプチドをコードする領域に対して上流（５’）に、下流（３’）に、またはその領域内にあり得る。それらの領域は、タンパク質コード領域またはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に対する配列最適化の前、及び／または後に、ポリヌクレオチド内に組み込むことができる。そのような特徴の例としては、限定されるものではないが、非翻訳領域（ＵＴＲ）、マイクロＲＮＡ配列、コザック配列、オリゴ（ｄＴ）配列、ポリＡ尾部、及び検出可能なタグが挙げられ、ＸｂａＩ認識を有し得る複数のクローニング部位を含む場合がある。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ及び／またはｍｉＲＮＡ結合部位を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、同じまたは異なる配列であり得る２つ以上の５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、同じまたは異なる配列であり得る２つ以上のｍｉＲＮＡを含む。５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、及び／またはｍｉＲＮＡ結合部位のいずれかの部分を、配列最適化することができ、配列最適化の前及び／または後に、１つ以上の異なる構造的もしくは化学的修飾を独立に含めることができる。
いくつかの実施形態では、最適化後に、ポリヌクレオチドを、例えば、限定されるものではないが、プラスミド、ウイルス、コスミド、及び人工染色体などのベクターに再構成して形質転換する。例えば、本明細書に記載の方法によって、最適化されたポリヌクレオチドを再構成して高コピープラスミド様または染色体構造が生じる化学的コンピテントＥ．ｃｏｌｉ、酵母、ニューロスポラ、トウモロコシ、ショウジョウバエなどに形質転換することができる。
６．ＰＢＧＤポリペプチドをコードする配列最適化ヌクレオチド配列
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書中に開示される最適化されたＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、ここで、このＯＲＦは配列最適化されたものである。
ヒトＰＢＧＤアイソフォーム１をコードする例示的な配列最適化ヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号９－３３（ＰＢＧＤ－ＣＯ０１、ＰＢＧＤ－ＣＯ０２、ＰＢＧＤ－ＣＯ０３、ＰＢＧＤ－ＣＯ０４、ＰＢＧＤ－ＣＯ０５、ＰＢＧＤ－ＣＯ０６、ＰＢＧＤ－ＣＯ０７、ＰＢＧＤ－ＣＯ０８、ＰＢＧＤ－ＣＯ０９、ＰＢＧＤ－ＣＯ１０、ＰＢＧＤ－ＣＯ１１、ＰＢＧＤ－ＣＯ１２、ＰＢＧＤ－ＣＯ１３、ＰＢＧＤ－ＣＯ１４、ＰＢＧＤ－ＣＯ１５、ＰＢＧＤ－ＣＯ１６、ＰＢＧＤ－ＣＯ１７、ＰＢＧＤ－ＣＯ１８、ＰＢＧＤ－ＣＯ１９、ＰＢＧＤ－ＣＯ２０、ＰＢＧＤ－ＣＯ２１、ＰＢＧＤ－ＣＯ２２、ＰＢＧＤ－ＣＯ２３、ＰＢＧＤ－ＣＯ２４、及びＰＢＧＤ－ＣＯ２５）として記載されている。更なる例示的なヒトＰＢＧＤアイソフォーム１をコードする配列最適化されたヌクレオチド配列を表２に示す。いくつかの実施形態では、配列番号９～３３として記載のまたは表２に示す、配列最適化されたＰＢＧＤ配列、それらの断片、及びそれらのバリアントを使用して、本明細書に開示される方法が実施される。いくつかの実施形態において、配列番号９～３３に記載のまたは表２に示す配列最適化されたＰＢＧＤ配列、それらの断片及びそれらのバリアントは、図１～４に開示される野生型配列と組み合わされるか、またはその代替とされる。
例示的なヒトＰＢＧＤアイソフォーム１をコードする配列最適化されたヌクレオチド配列が、配列番号８９～１１７（それぞれＰＢＧＤ－ＣＯ３０、ＰＢＧＤ－ＣＯ３１、ＰＢＧＤ－ＣＯ３２、ＰＢＧＤ－ＣＯ３３、ＰＢＧＤ－ＣＯ３４、ＰＢＧＤ－ＣＯ３５、ＰＢＧＤ－ＣＯ３６、ＰＢＧＤ－ＣＯ３７、ＰＢＧＤ－ＣＯ３８、ＰＢＧＤ－ＣＯ３９、ＰＢＧＤ－ＣＯ４０Ａ、ＰＢＧＤ－ＣＯ４１Ａ、ＰＢＧＤ－ＣＯ４２Ａ、ＰＢＧＤ－ＣＯ４３Ａ、ＰＢＧＤ－ＣＯ４４Ａ、ＰＢＧＤ－ＣＯ４５Ａ、ＰＢＧＤ－ＣＯ４６Ａ、ＰＢＧＤ－ＣＯ４７Ａ、ＰＢＧＤ－ＣＯ４０Ｂ、ＰＢＧＤ－ＣＯ４１Ｂ、ＰＢＧＤ－ＣＯ４２Ｂ、ＰＢＧＤ－ＣＯ４３Ｂ、ＰＢＧＤ－ＣＯ４４Ｂ、ＰＢＧＤ－ＣＯ４５Ｂ、ＰＢＧＤ－ＣＯ４６Ｂ、ＰＢＧＤ－ＣＯ４７Ｂ、ＰＢＧＤ－ＣＯ４８、ＰＢＧＤ－ＣＯ４９、ＰＢＧＤ－ＣＯ５０）に記載されている。更なる例示的なヒトＰＢＧＤアイソフォーム１をコードする配列最適化されたヌクレオチド配列を表２に示す。いくつかの実施形態において、配列番号８９～１１７に記載のまたは表２に示す、配列最適化されたＰＢＧＤ配列、断片、及びそれらのバリアントを使用して、本明細書に開示される方法が実施される。いくつかの実施形態において、配列番号８９～１１７に記載のまたは表２に示す配列最適化されたＰＢＧＤ配列、それらの断片及びバリアントは、図１～図４に開示される野生型配列と組み合わされるか、またはその代替とされる。
いくつかの実施形態において、本開示のポリヌクレオチド、例えば、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするｍＲＮＡヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、５’末端から３’末端で：
（ｉ）本明細書中に記載の５’キャップ、例えばＣＡＰ１、
（ｉｉ）５’ＵＴＲ、例えば本明細書中に記載の配列（配列番号３９など）、
（ｉｉｉ）ＰＢＧＤポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、例えば、配列番号９～３３及び８９～１１７に記載の、または表２に示すＰＢＧＤをコードする配列最適化された核酸配列、
（ｉｖ）少なくとも１つの終止コドン、
（ｖ）３’ＵＴＲ、例えば本明細書中に記載の配列（配列番号１４９～１５１など）、及び
（ｖｉ）上記のポリＡ尾部を含む。
表２ヒトＰＢＧＤアイソフォーム１用の配列最適化された配列
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本明細書中に開示される配列最適化されたヌクレオチド配列は、対応する野生型ヌクレオチド酸配列、及び他の公知の配列最適化されたヌクレオチド配列とは異なる。例えば、それらの配列最適化された核酸は独自の組成物特性を有する。
いくつかの実施形態において、配列最適化されたヌクレオチド配列（例えば、ＰＢＧＤポリペプチド、その機能的断片またはそのバリアントをコードするもの）中のウラシルまたはチミン核酸塩基の百分率は、参照野生型ヌクレオチド配列中のウラシルまたはチミン核酸塩基の百分率と比較して、改変（例えば低減）されている。そのような配列は、ウラシル修飾配列、またはチミン修飾配列と呼ばれる。ヌクレオチド配列中のウラシルもしくはチミン含有量の百分率は、配列中のウラシルまたはチミンの数をヌクレオチドの総数で除算してから、１００で乗算することにより算出できる。いくつかの実施形態において、配列最適化されたヌクレオチド配列は、ウラシルまたはチミン含有量は、参照野生型配列中のウラシルまたはチミン含有量よりも低い。いくつかの実施形態において、本発明の配列最適化ヌクレオチド配列中のウラシルまたはチミン含有量は、参照野生型配列中のウラシルもしくはチミン含有量よりも多く、参照野生型配列と比較して有益な効果（例えば、発現の増強、及び／またはトール様受容体（ＴＬＲ）応答の低減）が、依然として維持される。
野生型ＰＢＧＤアイソフォーム１のウラシルまたはチミン含有量は、約２０％である。いくつかの実施形態において、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするウラシルまたはチミン修飾配列のウラシルまたはチミン含有量は、２０％未満である。いくつかの実施形態において、本発明のＰＢＧＤポリペプチドをコードするウラシルまたはチミン修飾配列のウラシルまたはチミン含有量は、１９％未満、１８％未満、１７％未満、１６％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満もしくは１０％未満である。いくつかの実施形態において、ウラシルまたはチミン含有量は、１８％以下、１７％以下、１６％以下、１５％以下、１４％以下、１３％以下、１２％以下、１１％以下もしくは１０％以下である。本明細書中に開示される配列のウラシルまたはチミン含有量、すなわち、その総ウラシルまたはチミン含有量は、本明細書において％ＵＴＬまたは％ＴＴＬと略記されている。
また、本発明のＰＢＧＤポリペプチドをコードするウラシルまたはチミン修飾配列の記載は、対応する野生型核酸配列中のウラシルまたはチミン含有量を基準としたそのウラシルまたはチミン含有量（％ＵＷＴまたは％ＴＷＴ）に従うこともでき、あるいは、野生型タンパク質コードする核酸の理論的最小ウラシルまたはチミン含有量配列を基準としたそのウラシルまたはチミン含有量（％ＵＴＭまたは％ＴＴＭ）に従うこともできる。
「野生型核酸配列中のウラシルまたはチミン含有量に対するウラシルまたはチミン含有量」という語句は、配列最適化核酸中のウラシルまたはチミンの数を、対応する野生型核酸配列中のウラシルまたはチミンの総数で除算して１００で乗算して決定されるパラメータを指す。このパラメータは、本明細書において％ＵＷＴまたは％ＴＷＴと略記される。
いくつかの実施形態において、本発明のＰＢＧＤポリペプチドをコードするウラシルまたはチミン修飾配列の％ＵＷＴまたは％ＴＷＴは、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％もしくは約９５％である。
ウラシルまたはチミンの理論的最小値に対するウラシルまたはチミンの含有量は、配列最適化ヌクレオチド配列中のウラシルまたはチミンの数を、全てのコドンが、ウラシルまたはチミン含有量が可能な限り最低限の同義コドンで置換される仮説ヌクレオチド配列中のウラシルまたはチミンの総数で除算してから、１００で乗算して決定されるパラメータを指す。このパラメータは、本明細書において％ＵＴＭまたは％ＴＴＭと略記される。
ＤＮＡの場合、ウラシルでなくチミンが存在することから、Ｕが出現すべき場所がＴで置き換えられていることが、認識される。ゆえに、ＲＮＡに関して、例えば、％ＵＴＭ、％ＵＷＴまたは％ＵＴＬに関連する全ての開示は、ＤＮＡに関して％ＴＴＭ、％ＴＷＴまたは％ＴＴＬに同等に適用可能である。
いくつかの実施形態において、本発明のＰＢＧＤポリペプチドをコードするウラシル修飾配列の％ＵＴＭは約１１８％～約１３２％である。
いくつかの実施形態において、本発明のＰＢＧＤポリペプチドをコードするウラシル修飾配列は、対応する野生型核酸配列に対して連続したウラシルの数が減少する。例えば、２つの連続するロイシンは、４つのウラシルクラスタを含む配列ＣＵＵＵＵＧによってコードできる。そのようなサブ配列を、例えばＣＵＧＣＵＣで置換することによって、そのウラシルクラスタを除去することができる。
フェニルアラニンは、ＵＵＣまたはＵＵＵによりコードできる。ゆえに、ＵＵＵによりコードされるフェニルアラニンがＵＵＣで置換された場合でも、同義コドンには依然としてウラシルペア（ＵＵ）が含まれる。したがって、配列中のフェニルアラニンの数に基づいて、コードされたポリペプチド中のフェニルアラニン数を変更しない限り排除できないウラシルペア（ＵＵ）の最小数が確定される。例えば、ポリペプチド（例えば、野生型ＰＢＧＤアイソフォーム１）のフェニルアラニン数が、例えば７つ、８つまたは９つである場合、そのポリペプチドをコードするウラシル修飾配列（例えば野生型ＰＢＧＤアイソフォーム１）におけるウラシルペア（ＵＵ）の絶対最小数は、それぞれ７、８または９であり得る。
野生型ＰＢＧＤアイソフォーム１には、３２個のウラシルペア（ＵＵ）、及び４個のウラシルトリプレット（ＵＵＵ）が含まれる。いくつかの実施形態において、本発明のＰＢＧＤポリペプチドをコードするウラシル修飾配列は、野生型核酸配列と比べてウラシルトリプレット（ＵＵＵ）の数が少ない。いくつかの実施形態において、本発明のＰＢＧＤポリペプチドをコードするウラシル修飾配列には、ウラシルトリプレット（ＵＵＵ）４つ、３つ、２つもしくは１つが含まれるかまたは全く含まれない。
いくつかの実施形態において、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするウラシル修飾配列のウラシルペア（ＵＵ）数が、野生型核酸配列中のウラシルペア（ＵＵ）数と比べて低減している。いくつかの実施形態において、本発明のＰＢＧＤポリペプチドをコードするウラシル修飾配列は、野生型核酸配列中のウラシルペア（ＵＵ）の最小限の数に対応するいくつかのウラシルペア（ＵＵ）、例えば野生型ＰＢＧＤアイソフォーム１の場合には９ウラシルペアを有する。
いくつかの実施形態において、本発明のＰＢＧＤポリペプチドをコードするウラシル修飾配列のウラシルペア（ＵＵ）の数は、野生型核酸配列中のウラシルペア（ＵＵ）の数よりも少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個または２４個少ない。いくつかの実施形態において、本発明のＰＢＧＤポリペプチドをコードするウラシル修飾配列のウラシルペア（ＵＵ）数は、８～１６個である。
「野生型核酸配列中のウラシルペア（ＵＵ）に対するウラシルペア（ＵＵ）」という語句は、配列最適化されたヌクレオチド配列中のウラシルペア（ＵＵ）の数を、対応する野生型ヌクレオチド配列中のウラシルペア（ＵＵ）の総数で除算してから１００で乗算したパラメータである。このパラメータは、本明細書において、％ＵＵｗｔと略記されている。
いくつかの実施形態において、本発明のＰＢＧＤポリペプチドをコードするウラシル修飾配列の％ＵＵｗｔは、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、または２０％未満である。
いくつかの実施形態において、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするウラシル修飾配列は、％ＵＵｗｔが２０％～５５％である。特定の実施形態、本発明のＰＢＧＤポリペプチドをコードするウラシル修飾配列は、％ＵＵｗｔが２５％～５５％の間である。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書中に開示されるＰＢＧＤポリペプチドをコードするウラシル修飾配列を含む。いくつかの実施形態において、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするウラシル修飾配列は、少なくとも１つの化学修飾された核酸塩基、例えば、５－メトキシウラシルを含む。いくつかの実施形態において、本発明のＰＢＧＤポリペプチドをコードするウラシル修飾配列中の核酸塩基（例えば、ウラシル）の少なくとも９５％は、修飾核酸塩基である。いくつかの実施形態において、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするウラシル修飾配列中のウラシルの少なくとも９５％は、５－メトキシウラシルである。いくつかの実施形態において、ウラシル修飾配列を含むポリヌクレオチドは更に、例えばｍｉＲ－１４２に結合するｍｉＲＮＡ結合部位及び／またはｍｉＲ－１２６に結合するｍｉＲＮＡ結合部位などの、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。いくつかの実施形態において、本明細書中に開示されるポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）で、ウラシル修飾配列を含むものは、例えば式（Ｉ）を有する化合物、例えば化合物１～２３２のいずれか（例えば化合物１８）、式（ＩＩＩ）（ＩＶ）、（Ｖ）もしくは（ＶＩ）を有する化合物、例えば化合物２３３～３４２のいずれか（例えば化合物２３６）、あるいは式（ＶＩＩＩ）を有する化合物、例えば化合物４１９～４２８のいずれか（例えば化合物４２８）、またはそれらの任意の組み合わせを含む送達剤を用いて製剤化される。いくつかの実施形態において、送達剤は、化合物１８、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物４２８（例えば、モル比を約５０：１０：３８．５：１．５としたもの）を含む。
いくつかの実施形態において「ＰＢＧＤをコードするヌクレオチド配列の理論的最大グアニン含有量に対するＰＢＧＤをコードする配列最適化されたＯＲＦのグアニン含有量」（％ＧＴＭＸと略記）は、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％である。いくつかの実施形態において、％ＧＴＭＸは、約７０％～約８０％、約７１％～約７９％、約７１％～約７８％、または約７１％～約７７％である。
いくつかの実施形態において、「ＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の理論的最大シトシン含有量に対するＯＲＦのシトシン含有量」（％ＣＴＭＸと略記）は、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％である。いくつかの実施形態において、％ＣＴＭＸは、約６０％～約８０％、約６２％～約８０％、約６３％～約７９％、または約６８％～約７６％である。
いくつかの実施形態において、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列中の理論的最大グアニン及びシトシン含有量（Ｇ／Ｃ）に対するＯＲＦのＧ／Ｃ含有量」（％Ｇ／ＣＴＭＸと略記）は、少なくとも約８１％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％である。％Ｇ／ＣＴＭＸは、約８０％～約１００％、約８５％～約９９％、約９０％～約９７％、または約９１％～約９６％である。
いくつかの実施形態において「対応する野生型ＯＲＦにおけるＧ／Ｃ含有量に対するＯＲＦ中のＧ／Ｃ含有量」（％Ｇ／ＣＷＴと略記）は、少なくとも１０２％、少なくとも１０３％、少なくとも１０４％、少なくとも１０５％、少なくとも１０６％、少なくとも１０７％、少なくとも１１０％、少なくとも１１５％、または少なくとも１２０％である。
いくつかの実施形態において、ＯＲＦ中の第３のコドン位置における平均Ｇ／Ｃ含有量は、対応する野生型ＯＲＦの第３のコドン位置の平均Ｇ／Ｃ含有量よりも少なくとも２０％、少なくとも２１％、少なくとも２２％、少なくとも２３％、少なくとも２４％、少なくとも２５％、少なくとも２６％、少なくとも２７％、少なくとも２８％、少なくとも２９％、または少なくとも３０％高い。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、このＯＲＦが配列最適化されていて、％ＵＴＬ、％ＵＷＴ、％ＵＴＭ、％ＧＴＬ、％ＧＷＴ、％ＧＴＭＸ、％ＣＴＬ、％ＣＷＴ、％ＣＴＭＸ、％Ｇ／ＣＴＬ、％Ｇ／ＣＷＴもしくは％Ｇ／ＣＴＭＸの各々は、単独でまたはそれらの組み合わせで、（ｉ）パラメータの最大（ＭＡＸ）に対応する最大値に約０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５もしくは１０標準偏差（ＳＴＤ ＤＥＶ）を加算した値と（ｉｉ）パラメータの最小値（ＭＩＮ）に対応する最小値から０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５もしくは１０標準偏差（ＳＴＤ ＤＥＶ）を減算した値との間の範囲内にある。
７．配列最適化の方法
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、例えばｍＲＮＡ（例えば、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、例えば、野生型配列、その機能的断片、またはそのバリアント）は、配列最適化されている。配列最適化されたヌクレオチド配列（ヌクレオチド配列は本明細書中で「核酸」とも呼ばれる）は、参照配列（例えば、ＰＢＧＤポリペプチドをコードする野生型配列）に関して少なくとも１つのコドン修飾を含む。ゆえに、配列最適化された核酸、少なくとも１つのコドンは、参照配列（例えば、野生型配列）中の対応するコドンとは異なる。
概して、配列最適化された核酸は、参照配列中のコドンを同義コドン（すなわち、同じアミノ酸をコードするコドン）で置換することを含む少なくとも１つのステップによって生成される。そのような置換は、例えば、コドン置換マップ（すなわち、コドン最適化配列中の各アミノ酸をコードするコドンを提供する表）を適用することにより、または、一連のルール（例えば、グリシンが中性アミノ酸の隣にある場合にはグリシンはある特定のコドンによってコードされるが、極性アミノ酸の隣にある場合には別のコドンによってコードされる等）を適用して、行うことができる。コドン置換（すなわち、「コドン最適化」）に加えて、本明細書中に開示される配列最適化方法は、有害モチーフの除去（不安定化モチーフ置換）のようなコドン最適化に厳密に向けられていない追加の最適化ステップを含む。これらの配列最適化された核酸（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）を含む組成物及び製剤を、それを必要とする対象に投与することによって、ｉｎ ｖｉｖｏで機能的に活性なＰＢＧＤの発現を促進することができる。
細胞培養物中の大分子の組み換え発現は、タンパク質の発現レベルが低い、あるいは翻訳が停止された結果として翻訳産物が短縮されること、タンパク質の折り畳み異常を生ずるなどの、数多くの制限を伴う困難な課題となる可能性がある。それらの制限は、機能的に活性なＰＢＧＤをコードするポリヌクレオチド（例えばｍＲＮＡなどのＲＮＡ）、またはそのポリヌクレオチドを含む組成物または製剤をＡＩＰ罹患患者に投与することによって、ＡＩＰを治療するためのＰＢＧＤポリペプチドの合成及び送達が内因的に生起されるようにすることにより、低減または回避することができる。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系（例えば、細胞培養）がｉｎ ｖｉｖｏ発現に変えるには、治療薬をコードする核酸配列の再デザインが必要となる。コードされたアミノ酸配列を必ずしも変更することなしに別のコドンを選択することによって天然起源の遺伝子配列を再デザインすることで、多くの場合、タンパク質の発現レベルが劇的に上昇させることができる（Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２２：３４６－５３）。コドン適応指数（ＣＡＩ）、ｍＲＮＡ二次構造、シス調節配列、ＧＣ含有量及び他の多くの類似の変数をはじめとする変数は、タンパク質の発現レベルに幾分かは相関することが示されている（Ｖｉｌｌａｌｏｂｏｓ ｅｔ ａｌ．，２００６，ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ７：２８５）。しかしながら、遺伝コードの縮重により、すべて同じ治療剤をコードできる多数の異なる核酸配列が存在する。各アミノ酸は最高６つまでの同義コドンによってコードされ、これらのコドン間の選択は遺伝子発現に影響を及ぼす。加えて、コドン使用状況（すなわち、様々な生物がポリペプチド配列を発現する際にコドンを使用する頻度）は、生物間で異なる（例えば、ハムスターの細胞培養では、ヒトまたはヒト化治療抗体の組み換え産生が頻繁に起こる）。
いくつかの実施形態において、参照核酸配列を配列最適化することを目的に、コドンマップを適用できる。当業者に了解されるように、ＤＮＡ中にはＴ塩基が存在するが、そのＴ塩基は対応するＲＮＡ中ではＵ塩基で置き換えられるであろう。例えば、本明細書中に開示される配列最適化されたＤＮＡ形態の核酸（例えば、ベクターまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳（ＩＶＴ）鋳型）は、そのＴ塩基を、Ｕ塩基として、それに対応する転写ｍＲＮＡ中に転写されるであろう。この点に関して、配列最適化されたＤＮＡ配列（Ｔを含む）、及びそれら対応するＲＮＡ配列（Ｕを含む）は両方とも、本発明の配列最適化された核酸と見なされる。また、１つ以上の塩基を非天然塩基で置換することによって等価コドンマップを生成できることも、当業者に理解されるであろう。ゆえに、例えば、ＴＴＣコドン（ＤＮＡマップ）はＵＵＣコドン（ＲＮＡマップ）に対応するであろうし、後者のコドンはΨΨＣコドン（Ｕがシュードウリジンで置換されたＲＮＡマップ）に対応し得る。
一実施形態では、ある特定のアミノ酸をコードする全てのコドンを、コドンマップ中に提供される代替コドンのうちの１つだけで置換して、ＰＢＧＤをコードする参照配列を最適化することができる。例えば、最適化された配列中の全てのバリンは、ＧＴＧ、ＧＴＣまたはＧＴＴでコードされるであろう。
配列最適化された本発明のポリヌクレオチドは、１つ以上の最適化方法、またはそれらの組み合わせを用いて、生成できる。核酸配列を配列最適化する目的に使用できる配列最適化方法は、本明細書中に詳述されている。この方法の一覧は、包括的でもないしあるいは限定的でもない。
周知のように、後述する配列最適化方法の各々について説明したデザイン原理及びルールは、多様な方法で併用できる。例えば、いくつかの領域に対する高Ｇ／Ｃ含有量配列最適化、または参照核酸配列の他の領域に対するウリジン含有量の配列最適化、ならびに標的化されたヌクレオチドの変異を含み、配列全体にわたる二次構造を最小限に抑えるかまたは不利益モチーフを排除する。
配列最適化法に関して考えられる組み合わせの選択肢は、例えば、合成ポリヌクレオチドを産生する目的に使用される、特定の化学的性質に依存し得る。そのような選択肢は、配列最適化された核酸によりコードされるタンパク質の特徴（例えば完全配列、機能的断片またはＰＢＧＤを含む融合タンパク質など）に依存し得る。いくつかの実施形態において、そのような選択は、配列最適化された核酸（例えば、治療的合成ｍＲＮＡ）によって標的とされる、特定の組織または細胞に依存し得る。
配列最適化方法、または最適化方法の応用及び解析から導き出されたデザインルールを組み合わせるメカニズムは、単純になる場合もあるしあるいは複雑になる場合もある。例えば、可能な組み合わせは以下のとおりとなり得る：
（ｉ）逐次的：各配列最適化方法または一連のデザインルールが、配列全体中の異なるサブ配列に適用され、例えばコドン位置１～３０でウリジンを減少させ、次いで、配列の残りの部分に対しては高頻度のコドンを選択する。
（ｉｉ）階層的：いくつかのシーケンス最適化方法または一連のデザインルールが、階層的な決定論的様式にて結合される。例えば、ほとんどのＧＣ富化コドンを使用するには、それらのコドンの中で最高頻度のコドンを選択することによって（一般的）結合を破壊する。
（ｉｉｉ）多因子／多パラメータ：機械学習または他のモデリング技術を用いて、重複し、矛盾のある可能性のある複数の要件を最も満たす、単一の配列をデザインする。このアプローチでは、コンピュータを使用して、例えば遺伝的アルゴリズムのような数学的手法を適用する必要がある。
最終的に、これらのアプローチの各々により、多くの事例において単一コドン表、すなわち標的タンパク質（すなわちＰＢＧＤ）中のアミノ酸ごとにソートされたコドンリストに要約できる特定のルールセット、ならびに、アミノ酸位置に特異的なコドンを選択する方法を示す特定のルールまたは一連のルールをもたらすことができる。
ａ．ウリジン含有量の最適化
核酸配列中に局所的に高濃度のウリジンが存在すると、特に合成ｍＲＮＡの産生時に修飾ウリジン類似体が使用される場合に、翻訳に遅延が生じたりまたは時期尚早に翻訳が中断されたりする等、翻訳に有害な影響が及び得る。更になお、ウリジン含有量が高い場合、ＴＬＲの活性化が原因で、合成ｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ半減期が短縮もされ得る。
したがって、少なくとも１つのウリジン含有量の最適化ステップを含む方法を使用して、核酸配列を配列最適化することができる。そのようなステップは、例えば、参照核酸中の少なくとも１つのコドンを代替コドンで置換して、ウリジン修飾配列を生成することを含む。ここで、このウリジン修飾配列は、下記特性のうち少なくとも１つを有するものである。
（ｉ）ウリジン含有量の全体的な増加または減少、
（ｉｉ）ウリジン含有量の局所的な増加または減少（すなわち、ウリジン含有量の変化は特定のサブ配列に限定される）、
（ｉｉｉ）ウリジン含有量の全体的な変化を伴わない、ウリジン分布の変化、
（ｉｖ）ウリジンのクラスタリング（例えば、クラスタの数、クラスタの位置、またはクラスタ間の距離）の変化、あるいは
（ｖ）それらの組み合わせ。
いくつかの実施形態において、配列最適化プロセスは、全体的なウリジン含有量を最適化すること、すなわち、参照核酸配列中のウリジン核酸塩基の百分率に対して、配列最適化された核酸中のウリジン核酸塩基の百分率を最適化することを含む。例えば、参照配列では核酸塩基の３０％がウリジンであり得、配列最適化された核酸では核酸塩基の１０％がウリジンであり得る。
他の実施形態において、配列最適化プロセスは、参照核酸配列の特定の領域における局所的なウリジン含有量を低減させること、すなわち、参照核酸配列の対応するサブ配列中のウリジン核酸塩基の百分率に対して配列最適化核酸のサブ配列中のウリジン核酸塩基の百分率を低減させることを含む。例えば、参照核酸配列は、局所的ウリジン含有量が３０％である５’末端領域（例えば３０コドン）を有し得、その同じ領域内のウリジン含有量は、配列最適化核酸において１０％まで低減され得る。
特定の実施形態では、参照核酸配列内のコドンを置換することで、例えば、タンパク質翻訳に対して有害な影響を及ぼす可能性のあるウリジンクラスタの数、サイズ、位置、または分布を、低減または修飾することができる。一般原則として、参照核酸配列のウリジン含有量を減少させることが望ましいが、ある特定の実施形態では、参照核酸配列の一部のサブ配列のウリジン含有量、特に局所ウリジン含有量を増加させることができる。
ウリジン含有量の低減による、翻訳に対する悪影響の回避は、本明細書中に開示される他のデザイン目標を達成するための他の最適化方法と組み合わせて遂行することができる。例えば、ウリジン含有量の最適化は、ランプデザインと併用される場合がある。なぜなら、ほとんどのアミノ酸に対して最も希少なコドンを使用することによって、若干の例外を除いて、Ｕ含有量が低減されるためである。
いくつかの実施形態において、ウリジン修飾配列は、参照核酸配列と比較して、トール様受容体（ＴＬＲ）応答の低下を誘導するようにデザインされている。いくつかのＴＬＲは、核酸を認識して応答する。頻繁に見られるウイルス成分である二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡは、ＴＬＲ３を活性化することが示されている。Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ，４１３：７３２-７３８、及びＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１０：１３６６-１３７３を参照のこと。一本鎖（ｓｓ）ＲＮＡによって、ＴＬＲ７が活性化される。Ｄｉｅｂｏｌｄ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０３：１５２９-１５３１を参照のこと。ＲＮＡオリゴヌクレオチド（例えばホスホロチオエートヌクレオチド）間結合を有するＲＮＡは、ヒトＴＬＲ８のリガンドである。Ｈｅｉｌ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０３：１５２６-１５２９を参照のこと。細菌及びウイルスＤＮＡに特有な非メチル化ＣｐＧモチーフを含むＤＮＡによって、ＴＬＲ９が活性化される。Ｈｅｍｍｉ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ，４０８：７４０-７４５を参照のこと。
本明細書において「ＴＬＲ応答」という用語は、ＴＬＲ７受容体による一本鎖ＲＮＡの認識として定義され、いくつかの実施形態では、受容体による一本鎖ＲＮＡの認識によって引き起こされるＲＮＡ分解、及び／または生理学的応答を包含する。ＴＬＲ７へのＲＮＡの結合を判別して定量する方法は、当該技術分野において公知である。同様に、ＲＮＡがＴＬＲ７媒介性生理学的応答（例えば、サイトカイン分泌）を誘発したかどうかを判定する方法は、当該技術分野において周知である。いくつかの実施形態において、ＴＬＲ応答は、ＴＬＲ７でなく、ＴＬＲ３、ＴＬＲ８またはＴＬＲ９によって媒介され得る。
ＳＴＬＲ７媒介性応答の抑制は、ヌクレオシド修飾を介して達成できる。自然界では、ＲＮＡは、１００を超えるヌクレオシド修飾を経る（ｍｏｄｓ．ｒｎａ．ａｌｂａｎｙ．ｅｄｕで閲覧可能なＲＮＡ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｄａｔａｂａｓｅを参照）。例えば、ヒトｒＲＮＡは、細菌ｒＲＮＡに比べて、シュードウリジン（Ψ）が１０倍多く、しかも２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドが２５倍多い。細菌ｍＲＮＡにはヌクレオシド修飾が全く含まれないのに対して、哺乳類のｍＲＮＡには、Ｎ７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）のほか、５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、イノシン、及び多くの２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドなどの修飾ヌクレオシドが含まれている。
ＲＮＡの２つの定義的な特徴であるウラシル及びリボースは、ＴＬＲ７刺激に必要且つ十分であり、短い一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）は、いくつかのウリジンが近接して含まれている限り、配列非依存的な様式でＴＬＲ７アゴニストとして作用する。Ｄｉｅｂｏｌｄ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６：３２５６－３２６７を参照のこと。本文献はその全体が本明細書中に参照により組み込まれる。したがって、本明細書中に開示される１つ以上の最適化方法は、ウリジン含有量を（局所的及び／または大域的に）減少させること、及び／またはウリジンクラスタ形成の低減もしくは修飾によってＴＬＲ７媒介性応答を減少または抑制することを含む。
いくつかの実施形態において、ウリジン修飾配列を介して生ずるＴＬＲ応答（例えば、ＴＬＲ７により媒介される応答）は、参照核酸配列を介して生ずるＴＬＲ応答よりも少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％低い。
いくつかの実施形態において参照核酸配列を介して生ずるＴＬＲ応答は、ウリジン修飾配列を介して生ずるＴＬＲ応答よりも少なくとも約１倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、または少なくとも約１０倍高い。
いくつかの実施形態において、ウリジン修飾配列のウリジン含有量（平均の全体的なウリジン含有量）（絶対または相対）は、参照核酸配列のウリジン含有量（絶対または相対）よりも高い。したがって、いくつかの実施形態において、ウリジン修飾配列には、参照核酸配列よりも少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％もしくは少なくとも約１００％多くのウリジンが含有される。
他の実施形態において、ウリジン修飾配列のウリジン含有量（平均の全体的なウリジン含有量）（絶対または相対）は、参照核酸配列のウリジン含有量（絶対または相対）よりも低い。したがって、いくつかの実施形態において、ウリジン修飾配列中のウリジン含有量は、参照核酸配列に比べて少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％少ない。
いくつかの実施形態において、ウリジン修飾配列のウリジン含有量（平均の全体的なウリジン含有量）（絶対または相対）は、ウリジン修飾配列中の核酸塩基総数の５０％、４９％、４８％、４７％、４６％、４５％、４４％、４３％、４２％、４１％、４０％、３９％、３８％、３７％、３６％、３５％、３４％、３３％、３２％、３１％、３０％、２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％もしくは１％未満である。いくつかの実施形態において、ウリジン修飾配列のウリジン含有量は、約１０％～約２０％である。いくつかの特定の実施形態において、ウリジン修飾配列のウリジン含有量は、約１２％～約１６％である。
いくつかの実施形態において、参照核酸配列のウリジン含有量は、スライディングウインドウを使用して測定できる。いくつかの実施形態において、スライディングウインドウの長さは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０核酸塩基である。いくつかの実施形態において、スライディングウインドウは、４０核酸塩基長を超える。いくつかの実施形態において、スライディングウインドウは、２０核酸塩基長である。参照核酸配列及び配列最適化された核酸の全長にわたるウリジン含有量を表すヒストグラムを、スライディングウインドウで測定されたウリジン含有量に基づいて、生成することが可能である。
いくつかの実施形態において参照核酸配列は、特定の百分率値超またはそれ未満のヒストグラムのピークが低減または排除されるように修飾できる。いくつかの実施形態において参照核酸配列は、スライディングウインドウ表現にて、ウリジン約６５％超、６０％超、５５％超、５０％超、４５％超、４０％超、３５％超または３０％超のピークが排除されるように修飾できる。別の実施形態において参照核酸配列は、２０核酸塩基スライディングウインドウを使用して測定した場合、配列最適化された核酸中にウリジン３０％超のピークが存在しないように修飾できる。いくつかの実施形態では、参照核酸配列は、２０核酸塩基スライディングウインドウを使用して測定した場合、配列最適化された核酸配列中の所定数以上または所定数以下のピークが特定の閾値超もしくは閾値未満にならないように修飾できる。例えば、いくつかの実施形態において参照核酸配列は、配列最適化された核酸中の０、１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０を超えないピークが、ウリジン約１０％超、１５％超、２０％超、２５％超または３０％超になるように修飾できる。別の実施形態では、配列最適化された核酸には、３０％よりも高いピークは０ピーク～２ピークが含有される。
いくつかの実施形態において参照核酸配列は、ウリジンの連続発生が低減されるように配列最適化することができる。例えば、２つの連続するロイシンは、配列ＣＵＵＵＵＧでコードされ得る。このコードの場合、４つのウリジンのクラスタが含まれている。そのようなサブ配列は、ＣＵＧＣＵＣで置換され得る。この置換によって、ウリジンクラスタが効率的に除去される。したがって、参照核酸配列は、ウリジンペア（ＵＵ）、ウリジントリプレット（ＵＵＵ）またはウリジンクアドラプレット（ＵＵＵＵ）を減らすかあるいは無くすことによって、配列最適化することができる。Ｕを高次に組み合わせたものは、低次に組み合わせたものとは異なる組み合わせであると見なされる。ゆえに、例えば、ＵＵＵＵは、２つの連続Ｕペアではなく厳密にクアドラプレットと見なされ、また、ＵＵＵＵＵＵは、３つの連続Ｕペアまたは２つの連続Ｕトリプレットでなく６つ組と見なされる、といったようになる。
いくつかの実施形態では、全てのウリジンペア（ＵＵ）及び／またはウリジントリプレット（ＵＵＵ）及び／またはウリジンクアドラプレット（ＵＵＵＵ）を、参照核酸配列から除去することができる。他の実施形態において、ウリジンペア（ＵＵ）及び／またはウリジントリプレット（ＵＵＵ）及び／またはウリジンクアドラプレット（ＵＵＵＵ）は、ある特定の閾値未満、例えば、配列最適化された核酸における出現数を１以下、２以下、３以下、４以下、５以下、６以下、７以下、８以下、９以下、１０以下、１１以下、１２以下、１３以下、１４以下、１５以下、１６以下、１７以下、１８以下、１９以下、または２０以下に低減させることができる。特定の実施形態において、配列最適化された核酸には、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１未満のウリジンペアが含有される。別の特定の実施形態において、配列最適化された核酸には、ウリジンペア及び／またはトリプレットが全く含まれない。
フェニルアラニンコドン（すなわち、ＵＵＣまたはＵＵＵ）は、ウリジンペアまたはトリプレットを含むことから、配列最適化によってウリジン含有量を低減させた場合、フェニルアラニンＵトリプレットの低減は、最大でフェニルアラニンＵペアとすることができる。いくつかの実施形態において、ウリジンペア（ＵＵ）及び／またはウリジントリプレット（ＵＵＵ）の出現は、非フェニルアラニンＵ対またはトリプレットのみを指す。したがって、いくつかの実施形態において、非フェニルアラニンウリジンペア（ＵＵ）及び／またはウリジントリプレット（ＵＵＵ）は、ある特定の閾値未満、例えば、配列最適化された核酸における出現数を１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０以下に低減させることができる。特定の実施形態において、配列最適化された核酸には、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２もしくは１未満の非フェニルアラニンウリジンペア及び／またはトリプレットが含まれる。別の特定の実施形態において、配列最適化された核酸には、非フェニルアラニンウリジンペア及び／またはトリプレットが全く含まれない。
いくつかの実施形態において、配列最適化された核酸中のウリジンの組み合わせ（例えば、ペア、トリプレット、クアドラプレット）の低減は、参照核酸配列中に存在するウリジンの組み合わせに対する百分率の低減として表すことができる。
いくつかの実施形態において、配列最適化された核酸には、配列最適化された核酸には、参照核酸配列中に存在するウリジンペアの総数の約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％が含有され得る。いくつかの実施形態において、配列最適化された核酸には、参照核酸配列中に存在するウリジントリプレットの総数の約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％が含有され得る。いくつかの実施形態において、配列最適化された核酸には、参照核酸配列中に存在するウリジンクアドラプレットの総数の約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％が含有され得る。
いくつかの実施形態において、配列最適化された核酸には、参照核酸配列中に存在する非フェニルアラニンウリジンペアの総数の約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％が含有され得る。いくつかの実施形態において、配列最適化された核酸には、配列最適化された核酸には、参照核酸配列中に存在する非フェニルアラニンウリジンのトリプレットの総数の約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％が含有され得る。
いくつかの実施形態において、配列最適化された配列中のウリジン含有量は、配列中の理論的最小ウリジン含有量を基準にして表すことができる。「理論的最小ウリジン含有量」という用語は、核酸配列のウリジン含有量（配列中の全てのコドンがウリジン含有量の最も低い同義コドンで置換された後の、配列の長さの百分率）として定義される。いくつかの実施形態において、配列最適化された核酸のウリジン含有量は、参照配列（例えば野生型配列）の理論的最小ウリジン含有量と同一である。いくつかの態様において、配列最適化された核酸のウリジン含有量は、参照配列（例えば野生型配列）の理論的最小ウリジン含有量の約１００％、約１０５％、約１１０％、約１１５％、約１２０％、約１２５％、約１３０％、約１３５％、約１４０％、約１４５％、約１５０％、約１５５％、約１６０％、約１６５％、約１７０％、約１７５％、約１８０％、約１８５％、約１９０％、約１９５％、約２００％、約２１０％、約２２０％、約２３０％、約２４０％または約２５０％である。
いくつかの実施形態において、配列最適化された核酸のウリジン含有量は、参照配列（例えば野生型配列）の理論的最小ウリジン含有量と同一である。
参照核酸配列（例えば野生型配列）は、その数、サイズ、位置、分布またはそれらの組み合わせが原因で翻訳に対しマイナスの効果を有する、ウリジンクラスタを含み得る。本明細書において「ウリジンクラスタ」という用語は、ある特定の閾値を超えるウリジン含有量（通常、百分率として記載）を含む参照核酸配列または配列最適化された核酸配列のサブ配列を指す。ゆえに、ある特定の実施形態において、サブ配列のウリジン含有量が、約１０％超、１５％超、２０％超、２５％超、３０％超、３５％超、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超または６５％超である場合、そのようなサブ配列は、ウリジンクラスタであると見なされる。
ウリジンクラスタによるマイナスの効果によって、例えばＴＬＲ７応答が誘発され得る。ゆえに、本明細書に開示される核酸配列最適化方法のいくつかの実施において、クラスタの数、クラスタのサイズ、クラスタの位置（核酸配列の５’及び／もしくは３’末端に近接する等）、クラスタ間の距離、またはウリジンクラスタの分布（例えば、核酸配列に沿ったクラスタのある特定のパターン、発現産物中の二次構造エレメントに関するクラスタの分布、またはｍＲＮＡの二次構造に関するクラスタの分布）を低減することが望ましい。
いくつかの実施形態において参照核酸配列は、参照核酸配列のサブ配列であり、且つ前記サブ配列中の総ウリジン核酸塩基の百分率が所定の閾値を上回る、少なくとも１つのウリジンクラスタを含む。いくつかの実施形態において、サブ配列の長さは、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、少なくとも約９０、少なくとも約９５、または少なくとも約１００核酸塩基である。いくつかの実施形態において、サブ配列は１００核酸塩基よりも長い。いくつかの実施形態において、ウリジン含有量の閾値は、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％または２５％である。いくつかの実施形態において、この閾値は約２５％である。
例えば、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｓ及びＲが含まれるアミノ酸配列を、核酸配列ＧＣＵ、ＧＡＵ、ＧＧＵ、ＡＧＵ、ＣＧＵでコードすることが可能である。そのような配列は、ウリジンペア、トリプレットまたはクアドラプレットを含まないが、核酸塩基の１／３はウリジンであろう。そのようなウリジンクラスタは、例えば、ＧＣＣ、ＧＡＣ、ＧＧＣ、ＡＧＣ及びＣＧＣなどの、ウリジン不含の代替コドンを使用して、除去することが可能である。
他の実施形態において参照核酸配列は、参照核酸配列のサブ配列であり、スライディングウインドウを用いて測定された前記サブ配列のウリジン核酸塩基の百分率が、所定の閾値を上回る、少なくとも１つのウリジンクラスタを含む。いくつかの実施形態において、スライディングウインドウの長さは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０核酸塩基である。いくつかの実施形態において、スライディングウインドウは、４０核酸塩基長を超える。いくつかの実施形態において、ウリジン含有量の閾値は、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％または２５％である。いくつかの実施形態において、この閾値は２５％を超える。
いくつかの実施形態において参照核酸配列は、少なくとも２つのウリジンクラスタを含む。いくつかの実施形態において、ウリジン修飾配列のウリジン富化クラスタ含有量は参照核酸配列よりも低い。いくつかの実施形態において、ウリジン修飾配列のウリジン富化クラスタ含有量は参照核酸配列よりも高い。いくつかの実施形態において、ウリジン修飾配列中に含まれるウリジン富化クラスタの長さは、参照核酸配列中の対応するウリジン富化クラスタよりも短い。他の実施形態において、ウリジン修飾配列中に含まれるウリジン富化クラスタの長さは、参照核酸配列中の対応するウリジン富化クラスタよりも長い。
Ｋａｒｉｋｏ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２３：１６５－１７５；Ｋｏｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９：１５４－１５７、またはＳａｈｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ｜ＡＯＰ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ １９ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１４ｍ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｄ４２７８を参照のこと。これらの文献はいずれも、その全体が本明細書中に参照により組み込まれる。
ｂ．グアニン／シトシン（Ｇ／Ｃ）含有量
参照核酸配列は、参照核酸配列のグアニン／シトシン（Ｇ／Ｃ）含有量（絶対または相対）を変更することを含む方法を使用して、配列最適化することができる。そのような最適化では、参照核酸配列の全体的なＧ／Ｃ含有量（絶対または相対）を変更する（例えば増加または減少させる）こと、参照核酸配列中のＧ／Ｃ含有量における局所的な変更を導入する（参照核酸配列中の選択された領域またはサブ配列におけるＧ／Ｃを増加または減少させる）こと、参照核酸配列中のＧ／Ｃクラスタの頻度、サイズ及び分布、またはそれらの組み合わせを変更すること、を含めることができる。
いくつかの実施形態において、ＰＢＧＤをコードする配列最適化された核酸は、参照核酸配列のＧ／Ｃ含有量（絶対または相対）に対してＧ／Ｃ含有量（絶対または相対）の全体的な増加を含む。いくつかの実施形態において、Ｇ／Ｃ含有量の全体的な増加（絶対または相対）は、参照核酸配列のＧ／Ｃ含有量（絶対または相対）に対して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％もしくは少なくとも約１００％である。
いくつかの実施形態において、ＰＢＧＤをコードする配列最適化された核酸は、参照核酸配列のＧ／Ｃ含有量に対してＧ／Ｃ含有量の全体的な（絶対または相対）減少を含む。いくつかの実施形態において、Ｇ／Ｃ含有量の全体的な（絶対または相対）減少は、参照核酸配列のＧ／Ｃ含有量（絶対または相対）に対して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％もしくは少なくとも約１００％である。
いくつかの実施形態において、ＰＢＧＤをコードする配列最適化された核酸は、参照核酸配列中の対応するサブ配列のグアニン／シトシン（Ｇ／Ｃ）Ｇ／Ｃ含有量（絶対または相対）に対して、サブ配列（すなわち、Ｇ／Ｃ修飾サブ配列）中のＧ／Ｃ含有量含有量（絶対または相対）の局所的な増加を含む。いくつかの実施形態において、Ｇ／Ｃ含有量（絶対または相対）の局所的な減少は、参照核酸配列中の対応するサブ配列のＧ／Ｃ含有量（絶対または相対）に対して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％もしくは少なくとも約１００％である。
いくつかの実施形態において、ＰＢＧＤをコードする配列最適化された核酸は、参照核酸配列中の対応するサブ配列のグアニン／シトシン（Ｇ／Ｃ）含有量（絶対または相対）に対して、サブ配列（すなわち、Ｇ／Ｃ修飾サブ配列）中のＧ／Ｃ含有量（絶対または相対）の局所的な減少を含む。いくつかの実施形態において、Ｇ／Ｃ含有量の局所的な減少（絶対または相対）は、参照核酸配列中の対応するサブ配列のＧ／Ｃ含有量（絶対または相対）に対して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％もしくは少なくとも約１００％である。
いくつかの実施形態では、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくは１００核酸塩基長のサブ配列のＧ／Ｃ含有量（絶対または相対）が、増加または減少する。
いくつかの実施形態では、少なくとも約１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０もしくは１０００核酸塩基長のサブ配列のＧ／Ｃ含有量（絶対または相対）が、増加または減少する
いくつかの実施形態では、少なくとも約１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、４１００、４２００、４３００、４４００、４５００、４６００、４７００、４８００、４９００、５０００、５１００、５２００、５３００、５４００、５５００、５６００、５７００、５８００、５９００、６０００、６１００、６２００、６３００、６４００、６５００、６６００、６７００、６８００、６９００、７０００、７１００、７２００、７３００、７４００、７５００、７６００、７７００、７８００、７９００、８０００、８１００、８２００、８３００、８４００、８５００、８６００、８７００、８８００、８９００、９０００、９１００、９２００、９３００、９４００、９５００、９６００、９７００、９８００、９９００もしくは１００００核酸塩基長のサブ配列のＧ／Ｃ含有量（絶対または相対）が、増加または減少する
本明細書に記載のＧ含有量及びＣ含有量（絶対もしくは相対）の増加または減少は、Ｇ／Ｃ含有量の低い同義コドンをＧ／Ｃ含有量の高い同義コドンで置換することによって、またはその逆に、Ｇ／Ｃ含有量の高い同義コドンをＧ／Ｃ含有量の低い同義コドンで置換することによって行うことができる。例えば、Ｌは６つの同義コドンを有し、それらの同義コドンのうちの２つは２つのＧ／Ｃ（ＣＵＣ、ＣＵＧ）を有し、そのうちの３つは１つのＧ／Ｃ（ＵＵＧ、ＣＵＵ、ＣＵＡ）を有し、そのうちの１つはＧ／Ｃ（ＵＵＡ）を有さない。したがって、ある特定の位置にて参照核酸がＣＵＣコドンを有した場合、ＣＵＣを単一のＧ／Ｃを有するコドンまたはＧ／Ｃを全く有さないコドンのいずれかで置換することによって、その位置におけるＧ／Ｃ含有量を低減させ得る。
米国特許出願公開第ＵＳ２０１４０２２８５５８号、同第ＵＳ２００５００３２７３０ Ａ１；Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ８３：３７-４６を参照のこと。これらの文献はいずれも、その全体が本明細書中に参照により組み込まれる。
ｃ．コドン頻度－コドン使用バイアス
当該技術分野において公知のコドン最適化法の多くは、参照核酸配列中のコドンを頻度の高いコドンで置換することに基礎を置くものである。ゆえに、いくつかの実施形態において、本明細書中に開示されるＰＢＧＤをコードする核酸配列は、非コドン最適化配列中の使用頻度に関し、配列最適化された核酸中の他の同義コドンに対して１つ以上のコドンの使用頻度の改変を用いることを含む方法を使用して、配列最適化することができる。
本明細書において「コドン頻度」という用語は、コドン使用バイアス、すなわちコードＤＮＡ／ＲＮＡ中の同義コドンの出現頻度の差異を指す。遍く認識されているように、翻訳の最適化を期して、変異バイアスと自然選択との間のバランスがコドンの優先順位に反映される。最適コドンは、翻訳の迅速化及び高精度化を達成する助けとなる。それらの要因の結果、高度に発現した遺伝子において、翻訳の選択が強力になることが予期される。バイオインフォマティクス及び計算生物学の分野では、多くの統計的方法が提案され、コドン使用バイアスの分析を目的に使用されている。例えばＣｏｍｅｒｏｎ ＆ Ａｇｕａｄｅ（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．４７：２６８-７４を参照。「最適コドンの頻度」（Ｆｏｐ）（Ｉｋｅｍｕｒａ（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５１（３）：３８９-４０９），”Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｃｏｄｏｎ Ａｄａｐｔａｔｉｏｎ”（ＲＣＡ）（Ｆｏｘ ＆ Ｅｒｉｌ（２０１０）ＤＮＡ Ｒｅｓ．１７（３）：１８５-９６）または”Ｃｏｄｏｎ Ａｄａｐｔａｔｉｏｎ Ｉｎｄｅｘ”（ＣＡＩ）（Ｓｈａｒｐ ＆ Ｌｉ（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５（３）：１２８１-９５）などの方法は、遺伝子発現レベルの予測を用途とするのに対し、情報理論による「有効コドン数」（Ｎｃ）及びシャノンエントロピーなどの方法は、コドン使用率の均一性を測定することを用途とするものである。遺伝子間のコドン使用状況の変動分析を目的に、遍く使用されているのが、対応分析及び主成分分析などの多変量統計的方法である（Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００８）ＤＮＡ Ｒｅｓ．１５（６）：３５７-６５；Ｓａｎｄｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｓｉｌｉｃｏ Ｂｉｏｌ．２００８；８（２）：１８７－９２）。
本明細書中に開示されるＰＢＧＤポリペプチドをコードする核酸配列、例えば、野生型核酸配列、変異体核酸配列、キメラ核酸配列（例えばｍＲＮＡであり得る）等は、参照核酸配列中の少なくとも１つのコドンを、同義コドンセット中の置換コドンのコドン頻度よりもコドン頻度が高いかもしくは低い、代替コドンで置換することを含む方法を使用してコドン最適化することができ、結果として得られた配列最適化された核酸は、参照核酸配列に対して少なくとも１つの最適化された特性を有する。
いくつかの実施形態において、ＰＢＧＤをコードする参照核酸配列中のコドンの少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％は、各々が同義コドンセット中の置換コドンのコドン頻度よりもコドン頻度が高い、代替コドンでそれぞれ置換される。
いくつかの実施形態において、ＰＢＧＤをコードする参照核酸配列中の少なくとも１つのコドンは、同義コドンセット中の置換コドンのコドン頻度よりもコドン頻度が高い、代替コドンで置換され、参照核酸配列中の少なくとも１つのコドンは、同義コドンセット中の置換コドンのコドン頻度よりもコドン頻度が低い、代替コドンで置換される。
いくつかの実施形態において、ＰＢＧＤをコードする参照核酸配列中のコドンの少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％は、各々が同義コドンセット中の置換コドンのコドン頻度よりもコドン頻度が高い、代替コドンでそれぞれ置換される。
いくつかの実施形態において、コドン頻度が高い少なくとも１つの代替コドンは、同義コドンセット中のコドン頻度が最も高い。他の実施形態において、コドン頻度が高い全ての代替コドンは、同義コドンセット中でコドン頻度が最も高い。
いくつかの実施形態において、コドン頻度が低い少なくとも１つの代替コドンは、同義コドンセット中のコドン頻度が最も低い。いくつかの実施形態において、コドン頻度が高い全ての代替コドンは、同義コドンセット中でコドン頻度が最も高い。
いくつかの特定の実施形態において、少なくとも１つの代替コドンは、同義コドンセット中で頻度が２番目に高いか、３番目に高いか、４番目に高いか、５番目に高いか、または６番目に高い。いくつかの特定の実施形態において、少なくとも１つの代替コドンは、同義コドンセット中で頻度が２番目に低いか、３番目に低いか、４番目に低いか、５番目に低いか、または６番目に低い。
ＰＢＧＤポリペプチドをコードする参照核酸配列に対し、コドン頻度ベースの最適化は、上述されているように全体的に適用される場合もあれば、あるいは局所的に適用される場合もある。いくつかの実施形態では、局所的に適用された参照核酸配列の領域は、コドン頻度に基づいて修飾され得、ある特定のサブ配列中のコドンの全てのまたはある特定の百分率が、その各々の同義コドンセット中の高頻度もしくは低頻度のコドンで置換され得る。ゆえに、いくつかの実施形態において、参照核酸配列のサブ配列中のコドンの少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％が、各々が同義コドンセット中の置換コドンのコドン頻度よりもコドン頻度が高い、代替コドンでそれぞれ置換される。
いくつかの実施形態において、ＰＢＧＤポリペプチドをコードする参照核酸配列のサブ配列中の少なくとも１つのコドンは、同義コドンセット中の置換コドンのコドン頻度よりもコドン頻度が高い、代替コドンで置換され、参照核酸配列のサブ配列中の少なくとも１つのコドンは、同義コドンセット中の置換コドンのコドン頻度よりもコドン頻度が低い、代替コドンで置換される。
いくつかの実施形態において、ＰＢＧＤポリペプチドをコードする参照核酸配列のサブ配列中のコドンの少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％は、各々が同義コドンセット中の置換コドンのコドン頻度よりもコドン頻度が高い、代替コドンでそれぞれ置換される。
いくつかの実施形態において、ＰＢＧＤポリペプチドをコードする参照核酸配列のサブ配列中で置換された少なくとも１つの代替コドンのうちコドン頻度が高いものは、同義コドンセット中のコドン頻度が最も高い。他の実施形態において、参照核酸配列のサブ配列中で置換された全ての代替コドンのうちコドン頻度が低いものは、同義コドンセット中のコドン頻度が最も低い。
いくつかの実施形態において、ＰＢＧＤポリペプチドをコードする参照核酸配列のサブ配列中で置換された少なくとも１つの代替コドンのうちコドン頻度が低いものは、同義コドンセット中のコドン頻度が最も低い。いくつかの実施形態において、参照核酸配列のサブ配列中で置換された全ての代替コドンのうちコドン頻度が高いものは、同義コドンセット中のコドン頻度が最も高い。
特定の実施形態において、ＰＢＧＤポリペプチドをコードする配列最適化された核酸は、特定の位置にて、例えば、配列最適化された核酸の５’末端もしくは３’末端、またはそれらの領域から所定の距離内（例えば、配列最適化された核酸の５’末端もしくは３’末端から少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくは１００コドン）にて全体的なコドン頻度が、参照核酸配列の対応するサブ配列中の全体的なコドン頻度よりも高いかまたは低いサブ配列を含むことができる。
いくつかの実施形態において、ＰＢＧＤポリペプチドをコードする配列最適化された核酸は、参照核酸配列の対応するサブ配列中の全体的なコドン頻度よりも全体的なコドン頻度が高いかまたは低い、１を超えるサブ配列を含むことができる。全体的なコドン頻度が高いまたは低いサブ配列を、全体的なコドン頻度の高低、サブ配列の長さ、サブ配列間の距離、サブ配列の位置などに応じて、無数のパターンで編成することができることは、当業者に理解されるであろう。
米国特許第ＵＳ５０８２７６７号、同第ＵＳ８１２６６５３号、同第ＵＳ７５６１９７３号、同第ＵＳ８４０１７９８号；米国特許出願公開第ＵＳ２００８００４６１９２号、同第ＵＳ２００８００７６１６１号；国際出願公開第ＷＯ２００００１８７７８号；Ｗｅｌｃｈ ｅｔ ａｌ．（２００９）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ４（９）：ｅ７００２；Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ８３：３７-４６；Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＢＭＣ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ ６：１３４を参照のこと。これらの文献はいずれも、その全体が本明細書中に参照により組み込まれる。
ｄ．モチーフ置換の不安定化
配列最適化に影響し得るモチーフで、様々な非排他的カテゴリに分類されるものには、例えば、以下のように様々な種類がある。
（ｉ）一次配列ベースのモチーフ：ヌクレオチドの単純なアレンジによって定義されるモチーフ。
（ｉｉ）構造モチーフ：ある特定の二次構造を形成する傾向のあるヌクレオチドのアレンジによりコードされるモチーフ。
（ｉｉｉ）局所的モチーフ：１つの連続サブ配列内にコードされたモチーフ。
（ｉｖ）分散モチーフ：２つ以上の不連続サブ配列内にコードされたモチーフ。
（ｖ）有益モチーフ：ヌクレオチド構造または機能を改良するモチーフ。
（ｖｉ）不利益モチーフ：ヌクレオチド構造または機能に対し不利益な影響を及ぼすモチーフ。
不利益モチーフのカテゴリに見合うモチーフが数多く存在している。いくつかの例としては、例えば、制限酵素モチーフ（例えば、Ｘｂａ１（ＴＣＴＡＧＡ）、ＥｃｏＲＩ（ＧＡＡＴＴＣ）、ＥｃｏＲＩＩ（ＣＣＷＧＧ；式中：Ｗは、ＩＵＰＡＣのあいまいコードごとにＡまたはＴを意味する）、またはＨｉｎｄＩＩＩ（ＡＡＧＣＴＴ）の制限部位モチーフなどの、比較的短く、厳密配列となる傾向のあるもの）、酵素部位（例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（ＧｎｎｎｎＷｎＣＲｎＣＴＣｎＣｎｎＷｎＤ；式中：ｎは任意のヌクレオチドを意味し、ＲはＡまたはＧを意味し、ＷはＡまたはＴを意味し、ＤはＡまたはＧまたはＴを意味するがＣを意味しない）におけるもの等、長くなる傾向があり、厳密配列ではないコンセンサスに基づくもの）、構造モチーフ（例えばＧＧＧＧリピート（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５１（６３２４）：３３１－２）、または、他のモチーフ（例えばＣＵＧ－トリプレット反復（Ｑｕｅｒｉｄｏ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１２４：１７０３－１７１４））が挙げられる。
したがって、参照核酸配列内の少なくとも１つの不安定化モチーフを置換することと、そのような不利益モチーフを除去するか、あるいはその不利益モチーフを有益モチーフに置き換えることと、を含む方法を使用して、本明細書に開示されるＰＢＧＤポリペプチドをコードする核酸配列を配列最適化することができる。
いくつかの実施形態において最適化プロセスは、参照核酸配列中の有益モチーフ及び／または不利益モチーフを同定することを含み、そのようなモチーフは、例えば最適化プロセスに先立ってまたは最中に参照核酸配列における安定性の喪失を引き起こす可能性のある、特定のサブ配列である。例えば、最適化の最中に特定の塩基が置換されると、制限酵素に認識されるサブ配列（モチーフ）が生成され得る。したがって、配列最適化された配列を、不利益であることが公知であるモチーフのライブラリーと比較して、最適化プロセスの最中に不利益モチーフが出現するのをモニターすることができる。この場合、不利益モチーフの同定を、ポストホックフィルターとして用いることによって、すなわち参照核酸配列内に導入することの可能なある特定の修飾を、実際に実施すべきか否かを判定することができ得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される配列最適化方法を適用する前に、不利益モチーフの同定を使用することができる。例えばウリジン還元前の前処理ステップとして、ＰＢＧＤポリペプチドをコードする参照核酸配列中のモチーフを同定し、それらのモチーフを代替核酸配列で置換することが用いられ得る。
他の実施形態において、本明細書中に開示される２つ以上の配列最適化方法を含む多パラメトリック核酸最適化方法に統合された、更なる配列最適化技術として、不利益モチーフを同定して除去することが用いられる。このように使用すると、可能な限り少ない数の核酸塩基を置換することによって、最適化プロセス中に同定された不利益モチーフが除去され、当初のデザイン原理（例えば、低Ｕ、高頻度など）が、可能な限り密接に保持されるようになる。
例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２０１４０２２８５５８号、同第ＵＳ２００５００３２７３０号、または同第ＵＳ２０１４０２２８５５８号を参照のこと。これらの文献は、その全体が本明細書中に参照により組み込まれる。
ｅ．制限付きコドンセット最適化
いくつかの特定の実施形態において、ＰＢＧＤポリペプチドをコードする参照核酸配列の配列最適化を、制限付きコドンセットを用いることができる。例えば、２０天然アミノ酸、２０天然アミノ酸のサブセット、またはアミノ酸の拡張セット（例えば非天然アミノ酸を含む）をコードするために天然コドンの数未満のコドンが使用されるコドンセットを挙げることができる。
遺伝コードは、全ての生物間できわめて類似しており、タンパク質の翻訳に関与する標準の２０アミノ酸、開始コドン及び終止コドンをコードする６４エントリを含めた、単純な表で表すことができる。遺伝コードは縮重している。すなわち一般的に複数のコドンによって各アミノ酸が特定される。例えば、アミノ酸ロイシンは、ＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＵ、ＣＵＣ、ＣＵＡ、またはＣＵＧコドンで指定され、一方、アミノ酸セリンは、ＵＣＡ、ＵＣＧ、ＵＣＣ、ＵＣＵ、ＡＧＵ、またはＡＧＣコドン（第１、第２、または第３の位置が異なるもの）で指定される。天然の遺伝コードは、天然アミノ酸をコードする６２コドンを含む。ゆえに、本明細書中に開示される方法のいくつかの実施形態において、２０アミノ酸をコードする６２未満のコドンを含む最適化コドンセット（遺伝コード）は、６１、６０、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、または２０コドンを含み得る。
いくつかの実施形態において、制限付きコドンセットは、２０未満のコドンを含む。例えば、タンパク質に２０種類未満のアミノ酸が含有される場合、そのようなタンパク質は、２０コドン未満のコドンセットによりコードすることが可能である。したがって、いくつかの実施形態において、最適化されたコドンセットには、参照核酸配列によりコードされたタンパク質中に存在するアミノ酸の種類の数のコドンが含まれる。いくつかの実施形態において、最適化されたコドンセットには、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または更には１コドンが含まれる。
いくつかの実施形態において、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、及びＶａｌからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸（すなわち、２つ以上のコドンで天然にコードされるアミノ酸）は、同義コドンの天然発生数よりも少ないコドンでコードされる。例えば、いくつかの実施形態において、Ａｌａは、配列最適化された核酸中で３コドン、２コドンまたは１コドンでコードでき、Ｃｙｓは、配列最適化された核酸中で１コドンでコードでき、Ａｓｐは、配列最適化された核酸中で１コドンでコードでき、Ｇｌｕは、配列最適化された核酸中で１コドンでコードでき、Ｐｈｅは、配列最適化された核酸中で１コドンでコードでき、Ｇｌｙは、配列最適化された核酸中で３コドン、２コドンまたは１コドンでコードでき、Ｈｉｓは、配列最適化された核酸中で１コドンでコードでき、Ｉｌｅは、配列最適化された核酸中で２コドンまたは１コドンでコードでき、Ｌｙｓは、配列最適化された核酸中で１コドンでコードでき、Ｌｅｕは、配列最適化された核酸中で５コドン、４コドン、３コドン、２コドンまたは１コドンでコードでき、Ａｓｎは、配列最適化された核酸中で１コドンでコードでき、Ｐｒｏは、配列最適化された核酸中で３コドン、２コドンまたは１コドンでコードでき、Ｇｌｎは、配列最適化された核酸中で１コドンでコードでき、Ａｒｇは、配列最適化された核酸中で５コドン、４コドン、３コドン、２コドンまたは１コドンでコードでき、Ｓｅｒは、配列最適化された核酸中で５コドン、４コドン、３コドン、２コドンまたは１コドンでコードでき、Ｔｈｒは、配列最適化された核酸中で３コドン、２コドンまたは１コドンでコードでき、Ｖａｌは、配列最適化された核酸中で３コドン、２コドンまたは１コドンでコードでき、ならびに、Ｔｙｒは、配列最適化された核酸中で１コドンでコードできる。
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ及びＶａｌからなる群から選択される。すなわち、２つ以上のコドンによって天然にコードされるアミノ酸は、制限付きコドンセット中の単一のコドンによりコードされる。
いくつかの特定の実施形態において、配列最適化された核酸はＤＮＡであり、制限付きコドンセットは２０個のコドンからなり、各コドンは２０個のアミノ酸のうちの１個をコードする。いくつかの実施形態において、配列最適化された核酸はＤＮＡであり、制限付きコドンセットは、ＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＡ及びＧＣＧからなる群から選択される少なくとも１つのコドン、ＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ及びＡＧＧからなる群から選択される少なくとも１つのコドン、ＡＡＴまたはＡＣＣから選択される少なくとも１つのコドン、ＧＡＴまたはＧＡＣから選択される少なくとも１つのコドン、ＴＧＴまたはＴＧＣから選択される少なくとも１つのコドン、ＣＡＡまたはＣＡＧから選択される少なくとも１つのコドン、ＧＡＡまたはＧＡＧから選択される少なくとも１つのコドン、ＧＧＴ、ＧＧＣ、ＧＧＡ及びＧＧＧからなる群から選択される少なくとも１つのコドン、ＣＡＴまたはＣＡＣから選択される少なくとも１つのコドン、ＡＴＴ、ＡＴＣ、及びＡＴＡからなる群から選択される少なくとも１つのコドン、ＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ及びＣＴＧからなる群から選択される少なくとも１つのコドン、ＡＡＡまたはＡＡＧ選択される少なくとも１つのコドン、ＡＴＧコドン、ＴＴＴまたはＴＴＣから選択される少なくとも１つのコドン、ＣＣＴ、ＣＣＣ、ＣＣＡ及びＣＣＧからなる群から選択される少なくとも１つのコドン、ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴ、及びＡＧＣからなる群から選択される少なくとも１つのコドン、ＡＣＴ、ＡＣＣ、ＡＣＡ、及びＡＣＧからなる群から選択されるコドン、ＴＧＧコドン、ＴＡＴまたはＴＡＣから選択される少なくとも１つのコドン、ならびに、少なくともＧＴＴ、ＧＴＣ、ＧＴＡ、及びＧＴＧからなる群から選択される少なくとも１つのコドンを含む。
他の実施形態において、配列最適化された核酸はＲＮＡ（ｍＲＮＡなど）であり、制限付きコドンセットは２０個のコドンからなり、各コドンは２０個のアミノ酸のうちの１個をコードする。いくつかの実施形態において、配列最適化された核酸はＲＮＡであり、制限付きコドンセットは、ＧＣＵ、ＧＣＣ、ＧＣＡ及びＧＣＧからなる群から選択される少なくとも１つのコドン、少なくともＣＧＵ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ及びＡＧＧからなる群から選択される少なくとも１つのコドン、ＡＡＵまたはＡＣＣから選択される少なくとも１つのコドン、ＧＡＵまたはＧＡＣから選択される少なくとも１つのコドン、ＵＧＵまたはＵＧＣから選択される少なくとも１つのコドン、ＣＡＡまたはＣＡＧから選択される少なくとも１つのコドン、ＧＡＡまたはＧＡＧから選択される少なくとも１つのコドン、ＧＧＵ、ＧＧＣ、ＧＧＡ及びＧＧＧからなる群から選択される少なくとも１つのコドン、ＣＡＵまたはＣＡＣから選択される少なくとも１つのコドン、ＡＵＵ、ＡＵＣ及びＡＵＡからなる群から選択される少なくとも１つのコドン、ＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＵ、ＣＵＣ、ＣＵＡ及びＣＵＧからなる群から選択される少なくとも１つのコドン、ＡＡＡまたはＡＡＧから選択されるコドン、ＡＵＧコドン、少なくともＵＵＵまたはＵＵＣから選択される少なくとも１つのコドン、ＣＣＵ、ＣＣＣ、ＣＣＡ、及びＣＣＧからなる群から選択される少なくとも１つのコドン、ＵＣＵ、ＵＣＣ、ＵＣＡ、ＵＣＧ、ＡＧＵ及びＡＧＣからなる群から選択される少なくとも１つのコドン、ＡＣＵ、ＡＣＣ、ＡＣＡ及びＡＣＧからなる群から選択されるコドン、ＵＧＧコドン、少なくともＵＡＵまたはＵＡＣから選択されるコドン、ならびに、少なくともＧＵＵ、ＧＵＣ、ＧＵＡ、及びＧＵＧからなる群から選択されるコドンを含む。
いくつかの特定の実施形態では、ある特定の組織または細胞に投与された後の制限付きコドンセットが、配列最適化された核酸（例えば合成ｍＲＮＡ）のｉｎ ｖｉｖｏ発現用に、最適化されている。
いくつかの実施形態において、最適化されたコドンセット（例えば、２０アミノ酸をコードする２０コドンセット）は、少なくとも以下の特性のうちの少なくとも１つに準拠する。
（ｉ）最適化されたコドンセットは、元のコドンセットまたは天然コドンセットよりも平均Ｕ含有量が高い、または
（ｉｉ）最適化されたコドンセットは、元のコドンセットまたは天然コドンセットよりも平均Ｕ含有量が低い、または
（ｉｉｉ）最適化されたコドンセットは、頻度が最も高いコドンから構成される、または
（ｉｖ）最適化されたコドンセットは、頻度が最も低いコドンから構成される、または
（ｖ）それらの組み合わせ。
いくつかの特定の実施形態において、最適化されたコドンセット中の少なくとも１つのコドンは、同義コドンセットで頻度が２番目に高いか、３番目に高いか、４番目に高いか、５番目に高いか、または６番目に高い。いくつかの特定の実施形態において、最適化されたコドン中、少なくとも１つのコドンは、同義コドンセットで頻度が２番目に低いか、３番目に低いか、４番目に低いか、５番目に低いか、または６番目に低い。
本明細書において「天然コドンセット」という用語は、参照核酸配列をコードするために自然において供給源生物によって使用されるコドンセットを指す。本明細書において「元のコドンセット」という用語は、配列最適化の開始前に参照核酸配列をコードする目的に使用されるコドンセット、または、反復的にまたは再帰的に配列最適化が適用されている場合、新しい最適化反復の開始時に参照核酸配列の最適化バリアントをコードする目的に使用されるコドンセットを指す。
いくつかの実施形態において、コドンセット中のコドンの５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％は、頻度が最も高いコドンである。他の実施形態において、コドンセット中のコドンの５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％は、頻度が最も低いコドンである。
いくつかの実施形態において、コドンセット中のコドンの５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％は、ウリジン含有量が最も高いコドンである。いくつかの実施形態において、コドンセット中のコドンの５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％は、ウリジン含有量が最も低いコドンである。
いくつかの実施形態において、コドンセットの平均Ｇ／Ｃ含有量（絶対または相対）は、元のコドンセットの平均Ｇ／Ｃ含有量（絶対または相対）よりも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは１００％高い。いくつかの実施形態において、コドンセットの平均Ｇ／Ｃ含有量（絶対または相対）は、元のコドンセットの平均Ｇ／Ｃ含有量（絶対または相対）よりも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは１００％低い。
いくつかの実施形態において、コドンセットのウラシル含有量（絶対または相対）は、元のコドンセットの平均ウラシル含有量（絶対または相対）よりも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは１００％高い。いくつかの実施形態において、コドンセットのウラシル含有量（絶対または相対）は、元のコドンセットの平均ウラシル含有量（絶対または相対）よりも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは１００％低い。
米国特許出願公開第２０１１／００８２０５５号、及び国際公開第ＷＯ２００００１８７７８号もまた参照のこと。これらの文献は両方とも、その全体が本明細書中に参照により組み込まれる。
８．配列最適化された核酸の特性評価
本発明のいくつかの実施形態において、ＰＢＧＤポリペプチドをコードする本明細書中に開示される配列最適化核酸を含むポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）を試験して、配列最適化されていない核酸に関して少なくとも１つの核酸配列特性（例えば、ヌクレアーゼに曝露された場合の安定性）または発現特性が改善されたかどうかを決定することができる。
本明細書において「発現特性」とは、ｉｎ ｖｉｖｏでの核酸配列の特性（例えば、それを必要とする対象に投与された後の、合成ｍＲＮＡの翻訳効率）、またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの核酸配列の特性（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデル系において試験された合成ｍＲＮＡの翻訳効率）を指す。発現特性としては、限定されるものではないが、投与後のＰＢＧＤポリペプチドをコードするｍＲＮＡによって産生されるタンパク質の量、及び産生された可溶性またはその他の機能性タンパク質の量が挙げられる。いくつかの実施形態において、本明細書中に開示される配列最適化された核酸は、本明細書中に開示されるＰＢＧＤポリペプチドをコードする配列最適化された核酸配列（例えばｍＲＮＡなどのＲＮＡ）によってコードされるタンパク質を発現する細胞の生存能力に従って評価できる。
特定の実施形態において、本明細書中に開示される複数の配列最適化核酸（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）（最適化されていない参照核酸配列という観点でコドン置換を含むもの）を、機能的に特徴付けることによって、関心対象の特性（例えばｉｎ ｖｉｔｒｏモデル系における発現特性、または標的組織もしくは細胞内でのｉｎ ｖｉｖｏ特性）を測定することができる。
ａ．核酸配列の固有特性の最適化
本発明のいくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドの所望の特性は、核酸配列の固有特性である。例えば、ヌクレオチド配列（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）が、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでの安定性のために配列最適化され得る。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列を、標的組織または細胞内での発現用に配列最適化することができる。いくつかの実施形態では、核酸配列を、それがエンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼで分解されるのを防止することによってその血漿半減期を延ばすように配列最適化することができる。
他の実施形態では、核酸配列を、溶液中の加水分解に対する耐性を増強させて、例えば、配列最適化された核酸、またはその配列最適化核酸を含む医薬組成物が、最小限の分解で水性条件下で保存できる時間を延長させるように配列最適化することができる。
他の実施形態において、配列最適化核酸を、乾燥貯蔵条件における加水分解に対する耐性を増強させて、例えば、最小限の分解で凍結乾燥後に配列最適化核酸を保存できる時間を延長させるように最適化することができる。
ｂ．タンパク質の発現用に最適化された核酸配列
本発明のいくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドの所望の特性は、本明細書中に開示される配列最適化配列によりコードされるＰＢＧＤポリペプチドの発現レベルである。タンパク質の発現レベルは、１つ以上の発現系を用いて測定できる。いくつかの実施形態では、細胞培養系、例えばＣＨＯ細胞またはＨＥＫ２９３細胞内での発現を測定できる。いくつかの実施形態では、例えばウサギ網状赤血球溶解物のような生存細胞の抽出物から調製されたｉｎ ｖｉｖｏ発現系を使用するか、あるいは精製された個々の成分の集合によって調製されたｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系を使用して、発現を測定できる。他の実施形態において、タンパク質の発現は、ｉｎ ｖｉｖｏ系（例えば、マウス、ラビット、サル等）において測定される。
いくつかの実施形態では、溶液形態のタンパク質の発現が所望され得る。したがって、いくつかの実施形態において参照配列を配列最適化して、可溶性形態で発現したタンパク質の最適化レベルを有する、配列最適化核酸配列を産生することができる。タンパク質発現のレベル、ならびに他の特性、例えば、可溶性、凝集レベル、及び切断生成物の存在（すなわち、タンパク質分解、加水分解、または翻訳の欠損に起因する断片）などは、例えば、電気泳動（天然またはＳＤＳ－ＰＡＧＥなど）またはクロマトグラフィー法（例えばＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィーなど）を用いて、当該技術分野において公知の方法に従って測定できる。
ｃ．標的組織または標的細胞の生存率の最適化
いくつかの実施形態において、核酸配列によってコードされる異種治療タンパク質の発現は、標的組織または細胞において有害な影響を及ぼし、タンパク質収量を低減させ、または（封入体内にタンパク質断片が存在する、または発現タンパク質が沈殿するなど）発現産物の質を低下させたり、毒性を生ずる場合がある。
したがって、本発明のいくつかの実施形態において、本明細書中に開示される核酸配列（例えば、ＰＢＧＤポリペプチドをコードする核酸配列）に対し配列最適化を用いることで、配列最適化された核酸によりコードされるタンパク質を発現する標的細胞の生存率を上昇させることができる。
異種タンパク質の発現はまた、自己移植または異種移植のために核酸配列を形質移入された細胞に対して有害となり得る。したがって、本開示のいくつかの実施形態では、本明細書中に開示される核酸配列の配列最適化を用いることによって、配列最適化された核酸によりコードされるタンパク質を発現する標的細胞の生存率を上昇させることができる。細胞または組織の生存率、毒性及び他の生理学的反応における変化は、当該技術分野において公知の方法に従って、測定できる。
ｄ．免疫応答及び／または炎症反応の低減
いくつかの事例では、ＰＢＧＤをコードする配列最適化された核酸ポリペプチドもしくはそれらの機能的断片を投与することによって、（ｉ）治療剤（例えば、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするｍＲＮＡ）（ｉｉ）そのような治療剤の発現産物（例えば、ｍＲＮＡによってコードされるＰＢＧＤポリペプチド）、または（ｉｖ）それらの組み合わせによって引き起こされる可能性のある免疫応答が誘発される場合がある。したがって、本開示のいくつかの実施形態において、本明細書中に開示される核酸配列（例えばｍＲＮＡ）に対して配列最適化を用い、ＰＢＧＤポリペプチドをコードする核酸の投与によって、あるいはそのような核酸によりコードされるＰＢＧＤの発現産物によって誘発される免疫応答または炎症反応を低減させることができる。
いくつかの態様において、炎症反応は、当該技術分野において公知の方法（例えばＥＬＩＳＡ）を用い、１つ以上の炎症性サイトカインのレベルの上昇を検出することによって測定できる。「炎症性サイトカイン」という用語は、炎症応答において高まったサイトカインを指す。炎症性サイトカインとしての例としては、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、ＣＸＣＬ１（ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド１（別称ＧＲＯα）、インターフェロン－γ（ＩＦＮγ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターフェロンγ誘発性タンパク質１０（ＩＰ－１０）、または顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）が挙げられる。また、「炎症性サイトカイン」という用語は、当該技術分野において公知の、炎症反応に関連する他のサイトカイン、例えば、インターロイキン－１（ＩＬ－１）、インターロイキン－８（ＩＬ－８）、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン－１３（Ｉｌ－１３）、インターフェロンα（ＩＦＮ－α）等も含む。
９．ＰＢＧＤポリペプチドをコードする修飾ヌクレオチド配列
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）は、化学修飾された核酸塩基、例えば、５－メトキシウラシルを含む。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするＯＲＦを含むウラシル修飾配列であり、この修飾配列においてｍＲＮＡは化学修飾された核酸塩基、例えば５－メトキシウラシルを含む。
本発明のある特定の態様において、ポリヌクレオチド中のように、５－メトキシウラシル塩基がリボース糖に結合している場合、結果として得られた修飾ヌクレオシドまたは修飾ヌクレオチドは５－メトキシウリジンと呼ばれる。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド中のウラシルは少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％もしくは約１００％が５－メトキシウラシルである。一実施形態において、ポリヌクレオチド中のウラシルは少なくとも９５％が５－メトキシウラシルである。別の実施形態において、ポリヌクレオチド中のウラシルは１００％が５－メトキシウラシルである。
ポリヌクレオチド中のウラシルの少なくとも９５％が５－メトキシウラシルである実施形態において、全体的なウラシル含有量は、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）によって、免疫応答がほとんどまたは全く誘発されることがなく、適切なタンパク質の発現レベルが実現されるように調節できる。いくつかの実施形態において、ＯＲＦのウラシル含有量は、対応する野生型ＯＲＦ中の理論的最小ウラシル含有量の約１０５％～約１４５％、約１０５％～約１４０％、約１１０％～約１４０％、約１１０％～約１４５％、約１１５％～約１３５％、約１０５％～約１３５％、約１１０％～約１３５％、約１１５％～約１４５％、または約１１５％～約１４０％（％ＵＴＭ）である。他の実施形態において、ＯＲＦのウラシル含有量は約１１７％～約１３４％、または１１８％～１３２％の％ＵＴＭである。いくつかの実施形態において、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするＯＲＦのウラシル含有量は、約１１５％、約１２０％、約１２５％、約１３０％、約１３５％、約１４０％、約１４５％、または約１５０％の％ＵＴＭである。これに関連して、「ウラシル」という用語は、５－メトキシウラシル及び／または天然起源のウラシルを指し得る。
いくつかの実施形態において、本発明のＰＢＧＤポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦ中のウラシル含有量は、ＯＲＦ中の総核酸塩基含有量の約５０％、約４０％、約３０％、または約２０％未満である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦ中のウラシル含有量は、ＯＲＦ中の総核酸塩基含有量の約１５％～約２５％である。他の実施形態において、ＯＲＦ中のウラシル含有量は、ＯＲＦ中の総核酸塩基含有量の約２０％～約３０％である。一実施形態において、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦ中のウラシル含有量は、オープンリーディングフレーム中の総核酸塩基含有量の約２０％未満である。これに関連して、「ウラシル」という用語は、５－メトキシウラシル及び／または天然起源のウラシルを指し得る。
更なる実施形態において、５－メトキシウラシル及び調節されたウラシル含有量を有する、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦは、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、またはグアニン／シトシン（Ｇ／Ｃ）含有量（絶対または相対）が増加している。いくつかの実施形態において、ＯＲＦのＣ、Ｇ、またはＧ／Ｃ含有量（絶対または相対）の全体的な増加は、野生型ＯＲＦのＧ／Ｃ含有量（絶対または相対）に対して少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％もしくは少なくとも約１００％である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦ中のＧ含有量、Ｃ含有量またはＧ／Ｃ含有量は、ＰＢＧＤポリペプチドをコードする対応する野生型ヌクレオチド配列の理論的最大Ｇ含有量、Ｃ含有量またはＧ／Ｃ含有量の約１００％未満、約９０％未満、約８５％未満、または約８０％未満（％ＧＴＭＸｍ％ＣＴＭＸ、または％Ｇ／ＣＴＭＸ）である。他の実施形態において、ＯＲＦ中のＧ含有量、Ｃ含有量またはＧ／Ｃ含有量は、約７０％～約８０％、約７１％～約７９％、約７１％～約７８％もしくは約７１％～約７７％の％ＧＴＭＸ、％ＣＴＭＸ、または％Ｇ／ＣＴＭＸである。いくつかの実施形態では、Ｇ含有量、Ｃ含有量またはＧ／Ｃ含有量の低い同義コドンをＧ、Ｃ、またはＧ／Ｃ含有量の高い同義コドンで置換することによって、本明細書に記載のＧ含有量及び／またはＣ含有量（絶対または相対）を増加させることができる。他の実施形態では、Ｕで終わるコドンを、ＧもしくはＣで終わる同義コドンで置換することによって、Ｇ含有量及び／またはＣ含有量（絶対または相対）を増加させることができる。
更なる実施形態では、本発明のＰＢＧＤポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦは５－メトキシウラシルを含み、対応する野生型ヌクレオチドより少ないウラシルペア（ＵＵ）及び／またはウラシルトリプレット（ＵＵＵ）及び／またはウラシルクアドラプレット（ＵＵＵＵ）を含有する調節されたウラシル含有量を有する。いくつかの実施形態において、本発明のＰＢＧＤポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦには、ウラシルペア及び／またはウラシルトリプレット及び／またはウラシルクアドラプレットが全く含まれない。いくつかの実施形態において、ウラシルペア及び／またはウラシルトリプレット及び／またはウラシルクアドラプレットは、ある特定の閾値未満、例えば、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦ中における出現数が、１以下、２以下、３以下、４以下、５以下、６以下、７以下、８以下、９以下、１０以下、１１以下、１２以下、１３以下、１４以下、１５以下、１６以下、１７以下、１８以下、１９以下、または２０以下に低減される。特定の実施形態において、本発明のＰＢＧＤポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦには、２０未満、１９未満、１８未満、１７未満、１６未満、１５未満、１４未満、１３未満、１２未満、１１未満、１０未満、９未満、８未満、７未満、６未満、５未満、４未満、３未満、２未満もしくは１未満の非フェニルアラニンウラシルペア及び／またはトリプレットが含まれる。別の実施形態において、本発明のＰＢＧＤポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦには、非フェニルアラニンウラシルペア及び／またはトリプレットが全く含まれない。
更なる実施形態では、本発明のＰＢＧＤポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦは５－メトキシウラシルを含み、ＰＢＧＤポリペプチドをコードする対応する野生型ヌクレオチド配列よりも少ないウラシルに富むクラスタを含有する、調節されたウラシル含有量を有する。いくつかの実施形態において、本発明のＰＢＧＤポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦは、対応するＰＢＧＤポリペプチドをコードする野生型ヌクレオチド配列中の対応するウラシルに富むクラスタよりも長さが短いウラシルに富むクラスタを含む。
更なる実施形態では、低頻度代替コドンが用いられる。ＰＢＧＤポリペプチドをコードする５－メトキシウラシル含有ｍＲＮＡのＯＲＦ中のコドンの少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％が、同義コドンセット中の置換コドンのコドン頻度よりもコドン頻度が低い各代替コドンでそれぞれ置換される。ＯＲＦはまた、上述されているように、ウラシル含有量が調節されている。いくつかの実施形態において、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦ中の少なくとも１つのコドンは、同義コドンセット中の置換コドンのコドン頻度よりもコドン頻度が低い、代替コドンで置換される。
いくつかの実施形態において、ウラシル含有量を調節したことによって、ＰＢＧＤポリペプチドをコードする５－メトキシウラシル含有ｍＲＮＡのＯＲＦは、哺乳類の細胞に投与された場合、ＰＢＧＤの発現レベルが、対応する野生型ｍＲＮＡ由来のＰＢＧＤの発現レベルよりも高くなる。他の実施形態において、哺乳類の細胞に投与された場合に、ＰＢＧＤの発現レベルは、５－メトキシウラシル含有量が少なくとも９５％でありウラシル含有量が理論的最小値の約１６０％、約１７０％、約１８０％、約１９０％、または約２００％にも及ぶ、対応するｍＲＮＡに対して相対的に増加する。更に他の実施形態において、哺乳類の細胞に投与された場合、ＰＢＧＤの発現レベルは、ウラシルの少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または約１００％が１－メチルシュードウラシルまたはシュードウラシルである、対応するｍＲＮＡに対して相対的に増加する。いくつかの実施形態において、哺乳類の細胞は、マウス細胞、ラット細胞、またはウサギ細胞である。他の実施形態において、哺乳類の細胞は、サル細胞またはヒト細胞である。いくつかの実施形態において、ヒト細胞は、ヒーラ細胞、ＢＪ線維芽細胞、または末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）である。いくつかの実施形態では、ｉｎ ｖｉｖｏでｍＲＮＡが哺乳類細胞に投与された場合に、ＰＢＧＤが発現する。いくつかの実施形態では、マウス、ラビット、ラット、サルまたはヒトにｍＲＮＡを投与する。一実施形態において、マウスはヌルマウスである。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、または約０．１５ｍｇ／ｋｇの量でマウスに投与する。いくつかの実施形態において、静脈内または筋肉内にｍＲＮＡを投与する。他の実施形態では、ｍＲＮＡがｉｎ ｖｉｔｒｏで哺乳類の細胞に投与された場合に、ＰＢＧＤポリペプチドが発現する。いくつかの実施形態において、発現は、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約１５００倍、または少なくとも約３０００倍増加する。他の実施形態において、発現は、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％増加する。
いくつかの実施形態では、ウラシル含有量を調節したことによって、ＰＢＧＤポリペプチドをコードする５－メトキシウラシル含有ｍＲＮＡのＯＲＦが、安定性の増強を呈する。いくつかの実施形態において、このｍＲＮＡは、同じ条件下にて対応する野生型ｍＲＮＡの安定性と比べて、細胞内の安定性増強を呈する。いくつかの実施形態において、このｍＲＮＡが呈する細胞内安定性の増強としては、ヌクレアーゼに対する耐性、熱安定性、及び／または二次構造の安定化の向上が挙げられる。いくつかの実施形態において、このｍＲＮＡが呈する細胞内安定性の増強は、ｍＲＮＡの半減期（例えば、血漿、血清、細胞もしくは組織試料中）を算出し、及び／または経時的に（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏで）ｍＲＮＡによるタンパク質発現の曲線下面積（ＡＵＣ）を算出することによって定量される。同じ条件下にて、半減期及び／またはＡＵＣが対応する野生型ｍＲＮＡの半減期及び／またはＡＵＣを超える場合、ｍＲＮＡは安定性が向上しているものと同定される。
いくつかの実施形態において、本発明のｍＲＮＡは、同じ条件下にて対応する野生型ｍＲＮＡによって誘発された免疫応答と比べて検出可能に低い免疫応答（例えば、先天性もしくは後天性）を誘導する。他の実施形態において、本開示のｍＲＮＡは、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするが同じ条件下にて５－メトキシウラシルを含まないｍＲＮＡによって誘導される免疫応答と比べて、あるいはＰＢＧＤポリペプチドをコードし５－メトキシウラシルを含むが同じ条件下にてウラシル含有量が調節されていないｍＲＮＡによって誘導される免疫応答と比べて、検出可能に低い免疫応答（例えば、先天性もしくは後天性）を誘発する。先天性免疫応答は、炎症促進性サイトカインの発現増強、細胞内ＰＲＲ（ＲＩＧ－１、ＭＤＡ５など）の活性化、細胞死、及び／またはタンパク質翻訳の終結もしくは低減によって顕在化し得る。いくつかの実施形態において、先天性免疫応答の低下は、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－κ、ＩＦＮ－δ、ＩＦＮ－ε、ＩＦＮ－τ、ＩＦＮ－τＮ－τ、ＩＦＮ－ω、及びＩＦＮ－ζなどの１型インターフェロンの発現もしくは活性レベルまたはトール様受容体（例えば、ＴＬＲ７及びＴＬＲ８）のようなインターフェロン調節遺伝子の発現によって、及び／または本発明のｍＲＮＡを細胞に１回以上の投与した後の細胞死の低減によって測定できる。
いくつかの実施形態において、本開示のｍＲＮＡに応答する哺乳類細胞による１型インターフェロンの発現は、対応する野生型ｍＲＮＡ、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするが５－メトキシウラシルを含まないｍＲＮＡ、またはＰＢＧＤポリペプチドをコードし５－メトキシウラシルを含むがウラシル含有量が調節されていないｍＲＮＡに対して相対的に少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、９９．９％もしくは９９．９％超低下する。いくつかの実施形態において、インターフェロンはＩＦＮ－βである。いくつかの実施形態において、本開示のｍＲＮＡの哺乳類の細胞への投与に起因する細胞死の頻度は、対応する野生型ｍＲＮＡ、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするが５－メトキシウラシルを含まないｍＲＮＡ、またはＰＢＧＤポリペプチドをコードし５－メトキシウラシルを含むがウラシル含有量が調節されていないｍＲＮＡで観察される細胞死の頻度よりも、１０％、２５％、５０％、７５％、８５％、９０％、９５％もしくは９５％超％低い。いくつかの実施形態において、哺乳類の細胞は、ＢＪ線維芽細胞である。他の実施形態において、哺乳類の細胞は、脾細胞である。いくつかの実施形態において、哺乳類の細胞は、マウスまたはラットの細胞である。他の実施形態において、哺乳類の細胞は、ヒトの細胞である。一実施形態において、本開示のｍＲＮＡは、そのｍＲＮＡの導入先となった哺乳類の細胞の本来の免疫応答を実質的に誘発しない。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡであり、このｍＲＮＡ中のウラシルは、少なくとも約９５％が５－メトキシウラシルであり、ＯＲＦのウラシル含有量は、対応する野生型ＯＲＦ中の理論的最小ウラシル含有量の約１１５％～約１３５％であり、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするＯＲＦ中のウラシル含有量は、ＯＲＦ中の総核酸塩基含有量の約３０％未満である。いくつかの実施形態において、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするＯＲＦは、ＯＲＦのＧ／Ｃ含有量（絶対または相対）を対応する野生型ＯＲＦと比較して少なくとも約４０％増加させるように、更に修飾されている。更に他の実施形態において、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするＯＲＦに含まれる非フェニルアラニンウラシルペア及び／またはトリプレットは、２０未満である。いくつかの実施形態において、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦ中の少なくとも１つのコドンは更に、同義コドンセット中の置換コドンのコドン頻度よりもコドン頻度が低い、代替コドンで置換される。いくつかの実施形態において、ＯＲＦを含むｍＲＮＡによってコードされるＰＢＧＤポリペプチドの発現は、ｍＲＮＡ中のウラシルの少なくとも約９５％が５－メトキシウラシルであり、ＯＲＦのウラシル含有量が対応する野生型ＯＲＦ中の理論的最小ウラシル含有量の約１１５％～約１３５％である場合に、対応する野生型ｍＲＮＡ由来のＰＢＧＤポリペプチドの発現と比較して少なくとも約１０倍増加する。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡはオープンＯＲＦを含み、ｍＲＮＡ中のウラシルは少なくとも約９５％が５－メトキシウラシルであり、ＯＲＦのウラシル含有量は、対応する野生型ＯＲＦ中の理論的最小ウラシル含有量の約１１５％～約１３５％であり、ｍＲＮＡは、そのｍＲＮＡの導入先となった哺乳類の細胞の先天性免疫応答を実質的に誘導しない。
１０．ポリヌクレオチドの修飾方法
本発明は、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ポリヌクレオチド、例えば、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡ）を含む修飾ポリヌクレオチドを含む。修飾ポリヌクレオチドは、化学修飾及び／または構造修飾することができる。本発明のポリヌクレオチドが化学修飾及び／または構造修飾されたポリヌクレオチドは、修飾ポリヌクレオチド」と呼ばれ得る。
本開示は、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）の修飾ヌクレオシド及び修飾ヌクレオチドを提供する。「ヌクレオシド」は、糖分子（例えばペントースもしくはリボース）またはその誘導体を有機塩基（例えばプリンもしくはピリミジン）またはその誘導体（本明細書では「核酸塩基」とも呼ばれる）と組み合わせてを含有する化合物を指す。「ヌクレオチド」は、リン酸基を含むヌクレオシドを指す。例えば任意の有用な方法（化学的、酵素的に、もしくは組み換え的になど）で、修飾ヌクレオシドを合成することによって、１つ以上の修飾ヌクレオシドまたは非天然ヌクレオシドを含み得る。ポリヌクレオチドは、結合したヌクレオシドの１つまたは複数の領域を含むことができる。そのような領域は、可変の主鎖結合を有し得る。その結合は標準のホスホジエステル結合であり得、その場合、ポリヌクレオチドはヌクレオチドの領域を含むこととなる。
本明細書中に開示される修飾ポリヌクレオチドは、様々な異なる修飾を含むことができる。いくつかの実施形態において、修飾ポリヌクレオチドは、１つ、２つもしくはそれより多くの（任意に異なる）ヌクレオシド修飾またはヌクレオチド修飾を含む。いくつかの実施形態において、修飾ポリヌクレオチドは、細胞に導入されると、非修飾ポリヌクレオチドと比較して１つ以上の望ましい特性（例えば、細胞内でのタンパク質発現の向上、免疫原性の低下、または分解の低減）を呈し得る。
ａ．構造修飾
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、構造修飾される。本明細書において「構造」修飾とは、２つ以上の連結されたヌクレオシドを、ヌクレオチド自体に対し著しい化学修飾を施さずに、ポリヌクレオチド中に挿入、欠失、複製、逆位または無作為化することをいう。化学結合が必然的に破壊され、改良によって構造修飾が為されることから、構造修飾は化学的性質のものであり、化学修飾であるとされる。しかしながら、構造修飾によって、異なるヌクレオチド配列が生ずる。例えば、ポリヌクレオチド「ＡＴＣＧ」は「ＡＴ－５ｍｅＣ－Ｇ」に化学修飾することができる一方、これと同じポリヌクレオチド「ＡＴＣＧ」を「ＡＴＣＣＣＧ」に構造修飾することもできる。この場合、ジヌクレオチド「ＣＣ」が挿入された結果として、ポリヌクレオチドに対して構造修飾が為される。
ｂ．化学修飾
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、化学修飾される。本明細書において、ポリヌクレオチドに関して、「化学修飾」または適宜に「化学修飾された」という用語は、アデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、ウリジン（Ｕ）、チミジン（Ｔ）、またはシチジン（Ｃ）リボヌクレオシドもしくはデオキシリボヌクレオシドに関して、その核酸塩基、糖、主鎖、またはそれらの任意の組み合わせを含むがそれらに限定されない、それらの位置、パターン、パーセントもしくは集団のうちの１つ以上における修飾を指す。一般的に、本明細書において、これらの用語は、天然起源の５’末端ｍＲＮＡキャップ残基のリボヌクレオチド修飾を指すことを意図するものではない。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、同じヌクレオシド型の全てまたは任意の一様な化学修飾、同じヌクレオシド型の全てまたは任意のものにおける同じ出発修飾の下方滴定によって産生される修飾の集団、あるいは、ランダム組み込みを有する（例えば、全てのウリジンがウリジン類似体、例えば５－メトキシウリジンで置換されている）同じヌクレオシド型の全ての任意の化学修飾の測定パーセントを有し得る。別の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド全体にわたって（例えば、全てのウリジン及び／または全てのシチジンなどが同じ方法で修飾されている）同じヌクレオシド型の２つ、３つもしくは４つの均一な化学修飾を有し得る。
修飾ヌクレオチド塩基対形成は、標準アデニン－チミン、アデニン－ウラシル、またはグアニン－シトシン塩基対を包含するだけでなく、ヌクレオチド間に形成された塩基対及び／または非標準塩基もしくは修飾塩基を含む修飾ヌクレオチドにおいて、水素結合供与体及び水素結合受容体の配置によって、非標準塩基と標準塩基の間の水素結合、または２つの相補的非標準塩基構造どうしの間の水素結合を可能にしている修飾ヌクレオチドも包含する。そのような非標準的な塩基対形成の一例は、修飾核酸塩基イノシンと、アデニン、シトシンまたはウラシルとの間の塩基対形成である。塩基／糖またはリンカーの任意の組み合わせは、本開示のポリヌクレオチド中に組み込むことが可能である。
別途注記のない限り、本出願に記載のポリヌクレオチド配列において代表的なＤＮＡ配列中には「Ｔ」が列挙されているが、その配列がＲＮＡを表す場合に「Ｔ」が「Ｕ」で置換される。このことは、当業者に了解されるであろう。
本開示の組成物、方法及び合成プロセスに有用なポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）の修飾としては、限定されるものではないが、以下のヌクレオチド、ヌクレオシド、及び核酸塩基が挙げられる：２－メチルチオ－Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－メチルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、Ｎ６－メチルアデノシン、Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン、１，２’－Ｏ－ジメチルアデノシン、１－メチルアデノシン、２’－Ｏ－メチルアデノシン、２’－Ｏ－リボシルアデノシン（フォスフェート）、２－メチルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６イソペンテニルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン、２’－Ｏ－メチルアデノシン、２’－Ｏ－リボシルアデノシン（フォスフェート）、イソペンテニルアデノシン、Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６，２’－Ｏ－ジメチルアデノシン、Ｎ６，２’－Ｏ－ジメチルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６，２’－Ｏ－トリメチルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデノシン、Ｎ６－アセチルアデノシン、Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン、Ｎ６－メチル－Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン、２－メチルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、７－デアザ－アデノシン、Ｎ１－メチル－アデノシン、Ｎ６，Ｎ６（ジメチル）アデニン、Ｎ６－シス－ヒドロキシ－イソペンテニル－アデノシン、α－チオ－アデノシン、２（アミノ）アデニン、２（アミノプロピル）アデニン、２（メチルチオ）Ｎ６（イソペンテニル）アデニン、２－（アルキル）アデニン、２－（アミノアルキル）アデニン、２－（アミノプロピル）アデニン、２－（ハロ）アデニン、２－（ハロ）アデニン、２－（プロピル）アデニン、２’－アミノ－２’－デオキシ－ＡＴＰ、２’－アジド－２’－デオキシ－ＡＴＰ、２’－デオキシ－２’－α－アミノアデノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’－α－アジドアデノシンＴＰ、６（アルキル）アデニン、６（メチル）アデニン、６－（アルキル）アデニン、６－（メチル）アデニン、７（デアザ）アデニン、８（アルケニル）アデニン、８（アルキニル）アデニン、８（アミノ）アデニン、８（チオアルキル）アデニン、８－（アルケニル）アデニン、８－（アルキル）アデニン、８－（アルキニル）アデニン、８－（アミノ）アデニン、８－（ハロ）アデニン、８－（ヒドロキシル）アデニン、８－（チオアルキル）アデニン、８－（チオｌ）アデニン、８－アジド－アデノシン、アザアデニン、デアザアデニン、Ｎ６（メチル）アデニン、Ｎ６－（イソペンチル）アデニン、７－デアザ－８－アザ－アデノシン、７－メチルアデニン、１－デアザアデノシンＴＰ、２’フルオロ－Ｎ６－Ｂｚ－デオキシアデノシンＴＰ、２’－ＯＭｅ－２－アミノ－ＡＴＰ、２’Ｏ－メチル－Ｎ６－Ｂｚ－デオキシアデノシンＴＰ、２’－α－エチニルアデノシンＴＰ、２－アミノアデニン、２－アミノアデノシンＴＰ、２－アミノ－ＡＴＰ、２’－α－トリフルオロメチルアデノシンＴＰ、２－アジドアデノシンＴＰ、２’－β－エチニルアデノシンＴＰ、２－ブロモアデノシンＴＰ、２’－β－トリフルオロメチルアデノシンＴＰ、２－クロロアデノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’，２’－ジフルオロアデノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’－α－メルカプトアデノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’－α－チオメトキシアデノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’－β－アミノアデノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’－β－アジドアデノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’－β－ブロモアデノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’－β－クロロアデノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’－β－フルオロアデノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’－β－ヨードアデノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’－β－メルカプトアデノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’－β－チオメトキシアデノシンＴＰ、２－フルオロアデノシンＴＰ、２－ヨードアデノシンＴＰ、２－メルカプトアデノシンＴＰ、２－メトキシ－アデニン、２－メチルチオ－アデニン、２－トリフルオロメチルアデノシンＴＰ、３－デアザ－３－ブロモアデノシンＴＰ、３－デアザ－３－クロロアデノシンＴＰ、３－デアザ－３－フルオロアデノシンＴＰ、３－デアザ－３－ヨードアデノシンＴＰ、３－デアザアデノシンＴＰ、４’－アジドアデノシンＴＰ、４’－炭素環アデノシンＴＰ、４’－エチニルアデノシンＴＰ、５’－ホモ－アデノシンＴＰ、８－アザ－ＡＴＰ、８－ブロモ－アデノシンＴＰ、８－トリフルオロメチルアデノシンＴＰ、９－デアザアデノシンＴＰ、２－アミノプリン、７－デアザ－２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－８－アザ－アデニン、７－デアザ－２－アミノプリン、２－チオシチジン、３－メチルシチジン、５－ホルミルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、５－メチルシチジン、Ｎ４－アセチルシチジン、２’－Ｏ－メチルシチジン、２’－Ｏ－メチルシチジン、５，２’－Ｏ－ジメチルシチジン、５－ホルミル－２’－Ｏ－メチルシチジン、リシジン、Ｎ４，２’－Ｏ－ジメチルシチジン、Ｎ４－アセチル－２’－Ｏ－メチルシチジン、Ｎ４－メチルシチジン、Ｎ４，Ｎ４－ジメチル－２’－ＯＭｅ－シチジンＴＰ、４－メチルシチジン、５－アザ－シチジン、シュード－イソ－シチジン、ピロロ－シチジン、α－チオ－シチジン、２－（チオ）シトシン、２’－アミノ－２’－デオキシ－ＣＴＰ、２’－アジド－２’－デオキシ－ＣＴＰ、２’－デオキシ－２’－α－アミノシチジンＴＰ、２’－デオキシ－２’－α－アジドシチジンＴＰ、３－（デアザ）５（アザ）シトシン、３－（メチル）シトシン、３－（アルキル）シトシン、３－（デアザ）５（アザ）シトシン、３－（メチル）シチジン、４，２’－Ｏ－ジメチルシチジン、５（ハロ）シトシン、５（メチル）シトシン、５（プロピニル）シトシン、５（トリフルオロメチル）シトシン、５－（アルキル）シトシン、５－（アルキニル）シトシン、５－（ハロ）シトシン、５－（プロピニル）シトシン、５－（トリフルオロメチル）シトシン、５－ブロモ－シチジン、５－ヨード－シチジン、５－プロピニルシトシン、６－（アゾ）シトシン、６－アザ－シチジン、アザシトシン、デアザシトシン、Ｎ４（アセチル）シトシン、１－メチル－１－デアザ－シュードイソシチジン、１－メチル－シュードイソシチジン、２－メトキシ－５－メチル－シチジン、２－メトキシ－シチジン、２－チオ－５－メチル－シチジン、４－メトキシ－１－メチル－シュードイソシチジン、４－メトキシ－シュードイソシチジン、４－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードイソシチジン、４－チオ－１－メチル－シュードイソシチジン、４－チオ－シュードイソシチジン、５－アザ－ゼブラリン、５－メチル－ゼブラリン、ピロロ－シュードイソシチジン、ゼブラリン、（Ｅ）－５－（２－ブロモ－ビニル）シチジンＴＰ、２，２’－アンヒドロ－シチジンＴＰハイドロクロライド、２’フルオル－Ｎ４－Ｂｚ－シチジンＴＰ、２’フルオロ－Ｎ４－アセチル－シチジンＴＰ、２’－Ｏ－メチル－Ｎ４－アセチル－シチジンＴＰ、２’Ｏ－メチル－Ｎ４－Ｂｚ－シチジンＴＰ、２’－α－エチニルシチジンＴＰ、２’－α－トリフルオロメチルシチジンＴＰ、２’－β－エチニルシチジンＴＰ、２’－β－トリフルオロメチルシチジンＴＰ、２’－デオキシ－２’，２’－ジフルオロシチジンＴＰ、２’－デオキシ－２’－α－メルカプトシチジンＴＰ、２’－デオキシ－２’－α－チオメトキシシチジンＴＰ、２’－デオキシ－２’－β－アミノシチジンＴＰ、２’－デオキシ－２’－β－アジドシチジンＴＰ、２’－デオキシ－２’－β－ブロモシチジンＴＰ、２’－デオキシ－２’－β－クロロシチジンＴＰ、２’－デオキシ－２’－β－フルオロシチジンＴＰ、２’－デオキシ－２’－β－ヨードシチジンＴＰ、２’－デオキシ－２’－β－メルカプトシチジンＴＰ、２’－デオキシ－２’－β－チオメトキシシチジンＴＰ、２’－Ｏ－メチル－５－（１－プロピニル）シチジンＴＰ、３’－エチニルシチジンＴＰ、４’－アジドシチジンＴＰ、４’－炭素環シチジンＴＰ、４’－エチニルシチジンＴＰ、５－（１－プロピニル）アラ－シチジンＴＰ、５－（２－クロロ－フェニル）－２－チオシチジンＴＰ、５－（４－アミノ－フェニル）－２－チオシチジンＴＰ、５－アミノアリル－ＣＴＰ、５－シアノシチジンＴＰ、５－エチニルアラ－シチジンＴＰ、５－エチニルシチジンＴＰ、５’－ホモ－シチジンＴＰ、５－メトキシシチジンＴＰ、５－トリフルオロメチル－シチジンＴＰ、Ｎ４－アミノ－シチジンＴＰ、Ｎ４－ベンゾイル－シチジンＴＰ、シュードイソシチジン、７－メチルグアノシン、Ｎ２，２’－Ｏ－ジメチルグアノシン、Ｎ２－メチルグアノシン、ワイオシン、１，２’－Ｏ－ジメチルグアノシン、１－メチルグアノシン、２’－Ｏ－メチルグアノシン、２’－Ｏ－リボシルグアノシン（フォスフェート）、２’－Ｏ－メチルグアノシン、２’－Ｏ－リボシルグアノシン（フォスフェート）、７－アミノメチル－７－デアザグアノシン、７－シアノ－７－デアザグアノシン、アルカエオシン、メチルワイオシン、Ｎ２，７－ジメチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２，２’－Ｏ－トリメチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２，７－トリメチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン、Ｎ２，７，２’－Ｏ－トリメチルグアノシン、６－チオ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、Ｎ１－メチル－グアノシン、α－チオ－グアノシン、２（プロピル）グアニン、２－（アルキル）グアニン、２’－アミノ－２’－デオキシ－ＧＴＰ、２’－アジド－２’－デオキシ－ＧＴＰ、２’－デオキシ－２’－α－アミノグアノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’－α－アジドグアノシンＴＰ、６（メチル）グアニン、６－（アルキル）グアニン、６－（メチル）グアニン、６－メチル－グアノシン、７（アルキル）グアニン、７（デアザ）グアニン、７（メチル）グアニン、７－（アルキル）グアニン、７－（デアザ）グアニン、７－（メチル）グアニン、８（アルキル）グアニン、８（アルキニル）グアニン、８（ハロ）グアニン、８（チオアルキル）グアニン、８－（アルケニル）グアニン、８－（アルキル）グアニン、８－（アルキニル）グアニン、８－（アミノ）グアニン、８－（ハロ）グアニン、８－（ヒドロキシル）グアニン、８－（チオアルキル）グアニン、８－（チオｌ）グアニン、アザグアニン、デアザグアニン、Ｎ（メチル）グアニン、Ｎ－（メチル）グアニン、１－メチル－６－チオ－グアノシン、６－メトキシ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－８－アザ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－グアノシン、６－チオ－７－メチル－グアノシン、７－デアザ－８－アザ－グアノシン、７－メチル－８－オキソ－グアノシン、Ｎ２，Ｎ２－ジメチル－６－チオ－グアノシン、Ｎ２－メチル－６－チオ－グアノシン、１－Ｍｅ－ＧＴＰ、２’フルオロ－Ｎ２－イソブチル－グアノシンＴＰ、２’Ｏ－メチル－Ｎ２－イソブチル－グアノシンＴＰ、２’－α－エチニルグアノシンＴＰ、２’－α－トリフルオロメチルグアノシンＴＰ、２’－β－エチニルグアノシンＴＰ、２’－β－トリフルオロメチルグアノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’，２’－ジフルオログアノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’－α－メルカプトグアノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’－α－チオメトキシグアノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’－β－アミノグアノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’－β－アジドグアノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’－β－ブロモグアノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’－β－クロログアノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’－β－フルオログアノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’－β－ヨードグアノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’－β
－メルカプトグアノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’－β－チオメトキシグアノシンＴＰ、４’－アジドグアノシンＴＰ、４’－炭素環グアノシンＴＰ、４’－エチニルグアノシンＴＰ、５’－ホモ－グアノシンＴＰ、８－ブロモ－グアノシンＴＰ、９－デアザグアノシンＴＰ、Ｎ２－イソブチル－グアノシンＴＰ、１－メチルイノシン、イノシン、１，２’－Ｏ－ジメチルイノシン、２’－Ｏ－メチルイノシン、７－メチルイノシン、２’－Ｏ－メチルイノシン、エポキシクオオシン、ガラクトシル－クオオシン、マンノシルクオオシン、クオオシン、アリルアミノ－チミジン、アザチミジン、デアザチミジン、デオキシ－チミジン、２’－Ｏ－メチルウリジン、２－チオウリジン、３－メチルウリジン、５－カルボキシメチルウリジン、５－ヒドロキシウリジン、５－メチルウリジン、５－タウリノメチル－２－チオウリジン、５－タウリノメチルウリジン、ジヒドロウリジン、シュードウリジン、（３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウリジン、１－メチル－３－（３－アミノ－５－カルボキシプロピル）シュードウリジン、１－メチルシュードウリジン、１－エチル－シュードウリジン、２’－Ｏ－メチルウリジン、２’－Ｏ－メチルシュードウリジン、２’－Ｏ－メチルウリジン、２－チオ－２’－Ｏ－メチルウリジン、３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウリジン、３，２’－Ｏ－ジメチルウリジン、３－メチル－シュード－ウリジンＴＰ、４－チオウリジン、５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン、５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジンメチルエステル、５，２’－Ｏ－ジメチルウリジン、５，６－ジヒドロ－ウリジン、５－アミノメチル－２－チオウリジン、５－カルバモイルメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－カルバモイルメチルウリジン、５－カルボキシヒドロキシメチルウリジン、５－カルボキシヒドロキシメチルウリジンメチルエステル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウリジン、５－カルバモイルメチルウリジンＴＰ、５－メトキシカルボニルメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－メトキシカルボニルメチル－２－チオウリジン、５－メトキシカルボニルメチルウリジン、５－メチルウリジン）、５－メトキシウリジン、５－メチル－２－チオウリジン、５－メチルアミノメチル－２－セレノウリジン、５－メチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－メチルアミノメチルウリジン、５－メチルジヒドロウリジン、５－オキシ酢酸－ウリジンＴＰ、５－オキシ酢酸－メチルエステル－ウリジンＴＰ、Ｎ１－メチル－シュード－ウラシル、Ｎ１－エチル－シュード－ウラシル、ウリジン５－オキシ酢酸、ウリジン５－オキシ酢酸メチルエステル、３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）－ウリジンＴＰ、５－（イソ－ペンテニルアミノメチル）－２－チオウリジンＴＰ、５－（イソ－ペンテニルアミノメチル）－２’－Ｏ－メチルウリジンＴＰ、５－（イソ－ペンテニルアミノメチル）ウリジンＴＰ、５－プロピニルウラシル、α－チオ－ウリジン、１（アミノアルキルアミノ－カルボニルエチレニル）－２（チオ）－シュードウラシル、１（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）－２，４－（ジチオ）シュードウラシル、１（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）－４（チオ）シュードウラシル、１（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）－シュードウラシル、１（アミノカルボニルエチレニル）－２（チオ）－シュードウラシル、１（アミノカルボニルエチレニル）－２，４－（ジチオ）シュードウラシル、１（アミノカルボニルエチレニル）－４（チオ）シュードウラシル、１（アミノカルボニルエチレニル）－シュードウラシル、１置換２（チオ）－シュードウラシル、１置換２，４－（ジチオ）シュードウラシル、１置換４（チオ）シュードウラシル、１置換シュードウラシル、１－（アミノアルキルアミノ－カルボニルエチレニル）－２－（チオ）－シュードウラシル、１－メチル－３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）シュードウリジンＴＰ、１－メチル－３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）シュード－ＵＴＰ、１－メチル－シュード－ＵＴＰ、１－エチル－シュード－ＵＴＰ、２（チオ）シュードウラシル、２’デオキシウリジン、２’フルオロウリジン、２－（チオ）ウラシル、２，４－（ジチオ）シュードウラシル、２’メチル、２’アミノ、２’アジド、２’フルロ－グアノシン、２’－アミノ－２’－デオキシ－ＵＴＰ、２’－アジド－２’－デオキシ－ＵＴＰ、２’－アジド－デオキシウリジンＴＰ、２’－Ｏ－メチルシュードウリジン、２’デオキシウリジン、２’フルオロウリジン、２’－デオキシ－２’－α－アミノウリジンＴＰ、２’－デオキシ－２’－α－アジドウリジンＴＰ、２－メチルシュードウリジン、３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウラシル、４（チオ）シュードウラシル、４－（チオ）シュードウラシル、４－（チオ）ウラシル、４－チオウラシル、５（１，３－ジアゾール－１－アルキル）ウラシル、５（２－アミノプロピル）ウラシル、５（アミノアルキル）ウラシル、５（ジメチルアミノアルキル）ウラシル、５（グアニジニウムアルキル）ウラシル、５（メトキシカルボニルメチル）－２－（チオ）ウラシル、５（メトキシカルボニル－メチル）ウラシル、５（メチル）－２－（チオ）ウラシル、５（メチル）２，４（ジチオ）ウラシル、５（メチル）４（チオ）ウラシル、５（メチルアミノメチル）－２（チオ）ウラシル、５（メチルアミノメチル）－２，４（ジチオ）ウラシル、５（メチルアミノメチル）－４（チオ）ウラシル、５（プロピニル）ウラシル、５（トリフルオロメチル）ウラシル、５－（２－アミノプロピル）ウラシル、５－（アルキル）－２－（チオ）シュードウラシル、５－（アルキル）－２，４（ジチオ）シュードウラシル、５－（アルキル）－４（チオ）シュードウラシル、５－（アルキル）シュードウラシル、５－（アルキル）ウラシル、５－（アルキニル）ウラシル、５－（アリルアミノ）ウラシル、５－（シアノアルキル）ウラシル、５－（ジアルキルアミノアルキル）ウラシル、５－（ジメチルアミノアルキル）ウラシル、５－（グアニジニウムアルキル）ウラシル、５－（ハロ）ウラシル、５－（ｌ，３－ジアゾール－ｌ－アルキル）ウラシル、５－（メトキシ）ウラシル、５－（メトキシカルボニルメチル）－２－（チオ）ウラシル、５－（メトキシカルボニル－メチル）ウラシル、５－（メチル）－２－（チオ）ウラシル、５－（メチル）２，４（ジチオ）ウラシル、５－（メチル）４（チオ）ウラシル、５－（メチル）－２－（チオ）シュードウラシル、５－（メチル）－２，４（ジチオ）シュードウラシル、５－（メチル）－４（チオ）シュードウラシル、５－（メチル）シュードウラシル、５－（メチルアミノメチル）－２（チオ）ウラシル、５－（メチルアミノメチル）－２，４（ジチオ）ウラシル、５－（メチルアミノメチル）－４－（チオ）ウラシル、５－（プロピニル）ウラシル、５－（トリフルオロメチル）ウラシル、５－アミノアリル－ウリジン、５－ブロモ－ウリジン、５－ヨード－ウリジン、５－ウラシル、６（アゾ）ウラシル、６－（アゾ）ウラシル、６－アザ－ウリジン、アリルアミノ－ウラシル、アザウラシル、デアザウラシル、Ｎ３－（メチル）ウラシル、シュード－ＵＴＰ－１－２－ブタン酸、シュードウラシル、４－チオ－シュード－ＵＴＰ、１－カルボキシメチル－シュードウリジン、１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、１－プロピニル－ウリジン、１－タウリノメチル－１－メチル－ウリジン、１－タウリノメチル－４－チオ－ウリジン、１－タウリノメチル－シュードウリジン、２－メトキシ－４－チオ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、４－チオ－シュードウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、（±）１－（２－ヒドロキシプロピル）シュードウリジンＴＰ、（２Ｒ）－１－（２－ヒドロキシプロピル）シュードウリジンＴＰ、（２Ｓ）－１－（２－ヒドロキシプロピル）シュードウリジンＴＰ、（Ｅ）－５－（２－ブロモ－ビニル）アラ－ウリジンＴＰ、（Ｅ）－５－（２－ブロモ－ビニル）ウリジンＴＰ、（Ｚ）－５－（２－ブロモ－ビニル）アラ－ウリジンＴＰ、（Ｚ）－５－（２－ブロモ－ビニル）ウリジンＴＰ、１－（２，２，２－トリフルオロエチル）－シュード－ＵＴＰ、１－（２，２，３，３，３－ペンタフルオロプロピル）シュードウリジンＴＰ、１－（２，２－ジエトキシエチル）シュードウリジンＴＰ、１－（２，４，６－トリメチルベンジル）シュードウリジンＴＰ、１－（２，４，６－トリメチル－ベンジル）シュード－ＵＴＰ、１－（２，４，６－トリメチル－フェニル）シュード－ＵＴＰ、１－（２－アミノ－２－カルボキシエチル）シュード－ＵＴＰ、１－（２－アミノ－エチル）シュード－ＵＴＰ、１－（２－ヒドロキシエチル）シュードウリジンＴＰ、１－（２－メトキシエチル）シュードウリジンＴＰ、１－（３，４－ビス－トリフルオロメトキシベンジル）シュードウリジンＴＰ、１－（３，４－ジメトキシベンジル）シュードウリジンＴＰ、１－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）シュード－ＵＴＰ、１－（３－アミノ－プロピル）シュード－ＵＴＰ、１－（３－シクロプロピル－プロプ－２－イニル）シュードウリジンＴＰ、１－（４－アミノ－４－カルボキシブチル）シュード－ＵＴＰ、１－（４－アミノ－ベンジル）シュード－ＵＴＰ、１－（４－アミノ－ブチル）シュード－ＵＴＰ、１－（４－アミノ－フェニル）シュード－ＵＴＰ、１－（４－アジドベンジル）シュードウリジンＴＰ、１－（４－ブロモベンジル）シュードウリジンＴＰ、１－（４－クロロベンジル）シュードウリジンＴＰ、１－（４－フルオロベンジル）シュードウリジンＴＰ、１－（４－ヨードベンジル）シュードウリジンＴＰ、１－（４－メタンスルホニルベンジル）シュードウリジンＴＰ、１－（４－メトキシベンジル）シュードウリジンＴＰ、１－（４－メトキシ－ベンジル）シュード－ＵＴＰ、１－（４－メトキシ－フェニル）シュード－ＵＴＰ、１－（４－メチルベンジル）シュードウリジンＴＰ、１－（４－メチル－ベンジル）シュード－ＵＴＰ、１－（４－ニトロベンジル）シュードウリジンＴＰ、１－（４－ニトロ－ベンジル）シュード－ＵＴＰ、１（４－ニトロ－フェニル）シュード－ＵＴＰ、１－（４－チオメトキシベンジル）シュードウリジンＴＰ、１－（４－トリフルオロメトキシベンジル）シュードウリジンＴＰ、１－（４－トリフルオロメチルベンジル）シュードウリジンＴＰ、１－（５－アミノ－ペンチル）シュード－ＵＴＰ、１－（６－アミノ－ヘキシル）シュード－ＵＴＰ、１，６－ジメチル－シュード－ＵＴＰ、１－［３－（２－｛２－［２－（２－アミノエトキシ）－エトキシ］－エトキシ｝－エトキシ）－プロピオニル］シュードウリジンＴＰ、１－｛３－［２－（２－アミノエトキシ）－エトキシ］－プロピオニル｝シュードウリジンＴＰ、１－アセチルシュードウリジンＴＰ、１－アルキル－６－（１－プロピニル）－シュード－ＵＴＰ、１－アルキル－６－（２－プロピニル）－シュード－ＵＴＰ、１－アルキル－６－アリル－シュード－ＵＴＰ、１－アルキル－６－エチニル－シュード－ＵＴＰ、１－アルキル－６－ホモアリル－シュード－ＵＴＰ、１－アルキル－６－ビニル－シュード－ＵＴＰ、１－アリルシュードウリジンＴＰ、１－アミノメチル－シュード－ＵＴＰ、１－ベンゾイルシュードウリジンＴＰ、１－ベンジルオキシメチルシュードウリジンＴＰ、１－ベ
ンジル－シュード－ＵＴＰ、１－ビオチニル－ＰＥＧ２－シュードウリジンＴＰ、１－ビオチニルシュードウリジンＴＰ、１－ブチル－シュード－ＵＴＰ、１－シアノメチルシュードウリジンＴＰ、１－シクロブチルメチル－シュード－ＵＴＰ、１－シクロブチル－シュード－ＵＴＰ、１－シクロヘプチルメチル－シュード－ＵＴＰ、１－シクロヘプチル－シュード－ＵＴＰ、１－シクロヘキシルメチル－シュード－ＵＴＰ、１－シクロヘキシル－シュード－ＵＴＰ、１－シクロオクチルメチル－シュード－ＵＴＰ、１－シクロオクチル－シュード－ＵＴＰ、１－シクロペンチルメチル－シュード－ＵＴＰ、１－シクロペンチル－シュード－ＵＴＰ、１－シクロプロピルメチル－シュード－ＵＴＰ、１－シクロプロピル－シュード－ＵＴＰ、１－エチル－シュード－ＵＴＰ、１－ヘキシル－シュード－ＵＴＰ、１－ホモアリルシュードウリジンＴＰ、１－ヒドロキシメチルシュードウリジンＴＰ、１－イソ－プロピル－シュード－ＵＴＰ、１－Ｍｅ－２－チオ－シュード－ＵＴＰ、１－Ｍｅ－４－チオ－シュード－ＵＴＰ、１－Ｍｅ－αチオ－シュード－ＵＴＰ、１－メタンスルホニルメチルシュードウリジンＴＰ、１－メトキシメチルシュードウリジンＴＰ、１－メチル－６－（２，２，２－トリフルオロエチル）シュード－ＵＴＰ、１－メチル－６－（４－モルホリノ）－シュード－ＵＴＰ、１－メチル－６－（４－チオモルホリノ）－シュード－ＵＴＰ、１－メチル－６－（置換フェニル）シュード－ＵＴＰ、１－メチル－６－アミノ－シュード－ＵＴＰ、１－メチル－６－アジド－シュード－ＵＴＰ、１－メチル－６－ブロモ－シュード－ＵＴＰ、１－メチル－６－ブチル－シュード－ＵＴＰ、１－メチル－６－クロロ－シュード－ＵＴＰ、１－メチル－６－シアノ－シュード－ＵＴＰ、１－メチル－６－ジメチルアミノ－シュード－ＵＴＰ、１－メチル－６－エトキシ－シュード－ＵＴＰ、１－メチル－６－エチルカルボキシレート－シュード－ＵＴＰ、１－メチル－６－エチル－シュード－ＵＴＰ、１－メチル－６－フルオロ－シュード－ＵＴＰ、１－メチル－６－ホルミル－シュード－ＵＴＰ、１－メチル－６－ヒドロキシアミノ－シュード－ＵＴＰ、１－メチル－６－ヒドロキシ－シュード－ＵＴＰ、１－メチル－６－ヨード－シュード－ＵＴＰ、１－メチル－６－イソ－プロピル－シュード－ＵＴＰ、１－メチル－６－メトキシ－シュード－ＵＴＰ、１－メチル－６－メチルアミノ－シュード－ＵＴＰ、１－メチル－６－フェニル－シュード－ＵＴＰ、１－メチル－６－プロピル－シュード－ＵＴＰ、１－メチル－６－ｔｅｒｔ－ブチル－シュード－ＵＴＰ、１－メチル－６－トリフルオロメトキシ－シュード－ＵＴＰ、１－メチル－６－トリフルオロメチル－シュード－ＵＴＰ、１－モルホリノメチルシュードウリジンＴＰ、１－ペンチル－シュード－ＵＴＰ、１－フェニル－シュード－ＵＴＰ、１－ピバロイルシュードウリジンＴＰ、１－プロパルギルシュードウリジンＴＰ、１－プロピル－シュード－ＵＴＰ、１－プロピニル－シュードウリジン、１－ｐ－トリル－シュード－ＵＴＰ、１－ｔｅｒｔ－ブチル－シュード－ＵＴＰ、１－チオメトキシメチルシュードウリジンＴＰ、１－チオモルホリノメチルシュードウリジンＴＰ、１－トリフルオロアセチルシュードウリジンＴＰ、１－トリフルオロメチル－シュード－ＵＴＰ、１－ビニルシュードウリジンＴＰ、２，２’－アンヒドロ－ウリジンＴＰ、２’－ブロモ－デオキシウリジンＴＰ、２’－Ｆ－５－メチル－２’－デオキシ－ＵＴＰ、２’－ＯＭｅ－５－Ｍｅ－ＵＴＰ、２’－ＯＭｅ－シュード－ＵＴＰ、２’－α－エチニルウリジンＴＰ、２’－α－トリフルオロメチルウリジンＴＰ、２’－β－エチニルウリジンＴＰ、２’－β－トリフルオロメチルウリジンＴＰ、２’－デオキシ－２’，２’－ジフルオロウリジンＴＰ、２’－デオキシ－２’－α－メルカプトウリジンＴＰ、２’－デオキシ－２’－α－チオメトキシウリジンＴＰ、２’－デオキシ－２’－β－アミノウリジンＴＰ、２’－デオキシ－２’－β－アジドウリジンＴＰ、２’－デオキシ－２’－β－ブロモウリジンＴＰ、２’－デオキシ－２’－β－クロロウリジンＴＰ、２’－デオキシ－２’－β－フルオロウリジンＴＰ、２’－デオキシ－２’－β－ヨードウリジンＴＰ、２’－デオキシ－２’－β－メルカプトウリジンＴＰ、２’－デオキシ－２’－β－チオメトキシウリジンＴＰ、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、２－メトキシウリジン、２’－Ｏ－メチル－５－（１－プロピニル）ウリジンＴＰ、３－アルキル－シュード－ＵＴＰ、４’－アジドウリジンＴＰ、４’－炭素環ウリジンＴＰ、４’－エチニルウリジンＴＰ、５－（１－プロピニル）アラ－ウリジンＴＰ、５－（２－フラニル）ウリジンＴＰ、５－シアノウリジンＴＰ、５－ジメチルアミノウリジンＴＰ、５’－ホモ－ウリジンＴＰ、５－ヨード－２’－フルオロ－デオキシウリジンＴＰ、５－フェニルエチニルウリジンＴＰ、５－トリジュウテロメチル－６－ジュウテロウリジンＴＰ、５－トリフルオロメチル－ウリジンＴＰ、５－ビニルアラウリジンＴＰ、６－（２，２，２－トリフルオロエチル）－シュード－ＵＴＰ、６－（４－モルホリノ）－シュード－ＵＴＰ、６－（４－チオモルホリノ）－シュード－ＵＴＰ、６－（置換－フェニル）－シュード－ＵＴＰ、６－アミノ－シュード－ＵＴＰ、６－アジド－シュード－ＵＴＰ、６－ブロモ－シュード－ＵＴＰ、６－ブチル－シュード－ＵＴＰ、６－クロロ－シュード－ＵＴＰ、６－シアノ－シュード－ＵＴＰ、６－ジメチルアミノ－シュード－ＵＴＰ、６－エトキシ－シュード－ＵＴＰ、６－エチルカルボキシレート－シュード－ＵＴＰ、６－エチル－シュード－ＵＴＰ、６－フルオロ－シュード－ＵＴＰ、６－ホルミル－シュード－ＵＴＰ、６－ヒドロキシアミノ－シュード－ＵＴＰ、６－ヒドロキシ－シュード－ＵＴＰ、６－ヨード－シュード－ＵＴＰ、６－イソ－プロピル－シュード－ＵＴＰ、６－メトキシ－シュード－ＵＴＰ、６－メチルアミノ－シュード－ＵＴＰ、６－メチル－シュード－ＵＴＰ、６－フェニル－シュード－ＵＴＰ、６－フェニル－シュード－ＵＴＰ、６－プロピル－シュード－ＵＴＰ、６－ｔｅｒｔ－ブチル－シュード－ＵＴＰ、６－トリフルオロメトキシ－シュード－ＵＴＰ、６－トリフルオロメチル－シュード－ＵＴＰ、αチオ－シュード－ＵＴＰ、シュードウリジン１－（４－メチルベンゼンスルホン酸）ＴＰ、シュードウリジン１－（４－メチル安息香酸）ＴＰ、シュードウリジンＴＰ１－［３－（２－エトキシ）］プロピオン酸、シュードウリジンＴＰ１－［３－｛２－（２－［２－（２－エトキシ）－エトキシ］－エトキシ）－エトキシ｝］プロピオン酸、シュードウリジンＴＰ１－［３－｛２－（２－［２－｛２（２－エトキシ）－エトキシ｝－エトキシ］－エトキシ）－エトキシ｝］プロピオン酸、シュードウリジンＴＰ１－［３－｛２－（２－［２－エトキシ］－エトキシ）－エトキシ｝］プロピオン酸、シュードウリジンＴＰ１－［３－｛２－（２－エトキシ）－エトキシ｝］プロピオン酸、シュードウリジンＴＰ１－メチルホスホン酸、シュードウリジンＴＰ１－メチルホスホン酸ジエチルエステル、シュード－ＵＴＰ－Ｎ１－３－プロピオン酸、シュード－ＵＴＰ－Ｎ１－４－ブタン酸、シュード－ＵＴＰ－Ｎ１－５－ペンタン酸、シュード－ＵＴＰ－Ｎ１－６－ヘキサン酸、シュード－ＵＴＰ－Ｎ１－７－ヘプタン酸、シュード－ＵＴＰ－Ｎ１－メチル－ｐ－安息香酸、シュード－ＵＴＰ－Ｎ１－ｐ－安息香酸、ワイブトシン、ヒドロキシワイブトシン、イソワイオシン、ペルオキシウリブトシン、不完全修飾ヒドロキシワイブトシン、４－デメチルワイオシン、２，６－（ジアミノ）プリン、１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェノキサジン－１－イル：１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェンチアジン－ｌ－イル、１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェノキサジン－１－イル、１，３，５－（トリアザ）－２，６－（ジオキサ）－ナフタレン、２（アミノ）プリン、２，４，５－（トリメチル）フェニル、２’メチル、２’アミノ、２’アジド、２’フルロ－シチジン、２’メチル、２’アミノ、２’アジド、２’フルロ－アデニン、２’メチル、２’アミノ、２’アジド、２’フルロ－ウリジン、２’－アミノ－２’－デオキシリボース、２－アミノ－６－クロロ－プリン、２－アザ－イノシニル、２’－アジド－２’－デオキシリボース、２’フルオロ－２’－デオキシリボース、２’－フルオロ修飾塩基、２’－Ｏ－メチル－リボース、２－オキソ－７－アミノピリドピリミジン－３－イル、２－オキソ－ピリドピリミジン－３－イル、２－ピリミジノン、３－ニトロピロール、３－（メチル）－７－（プロピニル）イソカルボスチリル、３－（メチル）イソカルボスチリル、４－（フルオロ）－６－（メチル）ベンズイミダゾル、４－（メチル）ベンズイミダゾル、４－（メチル）インドリル、４，６－（ジメチル）インドリル、５－ニトロインドール、５置換ピリミジン、５－（メチル）イソカルボスチリル、５－ニトロインドール、６－（アザ）ピリミジン、６－（アゾ）チミン、６－（メチル）－７－（アザ）インドリル、６－クロロ－プリン、６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル、７－（アミノアルキルヒドロキシ）－１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェンチアジン－ｌ－イル、７－（アミノアルキルヒドロキシ）－１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェノキサジン－１－イル、７－（アミノアルキルヒドロキシ）－１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェノキサジン－１－イル、７－（アミノアルキルヒドロキシ）－ｌ，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェンチアジン－ｌ－イル、７－（アミノアルキルヒドロキシ）－ｌ，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェノキサジン－ｌ－イル、７－（アザ）インドリル、７－（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）－１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェノキサジンｌ－イル、７－（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）－１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェンチアジン－ｌ－イル、７－（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）－１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェノキサジン－１－イル、７－（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）－１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェノキサジン－１－イル、７－（グアニジニウムアルキル－ヒドロキシ）－ｌ，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェンチアジン－ｌ－イル、７－（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）－ｌ，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェノキサジン－ｌ－イル、７－（プロピニル）イソカルボスチリル、７－（プロピニル）イソカルボスチリル、プロピニル－７－（アザ）インドリル、７－デアザ－イノシニル、７－置換１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェノキサジン－１－イル、７－置換１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェノキサジン－１－イル、９－（メチル）－イミダゾピリジニル、アミノインドリル、アントラセニル、ビス－オルソ－（アミノアルキルヒドロキシ）－６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル、ビス－オルソ－置換－６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル、ジフルオロトリル、ハイポキサンチン、イミダゾピリジニル、イノシニル、イソカルボスチリル、イソグアニシン、Ｎ２－置換プリン、Ｎ６－メチル－２－アミノ－プリン、Ｎ６－置換プリン、Ｎ－アルキル化誘導体、ナフタレニル、ニトロベンズイミダゾリル、ニトロイミダゾリル、ニトロインダゾリル、ニトロピラゾリル、ヌブラリン、Ｏ６－置換プリン、Ｏ－アルキル化誘導体、オルソ－（アミノアルキルヒドロキシ）－６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル、オルソ－置換－６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル、オキソホルマイシンＴＰ、パラ－（アミノアルキルヒドロキシ）－６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル、パラ－置換－６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル、ペンタセニル、フェナントラセニル、フ
ェニル、プロピニル－７－（アザ）インドリル、ピレニル、ピリドピリミジン－３－イル、ピリドピリミジン－３－イル、２－オキソ－７－アミノ－ピリドピリミジン－３－イル、ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル、ピロロピリミジニル、ピロロピリジニル、スチルベンジル、置換１，２，４－トリアゾール、テトラセニル、ツベルシジン、キサンチン、キサントシン－５’－ＴＰ、２－チオ－ゼブラリン、５－アザ－２－チオ－ゼブラリン、７－デアザ－２－アミノ－プリン、ピリミジン－４－オンリボヌクレオシド、２－アミノ－リボシド－ＴＰ、ホルマイシンＡＴＰ、ホルマイシンＢＴＰ、ピロロシンＴＰ、２’－ＯＨ－アラ－アデノシンＴＰ、２’－ＯＨ－アラ－シチジンＴＰ、２’－ＯＨ－アラ－ウリジンＴＰ、２’－ＯＨ－アラ－グアノシンＴＰ、５－（２－カルボメトキシビニル）ウリジンＴＰ、及びＮ６－（１９－アミノ－ペンタオキサノナデシル）アデノシンＴＰ。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、前述の修飾核酸塩基のうち少なくとも２つ（例えば、２、３、４またはそれより多く）の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオシドは、シュードウリジン（Ψ）、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、４－チオ－シュードウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５－メチルウリジン、５－メトキシウリジン、２’－Ｏ－メチルウリジン、１－メチル－シュードウリジン（ｍ１Ψ）、１－エチル－シュードウリジン（ｅ１Ψ）、５－メトキシ－ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）、αチオ－グアノシン、αチオ－アデノシン、５－シアノウリジン、４’－チオウリジン７－デアザ－アデニン、１－メチル－アデノシン（ｍ１Ａ）、２－メチル－アデニン（ｍ２Ａ）、Ｎ６－メチル－アデノシン（ｍ６Ａ）、及び２，６－ジアミノプリン、（Ｉ）、１－メチル－イノシン（ｍ１Ｉ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、７－デアザ－グアノシン、７－シアノ－７－デアザ－グアノシン（プレＱ０）、７－アミノメチル－７－デアザ－グアノシン（プレＱ１）、７－メチル－グアノシン（ｍ７Ｇ）、１－メチル－グアノシン（ｍ１Ｇ）、８－オキソ－グアノシン、７－メチル－８－オキソ－グアノシン、２，８－ジメチルアデノシン、２－ゲラニルチオウリジン、２－リシジン、２－セレノウリジン、３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）－５，６－ジヒドロウリジン、３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）シュードウリジン、３－メチルシュードウリジン、５－（カルボキシヒドロキシメチル）－２’－Ｏ－メチルウリジンメチルエステル、５－アミノメチル－２－ゲラニルチオウリジン、５－アミノメチル－２－セレノウリジン、５－アミノメチルウリジン、５－カルバモイルヒドロキシメチルウリジン、５－カルバモイルメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－ゲラニルチオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－セレノウリジン、５－シアノメチルウリジン、５－ヒドロキシシチジン、５－メチルアミノメチル－２－ゲラニルチオウリジン、７－アミノカルボキシプロピル－デメチルワイオシン、７－アミノカルボキシプロピルワイオシン、７－アミノカルボキシプロピルワイオシンメチルエステル、８－メチルアデノシン、Ｎ４，Ｎ４－ジメチルシチジン、Ｎ６－ホルミルアデノシン、Ｎ６－ヒドロキシメチルアデノシン、アグマチジン、環状Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン、グルタミル－クオオシン、メチル化不完全修飾ヒドロキシワイブトシン、Ｎ４，Ｎ４，２’－Ｏ－トリメチルシチジン、ゲラニル化５－メチルアミノメチル－２－チオウリジン、ゲラニル化５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、Ｑ塩基、プレＱ０塩基、プレＱ１塩基、及び２つ以上のそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオシドは、シュードウリジン、１－メチルシュードウリジン、１－エチル－シュードウリジン、５－メチルシトシン、５－メトキシウリジン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、前述の修飾核酸塩基のうち少なくとも２つ（例えば、２、３、４またはそれより多く）の組み合わせを含む。
（ｉ）塩基修飾
ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）内の核酸塩基において化学修飾が為される。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）中の修飾核酸塩基は、１－メチル－シュードウリジン（ｍ１Ψ）、１－エチル－シュードウリジン（ｅ１Ψ）、５－メトキシ－ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）、シュードウリジン（Ψ）、α－チオ－グアノシン及びα－チオ－アデノシンからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、前述の修飾核酸塩基のうち少なくとも２つ（例えば、２、３、４またはそれより多く）の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、シュードウリジン（Ψ）と５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）とを含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、１－メチル－シュードウリジン（ｍ１Ψ）を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、１－エチル－シュードウリジン（ｅ１Ψ）を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、１－メチル－シュードウリジン（ｍ１Ψ）と５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）とを含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、１－エチル－シュードウリジン（ｅ１Ψ）と５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）とを含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、２－チオウリジン及び５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、メトキシ－ウリジン（ｍｏ５Ｕ）を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、５－メトキシ－ウリジン（ｍｏ５Ｕ）及び５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、２’－Ｏ－メチルウリジンを含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、２’－Ｏ－メチルウリジン及び５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、Ｎ６－メチル－アデノシン（ｍ６Ａ）を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、Ｎ６－メチル－アデノシン（ｍ６Ａ）及び５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡ（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチド）は、一様な修飾（例えば、完全な修飾、配列全体にわたる修飾）によって特定の修飾が為される。例えば、ポリヌクレオチドを５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）で一様に修飾することができる。これは、ｍＲＮＡ配列中の全てのシトシン残基が５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）で置換されることを意味する。同様に、ポリヌクレオチドを修飾残基（上記のいずれかのなど）で置換することによって、配列中に存在する任意の型のヌクレオシド残基に対して一様な修飾を行うことができる。
いくつかの実施形態において、オープンリーディングフレーム中の化学修飾されたヌクレオシドは、ウリジン、アデニン、シトシン、グアニン、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、修飾核酸塩基は、修飾シトシンである。修飾シトシンを有する核酸塩基及びヌクレオシドの例としては、Ｎ４－アセチル－シチジン（ａｃ４Ｃ）、５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）、５－ハロ－シチジン（例えば、５－ヨード－シチジン）、５－ヒドロキシメチル－シチジン（ｈｍ５Ｃ）、１－メチル－シュードイソシチジン、２－チオ－シチジン（ｓ２Ｃ）、２－チオ－５－メチル－シチジンが挙げられる。
いくつかの実施形態において、修飾核酸塩基は、修飾ウリジンである。修飾ウリジンを有する核酸塩基及びヌクレオシドの例としては、５－シアノウリジンまたは４’－チオウリジンが挙げられる。
いくつかの実施形態において、修飾核酸塩基は、修飾アデニンである。修飾アデニンを有する核酸塩基及びヌクレオシドの例としては、７－デアザ－アデニン、１－メチル－アデノシン（ｍ１Ａ）、２－メチル－アデニン（ｍ２Ａ）、Ｎ６－メチル－アデニン（ｍ６Ａ）、及び２，６－ジアミノプリンが挙げられる。
いくつかの実施形態において、修飾核酸塩基は、修飾グアニンである。修飾グアニンを有する核酸塩基及びヌクレオシドの例としては、イノシン（Ｉ）、１－メチル－イノシン（ｍ１Ｉ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、７－デアザ－グアノシン、７－シアノ－７－デアザ－グアノシン（プレＱ０）、７－アミノメチル－７－デアザ－グアノシン（プレＱ１）、７－メチル－グアノシン（ｍ７Ｇ）、１－メチル－グアノシン（ｍ１Ｇ）、８－オキソ－グアノシン、７－メチル－８－オキソ－グアノシンが挙げられる。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド中の核酸塩基修飾ヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、５－メトキシウリジンである。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、少なくとも２つ（例えば、２、３、４またはそれより多く）の修飾核酸塩基の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＰＢＧＤをコードするｍＲＮＡポリヌクレオチド）中の核酸塩基の種類（例えば、ウラシル）の少なくとも９５％は、修飾核酸塩基である。いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＰＢＧＤをコードするｍＲＮＡポリヌクレオチド）中のウラシルの少なくとも９５％は、５－メトキシウラシルである。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、５－メトキシウリジン（５ｍｏ５Ｕ）及び５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、一様な修飾（例えば、完全な修飾、配列全体にわたる修飾）によって特定の修飾が為される。例えば、ポリヌクレオチドは、５－メトキシウリジンで一様に修飾することができ、ｍＲＮＡ配列中の実質的に全てのウリジン残基が５－メトキシウリジンで置換されることを意味する。同様に、ポリヌクレオチドを修飾残基（上記のいずれかのなど）で置換することによって、配列中に存在する任意の型のヌクレオシド残基に対して一様な修飾を行うことができる。
いくつかの実施形態において、修飾核酸塩基は、修飾シトシンである。
いくつかの実施形態において、修飾核酸塩基は、修飾ウラシルである。修飾ウラシルを有する核酸塩基及びヌクレオシドの例は、５－メトキシウラシルを含む。
いくつかの実施形態において、修飾核酸塩基は、修飾アデニンである。
いくつかの実施形態において、修飾核酸塩基は、修飾グアニンである。
いくつかの実施形態において、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム中の核酸塩基、糖、主鎖、またはそれらの任意の組み合わせは、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％もしくは１００％化学修飾される。
いくつかの実施形態において、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム中のウリジンヌクレオシドは、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％化学修飾される。
いくつかの実施形態において、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム中のアデノシンヌクレオシドは、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％化学修飾される。
いくつかの実施形態において、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム中のシチジンヌクレオシドは、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％化学修飾される。
いくつかの実施形態において、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム中のグアノシンヌクレオシドは、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％化学修飾される。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ヌクレオシド間の任意の有用なリンカーを含むことができる。そのようなリンカーで、本開示の組成物において有用な主鎖修飾を含むものとしては、限定されないが、下記のリンカーが挙げられる：３’－アルキレンホスホネート、３’－アミノホスホラミデート、アルケン含有主鎖、アミノアルキルホスホルアミデート、アミノアルキルホスホトリエステル、ボラノフォスフェート、－ＣＨ２－Ｏ－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＨ２－、キラルホスホネート、キラルホスホロチオエート、ギ酸アセチル及びチオギ酸アセチル主鎖、メチレン（メチルイミノ）、メチレンギ酸アセチル及びチオギ酸アセチル主鎖、メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ主鎖、モルホリノ結合、－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－ＣＨ２－、オリゴヌクレオシド－ヘテロ原子ヌクレオシド間結合、ホスフィネート、ホスホルアミデート、ホスホロジチオエート、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、ＰＮＡ、シロキサン主鎖、スルファメート主鎖、スルフィドスルホキシド及びスルホン主鎖、スルホネート及びスルホンアミド主鎖、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、及びチオノホスホラミデート。
（ｉｉ）糖修飾
修飾ヌクレオシド及びヌクレオチド（例えば、構成要素分子）で、ポリヌクレオチドへの組み込みが可能なもの（例えば、本明細書に記載されているＲＮＡまたはｍＲＮＡ）は、リボ核酸の糖上で修飾できる。例えば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）は、いくつかの異なる置換基で修飾または置換できる。２’位における例示的な置換としては、限定されるものではないが、Ｈ、ハロ、任意に置換されたＣ１－６アルキル、任意に置換されたＣ１－６アルコキシ、任意に置換されたＣ６－１０アリールオキシ、任意に置換されたＣ３－８シクロアルキル、任意に置換されたＣ３－８シクロアルコキシ、任意に置換されたＣ６－１０アリールオキシ、任意に置換されたＣ６－１０アリール－Ｃ１－６アルコキシ、任意に置換されたＣ１－１２（ヘテロシクリル）オキシ、糖（例えば、リボース、ペントース、または本明細書に記載の任意の糖）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、－Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲが挙げられ、式中、Ｒは、Ｈまたは任意に置換されたアルキル、及びｎは、整数０～２０（例えば、０～４、０～８、０～１０、０～１６、１～４、１～８、１～１０、１～１６、１～２０、２～４、２～８、２～１０、２～１６、２～２０、４～８、４～１０、４～１６及び４～２０）であり、２’－ヒドロキシルがＣ１－６アルキレンまたはＣ１－６ヘテロアルキレン架橋を介して同じリボース糖の４’－炭素に結合されている「ロック」核酸（ＬＮＡ）であり、例示的な架橋としては、メチレン、プロピレン、エーテル、またはアミノ架橋、本明細書中に定義されているアミノアルキル、本明細書中に定義されているアミノアルコキシ、本明細書中に定義されているアミノ、及び本明細書中に定義されているアミノ酸が挙げられる。
一般的に、ＲＮＡは酸素を有する５員環である糖基リボースを含む。例示的な修飾ヌクレオチドは、限定されないが、リボース中の酸素の置換（例えばＳ、Ｓｅ、またはメチレンもしくはエチレンなどのアルキレンで置換する）、二重結合の付加（例えば、シクロペンテニルまたはシクロヘキセニルでリボースを置換する）、リボースの環収縮（例えば、シクロブタンまたはオキセタンの４員環を形成する）、リボース環の拡大、（例えば、アンヒドロヘキシトール、アルトリトール、マンニトール、シクロヘキサニル、シクロヘキセニル及びモルホリノなどの、ホスホラミデート主鎖をも有するような追加の炭素もしくはヘテロ原子を有する６員環または７員環を形成する）、多環式形態（例えばトリシクロ）、及び「アンロック」形態、例えば、グリコール核酸（ＧＮＡ）（リボースがホスホジエステル結合に結合したグリコール単位で置換されているＲ－ＧＮＡまたはＳ－ＧＮＡ等）、トレオース核酸（リボースがα－Ｌ－トレオフラノシル－（３’→２’）で置換されているＴＮＡ）ならびにペプチド核酸（２－アミノ－エチル－グリシン結合によってリボース及びリン酸ジエステル主鎖が置換されるＰＮＡ）を含み得る。糖基はまた、リボース中の対応する炭素に対向する立体化学配置を有する、１つ以上の炭素を含むこともできる。ゆえに、ポリヌクレオチド分子は、例えばアラビノース含有ヌクレオチドを、糖として含み得る。そのような糖修飾は、国際特許公報第ＷＯ２０１３０５２５２３号、及びＷＯ２０１４０９３９２４号において教示されており、それらの各文献の全容は本明細書中に参照により組み込まれる。
（ｉｉｉ）修飾の組み合わせ
本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、または機能的断片もしくはそれらのバリアント）としては、糖、核酸塩基及び／またはヌクレオシド間結合への修飾の組み合わせを挙げることができる。それらの組み合わせは、本明細書中に記載されているいずれか１つ以上の修飾を含み得る。
修飾されたヌクレオチドの組み合わせを用いて、本発明のポリヌクレオチドを形成できる。別途注記のない限り、本発明のポリヌクレオチドの天然ヌクレオチドは、完全に置換することができる。一例として、限定されるものではないが、天然ヌクレオチドウリジンは、本明細書に記載の修飾ヌクレオシドで置換可能である。別の非限定的な例において、天然ヌクレオチドウリジンは、本明細書中に開示される修飾ヌクレオシドの少なくとも１つで部分的に置換または置き換えができる（例えば、約０．１％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９．９％）。塩基／糖またはリンカーの任意の組み合わせを本発明のポリヌクレオチド内に組み込むことが可能であり、そのような修飾は、国際特許公報（第ＷＯ２０１３０５２５２３号、及び第ＷＯ２０１４０９３９２４号）、及び米国特許出願公開（第ＵＳ２０１３０１１５２７２号、及び第ＵＳ２０１５０３０７５４２号）中に教示されている。これらの各文献の全容は本明細書中に参照により組み込まれる。
１１．非翻訳領域（ＵＴＲ）
非翻訳領域（ＵＴＲ）は、開始コドン（５’ＵＴＲ）の前、及び終止コドン（３’ＵＴＲ)後の、ポリヌクレオチドの翻訳されない核酸部分である。いくつかの実施形態において、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む本発明のポリヌクレオチド（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）などの、リボ核酸（ＲＮＡ））は更に、ＵＴＲ（例えば、５’ＵＴＲもしくはそれらの機能的断片、３’ＵＴＲもしくはそれらの機能的断片、またはそれらの組み合わせ）を含む。
ＵＴＲは、ポリヌクレオチド中のコード領域に対して相同または異種であり得る。いくつかの実施形態において、ＵＴＲは、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするＯＲＦに対して相同である。いくつかの実施形態において、ＵＴＲは、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするＯＲＦに対して異種である。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、２つ以上の５’ＵＴＲもしくはそれらの機能的断片を含み、これらの各々は同じまたは異なるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、２つ以上の３’ＵＴＲもしくはそれらの機能的断片を含み、これらの各々は同じまたは異なるヌクレオチド配列を有する。
いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲもしくはそれらの機能的断片、３’ＵＴＲもしくはそれらの機能的断片、またはそれらの任意の組み合わせは、配列最適化されている。
いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲもしくはそれらの機能的断片、３’ＵＴＲもしくはそれらの機能的断片、またはそれらの任意の組み合わせは、少なくとも１つの化学修飾された核酸塩基、例えば１－メチルシュードウリジンまたは５－メトキシウラシルを含む。
ＵＴＲは、安定性、局在化及び／もしくは翻訳効率の増強または低減などの、調節的役割を提供する特徴を有し得る。ＵＴＲを含むポリヌクレオチドを、細胞、組織、または生物に投与でき、常法を用いて１つ以上の調節機能を測定できる。いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲの機能的断片は、それぞれ全長５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲの１つ以上の調節機能を含む。
天然５’ＵＴＲは、翻訳開始における役割を果たす機能を有しており、リボソームが多くの遺伝子の翻訳を開始する過程に関与することが遍く知られている、コザック配列などのシグネチャを保持している。コザック配列は、コンセンサスＣＣＲ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧＧを有し、ここで、Ｒは、開始コドンの３塩基上流にあるプリン（アデニンまたはグアニン）（ＡＵＧ）であり、その後に別の「Ｇ」が続く。５’ＵＴＲはまた、伸長因子結合に関与する二次構造を形成することが知られている。
特定の標的器官内に豊富に発現する遺伝子において典型的に見出される特徴を、操作することにより、ポリヌクレオチドの安定性及びタンパク質の産生を増強できる。例えば、肝臓内に発現するｍＲＮＡの５’ＵＴＲ（アルブミン、血清アミロイドＡ、アポリポタンパク質Ａ／Ｂ／Ｅ、トランスフェリン、αフェトタンパク質、エリスロポエチンまたは第ＶＩＩＩ因子等）を導入することによって、肝細胞株または肝臓におけるポリヌクレオチドの発現を増強することができる。同様に、筋肉（例えば、ＭｙｏＤ、ミオシン、ミオグロビン、ミオゲニン、ヘルクリン）、内皮細胞（例えば、Ｔｉｅ-１、ＣＤ３６）、骨髄細胞（例えばＣ／ＥＢＰ、ＡＭＬ１、Ｇ-ＣＳＦ、ＧＭ-ＣＳＦ、ＣＤ１１ｂ、ＭＳＲ、Ｆｒ-１、ｉ-ＮＯＳ）、白血球（例えばＣＤ４５、ＣＤ１８）、脂肪組織（例えばＣＤ３６、ＧＬＵＴ４、ＡＣＲＰ３０、アディポネクチン）、及び肺上皮細胞（例えば、ＳＰ-Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ）では、他の組織特異的ｍＲＮＡからの５’ＵＴＲを用いて、その組織での発現を増進することができる。
いくつかの実施形態において、ＵＴＲは、タンパク質が共通の機能、構造、特徴または特性を共有する、転写物のファミリーから選択される。例えば、コードされたポリペプチドは、特定の細胞内、組織内または発達中のある時期に発現するタンパク質ファミリー（すなわち少なくとも１つの機能、構造、特徴、局在、起点または発現パターンを共有する）ファミリーに属し得る。遺伝子またはｍＲＮＡのいずれかに由来するＵＴＲを、同じまたは異なるファミリーのタンパク質の他の任意のＵＴＲと交換することによって、新規のポリヌクレオチドを作成することができる。
いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲは異種であり得る。いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲは、３’ＵＴＲとは異なる種に由来するものであり得る。いくつかの実施形態において、３’ＵＴＲは、５’ＵＴＲとは異なる種に由来するものであり得る。
全体が本明細書中に参照により組み込まれる共同所有の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２１５２２号（公開第ＷＯ／２０１４／１６４２５３号）には、ＯＲＦに対する隣接領域として本発明のポリヌクレオチド中に利用可能な例示的なＵＴＲのリストが提供される。
本出願の例示的なＵＴＲとしては、限定されるものではないが、以下の核酸配列に由来する、１つ以上の５’ＵＴＲ及び／もしくは３’ＵＴＲが挙げられる：グロビン、例えばαまたはβ－グロビン（例えば、ゼノパス、マウス、ラビット、またはヒトグロビン）；強力なコザック翻訳開始シグナル、ＣＹＢＡ（例えば、ヒトシトクロムｂ－２４５αポリペプチド）、アルブミン（例えば、ヒトアルブミン７）、ＨＳＤ１７Ｂ４（ヒドロキシステロイド（１７－β）脱水素酵素）、ウイルス（例えば、タバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、デング熱ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えばＣＭＶ即初期１（ＩＥ１））、肝炎ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）、シンドビスウイルス、またはＰＡＶオオムギ黄萎ウイルス）、熱ショックタンパク質（例えば、ｈｓｐ７０）、翻訳開始因子（例えば、ｅｌＦ４Ｇ）、グルコース輸送体（例えば、ｈＧＬＵＴ１（ヒトグルコース輸送体１））、アクチン（例えば、ヒトαまたはβアクチン）、ＧＡＰＤＨ、チューブリン、ヒストン、クエン酸サイクル酵素、トポイソメラーゼ（例えば、５’ＴＯＰモチーフを欠くＴＯＰ遺伝子（オリゴピリミジン領域）の５’ＵＴＲ））、リボソーマルタンパク質Ｌａｒｇｅ３２（Ｌ３２）；リボソーマルタンパク質（例えば、ｒｐｓ９などのヒトまたはマウスリボソーマルタンパク質）、ＡＴＰ合成酵素（例えば、ＡＴＰ５Ａ１またはミトコンドリアＨ＋－ＡＴＰ合成酵素のβサブユニット）、成長ホルモン（例えば、ウシ（ｂＧＨ）またはヒト（ｈＧＨ））、伸長因子（例えば、伸長因子１ α１（ＥＥＦ１Ａ１））、マンガンスーパーオキシドジスムターゼ（ＭｎＳＯＤ）、筋細胞エンハンサー因子２Ａ（ＭＥＦ２Ａ）、β－Ｆ１－ＡＴＰアーゼ、クレアチンキナーゼ、ミオグロビン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、コラーゲン（例えば、コラーゲンＩ型、アルファ２（Ｃｏｌ１Ａ２）、コラーゲンＩ型、アルファ１（Ｃｏｌ１Ａ１）、コラーゲンＶＩ型、アルファ２（Ｃｏｌ６Ａ２）、コラーゲンＶＩ型、アルファ１（Ｃｏｌ６Ａ１））、リボフォリン（例えば、リボフォリンＩ（ＲＰＮＩ））、低密度リポタンパク質受容体関連のタンパク質（例えば、ＬＲＰ１）、カルジオトロフィン様サイトカイン因子（例えば、Ｎｎｔ１）、カルレティキュリン（Ｃａｌｒ）、プロコラーゲン－リジン、２－オキソグルタレート５－ジオキシゲナーゼ１（Ｐｌｏｄ１）；ならびにヌクレオビンジン（例えば、Ｎｕｃｂ１）。
いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲは、βグロビン５’ＵＴＲ、強力なコザック翻訳開始シグナルを含む５’ＵＴＲ、シトクロムｂ－２４５ αポリペプチド（ＣＹＢＡ）５’ＵＴＲ、ヒドロキシステロイド（１７－β）脱水素酵素（ＨＳＤ１７Ｂ４）５’ＵＴＲ、タバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）５’ＵＴＲ、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＴＥＥＶ）５’ＵＴＲ、非構造タンパク質をコードするルベラ・ウイルス（ＲＶ）ＲＮＡの５’近位オープンリーディングフレーム、デングウイルス（ＤＥＮ）５’ＵＴＲ、熱ショックタンパク質７０（Ｈｓｐ７０）５’ＵＴＲ、ｅＩＦ４Ｇ ５’ＵＴＲ、ＧＬＵＴ１ ５’ＵＴＲ、それらの機能的断片、及びそれらの任意の組み合わせ。
いくつかの実施形態において、３’ＵＴＲは、βグロビン３’ＵＴＲ、ＣＹＢＡ ３’ＵＴＲ、アルブミン３’ＵＴＲ、成長ホルモン（ＧＨ）３’ＵＴＲ、ＶＥＥＶ ３’ＵＴＲ、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）３’ＵＴＲ、α－グロビン３’ＵＴＲ、ＤＥＮ ３’ＵＴＲ、オオムギ黄萎ウイルス（ＢＹＤＶ－ＰＡＶ）３’ＵＴＲ、伸長因子 １ α１（ＥＥＦ１Ａ１）３’ＵＴＲ、マンガンスーパーオキシドジスムターゼ（ＭｎＳＯＤ）３’ＵＴＲ、ミトコンドリアＨ（＋）－ＡＴＰ合成酵素（β－ｍＲＮＡ）のβサブユニット３’ＵＴＲ、ＧＬＵＴ１ ３’ＵＴＲ、ＭＥＦ２Ａ ３’ＵＴＲ、β－Ｆ１－ＡＴＰアーゼ３’ＵＴＲ、それらの機能的断片、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
任意の遺伝子またはｍＲＮＡに由来する野生型ＵＴＲを、本発明のポリヌクレオチドへ組み込むことができる。いくつかの実施形態において、ＵＴＲは、野生型または天然のＵＴＲに対して修飾し、例えばＯＲＦに対するＵＴＲの配向または位置の変更によって、あるいは追加のヌクレオチドの包含、ヌクレオチドの欠失、ヌクレオチドの交換もしくは転位によって、バリアントＵＴＲを生成できる。いくつかの実施形態では、５’もしくは３’ＵＴＲのバリアント（例えば、野生型ＵＴＲの変異体、あるいは１つ以上のヌクレオチドがＵＴＲの末端に付加されているかまたはそのＵＴＲの末端から除去されるバリアント）を利用できる。
加えて、１つ以上の合成ＵＴＲが、１つ以上の非合成ＵＴＲと併用され得る（例えば、Ｍａｎｄａｌ及びＲｏｓｓｉ，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２０１３ ８（３）：５６８－８２、ならびにｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／Ｄｅｒｒｉｃｋ＿Ｒｏｓｓｉ／で閲覧可能な配列を参照のこと。これらの各々の全容は本明細書中に参照により組み込まれる）。
ＵＴＲまたはその一部は、その選択元となった転写物におけるのと同じ向きに配置してもよいし、あるいは配向もしくは位置を変更してもよい。それゆえ、５’及び／または３’ＵＴＲを、反転、短縮、延長すること、または１つ以上の他の５’ＵＴＲもしくは３’ＵＴＲと併用することもできる。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、複数のＵＴＲ、例えば、二重、三重もしくは四重５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲを含む。例えば、２連ＵＴＲは、直列であるかまたは実質的に直列であるかのいずれかの、同じＵＴＲの２つのコピーを含む。例えば、二重ベータ－グロビン３’ＵＴＲを使用できる（米国特許出願公開第２０１０／０１２９８７７号を参照；本文献の全容は本明細書中に参照により組み込まれる）。
ある特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書中に開示されるＵＴＲのいずれかから選択される５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲは以下を含む。
５’ＵＴＲ－００１（上流ＵＴＲ）
（ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号３９）、
５’ＵＴＲ－００２（上流ＵＴＲ）
（ＧＧＧＡＧＡＵＣＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号４０）、
５’ＵＴＲ－００３（上流ＵＴＲ）（配列番号４１を参照）、
５’ＵＴＲ－００４（上流ＵＴＲ）
（ＧＧＧＡＧＡＣＡＡＧＣＵＵＧＧＣＡＵＵＣＣＧＧＵＡＣＵＧＵＵＧＧＵＡＡＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号４２）、
５’ＵＴＲ－００５（上流ＵＴＲ）
（ＧＧＧＡＧＡＵＣＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号４３）、
５’ＵＴＲ－００６（上流ＵＴＲ）（配列番号４４を参照）、
５’ＵＴＲ－００７（上流ＵＴＲ）
（ＧＧＧＡＧＡＣＡＡＧＣＵＵＧＧＣＡＵＵＣＣＧＧＵＡＣＵＧＵＵＧＧＵＡＡＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号４５）、
５’ＵＴＲ－００８（上流ＵＴＲ）
（ＧＧＧＡＡＵＵＡＡＣＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号４６）、
５’ＵＴＲ－００９（上流ＵＴＲ）
（ＧＧＧＡＡＡＵＵＡＧＡＣＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号４７）、
ＵＴＲ ５’ＵＴＲ－０１０、上流
（ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＵＡＡＡＧＡＡＣＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号４８）、
５’ＵＴＲ－０１１（上流ＵＴＲ）
（ＧＧＧＡＡＡＡＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＣＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号４９）、
５’ＵＴＲ－０１２（上流ＵＴＲ）
（ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＵＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号５０）、
５’ＵＴＲ－０１３（上流ＵＴＲ）
（ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＣＡＡＡＡＣＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号５１）、
５’ＵＴＲ－０１４（上流ＵＴＲ）
（ＧＧＧＡＡＡＵＵＡＧＡＧＡＧＵＡＡＡＧＡＡＣＡＧＵＡＡＧＵＡＧＡＡＵＵＡＡＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号５２）、
５’ＵＴＲ－１５（上流ＵＴＲ）
（ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＵＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号５３）、
５’ＵＴＲ－０１６（上流ＵＴＲ）
（ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＡＵＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号５４）、
５’ＵＴＲ－０１７（上流ＵＴＲ）
（ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＵＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号５５）、または
５’ＵＴＲ－０１８（上流ＵＴＲ）
（ＵＣＡＡＧＣＵＵＵＵＧＧＡＣＣＣＵＣＧＵＡＣＡＧＡＡＧＣＵＡＡＵＡＣＧＡＣＵＣＡＣＵＡＵＡＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号５６）。
いくつかの実施形態において、３’ＵＴＲは以下を含む。
１４２－３ｐ ３’ＵＴＲ（ｍｉＲ１４２－３ｐ結合部位を含むＵＴＲ）
（ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ）（配列番号５７）、
１４２－３ｐ ３’ＵＴＲ（ｍｉＲ１４２－３ｐ結合部位を含むＵＴＲ）
（ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ）（配列番号５８）、
１４２－３ｐ ３’ＵＴＲ（ｍｉＲ１４２－３ｐ結合部位を含むＵＴＲ）
（ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ）（配列番号５９）、
１４２－３ｐ ３’ＵＴＲ（ｍｉＲ１４２－３ｐ結合部位を含むＵＴＲ）
（ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ）（配列番号６０）、
１４２－３ｐ ３’ＵＴＲ（ｍｉＲ１４２－３ｐ結合部位を含むＵＴＲ）
（ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ）（配列番号６１）、
１４２－３ｐ ３’ＵＴＲ（ｍｉＲ１４２－３ｐ結合部位を含むＵＴＲ）
（ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ）（配列番号６２）、
１４２－３ｐ ３’ＵＴＲ（ｍｉＲ１４２－３ｐ結合部位を含むＵＴＲ）
（ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ）（配列番号６３）、
３’ＵＴＲ－００１（クレアチンキナーゼＵＴＲ）（配列番号６４を参照）；
３’ＵＴＲ－００２（ミオグロビンＵＴＲ）（配列番号６５を参照）、
３’ＵＴＲ－００３（αアクチンＵＴＲ）（配列番号６６を参照）、
３’ＵＴＲ－００４（アルブミンＵＴＲ）（配列番号６７を参照）、
３’ＵＴＲ－００５（αグロビンＵＴＲ）（配列番号６８を参照）、
３’ＵＴＲ－００６（Ｇ－ＣＳＦ ＵＴＲ）（配列番号６９を参照）、
３’ＵＴＲ－００７（Ｃｏｌ１ａ２、コラーゲン、Ｉ型、アルファ２ ＵＴＲ）（配列番号７０を参照）、
３’ＵＴＲ－００８（Ｃｏｌ６ａ２、コラーゲン、ＶＩ型、アルファ２ ＵＴＲ）（配列番号７１を参照）、
３’ＵＴＲ－００９（ＲＰＮ１、リボフォリンＩ ＵＴＲ）（配列番号７２を参照）、
３’ＵＴＲ－０１０（ＬＲＰ１、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１ ＵＴＲ）（配列番号７３を参照）、
３’ＵＴＲ－０１１（Ｎｎｔ１、カルジオトロフィン様サイトカイン因子１ＵＴＲ）（配列番号７４を参照）、
３’ＵＴＲ－０１２（Ｃｏｌ６ａ１、コラーゲンＶＩ型、アルファ１ＵＴＲ）（配列番号７５を参照）、
３’ＵＴＲ－０１３（Ｃａｌｒ、カルレティキュリンＵＴＲ）（配列番号７６を参照）、
３’ＵＴＲ－０１４（Ｃｏｌ１ａ１、コラーゲンＩ型、アルファ１ＵＴＲ）（配列番号７７を参照）、
３’ＵＴＲ－０１５（Ｐｌｏｄ１、プロコラーゲン－リジン、２－オキソグルタレート５－ジオキシゲナーゼ１ＵＴＲ）（配列番号７８を参照）、
３’ＵＴＲ－０１６（Ｎｕｃｂ１、ヌクレオビンジン１ＵＴＲ）（配列番号７９を参照）、
３’ＵＴＲ－０１７（α－グロビン）（配列番号８０を参照）、
３’ＵＴＲ－０１８（配列番号８１を参照）、
３’ＵＴＲ（ｍｉＲ１４２－３ｐ及びｍｉＲ１２６－３ｐ結合部位バリアント１）
ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＣＧＣＡＵＵＡＵＵＡＣＵＣＡＣＧＧＵＡＣＧＡＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ（配列番号１４９）、
３’ＵＴＲ（ｍｉＲ１４２－３ｐ及びｍｉＲ１２６－３ｐ結合部位バリアント２）
ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＵＡＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＣＧＣＡＵＵＡＵＵＡＣＵＣＡＣＧＧＵＡＣＧＡＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ（配列番号１５０）、又は
３’ＵＴＲ（ｍｉＲ１４２－３ｐ結合部位バリアント３）
ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＵＡＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ（配列番号１５１）。
ある特定の実施形態において、本発明の５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲ配列は、配列番号３９～５６、８３、１８９～１９１のいずれかを含む５’ＵＴＲ配列、及び／または配列番号５７～８１、８４、１４９～１５１、１６１～１７２、１９２～１９９、及びそれらの任意の組み合わせを含む３’ＵＴＲ配列からなる群から選択される配列に対して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％もしくは約１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。
本発明のポリヌクレオチドは、特徴の組み合わせを含むことができる。例えば、ＯＲＦは、強力なコザック翻訳開始シグナルを含む５’ＵＴＲ及び／またはオリゴ（ｄＴ）配列を含む３’ＵＴＲに隣接することによって、ポリＡ尾部の鋳型付加を実現している。５’ＵＴＲは、同じ及び／または異なるＵＴＲに由来する、第１のポリヌクレオチド断片及び第２のポリヌクレオチド断片を含むことができる（例えば、全体が本明細書中に参照により組み込まれる米国特許第ＵＳ２０１０／０２９３６２５号を参照）。
他の非ＵＴＲ配列を、本発明のポリヌクレオチド内部の領域またはサブ領域として用いることができる。例えば、イントロンまたはイントロン配列の一部を、本発明のポリヌクレオチドへ組み込むことができる。イントロン配列の組み込みによって、タンパク質の産生及びポリヌクレオチドの発現レベルを増強させることが可能である。いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ＵＴＲの代わりにまたはそれに加えて、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む（例えば、その全容が本明細書中に参照により組み込まれるＹａｋｕｂｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１０ ３９４（１）：１８９－１９３を参照）。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、５’ＵＴＲ配列の代わりにＩＲＥＳを含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＯＲＦ及びウイルスキャプシド配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、非合成３’ＵＴＲと合成５’ＵＴＲとの組み合わせを含む。
いくつかの実施形態において、ＵＴＲはまた、少なくとも１つの翻訳エンハンサーポリヌクレオチド、または翻訳エンハンサーエレメント（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｅｌｅｍｅｎｔもしくはｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｅｌｅｍｅｎｔ、「ＴＥＥ」と総称される、ポリヌクレオチドから産生されるポリペプチドもしくはタンパク質の量を増加させる核酸配列）を指す。ＴＥＥの例としては、限定されるものではないが、全体が本明細書中に参照により組み込まれる米国特許出願公開第２００９／０２２６４７０号に記載されているＴＥＥ、及び当該技術分野において公知の他のＴＥＥを挙げることができる。例えば、ＴＥＥは、限定されるものではないが、転写プロモーターと開始コドンとの間に位置し得る。いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲはＴＥＥを含む。
一態様において、ＴＥＥは、限定されないが、キャップ依存性またはキャップ非依存性翻訳などの核酸の翻訳活性を促進できるＵＴＲ中の保存されたエレメントである。
ＴＥＥの一例としては、限定されるものではないが、Ｇｔｘホメオドメインタンパク質の５’リーダー中のＴＥＥ配列を含む。Ｃｈａｐｐｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ２００４ １０１：９５９０－９５９４を参照のこと。本文献は、その全体が本明細書中に参照により組み込まれる。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ＴＥＥの１または複数のコピーを含む。翻訳エンハンサーポリヌクレオチド中のＴＥＥは、１つ以上の配列セグメントに編成できる。配列セグメントには、本明細書中に提供される１つ以上のＴＥＥを保持することができ、各ＴＥＥは１以上のコピーにて存在する。複数の配列セグメントは、翻訳エンハンサーポリヌクレオチド中に存在するときに、均一である場合もあればまたは不均一である場合もある。ゆえに、翻訳エンハンサーポリヌクレオチド中の複数の配列セグメントは、本明細書中に提供される同一もしくは異なる型のＴＥＥ、同一もしくは異なるコピー数の各ＴＥＥ、及び／または各配列セグメント内のＴＥＥの同一もしくは異なる組織を保有し得る。一実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、翻訳エンハンサーポリヌクレオチド配列を含む。ＴＥＥ配列の例としては、限定されるものではないが、米国特許出願公開第２０１４／０２００２６１号に記載されており、本文献の全容は本明細書中に参照により組み込まれる。
１２．マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位
本発明のポリヌクレオチドは、調節エレメント、例えば、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位、転写因子結合部位、構造化ｍＲＮＡ配列及び／またはモチーフ、内因性核酸結合分子のシュード受容体として作用するようにエンジニアリングされた人工結合部位、ならびにそれらの組み合わせを含むことができる。いくつかの実施形態において、そのような調節エレメントを含むポリヌクレオチドは、「センサー配列」を含むものと称される。センサー配列の例としては、限定されるものではないが、米国特許出願公開第２０１４／０２００２６１号に記載されており、本文献の全容は本明細書中に参照により組み込まれる。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、例えば本発明のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）などのリボ核酸（ＲＮＡ）は、目的ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、更に、１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位（複数可）を含む。ｍｉＲＮＡ結合部位の包含または取り込みによって、天然起源のｍｉＲＮＡの組織特異的な発現及び／または細胞型特異的な発現に基づいて、本発明のポリヌクレオチドの調節が行われ、更にはそれからコードされるポリペプチドの調節が行われる。
本発明ではまた、上記のいずれかのポリヌクレオチドを含む医薬組成物及び製剤も提供される。いくつかの実施形態において、組成物または製剤は更に、送達剤を含む。
いくつかの実施形態において、組成物または製剤には、ポリペプチドをコードする本明細書中に開示される配列最適化された核酸配列を含んだポリヌクレオチドが含有され得る。いくつかの実施形態において、組成物または製剤には、ポリペプチドをコードする本明細書に開示される配列最適化された核酸配列に対して著しい配列同一性を有するポリヌクレオチド（例えばＯＲＦ）を含んだポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）を含めることができる。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは更に、ｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、結合するｍｉＲＮＡ結合部位を含む。
例えば、天然起源のｍｉＲＮＡなどのｍｉＲＮＡは、安定性を低下させるか、またはポリヌクレオチドの翻訳を阻害することによって、ポリヌクレオチドに結合して遺伝子発現を下方制御する、１９～２５ヌクレオチド長の非コードＲＮＡである。ｍｉＲＮＡ配列は、「シード」領域、すなわち、成熟ｍｉＲＮＡの２～８位の領域の配列を含む。ｍｉＲＮＡシードは、成熟ｍｉＲＮＡの２～８位または２～７位を含むことができる。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡシードは、７ヌクレオチド（例えば成熟ｍｉＲＮＡのヌクレオチド２～８）を含み得、対応するｍｉＲＮＡ結合部位内のシード相補的部位には、ｍｉＲＮＡの１位に対向するアデノシン（Ａ）が隣接する。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡシードは、６ヌクレオチド（例えば成熟ｍｉＲＮＡのヌクレオチド２～７）を含み得、対応するｍｉＲＮＡ結合部位内のシード相補的部位には、ｍｉＲＮＡの１位に対向するアデノシン（Ａ）が隣接している。例えば、Ｇｒｉｍｓｏｎ Ａ，Ｆａｒｈ ＫＫ，Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ＷＫ，Ｇａｒｒｅｔｔ－Ｅｎｇｅｌｅ Ｐ，Ｌｉｍ ＬＰ，Ｂａｒｔｅｌ ＤＰ；Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２００７ Ｊｕｌ ６；２７（１）：９１－１０５を参照のこと。標的細胞または組織のｍｉＲＮＡプロファイリングを実施することで、その細胞または組織中にｍｉＲＮＡが存在するかどうかを判定することができる。いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、メッセンジャーＲＮA（ｍＲＮＡ）のようなリボ核酸（ＲＮＡ））は、１つ以上のマイクロＲＮＡ結合部位、マイクロＲＮＡ標的配列、マイクロＲＮＡ相補配列、またはマイクロＲＮＡシード相補配列を含む。そのような配列は、例えば、その内容全体が本明細書中に参照により組み込まれる米国特許出願公開第ＵＳ２００５／０２６１２１８号及び米国特許出願公開第ＵＳ２００５／００５９００５号中に教示されているもの等の、公知の任意のマイクロＲＮＡに対応している、例えば、それらのマイクロＲＮＡに対する相補性を有し得る。
マイクロＲＮＡは、プレｍｉＲＮＡ（前駆体－ｍｉＲＮＡ）と呼ばれることが多い短いヘアピン構造を形成するように折り畳まれたＲＮＡ転写物の領域から酵素的に誘発される。プレｍｉＲＮＡは典型的に、その３’末端に２ヌクレオチドオーバーハングを有し、３’ヒドロキシル基と５’ホスフェート基とを有する。この前駆体ｍＲＮＡは、核内で処理され、続いて細胞質に輸送され、ＤＩＣＥＲ（ＲＮａｓｅＩＩＩ酵素）により更に処理され、およそ２２ヌクレオチドの成熟マイクロＲＮＡを形成する。続いて、成熟マイクロＲＮＡは、リボ核粒子中に取り込まれ、遺伝子サイレンシングを媒介するＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を形成する。成熟ｍｉＲＮＡの当該技術分野で認識されている命名法は典型的に、成熟ｍｉＲＮＡが由来するプレｍｉＲＮＡの群が指定される。「５ｐ」は、マイクロＲＮＡがプレｍｉＲＮＡヘアピンの５’群由来であることを意味し、「３ｐ」は、マイクロＲＮＡがプレｍｉＲＮＡヘアピンの３’末端に由来することを意味する。本明細書中にて番号で参照されるｍｉＲは、同じプレｍｉＲＮＡの反対の群（例えば、３ｐまたは５ｐマイクロＲＮＡのいずれか）に由来する２つの成熟マイクロＲＮＡのいずれかを指すことができる。本明細書中で言及されている全てのｍｉＲは、特に３ｐまたは５ｐを指定して特定されていない限り、３ｐ及び５ｐアーム／配列の両方を含むことを意図したものである。
本明細書において「マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲ）結合部位」という用語は、ｍｉＲＮＡと相互作用するか、会合するか、またはｍｉＲＮＡに結合するのに十分なｍｉＲＮＡの全部もしくは一部の領域に対する相補性を有する、５’ＵＴＲ及び／もしくは３’ＵＴＲを含む、例えばＤＮＡ内もしくはＲＮＡ転写物内のポリヌクレオチド内の配列を指す。いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは目的ポリペプチドをコードするＯＲＦを含み、更に、１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位（複数可）を含む。例示的な実施形態において、ポリヌクレオチド、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）などのリボ核酸（ＲＮＡ）の５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲは、１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位（複数可）を含む。
ｍｉＲＮＡに対して十分な相補性を有するｍｉＲＮＡ結合部位とは、ポリヌクレオチドのｍｉＲＮＡ媒介性調整（例えばポリヌクレオチドのｍｉＲＮＡ媒介性翻訳の抑制または分解）を促すうえで相補性の度合いが十分であることを指す。本発明の例示的な態様において、ｍｉＲＮＡに対して十分な相補性を有するｍｉＲＮＡ結合部位とは、ポリヌクレオチドのｍｉＲＮＡ媒介分解、例えば、ｍｉＲＮＡガイド付きＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を媒介してｍＲＮＡの切断を促進するうえで、相補性の度合いが十分であることを指す。ｍｉＲＮＡ結合部位は、例えば１９～２５ヌクレオチド長のｍｉＲＮＡ配列、１９～２３ヌクレオチド長のｍｉＲＮＡ配列、または２２ヌクレオチド長のｍｉＲＮＡ配列に対して相補性を有し得る。ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡの一部のみに対して相補的であり得る。例えば、天然起源のｍｉＲＮＡ配列の全長より１ヌクレオチド少ないか、２ヌクレオチド少ないか、３ヌクレオチド少ないかまたは４ヌクレオチド少ない部分に対して、あるいは、天然起源のｍｉＲＮＡ配列より１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチドまたは４ヌクレオチド短い部分に対して、ｍｉＲＮＡ結合部位は相補的であり得る。ｍＲＮＡの分解が、調節として所望される場合、相補性が十分であるかまたは完全である（例えば、天然起源のｍｉＲＮＡ全長の全部分またはかなりの部分にわたって相補性が十分であるかまたは完全である）ことが好ましい。
いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡシード配列との相補性（例えば、部分的または完全な相補性）を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡシード配列との完全な相補性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ配列との相補性（例えば、部分的または完全な相補性）を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ配列との完全な相補性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ただし、１、２もしくは３個のヌクレオチド置換、末端付加及び／または末端切断を除いて、ｍｉＲＮＡ配列との完全な相補性を有する。
いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡと長さが同じである。他の実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位は、５’末端、３’末端またはその両方で対応するｍｉＲＮＡよりも１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１１ヌクレオチドもしくは１２ヌクレオチド短い。更に他の実施形態において、マイクロＲＮＡ結合部位は、対応する５’末端、３’末端、またはその両方でマイクロＲＮＡよりも２ヌクレオチド短い。対応するｍｉＲＮＡよりも短いｍｉＲＮＡ結合部位は、依然としてｍｉＲＮＡ結合部位のうちの１以上を組み込んだｍＲＮＡを分解することができ、またはｍＲＮＡの翻訳を妨げることができる。
いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ダイサーを含む活性ＲＩＳＣの一部である対応する成熟ｍｉＲＮＡに結合する。別の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位をＲＩＳＣ中の対応するｍｉＲＮＡに結合することによって、ｍｉＲＮＡ結合部位を含むｍＲＮＡを分解するか、あるいはｍＲＮＡが翻訳されるのを防ぐ。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡを含むＲＩＳＣ複合体によってｍｉＲＮＡ結合部位を含むポリヌクレオチドが切断する程度に、ｍｉＲＮＡに対する相補性が十分である。他の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位の相補性が不完全なことに起因して、ｍｉＲＮＡを含むＲＩＳＣ複合体によって、ｍｉＲＮＡ結合部位を含むポリヌクレオチドにおける不安定性が誘発される。別の実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位の相補性が不完全なことに起因して、ｍｉＲＮＡを含むＲＩＳＣ複合体によって、ｍｉＲＮＡ結合部位を含むポリヌクレオチドの転写が抑制される。
いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡに対する不整合部を１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個有する。
いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡの、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、または少なくとも約２１の連続ヌクレオチドに対して相補的な、それぞれ少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、または少なくとも約２１の連続ヌクレオチドを有する。
１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位を本発明のポリヌクレオチドへ操作することによって、当該のｍｉＲＮＡが利用可能な場合、そのポリヌクレオチドを分解または翻訳低下の標的とすることが可能となる。こうすることで、ポリヌクレオチドが送達される際、オフターゲット効果を低減させることができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドが、組織または細胞に送達されることは意図されないが、最終的に前記組織または細胞に帰結するものである場合、組織または細胞内に多く存在するｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡの１つ以上の結合部位をポリヌクレオチドの５’ＵＴＲ及び／もしくは３’ＵＴＲへ操作することで、目的の遺伝子の発現を阻害し得る。ゆえに、いくつかの実施形態において、１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位を本開示のｍＲＮＡ内に組み込むことによって、ｍｉＲＮＡの１つ以上の結合部位をポリヌクレオチドの５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲへ操作することで、目的の遺伝子の発現を阻害し得る。更に他の実施形態において、１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位を本開示のｍＲＮＡ内に組み込むことによって、核酸をｉｎ ｖｉｖｏ送達する際の免疫応答を調節することができる。更なる実施形態において、１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位を本開示のｍＲＮＡ内に組み込むことによって、本明細書に記載の脂質含有化合物及び組成物に対する加速的血中（ＡＢＣ）を調節することができる。
逆に、ｍｉＲＮＡ結合部位は、天然起源のポリヌクレオチド配列から除去することで、特定の組織におけるタンパク質の発現を増強させることができる。例えば、特定のｍｉＲＮＡ用の結合部位をポリヌクレオチドから除去することで、ｍｉＲＮＡを含む組織または細胞内でのタンパク質の発現を増進することができる。
複数の組織における発現の調節は、１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位（例えば、１つ以上の別個のｍｉＲＮＡ結合部位の導入または除去によって達成することができる。発症及び／もしくは疾患状態にある組織ならびに／または細胞内でのｍｉＲＮＡ発現パターン及び／もしくはそのプロファイリングに基づいて、ｍｉＲＮＡ結合部位を除去するかそれとも挿入するかの決定を下すことができる。ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ結合部位及びそれらの発現パターンの同定、ならびに生物学における役割が報告されている（例えば、Ｂｏｎａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ ２０１０ １１：９４３－９４９、Ａｎａｎｄ ａｎｄ Ｃｈｅｒｅｓｈ Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ ２０１１ １８：１７１－１７６、Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ及びＲａｏ Ｌｅｕｋｅｍｉａ ２０１２ ２６：４０４－４１３（２０１１ Ｄｅｃ ２０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｌｅｕ．２０１１．３５６）、Ｂａｒｔｅｌ Ｃｅｌｌ ２００９ １３６：２１５－２３３、Ｌａｎｄｇｒａｆ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ，２００７ １２９：１４０１－１４１４、Ｇｅｎｔｎｅｒ ａｎｄ Ｎａｌｄｉｎｉ，Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ．２０１２ ８０：３９３－４０３、ならびにこれらの文献中の全ての参考文献。これらの各文献はその全体が本明細書中に参照により組み込まれる）。
ｍｉＲＮＡｓ及びｍｉＲＮＡ結合部位は、全体が本明細書中に参照により組み込まれる米国特許出願公開第２０１４／０２００２６１号、同第２００５／０２６１２１８号、及び同第２００５／００５９００５号に記載されている任意の既知の配列に対応し得る。
ｍｉＲＮＡがｍＲＮＡを調節することによってタンパク質の発現を調節することが知られている組織の例としては、限定されるものではないが、肝臓（ｍｉＲ－１２２）、筋肉（ｍｉＲ－１３３、ｍｉＲ－２０６、ｍｉＲ－２０８）、内皮細胞（ｍｉＲ－１７－９２、ｍｉＲ－１２６）、骨髄細胞（ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－２７）、脂肪組織（ｌｅｔ－７、ｍｉＲ－３０ｃ）、心臓（ｍｉＲ－１ｄ、ｍｉＲ－１４９）、腎臓（ｍｉＲ－１９２、ｍｉＲ－１９４、ｍｉＲ－２０４）、及び肺上皮細胞（ｌｅｔ－７、ｍｉＲ－１３３、ｍｉＲ－１２６）が挙げられる。
具体的には、ｍｉＲＮＡは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）などの免疫細胞（別称：造血細胞）（例えば、樹状細胞及びマクロファージ）；マクロファージ、単球、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、顆粒球、ナチュラルキラー細胞等において差次的に発現することが知られている。免疫細胞特異的ｍｉＲＮＡは、免疫原性、自己免疫、感染に対する免疫応答、炎症、ならびに遺伝子治療及び組織／器官移植後の望ましくない免疫応答に関与する。また、造血細胞（免疫細胞）の発達、増殖、分化及びアポトーシスの局面の多くが、免疫細胞特異的ｍｉＲＮＡによって調節される。例えば、ｍｉＲ－１４２及びｍｉＲ－１４６は免疫細胞においてのみ、特に骨髄性樹状細胞内で豊富に発現する。これまで実証されてきたように、ポリヌクレオチドに対する免疫応答は、ｍｉＲ－１４２結合部位をポリヌクレオチドの３’ＵＴＲに付加することにより遮断することができ、組織及び細胞内での遺伝子導入の安定性向上を可能にする。ｍｉＲ－１４２は、抗原提示細胞内で外因性ポリヌクレオチドを効率的に分解し、形質導入細胞の細胞傷害性排除を抑制する（例えば、Ａｎｎｏｎｉ Ａ ｅｔ ａｌ．，ｂｌｏｏｄ，２００９，１１４，５１５２－５１６１；Ｂｒｏｗｎ ＢＤ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ ｍｅｄ．２００６，１２（５），５８５－５９１；Ｂｒｏｗｎ ＢＤ，ｅｔ ａｌ．，ｂｌｏｏｄ，２００７，１１０（１３）：４１４４－４１５２。これらの各文献はその全体が本明細書中に参照により組み込まれる）。
抗原媒介性免疫応答は、生物に進入する際に抗原提示細胞によって処理され、抗原提示細胞の表面上に提示される、外来抗原によって誘発される免疫応答を指す。Ｔ細胞は、提示された抗原を認識して、抗原を発現する細胞の細胞傷害性排除を誘導することができる。
本発明のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲにｍｉＲ－１４２結合部位を導入し、ｍｉＲ－１４２媒介性分解を通じて抗原提示細胞内での遺伝子発現を選択的に抑制することによって、抗原提示細胞（例えば樹状細胞）内での抗原提示を制限し、それによりポリヌクレオチドの送達後の抗原媒介性免疫応答を防ぐことができる。次いで、ポリヌクレオチドは、細胞傷害性排除を誘発することなしに、標的組織または細胞内で安定に発現する。
一実施形態において、免疫細胞、特に抗原提示細胞内に発現することが公知であるｍｉＲＮＡのための結合部位を本発明のポリヌクレオチドへ操作することで、ｍｉＲＮＡ介在性ＲＮＡの分解によって抗原提示細胞内でのポリヌクレオチドの発現を抑制し、抗原媒介性免疫応答を抑制することができる。非免疫細胞内では、免疫細胞特異的ｍｉＲＮＡが発現しないため、ポリヌクレオチドの発現が維持される。例えば、いくつかの実施形態では、肝臓特異的タンパク質に対する免疫原性反応を防ぐために、任意のｍｉＲ－１２２結合部位を除去し、ｍｉＲ－１４２（及び／またはｍｉｒＲ－１４６）結合部位を、本発明のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲ及び／もしくは３’ＵＴＲへ操作することが可能である。
ＡＰＣ及びマクロファージにおける選択的な分解及び抑制を更に駆動するために、本発明のポリヌクレオチドは、５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲ内に、更なる負の調節エレメントを単独で、あるいはｍｉＲ－１４２及び／またはｍｉＲ－１４６結合部位と組み合わせて含めることができる。更なる負の調節エレメントの例としては、構成的減衰エレメント（ＣＤＥ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
免疫細胞特異的なｍｉＲＮＡとしては、限定されるものではないが、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－２－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－３ｐ、ｈｓａ－７ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｃ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｅ－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｉ－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｉ－５ｐ、ｍｉＲ－１０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１１８４、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－１－－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－２－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ、ｍｉＲ－１２５ｂ－１－３ｐ、ｍｉＲ－１２５ｂ－２－３ｐ、ｍｉＲ－１２５ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１２７９、ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１３０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１３２－３ｐ、ｍｉＲ－１３２－５ｐ、ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｍｉＲ－１４３－３ｐ、ｍｉＲ－１４３－５ｐ、ｍｉＲ－１４６ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１４６ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１４６ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１４７ａ、ｍｉＲ－１４７ｂ、ｍｉＲ－１４８ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１４８ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１５０－３ｐ、ｍｉＲ－１５０－５ｐ、ｍｉＲ－１５１ｂ、ｍｉＲ－１５５－３ｐ、ｍｉＲ－１５５－５ｐ、ｍｉＲ－１５ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１５ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１５ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１５ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１６－１－３ｐ、ｍｉＲ－１６－２－３ｐ、ｍｉＲ－１６－５ｐ、ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｍｉＲ－１８１ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１８１ａ－２－３ｐ、ｍｉＲ－１８２－３ｐ、ｍｉＲ－１８２－５ｐ、ｍｉＲ－１９７－３ｐ、ｍｉＲ－１９７－５ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｍｉＲ－２１－３ｐ、ｍｉＲ－２１４－３ｐ、ｍｉＲ－２１４－５ｐ、ｍｉＲ－２２３－３ｐ、ｍｉＲ－２２３－５ｐ、ｍｉＲ－２２１－３ｐ、ｍｉＲ－２２１－５ｐ、ｍｉＲ－２３ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２３ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２４－１－５ｐ、ｍｉＲ－２４－２－５ｐ、ｍｉＲ－２４－３ｐ、ｍｉＲ－２６ａ－１－３ｐ、ｍｉＲ－２６ａ－２－３ｐ、ｍｉＲ－２６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２６ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２７ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２７ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２７ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２７ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２８－３ｐ、ｍｉＲ－２８－５ｐ、ｍｉＲ－２９０９、ｍｉＲ－２９ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２９ｂ－１－５ｐ、ｍｉＲ－２９ｂ－２－５ｐ、ｍｉＲ－２９ｃ－３ｐ、ｍｉＲ－２９ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｅ－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｍｉＲ－３３１－５ｐ、ｍｉＲ－３３９－３ｐ、ｍｉＲ－３３９－５ｐ、ｍｉＲ－３４５－３ｐ、ｍｉＲ－３４５－５ｐ、ｍｉＲ－３４６、ｍｉＲ－３４ａ－３ｐ、ｍｉＲ－３４ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３６３－３ｐ、ｍｉＲ－３６３－５ｐ、ｍｉＲ－３７２、ｍｉＲ－３７７－３ｐ、ｍｉＲ－３７７－５ｐ、ｍｉＲ－４９３－３ｐ、ｍｉＲ－４９３－５ｐ、ｍｉＲ－５４２、ｍｉＲ－５４８ｂ－５ｐ、ｍｉＲ５４８ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－５４８ｉ、ｍｉＲ－５４８ｊ、ｍｉＲ－５４８ｎ、ｍｉＲ－５７４－３ｐ、ｍｉＲ－５９８、ｍｉＲ－７１８、ｍｉＲ－９３５、ｍｉＲ－９９ａ－３ｐ、ｍｉＲ－９９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－９９ｂ－３ｐ、及びｍｉＲ－９９ｂ－５ｐが挙げられる。更になお、マイクロアレイハイブリダイゼーション及びミクロトーム分析によって免疫細胞において新規なｍｉＲＮＡを同定することができる（例えば、Ｊｉｍａ ＤＤ ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ，２０１０，１１６：ｅ１１８－ｅ１２７、Ｖａｚ Ｃ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０１０，１１，２８８を参照）。それらの各文献の全容は本明細書中に参照により組み込まれる。
肝臓内に発現することが公知であるｍｉＲＮＡとしては、限定されるものではないが、ｍｉＲ－１０７、ｍｉＲ－１２２－３ｐ、ｍｉＲ－１２２－５ｐ、ｍｉＲ－１２２８－３ｐ、ｍｉＲ－１２２８－５ｐ、ｍｉＲ－１２４９、ｍｉＲ－１２９－５ｐ、ｍｉＲ－１３０３、ｍｉＲ－１５１ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１５１ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１５２、ｍｉＲ－１９４－３ｐ、ｍｉＲ－１９４－５ｐ、ｍｉＲ－１９９ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１９９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１９９ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１９９ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２９６－５ｐ、ｍｉＲ－５５７、ｍｉＲ－５８１、ｍｉＲ－９３９－３ｐ、及びｍｉＲ－９３９－５ｐが挙げられる。任意の肝臓特異的なｍｉＲＮＡ由来のｍｉＲＮＡ結合部位を本発明のポリヌクレオチドに導入するかまたは除去することで、肝臓内でのポリヌクレオチドの発現を調節することができる。肝臓特異的なｍｉＲＮＡ結合部位を単独で操作することも、または本発明のポリヌクレオチド中の免疫細胞（例えばＡＰＣ）のｍｉＲＮＡ結合部位と更に組み合わせて、操作することもできる。
肺内に発現することが公知であるｍｉＲＮＡとしては、限定されるものではないが、ｌｅｔ－７ａ－２－３ｐ、ｌｅｔ－７ａ－３ｐ、ｌｅｔ－７ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｍｉＲ－１２６－５ｐ、ｍｉＲ－１２７－３ｐ、ｍｉＲ－１２７－５ｐ、ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１３０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１３０ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１３０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－１３３ｂ、ｍｉＲ－１３４、ｍｉＲ－１８ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１８ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１８ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１８ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２４－１－５ｐ、ｍｉＲ－２４－２－５ｐ、ｍｉＲ－２４－３ｐ、ｍｉＲ－２９６－３ｐ、ｍｉＲ－２９６－５ｐ、ｍｉＲ－３２－３ｐ、ｍｉＲ－３３７－３ｐ、ｍｉＲ－３３７－５ｐ、ｍｉＲ－３８１－３ｐ、及びｍｉＲ－３８１－５ｐが挙げられる。任意の肺特異的ｍｉＲＮＡに由来するｍｉＲＮＡ結合部位を、本発明のポリヌクレオチドに導入するか、または除去することによって、肺内でのポリヌクレオチドの発現を調節することができる。肺特異的なｍｉＲＮＡ結合部位を単独で操作することも、または本発明のポリヌクレオチド中の免疫細胞（例えばＡＰＣ）のｍｉＲＮＡ結合部位と更に組み合わせて、操作することもできる。
心臓内に発現することが公知であるｍｉＲＮＡとしては、限定されるものではないが、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－１３３ｂ、ｍｉＲ－１４９－３ｐ、ｍｉＲ－１４９－５ｐ、ｍｉＲ－１８６－３ｐ、ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｍｉＲ－２０８ａ、ｍｉＲ－２０８ｂ、ｍｉＲ－２１０、ｍｉＲ－２９６－３ｐ、ｍｉＲ－３２０、ｍｉＲ－４５１ａ、ｍｉＲ－４５１ｂ、ｍｉＲ－４９９ａ－３ｐ、ｍｉＲ－４９９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－４９９ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－４９９ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－７４４－３ｐ、ｍｉＲ－７４４－５ｐ、ｍｉＲ－９２ｂ－３ｐ、及びｍｉＲ－９２ｂ－５ｐが挙げられる。任意の心臓特異的マイクロＲＮＡに由来するｍｉＲＮＡ（ｍＭｉＲＮＡ）結合部位を、本発明のポリヌクレオチド内に導入するかまたはそのポリヌクレオチドから除去することで、心臓におけるポリヌクレオチドの発現を調節することができる。心臓特異的なｍｉＲＮＡ結合部位を単独で操作することも、または本発明のポリヌクレオチド中の免疫細胞（例えばＡＰＣ）のｍｉＲＮＡ結合部位と更に組み合わせて、操作することも可能である。
神経系内に発現することが公知であるｍｉＲＮＡとしては、限定されるものではないが、ｍｉＲ－１２４－５ｐ、ｍｉＲ－１２５ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１２５ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１２５ｂ－１－３ｐ、ｍｉＲ－１２５ｂ－２－３ｐ、ｍｉＲ－１２５ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１２７１－３ｐ、ｍｉＲ－１２７１－５ｐ、ｍｉＲ－１２８、ｍｉＲ－１３２－５ｐ、ｍｉＲ－１３５ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１３５ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１３５ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１３５ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１３７、ｍｉＲ－１３９－５ｐ、ｍｉＲ－１３９－３ｐ、ｍｉＲ－１４９－３ｐ、ｍｉＲ－１４９－５ｐ、ｍｉＲ－１５３、ｍｉＲ－１８１ｃ－３ｐ、ｍｉＲ－１８１ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－１８３－３ｐ、ｍｉＲ－１８３－５ｐ、ｍｉＲ－１９０ａ、ｍｉＲ－１９０ｂ、ｍｉＲ－２１２－３ｐ、ｍｉＲ－２１２－５ｐ、ｍｉＲ－２１９－１－３ｐ、ｍｉＲ－２１９－２－３ｐ、ｍｉＲ－２３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｃ－１－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｃ－２－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｄ－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｄ－５ｐ、ｍｉＲ－３２９、ｍｉＲ－３４２－３ｐ、ｍｉＲ－３６６５、ｍｉＲ－３６６６、ｍｉＲ－３８０－３ｐ、ｍｉＲ－３８０－５ｐ、ｍｉＲ－３８３、ｍｉＲ－４１０、ｍｉＲ－４２５－３ｐ、ｍｉＲ－４２５－５ｐ、ｍｉＲ－４５４－３ｐ、ｍｉＲ－４５４－５ｐ、ｍｉＲ－４８３、ｍｉＲ－５１０、ｍｉＲ－５１６ａ－３ｐ、ｍｉＲ－５４８ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－５４８ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－５７１、ｍｉＲ－７－１－３ｐ、ｍｉＲ－７－２－３ｐ、ｍｉＲ－７－５ｐ、ｍｉＲ－８０２、ｍｉＲ－９２２、ｍｉＲ－９－３ｐ、及びｍｉＲ－９－５ｐが挙げられる。神経系内で富化されるｍｉＲＮＡとしては更に、ｍｉＲ－１３２－３ｐ、ｍｉＲ－１３２－３ｐ、ｍｉＲ－１４８ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１４８ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１５１ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１５１ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２１２－３ｐ、ｍｉＲ－２１２－５ｐ、ｍｉＲ－３２０ｂ、ｍｉＲ－３２０ｅ、ｍｉＲ－３２３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－３２３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３２４－５ｐ、ｍｉＲ－３２５、ｍｉＲ－３２６、ｍｉＲ－３２８、ｍｉＲ－９２２を含むがこれらに限定されないニューロン内で特異的に発現するｍｉＲＮＡ、ならびにｍｉＲ－１２５０、ｍｉＲ－２１９－１－３ｐ、ｍｉＲ－２１９－２－３ｐ、ｍｉＲ－２１９－５ｐ、ｍｉＲ－２３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３０６５－３ｐ、ｍｉＲ－３０６５－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｅ－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｍｉＲ－３２－５ｐ、ｍｉＲ－３３８－５ｐ、及びｍｉＲ－６５７を含むがこれらに限定されないグリア細胞内で特異的に発現するｍｉＲＮＡが挙げられる。任意のＣＮＳ特異的なｍｉＲＮＡに由来するｍｉＲＮＡ結合部位を、本発明のポリヌクレオチドに導入するかまたはこのポリヌクレオチドから除去することによって、神経系内でのポリヌクレオチドの発現を調節することができる。神経系特異的なｍｉＲＮＡ結合部位を単独で操作することも、または本発明のポリヌクレオチド中の免疫細胞（例えばＡＰＣ）のｍｉＲＮＡ結合部位と更に組み合わせて、操作することもできる。
膵臓内に発現することが公知であるｍｉＲＮＡとしては、限定されるものではないが、ｍｉＲ－１０５－３ｐ、ｍｉＲ－１０５－５ｐ、ｍｉＲ－１８４、ｍｉＲ－１９５－３ｐ、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９６ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１９６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２１４－３ｐ、ｍｉＲ－２１４－５ｐ、ｍｉＲ－２１６ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２１６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－３３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－３３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３７５、ｍｉＲ－７－１－３ｐ、ｍｉＲ－７－２－３ｐ、ｍｉＲ－４９３－３ｐ、ｍｉＲ－４９３－５ｐ、及びｍｉＲ－９４４が挙げられる。任意の膵臓特異的ｍｉＲＮＡに由来するｍｉＲＮＡ結合部位を、本発明のポリヌクレオチド内に導入するかまたはそのポリヌクレオチドから除去することで、膵臓におけるポリヌクレオチドの発現を調節することができる。膵臓特異的なｍｉＲＮＡ結合部位を単独で操作することも、または本発明のポリヌクレオチド中の免疫細胞（例えばＡＰＣ）のｍｉＲＮＡ結合部位と更に組み合わせて、操作することもできる。
腎臓内に発現することが公知であるｍｉＲＮＡとしては、限定されるものではないが、ｍｉＲ－１２２－３ｐ、ｍｉＲ－１４５－５ｐ、ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｍｉＲ－１９２－３ｐ、ｍｉＲ－１９２－５ｐ、ｍｉＲ－１９４－３ｐ、ｍｉＲ－１９４－５ｐ、ｍｉＲ－２０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２０４－３ｐ、ｍｉＲ－２０４－５ｐ、ｍｉＲ－２１０、ｍｉＲ－２１６ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２１６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２９６－３ｐ、ｍｉＲ－３０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－３０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｃ－１－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｃ－２－３ｐ、ｍｉＲ３０ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－３２４－３ｐ、ｍｉＲ－３３５－３ｐ、ｍｉＲ－３３５－５ｐ、ｍｉＲ－３６３－３ｐ、ｍｉＲ－３６３－５ｐ、及びｍｉＲ－５６２が挙げられる。任意の腎臓特異的ｍｉＲＮＡに由来するｍｉＲＮＡ結合部位を、本発明のポリヌクレオチド内に導入するかまたはそのポリヌクレオチドから除去することで、腎臓におけるポリヌクレオチドの発現を調節することができる。腎臓特異的なｍｉＲＮＡ結合部位を単独で操作することも、または本発明のポリヌクレオチド中の免疫細胞（例えばＡＰＣ）のｍｉＲＮＡ結合部位と更に組み合わせて、操作することもできる。
筋肉内に発現することが公知であるｍｉＲＮＡとしては、限定されるものではないが、ｌｅｔ－７ｇ－３ｐ、ｌｅｔ－７ｇ－５ｐ、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－１２８６、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－１３３ｂ、ｍｉＲ－１４０－３ｐ、ｍｉＲ－１４３－３ｐ、ｍｉＲ－１４３－５ｐ、ｍｉＲ－１４５－３ｐ、ｍｉＲ－１４５－５ｐ、ｍｉＲ－１８８－３ｐ、ｍｉＲ－１８８－５ｐ、ｍｉＲ－２０６、ｍｉＲ－２０８ａ、ｍｉＲ－２０８ｂ、ｍｉＲ－２５－３ｐ、及びｍｉＲ－２５－５ｐが挙げられる。任意の筋肉特異的なｍｉＲＮＡ由来のｍｉＲＮＡ結合部位を本発明のポリヌクレオチドに導入するかまたは除去することで、筋肉内でのポリヌクレオチドの発現を調節することができる。筋肉特異的なｍｉＲＮＡ結合部位を単独で操作することも、または本発明のポリヌクレオチド中の免疫細胞（例えばＡＰＣ）のｍｉＲＮＡ結合部位と更に組み合わせて、操作することもできる。
ｍｉＲＮＡはまた、様々な種類の細胞、例えば、限定されるものではないが、内皮細胞、上皮細胞及び脂肪細胞内で、差次的に発現する。
内皮細胞内に発現することが公知であるｍｉＲＮＡとしては、限定されるものではないが、ｌｅｔ－７ｂ－３ｐ、ｌｅｔ－７ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１００－３ｐ、ｍｉＲ－１００－５ｐ、ｍｉＲ－１０１－３ｐ、ｍｉＲ－１０１－５ｐ、ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｍｉＲ－１２６－５ｐ、ｍｉＲ－１２３６－３ｐ、ｍｉＲ－１２３６－５ｐ、ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１３０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｍｉＲ－１７－３ｐ、ｍｉＲ－１８ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１８ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１９ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１９ｂ－１－５ｐ、ｍｉＲ－１９ｂ－２－５ｐ、ｍｉＲ－１９ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２１７、ｍｉＲ－２１０、ｍｉＲ－２１－３ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｍｉＲ－２２１－３ｐ、ｍｉＲ－２２１－５ｐ、ｍｉＲ－２２２－３ｐ、ｍｉＲ－２２２－５ｐ、ｍｉＲ－２３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２９６－５ｐ、ｍｉＲ－３６１－３ｐ、ｍｉＲ－３６１－５ｐ、ｍｉＲ－４２１、ｍｉＲ－４２４－３ｐ、ｍｉＲ－４２４－５ｐ、ｍｉＲ－５１３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－９２ａ－１－５ｐ、ｍｉＲ－９２ａ－２－５ｐ、ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ、ｍｉＲ－９２ｂ－３ｐ、及びｍｉＲ－９２ｂ－５ｐが挙げられる。ディープシーケンシング分析によって、新規ｍｉＲＮＡの多くが内皮細胞において発見されている（例えば、全体が本明細書中に参照により組み込まれるＶｏｅｌｌｅｎｋｌｅ Ｃ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ，２０１２，１８，４７２－４８４）。任意の内皮細胞特異的なｍｉＲＮＡ由来のｍｉＲＮＡ結合部位を本発明のポリヌクレオチド内に導入するか、またはこの部位から除去することによって、内皮細胞内でのポリヌクレオチドの発現を調節することができる。
上皮細胞内に発現することが公知であるｍｉＲＮＡとしては、限定されるものではないが、呼吸繊毛上皮細胞において特異的なｌｅｔ－７ｂ－３ｐ、ｌｅｔ－７ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１２４６、ｍｉＲ－２００ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２００ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２００ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２００ｃ－３ｐ、ｍｉＲ－２００ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－３３８－３ｐ、ｍｉＲ－４２９、ｍｉＲ－４５１ａ、ｍｉＲ－４５１ｂ、ｍｉＲ－４９４、ｍｉＲ－８０２及びｍｉＲ－３４ａ、ｍｉＲ－３４ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－３４ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－４４９ａ、ｍｉＲ－４４９ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－４４９ｂ－５ｐ、肺上皮細胞において特異的なｌｅｔ－７ファミリー、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－１３３ｂ、ｍｉＲ－１２６、腎上皮細胞において特異的なｍｉＲ－３８２－３ｐ、ｍｉＲ－３８２－５ｐ、ならびに角膜上皮細胞において特異的なｍｉＲ－７６２が挙げられる。任意の上皮細胞において特異的なｍｉＲＮＡに由来するｍｉＲＮＡ結合部位を、本発明のポリヌクレオチドに導入または除去することによって、上皮細胞におけるポリヌクレオチドの発現を調節することができる。
加えて、大きなｍｉＲＮＡ群が胚性幹細胞内に多く存在し、幹細胞の自己再生を制御すると共に、神経細胞、心臓、造血細胞、皮膚細胞、骨形成細胞及び筋肉細胞などの様々な細胞系統の発達及び／または分化を制御している（例えば、Ｋｕｐｐｕｓａｍｙ ＫＴ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｍｏｌ Ｍｅｄ，２０１３，１３（５）、７５７－７６４、Ｖｉｄｉｇａｌ ＪＡ ａｎｄ Ｖｅｎｔｕｒａ Ａ，Ｓｅｍｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．２０１２，２２（５－６）、４２８－４３６、Ｇｏｆｆ ＬＡ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２００９，４：ｅ７１９２、Ｍｏｒｉｎ ＲＤ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ，２００８，１８，６１０－６２１、Ｙｏｏ ＪＫ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ．２０１２，２１（１１），２０４９－２０５７）。これらの各文献は、その全体が本明細書中に参照により組み込まれる）。胚性幹細胞内に多く存在するｍｉＲＮＡとしては、限定されるものではないが、ｌｅｔ－７ａ－２－３ｐ、ｌｅｔ－α－３ｐ、ｌｅｔ－７ａ－５ｐ、ｌｅｔ７ｄ－３ｐ、ｌｅｔ－７ｄ－５ｐ、ｍｉＲ－１０３ａ－２－３ｐ、ｍｉＲ－１０３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１０６ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１０６ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１２４６、ｍｉＲ－１２７５、ｍｉＲ－１３８－１－３ｐ、ｍｉＲ－１３８－２－３ｐ、ｍｉＲ－１３８－５ｐ、ｍｉＲ－１５４－３ｐ、ｍｉＲ－１５４－５ｐ、ｍｉＲ－２００ｃ－３ｐ、ｍｉＲ－２００ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－２９０、ｍｉＲ－３０１ａ－３ｐ、ｍｉＲ－３０１ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３０２ａ－３ｐ、ｍｉＲ－３０２ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－３０２ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－３０２ｃ－３ｐ、ｍｉＲ－３０２ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－３０２ｄ－３ｐ、ｍｉＲ－３０２ｄ－５ｐ、ｍｉＲ－３０２ｅ、ｍｉＲ－３６７－３ｐ、ｍｉＲ－３６７－５ｐ、ｍｉＲ－３６９－３ｐ、ｍｉＲ－３６９－５ｐ、ｍｉＲ－３７０、ｍｉＲ－３７１、ｍｉＲ－３７３、ｍｉＲ－３８０－５ｐ、ｍｉＲ－４２３－３ｐ、ｍｉＲ－４２３－５ｐ、ｍｉＲ－４８６－５ｐ、ｍｉＲ－５２０ｃ－３ｐ、ｍｉＲ－５４８ｅ、ｍｉＲ－５４８ｆ、ｍｉＲ－５４８ｇ－３ｐ、ｍｉＲ－５４８ｇ－５ｐ、ｍｉＲ－５４８ｉ、ｍｉＲ－５４８ｋ、ｍｉＲ－５４８ｌ、ｍｉＲ－５４８ｍ、ｍｉＲ－５４８ｎ、ｍｉＲ－５４８ｏ－３ｐ、ｍｉＲ－５４８ｏ－５ｐ、ｍｉＲ－５４８ｐ、ｍｉＲ－６６４ａ－３ｐ、ｍｉＲ－６６４ａ－５ｐ、ｍｉＲ－６６４ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－６６４ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－７６６－３ｐ、ｍｉＲ－７６６－５ｐ、ｍｉＲ－８８５－３ｐ、ｍｉＲ－８８５－５ｐ、ｍｉＲ－９３－３ｐ、ｍｉＲ－９３－５ｐ、ｍｉＲ－９４１、ｍｉＲ－９６－３ｐ、ｍｉＲ－９６－５ｐ、ｍｉＲ－９９ｂ－３ｐ及びｍｉＲ－９９ｂ－５ｐが挙げられる。予測された新規なｍｉＲＮＡの多くは、ヒト胚性幹細胞におけるディープシークエンシングによって発見されている（例えば、Ｍｏｒｉｎ ＲＤ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ，２００８，１８，６１０－６２１、Ｇｏｆｆ ＬＡ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２００９，４：ｅ７１９２、Ｂａｒ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，２００８，２６，２４９６－２５０５）。それらの各文献の全容は本明細書中に参照により組み込まれる）。
一実施形態において、胚性幹細胞特異的ｍｉＲＮＡの結合部位を本発明のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲ内に含めるかまたはその３’ＵＴＲから除去し、胚性幹細胞の発生及び／または分化を調節することによって、変性状態（例えば、変性疾患）における幹細胞の老化を阻害するか、あるいは、疾患状態（例えば、癌幹細胞）における幹細胞の老化及びアポトーシスを刺激することができる。
いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡは、造血系統の免疫細胞（例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞及びＴＬＲ７／ＴＬＲ８を発現することが公知である細胞、ならびに／または内皮細胞及び血小板などのサイトカインを分泌する機能を有することが公知である細胞）における発現及び存在量に基づいて選択される。ゆえに、いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡセットは、これらの細胞の免疫原性の一部に関与し得るｍｉＲを含む。そのため、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）内に対応するｍｉＲ部位を組み込んだ場合に、特定の細胞型においてｍＲＮＡの不安定化、及び／またはこれらのｍＲＮＡに対する翻訳の抑制につながる可能性がある。その代表例としては、限定されるものではないが、造血細胞の多くに特異的なｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１４４、ｍｉＲ－１５０、ｍｉＲ－１５５及びｍｉＲ－２２３、Ｂ細胞内に発現するｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ１５０、ｍｉＲ－１６及びｍｉＲ－２２３、前駆造血細胞内に発現するｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－４５１、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－１６、ならびに形質細胞様樹状細胞、血小板及び内皮細胞内に発現するｍｉＲ－１２６が挙げられる。ｍｉＲの組織発現に関する更なる考察については、例えば、Ｔｅｒｕｅｌ－Ｍｏｎｔｏｙａ、Ｒ．ｅｔ ａｌ．（２０１４）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ９：ｅ１０２２５９；Ｌａｎｄｇｒａｆ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｃｅｌｌ １２９：１４０１－１４１４；Ｂｉｓｓｅｌｓ，Ｕ．ｅｔ ａｌ．（２００９）ＲＮＡ １５：２３７５－２３８４を参照のこと。３’ＵＴＲ及び／または５’ＵＴＲ中のいずれか１つのｍｉＲ部位（例えば、Ｂ細胞及び樹状細胞の両方において多く存在するｍｉＲ－１４２）を組み込むことで、目的の複数の細胞型においてそのような効果を媒介できる。
いくつかの実施形態では、複数のｍｉＲで同じ細胞型を標的とすること、ならびに、３ｐアーム及び５ｐアームの両方が多く存在する（例えば、ｍｉＲ－１４２－３ｐ及びｍｉＲ１４２－５ｐの両方が造血幹細胞内に多く存在する）場合、それら両方の各々に対し結合部位を組み込むことが、有益とされる場合がある。ゆえに、ある特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドには、２つ以上の（例えば、２つ、３つ、４つまたはそれより多く）のｍｉＲ結合部位：（ｉ）ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１４４、ｍｉＲ－１５０、ｍｉＲ－１５５及びｍｉＲ－２２３（多くの造血細胞内に発現するもの）からなる群、あるいは（ｉｉ）ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ１５０、ｍｉＲ－１６及びｍｉＲ－２２３（Ｂ細胞内に発現するもの）からなる群、あるいはｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－４５１、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－１６（前駆造血細胞内に発現するもの）からなる群が含まれる。
また、いくつかの実施形態では、様々なｍｉＲを組み合わせることによって目的の複数の細胞型を同時に標的とする（例えば、ｍｉＲ－１４２及びｍｉＲ－１２６を組み合わせることによって造血系統及び内皮細胞中の多くの細胞を標的とする）ことも有益であり得る。ゆえに、例えば、ある特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、２つ以上の（例えば、２つ、３つ、４つもしくはそれより多く）のｍｉＲＮＡ結合部位：（ｉ）ｍｉＲのうちの少なくとも１つは造血系統の細胞（例えば、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１４４、ｍｉＲ－１５０、ｍｉＲ－１５５もしくはｍｉＲ－２２３）を標的とし、ｍｉＲのうちの少なくとも１つは形質細胞様樹状細胞、血小板または内皮細胞（例えば、ｍｉＲ－１２６）を標的とするもの、または（ｉｉ）ｍｉＲのうちの少なくとも１つはＢ細胞（例えば、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ１５０、ｍｉＲ－１６もしくはｍｉＲ－２２３）を標的とし、ｍｉＲのうちの少なくとも１つは形質細胞様樹状細胞、血小板もしくは内皮細胞（例えば、ｍｉＲ－１２６）を標的とするもの、または（ｉｉｉ）ｍｉＲのうちの少なくとも１つは前駆造血細胞（例えば、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－４５１、ｍｉＲ－２６ａもしくはｍｉＲ－１６）を標的としｍｉＲのうちの少なくとも１つは形質細胞様樹状細胞、血小板もしくは内皮細胞（例えば、ｍｉＲ－１２６）を標的化するもの、または（ｉｖ）ｍｉＲのうちの少なくとも１つは造血系統の細胞（例えば、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１４４、ｍｉＲ－１５０、ｍｉＲ－１５５もしくはｍｉＲ－２２３）を標的とし、ｍｉＲのうちの少なくとも１つはＢ細胞（例えば、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ１５０、ｍｉＲ－１６もしくはｍｉＲ－２２３）を標的とし、ｍｉＲのうちの少なくとも１つは形質細胞様樹状細胞、血小板または内皮細胞（例えば、ｍｉＲ－１２６）を標的化するものを含むか、あるいは、上記４つのクラスのｍｉＲ結合部位の他の任意の可能な組み合わせ（すなわち、造血系統を標的化する細胞、Ｂ細胞を標的化する細胞、前駆造血細胞及び／もしくは形質細胞様樹状細胞／血小板／内皮細胞を標的化する細胞）を含む。
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、従来の免疫細胞またはＴＬＲ７及び／もしくはＴＬＲ８を発現する任意の細胞内に発現する１つ以上のｍｉＲに結合する１つ以上のｍｉＲＮＡ結合配列を含み、（例えば、末梢リンパ器官及び／または脾細胞及び／もしくは内皮細胞の免疫細胞において）炎症促進性サイトカイン及び／もしくはケモカインを分泌することによって、免疫応答を調節することを可能にしている。（例えば、末梢リンパ器官、及び／または脾細胞、及び／または内皮細胞の免疫細胞中）ＴＬＲ７及び／もしくはＴＬＲ８を発現し且つ炎症促進性サイトカイン及び／もしくはケモカインを分泌する任意の細胞内に発現する１つ以上のｍｉＲを、ｍＲＮＡに取り込むことによって、免疫細胞活性化（例えば、活性化Ｂ細胞の頻度によって測定されるＢ細胞活性化）ならびに／あるいはサイトカイン産生（例えば、ＩＬ－６、ＩＦＮ－γ及び／またはＴＮＦαの産生）が低減または阻害されることが、昨今になって発見されている。昨今の発見としては、更に他にも、従来の免疫細胞、またはＴＬＲ７及びＣ８を発現し且つ炎症促進性サイトカイン及び／もしくはケモカインを分泌する任意の細胞（例えば、末梢リンパ器官の免疫細胞及び／もしくは脾細胞及び／もしくは内皮細胞）内に発現する１つ以上のｍｉＲを、ｍＲＮＡ中に組み込むことによって、ｍＲＮＡによりコードされる関心対象のタンパク質に対する抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答を低減または阻害することが可能となることが挙げられる。
別の実施形態では、脂質含有化合物または組成物中に送達されるポリヌクレオチドに対する加速的血中クリアランスを調節することを可能にするのを目的に、本発明のポリヌクレオチド内に、１つ以上のｍｉＲＮＡに結合する１つ以上のｍｉＲ結合配列を含める。これらのｍｉＲ結合配列は、従来の免疫細胞内に発現するか、あるいはＴＬＲ７及び／もしくはＴＬＲ８を発現し且つ炎症促進性サイトカイン及び／もしくはケモカインを分泌する任意の細胞（例えば、末梢リンパ器官の免疫細胞及び／または脾細胞及び／または内皮細胞）内に発現するものである。今日になって発見されているように、１つ以上のｍｉＲ結合部位をｍＲＮＡ内に取り込むことによって、ｍＲＮＡを送達する際に使用される脂質含有化合物または組成物に対する加速的血中クリアランス（ＡＢＣ）が低減または阻害される。今日の発見としては、更に他にも、１つ以上のｍｉＲ結合部位をｍＲＮＡ中に取り込むことによって、抗－ＰＥＧ抗－ＩｇＭの血清レベルが低減され（例えば、Ｂ細胞によるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を認識するＩｇＭの急性産生が低減または阻害され）、及び／または、脂質含有化合物またはｍＲＮＡを含む組成物を投与された後に形質細胞様樹状細胞の増殖、及び／または、活性化が低減または阻害されることが挙げられる。
いくつかの実施形態において、ｍｉＲ配列は、免疫細胞内に発現する任意の公知のマイクロＲＮＡに対応し得、このｍｉＲ配列としては、限定されるものではないが、米国特許出願公開第ＵＳ２００５／０２６１２１８号、及び米国特許出願公開第ＵＳ２００５／００５９００５号において教示されているものが挙げられる。本文献の全容は本明細書中に参照により組み込まれる。免疫細胞内に発現するｍｉＲの例としては、限定されるものではないが、脾臓細胞、骨髄細胞、樹状細胞、形質細胞様樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞及び／またはマクロファージ内に発現するｍｉＲが挙げられる。例えば、ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４及びｍｉＲ－２７は骨髄細胞内に発現し、ｍｉＲ－１５５は樹状細胞、Ｂ細胞及びＴ細胞内に発現し、ｍｉＲ－１４６はＴＬＲを刺激した際にマクロファージで上方制御され、ｍｉＲ－１２６は形質細胞様樹状細胞内に発現する。ある特定の実施形態において、ｍｉＲ（複数可）は、免疫細胞において豊富に、または優先的に発現する。例えば、ｍｉＲ－１４２（ｍｉＲ－１４２－３ｐ及び／またはｍｉＲ－１４２－５ｐ）、ｍｉＲ－１２６（ｍｉＲ－１２６－３ｐ及び／またはｍｉＲ－１２６－５ｐ）、ｍｉＲ－１４６（ｍｉＲ－１４６－３ｐ及び／またはｍｉＲ－１４６－５ｐ）、ならびにｍｉＲ－１５５（ｍｉＲ－１５５－３ｐ及び／またはｍｉＲ１５５－５ｐ）は、免疫細胞において多量に発現する。それらのマイクロＲＮＡ配列は、当該技術分野において公知であり、ゆえに、当業者は、これらのマイクロＲＮＡがワトソン－クリック相補性に基づいて結合する結合配列または標的配列を容易にデザインできる。
したがって、様々な実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１４６、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１２６、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４及びｍｉＲ－２７からなる群から選択されるｍｉＲの少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含む。別の実施形態において、ｍＲＮＡは、免疫細胞内に発現するマイクロＲＮＡに対して少なくとも２つのｍｉＲ結合部位を含む。様々な実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、免疫細胞内に発現するマイクロＲＮＡ用の１～４つ（１つ、２つ、３つまたは４つ）のｍｉＲ結合部位を含む。別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、３つのｍｉＲ結合部位を含む。それらのｍｉＲ結合部位は、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１４６、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１２６、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－２７、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるマイクロＲＮＡに対応し得る。一実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、免疫細胞内に発現する同じｍｉＲ結合部位の２つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ）のコピー、例えば、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１４６、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１２６、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－２７からなるｍｉＲの群から選択されるｍｉＲ結合部位の２つ以上のコピーを含む。
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、同じｍｉＲ結合部位の３つのコピーを含む。ある特定の実施形態において、同じｍｉＲ結合部位のコピーを３つ使用すれば、単一のｍｉＲ結合部位を使用した場合と比較して有益な特性が呈され得る。３つのｍｉＲ結合部位を含む３’ＵＴＲの配列の非限定的な例は、配列番号１６５（３つのｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位）、及び配列番号１６７（３つのｍｉＲ－１４２－５ｐ結合部位）に示す。
別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、免疫細胞内に発現する少なくとも２つの異なるｍｉＲ結合部位２つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ）のコピーを含む。２つ以上の異なるｍｉＲ結合部位が含まれる３’ＵＴＲ配列の例としては、限定されるものではないが、配列番号１６４（１つのｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位及び１つのｍｉＲ－１２６－３ｐ結合部位）、配列番号１６８（２つのｍｉＲ－１４２－５ｐ結合部位及び１つのｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位）及び配列番号１７１（２つのｍｉＲ－１５５－５ｐ結合部位及び１つのｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位）に示す。
別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、免疫細胞内に発現するマイクロＲＮＡ用の少なくとも２つのｍｉＲ結合部位であって、ｍｉＲ結合部位のうちの１つがｍｉＲ－１４２－３ｐ用であるものを含む。様々な実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ｍｉＲ－１４２－３ｐ及びｍｉＲ－１５５（ｍｉＲ－１５５－３ｐまたはｍｉＲ－１５５－５ｐ）、ｍｉＲ－１４２－３ｐ及びｍｉＲ－１４６（ｍｉＲ－１４６－３またはｍｉＲ－１４６－５ｐ）、あるいはｍｉＲ－１４２－３ｐ及びｍｉＲ－１２６（ｍｉＲ－１２６－３ｐまたはｍｉＲ－１２６－５ｐ）用の結合部位を含む。
別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、免疫細胞内に発現するマイクロＲＮＡ用の少なくとも２つのｍｉＲ結合部位であって、ｍｉＲ結合部位のうちの１つがｍｉＲ－１２６－３ｐ用である結合部位を含む。様々な実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ｍｉＲ－１２６－３ｐ及びｍｉＲ－１５５（ｍｉＲ－１５５－３ｐまたはｍｉＲ－１５５－５ｐ）、ｍｉＲ－１２６－３ｐ及びｍｉＲ－１４６（ｍｉＲ－１４６－３ｐまたはｍｉＲ－１４６－５ｐ）、あるいはｍｉＲ－１２６－３ｐ及びｍｉＲ－１４２（ｍｉＲ－１４２－３ｐまたはｍｉＲ－１４２－５ｐ）用の結合部位を含む。
別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、免疫細胞内に発現するマイクロＲＮＡ用の少なくとも２つのｍｉＲ結合部位であって、ｍｉＲ結合部位のうちの１つがｍｉＲ－１４２－５ｐ用である結合部位を含む。様々な実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ｍｉＲ－１４２－５ｐ及びｍｉＲ－１５５（ｍｉＲ－１５５－３ｐまたはｍｉＲ－１５５－５ｐ）、ｍｉＲ－１４２－５ｐ及びｍｉＲ－１４６（ｍｉＲ－１４６－３またはｍｉＲ－１４６－５ｐ）、あるいはｍｉＲ－１４２－５ｐ及びｍｉＲ－１２６（ｍｉＲ－１２６－３ｐまたはｍｉＲ－１２６－５ｐ）用の結合部位を含む。
更に別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、免疫細胞内に発現するマイクロＲＮＡ用の少なくとも２つのｍｉＲ結合部位であって、ｍｉＲ結合部位のうちの１つがｍｉＲ－１５５－５ｐ用である結合部位を含む。様々な実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ｍｉＲ－１５５－５ｐ及びｍｉＲ－１４２（ｍｉＲ－１４２－３ｐまたはｍｉＲ－１４２－５ｐ）、ｍｉＲ－１５５－５ｐ及びｍｉＲ－１４６（ｍｉＲ－１４６－３またはｍｉＲ－１４６－５ｐ）、あるいはｍｉＲ－１５５－５ｐ及びｍｉＲ－１２６（ｍｉＲ－１２６－３ｐまたはｍｉＲ－１２６－５ｐ）用の結合部位を含む。
ｍｉＲＮＡはまた、血管新生（例えばｍｉＲ－１３２）のような複雑な生物学的過程を調節できる（Ａｎａｎｄ及びＣｈｅｒｅｓｈ Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ ２０１１ １８：１７１－１７６）。本発明のポリヌクレオチドにおいて、ｍｉＲＮＡ結合部位を除去または導入することによって、そのようなプロセスに関与するｍｉＲＮＡ結合部位を、ポリヌクレオチドの発現を生物学的に関連する細胞型または関連する生物学的プロセスに合わせてカスタマイズすることができる。これに関連して、本発明のポリヌクレオチドは、栄養要求性ポリヌクレオチドと定義される。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、表３から選択される１つ以上のヌクレオチド配列（例えば、いずれか１つもしくはそれより多くのｍｉＲＮＡ結合部位配列のコピー１つ以上）を含む、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは更に、表３から選択される少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０もしくはそれより多くの、同じまたは異なるｍｉＲＮＡ結合部位（例えば、それらの任意の組み合わせなど）含む。
いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１４２に結合するかまたはｍｉＲ－１４２に対して相補的である。いくつかの実施形態において、ｍｉＲ－１４２は、配列番号３４を含む。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１４２－３ｐまたはｍｉＲ－１４２－５ｐに結合する。いくつかの実施形態において、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位は、配列番号３５を含む。いくつかの実施形態において、ｍｉＲ－１４２－５ｐ結合部位は、配列番号３７を含む。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位は、配列番号３６または配列番号３８に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは１００％同一な、ヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１２６に結合するかまたはｍｉＲ－１２６に対して相補的である。いくつかの実施形態において、ｍｉＲ－１２６は、配列番号１５６を含む。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１２６－３ｐまたはｍｉＲ－１２６－５ｐに結合する。いくつかの実施形態において、ｍｉＲ－１２６－３ｐ結合部位は、配列番号１５８を含む。いくつかの実施形態において、ｍｉＲ－１２６－５ｐ結合部位は、配列番号１６０を含む。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位は、配列番号１５８または配列番号１６０に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは１００％同一な、ヌクレオチド配列を含む。
一実施形態において、３’ＵＴＲは、２つのｍｉＲＮＡ結合部位（ｍｉＲ－１４２に結合する第１のｍｉＲＮＡ結合部位、及びｍｉＲ－１２６に結合する第２のｍｉＲＮＡ結合部位）を含む。特定の実施形態において、ｍｉＲ－１４２及びｍｉＲ－１２６に結合する３’ＵＴＲは、配列番号１４９もしくは１５０の配列を含むか、この配列からなるか、または本質的にこの配列からなる。
表３ ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１２６、ｍｉＲ－１４２結合部位、及びｍｉＲ－１２６結合部位
Figure 2023062097000050
いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ポリヌクレオチドの任意の位置（例えば、５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲ）で、本発明のポリヌクレオチド中に挿入される。いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。いくつかの実施形態において、３’ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。ポリヌクレオチド内の挿入部位は、対応するｍｉＲＮＡの非存在下で機能的ポリペプチドの翻訳が妨げられない限り、及びｍｉＲＮＡの存在下でポリヌクレオチド中にｍｉＲＮＡ結合部位を挿入してｍｉＲＮＡ結合部位の対応するｍｉＲＮＡに結合したとしてもポリヌクレオチドを劣化させたりあるいはポリヌクレオチドの翻訳を妨げる可能性のない限り、ポリヌクレオチド内のどこにあってもよい。
いくつかの実施形態において、ＯＲＦを含む本発明のポリヌクレオチド中のＯＲＦの終止コドンから少なくとも約３０ヌクレオチド下流に、ｍｉＲＮＡ結合部位が挿入される。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド中のＯＲＦの終止コドンから少なくとも約１０ヌクレオチド、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約３５ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約４５ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約５５ヌクレオチド、少なくとも約６０ヌクレオチド、少なくとも約６５ヌクレオチド、少なくとも約７０ヌクレオチド、少なくとも約７５ヌクレオチド、少なくとも約８０ヌクレオチド、少なくとも約８５ヌクレオチド、少なくとも約９０ヌクレオチド、少なくとも約９５ヌクレオチド、または少なくとも約１００ヌクレオチド下流に、ｍｉＲＮＡ結合部位が挿入される。いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド中のＯＲＦの終止コドンから約１０ヌクレオチド～約１００ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド～約９０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド～約８０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド～約７０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド～約６０ヌクレオチド、約４５ヌクレオチド～約６５ヌクレオチド下流に、ｍｉＲＮＡ結合部位が挿入される。
いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位は、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）内のコード領域の停止コドンの直後にある３’ＵＴＲ内に挿入される。いくつかの実施形態において、コンストラクト内に終止コドンのコピーが複数存在する場合、ｍｉＲＮＡ結合部位の挿入先は、最後の終止コドンの直後となる。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位の挿入先は、終止コドンの更に下流となり、そこで終止コドンとｍｉＲ結合部位との間に３’ＵＴＲ塩基が存在する。いくつかの実施形態において、３’ＵＴＲ内のｍｉＲ用の３つの挿入部位の非限定的な例を、配列番号５７、５８及び１７２に示す。これらは、３’ＵＴＲ内の３つの異なる可能な挿入部位のうちの１つに、ｍｉＲ－１４２－３ｐ部位が挿入された３’ＵＴＲ配列を示す。
いくつかの実施形態において、１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位は、５’ＵＴＲ内の１つ以上の可能な挿入部位に位置し得る。例えば、５’ＵＴＲ内のｍｉＲ用の３つの挿入部位の非限定的な例を、配列番号１８９、１９０及び１９１に示す。これらは、５’ＵＴＲ内の３つの異なる可能な挿入部位のうちの１つに、ｍｉＲ－１４２－３ｐ部位が挿入された５’ＵＴＲ配列を示す。
一実施形態において、目的ポリペプチドをコードするコドン最適化されたオープンリーディングフレームは終止コドンを含み、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、終止コドンの後の３’ＵＴＲ１～１００ヌクレオチド以内に位置する。一実施形態において、目的ポリペプチドをコードするコドン最適化されたオープンリーディングフレームは終止コドンを含み、免疫細胞内に発現するｍｉＲ用の少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は終止コドンの後の、３’ＵＴＲ３０～５０ヌクレオチド以内に位置する。別の実施形態において、目的ポリペプチドをコードするコドン最適化されたオープンリーディングフレームは終止コドンを含み、免疫細胞内に発現するｍｉＲ用の少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は終止コドンの後の３’ＵＴＲの少なくとも５０ヌクレオチド以内に位置する。他の実施形態において、目的ポリペプチドをコードするコドン最適化されたオープンリーディングフレームは終止コドンを含み、免疫細胞内に発現するｍｉＲ用の少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、終止コドンの直後の３’ＵＴＲ内、終止コドンの後の３’ＵＴＲ１５～２０ヌクレオチド以内、または終止コドンの後の３’ＵＴＲ７０～８０ヌクレオチド以内に位置する。他の実施形態において、３’ＵＴＲは、２つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位（例えば、２～４個のｍｉＲＮＡ結合部位）を含み、各ｍｉＲＮＡ結合部位の間にはスペーサ領域（例えば、１０～１００ヌクレオチド長、２０～７０ヌクレオチド長、または３０～５０ヌクレオチド長）が存在し得る。別の実施形態において、３’ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ結合部位の末端とポリＡ尾部ヌクレオチドとの間にスペーサ領域を含む。例えば、ｍｉＲＮＡ結合部位の末端とポリＡ尾部ヌクレオチドとの間には、１０～１００ヌクレオチド長、２０～７０ヌクレオチド長、または３０～５０ヌクレオチド長のスペーサ領域が存在し得る。
一実施形態において、目的ポリペプチドをコードするコドン最適化されたオープンリーディングフレームは開始コドンを含み、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、開始コドンより１～１００ヌクレオチド前（上流）の５’ＵＴＲ内に位置する。一実施形態において、目的ポリペプチドをコードするコドン最適化されたオープンリーディングフレームは開始コドンを含み、免疫細胞内に発現するｍｉＲ用の少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、開始コドンより１０～５０ヌクレオチド前（上流）の５’ＵＴＲ内に位置する。別の実施形態において、目的ポリペプチドをコードするコドン最適化されたオープンリーディングフレームは開始コドンを含み、免疫細胞内に発現するｍｉＲ用の少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、開始コドンより少なくとも２５ヌクレオチド前（上流）の５’ＵＴＲ内に位置する。他の実施形態において、目的ポリペプチドをコードするコドン最適化されたオープンリーディングフレームは開始コドンを含み、免疫細胞内に発現するｍｉＲ用の少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、開始コドンの直前の５’ＵＴＲ内、または開始コドンより１５～２０ヌクレオチド前（上流）の５’ＵＴＲ内、または開始コドンより７０～８０ヌクレオチド前（上流）の５’ＵＴＲ内に位置する。他の実施形態において、５’ＵＴＲは、２つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位（例えば、２～４個のｍｉＲＮＡ結合部位）を含み、各ｍｉＲＮＡ結合部位間にスペーサ領域（例えば、１０～１００、２０～７０または３０～５０ヌクレオチド長）が存在し得る。
一実施形態において、３’ＵＴＲは２つ以上の終止コドンを含み、終止コドンの下流には少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位が位置する。例えば、３’ＵＴＲは、１つ、２つまたは３つの終止コドンを含むことができる。使用できる三連終止コドンの例としては、限定されるものではないが、ＵＧＡＵＡＡＵＡＧ、ＵＧＡＵＡＧＵＡＡ、ＵＡＡＵＧＡＵＡＧ、ＵＧＡＵＡＡＵＡＡ、ＵＧＡＵＡＧＵＡＧ、ＵＡＡＵＧＡＵＧＡ、ＵＡＡＵＡＧＵＡＧ、ＵＧＡＵＧＡＵＧＡ、ＵＡＡＵＡＡＵＡＡ及びＵＡＧＵＡＧＵＡＧが挙げられる。３’ＵＴＲ内部では、例えば、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位などの１、２、３もしくは４つのｍｉＲＮＡ結合部位は、終止コドン（複数）に直接隣接して、または終止コドンの下流の任意の数ヌクレオチドのところに位置し得る。３’ＵＴＲ内部では、複数のｍｉＲＮＡ結合部位を含み、これらの結合部位は、コンストラクト内で互いに隣接して（すなわち、順番に）配置され得る、あるいは代わりにスペーサヌクレオチドが各結合部位の間に配置され得る。
一実施形態において、３’ＵＴＲは、第３の終止コドンより下流に位置する単一のｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位を有する３つの終止コドンを含む。３つの終止コドン、及び最終の終止コドンより下流の異なる位置に位置する単一のｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位を有する３’ＵＴＲ列配列の例としては、限定されるものではないが、配列番号５７、５８、６２、及び１７２に示す。
表４ ３’ＵＴＲ、ｍｉＲ配列、及びｍｉＲ結合部位
Figure 2023062097000051
Figure 2023062097000052
Figure 2023062097000053
Figure 2023062097000054
Figure 2023062097000055
 終止コドン＝太字
ｍｉＲ１４２－３ｐ結合部位＝下線
ｍｉＲ１２６－３ｐ結合部位＝太字の下線
ｍｉＲ１５５－５ｐ結合部位＝陰影付き
ｍｉＲ１４２－５ｐ結合部位＝陰影付き太字の下線
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、５’ＵＴＲ、目的ポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレーム、免疫細胞内に発現したｍｉＲ用の少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位を含む３’ＵＴＲ、及び連結ヌクレオシドの３’尾部領域を含む。様々な実施形態において、３’ＵＴＲは、免疫細胞内に発現したｍｉＲ、好ましくは免疫細胞内に豊富にまたは優先的に発現したｍｉＲ用のｍｉＲＮＡ結合部位を１～４個（少なくとも２つ、あるいは１つ、２つ、３つもしくは４つ）を含む。
一実施形態において、免疫細胞内に発現する少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－１４２－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位である。一実施形態において、ｍｉＲ－１４２－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位は、配列番号３６に示す配列を含む。一実施形態において、ｍｉＲ－１４２－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位を含むｍＲＮＡの３’ＵＴＲは、配列番号１６１に示す配列を含む。
一実施形態において、免疫細胞内に発現する少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－１２６マイクロＲＮＡ結合部位である。一実施形態において、ｍｉＲ－１２６結合部位は、ｍｉＲ－１２６－３ｐ結合部位である。一実施形態において、ｍｉＲ－１２６－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位は、配列番号１５８に示す配列を含む。一実施形態において、ｍｉＲ－１２６－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位を含む本発明のｍＲＮＡの３’ＵＴＲは、配列番号１６２に示す配列を含む。
本開示のマイクロＲＮＡ結合部位（複数可）が結合し得るｍｉＲの例示的配列としては、限定されるものではないが、以下を含む：ｍｉＲ－１４２－３ｐ（配列番号３５）、ｍｉＲ－１４２－５ｐ（配列番号３７）、ｍｉＲ－１４６－３ｐ（配列番号１７３）、ｍｉＲ－１４６－５ｐ（配列番号１７４）、ｍｉＲ－１５５－３ｐ（配列番号１７５）、ｍｉＲ－１５５－５ｐ（配列番号１７６）、ｍｉＲ－１２６－３ｐ（配列番号１５７）、ｍｉＲ－１２６－５ｐ（配列番号１５９）、ｍｉＲ－１６－３ｐ（配列番号１７７）、ｍｉＲ－１６－５ｐ（配列番号１７８）、ｍｉＲ－２１－３ｐ（配列番号１７９）、ｍｉＲ－２１－５ｐ（配列番号１８０）、ｍｉＲ－２２３－３ｐ（配列番号１８１）、ｍｉＲ－２２３－５ｐ（配列番号１８２）、ｍｉＲ－２４－３ｐ（配列番号１８３）、ｍｉＲ－２４－５ｐ（配列番号１８４）、ｍｉＲ－２７－３ｐ（配列番号１８５）及びｍｉＲ－２７－５ｐ（配列番号１８６）。免疫細胞内に発現する他の好適なｍｉＲ配列、例えば免疫細胞内に豊富にまたは優先的に発現するｍｉＲ配列は、当該技術分野（例えば、マンチェスター大学のマイクロＲＮＡデータベースであるｍｉＲＢａｓｅ）において公知であり利用可能である。前述のｍｉＲのいずれかと結合する部位は、ｍｉＲに対するワトソン－クリック相補性（典型的にはｍｉＲに対する１００％相補性）に基づいてデザインされ、本明細書中に記載されているように本開示のｍＲＮＡコンストラクトに挿入することが可能である。
別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、及びその３’ＵＴＲなどのｍＲＮＡ）は、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位を含み、それにより、例えば、ＩｇＭの産生を低減または阻害することにより（例えば、Ｂ細胞による、ＰＥＧに対する加速的血中クリアランスを低減少または阻害する、及び／またはｐＤＣの増殖及び／もしくは活性化を低減または阻害することができ、目的のコードされたタンパク質の組織発現を調節するための、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位を含むことができる。
ｍｉＲＮＡ遺伝子調節は、限定されないが、周囲の配列の種、配列の型（異種、相同、外因性、内在性もしくは人工）、周囲の配列内の調節エレメント及び／または周囲の配列内の構造エレメントなどのｍｉＲＮＡを囲繞する配列による影響を受け得る。ｍｉＲＮＡは、５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲによる影響を受け得る。非限定的な例として、非ヒト３’ＵＴＲは、同じ配列型のヒト３’ＵＴＲと比較して、ｍｉＲＮＡ配列が目的ポリペプチドの発現に対して及ぼす調節効果を増強させ得る。
一実施形態において、５’ＵＴＲの他の調節エレメント及び／または構造エレメントは、ｍｉＲＮＡ媒介性遺伝子調節に影響し得る。制御エレメント及び／または構造エレメントの一例は、５’ＵＴＲ中の構造化ＩＲＥＳ（内部リボソーム侵入部位）であり、タンパク質翻訳を開始するに当たって、翻訳伸長因子の結合に必要とされる。５’ＵＴＲ内のこの二次構造エレメントに対するＥＩＦ４Ａ２の結合は、ｍｉＲＮＡ媒介性遺伝子の発現に必要である（全体が本明細書中に参照により組み込まれるＭｅｉｊｅｒ ＨＡ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３，３４０，８２－８５）。本発明のポリヌクレオチドは更に、この構造化５’ＵＴＲを含むことにより、マイクロＲＮＡ媒介性遺伝子調節を増強することができる。
少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位を、本発明のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲへ操作することができる。これに関連して、少なくとも２つ、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、またはそれより多くのｍｉＲＮＡ結合部位を、本発明のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲへ操作することが可能である。例えば１～１０、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３、２、または１つのｍｉＲＮＡ結合部位を、本発明のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲへ操作することが可能である。一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド内に組み込まれるｍｉＲＮＡ結合部位は、同じまたは異なるｍｉＲＮＡ部位であり得る。本発明のポリヌクレオチド内に組み込まれる種々なｍｉＲＮＡ結合部位の組み合わせとしては、異なるｍｉＲＮＡ部位のいずれかの、１を超えるコピーが組み込まれている組み合わせを含むことができる。別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド内に組み込まれるｍｉＲＮＡ結合部位は、体内の同じ組織または異なる組織に対して標的化できる。非限定例として、本発明のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲ内に組織、細胞型または疾患特異的ｍｉＲＮＡ結合部位を導入することにより、特定の細胞型（例えば、骨髄細胞、内皮細胞）内での発現の度合いを低減することができる。
一実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位は、本発明のポリヌクレオチド中の３’ＵＴＲの５’末端付近に、３’ＵＴＲの５’末端と３’末端との間の約半分のところに、及び／または３’ＵＴＲの３’末端の付近に操作することができる。非限定的な例として、ｍｉＲＮＡ結合部位は、３’ＵＴＲの５’末端付近に、及び３’ＵＴＲの５’末端と３’末端との間の約半分のところに操作することができる。別の非限定的な例として、ｍｉＲＮＡ結合部位は、３’ＵＴＲの３’末端付近に、及び３’ＵＴＲの５’末端と３’末端との間の約半分のところに操作することができる。更に別の非限定的な例として、ｍｉＲＮＡ結合部位は、３’ＵＴＲの５’末端付近に、及び３’ＵＴＲの３’末端付近に操作することができる。
別の実施形態において、３’ＵＴＲは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のｍｉＲＮＡ結合部位を含むことができる。ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡシード配列、及び／またはシード配列に隣接するｍｉＲＮＡ配列に対して相補的であり得る。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドの発現は、少なくとも１つのセンサー配列をポリヌクレオチド内に組み込み、投与用にポリヌクレオチドを製剤化することによって制御できる。非限定例として、本発明のポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ結合部位を組み込み、本明細書に記載の脂質のいずれかを含むイオン性脂質を含む脂質ナノ粒子中にポリヌクレオチドを製剤化することにより、組織または細胞を標的とすることができる。
本発明のポリヌクレオチドは、異なる組織、細胞型、または生物学的状態におけるｍｉＲＮＡの発現パターンに基づいて、特定の組織、細胞型もしくは生物学的状態において標的化を強化した発現用に操作することができる。組織特異的ｍｉＲＮＡ結合部位を導入することによって、本発明のポリヌクレオチドは、組織もしくは細胞内でのタンパク質発現を最適なものとする目的で、または生物学的状態という観点からデザインできる。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、公知のｍｉＲＮＡシード配列に対して１００％の同一性、またはｍｉＲＮＡシード配列に対して１００％未満の同一性を有するｍｉＲＮＡ結合部位が組み込まれるようにデザインすることができる。いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、公知のｍｉＲＮＡシード配列に対して少なくとも、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するｍｉＲＮＡ結合部位が組み込まれるようにデザインすることができる。ｍｉＲＮＡシード配列は、ｍｉＲＮＡ結合親和性を低下させることで結果としてポリヌクレオチドの下方調節が低減するように、ある特定の程度変異させることができる。本質的に、ｍｉＲＮＡ結合部位とｍｉＲＮＡシードとの間の一致または不一致の度合いは、ｍｉＲＮＡのタンパク質発現調節機能を細かく調整するためのレオスタットとして作用し得る。加えて、ｍｉＲＮＡ結合部位の非シード領域内での変異はまた、ｍｉＲＮＡのタンパク質発現調節機能に影響を及ぼし得る。
一実施形態において、ｍｉＲＮＡ配列は、ステムループのステムへの組み込みができる。
別の実施形態において、ｍｉＲＮＡシード配列をステムループのステム内に組み込むことができ、ｍｉＲＮＡ結合部位をステムループの５’ステム内または３’ステム内に組み込むことができる。
一実施形態では、翻訳エンハンサーエレメント（ＴＥＥ）をステムループのステムの５’末端内に組み込むことができ、ｍｉＲＮＡシードをステムループのステム内に組み込むことができる。別の実施形態では、ＴＥＥをステムループのステムの５’末端内に組み込むことができ、ｍｉＲＮＡシードをステムループのステム内に組み込むことができ、ｍｉＲＮＡ結合部位をステムの３’末端内に、またはステムループの後の配列内に組み込むことができる。ｍｉＲＮＡシード及びｍｉＲＮＡ結合部位は、同じ及び／または異なるｍｉＲＮＡ配列に対応し得る。
一実施形態において、ｍｉＲＮＡ配列及び／またはＴＥＥ配列の取り込みによって、ステムループ領域の形状を変化させ、翻訳を増強し、且つ／または低減させることができる（例えば、Ｋｅｄｄｅ ｅｔ ａｌ．，”Ａ Ｐｕｍｉｌｉｏ－ｉｎｄｕｃｅｄ ＲＮＡ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｓｗｉｔｃｈ ｉｎ ｐ２７－３’ＵＴＲ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｍｉＲ－２２１ ａｎｄ ｍｉＲ－２２ ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ．”Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１０を参照のこと。本文献は、その全体が本明細書中に参照により組み込まれる）。
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲは、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ配列を含むことができる。ｍｉＲＮＡ配列は、限定されるものではないが、１９または２２ヌクレオチド配列及び／またはｍｉＲＮＡ配列（シードなし）であり得る。
一実施形態では、本発明の本明細書に記載のポリヌクレオチドを安定化させることを目的に、５’ＵＴＲ内のｍｉＲＮＡ配列が使用され得る。
別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲ内のｍｉＲＮＡ配列を使用することで、限定されないが開始コドンなどの翻訳開始部位へのアクセスを低減させることができる。例えば、全体が本明細書中に参照により組み込まれるＭａｔｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１０ １１（５）：ｅ１５０５７を参照のこと。Ｍａｔｓｕｄａらは、開始コドンの周りにアンチセンスロック核酸（ＬＮＡ）オリゴヌクレオチド及びエクソン接合部複合体（ＥＪＣ）を用い、（－４～＋３７、ＡＵＧコドンのＡは＋１）、最初の開始コドン（ＡＵＧ）の可用性を低減させた。Ｍａｔｓｕｄａは、ＬＮＡまたはＥＪＣを用いて開始コドン周辺の配列を変更すると、ポリヌクレオチドの効率、長さ及び構造安定性に影響が及ぶことを示した。本発明のポリヌクレオチドは、Ｍａｔｓｕｄａらによって記載されたＬＮＡまたはＥＪＣ配列でなく、ｍｉＲＮＡ配列を翻訳開始部位近くに含めることで、翻訳開始部位の可用性を低減させることができる。翻訳開始部位は、ｍｉＲＮＡ配列の前、後またはその中であり得る。非限定例として、翻訳開始部位は、ｍｉＲＮＡ配列、例えばシード配列または結合部位の内部に位置し得る。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドには、抗原提示細胞による抗原提示を減弱させるための、少なくとも１つのｍｉＲＮＡを含めることができる。ｍｉＲＮＡは、完全なｍｉＲＮＡ配列、ｍｉＲＮＡシード配列、シードなしのｍｉＲＮＡ配列、またはそれらの組み合わせであり得る。非限定的な例として、本発明のポリヌクレオチド内に組み込まれたｍｉＲＮＡは、造血系に特異的であり得る。別の非限定的な例として、抗原提示の減弱を目的として本発明のポリヌクレオチド内に組み込まれたｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－１４２－３ｐである。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドには、関心対象の組織または細胞内でのコードされたポリペプチドの発現を減弱させるために少なくとも１つのｍｉＲＮＡを含めることができる。非限定的な例として、本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも１つのｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位、ｍｉＲ－１４２－３ｐシード配列、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位（シードなし）、ｍｉＲ－１４２－５ｐ結合部位、ｍｉＲ－１４２－５ｐシード配列、ｍｉＲ－１４２－５ｐ結合部位（シードなし）、ｍｉＲ－１４６結合部位、ｍｉＲ－１４６シード配列及び／またはｍｉＲ－１４６結合部位（シード配列なし）を含めることができる。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、免疫細胞中のｍＲＮＡ治療剤を選択的に分解するための少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位を３’ＵＴＲに含めることで、治療的送達によって引き起こされる望ましくない免疫原性反応を抑制することができる。非限定例として、ｍｉＲＮＡ結合部位が、抗原提示細胞内の本発明のポリヌクレオチドの不安定度を高め得る。それらのｍｉＲＮＡの例としては、限定されるものではないが、ｍｉｒ－１４２－５ｐ、ｍｉｒ－１４２－３ｐ、ｍｉｒ－１４６ａ－５ｐ、及びｍｉｒ－１４６－３ｐが挙げられる。
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ結合タンパク質と相互作用し得るポリヌクレオチドの領域内に少なくとも１つのｍｉＲＮＡ配列を含む。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）は、（ｉ）ＰＢＧＤポリペプチド（例えば、野生型配列、その機能的断片、またはそのバリアント）をコードする配列最適化されたＯＲＦなどのヌクレオチド配列、ならびに（ｉｉ）ｍｉＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ－１４２に結合するｍｉＲＮＡ結合部位）を含む。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書中に開示されるＰＢＧＤポリペプチドをコードするウラシル修飾配列、及び本明細書中に開示されるｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、ｍｉＲ－１４２に結合するｍｉＲＮＡ結合部位、及び／またはｍｉＲ－１２６に結合するｍｉＲＮＡ結合部位を含む。いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書中に開示されるポリペプチドをコードするウラシル修飾配列、及び本明細書中に開示されるｍｉＲＮＡ結合部位、例えばｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１２６、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１４４、ｍｉＲ－１４６、ｍｉＲ－１５０、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－２７またはｍｉＲ－２６ａに結合するｍｉＲＮＡ結合部位を含む。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ１２６－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－５ｐまたはｍｉＲ－１５５に結合する。いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書中に開示されるポリペプチドをコードするウラシル修飾配列と、少なくとも２つの異なるマイクロＲＮＡ結合部位と、を含み、ここで、マイクロＲＮＡは、造血系統の免疫細胞内に発現するか、あるいはＴＬＲ７及び／もしくはＴＬＲ８を発現し炎症促進性サイトカイン及び／もしくはケモカインを分泌する細胞内に発現し、ポリヌクレオチドは、１つ以上の修飾核酸塩基を含む。いくつかの実施形態において、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするウラシル修飾配列は、少なくとも１つの化学修飾された核酸塩基、例えば、５－メトキシウラシルを含む。いくつかの実施形態において、本発明のＰＢＧＤポリペプチドをコードするウラシル修飾配列中の核酸塩基の一種（例えば、ウラシル）の少なくとも９５％は、修飾核酸塩基である。いくつかの実施形態において、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするウラシル修飾配列中のウラシルの少なくとも９５％は、５－メトキシウリジンである。いくつかの実施形態において、本明細書中に開示される、例えばｍｉＲＮＡ結合部位を含むポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）は、例えば式（Ｉ）を有する化合物、例えば化合物１～２３２のいずれか（例えば化合物１８）、式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）もしくは（ＶＩ）を有する化合物、例えば化合物２３３～３４２のいずれか（例えば化合物２３６）、あるいは式（ＶＩＩＩ）を有する化合物、例えば化合物４１９～４２８のいずれか（例えば化合物４２８）、またはそれらの任意の組み合わせを含む送達剤を用いて製剤化される。いくつかの実施形態において、送達剤は、化合物１８、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物４２８（例えば、モル比を約５０：１０：３８．５：１．５としたもの）を含む。
１３．３’ＵＴＲ
ある特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む本発明のポリヌクレオチド）は更に、３’ＵＴＲを含む。
３’ＵＴＲは、翻訳終止コドンのすぐ後に続くｍＲＮＡのセクションであり、多くの場合、転写後に遺伝子発現に対し影響を与える調節領域を含む。３’ＵＴＲ内の調節領域は、ｍＲＮＡのポリアデニル化、翻訳効率、局在化、及び安定性に影響を及ぼし得る。一実施形態において、本発明に有用な３’ＵＴＲは、調節タンパク質またはマイクロＲＮＡに対する結合部位を含む。
ある特定の実施形態において、本発明に有用な３’ＵＴＲのポリヌクレオチドは、配列番号５７～８１、８４、１４９～１５１、１６１～１７２、１９２～１９９、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される３’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態において、３’ＵＴＲは、配列番号１４９～１５１、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、３’ＵＴＲは、配列番号１５０の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、３’ＵＴＲは、配列番号１５１の核酸配列を含む。
ある特定の実施形態において、本発明に有用な３’ＵＴＲ配列は、配列番号５７～８１、８４、１４９～１５１、１６１～１７２、１９２～１９９、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される配列に対して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％もしくは約１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。
１４．５’キャップを有する領域
本発明はまた、５’キャップと本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）の両方を含む、ポリヌクレオチドを含む。
天然ｍＲＮＡの５’キャップ構造は、核輸送に関与し、ｍＲＮＡの安定性を増強させ、ＣＢＰとポリＡ結合タンパク質との会合を介して細胞内でｍＲＮＡ安定性に対する責務を担うｍＲＮＡキャップ結合タンパク質（ＣＢＰ）と結合することによって、成熟した環状ｍＲＮＡ種を形成する。キャップは更に、ｍＲＮＡのスプライシング中に５’近位イントロンを除去する一助となる。
内因性ｍＲＮＡ分子の５’末端キャップによって、末端グアノシンキャップ残基とｍＲＮＡ分子の５’末端転写センスヌクレオチドとの間に５’－ｐｐｐ－５’－トリホスフェート結合が生じ得る。続いて、この５’-グアニレートキャップがメチル化され得r、Ｎ７-メチル-グアニレート残基が生成される。ｍＲＮＡの５’末端及び／または末端前転写ヌクレオチドのリボース糖も、任意に２’-Ｏ-メチル化され得る。グアニレートキャップ構造の加水分解及び切断を介した５’デキャップによって、ｍＲＮＡ分子などの核酸分子を分解の標的とすることが可能である。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）には、キャップ残基が組み込まれている。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）に非加水分解性キャップ構造を具備させることで、デキャップが防止され、結果として、ｍＲＮＡ半減期が延びる。キャップ構造の加水分解では５’－ｐｐｐ－５’ホスホロジエステル結合の切断が必要とされるので、キャッピング反応中に修飾ヌクレオチドを使用することができる。例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）製のワクシニアキャッピング酵素を、メーカーの指示に従ってα－チオ－グアノシンヌクレオチドと併用することで、５’－ｐｐｐ－５’キャップ中にホスホロチオエート結合を生ずることができる。追加的な修飾グアノシンヌクレオチド、例えばαメチル－ホスホネート及びセレノ－フォスフェートヌクレオチドを使用することもできる。
更なる修飾としては、限定されるものではないが、糖環の２’－ヒドロキシル基上での（上記）ポリヌクレオチドの５’末端及び／または５’末端前ヌクレオチドのリボース糖の２’－Ｏ－メチル化が挙げられる。複数の異なる５’キャップ構造を用いることによって、ｍＲＮＡ分子として機能するポリヌクレオチドなどの、核酸分子の５’キャップを生成することができる。本明細書において、キャップ類縁体は、合成キャップ類似体、化学的キャップ、化学的キャップ類似体、または構造的もしくは機能的キャップ類似体とも呼ばれ、キャップ機能を保持しているが、その化学構造は天然の（すなわち、内因性、野生型もしくは生理学的）５’キャップとは異なる。キャップ類縁体は、化学的に（すなわち非酵素的に）または酵素的に合成し、及び／または本発明のポリヌクレオチドに結合することができる。
例えば、抗逆方向キャップ類似体（ＡＲＣＡ）キャップには、５’－５’－トリフォスフェート基によって連結された２つのグアニンが含まれており、１つのグアニンには、Ｎ７メチル基と、３’－Ｏ－メチル基（すなわち、Ｎ７，３’－Ｏ－ジメチル－グアノシン－５’－トリフォスフェート－５’－グアノシン（ｍ７Ｇ－３’ｍｐｐｐ－Ｇ）と、が含有されている。後者は等価的に３’Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ）と称され得る。他方の修飾されていないグアニン３’－Ｏ原子は、キャップ付きポリヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドに連結されるようになる。Ｎ７－及び３’－Ｏ－メチル化グアニンによって、キャップ付きポリヌクレオチドの末端部分が提供される。
例示的なキャップとしては、ｍＣＡＰがある。このｍＣＡＰは、ＡＲＣＡに類似しているが、グアノシン上に、２’－Ｏ－メチル基を有する（すなわち、Ｎ７，２’－Ｏ－ジメチル－グアノシン－５’－トリフォスフェート－５’－グアノシン、ｍ７Ｇｍ－ｐｐｐ－Ｇ）。
いくつかの実施形態において、キャップは、ジヌクレオチドキャップ類縁体である。ジヌクレオチドキャップ類似体の例としては、限定されるものではないが、米国特許第ＵＳ８，５１９，１１０号において記載されているジヌクレオチドキャップ類似体のような、ボラノホスフェート基またはホスホロセレノエート基を用いて異なるホスフェート位置で修飾することができる。本文献の全容は本明細書中に参照により組み込まれる。
別の実施形態において、キャップは、当該技術分野において公知の、及び／または本明細書に記載されているＮ７－（４－クロロフェノキシエチル）置換ジヌクレオチド形態のキャップ類似体である。Ｎ７－（４－クロロフェノキシエチル）置換ジヌクレオチド形態のキャップ類似体の例としては、限定されるものではないが、Ｎ７－（４－クロロフェノキシエチル）－Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、及びＮ７－（４－クロロフェノキシエチル）－ｍ３’－ＯＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップ類縁体が挙げられる（例えば、Ｋｏｒｅ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１３ ２１：４５７０－４５７４に記載されている種々のキャップ類縁体及びキャップ類縁体の合成方法を参照のこと。本文献の全容は、本明細書中に参照により組み込まれる）。別の実施形態において、本発明のキャップ類縁体は、４－クロロ／ブロモフェノキシエチル類似体である。
キャップ類似体は、ポリヌクレオチドまたはその領域に対する同時的キャップ付加を可能にするが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応では、転写産物のうち、キャップされていないままの状態に維持される可能性のあるものが最高２０％にも及ぶ。上記のことと、内因性細胞転写機構を介して産生された核酸の内因性５’キャップ構造に起因するキャップ類似体の構造上の相違とが相俟って、翻訳能力の低下及び細胞安定性の低下をも招来する可能性がある。
本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）はまた、製造後（ＩＶＴか化学合成）に酵素を使用してキャップ付加することによって、より真正性の高い５’キャップ構造を生成することができる。本明細書において「より真正性の高い」という語句は、内因性または野生型特徴を、構造的にもしくは機能的に、密接に反映するかあるいは模倣する特徴を指す。つまり、「より真正性の高い」特徴は、先行技術の合成の特徴または類似体などと比較して、内因性、野生型、天然もしくは生理学的な細胞機能及び／または構造に優れているか、あるいは１つ以上の点で対応する内因性、野生型、天然もしくは生理学的特徴よりも優れているものの代表例である。限定されるものではないが、本発明のより真正性の高い５’キャップ構造の例としては、当該技術分野において公知の合成５’キャップ構造と比較して（または野性型、天然型または生理学的な５’キャップ構造と比較して）、キャップ結合タンパク質の結合が強化され、半減期が延び、５’エンドヌクレアーゼに対する感受性が低減され、及び／または５’デキャップが低減されている。例えば、組み換えワクシニアウイルスキャッピング酵素及び組み換え２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ酵素は、例えば当該技術分野において公知の他の５’キャップアナログ構造に対して、ポリヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドとグアニンキャップヌクレオチドとの間に標準５’－５’－トリフォスフェート結合を生成し得る。キャップグアニンには７メチル化が含まれ、ｍＲＮＡＮの５’末端ヌクレオチドには、２’－Ｏ－メチルが含まれる。そのような構造は、キャップ１構造と呼ばれる。このキャップは、例えば、当該技術分野において公知の他の５’キャップアナログ構造と比較して、翻訳能力の向上、細胞安定性の増強、及び細胞性炎症性サイトカインの活性化の低下をもたらす。キャップ構造としては、限定されるものではないが、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ，ｐＮ２ｐ（キャップ０）、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐ（キャップ１）、及び７ｍＧ（５’）－ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮ２ｍｐ（キャップ２）が挙げられる。
非限定的な例として、製造後のキメラポリヌクレオチドのキャッピングは、キメラポリヌクレオチドのほぼ１００％をキャップするほど、効率が高くなり得る。これは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応の過程でキャップ類似体がキメラポリヌクレオチドに連結されている場合の約８０％とは対照的である。
本発明によれば５’末端キャップは、内因性キャップまたはキャップ類縁体を含むことができる。本発明によれば５’末端キャップは、グアニン類似体を含むことができる。有用なグアニン類似体としては、限定されるものではないが、イノシン、Ｎ１－メチル－グアノシン、２’フルオロ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、２－アミノ－グアノシン、ＬＮＡ－グアノシン、及び２－アジド－グアノシンが挙げられる。
１５．ポリＡ尾部
いくつかの実施形態において、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は更に、ポリＡ尾部を含む。更なる実施形態では、安定化のために、ポリＡ尾部上に末端基が組み込まれ得る。他の実施形態において、ポリＡ尾部はｄｅｓ－３’ヒドロキシル尾部を含む。
長鎖アデニンヌクレオチド（ポリＡ尾部）をｍＲＮＡ分子などのポリヌクレオチドに付加されると、ＲＮＡプロセシング中の安定性増強ができる。転写直後に、転写物の３’末端が切断されて、３’ヒドロキシルが遊離し得る。ここで、ポリＡポリメラーゼによって、アデニンヌクレオチドの鎖がＲＮＡに付加される。ポリアデニル化と呼ばれるこのプロセスによって、例えば、およそ８０～およそ２５０残基長（およそ８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０または２５０残基長など）のポリＡ尾部が付加され得る。
また、コンストラクトが核から排出された後に、ポリＡ尾部が付加され得る。
本発明によれば、安定化をのために、ポリＡ尾部上に末端基が組み込まれ得る。本発明のポリヌクレオチドは、ｄｅｓ－３’ヒドロキシル尾部を含むことができる。また、全容体本明細書中に参照により組み込まれるＪｕｎｊｉｅ Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５，１５０１-１５０７，Ａｕｇｕｓｔ ２３，２００５によって教示されているような構造的残基または２’－Ｏ－メチル修飾を含むこともできる。
本発明のポリヌクレオチドは、ヒストンｍＲＮＡを含む代替のポリＡ尾部構造を有する転写物がコードされるように、デザインできる。Ｎｏｒｂｕｒｙによれば、「末端ウリジル化はまた、ヒト複製依存性ヒストンｍＲＮＡ上でも検出されている。それらｍＲＮＡのターンオーバーは、染色体ＤＮＡ複製が完了したかまたは阻害された後に有毒なヒストンが蓄積される可能性を未然に防止するうえで、重要であると考えられている。これらのｍＲＮＡは、３’ポリ（Ａ）尾部が欠如している点で判別され、代わりに、その機能は、安定なステムループ構造及びその同族のステムループ結合タンパク質（ＳＬＢＰ）によって担われる。後者はポリアデニル化されたｍＲＮＡのＰＡＢＰと同じ機能を遂行する」（Ｎｏｒｂｕｒｙ，”Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ＲＮＡ：ａ ｃａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｔａｉｌ ｗａｇｇｉｎｇ ｔｈｅ ｄｏｇ”，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ；ＡＯＰ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２９ Ａｕｇｕｓｔ ２０１３；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｍ３６４５）、本文献の全容は本明細書中に参照により組み込まれる。
独自のポリＡ尾部の長さにより、本発明のポリヌクレオチドに対しある特定の恩恵がもたらされる。ポリＡ尾部（存在する場合）の長さは、概ね３０ヌクレオチド長を超える。別の実施形態において、ポリＡ尾部は、３５ヌクレオチド長を超える（例えば、少なくとも約３５ヌクレオチド長、４０ヌクレオチド長、４５ヌクレオチド長、５０ヌクレオチド長、５５ヌクレオチド長、６０ヌクレオチド長、７０ヌクレオチド長、８０ヌクレオチド長、９０ヌクレオチド長、１００ヌクレオチド長、１２０ヌクレオチド長、１４０ヌクレオチド長、１６０ヌクレオチド長、１８０ヌクレオチド長、２００ヌクレオチド長、２５０ヌクレオチド長、３００ヌクレオチド長、３５０ヌクレオチド長、４００ヌクレオチド長、４５０ヌクレオチド長、５００ヌクレオチド長、６００ヌクレオチド長、７００ヌクレオチド長、８００ヌクレオチド長、９００ヌクレオチド長、１，０００ヌクレオチド長、１，１００ヌクレオチド長、１，２００ヌクレオチド長、１，３００ヌクレオチド長、１，４００ヌクレオチド長、１，５００ヌクレオチド長、１，６００ヌクレオチド長、１，７００ヌクレオチド長、１，８００ヌクレオチド長、１，９００、ヌクレオチド長２，０００、ヌクレオチド長２，５００ヌクレオチド長及び３，０００ヌクレオチド長またはそれより長い）。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドまたはその領域は、約３０～約３，０００ヌクレオチド（例えば、３０～５０、３０～１００、３０～２５０、３０～５００、３０～７５０、３０～１，０００、３０～１，５００、３０～２，０００、３０～２，５００、５０～１００、５０～２５０、５０～５００、５０～７５０、５０～１，０００、５０～１，５００、５０～２，０００、５０～２，５００、５０～３，０００、１００～５００、１００～７５０、１００～１，０００、１００～１，５００、１００～２，０００、１００～２，５００、１００～３，０００、５００～７５０、５００～１，０００、５００～１，５００、５００～２，０００、５００～２，５００、５００～３，０００、１，０００～１，５００、１，０００～２，０００、１，０００～２，５００、１，０００～３，０００、１，５００～２，０００、１，５００～２，５００、１，５００～３，０００、２，０００～３，０００、２，０００～２，５００、及び２，５００～３，０００ヌクレオチド）を含む。
いくつかの実施形態において、ポリＡ尾部は、ポリヌクレオチド全長またはポリヌクレオチドの特定領域の長さに関連してデザインされている。このデザインは、コーディング領域の長さ、特定の特徴もしくは領域の長さ、またはポリヌクレオチドから発現する最終産物の長さに基づくものとしてもよい。
これに関連して、ポリＡ尾部は、ポリヌクレオチドまたはその特徴よりも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは１００％長くなり得る。また、ポリＡ尾部を、そのポリＡ尾部の属するポリヌクレオチドの一部としてデザインすることもできる。これに関連して、ポリＡ尾部は、コンストラクトの全長の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％もしくは９０％もしくはそれを超える長さとなり得、あるいはコンストラクト領域またはコンストラクトの全長からポリＡ尾部を減じた長さであり得る。更に、ポリＡ結合タンパク質用に操作された結合部位、及びポリヌクレオチドのコンジュゲーションによって、発現の増強が可能となる。
加えて、ポリＡ尾部の３’末端における修飾ヌクレオチドを使用して、ＰＡＢＰ（ポリＡ結合タンパク質）を介して３’末端経由で、複数の異なるポリヌクレオチドを一体的に連結することができる。関連する細胞株においてトランスフェクション実験を実施でき、トランスフェクション後１２時間目、２４時間目、４８時間目、７２時間目及び７日目に、タンパク質の産生をＥＬＩＳＡでアッセイすることができる。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ポリＡ－Ｇカルテット領域を含むようにデザインされている。Ｇ－カルテットは、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方においてＧに富む配列を介して形成できる４つのグアニンヌクレオチドの環状水素結合アレイである。本実施形態において、Ｇ－カルテットはポリＡ尾部の末端内に組み込まれる。結果として得られたポリヌクレオチドを、安定性、タンパク質の産生、及び他のパラメータ（様々な時点における半減期など）に関してアッセイする。これまで発見されてきたように、ポリＡ－Ｇカルテットを組み込んだことによってｍＲＮＡからタンパク質が産生され、この産生は、１２０ヌクレオチド単独のポリＡ尾部を用いて確認されたｍＲＮＡの少なくとも７５％に相当する。
１６．開始コドン領域
本発明はまた、開始コドン領域、及び本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）の両方を含むポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、開始コドン領域に類似する領域、または開始コドン領域と同様に機能する領域を有し得る。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドの翻訳は、開始コドンＡＵＧ以外のコドン上で開始され得る。ポリヌクレオチドの翻訳は、代替の開始コドン（例えば、限定されるものではないが、ＡＣＧ、ＡＧＧ、ＡＡＧ、ＣＴＧ／ＣＵＧ、ＧＴＧ／ＧＵＧ、ＡＴＡ／ＡＵＡ、ＡＴＴ／ＡＵＵ、ＴＴＧ／ＵＵＧ）上で開始され得る（Ｔｏｕｒｉｏｌ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ ９５（２００３）１６９－１７８及びＭａｔｓｕｄａ ａｎｄ Ｍａｕｒｏ ＰＬｏＳ ＯＮＥ，２０１０ ５：１１を参照、それらの各文献の全容は本明細書中に参照により組み込まれる）。
ポリヌクレオチドの翻訳の例としては、限定されるものではないが、代替の開始コドンＡＣＧ上で開始されるものが挙げられる。もう１つのポリヌクレオチドの翻訳の非限定例としては、代替の開始コドンＣＴＧまたはＣＵＧ上で開始されるものが挙げられる。更に別のポリヌクレオチドの翻訳の非限定例としては、代替の開始コドンＧＴＧまたはＧＵＧ上で開始されるものが挙げられる。
翻訳を開始するコドンに隣接するヌクレオチド（例えば、限定されるものではないが、開始コドンまたは代替の開始コドン）は、ポリヌクレオチドの翻訳効率、長さ及び／または構造に影響を及ぼすことが知られている。（例えば、Ｍａｔｓｕｄａ ａｎｄ Ｍａｕｒｏ ＰＬｏＳ ＯＮＥ，２０１０ ５：１１を参照のこと。本文献の全容は、本明細書中に参照により組み込まれる）。翻訳を開始するコドンに隣接するヌクレオチドのいずれかをマスキングすることにより、ポリヌクレオチドの翻訳開始位置、翻訳効率、長さ及び／または構造を変更できる。
いくつかの実施形態では、開始コドンまたは代替の開始コドン付近にマスキング剤を使用してコドンをマスキングまたは隠蔽することによって、マスキングされた開始コドンまたは代替の開始コドンの翻訳開始確率を低下させることができる。マスキング剤の例としては、限定されるものではないが、アンチセンスロック核酸（ＬＮＡ）ポリヌクレオチド及びエキソン接合部複合体（ＥＪＣ）が挙げられる（例えば、Ｍａｔｓｕｄａ ａｎｄ Ｍａｕｒｏによるマスキング剤ＬＮポリヌクレオチド及びＥＪＣに関する記載（ＰＬｏＳ ＯＮＥ，２０１０ ５：１１）を参照のこと。本文献の全容は本明細書中に参照により組み込まれる）。
別の実施形態では、マスキング剤を使用してポリヌクレオチドの開始コドンをマスキングすることにより、翻訳が代替の開始コドン上で開始される可能性を高めることができる。いくつかの実施形態では、マスキング剤を使用して第１の開始コドンまたは代替の開始コドンをマスキングして、開始コドンまたはマスキングされた開始コドンまたは代替開始コドンより下流の代替開始コドン上で翻訳が開始される可能性を高めることができる。
いくつかの実施形態において、開始コドンまたは代替の開始コドンは、ｍｉＲＮＡ結合部位に対する完全補完体の内部に位置し得る。ｍｉＲＮＡ結合部位に対する完全補完体は、マスキング剤と同様にポリヌクレオチドの翻訳、長さ及び／または構造を制御する一助となり得る。開始コドンまたは代替の開始コドンの例としては、限定されるものではないが、ｍｉＲＮＡ結合部位に対する完全補完体の中央に位置し得るものを挙げることができる。開始コドンまたは代替開始コドンは、第１ヌクレオチド、第２ヌクレオチド、第３ヌクレオチド、第４ヌクレオチド、第５ヌクレオチド、第６ヌクレオチド、第７ヌクレオチド、第８ヌクレオチド、第９ヌクレオチド、第１０ヌクレオチド、第１１ヌクレオチド、第１２ヌクレオチド、第１３ヌクレオチド、第１４ヌクレオチド、第１５ヌクレオチド、第１６ヌクレオチド、第１７ヌクレオチド、第１８ヌクレオチド、第１９ヌクレオチド、第２０ヌクレオチドまたは第２１ヌクレオチドの後に位置し得る。
別の実施形態では、ポリヌクレオチドの開始コドンをポリヌクレオチド配列から除去することによって、その開始コドン以外のコドン上で、ポリヌクレオチドの翻訳を開始することができる。その除去された開始コドンの後に続くコドン上で、下流の開始コドン上で、または代替の開始コドン上で、ポリヌクレオチドの翻訳を開始できる。非限定的な例では、開始コドンＡＴＧまたはＡＵＧをポリヌクレオチド配列の最初の３ヌクレオチドとして除去することによって、下流の開始コドン上でまたは代替の開始コドン上で、翻訳が開始されるようになる。開始コドンが除去されたポリヌクレオチド配列内に、下流の開始コドン及び／または代替の開始コドン用に少なくとも１つのマスキング剤を更に含めることによって、翻訳の開始、ポリヌクレオチドの長さ、及び／またはポリヌクレオチドの構造を制御するかあるいその制御を試みることができる。
１７．終止コドン領域
本発明はまた、終止コドン領域、及び本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）の両方を含むポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の前に少なくとも２つの終止コドンを含むことができる。ＤＮＡの場合はＴＧＡ、ＴＡＡ及びＴＡＧからコドンを選択することができ、ＲＮＡの場合はＵＧＡ、ＵＡＡ及びＵＡＧから終止コドンを選択することができる。いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡの場合は終止コドンＴＧＡ、またはＲＮＡの場合は終止コドンＵＧＡ、及び１つの追加的な終止コドンを含む。更なる実施形態において、追加的な終止コドンは、ＴＡＡまたはＵＡＡであり得る。別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、３つの連続した終止コドン、４つの終止コドン、またはそれより多くの終止コドンを含む。
１８．挿入及び置換
本発明はまた、挿入及び／または置換を含んだ本開示のポリヌクレオチドを更に含む。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドの５’ＵＴＲは、同じ塩基のヌクレオシドの少なくとも１つの領域及び／またはストリングの挿入によって置換できる。ヌクレオシドの領域及び／またはストリングは、限定されるものではないが、少なくとも３ヌクレオチド、少なくとも４ヌクレオチド、少なくとも５ヌクレオチド、少なくとも６ヌクレオチド、少なくとも７または少なくとも８ヌクレオチドを含み得、このヌクレオチドは天然及び／または非天然のものであり得る。ヌクレオチドの基の例としては、限定されるものではないが、５～８個のアデニン、シトシン、チミン、本明細書中に開示される他のヌクレオチドのいずれかのストリング、及び／またはそれらの組み合わせを挙げることができる。
いくつかの実施形態では、少なくとも２つの領域及び／または２つの異なる塩基のヌクレオチドのストリング（例えば、限定されるものではないが、本明細書中に開示されるアデニン、シトシン、チミン、他のヌクレオチドのいずれか、及び／またはそれらの組み合わせ）を挿入することによって、ポリヌクレオチドの５’ＵＴＲを置換することができる。例えば、まず５～８個のアデニン塩基を挿入してから５～８個のシトシン塩基を挿入することによって、５’ＵＴＲを置換することができる。別の実施例では、まず５～８個のシトシン塩基を挿入してから５～８個のアデニン塩基を挿入することによって、５’ＵＴＲを置換することができる。
いくつかの実施形態においてポリヌクレオチドは、ＲＮＡポリメラーゼにより認識できる転写開始部位の下流に、少なくとも１つの置換及び／または挿入を含むことができる。非限定例として、少なくとも１つの置換及び／または挿入は、少なくとも１つ（例えば、限定されるものではないが、＋１～＋６）の核酸を置換することによって、転写開始部位のすぐ下流の領域内に発生し得る。転写開始部位のすぐ下流のヌクレオチドの領域への変化は、開始速度に影響を及ぼし、見かけのヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）反応定数値を増強させ、転写複合体の初期転写を矯正する短い転写物の解離を増強させる（全体が、本明細書中に参照により組み込まれるＢｒｉｅｂａ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００２）４１：５１４４－５１４９）。少なくとも１つのヌクレオシドの修飾、置換及び／または挿入によって、配列のサイレント変異が引き起こされ得、あるいはアミノ酸配列内に変異が引き起こされ得る。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、転写開始部位の下流にて、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２または少なくとも１３グアニン塩基の置換を含むことができる。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、転写開始部位のすぐ下流の領域内にて、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５または少なくとも６グアニン塩基の置換を含むことができる。非限定的な例として、領域中のヌクレオチドがＧＧＧＡＧＡである場合、グアニン塩基を、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つまたは少なくとも４つのアデニンヌクレオチドで置換することができる。別の非限定的な例では、領域中のヌクレオチドがＧＧＧＡＧＡである場合、グアニン塩基を、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つまたは少なくとも４つのシトシン塩基で置換することができる。別の非限定的な例では、領域中のヌクレオチドがＧＧＧＡＧＡである場合、グアニン塩基を、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つまたは少なくとも４つのチミンで、及び／または本明細書に記載のヌクレオチドのいずれかで、置換することができる。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの置換及び／または挿入を、開始コドンの上流に含むことができる。明確にするため記すと、開始コドンがタンパク質コーディング領域の最初のコドンである一方、転写開始部位は転写が開始する部位である。このことは、当業者に理解されるであろう。ポリヌクレオチドは、限定されるものではないが、ヌクレオチド塩基は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６、少なくとも７つまたは少なくとも８つ置換及び／または挿入を含むことができる。ヌクレオチド塩基は、１つ、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つまたは少なくとも５つの位置を、開始コドンの上流に挿入または置換し得る。挿入および／または置換されたヌクレオチドは、同じ塩基（例えば、全てのＡまたは全てのＣまたは全てのＴまたは全てのＧ）、２つの異なる塩基（例えば、Ａ及びＣ、Ａ及びＴ、またはＣ及びＴ）、３つの異なる塩基（例えば、Ａ、Ｃ及びＴまたはＡ、Ｃ及びＴ）または少なくとも４つの異なる塩基であり得る。
非限定的な例として、ポリヌクレオチド中のコーディング領域の上流にあるグアニン塩基は、アデニン、シトシン、チミン、または本明細書に記載のヌクレオチドのいずれかで置換することができる。別の非限定的な例において、ポリヌクレオチド中のグアニン塩基の置換は、転写開始部位の下流にあって開始コドンの前にある領域に１つのグアニン塩基を残すようにデザインすることができる（Ｅｓｖｅｌｔ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（２０１１）４７２（７３４４）：４９９－５０３を参照のこと。本文献の全容は本明細書中に参照により組み込まれる）。非限定的な例として、少なくとも５ヌクレオチドを、転写開始部位の下流であるが開始コドンの上流の１つの位置にに挿入することができ、少なくとも５ヌクレオチドは同じ塩基型であり得る。
１９．ＰＢＧＤポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含むポリヌクレオチド
ある特定の実施形態において、本開示のポリヌクレオチド、例えば、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするｍＲＮＡヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、５’末端から３’末端で：
（ｉ）上記の５’キャップ、
（ｉｉ）５’ＵＴＲ、例えば上記の配列、
（ｉｉｉ）ＰＢＧＤポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、例えば、本明細書中に開示されるＰＢＧＤをコードする配列最適化された核酸配列、
（ｉｖ）少なくとも１つの終止コドン、
（ｖ）３’ＵＴＲ、例えば上記の配列、及び
（ｖｉ）上記のポリＡ尾部、を含む。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは更に、ｍｉＲＮＡ－１４２に結合するｍｉＲＮＡ結合部位などの、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。
いくつかの実施形態において、本開示のポリヌクレオチドは、野生型ＰＢＧＤ（例えば、アイソフォーム１、２、３もしくは４）のタンパク質配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％同一である、ポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、本開示のポリヌクレオチド、例えば、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするｍＲＮＡヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、（１）上記の５’キャップ、例えばＣＡＰ１、（２）配列番号１３３、１４１、１４４及び１４５からなる群から選択されるヌクレオチド配列、及び（３）上記のポリＡ尾部（例えば約１００残基のポリＡ尾部）とを含み、
配列番号１３３は、５’末端から３’末端で、配列番号３９の５’ＵＴＲ、配列番号１０４のＰＢＧＤポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号１４９の３’ＵＴＲを含み、
配列番号１４１は、５’末端から３’末端で、配列番号３９の５’ＵＴＲ、配列番号１１２のＰＢＧＤポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号１４９の３’ＵＴＲを含み、
配列番号１４４は、５’末端から３’末端で、配列番号３９の５’ＵＴＲ、配列番号１１２のＰＢＧＤポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号１５０の３’ＵＴＲを含み、
配列番号１４５は、５’末端から３’末端で、配列番号３９の５’ＵＴＲ、配列番号１１２のＰＢＧＤポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号１５１の３’ＵＴＲを含む。
いくつかの実施形態において、本開示のポリヌクレオチド、例えば、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするｍＲＮＡヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、（１）上記の５’キャップ、例えばＣＡＰ１、（２）配列番号１１８～１３２、１３４～１４０、１４２、１４３及び１４６～１４８からなる群から選択されるヌクレオチド配列、及び（３）上記のポリＡ尾部、例えば約１００残基のポリＡ尾部とを含み、
配列番号１１８は、５’末端から３’末端で、配列番号３９の５’ＵＴＲ、配列番号８９のＰＢＧＤポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号１４９の３’ＵＴＲを含み、
配列番号１１９は、５’末端から３’末端で、配列番号３９の５’ＵＴＲ、配列番号９０のＰＢＧＤポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号１４９の３’ＵＴＲを含み、
配列番号１２０は、５’末端から３’末端で、配列番号３９の５’ＵＴＲ、配列番号９１のＰＢＧＤポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号１４９の３’ＵＴＲを含み、
配列番号１２１は、５’末端から３’末端で、配列番号３９の５’ＵＴＲ、配列番号９２のＰＢＧＤポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号１４９の３’ＵＴＲを含み、
配列番号１２２は、５’末端から３’末端で、配列番号３９の５’ＵＴＲ、配列番号９３のＰＢＧＤポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号１４９の３’ＵＴＲを含み、
配列番号１２３は、５’末端から３’末端で、配列番号３９の５’ＵＴＲ、配列番号９４のＰＢＧＤポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号１４９の３’ＵＴＲを含み、
配列番号１２４は、５’末端から３’末端で、配列番号３９の５’ＵＴＲ、配列番号９５のＰＢＧＤポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号１４９の３’ＵＴＲを含み、
配列番号１２５は、５’末端から３’末端で、配列番号３９の５’ＵＴＲ、配列番号９６のＰＢＧＤポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号１４９の３’ＵＴＲを含み、
配列番号１２６は、５’末端から３’末端で、配列番号３９の５’ＵＴＲ、配列番号９７のＰＢＧＤポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号１４９の３’ＵＴＲを含み、
配列番号１２７は、５’末端から３’末端で、配列番号３９の５’ＵＴＲ、配列番号９８のＰＢＧＤポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号１４９の３’ＵＴＲを含み、
配列番号１２８は、５’末端から３’末端で、配列番号３９の５’ＵＴＲ、配列番号９９のＰＢＧＤポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号１４９の３’ＵＴＲを含み、
配列番号１２９は、５’末端から３’末端で、配列番号３９の５’ＵＴＲ、配列番号１００のＰＢＧＤポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号１４９の３’ＵＴＲを含み、
配列番号１３０は、５’末端から３’末端で、配列番号３９の５’ＵＴＲ、配列番号１０１のＰＢＧＤポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号１４９の３’ＵＴＲを含み、
配列番号１３１は、５’末端から３’末端で、配列番号３９の５’ＵＴＲ、配列番号１０２のＰＢＧＤポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号１４９の３’ＵＴＲを含み、
配列番号１３２は、５’末端から３’末端で、配列番号３９の５’ＵＴＲ、配列番号１０３のＰＢＧＤポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号１４９の３’ＵＴＲを含み、
配列番号１３４は、５’末端から３’末端で、配列番号３９の５’ＵＴＲ、配列番号１０５のＰＢＧＤポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号１４９の３’ＵＴＲを含み、
配列番号１３５は、５’末端から３’末端で、配列番号３９の５’ＵＴＲ、配列番号１０６のＰＢＧＤポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号１４９の３’ＵＴＲを含み、
配列番号１３６は、５’末端から３’末端で、配列番号３９の５’ＵＴＲ、配列番号１０７のＰＢＧＤポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号１４９の３’ＵＴＲを含み、
配列番号１３７は、５’末端から３’末端で、配列番号３９の５’ＵＴＲ、配列番号１０８のＰＢＧＤポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号１４９の３’ＵＴＲを含み、
配列番号１３８は、５’末端から３’末端で、配列番号３９の５’ＵＴＲ、配列番号１０９のＰＢＧＤポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号１４９の３’ＵＴＲを含み、
配列番号１３９は、５’末端から３’末端で、配列番号３９の５’ＵＴＲ、配列番号１１０のＰＢＧＤポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号１４９の３’ＵＴＲを含み、
配列番号１４０は、５’末端から３’末端で、配列番号３９の５’ＵＴＲ、配列番号１１１のＰＢＧＤポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号１４９の３’ＵＴＲを含み、
配列番号１４２は、５’末端から３’末端で、配列番号３９の５’ＵＴＲ、配列番号１１３のＰＢＧＤポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号１４９の３’ＵＴＲを含み、
配列番号１４３は、５’末端から３’末端で、配列番号３９の５’ＵＴＲ、配列番号１１４のＰＢＧＤポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号１４９の３’ＵＴＲを含み、
配列番号１４６は、５’末端から３’末端で、配列番号３９の５’ＵＴＲ、配列番号１１５のＰＢＧＤポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号１４９の３’ＵＴＲを含み、
配列番号１４７は、５’末端から３’末端で、配列番号３９の５’ＵＴＲ、配列番号１１６のＰＢＧＤポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号１４９の３’ＵＴＲを含み、
配列番号１４８は、５’末端から３’末端で、配列番号３９の５’ＵＴＲ、配列番号１１７のＰＢＧＤポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号１４９の３’ＵＴＲを含む。
表５ ｍＲＮＡコンストラクト
Figure 2023062097000056
Figure 2023062097000057
Figure 2023062097000058
Figure 2023062097000059
Figure 2023062097000060
Figure 2023062097000061
Figure 2023062097000062
Figure 2023062097000063
Figure 2023062097000064
Figure 2023062097000065
Figure 2023062097000066
Figure 2023062097000067
Figure 2023062097000068
２０．ポリヌクレオチドの作製方法
本開示は、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）またはその相補体を作製するための方法も提供する。
いくつかの態様では、本明細書に開示され、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を使用して構築することができる。他の態様では、本明細書に開示され、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、オリゴヌクレオチド合成装置を使用する化学合成により構築することができる。
他の態様では、本明細書に開示され、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、宿主細胞を使用して作製される。ある特定の態様では、本明細書に開示され、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＩＶＴ、化学合成、宿主細胞発現、または当該技術分野で既知の他の任意の方法のうちの１つ以上の組み合わせにより作製される。
天然に存在するヌクレオシド、天然に存在しないヌクレオシド、またはそれらの組み合わせは、候補ヌクレオチド配列に存在する天然に存在するヌクレオシドを全体的または部分的に置換することができ、ＰＢＧＤポリペプチドをコードする配列最適化ヌクレオチド配列（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）に組み込むことができる。次に、得られたポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡは、タンパク質を産生する能力及び／または治療的結果を生じる能力について試験することができる。
ａ．ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／酵素合成
本明細書に開示の本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）系を使用して転写することができる。このシステムは通常、転写緩衝液、ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）、ＲＮａｓｅ阻害薬、及びポリメラーゼを含む。ＮＴＰは、天然及び非天然（修飾）ＮＴＰを含む、本明細書に記載のものから選択することができるが、これらに限定されない。ポリメラーゼは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、及び変異ポリメラーゼ、例えば、限定されないが、本明細書に開示のポリヌクレオチドを取り込むことができるポリメラーゼ、から選択することができるが、これらに限定されない。本明細書に全体が参照により組み込まれる米国特許公開ＵＳ２０１３０２５９９２３を参照のこと。
任意数のＲＮＡポリメラーゼまたはバリアントを、本発明のポリヌクレオチドの合成に使用することができる。ＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼ配列のアミノ酸を挿入または欠失させることにより修飾することができる。非限定例として、ＲＮＡポリメラーゼは、非修飾ＲＮＡポリメラーゼと比較して、２’－修飾ヌクレオチド三リン酸を取り込む能力の増加を示すように修飾することができる（本明細書に全体が参照により組み込まれる国際公開第ＷＯ２００８０７８１８０号及び米国特許第８，１０１，３８５号を参照のこと）。
バリアントは、ＲＮＡポリメラーゼを進化させ、ＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸及び／もしくは核酸配列を最適化することにより、および／または当該技術分野で既知の他の方法を使用することにより得ることができる。非限定例として、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、Ｅｓｖｅｌｔ ｅｔ ａｌ．（本明細書に全体が参照により組み込まれるＮａｔｕｒｅ ４７２：４９９－５０３（２０１１））により述べられている連続指向性進化システムを使用して進化させることができ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼのクローンは、少なくとも１つの変異、例えば、限定されないが、スレオニン（Ｋ９３Ｔ）、Ｉ４Ｍ、Ａ７Ｔ、Ｅ６３Ｖ、Ｖ６４Ｄ、Ａ６５Ｅ、Ｄ６６Ｙ、Ｔ７６Ｎ、Ｃ１２５Ｒ、Ｓ１２８Ｒ、Ａ１３６Ｔ、Ｎ１６５Ｓ、Ｇ１７５Ｒ、Ｈ１７６Ｌ、Ｙ１７８Ｈ、Ｆ１８２Ｌ、Ｌ１９６Ｆ、Ｇ１９８Ｖ、Ｄ２０８Ｙ、Ｅ２２２Ｋ、Ｓ２２８Ａ、Ｑ２３９Ｒ、Ｔ２４３Ｎ、Ｇ２５９Ｄ、Ｍ２６７Ｉ、Ｇ２８０Ｃ、Ｈ３００Ｒ、Ｄ３５１Ａ、Ａ３５４Ｓ、Ｅ３５６Ｄ、Ｌ３６０Ｐ、Ａ３８３Ｖ、Ｙ３８５Ｃ、Ｄ３８８Ｙ、Ｓ３９７Ｒ、Ｍ４０１Ｔ、Ｎ４１０Ｓ、Ｋ４５０Ｒ、Ｐ４５１Ｔ、Ｇ４５２Ｖ、Ｅ４８４Ａ、Ｈ５２３Ｌ、Ｈ５２４Ｎ、Ｇ５４２Ｖ、Ｅ５６５Ｋ、Ｋ５７７Ｅ、Ｋ５７７Ｍ、Ｎ６０１Ｓ、Ｓ６８４Ｙ、Ｌ６９９Ｉ、Ｋ７１３Ｅ、Ｎ７４８Ｄ、Ｑ７５４Ｒ、Ｅ７７５Ｋ、Ａ８２７Ｖ、Ｄ８５１Ｎ、またはＬ８６４Ｆと置換された９３位のリシンをコードすることができる。別の非限定例として、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、本明細書に全体が参照により組み込まれる米国特許公開第２０１００１２００２４号及び同第２００７０１１７１１２号に記載されるような少なくとも変異をコードすることができる。ＲＮＡポリメラーゼのバリアントは、置換バリアント、保存的アミノ酸置換、挿入バリアント、及び／または欠失バリアントも含むことができるが、これらに限定されない。
一態様では、ポリヌクレオチドは、野生型またはバリアントＲＮＡポリメラーゼにより認識されるようにデザインすることができる。そうすることで、ポリヌクレオチドは、野生型または親キメラポリヌクレオチドの配列変化からの部位または領域を含有するように修飾することができる。
ポリヌクレオチドまたは核酸合成反応は、ポリメラーゼを利用する酵素的方法により実施することができる。ポリメラーゼは、ポリヌクレオチドまたは核酸鎖内のヌクレオチド間のホスホジエステル結合の生成を触媒する。現在知られているＤＮＡポリメラーゼは、アミノ酸配列比較及び結晶構造解析に基づいて異なるファミリーに分けることができる。Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ、ならびにＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片を含むＤＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌ Ｉ）またはポリメラーゼファミリーは、最もよく研究されたこれらのファミリーの１つである。別の大きなファミリーは、ファージＴ４及びＲＢ６９由来の全ての真核生物複製ＤＮＡポリメラーゼ及びポリメラーゼを含むＤＮＡポリメラーゼα（ｐｏｌα）またはＢポリメラーゼファミリーである。それらは、同様の触媒機序を用いるが、ポリメラーゼのこれらのファミリーは、基質特異性、基質アナログ組み込み効率、プライマー伸長の程度及び速度、ＤＮＡ合成様式、エキソヌクレアーゼ活性、ならびに阻害剤に対する感受性が異なる。
ＤＮＡポリメラーゼは、それらが必要とする最適な反応条件、例えば、反応温度、ｐＨ、ならびに鋳型及びプライマー濃度に基づいても選択される。場合により、複数のＤＮＡポリメラーゼの組み合わせが、所望のＤＮＡ断片サイズ及び合成効率を達成するために用いられる。例えば、Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．は、ｐＨを上昇させ、グリセロール及びジメチルスルホキシドを添加し、変性時間を減少させ、伸長時間を増加させ、クローニングされたインサート及びヒトゲノムＤＮＡの長い標的を効果的に増幅する３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する第２の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを利用する。（全体が参照により本明細書に組み込まれるＣｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９１：５６９５－５６９９（１９９４））。バクテリオファージＴ３、Ｔ７、及びＳＰ６由来のＲＮＡポリメラーゼは、生化学的及び生物物理学的研究のためのＲＮＡを調製するために広く使用されている。ＲＮＡポリメラーゼ、キャッピング酵素、及びポリＡポリメラーゼは、同時係属の国際公開第ＷＯ２０１４０２８４２９号に開示されており、この内容は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
一態様では、本発明のポリヌクレオチドの合成に使用することができるＲＮＡポリメラーゼは、Ｓｙｎ５ ＲＮＡポリメラーゼである（本明細書に全体が参照により組み込まれるＺｈｕ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１３，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｔ１１９３を参照のこと）。Ｓｙｎ５ ＲＮＡポリメラーゼは近年、Ｚｈｕらにより海洋シアノファージＳｙｎ５から特性決定され、彼らは、プロモーター配列も同定した（内容が本明細書に全体が参照により組み込まれるＺｈｕ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１３を参照のこと）。Ｚｈｕらは、Ｓｙｎ５ ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼと比較して、より広い範囲の温度及び塩分濃度にわたってＲＮＡ合成を触媒することを見出した。さらに、プロモーターでの開始ヌクレオチドに対する要件は、ＲＮＡ合成に有望なＳｙｎ５ ＲＮＡポリメラーゼを作製するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼと比較して、Ｓｙｎ５ ＲＮＡポリメラーゼの場合あまり厳しくないことが判明した。
一態様では、Ｓｙｎ５ ＲＮＡポリメラーゼを、本明細書に記載のポリヌクレオチドの合成に使用することができる。非限定例として、Ｓｙｎ５ ＲＮＡポリメラーゼを、精密な３’末端を必要とするポリヌクレオチドの合成に使用することができる。
一態様では、Ｓｙｎ５プロモーターを、ポリヌクレオチドの合成に使用することができる。非限定例として、Ｓｙｎ５プロモーターは、５’－ＡＴＴＧＧＧＣＡＣＣＣＧＴＡＡＧＧＧ－３’（Ｚｈｕら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１３）により記載されているような配列番号８２）とすることができる。
一態様では、Ｓｙｎ５ ＲＮＡポリメラーゼを、本明細書に記載の及び／または当該技術分野で既知の少なくとも１つの化学修飾を含むポリヌクレオチドの合成に使用することができる（例えば、Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１３に記載されたシュードＵＴＰ及び５Ｍｅ－ＣＴＰを参照のこと）。
一態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、Ｚｈｕら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１３）により記載された修正及び改良された精製手順を使用して精製されているＳｙｎ５ ＲＮＡポリメラーゼを使用して合成することができる。
遺伝子工学での種々のツールは、鋳型として作用する標的遺伝子の酵素的増幅に基づいている。目的の個々の遺伝子または具体的な領域の配列の研究及び他の研究ニーズでは、ポリヌクレオチドまたは核酸の少量の試料から標的遺伝子の複数のコピーを生成することが必要である。そのような方法を、本発明のポリヌクレオチドの製造に適用することができる。
例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）とも呼ばれる核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、及び／またはローリングサークル型増幅（ＲＣＡ）は、本発明のポリヌクレオチドの１つ以上の領域の製造に利用することができる。リガーゼによるポリヌクレオチドまたは核酸のアセンブリもまた、広く使用される。
ｂ．化学合成
目的の単離ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド、例えば、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を合成するために、標準的な方法を適用することができる。例えば、特定の単離されたポリペプチドをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を含有する単一のＤＮＡまたはＲＮＡオリゴマーを合成することができる。他の態様では、所望のポリペプチドの部分をコードするいくつかの小さなオリゴヌクレオチドを合成し、次に、ライゲーションすることができる。いくつかの態様では、個々のオリゴヌクレオチドは通常、相補的なアセンブリのために、５’または３’オーバーハングを含有する。
本明細書に開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、当該技術分野で既知の化学合成方法及び可能な核酸塩基置換を使用して、化学的に合成することができる。例えば、国際公開第ＷＯ２０１４０９３９２４号、同第ＷＯ２０１３０５２５２３号、同第ＷＯ２０１３０３９８５７号、同第ＷＯ２０１２１３５８０５号、同第ＷＯ２０１３１５１６７１号；米国公開第ＵＳ２０１３０１１５２７２号；または米国特許第ＵＳ８９９９３８０号もしくは第ＵＳ８７１０２００号（これらの全ては、本明細書に全体が参照により組み込まれる）を参照のこと。
ｃ．ＰＢＧＤをコードするポリヌクレオチドの精製
本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）の精製は、ポリヌクレオチドのクリーンアップ、品質保証、及び品質管理を含むことができるが、これらに限定されない。クリーンアップは、当該技術分野で既知の方法、例えば、限定されないが、ＡＧＥＮＣＯＵＲＴ（登録商標）ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、マサチューセッツ州ダンバーズ）、ポリＴビーズ、ＬＮＡ（商標）オリゴＴ補足プローブ（ＥＸＩＱＯＮ（登録商標）Ｉｎｃ．、デンマーク・ベドベック）またはＨＰＬＣに基づく精製方法、例えば、限定されないが、強陰イオン交換ＨＰＬＣ、弱陰イオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、及び疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）により実施することができる。
「精製された」という用語は、「精製されたポリヌクレオチド」などのポリヌクレオチドに関して使用される場合、少なくとも１つの汚染物質から分離されるものを指す。本明細書で使用される場合、「汚染物質」は、他の物質を不適当、不純、または粗悪にする物質である。従って、精製されたポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡ）は、自然にみられるものとは異なる形態もしくは環境、または、それを処理もしくは精製方法に供する前に存在するものとは異なる形態もしくは環境で存在する。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）の精製は、望ましくない免疫応答、例えば、サイトカイン活性の低下、を低減または除去することができる不純物を除去する。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、カラムクロマトグラフィー（例えば、強陰イオン交換ＨＰＬＣ、弱陰イオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、及び疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）、または（ＬＣＭＳ））を使用して、投与前に精製される。
いくつかの実施形態では、（カラムクロマトグラフィー（例えば、強陰イオン交換ＨＰＬＣ、弱陰イオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ、疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）、または（ＬＣＭＳ））を使用して精製された本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、異なる精製方法で精製された本開示の同じポリヌクレオチドで得られた発現レベルと比較して、コードされたＰＢＧＤタンパク質の発現の増加を示す。
いくつかの実施形態では、カラムクロマトグラフィー（例えば、強陰イオン交換ＨＰＬＣ、弱陰イオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）、または（ＬＣＭＳ））精製ポリヌクレオチドは、当該技術分野で既知の点変異の１つ以上を含むＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＲＰ－ＨＰＬＣ精製ポリヌクレオチドの使用は、細胞内のＰＢＧＤタンパク質発現レベルを、それらの細胞に導入された時に、ＲＰ－ＨＰＬＣ精製ポリヌクレオチドを細胞に導入する前の、または非ＲＰ－ＨＰＬＣ精製ポリヌクレオチドを細胞に導入した後の細胞内のＰＢＧＤタンパク質の発現レベルに対して、例えば、１０～１００％、すなわち、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％増加させる。
いくつかの実施形態では、ＲＰ－ＨＰＬＣ精製ポリヌクレオチドの使用は、細胞内の機能性ＰＢＧＤタンパク質発現レベルを、それらの細胞に導入された時に、ＲＰ－ＨＰＬＣ精製ポリヌクレオチドを細胞に導入する前の、または非ＲＰ－ＨＰＬＣ精製ポリヌクレオチドを細胞に導入した後の細胞内のＰＢＧＤタンパク質の機能性発現レベルに対して、例えば、１０～１００％、すなわち、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％増加させる。
いくつかの実施形態では、ＲＰ－ＨＰＬＣ精製ポリヌクレオチドの使用は、細胞内の検出可能なＰＢＧＤ活性を、それらの細胞に導入された時に、ＲＰ－ＨＰＬＣ精製ポリヌクレオチドを細胞に導入する前の、または非ＲＰ－ＨＰＬＣ精製ポリヌクレオチドを細胞に導入した後の細胞内の機能性ＰＢＧＤの活性レベルに対して、例えば、１０～１００％、すなわち、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％増加させる。
いくつかの実施形態では、精製ポリヌクレオチドは、少なくとも約８０％の純度、少なくとも約８５％の純度、少なくとも約９０％の純度、少なくとも約９５％の純度、少なくとも約９６％の純度、少なくとも約９７％の純度、少なくとも約９８％の純度、少なくとも約９９％の純度、または約１００％の純度である。
品質保証及び／または品質管理チェックを、例えば、限定されないが、ゲル電気泳動、ＵＶ吸光度、または分析用ＨＰＬＣなどの方法を使用して実施することができる。別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、限定されないが、逆転写酵素ＰＣＲを含む方法で配列決定することができる。
ｄ．ＰＢＧＤをコードする発現ポリヌクレオチドの定量
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）、それらの発現産物、ならびに分解産物及び代謝産物は、当該技術分野で既知の方法に従って定量することができる。
いくつかの実施形態では、エキソソーム内で、または１つ以上の体液から生じる時に、本発明のポリヌクレオチドを定量することができる。本明細書で使用される場合、「体液」は、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、痰、唾液、骨髄、滑液、房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー液または尿道球腺液、汗、糞便、髪、涙、嚢胞液、胸膜及び腹腔液、心嚢液、リンパ液、消化粥、乳糜、胆汁、間質液、経血、膿、皮脂、嘔吐物、膣液、粘膜分泌液、糞便水、膵液、副鼻腔の洗浄液、気管支肺吸引液、胞胚腔液、及び臍帯血を含む。あるいは、エキソソームは、肺、心臓、膵臓、胃、腸、膀胱、腎臓、卵巣、精巣、皮膚、結腸、乳房、前立腺、脳、食道、肝臓、及び胎盤からなる群から選択される器官から回収することができる。
エキソソーム定量法では、多くとも２ｍＬの試料が対象から得られ、エキソソームは、サイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配遠心分離、分画遠心分離、ナノ膜限外濾過、免疫吸着捕捉、アフィニティー精製、マイクロ流体分離、またはそれらの組み合わせで単離される。この分析では、ポリヌクレオチドのレベルまたは濃度は、投与される構築物の発現レベル、存在、不存在、切断、または変更であり得る。レベルを、１つ以上の臨床表現型またはヒト疾患バイオマーカーのアッセイと関連させることが有利である。
アッセイは、構築物特異的プローブ、サイトメトリー、ｑＲＴ－ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ＰＣＲ、フローサイトメトリー、電気泳動、質量分析、またはそれらの組み合わせを使用して実施することができるが、エキソソームは、免疫組織化学的方法、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）法、を使用して単離することができる。エキソソームは、サイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配遠心分離、分画遠心分離、ナノ膜限外濾過、免疫吸着捕捉、アフィニティー精製、マイクロ流体分離、またはそれらの組み合わせでも単離することができる。
これらの方法は、研究者に、残存するかまたは送達されたポリヌクレオチドのレベルをリアルタイムで監視する能力を提供する。これは、本発明のポリヌクレオチドが構造的または化学的修飾のために内因性形態と異なるために、可能である。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、限定されないが、紫外可視分光法（ＵＶ／Ｖｉｓ）等の方法をを使用して定量することができる。ＵＶ／Ｖｉｓ分光計の非限定例としては、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（登録商標）分光計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、マサチューセッツ州ウォルサム）である。定量されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが適切なサイズであることができるかどうかを決定するために、分析することができ、ポリヌクレオチドの分解が生じていないことを確認することができる。ポリヌクレオチドの分解は、限定されないが、アガロースゲル電気泳動、ＨＰＬＣ系精製方法、例えば、限定されないが、強陰イオン交換ＨＰＬＣ、弱陰イオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、及び疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）、液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣＭＳ）、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）、ならびにキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）等の方法でで確認することができる。
２１．医薬組成物及び製剤
本発明は、上記ポリヌクレオチドのいずれかを含む医薬組成物及び製剤を提供する。いくつかの実施形態では、組成物または製剤は、送達剤をさらに含む。
いくつかの実施形態では、組成物または製剤は、ＰＢＧＤポリペプチドをコードする本明細書に開示の配列最適化核酸配列を含むポリヌクレオチドを含有することができる。いくつかの実施形態では、組成物または製剤は、ＰＢＧＤポリペプチドをコードする本明細書に開示の配列最適化核酸配列と著しい配列同一性を有するポリヌクレオチド（例えば、ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を含有することができる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｍｉＲ結合部位、例えば、ｍｉＲ－１２６、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１４４、ｍｉＲ－１４６、ｍｉＲ－１５０、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－２７、及びｍｉＲ－２６ａに結合するｍｉＲＮＡ結合部位をさらに含む。
医薬組成物または製剤は、１つ以上のさらなる活性物質、例えば、治療的及び／または予防的活性物質を任意に含むことができる。本発明の医薬組成物または製剤は、滅菌及び／または発熱性物質不含であることができる。医薬品の製剤及び／または製造における一般的考察は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２１ｓｔ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５（全体が参照により本明細書に組み込まれる）に見出すことができる。いくつかの実施形態では、組成物は、ヒト、ヒト患者、または対象に投与される。本開示の目的のために、「活性成分」という語句は一般に、本明細書に記載されるように送達されるポリヌクレオチドを指す。
本明細書に記載の製剤及び医薬組成物は、薬理学の分野で既知または以後開発される任意の方法により調製することができる。一般に、そのような調製方法は、活性成分を、賦形剤及び／または１つ以上の他の補助成分と合わせるステップ、次に、必要及び／または望ましい場合、分割し、成形し、及び／または製品を所望の単回投与単位もしくは複数回投与単位にパッケージングするステップ、を含む。
本開示による医薬組成物または製剤は、バルクで、単回単位用量として、及び／または複数の単回単位用量として、調製、パッケージング、及び／または販売することができる。本明細書で使用される場合、「単位用量」は、所定量の活性成分を含む医薬組成物の別個の量を指す。活性成分の量は一般に、対象に投与される活性成分の投薬量、及び／または、そのような投薬量の好都合な分数、例えば、そのような投薬量の２分の１または３分の１、と等しい。
本開示による医薬組成物中の活性成分、薬学的に許容される賦形剤、及び／または任意の追加の成分の相対量は、治療される対象が何であるか、そのサイズ、及び／または状態に応じて、さらに、組成物が投与されるべき経路に応じて、変動し得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物及び製剤は、少なくとも１つの本発明のポリヌクレオチドを含有することができる。非限定例として、組成物または製剤は、本発明の１、２、３、４、または５ポリヌクレオチドを含有することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物または製剤は、複数タイプのポリヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、組成物または製剤は、線状及び環状形態のポリヌクレオチドを含むことができる。別の実施形態では、組成物または製剤は、環状ポリヌクレオチド及びｉｎ ｖｉｔｒｏ転写された（ＩＶＴ）ポリヌクレオチドを含むことができる。さらに別の実施形態では、組成物または製剤は、ＩＶＴポリヌクレオチド、キメラポリヌクレオチド、及び環状ポリヌクレオチドを含むことができる。
本明細書に提供される医薬組成物及び製剤の説明は、主に、ヒトへの投与に適する医薬組成物及び製剤に関するが、そのような組成物が一般に、他の任意の動物、例えば、非ヒト動物、例えば、非ヒト哺乳動物、への投与に適することは、当業者に理解されるであろう。
本発明は、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む医薬製剤を提供する。本明細書に記載のポリヌクレオチドは、（１）安定性を増加させるために、（２）細胞形質移入を増加させるために、（３）（例えば、ポリヌクレオチドのデポー製剤から）持続放出または遅延放出を可能にするために、（４）生体内分布を変更するために（例えば、ポリヌクレオチドを特定の組織または細胞型に標的化するために）、（５）ｉｎ ｖｉｖｏで、コードされたタンパク質の翻訳を増加させるために、及び／または（６）ｉｎ ｖｉｖｏで、コードされたタンパク質の放出プロフィールを変更するために、１つ以上の賦形剤を使用して製剤化することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の医薬製剤は、例えば、式（Ｉ）を有する化合物、例えば、化合物１～２３２のいずれか、例えば、化合物１８；式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、もしくは（ＶＩ）を有する化合物、例えば、化合物２３３～３４２のいずれか、例えば、化合物２３６；または式（ＶＩＩＩ）を有する化合物、例えば、化合物４１９～４２８のいずれか、例えば、化合物４２８、あるいはそれらの任意の組み合わせを含む送達剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、送達剤は、化合物１８、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物４２８を、例えば、約５０：１０：３８．５：１．５のモル比で含む。
薬学的に許容される賦形剤は、本明細書で使用される場合、所望の特定の剤形に適するような、任意及び全ての溶媒、分散媒、もしくは他の液体ビヒクル、分散剤もしくは懸濁助剤、希釈剤、造粒剤及び／もしくは分散剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤もしくは乳化剤、防腐剤、結合剤、滑沢剤もしくは油、着色剤、甘味剤もしくは香味剤、安定剤、酸化防止剤、抗菌剤もしくは抗真菌剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、キレート剤、凍結保護剤、及び／または増量剤を含むが、これらに限定されない。医薬組成物を製剤化するための種々の賦形剤及び組成物を調製するための技術は、当該技術分野で知られている（全体が参照により本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，２００６を参照のこと）。
例示的な希釈剤としては、炭酸カルシウムもしくは炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウム、ラクトース、スクロース、セルロース、微晶質セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトールなど、及び／またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
例示的な造粒剤及び／または分散剤は、デンプン、プレゼラチン化デンプンもしくは微晶質デンプン、アルギン酸、グアーガム、アガー、ポリ（ビニルピロリドン）、プロビドン、架橋ポリ（ビニルピロリドン）（クロスポビドン）、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム（クロスカルメロース）、ケイ酸アルミニウムマグネシウム（ＶＥＥＧＵＭ（登録商標））、ラウリル硫酸ナトリウムなど、及び／またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
例示的な界面活性剤及び／または乳化剤には、天然の乳化剤（例えば、アカシア、アガー、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、トラガカント、コンドル（ｃｈｏｎｄｒｕｘ）、コレステロール、キサンタン、ペクチン、ゼラチン、卵黄、カゼイン、羊毛脂、コレステロール、ワックス、及びレシチン）、ソルビタン脂肪酸エステル（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート［ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０］、ソルビタンモノパルミタート［ＳＰＡＮ（登録商標）４０］、グリセリルモノオアエート、ポリオキシエチレンエステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル（例えば、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標））、ポリオキシエチレンエーテル（例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル［ＢＲＩＪ（登録商標）３０］）、ＰＬＵＯＲＩＮＣ（登録商標）Ｆ６８、ＰＯＬＯＸＡＭＥＲ（登録商標）１８８など、ならびに／またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
例示的な結合剤は、デンプン、ゼラチン、糖（例えば、スクロース、グルコース、デキストロース、デキストリン、糖蜜、ラクトース、ラクチトール、マンニトール）、アミノ酸（例えば、グリシン）、天然及び合成ガム（例えば、アカシア、アルギン酸ナトリウム）、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなど、ならびにそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
酸化は、ｍＲＮＡ、特に、液体ｍＲＮＡ製剤、の潜在的な分解経路である。酸化を防止するために、酸化防止剤を配合物に添加することができる。例示的な酸化防止剤としては、アルファトコフェロール、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、ベンジルアルコール、ブチル化ヒドロキシアニソール、ｍ－クレゾール、メチオニン、ブチル化ヒドロキシトルエン、モノチオグリセロール、メタ重亜硫酸ナトリウムまたはカリウム、プロピオン酸、プロピルガラート、アスコルビン酸ナトリウムなど、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
例示的なキレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸一水和物、エデト酸二ナトリウム、フマル酸、リンゴ酸、リン酸、エデト酸ナトリウム、酒石酸、エデト酸三ナトリウムなど、及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
例示的な抗菌剤または抗真菌剤としては、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、安息香酸カリウムまたはナトリウム、ソルビン酸カリウムまたはナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、ソルビン酸など、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
例示的な防腐剤としては、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ベータカロテン、クエン酸、アスコルビン酸、ブチル化ヒドロキシアニソール、エチレンジアミン、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム（ＳＬＥＳ）など、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド溶液のｐＨは、安定性を向上させるためにｐＨ５～ｐＨ８に維持される。ｐＨを制御する例示的な緩衝剤としては、リン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、ヒスチジン（もしくはヒスチジン－ＨＣｌ）、リンゴ酸ナトリウム、炭酸ナトリウムなど、及び／またはそれらの組み合わせを挙げることができるが、これらに限定されない。
例示的な滑沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、シリカ、タルク、麦芽、水素添加植物油、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウムまたはマグネシウムなど、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書に記載の医薬組成物または製剤は、凍結中に、本明細書に記載のポリヌクレオチドを安定化させる凍結防止剤を含有することができる。例示的な凍結防止剤としては、マンニトール、スクロース、トレハロース、ラクトース、グリセロール、デキストロースなど、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書に記載の医薬組成物または製剤は、「薬学的に洗練された」固形物を得るために、増量剤を凍結乾燥ポリヌクレオチド製剤中に含有することができ、凍結乾燥ポリヌクレオチドを長期間（例えば、３６ヶ月）保存中に安定化させることができる。本発明の例示的な増量剤としては、スクロース、トレハロース、マンニトール、グリシン、ラクトース、ラフィノース、及びそれらの組み合わせを挙げることができるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、医薬組成物または製剤は、送達剤をさらに含む。本開示の送達剤は、リポソーム、脂質ナノ粒子、リピドイド、ポリマー、リポプレックス、微小胞、エキソソーム、ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチドで形質移入された細胞、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子模倣物、ナノチューブ、コンジュゲート、及びそれらの組み合わせを含むことができるが、これらに限定されない。
２２．送達剤
ａ．脂質化合物
本開示は、有利な特性を有する医薬組成物を提供する。本明細書に記載の脂質組成物は、治療薬及び／または予防薬、例えば、ｍＲＮＡを、哺乳動物細胞または器官に送達するための脂質ナノ粒子組成物に有利に使用され得る。例えば、本明細書に記載の脂質は、免疫原性がほとんどないか、または全くない。例えば、本明細書に開示の脂質化合物は、参照脂質（例えば、ＭＣ３、ＫＣ２、またはＤＬｉｎＤＭＡ）と比較して低い免疫原性を有する。例えば、本明細書に開示の脂質及び治療薬または予防薬、例えば、ｍＲＮＡ、を含む製剤は、参照脂質（例えば、ＭＣ３、ＫＣ２、またはＤＬｉｎＤＭＡ）及び同じ治療薬または予防薬を含む対応する製剤と比較して、治療指数の増加を示す。
ある特定の実施形態では、本出願は、
（ａ）ＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、及び
（ｂ）送達剤、
を含む医薬組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、送達剤は、式（Ｉ）
Figure 2023062097000069
 （Ｉ）、
（式中、
Ｒ１は、Ｃ５－３０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立に、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１～６アルキルからなる群から選択され、式中、Ｑは、炭素環、複素環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、及び－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは独立に、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５は独立に、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は独立に、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’は独立に、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｒ８は、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１－６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ３－６炭素環、及び複素環からなる群から選択され、
各Ｒは独立に、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は独立に、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立に、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は独立に、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは独立に、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘは独立に、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される）
またはその塩もしくは立体異性体を含む。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、式（Ｉ）の化合物（式中、
Ｒ１は、Ｃ５－２０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立に、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１－６アルキルからなる群から選択され、式中、Ｑは、炭素環、複素環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、及び－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは独立に、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５は独立に、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は独立に、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’は独立に、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒは独立に、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は独立に、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立に、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は独立に、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは独立に、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘは独立に、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される）
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、アルキル及びアルケニル基は、直鎖または分枝鎖であってよい。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、式（Ｉ）の化合物であり、式中、Ｒ４が－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、または－ＣＱ（Ｒ）２である場合、（ｉ）ｎが、１、２、３、４、もしくは５である時、Ｑは、－Ｎ（Ｒ）２ではなく、または（ｉｉ）ｎが、１もしくは２である時、Ｑは、５員、６員、もしくは７員ヘテロシクロアルキルではない。
別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、式（Ｉ）の化合物（式中、
Ｒ１は、Ｃ５－３０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立に、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１－６アルキルからなる群から選択され、式中、Ｑは、Ｃ３－６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５～１４員ヘテロアリール、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、ならびに、オキソ（＝Ｏ）、ＯＨ、アミノ、及びＣ１－３アルキルから選択される１つ以上の置換基で置換される、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５～１４員ヘテロシクロアルキル、から選択され、各ｎは独立に、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５は独立に、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は独立に、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’は独立に、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｒ８は、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１－６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
各Ｒは独立に、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は独立に、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立に、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は独立に、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは独立に、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘは独立に、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される）
またはその塩もしくは立体異性体を含む。
別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、式（Ｉ）の化合物（式中、
Ｒ１は、Ｃ５－２０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立に、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１－６アルキル（式中、Ｑは、Ｃ３－６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５～１４員ヘテロアリール、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ならびにオキソ（＝Ｏ）、ＯＨ、アミノ、及びＣ１－３アルキルから選択される１つ以上の置換基で置換される、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５～１４員ヘテロシクロアルキルから選択され、各ｎは独立に、１、２、３、４、及び５から選択される）からなる群から選択され、
各Ｒ５は独立に、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は独立に、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’は独立に、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒは独立に、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は独立に、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立に、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は独立に、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは独立に、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘは独立に、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される）
またはその塩もしくは立体異性体を含む。
さらに別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、式（Ｉ）の化合物（式中、
Ｒ１は、Ｃ５－３０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立に、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１－６アルキルからなる群から選択され、式中、Ｑは、Ｃ３－６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５～１４員複素環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、及び－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２から選択され、各ｎは独立に、１、２、３、４、及び５から選択され、Ｑが５～１４員複素環であり、且つ（ｉ）Ｒ４が－（ＣＨ２）ｎＱ（式中、ｎは、１もしくは２である）であるか、または（ｉｉ）Ｒ４が－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ（式中、ｎは、１である）であるか、または（ｉｉｉ）Ｒ４が－ＣＨＱＲ、及び－ＣＱ（Ｒ）２である時、Ｑは、５～１４員ヘテロアリールまたは８～１４員ヘテロシクロアルキルのいずれかであり、
各Ｒ５は独立に、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は独立に、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’は独立に、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｒ８は、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１－６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
各Ｒは独立に、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は独立に、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立に、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は独立に、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは独立に、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘは独立に、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される）
またはその塩もしくは立体異性体を含む。
さらに別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、式（Ｉ）の化合物（式中、
Ｒ１は、Ｃ５－２０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立に、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１－６アルキルからなる群から選択され、式中、Ｑは、Ｃ３－６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５～１４員複素環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは独立に、１、２、３、４、及び５から選択され、Ｑが５～１４員複素環であり、且つ（ｉ）Ｒ４が－（ＣＨ２）ｎＱ（式中、ｎは、１もしくは２である）であるか、または（ｉｉ）Ｒ４が－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ（式中、ｎは、１である）であるか、または（ｉｉｉ）Ｒ４が－ＣＨＱＲ、及び－ＣＱ（Ｒ）２である時、Ｑは、５～１４員ヘテロアリールまたは８～１４員ヘテロシクロアルキルのいずれかであり、
各Ｒ５は独立に、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は独立に、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’は独立に、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒは独立に、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は独立に、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立に、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は独立に、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは独立に、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘは独立に、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される）
またはその塩もしくは立体異性体を含む。
さらに別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、式（Ｉ）の化合物（式中、
Ｒ１は、Ｃ５－３０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立に、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１－６アルキルからなる群から選択され、式中、Ｑは、Ｃ３－６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５～１４員ヘテロアリール、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、及び－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２から選択され、各ｎは独立に、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５は独立に、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は独立に、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’は独立に、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｒ８は、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１－６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
各Ｒは独立に、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は独立に、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立に、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は独立に、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは独立に、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘは独立に、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される）
またはその塩もしくは立体異性体を含む。
さらに別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、式（Ｉ）の化合物（式中、
Ｒ１は、Ｃ５－２０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立に、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１－６アルキルからなる群から選択され、式中、Ｑは、Ｃ３－６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５～１４員ヘテロアリール、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは独立に、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５は独立に、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は独立に、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’は独立に、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒは独立に、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は独立に、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立に、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は独立に、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは独立に、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘは独立に、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される）
またはその塩もしくは立体異性体を含む。
さらに別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、式（Ｉ）の化合物（式中、
Ｒ１は、Ｃ５－３０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立に、Ｈ、Ｃ２－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎＱまたは－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲであり、式中、Ｑは、－Ｎ（Ｒ）２であり、ｎは、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５は独立に、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は独立に、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’は独立に、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒは独立に、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は独立に、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立に、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は独立に、Ｃ１－１２アルキル及びＣ１－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは独立に、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘは独立に、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される）
またはその塩もしくは立体異性体を含む。
さらに別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、式（Ｉ）の化合物（式中、
Ｒ１は、Ｃ５－２０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立に、Ｈ、Ｃ２－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎＱまたは－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲであり、式中、Ｑは、－Ｎ（Ｒ）２であり、ｎは、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５は独立に、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は独立に、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’は独立に、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒは独立に、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は独立に、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立に、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は独立に、Ｃ１－１２アルキル及びＣ１－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは独立に、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘは独立に、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される）
またはその塩もしくは立体異性体を含む。
さらに他の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、式（Ｉ）の化合物（式中、
Ｒ１は、Ｃ５－３０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立に、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、及び－ＣＱ（Ｒ）２からなる群から選択され、式中、Ｑは、－Ｎ（Ｒ）２であり、ｎは、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５は独立に、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は独立に、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’は独立に、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒは独立に、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は独立に、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立に、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は独立に、Ｃ１－１２アルキル及びＣ１－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは独立に、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘは独立に、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される）
またはその塩もしくは立体異性体を含む。
さらに他の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、式（Ｉ）の化合物（式中、
Ｒ１は、Ｃ５－２０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立に、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、及び－ＣＱ（Ｒ）２からなる群から選択され、式中、Ｑは、－Ｎ（Ｒ）２であり、ｎは、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５は独立に、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は独立に、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’は独立に、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒは独立に、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は独立に、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立に、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は独立に、Ｃ１－１２アルキル及びＣ１－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは独立に、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘは独立に、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される）
またはその塩もしくは立体異性体を含む。
ある特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、式（ＩＡ）の化合物：
Figure 2023062097000070
 （ＩＡ）、
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され、ｍは、５、６、７、８、及び９から選択され、Ｍ１は、結合またはＭ’であり、Ｒ４は、非置換Ｃ１－３アルキル、または－（ＣＨ２）ｎＱであり、式中、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリール、またはヘテロシクロアルキルであり、Ｍ及びＭ’は独立に、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立に、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、式（ＩＡ）の化合物、またはその塩もしくは立体異性体を含み、
式中、
ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され；ｍは、５、６、７、８、及び９から選択され；
Ｍ１は、結合またはＭ’であり、
Ｒ４は、非置換Ｃ１－３アルキル、または－（ＣＨ２）ｎＱであり、式中、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、もしくは－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２であり、
Ｍ及びＭ’は独立に、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立に、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、式（ＩＩ）の化合物：
Figure 2023062097000071
 （ＩＩ）
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され、Ｍ１は、結合またはＭ’であり、Ｒ４は、非置換Ｃ１－３アルキル、または（ＣＨ２）ｎＱであり、式中、ｎは、２、３、もしくは４であり、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリール、もしくはヘテロシクロアルキルであり、Ｍ及びＭ’は独立に、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立に、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、式（ＩＩ）の化合物、またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され、
Ｍ１は、結合またはＭ’であり、
Ｒ４は、非置換Ｃ１－３アルキル、または－（ＣＨ２）ｎＱであり、式中、ｎは、２、３、もしくは４であり、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、もしくは－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２であり、
Ｍ及びＭ’は独立に、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立に、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩａ）の化合物
Figure 2023062097000072
 （ＩＩａ）、
またはその塩であり、式中、Ｒ４は、上記の通りである。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｂ）の化合物
Figure 2023062097000073
 （ＩＩｂ）、
またはその塩であり、式中、Ｒ４は、上記の通りである。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｃ）の化合物
Figure 2023062097000074
 （ＩＩｃ）、
またはその塩であり、式中、Ｒ４は、上記の通りである。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｅ）の化合物：
Figure 2023062097000075
 （ＩＩｅ）、
またはその塩であり、式中、Ｒ４は、上記の通りである。
いくつかの実施形態では、式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、または（ＩＩｅ）の化合物は、－（ＣＨ２）ｎＱ及び－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲから選択されるＲ４を含み、式中、Ｑ、Ｒ、及びｎは上記の通りである。
いくつかの実施形態では、Ｑは、－ＯＲ、－ＯＨ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、及び複素環からなる群から選択され、式中、Ｒは、上記で定義した通りである。いくつかの態様では、ｎは、１または２である。いくつかの実施形態では、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、または－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２である。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｄ）の化合物
Figure 2023062097000076
 （ＩＩｄ）、
またはその塩であり、式中、Ｒ２及びＲ３は独立に、Ｃ５－１４アルキル及びＣ５－１４アルケニルからなる群から選択され、ｎは、２、３、及び４から選択され、Ｒ’、Ｒ”、Ｒ５、Ｒ６、及びｍは、上で定義された通りである。
式（ＩＩｄ）の化合物のいくつかの態様では、Ｒ２は、Ｃ８アルキルである。式（ＩＩｄ）の化合物のいくつかの態様では、Ｒ３は、Ｃ５～Ｃ９アルキルである。式（ＩＩｄ）の化合物のいくつかの態様では、ｍは、５、７、または９である。式（ＩＩｄ）の化合物のいくつかの態様では、各Ｒ５は、Ｈである。式（ＩＩｄ）の化合物のいくつかの態様では、各Ｒ６は、Ｈである。
別の態様では、本出願は、（１）式（Ｉ）を有する化合物、（２）任意に、ヘルパー脂質（例えば、リン脂質）、（３）任意に、構造脂質（例えば、ステロール）、及び（４）任意に、脂質コンジュゲート（例えば、ＰＥＧ－脂質）を含む脂質組成物（例えば、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ））を提供する。例示的な実施形態では、脂質組成物（例えば、ＬＮＰ）は、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば、その中に封入されたポリヌクレオチド、をさらに含む。
本明細書で使用する場合、「アルキル」または「アルキル基」という用語は、１つ以上の炭素原子（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上の炭素原子）を含む直鎖状または分岐状の飽和炭化水素を意味する。
「Ｃ１－１４アルキル」という表記は、１～１４の炭素原子を含む直鎖状または分枝状の飽和炭化水素を意味する。アルキル基は、任意に置換することができる。
本明細書で使用する場合、「アルケニル」または「アルケニル基」という用語は、２つ以上の炭素原子（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上の炭素原子）及び少なくとも１つの二重結合を含む直鎖状または分岐状の炭化水素を意味する。
「Ｃ２－１４アルケニル」という表記は、２～１４の炭素原子及び少なくとも１つの二重結合を含む直鎖状または分枝状の炭化水素を意味する。アルケニル基は、１、２、３、４、またはそれ以上の二重結合を含むことができる。例えば、Ｃ１８アルケニルは、１つ以上の二重結合を含むことができる。２つの二重結合を含むＣ１８アルケニル基は、リノレイル基とすることができる。アルケニル基は、任意に置換することができる。
本明細書で使用される場合、「炭素環」または「炭素環式基」という用語は、炭素原子の１つ以上の環を含む単環または多環系を意味する。環は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５員環とすることができる。
「Ｃ３－６炭素環」という表記は、３～６の炭素原子を有する単環を含む炭素環を意味する。炭素環は、１つ以上の二重結合を含むことができ、芳香族（例えば、アリール基）であることができる。炭素環の例としては、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、フェニル、ナフチル、及び１，２－ジヒドロナフチル基が挙げられる。炭素環は、任意に置換することができる。
本明細書で使用される場合、「複素環」または「複素環基」という用語は、少なくとも１つの環が少なくとも１つのヘテロ原子を含む、１つ以上の環を含む単環または多環系を意味する。ヘテロ原子は、例えば、窒素原子、酸素原子、または硫黄原子とすることができる。環は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２員環とすることができる。複素環は、１つ以上の二重結合を含むことができ、芳香族（例えば、ヘテロアリール基）であることができる。複素環の例としては、イミダゾリル、オキサゾリル、オキサゾリジニル、チアゾリル、チアゾリジニル、ピラゾリジニル、ピラゾリル、イソオキサゾリジニル（ｉｓｏｘａｚｏｌｉｄｉｎｙｌ）、イソオキサゾリル、イソチアゾリジニル、イソチアゾリル、モルホリニル、ピロリル、ピロリジニル、フリル、テトラヒドロフリル、チオフェニル、ピリジニル、ピペリジニル、キノリル、及びイソキノリル基が挙げられる。複素環は、任意に置換することができる。
本明細書で使用される場合、「生分解性基」は、対象における脂質のより速い代謝を促進することができる基である。生分解性基は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、アリール基、及びヘテロアリール基とすることができるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「アリール基」は、１つ以上の芳香環を含む炭素環式基である。アリール基の例としては、フェニル及びナフチル基が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「ヘテロアリール基」は、１つ以上の芳香環を含む複素環基である。ヘテロアリール基の例としては、ピロリル、フリル、チオフェニル、イミダゾリル、オキサゾリル、及びチアゾリルが挙げられる。アリール基及びヘテロアリール基の両方は、任意に置換することができる。例えば、Ｍ及びＭ’は、任意に置換されたフェニル、オキサゾール、及びチアゾールからなる非限定的な基から選択することができる。本明細書の式では、Ｍ及びＭ’は独立に、上記の生分解性基のリストから選択することができる。
アルキル、アルケニル、及びシクリル（例えば、カルボシクリル及びヘテロシクリル）基は、別途明記のない限り、任意に置換することができる。任意の置換基は、限定されないが、ハロゲン原子（例えば、塩化物、臭化物、フッ化物、またはヨウ化物基）、カルボン酸（例えば、－Ｃ（Ｏ）ＯＨ）、アルコール（例えば、ヒドロキシル、－ＯＨ）、エステル（例えば、－Ｃ（Ｏ）ＯＲまたは－ＯＣ（Ｏ）Ｒ）、アルデヒド（例えば、－Ｃ（Ｏ）Ｈ）、カルボニル（例えば、－Ｃ（Ｏ）Ｒ、あるいは、Ｃ＝Ｏで表される）、ハロゲン化アシル（例えば、－Ｃ（Ｏ）Ｘ（式中、Ｘは、臭化物、フッ化物、塩化物、及びヨウ化物から選択されるハロゲン化物である））、カーボナート（例えば、－ＯＣ（Ｏ）ＯＲ）、アルコキシ（例えば、－ＯＲ）、アセタール（例えば、－Ｃ（ＯＲ）２Ｒ””（式中、各ＯＲは、同じまたは異なる可能性があるアルコキシ基であり、Ｒ””は、アルキル基またはアルケニル基である）、ホスファート（例えば、Ｐ（Ｏ）４３－）、チオール（例えば、－ＳＨ）、スルホキシド（例えば、－Ｓ（Ｏ）Ｒ）、スルフィン酸（例えば、－Ｓ（Ｏ）ＯＨ）、スルホン酸（例えば、－Ｓ（Ｏ）２ＯＨ）、チアール（例えば、－Ｃ（Ｓ）Ｈ）、スルファート（例えば、Ｓ（Ｏ）４２－）、スルホニル（例えば、－Ｓ（Ｏ）２－）、アミド（例えば、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、または－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ）、アジド（例えば、－Ｎ３）、ニトロ（例えば、－ＮＯ２）、シアノ（例えば、－ＣＮ）、イソシアノ（例えば、－ＮＣ）、アシロキシ（例えば、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ）、アミノ（例えば、－ＮＲ２、－ＮＲＨ、または－ＮＨ２）、カルバモイル（例えば、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ２、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲＨ、または－ＯＣ（Ｏ）ＮＨ２）、スルホンアミド（例えば、－Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２、－Ｓ（Ｏ）２ＮＲＨ、－Ｓ（Ｏ）２ＮＨ２、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｈ、または－Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｈ）、アルキル基、アルケニル基、及びシクリル（例えば、カルボシクリルまたはヘテロシクリル）基からなる群から選択することができる。
上述のいずれかでは、Ｒは、本明細書で定義されるようなアルキルまたはアルケニル基である。いくつかの実施形態では、置換基自体は、例えば、本明細書で定義されるような１、２、３、４、５、または６の置換基でさらに置換することができる。例えば、Ｃ１～６アルキル基は、本明細書に記載されるような１、２、３、４、５、または６の置換基でさらに置換することができる。
式（Ｉ）、（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、及び（ＩＩｅ）のうちのいずれか１つの化合物は、適用可能な時、以下の特徴のうちの１つ以上を含む。
いくつかの実施形態では、Ｒ４は、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、及び－ＣＱ（Ｒ）２からなる群から選択され、式中、Ｑは、Ｃ３－６炭素環、Ｎ、Ｏ、Ｓ、及びＰから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５～１４員芳香族または非芳香族複素環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、及び－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは独立に、１、２、３、４、及び５から選択される。
別の実施形態では、Ｒ４は、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、及び－ＣＱ（Ｒ）２からなる群から選択され、式中、Ｑは、Ｃ３－６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５～１４員ヘテロアリール、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ならびにオキソ（＝Ｏ）、ＯＨ、アミノ、及びＣ１－３アルキルから選択される１つ以上の置換基で置換される、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５～１４員ヘテロシクロアルキルから選択され、各ｎは独立に、１、２、３、４、及び５から選択される。
別の実施形態では、Ｒ４は、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、及び－ＣＱ（Ｒ）２からなる群から選択され、式中、Ｑは、Ｃ３－６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択された１つ以上のヘテロ原子を有する５～１４員複素環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは独立に、１、２、３、４、及び５から選択され、Ｑが５～１４員複素環であり、且つ（ｉ）Ｒ４が－（ＣＨ２）ｎＱ（式中、ｎは、１もしくは２である）であるか、または（ｉｉ）Ｒ４が－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ（式中、ｎは、１である）であるか、または（ｉｉｉ）Ｒ４が－ＣＨＱＲ、及び－ＣＱ（Ｒ）２である時、Ｑは、５～１４員ヘテロアリールまたは８～１４員ヘテロシクロアルキルのいずれかである。
別の実施形態では、Ｒ４は、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、及び－ＣＱ（Ｒ）２からなる群から選択され、式中、Ｑは、Ｃ３－６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５～１４員ヘテロアリール、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは独立に、１、２、３、４、及び５から選択される。
別の実施形態では、Ｒ４は、非置換Ｃ１－４アルキル、例えば、非置換メチルである。
ある特定の実施形態では、本開示は、式（Ｉ）を有する化合物を提供し、式中、Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎＱまたは－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲであり、式中、Ｑは、－Ｎ（Ｒ）２であり、ｎは、３、４、及び５から選択される。
ある特定の実施形態では、本開示は、式（Ｉ）を有する化合物を提供し、式中、Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、及び－ＣＱ（Ｒ）２からなる群から選択され、式中、Ｑは、－Ｎ（Ｒ）２であり、ｎは、１、２、３、４、及び５から選択される。
ある特定の実施形態では、本開示は、式（Ｉ）有する化合物を提供し、式中、Ｒ２及びＲ３は独立に、Ｃ２－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎＱまたは－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲであり、式中、Ｑは、－Ｎ（Ｒ）２であり、ｎは、３、４、及び５から選択される。
ある特定の実施形態では、Ｒ２及びＲ３は独立に、Ｃ２－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成する。
いくつかの実施形態では、Ｒ１は、Ｃ５－２０アルキル及びＣ５－２０アルケニルからなる群から選択される。
他の実施形態では、Ｒ１は、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、－Ｒ＊ＹＲ”及び－ＹＲ”から選択される。いくつかの実施形態では、Ｙは、シクロプロピル基である。いくつかの実施形態では、Ｒ＊は、Ｃ８アルキルまたはＣ８アルケニルである。ある特定の実施形態では、Ｒ”は、Ｃ３－１２アルキルである。例えば、Ｒ”は、Ｃ３アルキルとすることができる。例えば、Ｒ”は、Ｃ４－８アルキル（例えば、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、またはＣ８アルキル）とすることができる。
いくつかの実施形態では、Ｒ１は、Ｃ５－２０アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ１は、Ｃ６アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ１は、Ｃ８アルキルである。他の実施形態では、Ｒ１は、Ｃ９アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、Ｃ１４アルキルである。他の実施形態では、Ｒ１は、Ｃ１８アルキルである。
いくつかの実施形態では、Ｒ１は、Ｃ５－２０アルケニルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、Ｃ１８アルケニルである。いくつかの実施形態では、Ｒ１は、リノレイルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、分枝鎖（例えば、デカン－２－イル、ウンデカン－３－イル、ドデカン－４－イル、トリデカン５－イル、テトラデカン－６－イル、２－メチルウンデカン－３－イル、２－メチルデカン－２－イル、３－メチルウンデカン－３－イル、４－メチルドデカン－４－イル、またはヘプタデカ－９－イル）である。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、
Figure 2023062097000077
 である。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、非置換Ｃ５－２０アルキルまたはＣ５－２０アルケニルである。ある特定の実施形態では、Ｒ’は、（例えば、１－シクロプロピルノニルなどのＣ３－６炭素環で置換された）置換Ｃ５－２０アルキルまたはＣ５－２０アルケニルである。
他の実施形態では、Ｒ１は、－Ｒ”Ｍ’Ｒ’である。
いくつかの実施形態では、Ｒ’は、－Ｒ＊ＹＲ”及び－ＹＲ”から選択される。いくつかの実施形態では、Ｙは、Ｃ３－８シクロアルキルである。いくつかの実施形態では、Ｙは、Ｃ６－１０アリールである。いくつかの実施形態では、Ｙは、シクロプロピル基である。いくつかの実施形態では、Ｙは、シクロヘキシル基である。ある特定の実施形態では、Ｒ＊は、Ｃ１アルキルである。
いくつかの実施形態では、Ｒ”は、Ｃ３－１２アルキル及びＣ３－１２アルケニルからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｙに隣接したＲ”は、Ｃ１アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｙに隣接したＲ”は、Ｃ４－９アルキル（例えば、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、またはＣ８、またはＣ９アルキル）である。
いくつかの実施形態では、Ｒ’は、Ｃ４アルキル及びＣ４アルケニルから選択される。ある特定の実施形態では、Ｒ’は、Ｃ５アルキル及びＣ５アルケニルから選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ’は、Ｃ６アルキル及びＣ６アルケニルから選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ’は、Ｃ７アルキル及びＣ７アルケニルから選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ’は、Ｃ９アルキル及びＣ９アルケニルから選択される。
他の実施形態では、Ｒ’は、Ｃ１１アルキル及びＣ１１アルケニルから選択される。他の実施形態では、Ｒ’は、Ｃ１２アルキル、Ｃ１２アルケニル、Ｃ１３アルキル、Ｃ１３アルケニル、Ｃ１４アルキル、Ｃ１４アルケニル、Ｃ１５アルキル、Ｃ１５アルケニル、Ｃ１６アルキル、Ｃ１６アルケニル、Ｃ１７アルキル、Ｃ１７アルケニル、Ｃ１８アルキル、及びＣ１８アルケニルから選択される。ある特定の実施形態では、Ｒ’は、分枝鎖（例えば、デカン－２－イル、ウンデカン－３－イル、ドデカン－４－イル、トリデカン５－イル、テトラデカン－６－イル、２－メチルウンデカン－３－イル、２－メチルデカン－２－イル、３－メチルウンデカン－３－イル、４－メチルドデカン－４－イル、またはヘプタデカ－９－イル）である。ある特定の実施形態では、Ｒ’は、
Figure 2023062097000078
 である。
ある特定の実施形態では、Ｒ’は、非置換Ｃ１－１８アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ’は、置換Ｃ１－１８アルキル（例えば、Ｃ３－６炭素環、例えば、１－シクロプロピルノニル、で置換されたＣ１－１５アルキル）である。
いくつかの実施形態では、Ｒ”は、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ”は、Ｃ３アルキル、Ｃ４アルキル、Ｃ５アルキル、Ｃ６アルキル、Ｃ７アルキル、またはＣ８アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ”は、Ｃ９アルキル、Ｃ１０アルキル、Ｃ１１アルキル、Ｃ１２アルキル、Ｃ１３アルキル、またはＣ１４アルキルである。
いくつかの実施形態では、Ｍ’は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－である。いくつかの実施形態では、Ｍ’は、－ＯＣ（Ｏ）－である。
他の実施形態では、Ｍ’は、アリール基またはヘテロアリール基である。例えば、Ｍ’は、フェニル、オキサゾール、及びチアゾールからなる群から選択することができる。
いくつかの実施形態では、Ｍは、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－である。いくつかの実施形態では、Ｍは、－ＯＣ（Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｍは、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－である。いくつかの実施形態では、Ｍは、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－である。
他の実施形態では、Ｍは、アリール基またはヘテロアリール基である。例えば、Ｍは、フェニル、オキサゾール、及びチアゾールからなる群から選択することができる。
いくつかの実施形態では、Ｍは、Ｍ’と同じものである。他の実施形態では、Ｍは、Ｍ’とは異なる。
いくつかの実施形態では、各Ｒ５は、Ｈである。そのようなある特定の実施形態では、各Ｒ６もまた、Ｈである。
いくつかの実施形態では、Ｒ７は、Ｈである。他の実施形態では、Ｒ７は、Ｃ１－３アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル、またはｉ－プロピル）である。
いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は独立に、Ｃ５－１４アルキルまたはＣ５－１４アルケニルである。
いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、同じである。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、Ｃ８アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、Ｃ２アルキルである。他の実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、Ｃ３アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、Ｃ４アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、Ｃ５アルキルである。他の実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、Ｃ６アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、Ｃ７アルキルである。
他の実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、異なる。ある特定の実施形態では、Ｒ２は、Ｃ８アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ３は、Ｃ１－７（例えば、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、もしくはＣ７アルキル）またはＣ９アルキルである。
いくつかの実施形態では、Ｒ７及びＲ３は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、Ｈである。
いくつかの実施形態では、ｍは、５、７、または９である。
いくつかの実施形態では、Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎＱ及び－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲから選択される。
いくつかの実施形態では、Ｑは、－ＯＲ、－ＯＨ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、炭素環、及び複素環からなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、Ｑは、－ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｑは、置換または非置換５～１０員ヘテロアリールであり、例えば、Ｑは、イミダゾール、ピリミジン、プリン、２－アミノ－１，９－ジヒドロ－６Ｈ－プリン－６－オン－９－イル（もしくはグアニン－９－イル）、アデニン－９－イル、シトシン－１－イル、またはウラシル－１－イルである。ある特定の実施形態では、Ｑは、例えば、オキソ（＝Ｏ）、ＯＨ、アミノ及びＣ１－３アルキルから選択される１つ以上の置換基で置換された、置換５～１４員ヘテロシクロアルキルである。例えば、Ｑは、４－メチルピペラジニル、４－（４－メトキシベンジル）ピペラジニルまたはイソインドリン－２－イル－１，３－ジオンである。
ある特定の実施形態では、Ｑは、非置換または置換Ｃ６－１０アリール（例えば、フェニル）またはＣ３－６シクロアルキルである。
いくつかの実施形態では、ｎは、１である。他の実施形態では、ｎは、２である。さらなる実施形態では、ｎは、３である。他のある特定の実施形態では、ｎは、４である。例えば、Ｒ４は、－（ＣＨ２）２ＯＨとすることができる。例えば、Ｒ４は、－（ＣＨ２）３ＯＨとすることができる。例えば、Ｒ４は、－（ＣＨ２）４ＯＨとすることができる。例えば、Ｒ４は、ベンジルとすることができる。例えば、Ｒ４は、４－メトキシベンジルとすることができる。
いくつかの実施形態では、Ｒ４は、Ｃ３－６炭素環である。いくつかの実施形態では、Ｒ４は、Ｃ３－６シクロアルキルである。例えば、Ｒ４は、例えば、ＯＨ、ハロ、Ｃ１－６アルキルなどで任意に置換されたシクロヘキシルとすることができる。例えば、Ｒ４は、２－ヒドロキシシクロヘキシルとすることができる。
いくつかの実施形態では、Ｒは、Ｈである。
いくつかの実施形態では、Ｒは、非置換Ｃ１－３アルキルまたは非置換Ｃ２－３アルケニルである。例えば、Ｒ４は、－ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３または－ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＣＨ３とすることができる。
いくつかの実施形態では、Ｒは、置換Ｃ１－３アルキル、例えば、ＣＨ２ＯＨである。例えば、Ｒ４は、－ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＯＨとすることができる。
いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環または炭素環を形成する。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、Ｎ、Ｏ、Ｓ、及びＰから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５～１４員芳香族または非芳香族複素環を形成する。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、芳香族または非芳香族のいずれかである任意に置換されたＣ３－２０炭素環（例えば、Ｃ３－１８炭素環、Ｃ３－１５炭素環、Ｃ３－１２炭素環、またはＣ３－１０炭素環）を形成する。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、Ｃ３－６炭素環を形成する。他の実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、シクロヘキシルまたはフェニル基などのＣ６炭素環を形成する。ある特定の実施形態では、複素環またはＣ３－６炭素環は、（例えば、同じ環原子で、または隣接もしくは非隣接環原子で）１つ以上のアルキル基で置換されている。例えば、Ｒ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＣ５アルキル置換基を持つシクロヘキシルまたはフェニル基を形成することができる。ある特定の実施形態では、Ｒ２及びＲ３により形成される複素環またはＣ３－６炭素環は、炭素環基で置換される。例えば、Ｒ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、シクロヘキシルまたはシクロヘキシルで置換されるフェニル基を形成することができる。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、Ｃ７－１５炭素環、例えば、シクロヘプチル基、シクロペンタデカニル基、またはナフチル基、を形成する。
いくつかの実施形態では、Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎＱ及び－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲから選択される。いくつかの実施形態では、Ｑは、－ＯＲ、－ＯＨ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、及び複素環からなる群から選択される。他の実施形態では、Ｑは、イミダゾール、ピリミジン、及びプリンからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環または炭素環を形成する。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、フェニル基などのＣ３－６炭素環を形成する。ある特定の実施形態では、複素環またはＣ３－６炭素環は、（例えば、同じ環原子で、または隣接もしくは非隣接環原子で）１つ以上のアルキル基で置換されている。例えば、Ｒ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＣ５アルキル置換基を持つフェニル基を形成することができる。
いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、式（Ｉ）の化合物が、以下及びその塩または立体異性体からなる群から選択される：
Figure 2023062097000079
Figure 2023062097000080
Figure 2023062097000081
Figure 2023062097000082
Figure 2023062097000083
Figure 2023062097000084
Figure 2023062097000085
Figure 2023062097000086
Figure 2023062097000087
Figure 2023062097000088
Figure 2023062097000089
Figure 2023062097000090
Figure 2023062097000091
Figure 2023062097000092
Figure 2023062097000093
Figure 2023062097000094
Figure 2023062097000095
Figure 2023062097000096
Figure 2023062097000097
Figure 2023062097000098
Figure 2023062097000099
Figure 2023062097000100
Figure 2023062097000101
Figure 2023062097000102
Figure 2023062097000103
Figure 2023062097000104
Figure 2023062097000105
Figure 2023062097000106
Figure 2023062097000107
Figure 2023062097000108
Figure 2023062097000109
Figure 2023062097000110
Figure 2023062097000111
Figure 2023062097000112
Figure 2023062097000113
Figure 2023062097000114
Figure 2023062097000115
Figure 2023062097000116
他の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、化合物１～化合物１４７、またはその塩もしくは立体異性体からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、中心ピペラジン部分を含むイオン性脂質が提供される。
いくつかの実施形態では、送達剤は、式（ＩＩＩ）を有する脂質化合物
Figure 2023062097000117
 （ＩＩＩ）、
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
環Ａは、
Figure 2023062097000118
 であり、
ｔは、１または２であり、
Ａ１及びＡ２はそれぞれ独立に、ＣＨまたはＮから選択され、
Ｚは、ＣＨ２であるか、または存在せず、式中、ＺがＣＨ２である時、破線（１）及び（２）はそれぞれ、単結合を表し、Ｚが存在しない時、破線（１）及び（２）は両方ともに、存在せず、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は独立に、Ｃ５－２０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ”ＭＲ’、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択され、
各Ｍは独立に、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、アリール基、及びヘテロアリール基からなる群から選択され、
Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３は独立に、結合、－ＣＨ２－、－（ＣＨ２）２－、－ＣＨＲ－、－ＣＨＹ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－ＣＨ２－、－ＯＣ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＣＨ２－ＯＣ（Ｏ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｃ（Ｓ）－、及び－ＣＨ（ＳＨ）－からなる群から選択され、
各Ｙは独立に、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｒ＊は独立に、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒは独立に、Ｃ１－３アルキル及びＣ３－６炭素環からなる群から選択され、
各Ｒ’は独立に、Ｃ１－１２アルキル、Ｃ２－１２アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立に、Ｃ３－１２アルキル及びＣ３－１２アルケニルからなる群から選択され、
環Ａが
Figure 2023062097000119
 である時、
ｉ）Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３の少なくとも１つは、－ＣＨ２－ではなく、及び／または
ｉｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５の少なくとも１つは、－Ｒ”ＭＲ’である。
いくつかの実施形態では、化合物は、式（ＩＩＩａ１）～（ＩＩＩａ６）のいずれかである：
Figure 2023062097000120
式（ＩＩＩ）または（ＩＩＩａ１）～（ＩＩＩａ６）のいずれかの化合物は、適用可能な時、以下の特徴のうちの１つ以上を含む。
いくつかの実施形態では、環Ａは、
Figure 2023062097000121
 である。
いくつかの実施形態では、環Ａは、
Figure 2023062097000122
 である。
いくつかの実施形態では、環Ａは、
Figure 2023062097000123
 である。
いくつかの実施形態では、環Ａは、
Figure 2023062097000124
 である。
いくつかの実施形態では、環Ａは、
Figure 2023062097000125
 である。
いくつかの実施形態では、環Ａは、
Figure 2023062097000126
 であり、
式中、Ｎ原子がＸ２と結合している環である。
いくつかの実施形態では、Ｚは、ＣＨ２である。
いくつかの実施形態では、Ｚは、存在しない。
いくつかの実施形態では、Ａ１及びＡ２のうちの少なくとも１つは、Ｎである。
いくつかの実施形態では、Ａ１及びＡ２のそれぞれは、Ｎである。
いくつかの実施形態では、Ａ１及びＡ２のそれぞれは、ＣＨである。
いくつかの実施形態では、Ａ１は、Ｎであり、Ａ２は、ＣＨである。
いくつかの実施形態では、Ａ１は、ＣＨであり、Ａ２は、Ｎである。
いくつかの実施形態では、Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３のうちの少なくとも１つは、－ＣＨ２－ではない。例えば、ある特定の実施形態では、Ｘ１は、－ＣＨ２－ではない。いくつかの実施形態では、Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３のうちの少なくとも１つは、－Ｃ（Ｏ）－である。
いくつかの実施形態では、Ｘ２は、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－ＣＨ２－、－ＯＣ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、または－ＣＨ２－ＯＣ（Ｏ）－である。
いくつかの実施形態では、Ｘ３は、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－ＣＨ２－、－ＯＣ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、または－ＣＨ２－ＯＣ（Ｏ）－である。他の実施形態では、Ｘ３は、－ＣＨ２－である。
いくつかの実施形態では、Ｘ３は、結合または－（ＣＨ２）２－である。
いくつかの実施形態では、Ｒ１及びＲ２は、同じである。ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、同じである。いくつかの実施形態では、Ｒ４及びＲ５は、同じである。ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、同じである。
いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つは、－Ｒ”ＭＲ’である。いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの多くとも１つは、－Ｒ”ＭＲ’である。例えば、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３のうちの少なくとも１つは、Ｒ”ＭＲ’であってよく、及び／またはＲ４及びＲ５のうちの少なくとも１つは、－Ｒ”ＭＲ’である。ある特定の実施形態では、少なくとも１つのＭは、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－である。いくつかの実施形態では、各Ｍは、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＭは、－ＯＣ（Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、各Ｍは、－ＯＣ（Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＭは、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－である。いくつかの実施形態では、各Ｍは、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲ”は、Ｃ３アルキルである。ある特定の実施形態では、各Ｒ”は、Ｃ３アルキルである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲ”は、Ｃ５アルキルである。ある特定の実施形態では、各Ｒ”は、Ｃ５アルキルである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲ”は、Ｃ６アルキルである。ある特定の実施形態では、各Ｒ”は、Ｃ６アルキルである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲ”は、Ｃ７アルキルである。ある特定の実施形態では、各Ｒ”は、Ｃ７アルキルである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲ’は、Ｃ５アルキルである。ある特定の実施形態では、各Ｒ’は、Ｃ５アルキルである。他の実施形態では、少なくとも１つのＲ’は、Ｃ１アルキルである。ある特定の実施形態では、各Ｒ’は、Ｃ１アルキルである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲ’は、Ｃ２アルキルである。ある特定の実施形態では、各Ｒ’は、Ｃ２アルキルである。
いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つは、Ｃ１２アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のそれぞれは、Ｃ１２アルキルである。
ある特定の実施形態では、化合物は、以下からなる群から選択される：
Figure 2023062097000127
Figure 2023062097000128
Figure 2023062097000129
Figure 2023062097000130
Figure 2023062097000131
Figure 2023062097000132
Figure 2023062097000133
Figure 2023062097000134
Figure 2023062097000135
Figure 2023062097000136
Figure 2023062097000137
Figure 2023062097000138
Figure 2023062097000139
Figure 2023062097000140
Figure 2023062097000141
いくつかの実施形態では、送達剤は、化合物２３６を含む。
いくつかの実施形態では、送達剤は、式（ＩＶ）を有する化合物
Figure 2023062097000142
 （ＩＶ）、
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
Ａ１及びＡ２はそれぞれ独立に、ＣＨまたはＮから選択され、Ａ１及びＡ２のうちの少なくとも１つは、Ｎであり、
Ｚは、ＣＨ２であるか、または存在せず、式中、ＺがＣＨ２である時、破線（１）及び（２）はそれぞれ、単結合を表し、Ｚが存在しない時、破線（１）及び（２）は両方ともに、存在せず、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は独立に、Ｃ６－２０アルキル及びＣ６－２０アルケニルからなる群から選択され、
環Ａが
Figure 2023062097000143
 である時、
ｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、同じであり、Ｒ１は、Ｃ１２アルキル、Ｃ１８アルキル、もしくはＣ１８アルケニルでないか、
ｉｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの１つのみが、Ｃ６－２０アルケニルから選択されるか、
ｉｉｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの他の少なくとも１つとは異なる数の炭素原子を有するか、
ｉｖ）Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、Ｃ６－２０アルケニルから選択され、Ｒ４及びＲ５は、Ｃ６－２０アルキルから選択されるか、または
ｖ）Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、Ｃ６－２０アルキルから選択され、Ｒ４及びＲ５は、Ｃ６－２０アルケニルから選択される。
いくつかの実施形態では、化合物は、式（ＩＶａ）の化合物：
Figure 2023062097000144
 （ＩＶａ）
である。
式（ＩＶ）または（ＩＶａ）の化合物は、適用可能な時、以下の特徴のうちの１つ以上を含む。
いくつかの実施形態では、Ｚは、ＣＨ２である。
いくつかの実施形態では、Ｚは、存在しない。
いくつかの実施形態では、Ａ１及びＡ２のうちの少なくとも１つは、Ｎである。
いくつかの実施形態では、Ａ１及びＡ２のそれぞれは、Ｎである。
いくつかの実施形態では、Ａ１及びＡ２のそれぞれは、ＣＨである。
いくつかの実施形態では、Ａ１は、Ｎであり、Ａ２は、ＣＨである。
いくつかの実施形態では、Ａ１は、ＣＨであり、Ａ２は、Ｎである。
いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、同じであり、Ｃ１２アルキル、Ｃ１８アルキル、またはＣ１８アルケニルではない。いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、同じであり、Ｃ９アルキルまたはＣ１４アルキルである。
いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの１つのみが、Ｃ６－２０アルケニルから選択される。そのようなある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、同じ数の炭素原子を有する。いくつかの実施形態では、Ｒ４は、Ｃ５－２０アルケニルから選択される。例えば、Ｒ４は、Ｃ１２アルケニルまたはＣ１８アルケニルであってよい。
いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの他の少なくとも１つとは異なる数の炭素原子を有する。
ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、Ｃ６－２０アルケニルから選択され、Ｒ４及びＲ５は、Ｃ６－２０アルキルから選択される。他の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、Ｃ６－２０アルキルから選択され、Ｒ４及びＲ５は、Ｃ６－２０アルケニルから選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、同じ数の炭素原子を有し、且つ／またはＲ４及びＲ５は、同じ数の炭素原子を有する。例えば、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３、またはＲ４及びＲ５は、６、８、９、１２、１４、または１８の炭素原子を有してもよい。いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３、またはＲ４及びＲ５は、Ｃ１８アルケニル（例えば、リノレイル）である。いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３、またはＲ４及びＲ５は、６、８、９、１２、または１４の炭素原子を含むアルキル基である。
いくつかの実施形態では、Ｒ１は、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５とは異なる数の炭素原子を有する。他の実施形態では、Ｒ３は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、及びＲ５とは異なる数の炭素原子を有する。さらなる実施形態では、Ｒ４は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ５とは異なる数の炭素原子を有する。
いくつかの実施形態では、化合物は、以下からなる群から選択される：
Figure 2023062097000145
Figure 2023062097000146
Figure 2023062097000147
他の実施形態では、送達剤は、式（Ｖ）を有する化合物
Figure 2023062097000148
 （Ｖ）、
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
Ａ３は、ＣＨまたはＮであり、
Ａ４は、ＣＨ２またはＮＨであり、Ａ３及びＡ４のうちの少なくとも１つは、ＮまたはＮＨであり、
Ｚは、ＣＨ２であるか、または存在せず、式中、ＺがＣＨ２である時、破線（１）及び（２）はそれぞれ、単結合を表し、Ｚが存在しない時、破線（１）及び（２）は両方ともに、存在せず、
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は独立に、Ｃ５－２０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ”ＭＲ’、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択され、
各Ｍは独立に、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｘ１及びＸ２は独立に、－ＣＨ２－、－（ＣＨ２）２－、－ＣＨＲ－、－ＣＨＹ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－ＣＨ２－、－ＯＣ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＣＨ２－ＯＣ（Ｏ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｃ（Ｓ）－、及び－ＣＨ（ＳＨ）－からなる群から選択され、
各Ｙは独立に、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｒ＊は独立に、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒは独立に、Ｃ１－３アルキル及びＣ３－６炭素環からなる群から選択され、
各Ｒ’は独立に、Ｃ１－１２アルキル、Ｃ２－１２アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立に、Ｃ３－１２アルキル及びＣ３－１２アルケニルからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、化合物は、式（Ｖａ）の化合物：
Figure 2023062097000149
 （Ｖａ）
である。
式（Ｖ）または（Ｖａ）の化合物は、適用可能な時、以下の特徴のうちの１つ以上を含む。
いくつかの実施形態では、Ｚは、ＣＨ２である。
いくつかの実施形態では、Ｚは、存在しない。
いくつかの実施形態では、Ａ３及びＡ４のうちの少なくとも１つは、ＮまたはＮＨである。
いくつかの実施形態では、Ａ３は、Ｎであり、Ａ４は、ＮＨである。
いくつかの実施形態では、Ａ３は、Ｎであり、Ａ４は、ＣＨ２である。
いくつかの実施形態では、Ａ３は、ＣＨであり、Ａ４は、ＮＨである。
いくつかの実施形態では、Ｘ１及びＸ２のうちの少なくとも１つは、－ＣＨ２－ではない。例えば、ある特定の実施形態では、Ｘ１は、－ＣＨ２－ではない。いくつかの実施形態では、Ｘ１及びＸ２の少なくとも１つは、－Ｃ（Ｏ）－である。
いくつかの実施形態では、Ｘ２は、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－ＣＨ２－、－ＯＣ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、または－ＣＨ２－ＯＣ（Ｏ）－である。
いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は独立に、Ｃ５－２０アルキル及びＣ５－２０アルケニルからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、同じである。ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、Ｃ６、Ｃ９、Ｃ１２、またはＣ１４アルキルである。他の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、Ｃ１８アルケニルである。例えば、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、リノレイルであってよい。
いくつかの実施形態では、化合物は、以下からなる群から選択される：
Figure 2023062097000150
他の実施形態では、送達剤は、式（ＶＩ）を有する化合物：
Figure 2023062097000151
 （ＶＩ）、
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
Ａ６及びＡ７はそれぞれ独立に、ＣＨまたはＮから選択され、Ａ６及びＡ７の少なくとも１つは、Ｎであり、
Ｚは、ＣＨ２であるか、または存在せず、式中、ＺがＣＨ２である時、破線（１）及び（２）はそれぞれ、単結合を表し；Ｚが存在しない時、破線（１）及び（２）は両方ともに、存在せず、
Ｘ４及びＸ５は独立に、－ＣＨ２－、－（ＣＨ２）２－、－ＣＨＲ－、－ＣＨＹ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－ＣＨ２－、－ＯＣ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＣＨ２－ＯＣ（Ｏ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｃ（Ｓ）－、及び－ＣＨ（ＳＨ）－からなる群から選択され、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５はそれぞれ独立に、Ｃ５－２０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ”ＭＲ’、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択され、
各Ｍは独立に、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、アリール基、及びヘテロアリール基からなる群から選択され、
各Ｙは独立に、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｒ＊は独立に、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒは独立に、Ｃ１－３アルキル及びＣ３－６炭素環からなる群から選択され、
各Ｒ’は独立に、Ｃ１－１２アルキル、Ｃ２－１２アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立に、Ｃ３－１２アルキル及びＣ３－１２アルケニルからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５はそれぞれ独立に、Ｃ６－２０アルキル及びＣ６－２０アルケニルからなる群から選択され、
いくつかの実施形態では、Ｒ１及びＲ２は、同じである。ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、同じである。いくつかの実施形態では、Ｒ４及びＲ５は、同じである。ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、同じである。
いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つは、Ｃ９－１２アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のそれぞれは独立に、Ｃ９、Ｃ１２、または、Ｃ１４アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のそれぞれは、Ｃ９アルキルである。
いくつかの実施形態では、Ａ６は、Ｎであり、Ａ７は、Ｎである。いくつかの実施形態では、Ａ６は、ＣＨであり、Ａ７は、Ｎである。
いくつかの実施形態では、Ｘ４は、－ＣＨ２－であり、Ｘ５は、－Ｃ（Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｘ４及びＸ５は、－Ｃ（Ｏ）－である。
いくつかの実施形態では、Ａ６がＮであり、且つＡ７がＮである時、Ｘ４及びＸ５の少なくとも１つは、－ＣＨ２－ではなく、例えば、Ｘ４及びＸ５の少なくとも１つは、－Ｃ（Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ａ６がＮであり、且つＡ７がＮである時、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つは、－Ｒ”ＭＲ’である。
いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つは、－Ｒ”ＭＲ’ではない。
いくつかの実施形態では、化合物は、
Figure 2023062097000152
 である。
他の実施形態では、送達剤は、式：
Figure 2023062097000153
 を有する化合物（化合物３４２）を含む。
本明細書に開示の脂質化合物のアミン部分は、特定の条件下でプロトン化することができる。例えば、式（Ｉ）による脂質の中央のアミン部分は通常、アミノ部分のｐＫａ未満のｐＨで、プロトン化され（すなわち、正に荷電し）、ｐＫａを超えるｐＨで、実質的に荷電していない。そのような脂質は、イオン性アミノ脂質と呼ぶことができる。
特定の一実施形態では、イオン性アミノ脂質は、化合物１８である。別の実施形態では、イオン性アミノ脂質は、化合物２３６である。
いくつかの実施形態では、イオン性アミノ脂質、例えば、式（Ｉ）の化合物、の量は、脂質組成物中、約１ｍｏｌ％～９９ｍｏｌ％の範囲である。
一実施形態では、イオン性アミノ脂質、例えば、式（Ｉ）の化合物、の量は、脂質組成物中、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９ｍｏｌ％である。
一実施形態では、イオン性アミノ脂質、例えば、式（Ｉ）の化合物、の量は、脂質組成物中、約３０ｍｏｌ％～約７０ｍｏｌ％、約３５ｍｏｌ％～約６５ｍｏｌ％、約４０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、及び約４５ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％の範囲である。
特定の一実施形態では、イオン性アミノ脂質、例えば、式（Ｉ）の化合物、の量は、脂質組成物中、約５０ｍｏｌ％である。
本明細書に開示のイオン性アミノ脂質、例えば、式（Ｉ）の化合物、に加えて、本明細書に開示の医薬組成物の脂質組成物は、追加構成成分、例えば、リン脂質、構造脂質、ＰＥＧ脂質、及びそれらの任意の組み合わせ、を含むことができる。
ｂ．脂質組成物中の追加構成成分
（ｉ）リン脂質
本明細書に開示の医薬組成物の脂質組成物は、１つ以上のリン脂質、例えば、１つ以上の飽和もしくは（ポリ）不飽和リン脂質またはそれらの組み合わせ、を含むことができる。一般に、リン脂質は、リン脂質部分及び１つ以上の脂肪酸部分を含む。
リン脂質部分は、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、２－リゾホスファチジルコリン、及びスフィンゴミエリンからなる非限定的な群から選択することができる。
脂肪酸部分は、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、ミリストレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、α－リノレン酸、エルカ酸、フィタン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ベヘン酸、ドコサペンタエン酸、及びドコサヘキサエン酸からなる非限定的な群から選択することができる。
特定のリン脂質は、膜への融合を容易にすることができる。例えば、カチオン性リン脂質は、膜（例えば、細胞膜または細胞内膜）の１つ以上の負荷電リン脂質と相互作用することができる。リン脂質の膜への融合は、脂質含有組成物（例えば、ＬＮＰ）の１つ以上の要素（例えば、治療薬）が、膜を通過することを可能にし、例えば、１つ以上の要素の標的組織への送達を可能にすることができる。
分岐、酸化、環化、及びアルキンを含む修飾及び置換を有する天然種を含む非天然リン脂質種もまた企図される。例えば、リン脂質は、１つ以上のアルキン（例えば、１つ以上の二重結合が三重結合で置換されたアルケニル基）で官能化または架橋することができる。好適な反応条件下で、アルキン基は、アジドへの曝露時に、銅触媒付加環化を受ける可能性がある。そのような反応は、ナノ粒子組成物の脂質二重層を官能化して膜透過もしくは細胞認識を促進することに、または、ナノ粒子組成物を、有用な構成要素、例えば、標的化もしくはイメージング部分（例えば、色素）にコンジュゲートさせること、に有用であり得る
リン脂質は、グリセロリン脂質、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジグリセロール（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙ ｇｌｙｃｅｒｏｌｓ）及びホスファチジン酸、を含むが、これらに限定されない。リン脂質は、スフィンゴミエリンなどのホスホスフィンゴ脂質を含む。
リン脂質の例としては、以下の挙げられるが、それらに限定されない：
Figure 2023062097000154
Figure 2023062097000155
ある特定の実施形態では、本発明で有用または有用である可能性のあるリン脂質は、ＤＳＰＣのアナログまたはバリアントである。ある特定の実施形態では、本発明で有用または有用なリン脂質は、式（ＩＸ）の化合物またはその塩であり：
Figure 2023062097000156
 （ＩＸ）、
式中、
各Ｒ１は独立に、任意に置換されたアルキルであるか、または任意に、２つのＲ１は、間の原子と一緒になって結合して、任意に置換された単環式カルボシクリルもしくは任意に置換された単環式ヘテロシクリルを形成するか、または任意に、３つのＲ１は、間の原子と一緒になって結合して、任意に置換された二環式カルボシクリルまたは任意に置換された二環式ヘテロシクリルを形成し、
ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
ｍは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
Ａは、式：
Figure 2023062097000157
 のものであり、
Ｌ２の各例は独立に、結合または任意に置換されたＣ１～６アルキレンであり、任意に置換されたＣ１～６アルキレンの１つのメチレン単位は、－Ｏ－、－Ｎ（ＲＮ）－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ－、または－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－で任意に置換され、
Ｒ２の各例は独立に、任意に置換されたＣ１～３０アルキル、任意に置換されたＣ１－３０アルケニル、または任意に置換されたＣ１－３０アルキニルであり、任意に、Ｒ２の１つ以上のメチレン単位は独立に、任意に置換されたカルボシクリレン（ｃａｒｂｏｃｙｃｌｙｌｅｎｅ）、任意に置換されたヘテロシクリレン（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｙｌｅｎｅ）、任意に置換されたアリーレン、任意に置換されたヘテロアリーレン、－Ｎ（ＲＮ）－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｏ）－、－Ｃ（＝ＮＲＮ）－、－Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｓ）－、－ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｓ（Ｏ）－、－ＯＳ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）２Ｏ－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、－ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、または－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏ－で置換され、
ＲＮの各例は独立に、水素、任意に置換されたアルキル、または窒素保護基であり、
環Ｂは、任意に置換されたカルボシクリル、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたヘテロアリールであり、
ｐは、１または２であり、
但し、化合物は以下の式の化合物ではない：
Figure 2023062097000158
 、
（式中、Ｒ２の各例は独立に、非置換アルキル、非置換アルケニル、または非置換アルキニルである）。
リン脂質頭部修飾
ある特定の実施形態では、本発明で有用または有用である可能性のあるリン脂質は、修飾リン脂質頭部（例えば、修飾コリン基）を含む。ある特定の実施形態では、修飾頭部を有するリン脂質は、修飾４級アミンを有するＤＳＰＣまたはそのアナログである。例えば、式（ＩＸ）の実施形態では、Ｒ１のうちの少なくとも１つは、メチルではない。ある特定の実施形態では、Ｒ１のうちの少なくとも１つは、水素またはメチルではない。ある特定の実施形態では、式（ＩＸ）の化合物は、以下の式のうちの１つの化合物またはその塩であり：
Figure 2023062097000159
 式中、
各ｔは独立に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
各ｕは独立に、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
各ｖは独立に、１、２、または３である 。
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ）の化合物は、以下の式のうちの１つの化合物またはその塩である：
Figure 2023062097000160
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ）の化合物は、以下のうちの１つまたはその塩である：
Figure 2023062097000161
Figure 2023062097000162
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ）の化合物は、式（ＩＸ－ａ）の化合物またはその塩である：
Figure 2023062097000163
 （ＩＸ－ａ）。
ある特定の実施形態では、本発明で有用または有用である可能性のあるリン脂質は、修飾コアを含む。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の修飾コアを有するリン脂質は、修飾コア構造を有するＤＳＰＣまたはそのアナログである。例えば、式（ＩＸ－ａ）のある特定の実施形態では、基Ａは、以下の式の化合物ではない：
Figure 2023062097000164
 。
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ－ａ）の化合物は、以下の式のうちの１つの化合物またはその塩である：
Figure 2023062097000165
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ）の化合物は、以下のうちの１つまたはその塩である：
Figure 2023062097000166
ある特定の実施形態では、本発明で有用または有用である可能性のあるリン脂質は、グリセリド部分の代わりに環状部分を含む。ある特定の実施形態では、本発明で有用なリン脂質は、グリセリド部分の代わりに環状部分を有するＤＳＰＣまたはそのアナログである。ある特定の実施形態では、式（ＩＸ）の化合物は、式（ＩＸ－ｂ）の化合物またはその塩である：
Figure 2023062097000167
 （ＩＸ－ｂ）。
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ－ｂ）の化合物は、式（ＩＸ－ｂ－１）の化合物またはその塩であり：
Figure 2023062097000168
 （ＩＸ－ｂ－１）、
式中、
ｗは、０、１、２、または３である。
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ－ｂ）の化合物は、式（ＩＸ－ｂ－２）の化合物またはその塩である：
Figure 2023062097000169
 （ＩＸ－ｂ－２）。
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ－ｂ）の化合物は、式（ＩＸ－ｂ－３）の化合物またはその塩である：
Figure 2023062097000170
 （ＩＸ－ｂ－３）。
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ－ｂ）の化合物は、式（ＩＸ－ｂ－４）の化合物またはその塩である：
Figure 2023062097000171
 （ＩＸ－ｂ－４）。
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ－ｂ）の化合物は、以下のうちの１つまたはその塩である：
Figure 2023062097000172
リン脂質尾部修飾
ある特定の実施形態では、本発明で有用または有用である可能性のあるリン脂質は、修飾尾部を含む。ある特定の実施形態では、本発明で有用または有用である可能性のあるリン脂質は、修飾尾部を有するＤＳＰＣまたはそのアナログである。本明細書に記載される場合、「修飾尾部」は、より短いまたはより長い脂肪族鎖、分岐が導入された脂肪族鎖、置換基が導入された脂肪族鎖、１つ以上のメチレンが環状もしくはヘテロ原子基脂肪族鎖、またはそれらの任意の組み合わせを有する尾部であってよい。例えば、ある特定の実施形態では、（ＩＸ）の化合物は、式（ＩＸ－Ａ）の化合物、またはその塩であり、式中、Ｒ２の少なくとも１つの例は、Ｒ２の各例、任意に置換されたＣ１～３０アルキルであり、Ｒ２の１つ以上のメチレン単位は独立に、任意に置換されたカルボシクリレン、任意に置換されたヘテロシクリレン、任意に置換されたアリーレン、任意に置換されたヘテロアリーレン、－Ｎ（ＲＮ）－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｏ）－、－Ｃ（＝ＮＲＮ）－、－Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｓ）－、－ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｓ（Ｏ）－、－ＯＳ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）２Ｏ－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、－ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、または－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏ－で置換される。
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ）の化合物は、式（ＩＸ－ｃ）の化合物またはその塩であり：
Figure 2023062097000173
 （ＩＸ－ｃ）、
式中、
各ｘは独立に、０～３０の整数（端点を含む）であり、
Ｇの各例は独立に、任意に置換されたカルボシクリレン、任意に置換されたヘテロシクリレン、任意に置換されたアリーレン、任意に置換されたヘテロアリーレン、－Ｎ（ＲＮ）－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｏ）－、－Ｃ（＝ＮＲＮ）－、－Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｓ）－、－ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｓ（Ｏ）－、－ＯＳ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）２Ｏ－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２－、－任Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、－ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、または－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏ－からなる群から選択される。各可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ－ｃ）の化合物は、式（ＩＸ－ｃ－１）の化合物またはその塩であり：
Figure 2023062097000174
 （ＩＸ－ｃ－１）、
式中、
ｖの各例は独立に、１、２、または３である。
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ－ｃ）の化合物は、式（ＩＸ－ｃ－２）の化合物またはその塩である：
Figure 2023062097000175
 （ＩＸ－ｃ－２）。
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ－ｃ）の化合物は、以下の式の化合物またはその塩である：
Figure 2023062097000176
 。
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ－ｃ）の化合物は、以下またはその塩である：
Figure 2023062097000177
 。
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ－ｃ）の化合物は、式（ＩＸ－ｃ－３）の化合物、
またはその塩である：
Figure 2023062097000178
 （ＩＸ－ｃ－３）。
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ－ｃ）の化合物は、以下の式の化合物またはその塩である：
Figure 2023062097000179
 。
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ－ｃ）の化合物は、以下またはその塩である：
Figure 2023062097000180
 。
ある特定の実施形態では、本発明で有用または有用である可能性のあるリン脂質は、修飾ホスホコリン部分を含み、４級アミンをホスホリル基に連結するアルキル鎖は、エチレンではない（例えば、ｎは、２ではない）。それ故、ある特定の実施形態では、本発明で有用または有用である可能性のあるリン脂質は、式（ＩＸ）の化合物であって、式中、ｎは、１、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。例えば、ある特定の実施形態では、式（ＩＸ）の化合物は、以下の式のうちの１つの化合物またはその塩である：
Figure 2023062097000181
 。
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ）の化合物は、以下のうちの１つまたはその塩である：
Figure 2023062097000182
Figure 2023062097000183
（ｉｉ）代替脂質
ある特定の実施形態では、代替脂質が、本発明のリン脂質の代わりに使用される。そのような代替脂質の非限定例としては、以下を含む：
Figure 2023062097000184
（ｉｉｉ）構造脂質
本明細書に開示の医薬組成物の脂質組成物は、１つ以上の構造脂質を含むことができる。本明細書で使用される場合、「構造脂質」という用語は、ステロール、さらに、ステロール部分を含有する脂質を指す。
脂質ナノ粒子中の構造脂質の取り込みは、粒子中の他の脂質の凝集を弱めるのに役立ち得る。構造脂質は、限定されないが、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、トマチン、ウルソル酸、アルファ－トコフェロール、ホパノイド、フィトステロール、ステロイド、及びそれらの混合物を含む群から選択することができる。いくつかの実施形態では、構造脂質は、ステロールである。本明細書で定義される場合、「ステロール」は、ステロイドアルコールからなるステロイドのサブグループである。ある特定の実施形態では、構造脂質は、ステロイドである。ある特定の実施形態では、構造脂質は、コレステロールである。ある特定の実施形態では、構造脂質は、コレステロールのアナログである。ある特定の実施形態では、構造脂質は、アルファ－トコフェロールである。構造脂質の例としては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：
Figure 2023062097000185
一実施形態では、本明細書に開示の医薬組成物の脂質組成物中の構造脂質（例えば、コレステロールなどのステロール）の量は、約２０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％～約５５ｍｏ％、約３０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％、または約３５ｍｏｌ％～約４５ｍｏｌ％の範囲である。
一実施形態では、本明細書に開示の脂質組成物中の構造脂質（例えば、コレステロールなどのステロール）の量は、約２５ｍｏｌ％～約３０ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約３５ｍｏｌ％、または約３５ｍｏｌ％～約４０ｍｏｌ％の範囲である。
一実施形態では、本明細書に開示の脂質組成物中の構造脂質（例えば、コレステロールなどのステロール）の量は、約２４ｍｏｌ％、約２９ｍｏｌ％、約３４ｍｏｌ％、または約３９ｍｏｌ％である。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の脂質組成物中の構造脂質（例えば、コレステロールなどのステロール）の量は、少なくとも約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または６０ｍｏｌ％である。
（ｉｖ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質
本明細書に開示の医薬組成物の脂質組成物は、１つ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質を含むことができる。
本明細書で使用される場合、「ＰＥＧ脂質」という用語は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質を指す。ＰＥＧ脂質の非限定例としては、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジン酸、ＰＥＧセラミドコンジュゲート（例えば、ＰＥＧ－ＣｅｒＣ１４またはＰＥＧ－ＣｅｒＣ２０）、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン及びＰＥＧ修飾１，２－ジアシルオキシプロパン－３－アミンが挙げられる。そのような脂質は、ＰＥＧ化脂質とも呼ばれる。例えば、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ、またはＰＥＧ－ＤＳＰＥ脂質とすることができる。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質としては、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロールメトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）］（ＰＥＧ－ＤＳＰＥ）、ＰＥＧ－ジステニルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＳＧ）、ＰＥＧ－ジパルミトレイル、ＰＥＧ－ジオレイル、ＰＥＧ－ジステアリル、ＰＥＧ－ジアシルグリカミド（ＰＥＧ－ＤＡＧ）、ＰＥＧ－ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＤＰＰＥ）、またはＰＥＧ－１，２－ジミリスチルオキシプロピル－３－アミン（ＰＥＧ－ｃ－ＤＭＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物でからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質の脂質部分は、約Ｃ１４～約Ｃ２２、好ましくは、約Ｃ１４～約Ｃ１６、の長さを有するものを含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分、例えば、ｍＰＥＧ－ＮＨ２は、約１０００、２０００、５０００、１００００、１５０００、または２０，０００ダルトンのサイズを有する。一実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧである。
一実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子は、非拡散性ＰＥＧであるＰＥＧ脂質を含むことができる。非拡散性ＰＥＧの非限定例としては、ＰＥＧ－ＤＳＧ及びＰＥＧ－ＤＳＰＥが挙げられる。
ＰＥＧ－脂質は、米国特許第８１５８６０１号及び国際公開第ＷＯ２０１５／１３０５８４Ａ２号に記載されているように、当該技術分野で既知であり、これらは、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
一般に、本明細書に記載の種々の式の他の脂質構成成分（例えば、ＰＥＧ脂質）の一部は、「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｇｅｎｔｓ（治療薬の送達のための組成物及び方法）」という名称の２０１６年１２月１０日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０００１２９号」に記載されているように合成されてもよく、これは、全体が参照により組み込まれる。
脂質ナノ粒子組成物の脂質構成成分は、ポリエチレングリコールを含む１つ以上の分子、例えば、ＰＥＧ脂質またはＰＥＧ修飾脂質を含み得る。あるいは、そのような種は、ＰＥＧ化脂質と呼ばれ得る。ＰＥＧ脂質は、ポリエチレングリコールで修飾されている脂質である。ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物を含む非限定的な群から選択され得る。例えば、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ、またはＰＥＧ－ＤＳＰＥ脂質であってよい。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、ＰＥＧ－ＤＭＧの修飾形態である。ＰＥＧ－ＤＭＧは、以下の構造を有する：
Figure 2023062097000186
 。
一実施形態では、本発明で有用なＰＥＧ脂質は、国際公開第ＷＯ２０１２０９９７５５号に記載のＰＥＧ化脂質とすることができ、この内容は、本明細書に全体が参照により組み込まれる。本明細書に記載のこれらの例示的なＰＥＧ脂質のいずれもが、ヒドロキシル基をＰＥＧ鎖に含むように修飾され得る。ある特定の実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ＯＨ脂質である。本明細書で一般に定義されるように、（本明細書では「ヒドロキシＰＥＧ化脂質」とも呼ばれる）「ＰＥＧ－ＯＨ脂質」は、１つ以上のヒドロキシル（－ＯＨ）基を脂質に有するＰＥＧ化脂質である。ある特定の実施形態では、ＰＥＧ－ＯＨ脂質は、１つ以上のヒドロキシル基をＰＥＧ鎖に含む。ある特定の実施形態では、ＰＥＧ－ＯＨまたはヒドロキシＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ鎖の末端に－ＯＨ基を含む。各可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。
ある特定の実施形態では、本発明に有用なＰＥＧ脂質は、式（ＶＩＩ）の化合物である。式（ＶＩＩ）の化合物またはその塩が本明細書で提供され：
Figure 2023062097000187
 （ＶＩＩ）、
式中、
Ｒ３は、－ＯＲＯであり、
ＲＯは、水素、任意に置換されたアルキル、または酸素保護基であり、
ｒは、１～１００の整数（端点を含む）であり、
Ｌ１は、任意に置換されたＣ１～１０アルキレンであり、任意に置換されたＣ１～１０アルキレンのうちの少なくとも１つは独立に、任意に置換されたカルボシクリレン、任意に置換されたヘテロシクリレン、任意に置換されたアリーレン、任意に置換されたヘテロアリーレン、－Ｏ－、－Ｎ（ＲＮ）－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ－、または－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－で置換され、
Ｄは、クリックケミストリーにより得られる部分または生理的条件下で切断可能な部分であり、
ｍは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
Ａは、式：
Figure 2023062097000188
 のものであり、
Ｌ２の各例は独立に、結合または任意に置換されたＣ１～６アルキレンであり、任意に置換されたＣ１～６アルキレンの１つのメチレン単位は、－Ｏ－、－Ｎ（ＲＮ）－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ－、または－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－で任意に置換され、
Ｒ２の各例は独立に、任意に置換されたＣ１～３０アルキル、任意に置換されたＣ１～３０アルケニル、または任意に置換されたＣ１～３０アルキニルであり、任意に、Ｒ２の１つ以上のメチレン単位は独立に、任意に置換されたカルボシクリレン、任意に置換されたヘテロシクリレン、任意に置換されたアリーレン、任意に置換されたヘテロアリーレン、－Ｎ（ＲＮ）－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｏ）－、－Ｃ（＝ＮＲＮ）－、－Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｓ）－、－ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｓ（Ｏ）－、－ＯＳ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）２Ｏ－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、－ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、または－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏ－であり、
ＲＮの各例は独立に、水素、任意に置換されたアルキル、または窒素保護基であり、
環Ｂは、任意に置換されたカルボシクリル、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたヘテロアリールであり、
ｐは、１または２である。
ある特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、ＰＥＧ－ＯＨ脂質（すなわち、Ｒ３は、－ＯＲＯであり、ＲＯは、水素である）である。ある特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、式（ＶＩＩ－ＯＨ）の化合物またはその塩である：
Figure 2023062097000189
 （ＶＩＩ－ＯＨ）。
ある特定の実施形態では、Ｄは、クリック化学（例えば、トリアゾール）により得られた部分である。ある特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、式（ＶＩＩ－ａ－１）または（ＶＩＩ－ａ－２）の化合物またはその塩である：
Figure 2023062097000190
 （ＶＩＩ－ａ－１）、（ＶＩＩ－ａ－２）。
ある特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、以下の式のうちの１つの化合物またはその塩であり：
Figure 2023062097000191
 式中、
ｓは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。
ある特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、以下の式のうちの１つの化合物またはその塩である：
Figure 2023062097000192
ある特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、以下の式のうちの１つの化合物またはその塩である：
Figure 2023062097000193
ある特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、以下の式のうちの１つの化合物またはそれらの塩である：
Figure 2023062097000194
ある特定の実施形態では、Ｄは、生理学的条件下で切断可能な部分（例えば、エステル、アミド、カルボナート、カルバマート、尿素）である。ある特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、式（ＶＩＩ－ｂ－１）または（ＶＩＩ－ｂ－２）の化合物またはその塩である：
Figure 2023062097000195
 （ＶＩＩ－ｂ－１） （ＶＩＩ－ｂ－２）。
ある特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、式（ＶＩＩ－ｂ－１－ＯＨ）または（ＶＩＩ－ｂ－２－ＯＨ）の化合物またはその塩である：
Figure 2023062097000196
 （ＶＩＩ－ｂ－１－ＯＨ） （ＶＩＩ－ｂ－２－ＯＨ）。
ある特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、以下の式のうちの１つの化合物またはその塩である：
Figure 2023062097000197
ある特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、以下の式のうちの１つの化合物またはその塩である：
Figure 2023062097000198
ある特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、以下の式のうちの１つの化合物またはその塩である：
Figure 2023062097000199
ある特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、以下の式のうちの１つの化合物またはその塩である：
Figure 2023062097000200
ある特定の実施形態では、本発明で有用なＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ化脂肪酸である。ある特定の実施形態では、本発明に有用なＰＥＧ脂質は、式（ＶＩＩＩ）の化合物である。式（ＶＩＩＩ）の化合物またはその塩が本明細書に提供され：
Figure 2023062097000201
 （ＶＩＩＩ）、
式中、
Ｒ３は、－ＯＲＯであり、
ＲＯは、水素、任意に置換されたアルキル、または酸素保護基であり、
ｒは、１～１００の整数（端点を含む）であり、
Ｒ５は、任意に置換されたＣ１０～４０アルキル、任意に置換されたＣ１０～４０アルケニル、または任意に置換されたＣ１０～４０アルキニルであり、任意に、Ｒ５の１つ以上のメチレン基は、任意に置換されたカルボシクリレン、任意に置換されたヘテロシクリレン、任意に置換されたアリーレン、任意に置換されたヘテロアリーレン、－Ｎ（ＲＮ）－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｏ）－、－Ｃ（＝ＮＲＮ）－、－Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｓ）－、－ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｓ（Ｏ）－、－ＯＳ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）２Ｏ－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、－ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、または－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏ－で置換され、
ＲＮの各例は独立に、水素、任意に置換されたアルキル、または窒素保護基である。
ある特定の実施形態では、式（ＶＩＩＩ）の化合物は、式（ＶＩＩＩ－ＯＨ）の化合物またはそれらの塩である：
Figure 2023062097000202
 （ＶＩＩＩ－ＯＨ）。
いくつかの実施形態では、ｒは、４５である。
ある特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、以下の式のうちの１つの化合物またはその塩である：
Figure 2023062097000203
 いくつかの実施形態では、ｒは、４５である。
さらに他の実施形態では、式（ＶＩＩＩ）の化合物は、
Figure 2023062097000204
 またはその塩である。
一実施形態では、式（ＶＩＩＩ）の化合物は、
Figure 2023062097000205
 である。
一実施形態では、本明細書に開示の医薬組成物の脂質組成物中のＰＥＧ脂質の量は、約０．１ｍｏｌ％～約５ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ％～約５ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％～約５ｍｏｌ％、約１．５ｍｏｌ％～約５ｍｏｌ％、約２ｍｏｌ％～約５ｍｏｌ％ｍｏｌ％、約０．１ｍｏｌ％～約４ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ％～約４ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％～約４ｍｏｌ％、約１．５ｍｏｌ％～約４ｍｏｌ％、約２ｍｏｌ％～約４ｍｏｌ％、約０．１ｍｏｌ％～約３ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ％～約３ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％～約３ｍｏｌ％、約１．５ｍｏｌ％～約３ｍｏｌ％、約２ｍｏｌ％～約３ｍｏｌ％、約０．１ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％、約１．５ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％、約０．１ｍｏｌ％～約１．５ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ％～約１．５ｍｏｌ％、または約１ｍｏｌ％～約１．５ｍｏｌ％の範囲である。
一実施形態では、本明細書に開示の脂質組成物中のＰＥＧ脂質の量は、約２ｍｏｌ％である。一実施形態では、本明細書に開示の脂質組成物中のＰＥＧ脂質の量は、約１．５ｍｏｌ％である。
一実施形態では、本明細書に開示の脂質組成物中のＰＥＧ脂質の量は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、または５ｍｏｌ％である。
いくつかの態様では、本明細書に開示の医薬組成物の脂質組成物は、ＰＥＧ脂質を含まない。
（ｖ）他のイオン性アミノ脂質
本明細書に開示の医薬組成物の脂質組成物は、式（Ｉ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、または（ＶＩ）による脂質に加えて、１つ以上のイオン性アミノ脂質を含むことができる。
イオン性脂質は、３－（ジドデシルアミノ）－Ｎ１，Ｎ１，４－トリドデシル－１－ピペラジンエタンアミン（ＫＬ１０）、Ｎ１－［２－（ジドデシルアミノ）エチル］－Ｎ１，Ｎ４，Ｎ４－トリドデシル－１，４－ピペラジンジエタンアミン（ＫＬ２２）、１４，２５－ジトリデシル－１５，１８，２１，２４－テトラアザ－オクタトリアコンタン（ＫＬ２５）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノメチル）ブタノアート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、（１３Ｚ，１６５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－ノニドコサ－１３－１６－ジエン－１－アミン（Ｌ６０８）、２－（｛８－［（３β）－コレスタ－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ）、（２Ｒ）－２－（｛８－［（３β）－コレスタ－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｒ））、及び（２Ｓ）－２－（｛８－［（３β）－コレスタ－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｓ））からなる非限定的な群から選択することができる。これらに加えて、イオン性アミノ脂質は、環状アミン基を含む脂質とすることもできる。
イオン性脂質は、全体として本明細書で参照により組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１７／０７５５３１Ａ１号に開示される化合物とすることもできる。例えば、イオン性アミノ脂質は、
Figure 2023062097000206
 及びそれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない。
イオン性脂質は、全体として本明細書で参照により組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１５／１９９９５２Ａ１号に開示される化合物とすることもできる。例えば、イオン性アミノ脂質は、
Figure 2023062097000207
Figure 2023062097000208
 及びそれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない。
イオン性脂質は、
Figure 2023062097000209
 及びそれらの任意の組み合わせをさらに含むことができるが、これらに限定されない。
（ｖｉ）他の脂質組成物構成成分
本明細書に開示の医薬組成物の脂質組成物は、上記のものに加えて、１つ以上の構成成分を含むことができる。例えば、脂質組成物は、１つ以上の透過促進分子、炭水化物、ポリマー、表面改質剤（例えば、界面活性剤）、または他の構成成分を含むことができる。例えば、透過促進分子は、米国特許出願公開第２００５／０２２２０６４号に記載の分子とすることができる。炭水化物は、単糖（例えば、グルコース）及び多糖（例えば、グリコーゲンならびにその誘導体及びアナログ）を含むことができる。
ポリマーは、本明細書に開示の医薬組成物（例えば、脂質ナノ粒子形態の医薬組成物）に含むことができ、且つ／または、それを封入もしくは部分的に封入するために使用することができる。ポリマーは、生分解性及び／または生体適合性であることができる。ポリマーは、ポリアミン、ポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、ポリカルバマート、ポリ尿素、ポリカルボナート、ポリスチレン、ポリイミド、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリアセチレン、ポリエチレン、ポリエチレンイミン、ポリイソシアナート、ポリアクリラート、ポリメタクリラート、ポリアクリロニトリル、及びポリアリーラートから選択することができるが、これらに限定されない。
脂質組成物及びポリヌクレオチドの間の比の範囲は、約１０：１～約６０：１（ｗｔ／ｗｔ）であることができる。
いくつかの実施形態では、脂質組成物及びポリヌクレオチドの比率は、約１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０：１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、３６：１、３７：１、３８：１、３９：１、４０：１、４１：１、４２：１、４３：１、４４：１、４５：１、４６：１、４７：１、４８：１、４９：１、５０：１、５１：１、５２：１、５３：１、５４：１、５５：１、５６：１、５７：１、５８：１、５９：１、または６０：１（ｗｔ／ｗｔ）とすることができる。いくつかの実施形態では、脂質組成物対治療薬をコードするポリヌクレオチドのｗｔ／ｗｔ比は、約２０：１または約１５：１である。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の医薬組成物は、複数のポリペプチドを含有することができる。例えば、本明細書に開示の医薬組成物は、２つ以上のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を含有することができる。
一実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子は、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を、５：１、１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１、５５：１、６０：１、もしくは７０：１の脂質：ポリヌクレオチド重量比、または、これらの比の範囲もしくはいずれか、例えば、限定されないが、５：１～約１０：１、約５：１～約１５：１、約５：１～約２０：１、約５：１～約２５：１、約５：１～約３０：１、約５：１～約３５：１、約５：１～約４０：１、約５：１～約４５：１、約５：１～約５０：１、約５：１～約５５：１、約５：１～約６０：１、約５：１～約７０：１、約１０：１～約１５：１、約１０：１～約２０：１、約１０：１～約２５：１、約１０：１～約３０：１、約１０：１～約３５：１、約１０：１～約４０：１、約１０：１～約４５：１、約１０：１～約５０：１、約１０：１～約５５：１、約１０：１～約６０：１、約１０：１～約７０：１、約１５：１～約２０：１、約１５：１～約２５：１，約１５：１～約３０：１、約１５：１～約３５：１、約１５：１～約４０：１、約１５：１～約４５：１、約１５：１～約５０：１、約１５：１～約５５：１、約１５：１～約６０：１、もしくは約１５：１～約７０：１で含むことができる。
一実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子は、ポリヌクレオチドを、およそ０．１ｍｇ／ｍｌ～２ｍｇ／ｍｌ、例えば、限定されないが、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．３ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、０．７ｍｇ／ｍｌ、０．８ｍｇ／ｍｌ、０．９ｍｇ／ｍｌ、１．０ｍｇ／ｍｌ、１．１ｍｇ／ｍｌ、１．２ｍｇ／ｍｌ、１．３ｍｇ／ｍｌ、１．４ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、１．６ｍｇ／ｍｌ、１．７ｍｇ／ｍｌ、１．８ｍｇ／ｍｌ、１．９ｍｇ／ｍｌ、２．０ｍｇ／ｍｌ、または２．０ｍｇ／ｍｌを超える濃度で含むことができる。
（ｖｉｉ）ナノ粒子組成物
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の医薬組成物は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）として製剤化される。従って、本開示は、（ｉ）本明細書に記載の式（Ｉ）または（ＩＩＩ）の化合物などの送達剤、及び、（ｉｉ）ＰＢＧＤポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、を含む脂質組成物を含むナノ粒子組成物も提供する。そのようなナノ粒子組成物では、本明細書に開示の脂質組成物は、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを封入することができる。
ナノ粒子組成物は通常、マイクロメートル台以下の大きさであり、脂質二重層を含むことができる。ナノ粒子組成物は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リポソーム（例えば、脂質小胞）、及びリポプレックスを包含する。例えば、ナノ粒子組成物は、５００ｎｍ以下の直径を有する脂質二重層を有するリポソームとすることができる。
ナノ粒子組成物は、例えば、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リポソーム、及びリポプレックスを含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、１つ以上の脂質二重層を含む小胞である。ある特定の実施形態では、ナノ粒子組成物は、水性区画により隔てられた２つ以上の同心二重層を含む。脂質二重層は、官能化及び／または互いに架橋することができる。脂質二重層は、１つ以上のリガンド、タンパク質、またはチャネルを含むことができる。
いくつかの実施形態では、本開示のナノ粒子組成物は、式（Ｉ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、または（ＶＩ）による少なくとも１つの化合物を含む。例えば、ナノ粒子組成物は、化合物１～１４７のうちの１つ以上または化合物１～３４２のうちの１つ以上を含むことができる。ナノ粒子組成物は、様々な他の構成成分を含むこともできる。例えば、ナノ粒子組成物は、式（Ｉ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、または（ＶＩ）による脂質に加えて、他の１つ以上の脂質、例えば、（ｉ）少なくとも１つのリン脂質、（ｉｉ）少なくとも１つの構造脂質、（ｉｉｉ）少なくとも１つのＰＥＧ－脂質、または（ｉｖ）それらの任意の組み合わせ、を含んでもよい。構造脂質を含むことは、例えば、式ＩＩＩによる脂質が本発明の脂質ナノ粒子組成物に使用される場合、任意とすることができる。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、式（Ｉ）の化合物（例えば、化合物１８、２５、２６、または４８）を含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、式（Ｉ）の化合物（例えば、化合物１８、２５、２６、または４８）及びリン脂質（例えば、ＤＳＰＣ）を含む。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、式（ＩＩＩ）の化合物（例えば、化合物２３６）を含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、式（ＩＩＩ）の化合物（例えば、化合物２３６）及びリン脂質（例えば、ＤＯＰＥまたはＤＳＰＣ）を含む。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、式（Ｉ）の化合物（例えば、化合物１８、２５、２６、または４８）からなるか、または本質的なる脂質組成物を含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、式（Ｉ）の化合物（例えば、化合物１８、２５、２６、または４８）及びリン脂質（例えば、ＤＳＰＣ）からなるか、または本質的になる脂質組成物を含む。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、式（ＩＩＩ）の化合物（例えば、化合物２３６）からなるか、または本質的になる脂質組成物を含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、式（ＩＩＩ）の化合物（例えば、化合物２３６）及びリン脂質（例えば、ＤＯＰＥまたはＤＳＰＣ）からなるか、または本質的になる脂質組成物を含む。
一実施形態では、脂質ナノ粒子は、イオン性脂質、構造脂質、リン脂質、及びｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、イオン性脂質、ＰＥＧ修飾脂質、ステロール、及び構造脂質を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、約２０～６０％のイオン性脂質、約５～２５％の構造脂質、約２５～５５％のステロール、約０．５～１５％のＰＥＧ修飾脂質のモル比を有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、約５０％のイオン性脂質、約１．５％のＰＥＧ修飾脂質、約３８．５％のコレステロール、及び約１０％の構造脂質のモル比を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、約５５％のイオン性脂質、約２．５％のＰＥＧ脂質、約３２．５％のコレステロール、及び約１０％の構造脂質のモル比を含む。いくつかの実施形態では、イオン性脂質は、イオン性アミノ脂質であり、構造脂質は、中性脂質であり、ステロールは、コレステロールである。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、イオン性脂質：コレステロール：ＤＳＰＣ：ＰＥＧ脂質のモル比が５０：３８．５：１０：１．５である。いくつかの実施形態では、イオン性脂質は、化合物１８または化合物２３６であり、ＰＥＧ脂質は、化合物４２８である。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、化合物１８：コレステロール：リン脂質：化合物４２８のモル比が５０：３８．５：１０：１．５である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、化合物１８：コレステロール：ＤＳＰＣ：化合物４２８のモル比が５０：３８．５：１０：１．５である。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、化合物２３６：コレステロール：リン脂質：化合物４２８のモル比が５０：３８．５：１０：１．５である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、化合物２３６：コレステロール：ＤＳＰＣ：化合物４２８のモル比が５０：３８．５：１０：１．５である。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、０．４未満の多分散値を有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、中性ｐＨで正味中性電荷を有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、５０～１５０ｎｍの平均直径を有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、８０～１００ｎｍの平均直径を有する。
本明細書で一般に定義される場合、「脂質」という用語は、疎水性または両親媒性特性を有する小分子を指す。脂質は、天然に存在する脂質または合成脂質であってよい。脂質の部類の例としては、脂肪、ワックス、ステロール含有代謝産物、ビタミン、脂肪酸、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、サッカロ脂質、及びポリケチド、ならびにプレノール脂質が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの場合では、いくつかの脂質の両親媒性特性により、それらが水性媒体中でリポソーム、小胞、または膜を形成するようなる。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、イオン性脂質を含んでもよい。本明細書で使用される場合、「イオン性脂質」という用語は、当該分野におけるその通常の意味を有し、１つ以上の荷電部分を含む脂質を指し得る。いくつかの実施形態では、イオン性脂質は、正に荷電または負に荷電してもよい。イオン性脂質は、正に荷電してもよく、この場合、それは、「カチオン性脂質」と呼ぶことができる。ある特定の実施形態では、イオン性脂質分子は、アミン基を含んでもよく、イオン性アミノ脂質と呼ぶことができる。本明細書で使用される場合、「荷電部分」は、形式電荷、例えば、一価（＋１または－１）、二価（＋２または－２）、三価（＋３または－３）など、を有する化学的部分である。荷電部分は、アニオン性（すなわち、負に荷電）またはカチオン性（すなわち、正に荷電）であってよい。正荷電部分の例としては、アミン基（例えば、１級アミン、２級アミン、及び／または３級アミン）、アンモニウム基、ピリジニウム基、グアニジン基、及びイミジゾリウム（ｉｍｉｄｉｚｏｌｉｕｍ）基が挙げられる。特定の実施形態では、荷電部分は、アミン基を含む。負荷電基またはその前駆体の例としては、カルボキシラート基、スルホナート基、スルファート基、ホスホナート基、ホスファート基、ヒドロキシル基などが挙げられる。いくつかの場合では、荷電部分の電荷は、環境条件に伴い変動してもよく、例えば、ｐＨの変化は、部分の電荷を変化させ、及び／または部分が荷電または非荷電になるようし得る。一般に、分子の電荷密度は、所望に応じて選択され得る。
「荷電」または「荷電部分」という用語は、分子上の「部分的負電荷」または「部分的正電荷」を指さないことを理解すべきである。「部分負電荷」及び「部分正電荷」という用語は、当該技術分野で通常の意味が与えられる。電子密度が結合の１つの原子に向かって引っ張られて、原子上に部分的な負電荷を生成するように、官能基が分極化する結合を含む場合、「部分負電荷」が生じ得る。当業者らは一般に、このように分極することができる結合を認識するであろう。
いくつかの実施形態では、イオン性脂質は、当該技術分野で「イオン性カチオン性脂質」と呼ばれる場合があるイオン性アミノ脂質である。一実施形態では、イオン性アミノ脂質は、リンカー構造を介して連結される正荷電親水性頭部及び疎水性尾部を有し得る。
これらに加えて、イオン性脂質はまた、環状アミン基を含む脂質でもあり得る。
一実施形態では、イオン性脂質は、国際公開第ＷＯ２０１３０８６３５４号及び同第ＷＯ２０１３１１６１２６号に記載のイオン性脂質から選択され得るが、これらに限定されず、これらのそれぞれの内容は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
さらに別の実施形態では、イオン性脂質は、限定されないが、米国特許第７，４０４，９６９号の式ＣＬＩ－ＣＬＸＸＸＸＩＩから選択され得るが、これらに限定されず、これらのそれぞれの内容は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
一実施形態では、脂質は、本明細書に全体が参照により組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１２１７０８８９号に記載されるような切断可能な脂質であってよい。一実施形態では、脂質は、当該技術分野で既知の方法により及び／または国際公開第ＷＯ２０１３０８６３５４号（これらのそれぞれの内容は、全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、合成され得る。
ナノ粒子組成物は、様々な方法により特性決定することができる。例えば、顕微鏡（例えば、透過型電子顕微鏡または走査型電子顕微鏡）を、ナノ粒子組成物の形態及びサイズ分布を調べるために使用することができる。動的光散乱法または電位差測定法（例えば、電位差滴定）を、ゼータ電位を測定するために使用することができる。動的光散乱法は、粒子サイズを決定するために利用することもできる。Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ、英国ウスターシャー州マルバーン）などの装置を、ナノ粒子組成物の複数の特徴、例えば、粒径、多分散指数、及びゼータ電位、を測定するために使用することもできる。
ナノ粒子のサイズは、限定されないが、炎症などの生物学的反応を打ち消すのを助けることができ、または、ポリヌクレオチドの生物学的効果を増加させることができる。
本明細書で使用される場合、ナノ粒子組成物の文脈における「サイズ」または「平均サイズ」は、ナノ粒子組成物の平均直径を指す。
一実施形態では、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、約１０～約１００ｎｍ、例えば、限定されないが、約１０～約２０ｎｍ、約１０～約３０ｎｍ、約１０～約４０ｎｍ、約１０～約５０ｎｍ、約１０～約６０ｎｍ、約１０～約７０ｎｍ、約１０～約８０ｎｍ、約１０～約９０ｎｍ、約２０～約３０ｎｍ、約２０～約４０ｎｍ、約２０～約５０ｎｍ、約２０～約６０ｎｍ、約２０～約７０ｎｍ、約２０～約８０ｎｍ、約２０～約９０ｎｍ、約２０～約１００ｎｍ、約３０～約４０ｎｍ、約３０～約５０ｎｍ、約３０～約６０ｎｍ、約３０～約７０ｎｍ、約３０～約８０ｎｍ、約３０～約９０ｎｍ、約３０～約１００ｎｍ、約４０～約５０ｎｍ、約４０～約６０ｎｍ、約４０～約７０ｎｍ、約４０～約８０ｎｍ、約４０～約９０ｎｍ、約４０～約１００ｎｍ、約５０～約６０ｎｍ、約５０～約７０ｎｍ、約５０～約８０ｎｍ、約５０～約９０ｎｍ、約５０～約１００ｎｍ、約６０～約７０ｎｍ、約６０～約８０ｎｍ、約６０～約９０ｎｍ、約６０～約１００ｎｍ、約７０～約８０ｎｍ、約７０～約９０ｎｍ、約７０～約１００ｎｍ、約８０～約９０ｎｍ、約８０～約１００ｎｍ、及び／または約９０～約１００ｎｍの直径を有する脂質ナノ粒子に製剤化される。
一実施形態では、ナノ粒子は、約１０～５００ｎｍの直径を有する。一実施形態では、ナノ粒子は、１００ｎｍより大きい、１５０ｎｍより大きい、２００ｎｍより大きい、２５０ｎｍより大きい、３００ｎｍより大きい、３５０ｎｍより大きい、４００ｎｍより大きい、４５０ｎｍより大きい、５００ｎｍより大きい、５５０ｎｍより大きい、６００ｎｍより大きい、６５０ｎｍより大きい、７００ｎｍより大きい、７５０ｎｍより大きい、８００ｎｍより大きい、８５０ｎｍより大きい、９００ｎｍより大きい、９５０ｎｍより大きい、または１０００ｎｍより大きい直径を有する。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物の最大寸法は、１μｍ以下（例えば、１μｍ、９００ｎｍ、８００ｎｍ、７００ｎｍ、６００ｎｍ、５００ｎｍ、４００ｎｍ、３００ｎｍ、２００ｎｍ、１７５ｎｍ、１５０ｎｍ、１２５ｎｍ、１００ｎｍ、７５ｎｍ、５０ｎｍ、またはそれ以下）である。
ナノ粒子組成物は、比較的均質であることができる。多分散指数を、ナノ粒子組成物の均質性、例えば、ナノ粒子組成物の粒径分布、を示すために使用することができる。小さな（例えば、０．３未満の）多分散指数は一般に、狭い粒径分布を示す。ナノ粒子組成物は、約０～約０．２５、例えば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１０、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、０．２０、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４、または０．２５の多分散指数を有することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示のナノ粒子組成物の多分散指数は、約０．１０～約０．２０であることができる。
ナノ粒子組成物のゼータ電位は、組成物の界面動電電位を示すために使用することができる。例えば、ゼータ電位は、ナノ粒子組成物の表面電荷を表すことができる。より高い電荷種は、細胞、組織、及び体内の他の要素と望ましくない相互作用をする可能性があるので、正または負の比較的少ない電荷を有するナノ粒子組成物が一般に望ましい。いくつかの実施形態では、本明細書に開示のナノ粒子組成物のゼータ電位は、約－１０ｍＶ～約＋２０ｍＶ、約－１０ｍＶ～約＋１５ｍＶ、約１０ｍＶ～約＋１０ｍＶ、約－１０ｍＶ～約＋５ｍＶ、約－１０ｍＶ～約０ｍＶ、約－１０ｍＶ～約－５ｍＶ、約－５ｍＶ～約＋２０ｍＶ、約－５ｍＶ～約＋１５ｍＶ、約－５ｍＶ～約＋１０ｍＶ、約－５ｍＶ～約＋５ｍＶ、約－５ｍＶ～約０ｍＶ、約０ｍＶ～約＋２０ｍＶ、約０ｍＶ～約＋１５ｍＶ、約０ｍＶ～約＋１０ｍＶ、約０ｍＶ～約＋５ｍＶ、約＋５ｍＶ～約＋２０ｍＶ、約＋５ｍＶ～約＋１５ｍＶ、または約＋５ｍＶ～約＋１０ｍＶであることができる。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子のゼータ電位は、約０ｍＶ～約１００ｍＶ、約０ｍＶ～約９０ｍＶ、約０ｍＶ～約８０ｍＶ、約０ｍＶ～約７０ｍＶ、約０ｍＶ～約６０ｍＶ、約０ｍＶ～約５０ｍＶ、約０ｍＶ～約４０ｍＶ、約０ｍＶ～約３０ｍＶ、約０ｍＶ～約２０ｍＶ、約０ｍＶ～約１０ｍＶ、約１０ｍＶ～約１００ｍＶ、約１０ｍＶ～約９０ｍＶ、約１０ｍＶ～約８０ｍＶ、約１０ｍＶ～約７０ｍＶ、約１０ｍＶ～約６０ｍＶ、約１０ｍＶ～約５０ｍＶ、約１０ｍＶ～約４０ｍＶ、約１０ｍＶ～約３０ｍＶ、約１０ｍＶ～約２０ｍＶ、約２０ｍＶ～約１００ｍＶ、約２０ｍＶ～約９０ｍＶ、約２０ｍＶ～約８０ｍＶ、約２０ｍＶ～約７０ｍＶ、約２０ｍＶ～約６０ｍＶ、約２０ｍＶ～約５０ｍＶ、約２０ｍＶ～約４０ｍＶ、約２０ｍＶ～約３０ｍＶ、約３０ｍＶ～約１００ｍＶ、約３０ｍＶ～約９０ｍＶ、約３０ｍＶ～約８０ｍＶ、約３０ｍＶ～約７０ｍＶ、約３０ｍＶ～約６０ｍＶ、約３０ｍＶ～約５０ｍＶ、約３０ｍＶ～約４０ｍＶ、約４０ｍＶ～約１００ｍＶ、約４０ｍＶ～約９０ｍＶ、約４０ｍＶ～約８０ｍＶ、約４０ｍＶ～約７０ｍＶ、約４０ｍＶ～約６０ｍＶ，及び約４０ｍＶ～約５０ｍＶであることができる。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子のゼータ電位は、約１０ｍＶ～約５０ｍＶ、約１５ｍＶ～約４５ｍＶ、約２０ｍＶ～約４０ｍＶ、及び約２５ｍＶ～約３５ｍＶであることができる。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子のゼータ電位は、約１０ｍＶ、約２０ｍＶ、約３０ｍＶ、約４０ｍＶ、約５０ｍＶ、約６０ｍＶ、約７０ｍＶ、約８０ｍＶ、約９０ｍＶ、及び約１００ｍＶであることができる。
ポリヌクレオチドの「封入効率」という用語は、提供された初期量に対する、調製後のナノ粒子組成物により封入されるか、または別の方法でこれと会合するポリヌクレオチドの量を表す。本明細書で使用される場合、「封入」は、完全な、実質的な、または部分的な閉じ込め、拘束、取り囲み、または内包を指すことができる。
封入効率は、高いことが望ましい（例えば、１００％に近い）。封入効率は、例えば、１つ以上の有機溶媒または界面活性剤でナノ粒子組成物を分解させた前後で、ナノ粒子組成物を含有する溶液中のポリヌクレオチドの量を比較することにより、測定することができる。
蛍光を、溶液中の遊離ポリヌクレオチドの量を測定するために使用することができる。本明細書に記載のナノ粒子組成物では、ポリヌクレオチドの封入効率は、少なくとも５０％、例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であることができる。いくつかの実施形態では、封入効率は、少なくとも８０％であることができる。ある特定の実施形態では、封入効率は、少なくとも９０％であることができる。
本明細書に開示の医薬組成物中に存在するポリヌクレオチドの量は、複数の要因、例えば、ポリヌクレオチドのサイズ、所望の標的及び／もしくは用途、またはナノ粒子組成物の他の特性、ならびに、ポリヌクレオチドの特性、に依存する可能性がある。
例えば、ナノ粒子組成物に有用なｍＲＮＡの量は、ｍＲＮＡのサイズ（長さまたは分子量として表される）、配列、及び他の特徴に依存し得る。ナノ粒子組成物中のポリヌクレオチドの相対量もまた、変動する可能性がある。
本開示の脂質組成物及び脂質ナノ粒子組成物中に存在するポリヌクレオチドの相対量は、有効性及び忍容性の考察に従って最適化することができる。ポリヌクレオチドとしてのｍＲＮＡを含む組成物では、Ｎ：Ｐ比は、有用なメトリックとして機能することができる。
ナノ粒子組成物のＮ：Ｐ比が発現及び忍容性の両方を制御するので、低いＮ：Ｐ比及び強い発現を有するナノ粒子組成物が望ましい。Ｎ：Ｐ比は、ナノ粒子組成物中の脂質対ＲＮＡの比に従って変動する。
一般に、より低いＮ：Ｐ比が、好ましい。１つ以上のＲＮＡ、脂質、及びその量は、約２：１～約３０：１、例えば、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１２：１、１４：１、１６：１、１８：１、２０：１、２２：１、２４：１、２６：１、２８：１、または ３０：１のＮ：Ｐ比を提供するように選択することができる。ある特定の実施形態では、Ｎ：Ｐ比は、約２：１～約８：１であることができる。他の実施形態では、Ｎ：Ｐ比は、約５：１～約８：１である。ある特定の実施形態では、Ｎ：Ｐ比は、５：１～６：１である。具体的な一態様では、Ｎ：Ｐ比は、約５．６７：１である。
ナノ粒子組成物を提供することに加えて、本開示は、ポリヌクレオチドを封入することを含む、脂質ナノ粒子を生成する方法も提供する。そのような方法は、本明細書に開示の医薬組成物のいずれかを使用すること、及び当該技術分野で既知の脂質ナノ粒子の生成方法による脂質ナノ粒子を生成すること、を含む。例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１５）”Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ”Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．８７：６８－８０；Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．（２０１５）”Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．Ｐａｒｔ Ｉ：Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ”Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１６：９４０－９５４；Ｎａｓｅｒｉ ｅｔ ａｌ．（２０１５）”Ｓｏｌｉｄ Ｌｉｐｉｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｎｄ Ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ Ｌｉｐｉｄ Ｃａｒｒｉｅｒｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ”Ａｄｖ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．５：３０５－１３；Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．（２０１５）”Ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ”Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：２９１－３０２、及びそれらの中に引用されている参考文献を参照のこと。
２３．他の送達剤
ａ．リポソーム、リポプレックス、及び脂質ナノ粒子
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、送達剤、例えば、リポソーム、リオプレックス、脂質ナノ粒子、またはそれらの任意の組み合わせを含む。本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、１つ以上のリポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子を使用して製剤化することができる。リポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子は、ポリヌクレオチドによる細胞の形質移入を増加させ、且つ／またはコードされたタンパク質の翻訳を増加させるので、タンパク質産生を目的とするポリヌクレオチドの有効性を向上させるために使用することができる。リポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子は、ポリヌクレオチドの安定性を増加させるために使用することもできる。
リポソームは、主に脂質二重層で構成することができ、且つ医薬製剤を投与するための送達ビヒクルとして使用することができる人工的に調製された小胞である。リポソームは、異なるサイズであることができる。多重膜小胞（ＭＬＶ）は、直径が数百ナノメートルであることができ、狭い水性区画により隔てられた一連の同心二重層を含有することができる。小さな単細胞小胞（ＳＵＶ）は、直径が５０ｎｍよりも小さい可能性があり、大型単層小胞（ＬＵＶ）は、直径が５０～５００ｎｍであることができる。リポソームのデザインは、リポソームの不健康な組織への付着を向上させるための、または限定されないが、エンドサイトーシスなどの事象を活性化するための、オプソニンまたはリガンドを含むことができるが、これに限定されない。リポソームは、医薬製剤の送達を向上させるために、低いまたは高いｐＨ値を含有することができる。
リポソームの形成は、封入された医薬製剤及びリポソーム成分、脂質小胞が分散されている媒体の性質、封入された物質の有効濃度及びその潜在的な毒性、小胞の適用及び／または送達中に関与する任意の追加のプロセス、最適なサイズ、目的の用途のための小胞の多分散性及び貯蔵寿命、ならびにバッチ間の再現性及び安全且つ効率的なリポソーム製品の生成のスケールアップ等に依存し得る。
非限定例としては、合成膜小胞などのリポソームは、米国公開第ＵＳ２０１３０１７７６３８号、同第ＵＳ２０１３０１７７６３７号、同第ＵＳ２０１３０１７７６３６号、同第ＵＳ２０１３０１７７６３５号、同第ＵＳ２０１３０１７７６３４号、同第ＵＳ２０１３０１７７６３３号、同第ＵＳ２０１３０１８３３７５号、同第ＵＳ２０１３０１８３３７３号、及び同第ＵＳ２０１３０１８３３７２号に記載の方法、装置、及びデバイスで調製することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、リポソームにより封入することができ、及び／または、それは、例えば、国際公開第ＷＯ２０１２０３１０４６号、同第ＷＯ２０１２０３１０４３号、同第ＷＯ２０１２０３０９０１号、同第ＷＯ２０１２００６３７８号、及び同第ＷＯ２０１３０８６５２６号；ならびに、米国公開第ＵＳ２０１３０１８９３５１号、同第ＵＳ２０１３０１９５９６９号、及び同第ＵＳ２０１３０２０２６８４号に記載されるようなリポソームにより封入することができる水性コアに含有され得る。参考文献のそれぞれは、本明細書に全体が参照により組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、カチオン性水中油型エマルションに製剤化することができ、エマルション粒子は、分子をエマルション粒子にアンカーするポリヌクレオチドと相互作用することができる油性コア及びカチオン性脂質を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、親水性相を分散させる連続疎水性相を含む油中水型エマルションに製剤化することができる。例示的なエマルションは、国際公開第ＷＯ２０１２００６３８０号及び同第ＷＯ２０１０８７７９１号に記載の方法により作製することができ、これらのそれぞれは、本明細書に全体が参照により組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、脂質－ポリカチオン複合体に製剤化することができる。脂質－ポリカチオン複合体の形成は、例えば、米国公開第ＵＳ２０１２０１７８７０２号に記載されるような方法により達成することができる。非限定例として、ポリカチオンは、カチオン性ペプチドまたはポリペプチド、例えば、限定されないが、ポリリシン、ポリオルニチン、及び／またはポリアルギニン、ならびに、国際公開第ＷＯ２０１２０１３３２６号または米国公開第ＵＳ２０１３０１４２８１８号に記載のカチオン性ペプチドを含むことができる。参考文献のそれぞれは、本明細書に全体が参照により組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、国際公開第ＷＯ２０１３１２３５２３号、同第ＷＯ２０１２１７０９３０号、同第ＷＯ２０１１１２７２５５号、及び同第ＷＯ２００８１０３２７６；ならびに米国特許第ＵＳ２０１３０１７１６４６号に記載されるような脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に製剤化することができ、これらのそれぞれは、本明細書に全体が参照により組み込まれる。
脂質ナノ粒子製剤は通常は、１つ以上の脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質は、当該技術分野で「イオン性カチオン性脂質」と呼ばれる場合があるイオン性脂質（例えば、イオン性アミノ脂質）である。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、リン脂質、構造脂質、及び粒子凝集を低減することができる分子、例えば、ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を含む他の構成成分をさらに含む。
例示的なイオン性脂質としては、本明細書に開示の化合物１～３４２のうちのいずれか１つ、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）、ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｄ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｍ－Ｃ２－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ３－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ４－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｃ２Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＭＰ－ＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、９８Ｎ１２－５、Ｃ１２－２００、ＤＬｉｎ－Ｃ－ＤＡＰ、ＤＬｉｎ－ＤＡＣ、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎＡＰ、ＤＬｉｎ－ＥＧ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ、ＫＬ１０、ＫＬ２２、ＫＬ２５、オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ、オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｒ）、オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｓ）、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。他の例示的なイオン性脂質としては、（１３Ｚ，１６Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－ノニルドコサ－１３，１６－ジエン－１－アミン（Ｌ６０８）、（２０Ｚ，２３Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナコサ－２０，２３－ジエン－１０－アミン、（１７Ｚ，２０Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘキサコサ－１７，２０－ジエン－９－アミン、（１６Ｚ，１９Ｚ）－Ｎ５Ｎ－ジメチルペンタコサ－１６，１９－ジエン－８－アミン、（１３Ｚ，１６Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルドコサ－１３，１６－ジエン－５－アミン、（１２Ｚ，１５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘニコサ－１２，１５－ジエン－４－アミン、（１４Ｚ，１７Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルトリコサ－１４，１７－ジエン－６－アミン、（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルテトラコサ－１５，１８－ジエン－７－アミン、（１８Ｚ，２１Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘプタコサ－１８，２１－ジエン－１０－アミン、（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルテトラコサ－１５，１８－ジエン－５－アミン、（１４Ｚ，１７Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルトリコサ－１４，１７－ジエン－４－アミン、（１９Ｚ，２２Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルオクタコサ－１９，２２－ジエン－９－アミン、（１８Ｚ，２１Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘプタコサ－１８，２１－ジエン－８－アミン、（１７Ｚ，２０Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘキサコサ－１７，２０－ジエン－７－アミン、（１６Ｚ，１９Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルペンタコサ－１６，１９－ジエン－６－アミン、（２２Ｚ，２５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘントリアコンタ－２２，２５－ジエン－１０－アミン、（２１Ｚ，２４Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルトリアコンタ－２１，２４－ジエン－９－アミン、（１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘプタコサ－１８－エン－１０－アミン、（１７Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘキサコサ－１７－エン－９－アミン、（１９Ｚ，２２Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルオクタコサ－１９，２２－ジエン－７－アミン、Ν，Ν－ジメチルヘプタコサン－１０－アミン、（２０Ｚ，２３Ｚ）－Ｎ－エチルｌ－Ｎ－メチルノナコサ－２０，２３－ジエン－１０－アミン、１－［（１１Ｚ，１４Ｚ）－ｌ－ノニルイコサ－１１，１４－ジエン－ｌ－ｙｌ］ピロリジン、（２０Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘプタコサ－２０－エン－１０－アミン、（１５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルへプタコサ－１５－エン－１０－アミン、（１４Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナコサ－１４－エン－１０－アミン、（１７Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナコサ－１７－エン－１０－アミン、（２４Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルトリトリアコンタ－２４－エン－１０－アミン、（２０Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナコサ－２０－エン－１０－アミン、（２２Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘントリアコンタ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｈｅｎｔｒｉａｃｏｎｔ）－２２－エン－１０－アミン、（１６Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルペンタコサ－１６－エン－８－アミン、（１２Ｚ，１５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２－ノニルヘニコサ－１２，１５－ジエン－１－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－ｌ－［（ｌＳ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ヘプタデカン－８－アミン、ｌ－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－ヘキシルシクロプロピル］－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナデカン－１０－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ノナデカン－１０－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－２１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ヘニコサン－１０－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－ｌ－［（ｌＳ，２Ｓ）－２－｛［（１Ｒ，２Ｒ）－２－ペンチルシクロプロピル］メチル｝シクロプロピル］ノナデカン－１０－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－ｌ－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ヘキサデカン－８－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－［（ｌＲ，２Ｓ）－２－ウンデシルシクロプロピル］テトラデカン－５－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－｛７－［（ｌＳ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ヘプチル｝ドデカン－１－アミン、１－［（１Ｒ，２Ｓ）－２－ヘプチルシクロプロピル］－Ｎ，Ｎ－ジメチルオクタデカン－９－アミン、１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－デシルシクロプロピル］－Ｎ，Ｎ－ジメチルペンタデカン－６－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－ｌ－［（ｌＳ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ペンタデカン－８－アミン、Ｒ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、Ｓ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、１－｛２－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－１－［（オクチルオキシ）メチル］エチル｝ピロリジン、（２Ｓ）－Ν，Ν－ジメチル－１－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－３－［（５Ｚ）－オクタ－５－エン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン、１－｛２－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－１－［（オクチルオキシ）メチル］エチル｝アゼチジン、（２Ｓ）－１－（ヘキシルオキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン、（２Ｓ）－１－（ヘプチルオキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン、Ν，Ν－ジメチル－１－（ノニルオキシ）－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン、Ν，Ν－ジメチル－１－［（９Ｚ）－オクタデカ－９－エン－ｌ－イルオキシ］－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン；（２Ｓ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－ｌ－［（６Ｚ，９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－６，９，１２－トリエン－ｌ－イルオキシ］－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、（２Ｓ）－１－［（１１Ｚ，１４Ｚ）－イコサ－１１，１４－ジエン－１－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－（ペンチルオキシ）プロパン－２－アミン、（２Ｓ）－１－（ヘキシルオキシ）－３－［（１１Ｚ，１４Ｚ）－イコサ－１１，１４－ジエン－ｌ－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－２－アミン、１－［（１１Ｚ，１４Ｚ）－イコサ－１１，１４－ジエン－ｌ－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、１－［（１３Ｚ，１６Ｚ）－ドコサ－１３，１６－ジエン－ｌ－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、（２Ｓ）－１－［（１３Ｚ，１６Ｚ）－ドコサ－１３，１６－ジエン－１－イルオキシ］－３－（ヘキシルオキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－２－アミン、（２Ｓ）－１－［（１３Ｚ）－ドコサ－１３－エン－１－イルオキシ］－３－（ヘキシルオキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－２－アミン、１－［（１３Ｚ）－ドコサ－１３－エン－１－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、１－［（９Ｚ）－ヘキサデカ－９－エン－１－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、（２Ｒ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｈ（１－メトイルオクチル（ｍｅｔｏｙｌｏｃｔｙｌ））オキシ］－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン、（２Ｒ）－１－［（３，７－ジメチルオクチル）オキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－ｌ－イルオキシ］プロパン－２－アミン、Ν，Ν－ジメチル－１－（オクチルオキシ）－３－（｛８－［（１Ｓ，２Ｓ）－２－｛［（１Ｒ，２Ｒ）－２－ペンチルシクロプロピル］メチル｝シクロプロピル］オクチル｝オキシ）プロパン－２－アミン、Ν，Ν－ジメチル－１－｛［８－（２－オクチルシクロプロピル）オクチル］オキシ｝－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、及び（１１Ｅ，２０Ｚ，２３Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナコサ－１１，２０，２－トリエン－１０－アミン、ならびにそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
リン脂質は、グリセロリン脂質、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジグリセロール及びホスファチジン酸、を含むが、これらに限定されない。リン脂質は、スフィンゴミエリンなどのホスホスフィンゴ脂質を含む。いくつかの実施形態では、リン脂質は、ＤＬＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＵＰＣ、１８：０ジエーテルＰＣ、ＤＬｎＰＣ、ＤＡＰＣ、ＤＨＡＰＣ、ＤＯＰＥ、４ＭＥ １６：０ ＰＥ、ＤＳＰＥ、ＤＬＰＥ，ＤＬｎＰＥ、ＤＡＰＥ、ＤＨＡＰＥ、ＤＯＰＧ、及びそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、リン脂質は、ＭＰＰＣ、ＭＳＰＣ、ＰＭＰＣ、ＰＳＰＣ、ＳＭＰＣ、ＳＰＰＣ、ＤＨＡＰＥ、ＤＯＰＧ、及びそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、脂質組成物中のリン脂質（例えば、ＤＳＰＣ）の量は、約１ｍｏｌ％～約２０ｍｏｌ％の範囲である。
構造脂質は、ステロール部分を含有するステロール及び脂質を含む。いくつかの実施形態では、構造脂質は、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、トマチン、ウルソル酸、アルファ－トコフェロール、及びそれらの混合物を含む。いくつかの実施形態では、構造脂質は、コレステロールである。いくつかの実施形態では、脂質組成物中の構造脂質（例えば、コレステロール）の量は、約２０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％の範囲である。
ＰＥＧ修飾脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジン酸、ＰＥＧ－セラミドコンジュゲート（例えば、ＰＥＧ－ＣｅｒＣ１４またはＰＥＧ－ＣｅｒＣ２０）、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン及びＰＥＧ修飾１，２－ジアシルオキシプロパン－３－アミンを含む。そのような脂質は、ＰＥＧ化脂質とも呼ばれる。例えば、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ、またはＰＥＧ－ＤＳＰＥ脂質とすることができる。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ－脂質は、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロールメトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）］（ＰＥＧ－ＤＳＰＥ）、ＰＥＧ－ジステリルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＳＧ）、ＰＥＧ－ジパルメトレイル（ｄｉｐａｌｍｅｔｏｌｅｙｌ）、ＰＥＧ－ジオレイル、ＰＥＧ－ジステアリル、ＰＥＧ－ジアシルグリカミド（ＰＥＧ－ＤＡＧ）、ＰＥＧ－ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＤＰＰＥ）、またはＰＥＧ－１，２－ジミリスチルオキシルプロピル（ｄｉｍｙｒｉｓｔｙｌｏｘｌｐｒｏｐｙｌ）－３－アミン（ＰＥＧ－ｃ－ＤＭＡ）である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分は、約１０００、２０００、５０００、１００００、１５０００、または２０，０００ダルトンのサイズを有する。いくつかの実施形態では、脂質組成物中のＰＥＧ－脂質の量は、約０．１ｍｏｌ％～約５ｍｏｌ％の範囲である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＬＮＰ製剤は、透過促進分子をさらに含むことができる。非限定的な透過促進分子は、本明細書に全体が参照により組み込まれる米国公開第ＵＳ２００５０２２２０６４号に記載されている。
ＬＮＰ製剤は、ホスファートコンジュゲートをさらに含有することができる。ホスファートコンジュゲートは、ｉｎ ｖｉｖｏ循環時間を増加させ、及び／またはナノ粒子の標的送達を増加させることができる。ホスファートコンジュゲートは、例えば、国際公開第ＷＯ２０１３０３３４３８号または米国公開第ＵＳ２０１３０１９６９４８号に記載の方法により作製することができる。ＬＮＰ製剤は、例えば、米国公開第ＵＳ２０１３００５９３６０号、同第ＵＳ２０１３０１９６９４８号、及び同第ＵＳ２０１３００７２７０９号に記載されるようなポリマーコンジュゲート（例えば、水溶性コンジュゲート）も含有することができる。参考文献のそれぞれは、本明細書に全体が参照により組み込まれる。
ＬＮＰ製剤は、対象における本発明のナノ粒子の送達を増強するコンジュゲートを含むことができる。さらに、コンジュゲートは、対象におけるナノ粒子の貪食クリアランスを阻害することができる。いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、ヒト膜タンパク質ＣＤ４７からデザインされる「自己」ペプチド（例えば、本明細書に全体が参照により組み込まれるＲｏｄｒｉｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１３ ３３９，９７１－９７５により記載される「自己」粒子）とすることができる。Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ．により示されるように、自己ペプチドは、ナノ粒子のマクロファージ媒介クリアランスを遅延させて、ナノ粒子の送達を増強した。
ＬＮＰ製剤は、炭水化物担体を含むことができる。非限定例として、炭水化物担体は、無水物修飾フィトグリコーゲンまたはグリコーゲン型物質、フィトグリコーゲンオクテニルスクシナート、フィトグリコーゲンベータ－デキストリン、無水物修飾フィトグリコーゲンベータ－デキストリンを含むことができるが、これらに限定されない（例えば、本明細書に全体が参照により組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１２１０９１２１号）。
ＬＮＰ製剤は、粒子の送達を向上させるために、界面活性剤またはポリマーでコーティングすることができる。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、親水性のコーティング、例えば、限定されないが、ＰＥＧコーティング及び／または本明細書に全体が参照により組み込まれる米国公開第ＵＳ２０１３０１８３２４４号に記載されるような中性表面電荷を有するコーティングでコーティングすることができる。
ＬＮＰ製剤は、米国特許第８，２４１，６７０号または国際公開第ＷＯ２０１３１１００２８号（これらのそれぞれは、本明細書に全体が参照により組み込まれる）に記載されるように、脂質ナノ粒子が粘膜バリアに浸透することができるように、粒子の表面特性を変更するように操作することができる。
粘液に浸透するように操作されたＬＮＰは、ポリマー材料（すなわち、ポリマーコア）及び／またはポリマー－ビタミンコンジュゲート及び／またはトリブロックコポリマーを含むことができる。ポリマー材料は、ポリアミン、ポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、ポリカルバマート、ポリ尿素、ポリカルボナート、ポリ（スチレン）、ポリイミド、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリアセチレン、ポリエチレン、ポリエチレンイミン、ポリイソシアナート、ポリアクリラート、ポリメタクリラート、ポリアクリロニトリル、及びポリアリレートを含むことができるが、これらに限定されない。
粘液に浸透するように操作されたＬＮＰは、限定されないが、ポリヌクレオチド、アニオン性タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）、界面活性剤（例えば、カチオン性界面活性剤、例えば、ジメチルジオクタデシル－臭化アンモニウム）、糖類または糖誘導体（例えば、シクロデキストリン）、核酸、ポリマー（例えば、ヘパリン、ポリエチレングリコール、及びポロキサマー）、粘液溶解剤（例えば、Ｎ－アセチルシステイン、ヨモギ、ブロメライン、パパイン、ゲンペイカズラ、アセチルシステイン、ブロムヘキシン、カルボシステイン、エプラジノン、メスナ、アンブロキソール、ソブレロール、ドミオドール、レトステイン、ステプロニン、チオプロニン、ゲルゾリン、チモシンβ４ドルナーゼアルファ、ネルテネキシン、エルドステイン）、ならびにｒｈＤＮａｓｅを含む種々のＤＮａｓｅｓなどの表面改質剤を含むことができる。
いくつかの実施形態では、粘液浸透性ＬＮＰは、粘膜浸透促進コーティングを含む低張性製剤とすることができる。この製剤は、それが送達される上皮に対して低張性であることができる。低張性製剤の非限定例は、例えば、本明細書に全体が参照により組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１３１１００２８号に見出すことができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、リポプレックス、例えば、限定されないが、Ｓｉｌｅｎｃｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（英国ロンドン）製のＡＴＵＰＬＥＸ（商標）システム、ＤＡＣＣシステム、ＤＢＴＣシステム、及び他のｓｉＲＮＡ－リポプレックス技術、ＳＴＥＭＧＥＮＴ（登録商標）（マサチューセッツ州ケンブリッジ）製ＳＴＥＭＦＥＣＴ（商標）、ならびにポリエチレンイミン（ＰＥＩ）または核酸のプロタミンベースの標的化及び非標的化送達として製剤化される（Ａｌｅｋｕ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００８ ６８：９７８８－９７９８、Ｓｔｒｕｍｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ ２０１２ ５０：７６－７８、Ｓａｎｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００６ １３：１２２２－１２３４、Ｓａｎｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００６ １３：１３６０－１３７０；Ｇｕｔｂｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｕｌｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１０ ２３：３３４－３４４、Ｋａｕｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ Ｒｅｓ ２０１０ ８０：２８６－２９３Ｗｅｉｄｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００９ ３２：４９８－５０７、Ｗｅｉｄｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００８ ３１：１８０－１８８；Ｐａｓｃｏｌｏ Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．４：１２８５－１２９４、Ｆｏｔｉｎ－Ｍｌｅｃｚｅｋ ｅｔ ａｌ．，２０１１ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３４：１－１５、Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５，２３：７０９－７１７；Ｐｅｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００７ ６；１０４：４０９５－４１００、ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００８ １９：１２５－１３２。これらの全ては、全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、１０～１０００ｎｍの平均直径を有する球状であり得る固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）として製剤化される。ＳＬＮは、親油性分子を可溶化することができ、界面活性剤及び／または乳化剤で安定化することができる固体脂質コアマトリックスを有する。例示的なＳＬＮは、本明細書に全体が参照により組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１３１０５１０１号に記載されるようなものとすることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、徐放及び／または標的送達のために製剤化することができる。本明細書で使用される場合、「徐放」は、治療的結果を達成する、放出の特定のパターンに適合する医薬組成物または化合物放出プロファイルを指す。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、徐放及び／または標的送達のための、本明細書に記載の、及び／または当該技術分野で既知の送達剤に封入することができる。本明細書で使用される場合、「封入」という用語は、閉じ込めること、取り囲むこと、または内包することを意味する。それが本発明の化合物の製剤化に関連する場合、封入は、実質的、完全、または部分的であることができる。「実質的に封入された」という用語は、本発明の医薬組成物または化合物の少なくとも５０超、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．９、９９．９超、または９９．９９９％超を、送達剤に閉じ込めるか、取り囲むか、または内包することができることを意味する。「部分的封入」は、本発明の医薬組成物または化合物の１０未満、１０、２０、３０、４０、５０、またはそれ未満を、送達剤に閉じ込めるか、取り囲むか、または内包することができることを意味する。
有利なことに、封入は、蛍光及び／または電子顕微鏡写真を使用して、本発明の医薬組成物または化合物の脱出または活性を測定することにより決定することができる。例えば、本発明の医薬組成物または化合物の少なくとも１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．９、９９．９９、または９９．９９％超が、送達剤内封入される。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド徐放性製剤は、少なくとも１つの徐放性コーティング（例えば、ＯＰＡＤＲＹ（登録商標）、ＥＵＤＲＡＧＩＴ ＲＬ（登録商標）、ＥＵＤＲＡＧＩＴ ＲＳ（登録商標）、ならびにエチルセルロース水性分散液（ＡＱＵＡＣＯＡＴ（登録商標）及びＳＵＲＥＬＥＡＳＥ（登録商標））などのセルロース誘導体）を含むことができる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド徐放性製剤は、米国好評第ＵＳ２０１３０１３０３４８号に記載されるようなポリマー系、または米国特許第８，４０４，２２２号に記載されるようなＰＥＧ及び／もしくはＰＥＧ関連ポリマー誘導体を含むことができ、これらのそれぞれは、全体が参照により組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは治療的ナノ粒子内に封入することができ、本明細書では「治療的ナノ粒子ポリヌクレオチド」と呼ばれる。治療的ナノ粒子は、例えば、国際公開第ＷＯ２０１０００５７４０号、同第ＷＯ２０１００３０７６３号、同第ＷＯ２０１０００５７２１号、同第ＷＯ２０１０００５７２３号、及び同第ＷＯ２０１２０５４９２３号；ならびに米国公開第ＵＳ２０１１０２６２４９１号、同第ＵＳ２０１００１０４６４５号、同第ＵＳ２０１０００８７３３７号、同第ＵＳ２０１０００６８２８５号、同第ＵＳ２０１１０２７４７５９号、同第ＵＳ２０１０００６８２８６号、同第ＵＳ２０１２０２８８５４１号、同第ＵＳ２０１２０１４０７９０号、同第ＵＳ２０１３０１２３３５１号、及び同第ＵＳ２０１３０２３０５６７号；ならびに米国特許第８，２０６，７４７号、同第８，２９３，２７６号、同第８，３１８，２０８号、及び同第８，３１８，２１１号（これらのそれぞれは、本明細書に全体が参照により組み込まれる）に記載の方法により製剤化することができる。
いくつかの実施形態では、治療的ナノ粒子ポリヌクレオチドは、持続性放出のために製剤化することができる。本明細書で使用される場合、「持続性放出」は、特定の期間にわたる放出速度に適合する医薬組成物または化合物を指す。期間は、時間、日、週、月、年を含むことができるが、これらに限定されない。非限定例として、本明細書に記載のポリヌクレオチドの持続放出ナノ粒子は、国際公開第ＷＯ２０１００７５０７２号及び米国公開第ＵＳ２０１００２１６８０４号、同第ＵＳ２０１１０２１７３７７号、同第ＵＳ２０１２０２０１８５９号、及び同第ＵＳ２０１３０１５０２９５（これらのそれぞれは、全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるように製剤化することができる。
いくつかの実施形態では、治療的ナノ粒子ポリヌクレオチドは、国際公開第ＷＯ２００８１２１９４９号、同第ＷＯ２０１０００５７２６号、同第ＷＯ２０１０００５７２５号、同第ＷＯ２０１１０８４５２１号、及び同第ＷＯ２０１１０８４５１８号；ならびに米国公開第ＵＳ２０１０００６９４２６号、同第ＵＳ２０１２０００４２９３号、及び同第ＵＳ２０１００１０４６５５号（これらのそれぞれは、本明細書に全体が参照により組み込まれる）に記載されるように、標的特異的であるように製剤化することができる。
ＬＮＰは、マイクロ流体ミキサーまたはマイクロミキサーを使用して調製することができる。例示的マイクロ流体ミキサーとしては、限定されないが、Ｍｉｃｒｏｉｎｎｏｖａ（オーストリア・アラーハイリゲン・バイ・ヴィルドン）により製造されるもの及び／またはジグザグヘリンボーンマイクロミキサー（ＳＨＭ）を含むスリットインターデジタルマイクロミキサーを挙げることができるが、これらに限定されない（Ｚｈｉｇａｌｔｓｅｖｅｔ ａｌ．，”Ｂｏｔｔｏｍ－ｕｐ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｌｉｍｉｔ ｓｉｚｅ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｙｓｔｅｍｓ ｗｉｔｈ ａｑｕｅｏｕｓ ａｎｄ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｃｏｒｅｓ ｕｓｉｎｇ ｍｉｌｌｉｓｅｃｏｎｄ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｍｉｘｉｎｇ，”Ｌａｎｇｍｕｉｒ ２８：３６３３－４０（２０１２）、Ｂｅｌｌｉｖｅａｕ ｅｔ ａｌ．，”Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｈｉｇｈｌｙ ｐｏｔｅｎｔ ｌｉｍｉｔ－ｓｉｚｅ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｖｏ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｓｉＲＮＡ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．１：ｅ３７（２０１２）、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，”Ｒａｐｉｄ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｐｏｔｅｎｔ ｓｉＲＮＡ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｅｎａｂｌｅｄ ｂｙ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，”Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３４（１６）：６９４８－５１（２０１２）（これらのそれぞれは、本明細書に全体が参照により組み込まれる）を参照のこと）。例示的なマイクロミキサーとしては、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ｆｕｒ Ｍｉｋｒｏｔｅｃｈｎｉｋ Ｍａｉｎｚ ＧｍｂＨ（独国マインツ）製のスリットインターデジタル微細構造ミキサー（ＳＩＭＭ－Ｖ２）または標準スリットインターデジタルマイクロミキサー（ＳＳＩＭＭ）またはキャタピラー（ＣＰＭＭ）または衝突噴流（ＩＪＭＭ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＳＨＭを使用してＬＮＰを作製する方法は、少なくとも２つの入力ストリームを混合することをさらに含み、混合は、微細構造誘導カオス移流（ＭＩＣＡ）で生じる。この方法によれば、流体ストリームは、ヘリンボーンパターンに存在するチャネルを通って流れて、回転流を引き起こし、流体を互いに混ぜる。この方法は、流体混合のための面を含むこともでき、面は、流体循環中で方向を変える。ＳＨＭを使用してＬＮＰを生成する方法は、米国公開第ＵＳ２００４０２６２２２３号及び同第ＵＳ２０１２０２７６２０９号（これらのそれぞれは、全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるものを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、マイクロ流体技術を使用して、脂質ナノ粒子に製剤化することができる（Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，Ｇｅｏｒｇｅ Ｍ．，”Ｔｈｅ Ｏｒｉｇｉｎｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｆｕｔｕｒｅ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，”Ｎａｔｕｒｅ ４４２：３６８－３７３（２００６）、及びＡｂｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，”Ｃｈａｏｔｉｃ Ｍｉｘｅｒ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｃｈａｎｎｅｌｓ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９５：６４７－６５１（２００２）（これらのそれぞれは、本明細書に全体が参照により組み込まれる）を参照のこと）。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、限定されないが、Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ（マサチューセッツ州ホリストン）またはＤｏｌｏｍｉｔｅ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ（英国ロイストン）製のものなどのマイクロミキサーチップを使用して、脂質ナノ粒子に製剤化することができる。マイクロミキサーチップは、分割及び再結合機構を用いる２つ以上の流体ストリームの迅速な混合のために使用することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、約１ｎｍ～約１００ｎｍ、例えば、限定されないが、約１ｎｍ～約２０ｎｍ、約１ｎｍ～約３０ｎｍ、約１ｎｍ～約４０ｎｍ、約１ｎｍ～約５０ｎｍ、約１ｎｍ～約６０ｎｍ、約１ｎｍ～約７０ｎｍ、約１ｎｍ～約８０ｎｍ、約１ｎｍ～約９０ｎｍ、約５ｎｍ～約１００ｎｍ、約５ｎｍ～約１０ｎｍ、約５ｎｍ～約２０ｎｍ、約５ｎｍ～約３０ｎｍ、約５ｎｍ～約４０ｎｍ、約５ｎｍ～約５０ｎｍ、約５ｎｍ～約６０ｎｍ、約５ｎｍ～約７０ｎｍ、約５ｎｍ～約８０ｎｍ、約５ｎｍ～約９０ｎｍ、約１０～約２０ｎｍ、約１０～約３０ｎｍ、約１０～約４０ｎｍ、約１０～約５０ｎｍ、約１０～約６０ｎｍ、約１０～約７０ｎｍ、約１０～約８０ｎｍ、約１０～約９０ｎｍ、約２０～約３０ｎｍ、約２０～約４０ｎｍ、約２０～約５０ｎｍ、約２０～約６０ｎｍ、約２０～約７０ｎｍ、約２０～約８０ｎｍ、約２０～約９０ｎｍ、約２０～約１００ｎｍ、約３０～約４０ｎｍ、約３０～約５０ｎｍ、約３０～約６０ｎｍ、約３０～約７０ｎｍ、約３０～約８０ｎｍ、約３０～約９０ｎｍ、約３０～約１００ｎｍ、約４０～約５０ｎｍ、約４０～約６０ｎｍ、約４０～約７０ｎｍ、約４０～約８０ｎｍ、約４０～約９０ｎｍ、約４０～約１００ｎｍ、約５０～約６０ｎｍ、約５０～約７０ｎｍ、約５０～約８０ｎｍ、約５０～約９０ｎｍ、約５０～約１００ｎｍ、約６０～約７０ｎｍ、約６０～約８０ｎｍ、約６０～約９０ｎｍ、約６０～約１００ｎｍ、約７０～約８０ｎｍ、約７０～約９０ｎｍ、約７０～約１００ｎｍ、約８０～約９０ｎｍ、約８０～約１００ｎｍ、及び／または約９０～約１００ｎｍの直径を有する脂質ナノ粒子に製剤化することができる。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約１０～５００ｎｍの直径を有することができる。一実施形態では、脂質ナノ粒子は、１００ｎｍより大きい、１５０ｎｍより大きい、２００ｎｍより大きい、２５０ｎｍより大きい、３００ｎｍより大きい、３５０ｎｍより大きい、４００ｎｍより大きい、４５０ｎｍより大きい、５００ｎｍより大きい、５５０ｎｍより大きい、６００ｎｍより大きい、６５０ｎｍより大きい、７００ｎｍより大きい、７５０ｎｍより大きい、８００ｎｍより大きい、８５０ｎｍより大きい、９００ｎｍより大きい、９５０ｎｍより大きい、または１０００ｎｍより大きい直径を有することができる。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、より小さなＬＮＰを使用して送達することができる。そのような粒子は、０．１μｍ未満から１００ｎｍまで、例えば、限定されないが、０．１μｍ未満、１．０μｍ未満、５μｍ未満、１０μｍ未満、１５ｕｍ未満、２０ｕｍ未満、２５ｕｍ未満、３０ｕｍ未満、３５ｕｍ未満、４０ｕｍ未満、５０ｕｍ未満、５５ｕｍ未満、６０ｕｍ未満、６５ｕｍ未満、７０ｕｍ未満、７５ｕｍ未満、８０ｕｍ未満、８５ｕｍ未満、９０ｕｍ未満、９５ｕｍ未満、１００ｕｍ未満、１２５ｕｍ未満、１５０ｕｍ未満、１７５ｕｍ未満、２００ｕｍ未満、２２５ｕｍ未満、２５０ｕｍ未満、２７５ｕｍ未満、３００ｕｍ未満、３２５ｕｍ未満、３５０ｕｍ未満、３７５ｕｍ未満、４００ｕｍ未満、４２５ｕｍ未満、４５０ｕｍ未満、４７５ｕｍ未満、５００ｕｍ未満、５２５ｕｍ未満、５５０ｕｍ未満、５７５ｕｍ未満、６００ｕｍ未満、６２５ｕｍ未満、６５０ｕｍ未満、６７５ｕｍ未満、７００ｕｍ未満、７２５ｕｍ未満、７５０ｕｍ未満、７７５ｕｍ未満、８００ｕｍ未満、８２５ｕｍ未満、８５０ｕｍ未満、８７５ｕｍ未満、９００ｕｍ未満、９２５ｕｍ未満、９５０ｕｍ未満、または９７５ｕｍ未満の直径を含むことができる。
本明細書に記載のナノ粒子及びマイクロ粒子は、マクロファージ及び／または免疫応答を調節するために幾何学的に操作することができる。幾何学的に操作された粒子は、限定されないが、経肺送達などの標的送達のために本明細書に記載のポリヌクレオチドを組み込む様々な形状、サイズ、及び／または表面電荷を有することができる（例えば、本明細書に全体が参照により組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１３０８２１１１号を参照のこと）。粒子を幾何学的に操作する他の物理的特徴としては、細胞及び組織との相互作用を変更することができる開口、曲げられたアーム、非対称性、及び表面粗さ、電荷を含むが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のナノ粒子は、限定されないが、本明細書に全体が参照により組み込まれる米国公開第ＵＳ２０１３０１７２４０６号に記載のものなどのステルスナノ粒子または標的特異的ステルスナノ粒子である。ステルスまたは標的特異的ステルスナノ粒子は、限定されないが、ポリエチレン、ポリカルボナート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフマラート、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリラート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン（ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｚｅｎｅｓ）、ポリアクリラート、ポリメタクリラート、ポリシアノアクリラート、ポリ尿素、ポリスチレン、ポリアミン、ポリエステル、ポリ無水物、ポリエーテル、ポリウレタン、ポリメタクリラート、ポリアクリラート、ポリシアノアクリラート、またはそれらの組み合わせ、などの２つ以上のポリマーを含むことができるポリマーマトリックスを含むことができる。
ｂ．リピドイド
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、送達剤、例えば、リピドイド、を含む。本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、リピドイドと共に製剤化することができる。これらのリピドイドを含有する複合体、ミセル、リポソーム、または粒子を調製し、それ故、局所及び／または全身投与経路を介するリピドイド製剤の注射後に、コードされたタンパク質の産生により判定されるようなポリヌクレオチドの有効な送達を達成することができる。ポリヌクレオチドのリピドイド複合体は、限定されないが、静脈内、筋肉内、または皮下経路を含む種々の手段により投与することができる。
リピドイドの合成は、文献に記載されている（Ｍａｈｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．２０１０ ２１：１４４８－１４５４；Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ．２０１０ ２６７：９－２１、Ａｋｉｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８ ２６：５６１－５６９；Ｌｏｖｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１０ １０７：１８６４－１８６９、Ｓｉｅｇｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１１ １０８：１２９９６－３００１（これらの全ては、全体として本明細書に組み込まれている）を参照のこと）。
ペンタ［３－（１－ラウリルアミノプロピオニル）］－トリエチレンテトラミンヒドロクロリド（ＴＥＴＡ－５ＬＡＰ；９８Ｎ１２－５としても知られている、Ｍｕｒｕｇａｉａｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４０１：６１（２０１０）を参照のこと）、Ｃ１２－２００（誘導体及びバリアントを含む）、ならびにＭＤ１を含むがこれらに限定されない異なるリピドイドを有する製剤を、ｉｎ ｖｉｖｏ活性について試験することができる。リピドイド「９８Ｎ１２－５」は、Ａｋｉｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００９ １７：８７２－８７９により開示されている。リピドイド「Ｃ１２－２００」は、Ｌｏｖｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１０ １０７：１８６４－１８６９及びＬｉｕ ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ．２０１０ ６６９－６７０により開示される。参考文献のそれぞれは、本明細書に全体が参照により組み込まれる。
一実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、アミノアルコールリピドイドに製剤化することができる。アミノアルコールリピドイドは、米国特許第８，４５０，２９８号（本明細書に全体が参照により組み込まれる）に記載の方法により調製することができる。
リピドイド製剤は、ポリヌクレオチドに加えて、３または４以上の構成成分を含む粒子を含むことができる。リピドイド及びリピドイドを含むポリヌクレオチド製剤は、国際公開第ＷＯ２０１５０５１２１４号（本明細書に全体が参照により組み込まれる）に記載されている。
ｃ．ヒアルロニダーゼ
いくつかの実施形態では、注射用の本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）及びヒアルロニダーゼ（例えば、筋肉内または皮下注射）。ヒアルロニダーゼは、間質障壁の構成成分であるヒアルロナンの加水分解を触媒する。ヒアルロニダーゼは、ヒアルロナンの粘度を低下させ、それにより、組織透過性を増加させる（Ｆｒｏｓｔ，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．（２００７）４：４２７－４４０）。あるいは、ヒアルロニダーゼは、筋肉内または皮下投与されたポリヌクレオチドに曝露された細胞の数を増加させるために使用することができる。
ｄ．ナノ粒子模倣物
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、ナノ粒子模倣物内に封入され、且つ／またはナノ粒子模倣物に吸収される。ナノ粒子模倣物は、送達機能生体または粒子、例えば、限定されないが、病原体、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、プリオン、及び細胞を模倣することができる。非限定例として、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、ウイルスの送達機能を模倣することができる非ビリオン粒子に封入することができる（例えば、国際公開第ＷＯ２０１２００６３７６号ならびに米国公開第ＵＳ２０１３０１７１２４１号及び同第ＵＳ２０１３０１９５９６８号（これらのそれぞれは、本明細書に全体が参照により組み込まれる）を参照のこと）。
ｅ．ナノチューブ
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、限定されないが、ロゼットナノチューブ、リンカーで対をなす塩基を有するロゼットナノチューブ、カーボンナノチューブ、及び／または単層カーボンナノチューブなどの少なくとも１つのナノチューブに結合しているか、または別の方法で（例えば、立体的、イオン的、共有的、及び／もしくは他の力を介して）結びついている本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。ポリヌクレオチドを含むナノチューブ及びナノチューブ製剤は、例えば、本明細書に全体が参照により組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１４１５２２１１号に記載されている。
ｆ．自己組織化ナノ粒子、または自己組織化巨大分子
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、自己組織化ナノ粒子または送達のための両親媒性巨大分子（ＡＭ）内に、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。ＡＭは、ポリ（エチレングリコール）に共有結合したアルキル化糖主鎖を有する生体適合性の両親媒性ポリマーを含む。水溶液中で、ＡＭは、自己組織化してミセルを形成する。核酸自己組織化ナノ粒子は、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２７０７７号に記載されており、ＡＭ及びＡＭを形成する方法は、米国公開第ＵＳ２０１３０２１７７５３号に記載されており、これらのそれぞれは、本明細書に全体が参照により組み込まれる。
ｇ．無機ナノ粒子、半導電性及び金属性ナノ粒子
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、無機ナノ粒子、または半導体材料もしくは金属材料を含む水分散性ナノ粒子内の、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。無機ナノ粒子は、水膨潤性である粘土物質を含むことができるが、これに限定されない。水分散性ナノ粒子は、疎水性または親水性ナノ粒子とすることができる。非限定例として、無機ナノ粒子、半導電性ナノ粒子、及び金属ナノ粒子は、例えば、米国特許第５，５８５，１０８号及び同第８，２５７，７４５号；ならびに米国特許第ＵＳ２０１２０２２８５６５号、同第ＵＳ２０１２０２６５００１号、及び同第ＵＳ２０１２０２８３５０３号に記載されており、これらのそれぞれは、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ｈ．外科用シーラント：ゲル及びヒドロゲル
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、外科用シーラント中に、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。ゲル及びヒドロゲルなどの外科用シーラントは、本明細書に全体が参照により組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２７０７７号に記載されている。
ｉ．懸濁液製剤
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、懸濁液中の、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。いくつかの実施形態では、懸濁液は、ポリヌクレオチド、水不混和性油デポー、界面活性剤、ならびに／または共界面活性剤及び／もしくは共溶媒を含む。懸濁液は、最初に、ポリヌクレオチドの水溶液、及び１つ以上の界面活性剤を含む油性相を調製し、次に、その２つの相（水性及び油性）を混合することにより形成することができる。
懸濁液製剤のための例示的な油としては、（飽和ヤシ油及びパーム核油由来のカプリル及びカプリン酸脂肪酸ならびにグリセリンもしくはプロピレングリコールのエステルを含む）ゴマ油及びＭｉｇｌｙｏｌ、トウモロコシ油、大豆油、落花生油、蜜蝋、ならびに／またはヤシの種子油が挙げることができるが、これらに限定されない。例示的な界面活性剤は、クレモフォール、ポリソルバート２０、ポリソルバート８０、ポリエチレングリコール、トランスクトール（ｔｒａｎｓｃｕｔｏｌ）、Ｃａｐｍｕｌ（登録商標）、ラブラソル（ｌａｂｒａｓｏｌ）、イソプロピルミリスタート、及び／またはＳｐａｎ８０を挙げることができるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、懸濁液は、限定されないが、エタノール、グリセロール、及び／またはプロピレングリコールを含む共溶媒を含むことができる。
いくつかの実施形態では、懸濁液は、水不混和性デポーからの拡散、続いて、周囲環境（例えば、水性環境）への再可溶化により、ポリヌクレオチドの周囲環境への放出の調節を提供することができる。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、注射時、（例えば、水性相に送達される時）エマルションが自然に形成されるように製剤化することができ、これは、ポリヌクレオチドの油相から水相への放出のために高い表面積対体積比を提供することができる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、脂質または界面活性剤層で囲まれ、または被覆された液体疎水性コアを含むことができるナノエマルションに製剤化される。例示的なナノエマルション及びそれらの調製物は、例えば、本明細書に全体が参照により組み込まれる米国特許第８，４９６，９４５号に記載されている。
ｊ．カチオン及びアニオン
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）ならびにカチオンまたはアニオン、例えば、Ｚｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｕ２＋、Ｍｇ２＋、及びそれらの組み合わせを含む。例示的な製剤は、例えば、米国特許第６，２６５，３８９号及び同第６，５５５，５２５号（これらのそれぞれは、本明細書に全体が参照により組み込まれる）に記載されるような金属カチオンと複合化されたポリマー及びポリヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、カチオン性ナノ粒子は、二価カチオン及び一価カチオンの組み合わせを含有することができる。カチオン性ナノ粒子中のポリヌクレオチドまたはカチオン性ナノ粒子を含む１つ以上のデポー中のポリヌクレオチドの送達は、長時間作用型デポーを活性化すること及び／またはヌクレアーゼによる分解速度を低減させることにより、ポリヌクレオチド生物学的利用能を向上させることができる。
ｋ．成形されたナノ粒子及びマイクロ粒子
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、種々のサイズ、形状、及び化学的性質の成形ナノ粒子中に、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。例えば、ナノ粒子及び／またはマイクロ粒子は、ＬＩＱＵＩＤＡ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ（登録商標）（ノースカロライナ州モリスビル）によるＰＲＩＮＴ（登録商標）技術を使用して作製することができる（例えば、本明細書に全体が参照により組み込まれる国際公開第ＷＯ２００７０２４３２３号）。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、マイクロ粒子に製剤化される。マイクロ粒子は、限定されないが、ポリ（α－ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、及びポリ無水物を含む、ポリヌクレオチドのコアならびに生体適合性及び／または生分解性ポリマーの外皮を含有することができる。マイクロ粒子は、ポリヌクレオチドを吸着する吸着剤表面を有することができる。マイクロ粒子は、少なくとも１ミクロン～少なくとも１００ミクロン（例えば、少なくとも１ミクロン、少なくとも１０ミクロン、少なくとも２０ミクロン、少なくとも３０ミクロン、少なくとも５０ミクロン、少なくとも７５ミクロン、少なくとも９５ミクロン、及び少なくとも１００ミクロン）の直径を有することができる。いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、マイクロ粒子及びポリヌクレオチドを含むマイクロエマルションである。例示的なマイクロ粒子、マイクロエマルション、及びそれらの調製物は、例えば、米国特許第８，４６０，７０９号、同第８，３０９，１３９号、及び同第８，２０６，７４９号；米国公開第ＵＳ２０１３０１２９８３０号、同第ＵＳ２０１３１９５９２３号、及び同第ＵＳ２０１３０１９５８９８；ならびに国際公開第ＷＯ２０１３０７５０６８号に記載され、これらのそれぞれは、本明細書に全体が参照により組み込まれる。
ｌ．ナノジャケット及びナノリポソーム
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、Ｋｅｙｓｔｏｎｅ Ｎａｎｏ（ペンシルベニア州ステートカレッジ）によるナノジャケット及びナノリポソーム中に、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。ナノジャケットは、カルシウム、リン酸塩を含む、体内で自然にみられる材料で作製され、少量のケイ酸塩を含むこともできる。ナノジャケットは、５～５０ｎｍの範囲のサイズを有することができる。
ナノリポソームは、限定されないが、体内に天然に存在する脂質などの脂質で作製される。ナノリポソームは、６０～８０ｎｍの範囲のサイズを有することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示のポリヌクレオチドは、限定されないが、セラミドナノリポソームなどのナノリポソームに製剤化される。
ｍ．細胞またはミニ細胞
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、細胞にｅｘ ｖｉｖｏで形質移入され、続いて、対象に移植される、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。本明細書に開示のポリヌクレオチドの細胞ベースの製剤を、（例えば、細胞担体中の）細胞形質移入を確認するため、（例えば、細胞担体を、具体的な組織もしくは細胞型に標的化することにより）ポリヌクレオチドの生体内分布を変えるため、及び／またはコードされたタンパク質の翻訳を増加させるために、使用することができる。
例示的な細胞としては、赤血球、ビロソーム、及びエレクトロポレーションされた細胞が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Ｇｏｄｆｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１２ １２：１２７－１３３、Ｆａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１２ １２：３８５－３８９；Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１１ １０８：１０９８０－１０９８５、Ｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．２０１０ ２７：４００－４２０、Ｈｕｃｋｒｉｅｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｒｅｓ．２００７；１７：３９－４７、Ｃｕｓｉ，Ｈｕｍ Ｖａｃｃｉｎ．２００６ ２：１－７、ｄｅ Ｊｏｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００６ １３：４００－４１１（これらの全ては、本明細書に全体が参照により組み込まれる）を参照のこと）。
様々な方法が、当該技術分野で既知であり、ウイルス及び非ウイルス媒介技術を含む、核酸の細胞への導入に適する。代表的な非ウイルス媒介技術の例としては、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム媒介導入、ヌクレオフェクション、ソノポレーション、熱ショック、磁気フェクション、リポソーム媒介導入、マイクロインジェクション、マイクロプロジェクタイル媒介導入（ナノ粒子）、カチオン性ポリマー媒介導入（ＤＥＡＥ－デキストラン、ポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など）、または細胞融合が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、国際公開第ＷＯ２０１１０８５２３１号及び同第ＷＯ２０１３１１６６５６号；ならびに米国公開第２０１１０１７１２４８号（これらのそれぞれは、本明細書に全体が参照により組み込まれる）に記載されるような方法で合成された合成ウイルス様粒子（ＶＬＰ）内で送達することができる。
ソノポレーション、または細胞音波処理の技術は、細胞原形質膜の透過性を改変するための音（例えば、超音波周波数）の使用である。ソノポレーション法は、ｉｎ ｖｉｖｏで核酸を送達することが知られている（Ｙｏｏｎ ａｎｄ Ｐａｒｋ，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．２０１０ ７：３２１－３３０、Ｐｏｓｔｅｍａ ａｎｄ Ｇｉｌｊａ，Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００７ ８：３５５－３６１、Ｎｅｗｍａｎ ａｎｄ Ｂｅｔｔｉｎｇｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００７ １４：４６５－４７５、米国公開第ＵＳ２０１００１９６９８３号及び同第ＵＳ２０１００００９４２４号。全ては、全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、エレクトロポレーションにより送達することができる。エレクトロポレーション技術は、ｉｎ ｖｉｖｏ及び臨床的に核酸を送達することが知られている（Ａｎｄｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１０ １０：２６７－２８０、Ｃｈｉａｒｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１０ １０：２８１－２８６、Ｈｏｊｍａｎ，Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１０ １０：１２８－１３８。全ては、全体が参照により本明細書に組み込まれる）。エレクトロポレーションデバイスは、限定されないが、ＢＴＸ（登録商標）Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（マサチューセッツ州ホリストン）（例えば、ＡｇｉｌｅＰｕｌｓｅ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｓｙｓｔｅｍ）及びＩｎｏｖｉｏ（ペンシルベニア州ブルーベル）（例えば、Ｉｎｏｖｉｏ ＳＰ－５Ｐ筋肉内送達デバイスまたはＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）３０００皮内送達デバイス）を含む、世界中の多くの企業により販売されている。
いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞、細菌細胞、植物、微生物、藻類、及び真菌細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、細胞は、限定されないが、ヒト、マウス、ラット、ヤギ、ウマ、ウサギ、ハムスター、またはウシ細胞などの哺乳動物細胞である。さらなる実施形態では、細胞は、限定されないが、ＨｅＬａ、ＮＳ０、ＳＰ２／０、ＫＥＫ ２９３Ｔ、Ｖｅｒｏ、Ｃａｃｏ、Ｃａｃｏ－２、ＭＤＣＫ、ＣＯＳ－１、ＣＯＳ－７、Ｋ５６２、Ｊｕｒｋａｔ、ＣＨＯ－Ｋ１、ＤＧ４４、ＣＨＯＫ１ＳＶ、ＣＨＯ－Ｓ、Ｈｕｖｅｃ、ＣＶ－１、Ｈｕｈ－７、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨＥＫ２９３、２９３、Ａ５４９、ＨｅｐＧ２、ＩＭＲ－９０、ＭＣＦ－７、Ｕ－２０Ｓ、Ｐｅｒ．Ｃ６、ＳＦ９、ＳＦ２１、またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含む確立された細胞株由来であり得る。
ある特定の実施形態では、細胞は、限定されないが、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ細胞、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ細胞、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ細胞、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ細胞、Ｃａｎｄｉｄａ細胞、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ細胞、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ細胞、及びＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ細胞などの真菌細胞である。
ある特定の実施形態では、細胞は、限定されないが、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、またはＢＬ２１細胞などの細菌細胞である。本発明の方法により形質移入されるべき初代及び二次細胞は、様々な組織から得ることができ、培養中に維持することができる全ての細胞型を含むが、これらに限定されない。初代及び二次細胞は、線維芽細胞、ケラチノサイト、上皮細胞（例えば、乳腺上皮細胞、腸上皮細胞）、内皮細胞、グリア細胞、神経細胞、血液の形成要素（例えば、リンパ球、骨髄細胞）、筋肉細胞、及びこれらの体細胞型の前駆体を含むが、これらに限定されない。初代細胞は、同じ種のドナーまたは別の種（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、トリ、ヒツジ、ヤギ、ウマ）から得ることもできる。
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、細菌性ミニ細胞内に本明細書に記載のポリヌクレオチドを含む。非限定例として、細菌性ミニ細胞は、国際公開第ＷＯ２０１３０８８２５０号または米国公開第ＵＳ２０１３０１７７４９９号に記載されるものとすることができ、これらのそれぞれは、本明細書に全体が参照により組み込まれる。
ｎ．半固体組成物
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、半固体またはペースト様組成物を形成する疎水性マトリックス中に、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。非限定例として、半固体またはペースト様組成物は、本明細書に全体が参照により組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１３０７６０４号に記載の方法により作製することができる。
ｏ．エキソソーム
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、少なくとも１つのポリヌクレオチドが搭載され、細胞、組織及び／または生体に送達することができるエキソソーム中に本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。非限定例として、ポリヌクレオチドは、本明細書に全体が参照により組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１３０８４０００号に記載されるようなエキソソームに搭載することができる。
ｐ．シルクベースの送達
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、シルクベースの送達のために製剤化される本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。シルクベースの送達系は、シルクフィブロイン溶液を本明細書に記載のポリヌクレオチドと接触させることにより形成することができる。非限定例として、持続放出シルクベースの送達系及びそのような系を作製する方法は、本明細書に全体が参照により組み込まれる米国公開第ＵＳ２０１３０１７７６１１号に記載されている。
ｑ．アミノ酸脂質
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、アミノ酸脂質と共に製剤された、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。アミノ酸脂質は、アミノ酸残基及び１つ以上の親油性尾部を含む親油性化合物である。アミノ酸脂質、及びアミノ酸脂質を製造する方法の非限定例は、米国特許第８，５０１，８２４号に記載されている。アミノ酸脂質製剤は、ポリヌクレオチドに結合し、放出するアミノ酸脂質を含む放出可能な形態でポリヌクレオチドを送達することができる。非限定例として、本明細書に記載のポリヌクレオチドの放出は、例えば、米国特許第７，０９８，０３２号、同第６，８９７，１９６号、同第６，４２６，０８６号、同第７，１３８，３８２号、同第５，５６３，２５０号、及び同第５，５０５，９３１号（これらのそれぞれは、本明細書に全体が参照により組み込まれる）に記載されているような酸に不安定なリンカーにより提供することができる。
ｒ．微小胞
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、微小胞製剤内に、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。例示的な微小胞としては、（本明細書に全体が参照により組み込まれる）米国公開第ＵＳ２０１３０２０９５４４号に記載のものが挙げられる。いくつかの実施形態では、微小胞は、（本明細書に全体が参照により組み込まれる）国際公開第ＷＯ２０１３１１９６０２号に記載されるようなＡＲＲＤＣ１媒介微小胞（ＡＲＭＭ）である。
ｓ．共重合体電解質複合体
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、共重合体電解質複合体内に、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。共重合体電解質複合体は、電荷動的ポリマーが１つ以上のアニオン性分子と複合化される時に形成される。電荷動的ポリマー及び共重合体電解質複合体複合体ならびに共重合体電解質複合体を作製する方法の非限定例は、本明細書に全体が参照により組み込まれる米国特許第８，５２４，３６８号に記載されている。
ｔ．結晶性ポリマー系
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、結晶性ポリマー系中に、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。結晶性ポリマー系は、結晶性部分及び／または結晶性部分を含む末端単位を有するポリマーである。例示的なポリマーは、（本明細書に全体が参照により組み込まれる）米国特許第８，５２４，２５９号に記載されている。
ｕ．ポリマー、生分解性ナノ粒子、及びコアシェルナノ粒子
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）ならびに天然及び／または合成ポリマーを含む。ポリマーは、ポリエテン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（ｌ－リシン）（ＰＬＬ）、ＰＬＬにグラフトされたＰＥＧ、カチオン性リポポリマー、生分解性カチオン性リポポリマー、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、架橋分枝鎖ポリ（アルキレンイミン）、ポリアミン誘導体、修飾ポロキサマー、弾性生分解性ポリマー、生分解性コポリマー、生分解性ポリエステルコポリマー、生分解性ポリエステルコポリマー、多元ブロックコポリマー、ポリ［α－（４－アミノブチル）－Ｌ－グリコール酸）（ＰＡＧＡ）、生分解性架橋カチオン性多元ブロックコポリマー、ポリカルボナート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフマラート、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリラート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリ尿素、ポリスチレン、ポリアミン、ポリリシン、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ－ラクチド－コ－Ｌ－リシン）、ポリ（４－ヒドロキシ－Ｌ－プロリンエステル）、アミン含有ポリマー、デキストランポリマー、デキストランポリマー誘導体、またはそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
例示的なポリマーとしては、ＤＹＮＡＭＩＣ ＰＯＬＹＣＯＮＪＵＧＡＴＥ（登録商標）（Ａｒｒｏｗｈｅａｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐ．、カルフォルニア州パサデナ）、ＭＩＲＵＳ（登録商標）Ｂｉｏ（ウィスコンシン州マディソン）及びＲｏｃｈｅ Ｍａｄｉｓｏｎ（ウィスコンシン州マディソン）製の製剤、限定されないが、ＳＭＡＲＴＴ ＰＯＬＹＭＥＲ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（商標）（ＰＨＡＳＥＲＸ（登録商標）、ワシントン州シアトル）などのＰＨＡＳＥＲＸＴＭポリマー製剤、ＤＭＲＩ／ＤＯＰＥ、ポロキサマー、Ｖｉｃａｌ（カルフォルニア州サンディエゴ）製のＶＡＸＦＥＣＴＩＮ（登録商標）アジュバント、Ｃａｌａｎｄｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（カルフォルニア州パサデナ）製のキトサン、シクロデキストリン、デンドリマー及びポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）ポリマー、ＲＯＮＤＥＬ（商標）（ＲＮＡｉ／Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ）ポリマー（Ａｒｒｏｗｈｅａｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カルフォルニア州パサデナ）、ならびにＰＨＡＳＥＲＸ（登録商標）（ワシントン州シアトル）などのｐＨ応答性コブロックポリマーが挙げられる。
ポリマー製剤は、（例えば、筋肉内または皮下注射後の）ポリヌクレオチドの持続放出または遅延放出を可能にする。ポリヌクレオチドの変更された放出プロファイルは、例えば、長期間にわたって、コードされたタンパク質の翻訳をもたらすことができる。ポリマー製剤は、ポリヌクレオチドの安定性を増加させるために使用することもできる。持続放出製剤は、ＰＬＧＡマイクロスフェア、エチレンビニルアセテート（ＥＶＡｃ）、ポロキサマー、ＧＥＬＳＩＴＥ（登録商標）（Ｎａｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．、フロリダ州アラチュア）、ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）（Ｈａｌｏｚｙｍｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、カルフォルニア州サンディエゴ）、フィブリノゲンポリマーなどの外科用シーラント（Ｅｔｈｉｃｏｎ Ｉｎｃ．、ジョージア州コーネリア）、ＴＩＳＳＥＬＬ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．、イリノイ州ディアフィールド）、ＰＥＧベースのシーラント、及びＣＯＳＥＡＬ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．、イリノイ州ディアフィールド）を含むことができるが、これらに限定されない。
非限定例として、修飾ｍＲＮＡは、調整可能な放出速度（例えば、数日及び数週間）を有するＰＬＧＡミクロスフェアを調製すること、ならびに封入プロセス中に修飾ｍＲＮＡの完全性を維持しながら、修飾ｍＲＮＡをＰＬＧＡミクロスフェアに封入することにより、ＰＬＧＡミクロスフェアに製剤化することができる。ＥＶＡｃは、前臨床持続放出インプラント用途で広範に使用される非生分解性生体適合性ポリマーである（例えば、緑内障のためのピロカルピン眼内インサートである徐放性製品Ｏｃｕｓｅｒｔ、または持続放出プロゲステロン子宮内デバイスであるＰｒｏｇｅｓｔａｓｅｒｔ、経皮送達系Ｔｅｓｔｏｄｅｒｍ、Ｄｕｒａｇｅｓｉｃ、及びＳｅｌｅｇｉｌｉｎｅ、カテーテル）。ポロキサマーＦ－４０７ ＮＦは、５℃未満の温度での低粘度を有するポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレン－ポリオキシエチレンの親水性非イオン性界面活性三元ブロックコポリマーであり、１５℃を超える温度で、固体ゲルを形成する。
非限定例として、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、米国特許第６，１７７，２７４号に記載されるようなＰＬＬでグラフトされたＰＥＧのポリマー化合物と共に製剤化することができる。別の非限定例として、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、ＰＬＧＡ－ＰＥＧブロックコポリマー（例えば、米国公開第ＵＳ２０１２０００４２９３号ならびに米国特許第８，２３６，３３０号及び同第８，２４６，９６８号を参照のこと）またはＰＬＧＡ－ＰＥＧ－ＰＬＧＡブロックコポリマー（例えば、米国特許第６，００４，５７３号を参照のこと）などのブロックコポリマーと共に製剤化することができる。参考文献のそれぞれは、本明細書に全体が参照により組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、限定されないが、ポリリシン、ポリエチレンイミン、ポリ（アミドアミン）デンドリマー、ポリ（アミン－コ－エステル）またはそれらの組み合わせなどの少なくとも１つのアミン含有ポリマーと共に製剤化することができる。例示的なポリアミンポリマー及び送達剤としてのそれらの使用は、例えば、米国特許第８，４６０，６９６号、同第８，２３６，２８０号に記載されており、これらのそれぞれは、本明細書に全体が参照により組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、例えば、米国特許第６，６９６，０３８号、同第６，５１７，８６９号、同第６，２６７，９８７号、同第６，２１７，９１２号、同第６，６５２，８８６号、同第８，０５７，８２１号、及び同第８，４４４，９９２号；米国公開第ＵＳ２００３００７３６１９号、同第ＵＳ２００４０１４２４７４号、同第ＵＳ２０１００００４３１５号、同第ＵＳ２０１２００９１４５号、及び同第ＵＳ２０１３０１９５９２０号；ならびに国際公開第ＷＯ２００６０６３２４９号及び同第ＷＯ２０１３０８６３２２号（これらのそれぞれは、本明細書に全体が参照により組み込まれる）に記載されるような、生分解性カチオン性リポポリマー、生分解性ポリマー、もしくは生分解性コポリマー、生分解性ポリエステルコポリマー、生分解性ポリエステルポリマー、直鎖生分解性コポリマー、ＰＡＧＡ、生分解性架橋カチオン性マルチブロックコポリマー、またはそれらの組み合わせに製剤化することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、米国公開第ＵＳ２０１３０１８４４５３号に記載されるような少なくとも１つのシクロデキストリンポリマーに、またはこれらと共に製剤化することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、国際公開第ＷＯ２０１３１０６０７２号、同第ＷＯ２０１３１０６０７３号、及び同第ＷＯ２０１３１０６０８６号に記載されるような少なくとも１つの架橋カチオン結合ポリマーに、またはこれらと共に製剤化することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、米国公開第ＵＳ２０１３０２３１２８７号に記載されるような少なくともＰＥＧ化アルブミンポリマーに、またはこれらと共に製剤化することができる。参考文献のそれぞれは、本明細書に全体が参照により組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示のポリヌクレオチドは、ポリマー、脂質、及び／または限定されないが、リン酸カルシウムなどの他の生分解性薬の組み合わせを使用して、ナノ粒子として製剤化することができる。構成成分を、コアシェル、ハイブリッド、及び／または層ごとの構造で組み合わせて、送達のためのナノ粒子の微調整を可能にすることができる（本明細書に全体が参照により組み込まれるＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍａｔｅｒ．２００６ ５：７９１－７９６、Ｆｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２００８ ２９：１５２６－１５３２、ＤｅＫｏｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．２０１１ ６３：７４８－７６１、Ｅｎｄｒｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２０１１ ３２：７７２１－７７３１、Ｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ．２０１１ Ｊｕｎ ６；８（３）：７７４－８７）。非限定例として、ナノ粒子は、限定されないが、親水性－疎水性ポリマー（例えば、ＰＥＧ－ＰＬＧＡ）、疎水性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）、及び／または親水性ポリマー（本明細書に全体が参照により組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１２０２２５１２９号）などの複数のポリマーを含むことができる。
コアシェルナノ粒子の使用は、カチオン性架橋ナノゲルコア及び種々のシェルを合成するハイスループットアプローチにさらに焦点を当てている（本明細書に全体が参照により組み込まれるＳｉｅｇｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１１ １０８：１２９９６－１３００１）。ポリマーナノ粒子の複合化、送達、及び内在化は、ナノ粒子のコア構成要素及びシェル構成要素の両方における化学組成を変更することにより、正確に制御することができる。例えば、コアシェルナノ粒子は、コレステロールをナノ粒子に共有結合させた後に、ｓｉＲＮＡをマウス肝細胞に効率的に送達することができる。
いくつかの実施形態では、中程度のＰＬＧＡ層を含む中空脂質コア及びＰＥＧを含有する外側の中性脂質層を、本明細書に記載されるようなポリヌクレオチドの送達に使用することができる。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、本明細書に開示のポリヌクレオチドのコア及びコア中のポリヌクレオチドを保護するために使用されるポリマーシェルを含むことができる。ポリマーシェルは、本明細書に記載のポリマーのいずれかであることができ、当該技術分野で知られている。ポリマーシェルは、コア中のポリヌクレオチドを保護するために使用することができる。
本明細書に記載のポリヌクレオチドと共に使用されるコアシェルナノ粒子は、米国特許第８，３１３，７７７号または国際公開第ＷＯ２０１３１２４８６７号に記載されており、これらのそれぞれは、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ｖ．ペプチド及びタンパク質
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、ペプチド及び／またはタンパク質と共に製剤化される、ポリヌクレオチドによる細胞の形質移入を増加させ、及び／または（例えば、具体的な組織もしくは細胞型を標的とすることにより）ポリヌクレオチドの生体内分布を変更し、及び／またはコードされたタンパク質の翻訳を増加させる、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む（例えば、国際公開第ＷＯ２０１２１１０６３６号及び同第ＷＯ２０１３１２３２９８号）。いくつかの実施形態では、ペプチドは、米国公開第ＵＳ２０１３０１２９７２６号、同第ＵＳ２０１３０１３７６４４号、及び同第ＵＳ２０１３０１６４２１９号に記載のものとすることができる。参考文献のそれぞれは、本明細書に全体が参照により組み込まれる。
ｗ．コンジュゲート
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、コンジュゲートとして、担体もしくは標的化基に共有結合される、または融合タンパク質を共に産生する２つのコード領域を含む（例えば、標的化基及び治療的タンパク質もしくはペプチドを持つ）、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。コンジュゲートは、ナノ粒子を組織もしくは生体内のニューロンに選択的に向けるか、または血液脳関門の横断に役立つペプチドとすることができる。
コンジュゲートは、天然に存在する物質、例えば、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、もしくはグロブリン）、炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン、もしくはヒアルロン酸）、または脂質を含む。リガンドは、組換えまたは合成分子、例えば、合成ポリマー、例えば、合成ポリアミノ酸、オリゴヌクレオチド（例えば、アプタマー）、とすることもできる。ポリアミノ酸の例としては、ポリリシン（ＰＬＬ）、ポリＬ－アスパラギン酸、ポリＬ－グルタミン酸、スチレン－無水マレイン酸無水物コポリマー、ポリ（Ｌ－ラクチド－コ－グリコリド）コポリマー、ジビニルエーテル－無水マレイン酸コポリマー、Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２－エチルアクリル酸）、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリホスファジンが挙げられる。ポリアミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリリシン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、シュードペプチド－ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの四級塩、またはアルファらせんペプチドが挙げられる。
いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、本明細書に開示のポリヌクレオチドのための担体として機能することができる。コンジュゲートは、限定されないが、ポリ（エチレングリコール）でグラフトされ得るポリアミン、ポリリシン、ポリアルキレンイミン、及びポリエチレンイミンなどのカチオン性ポリマーを含むことができる。例示的な複合体及びそれらの調製物は、米国特許第６，５８６，５２４号及び米国公開第ＵＳ２０１３０２１１２４９号に記載されており、これらのそれぞれは、本明細書では、全体が参照により組み込まれる。
コンジュゲートは、腎臓細胞などの特定の細胞型に結合する標的化基、例えば、細胞または組織標的化剤、例えば、レクチン、糖タンパク質、脂質、またはタンパク質、例えば、抗体、を含むこともできる。標的化基は、甲状腺刺激ホルモン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタントタンパク質Ａ、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸、ビタミンＢ１２、ビオチン、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤペプチド模倣物、またはアプタマーとすることができる。
標的化基は、タンパク質、例えば、糖タンパク質、またはペプチド、例えば、共リガンドに対する特異的親和性を有する分子、または抗体、例えば、癌細胞、内皮細胞、もしくは骨細胞などの特定された細胞型に結合する抗体、とすることができる。標的化基は、ホルモン及びホルモン受容体を含むこともできる。それらは、非ペプチド種、例えば、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ－アセチルガラクトサミン、Ｎ－アセチルグルコサミン多価マンノース、多価性フルクトース、またはアプタマー、を含むこともできる。リガンドは、例えば、リポ多糖体、またはｐ３８ＭＡＰキナーゼのアクチベーターとすることができる。
標的化基は、特定の受容体を標的とすることができる任意のリガンドとすることができる。例としては、葉酸塩、ＧａｌＮＡｃ、ガラクトース、マンノース、マンノース－６Ｐ、アプタマー、インテグリン受容体リガンド、ケモカイン受容体リガンド、トランスフェリン、ビオチン、セロトニン受容体リガンド、ＰＳＭＡ、エンドセリン、ＧＣＰＩＩ、ソマトスタチン、ＬＤＬ、及びＨＤＬリガンドが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、標的化基は、アプタマーである。アプタマーは、非修飾であるか、または本明細書に開示の修飾の任意の組み合わせを有することができる。非限定例として、標的化基は、例えば、標的化基は、（本明細書に全体が参照により組み込まれる）米国公開第ＵＳ２０１３０２１６６１０１２号に記載されているような、血液中枢神経系バリアを越える標的化送達のためのグルタチオン受容体（ＧＲ）結合コンジュゲートとすることができる。
いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、より大きい治療有効性を提供するために長時間作用型連続放出系を含む相乗的生体分子－ポリマーコンジュゲートとすることができる。相乗的生体分子－ポリマーコンジュゲートは、米国公開第ＵＳ２０１３０１９５７９９号に記載されるものとすることができる。いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、国際特許公開第ＷＯ２０１２０４０５２４号に記載されるようなアプタマーコンジュゲートとすることができる。いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、米国特許第８，５０７，６５３号に記載されるようなアミン含有ポリマーとすることができる。参考文献のそれぞれは、本明細書に全体が参照により組み込まれる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＳＭＡＲＴＴ ＰＯＬＹＭＥＲ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（登録商標）（ＰＨＡＳＥＲＸ（登録商標），Ｉｎｃ．、ワシントン州シアトル）にコンジュゲートすることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、シグナル配列または標的化配列を含むこともできる細胞浸透性ポリペプチドに共有結合的にコンジュゲートされる。コンジュゲートは、安定性の増加及び／もしくは細胞の形質移入の増加、ならびに／または生体内分布の変更（例えば、具体的な組織または細胞型を標的とする）を有するようにデザインすることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、送達を増強するために、薬剤にコンジュゲートすることができる。いくつかの実施形態では、薬剤は、モノマーまたはポリマー、例えば、国際公開番号ＷＯ２０１１０６２９６５に記載されるような標的化ブロックを有する標的化モノマーまたはポリマーとすることができる。いくつかの実施形態では、薬剤は、例えば、米国特許第６，８３５．３９３号及び同第７，３７４，７７８号に記載されるようなポリヌクレオチドと共有結合した輸送薬剤とすることができる。いくつかの実施形態では、薬剤は、米国特許第７，７３７，１０８号及び同第８，００３，１２９号に記載されるような膜バリア輸送促進剤とすることができる。参考文献のそれぞれは、本明細書に全体が参照により組み込まれる。
ｘ．微小器官
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、長時間持続する治療的製剤内の、目的のコードされたポリペプチドを発現することができる微小器官内に、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。例示的な微小器官及び製剤は、（本明細書に全体が参照により組み込まれる）国際公開第ＷＯ２０１４１５２２１１号に記載される。
ｙ．シュードビリオン
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、シュードビリオン（例えば、Ａｕｒａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、マサチューセッツ州ケンブリッジにより開発されたシュードビリオン）内に、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドを送達するために使用されるシュードビリオンは、限定されないが、例えば、米国公開第ＵＳ２０１３００１２４５０号、同第ＵＳ２０１３００１２５６６号、同第ＵＳ２１０３００１２４２６号、及び同第ＵＳ２０１２０２０７８４０号；ならびに国際公開第ＷＯ２０１３００９７１７号（これらのそれぞれは、本明細書に全体が参照により組み込まれる）に記載されるようなヘルペス及びパピローマウイルスなどのウイルスに由来し得る。
シュードビリオンは、米国公開第ＵＳ２０１２００１５８９９号及び同第ＵＳ２０１３０１７７５８７号、ならびに国際公開第ＷＯ２０１００４７８３９号、同第ＷＯ２０１３１１６６５６号、同第ＷＯ２０１３１０６５２５号、及び同第ＷＯ２０１３１２２２６２号に記載の方法により調製されるウイルス様粒子（ＶＬＰ）とすることができる。一態様では、ＶＬＰは、バクテリオファージＭＳ、Ｑβ、Ｒ１７、ｆｒ、ＧＡ、Ｓｐ、ＭＩ、Ｉ、ＭＸＩ、ＮＬ９５、ＡＰ２０５、ｆ２、ＰＰ７、及び植物ウイルスであるＴｕｒｎｉｐ ｃｒｉｎｋｌｅ ｖｉｒｕｓ（ＴＣＶ）、Ｔｏｍａｔｏ ｂｕｓｈｙ ｓｔｕｎｔ ｖｉｒｕｓ（ＴＢＳＶ）、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｅａｎ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ（ＳＢＭＶ）及びＢｒｏａｄ ｂｅａｎ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓを含むＢｒｏｍｏｖｉｒｕｓ属のメンバー、Ｂｒｏｍｅ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ、Ｃａｓｓｉａ ｙｅｌｌｏｗ ｂｌｏｔｃｈ ｖｉｒｕｓ、Ｃｏｗｐｅａ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ （ＣＣＭＶ）、Ｍｅｌａｎｄｒｉｕｍ ｙｅｌｌｏｗ ｆｌｅｃｋ ｖｉｒｕｓ、ならびにＳｐｒｉｎｇ ｂｅａｕｔｙ ｌａｔｅｎｔ ｖｉｒｕｓとすることができる。別の態様では、ＶＬＰは、米国公開第ＵＳ２０１３０１７７５８７号及び米国特許第８，５０６，９６７号に記載されるようなｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓに由来し得る。一態様では、ＶＬＰは、国際公開第ＷＯ２０１３１１６６５６号に記載されるような脂質膜または粒子の外側にアンカーされるＢ７－１及び／またはＢ７－２分子を含むことができる。一態様では、ＶＬＰは、ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ、ｒｏｔａｖｉｒｕｓ組換えＶＰ６タンパク質、または二重層化ＶＰ２／ＶＰ６、例えば、国際公開第ＷＯ２０１２０４９３６６号に記載されるようなＶＬＰ、に由来し得る。参考文献のそれぞれは、本明細書に全体が参照により組み込まれる。
いくつかの実施形態では、シュードビリオンは、国際公開第ＷＯ２０１０１２０２６６号及び米国公開第ＵＳ２０１２０１７１２９０号に記載されるようなヒト乳頭腫ウイルス様粒子とすることができる。いくつかの実施形態では、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、自己組織化粒子とすることができる。一態様では、シュードビリオンは、米国特許第ＵＳ２０１３０１１６４０８号及び同第ＵＳ２０１３０１１５２４７号；ならびに国際公開第ＷＯ２０１３１１９８７７号に記載されるようなナノ粒子由来のビリオンとすることができる。参考文献のそれぞれは、本明細書に全体が参照により組み込まれる。
本明細書に記載の製剤及びポリヌクレオチドを製剤化するための方法の非限定例は、（全体が参照により本明細書に組み込まれる）国際公開第ＷＯ２０１３０９０６４８号にも提示される。
２４．促進された血液のクリアランス（ＡＢＣ）
本発明は、生物学的に活性な薬剤などの反復投与された活性薬剤に対するＡＢＣの効果を低減させるための化合物、組成物、及びその使用方法を提供する。容易に明らかとなるように、投与された活性薬剤に対するＡＢＣの効果を全体的に低減または排除することは、半減期及び有効性を効果的に増加させる。
いくつかの実施形態では、ＡＢＣを低減させるという用語は、ＭＣ３ ＬＮＰなどの正の参照対照のＡＢＣ誘導ＬＮＰと比較してＡＢＣの任意の低減を指す。ＡＢＣを誘導するＬＮＰは、所与の時間枠内の第２の投与またはその後の投与時に、活性薬の循環レベルの低減を引き起こす。従って、ＡＢＣの低減は、標準的なＬＮＰと比較して、薬剤の第２の投与またはその後の投与時に、循環薬のクリアランスがより少ないことを指す。低減は、例えば、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％であってよい。いくつかの実施形態では、低減は、１０～１００％、１０～５０％、２０～１００％、２０～５０％、３０～１００％、３０～５０％、４０％～１００％、４０～８０％、５０～９０％、または５０～１００％である。あるいは、ＡＢＣの低減は、２回目もしくはその後の投与後に循環薬剤が少なくとも検出可能なレベルであること、または、標準ＬＮＰの投与後の循環薬剤と比較して、循環薬剤が少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍増加すること、を特徴とし得る。いくつかの実施形態では、低減は、２～１００倍、２～５０倍、３～１００倍、３～５０倍、３～２０倍、４～１００倍、４～５０倍、４～４０倍、４～３０倍、４～２５倍、４～２０倍、４～１５倍、４～１０倍、４～５倍、５～１００倍、５～５０倍、５～４０倍、５～３０倍、５～２５倍、５～２０倍、５～１５倍、５～１０倍、６～１００倍、６～５０倍、６～４０倍、６～３０倍、６～２５倍、６～２０倍、６～１５倍、６～１０倍、８～１００倍、８～５０倍、８～４０倍、８～３０倍、８～２５倍、８～２０倍、８～１５倍、８～１０倍、１０～１００倍、１０～５０倍、１０～４０倍、１０～３０倍、１０～２５倍、１０～２０倍、１０～１５倍、２０～１００倍、２０～５０倍、２０～４０倍、２０～３０倍、または２０～２５倍である。
本開示は、クリアランスの影響をあまり受けず、且つ、それにより、ｉｎ ｖｉｖｏでより長い半減期を有する脂質含有化合物及び組成物を提供する。これは、特に、組成物が慢性投与を含む繰り返しのために意図されている場合、及び、さらにより詳細には、そのような反復投与が数日または数週間以内に発生する場合、である。
重大なことに、これらの組成物は、感受性が低いか、促進された血液クリアランス（ＡＢＣ）の観察される現象を完全に回避する。ＡＢＣは、特定の外因的に投与された薬剤が、２回目及びその後の投与時に血液から急速にクリアランスされる現象である。この現象は、部分的には、限定されないが、脂質化剤、リポソーム、または他の脂質ベースの送達ビヒクル、及び脂質封入剤を含む様々な脂質含有組成物で観察されている。従来、ＡＢＣの基礎は、あまり理解されておらず、いくつかの場合、体液性免疫応答に起因するとされ、従って、ｉｎ ｖｉｖｏで、特に、臨床設定において、その影響を制限するための方策は、理解しにくいままである。
本開示は、たとえ、ＡＢＣの影響を受けたとしても、あまり影響を受けない化合物及び組成物を提供する。いくつかの重要な態様では、そのような化合物及び組成物は、脂質含有化合物または組成物である。驚くべきことに、本開示の脂質含有化合物または組成物は、２回目の投与及びその後のｉｎ ｖｉｖｏ投与時にＡＢＣを経験しない。ＡＢＣに対するこの耐性は、これらの化合物及び組成物を、特にｉｎ ｖｉｖｏでの、数日または１～２週間を含む短期間内での反復使用を含む反復使用に適するようにする。この安定性及び／または半減期の増強は、部分的には、これらの組成物がＢ１ａ及び／もしくはＢ１ｂ細胞ならびに／または従来のＢ細胞、ｐＤＣ及び／もしくは血小板を活性化できないことに起因する。
それ故、本開示は、血液クリアランスの促進（ＡＢＣ）の根底にある機序の解明を提供する。本開示及び本明細書に提示の本発明によれば、ＡＢＣ現象は、少なくとも脂質及び脂質ナノ粒子に関する限り、少なくとも部分的に、Ｂ１ａ及び／もしくはＢ１ｂ細胞、ｐＤＣ、ならびに／または血小板を含む自然免疫応答に媒介されることが見出されている。Ｂ１ａ細胞は通常、循環ＩｇＭの形態で天然抗体の分泌に関与している。このＩｇＭは、ポリ反応性であり、それが様々な抗原に結合することができるが、各抗原に対する親和性は比較的低いことを意味する。
本発明によれば、ｉｎ ｖｉｖｏで投与された脂質ナノ粒子などの一部の脂質化剤または脂質含有製剤が、ＡＢＣを誘発し、ＡＢＣの影響を受けることが見出されている。本発明によれば、ＬＮＰの初回用量の投与時に、自然免疫応答を生じることに関与する１つ以上の細胞（本明細書ではセンサーと呼ばれる）は、そのような薬剤と結合し、活性化され、次に、ＡＢＣ及び毒性を促進する免疫因子（本明細書ではエフェクターと呼ばれる）のカスケードを開始することが見出されている。例えば、Ｂ１ａ及びＢ１ｂ細胞は、ＬＮＰに結合し、（単独で、またはｐＤＣなどの他のセンサー及び／またはＩＬ６などのエフェクターの存在下で）活性化されるようになり、ＬＮＰに結合する天然のＩｇＭを分泌し得る。対象の既存の天然ＩｇＭも、ＬＮＰを認識してそれに結合し、それにより、補体結合を誘発し得る。初回用量の投与後、天然ＩｇＭの産生は、ＬＮＰの投与から１～２時間以内に開始する。通常は、約２～３週間までに、天然ＩｇＭは、ＩｇＭの自然半減期に起因して、系からクリアランスされる。天然ＩｇＧは、ＬＮＰの投与後の最初約９６時間に産生される。薬剤は、ナイーブな環境で投与された時、Ｂ１ａ細胞またはＢ１ｂ細胞または天然ＩｇＧの活性化後に産生された天然ＩｇＭにより比較的妨げられない生物学的効果を発揮することができる。天然ＩｇＭ及び天然ＩｇＧは、非特異的であり、従って、抗ＰＥＧ ＩｇＭ及び抗ＰＥＧ ＩｇＧとは異なる。
出願人は機序に拘束されないが、ＬＮＰが、以下の機序により、ＡＢＣ及び／または毒性を誘発することが提案される。ＬＮＰが対象に投与された際、ＬＮＰは、脾臓に血液を介して急速に輸送されると考えられている。ＬＮＰは、血液及び／または脾臓中で免疫細胞に出会い得る。血液及び／または脾臓内のＬＮＰの存在に応答して、迅速な自然免疫応答が誘発される。本明細書では、ＬＮＰの投与の数時間以内に、いくつかの免疫センサーが、ＬＮＰの存在に反応していることを、本出願人は示している。これらのセンサーは、免疫応答を生じることに関与する免疫細胞、例えば、Ｂ細胞、ｐＤＣ、及び血小板を含むが、これらに限定されない。センサーは、脾臓の周辺領域及び／または血液などの脾臓に存在し得る。ＬＮＰは、他のセンサーと相互作用し得る１つ以上のセンサーと物理的に相互作用し得る。そのような場合では、ＬＮＰは、センサーと直接的または間接的に相互作用する。センサーは、ＬＮＰの認識に応答して、互いに直接相互作用し得る。例えば、多くのセンサーは、脾臓内に位置しており、容易に互いに相互作用することができる。あるいは、センサーのうちの１つ以上は、血液中のＬＮＰと相互作用して、活性化されるようになり得る。次に、活性化されたセンサーは、他のセンサーと直接的に相互作用するか、または（例えば、メッセンジャー、例えば、ＩＬ６、例えば、サイトカインの刺激または産生を介して）間接的に相互作用し得る。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、以下のセンサーのそれぞれと直接的に相互作用して、これを活性化し得る：ｐＤＣ、Ｂ１ａ細胞、Ｂ１ｂ細胞、及び血小板。次に、これらの細胞は、相互に直接的または間接的に相互作用して、最終的に、ＬＮＰの反復投与に伴うＡＢＣ及び／または毒性に関連するエフェクターの産生を開始し得る。例えば、出願人は、ＬＮＰ投与がｐＤＣ活性化、血小板凝集及び活性化、ならびにＢ細胞活性化をもたらすことを示している。ＬＮＰに応答して、血小板もまた、凝集し、活性化され、Ｂ細胞と凝集する。ｐＤＣ細胞は活性化される。ＬＮＰは、比較的迅速に血小板及びＢ細胞の表面と相互作用することが見出されている。ＬＮＰに応答して、これらのセンサーの任意の１つまたは組み合わせの活性化を遮断することは、通常生じる免疫応答を減衰させるのに有用である。免疫応答のこの減衰は、ＡＢＣ及び／または毒性の回避をもたらす。
センサーは、一旦活性化されると、エフェクターを産生する。本明細書で使用されるエフェクターは、Ｂ細胞などの免疫細胞により産生される免疫分子である。エフェクターは、天然ＩｇＭ及び天然ＩｇＧなどの免疫グロブリンならびにＩＬ６などのサイトカインを含むが、これらに限定されない。Ｂ１ａ及びＢ１ｂ細胞は、ＬＮＰの投与後の２～６時間以内に、天然ＩｇＭの産生を刺激する。天然ＩｇＧは、９６時間以内に検出することができる。ＩＬ６レベルは、数時間以内に増加する。天然ＩｇＭ及びＩｇＧは、体内を数日～数週間循環する。この時間中、循環エフェクターは、新しく投与されたＬＮＰと相互作用して、そのＬＮＰを身体によるクリアランスのために誘発することができる。例えば、エフェクターは、ＬＮＰを認識して、これに結合し得る。エフェクターのＦｃ領域は、マクロファージにより、認識され得、マクロファージによる装飾ＬＮＰの取り込みを誘発する。次に、マクロファージは、脾臓に輸送される。免疫センサーによるエフェクターの産生は、ＡＢＣについて観察されるタイミングと相関する過渡応答である。
投与された用量が、第２の用量またはその後の用量であり、且つそのような第２の用量またはその後の用量が、予め誘導された天然ＩｇＭ及び／またはＩｇＧが系からクリアランスされる前に（例えば、２～３のウィンドウ期間の前に）、投与される場合、そのような第２またはその後の用量は、副補体経路の活性化を誘発し、それ自体急速にクリアランスされる循環天然ＩｇＭ及び／または天然ＩｇＧまたはＦｃにより標的とされる。エフェクターが体内からクリアランスされるか、または数が低減した後に、ＬＮＰが投与される時、ＡＢＣは観察されない。
従って、ＬＮＰ及び１つ以上のセンサーの間の相互作用を阻害すること、（直接的または間接的な）ＬＮＰによる１つ以上のセンサーの活性化を阻害すること、１つ以上のエフェクターの産生を阻害すること、及び／または１つ以上のエフェクターの活性を阻害することは、本発明の態様によると有用である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＬＮＰのセンサーとの相互作用を制限または遮断するようにデザインされる。例えば、ＬＮＰは、センサーとの相互作用を防止するために、変更されたＰＣ及び／またはＰＥＧを有し得る。代替的または追加的に、ＬＮＰにより誘導される免疫応答を阻害する薬剤は、これらの効果のうちのいずれか１つ以上を達成するために使用されてもよい。
さらに、従来のＢ細胞もＡＢＣに関与していると結論づけている。具体的には、薬剤の初回投与時に、本明細書では、ＣＤ１９（＋）と呼ばれる従来のＢ細胞は、薬剤に結合し、これに対して反応する。Ｂ１ａ及びＢ１ｂ細胞とは異なるが、従来のＢ細胞は、（ＬＮＰの投与後の最初の約９６時間に）ＩｇＭ応答を最初に起こすことができ、続いて、（ＬＮＰ投与後の最初の約１４日に）記憶応答に付随するＩｇＭ応答を起こすことができる。従って、従来のＢ細胞は、投与された薬剤と反応し、ＡＢＣを媒介するＩｇＭ（及び最終的にはＩｇＧ）に寄与する。ＩｇＭ及びＩｇＧは通常、抗－ＰＥＧ ＩｇＭ及び抗－ＰＥＧ ＩｇＧである。
いくつかの場合では、ＡＢＣ応答の大部分が、Ｂ１ａ細胞及びＢ１ａ媒介免疫応答を介して媒介されることが考察される。いくつかの例では、従来のＢ細胞及びＢ１ａ細胞の両方がそのような効果を媒介しながら、ＡＢＣ応答が、ＩｇＭ及びＩｇＧの両方により媒介されることがさらに考察される。さらに他の場合では、ＡＢＣ応答は、天然ＩｇＭ分子により媒介され、これらのいくつかは、活性化されたＢ１ａ細胞により産生され得る天然ＩｇＭに結合することができる。天然ＩｇＭは、ＬＮＰの１つ以上の構成要素に結合し、例えば、ＬＮＰのリン脂質構成要素に結合（例えば、リン脂質のＰＣ部分に結合）し、及び／またはＬＮＰのＰＥＧ－脂質構成要素に結合（例えば、ＰＥＧ－ＤＭＧに結合、特に、ＰＥＧ－ＤＭＧのＰＥＧ部分に結合）し得る。Ｂ１ａは、ホスファチジルコリンがリガンドであるＣＤ３６を発現するので、ＣＤ３６受容体が、Ｂ１ａ細胞の活性化及びそれによる天然ＩｇＭの産生を媒介し得ることが考察される。さらに他の場合では、ＡＢＣ応答は、主に、従来のＢ細胞により媒介される。
本発明によれば、Ｂ１ａ細胞を活性化しない化合物及び組成物（例えば、薬剤、送達ビヒクル、及び製剤）を使用することにより、ＡＢＣ現象を少なくとも部分的に低減させ、または排除することができることが見出されている。Ｂ１ａ細胞を活性化しない化合物及び組成物は、本明細書ではＢ１ａ不活性化合物及び組成物と呼ばれ得る。さらに、本発明によれば、従来のＢ細胞を活性化しない化合物及び組成物の使用により、ＡＢＣ現象を、少なくとも部分的に低減させ、または排除することができることが見出されている。いくつかの実施形態では、従来のＢ細胞を活性化しない化合物及び組成物は、本明細書では、ＣＤ１９不活化合物及び組成物と呼ばれ得る。従って、本明細書で提供されるいくつかの実施形態では、化合物及び組成物は、Ｂ１ａ細胞を活性化せず、それらは、従来のＢ細胞を活性化しない。いくつかの実施形態では、Ｂ１ａ細胞及び従来のＢ細胞を活性化しない化合物及び組成物は、本明細書ではＢ１ａ／ＣＤ１９不活性化合物及び組成物と呼ばれ得る。
これらの根底にある機序は、従来理解されておらず、そのような現象における、Ｂ１ａ及びＢ１ｂの細胞の役割及びそれらの従来のＢ細胞との相互作用もまた、評価されていなかった。
従って、本開示は、ＡＢＣを促進しない化合物及び組成物を提供する。これらは、Ｂ１ａ及び／またはＢ１ｂ細胞、血小板及び／またはｐＤＣ、ならびに任意に、従来のＢ細胞も活性化することが可能でないことをさらに特徴とし得る。これらの化合物（例えば、予防薬、治療薬、及び診断薬などの生物学的に活性な薬剤を含む薬剤、リポソーム、脂質ナノ粒子、及び他の脂質ベースの封入構造体を含む送達ビヒクルなど）ならびに組成物（例えば、製剤など）は、特に、反復投与、特に、時間の短い期間（例えば、１～２週間以内）内で生じる反復投与、を必要とする用途に望ましい。これは、例えば、薬剤が規則的で密接した間隔で対象に提供される核酸ベースの治療薬である場合である。本明細書で提供される知見は、同様に投与される、且つ／またはＡＢＣを受けやすいこれら及び他の薬剤に適用され得る。
特に興味深いのは、脂質含有化合物、脂質含有粒子、及び脂質含有組成物である。それは、これらがＡＢＣの影響を受けやすいことが知られているからである。そのような脂質含有化合物粒子及び組成物は、生物学的に活性な薬剤としてまたはそのような薬剤の送達ビヒクルとして広範囲に使用されている。従って、そのような薬剤の有効性を向上させる能力は、薬剤自体またはその送達ビヒクルに対するＡＢＣの効果を低減させるかどうかに関わらず、多種多様な活性薬剤にとって有益である。
１つ以上の生物学的に活性な薬剤の反復用量投与と関連する急性期応答（ＡＲＰ）を刺激または増強しない組成物もまた本明細書で提供される。
この組成物は、いくつかの場合では、限定されないが、天然ＩｇＭを含むＩｇＭに結合しないことがある。
この組成物は、いくつかの場合では、限定されないが、Ｃ反応性タンパク質などの急性期タンパク質に結合しないことがある。
組成物は、いくつかの場合では、ＣＤ５（＋）媒介免疫応答を誘発しないことがある。本明細書で使用される場合、ＣＤ５（＋）媒介免疫応答は、Ｂ１ａ及び／またはＢ１ｂ細胞により媒介される免疫応答である。そのような応答は、ＡＢＣ応答、急性期応答、天然ＩｇＭ及び／またはＩｇＧの誘導などを含み得る。
組成物は、いくつかの場合では、ＣＤ１９（＋）媒介免疫応答を誘発しないことがある。本明細書で使用される場合、ＣＤ１９（＋）媒介免疫応答は、従来のＣＤ１９（＋）、ＣＤ５（－）Ｂ細胞により媒介される免疫応答である。そのような応答は、ＩｇＭの誘導、ＩｇＧの誘導、記憶Ｂ細胞の誘導、ＡＢＣ応答、タンパク質がＬＮＰ内に封入され得る抗タンパク質応答を含む抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答、などを含み得る。
Ｂ１ａ細胞は、先天性免疫に関与するＢ細胞のサブセットである。これらの細胞は、天然抗体または天然血清抗体と呼ばれる循環ＩｇＭの供給源である。天然ＩｇＭ抗体は、いくつかの抗原に対して弱い親和性を有することを特徴とし、従って、それらは、「ポリ特異的」または「ポリ反応性」と呼ばれ、複数の抗原に結合する能力を示す。Ｂ１ａ細胞は、ＩｇＧを産生することができない。さらに、それらは、記憶細胞に発展せず、従って、適応免疫応答に寄与しない。しかし、それらは、活性化時に、ＩｇＭを分泌することができる。分泌されたＩｇＭは通常、約２～３週間以内にクリアランスされ、この時点で、免疫系は、以前に投与された抗原に対して比較的ナイーブになる。同じ抗原が、この期間後（例えば、最初の曝露の約３週間後）に提示された場合、抗原は、急速にクリアランスされない。しかし、重大なことに、抗原がその期間内（例えば、１週間以内または数日以内を含む２週間以内）に提示される場合、抗原は急速にクリアランスされる。連続投与間の遅延により、特定の脂質含有治療薬または診断薬が使用に適さなくなる。
ヒトでは、Ｂ１ａ細胞は、ＣＤ１９（＋）、ＣＤ２０（＋）、ＣＤ２７（＋）、ＣＤ４３（＋）、ＣＤ７０（－）、及びＣＤ５（＋）である。マウスでは、Ｂ１ａ細胞は、ＣＤ１９（＋）、ＣＤ５（＋）、及びＣＤ４５ Ｂ細胞アイソフォームＢ２２０（＋）である。Ｂ１ａ細胞を他の従来のＢ細胞と区別するのは、通常、ＣＤ５の発現である。Ｂ１Ａ細胞は、ＣＤ５を高レベルで発現し得、これに基づき、ＣＤ５を低いまたは検出不可能なレベルで発現するＢ－１Ｂ細胞などの他のＢ－１細胞と区別し得る。ＣＤ５は、汎Ｔ細胞表面糖タンパク質である。Ｂ１ａ細胞は、脂肪酸トランスロカーゼとしても既知のＣＤ３６を発現する。ＣＤ３６は、クラスＢスカベンジャー受容体ファミリーのメンバーである。ＣＤ３６は、酸化低密度リポタンパク質、天然リポタンパク質、酸化リン脂質、及び長鎖脂肪酸を含む多くのリガンドと結合することができる。
Ｂ１ｂ細胞は、先天性免疫に関与するＢ細胞の別のサブセットである。これらの細胞は、循環天然ＩｇＭの別の供給源である。ＰＳを含むいくつかの抗原は、Ｂ１ｂ活性化を介してＴ細胞非依存の免疫を誘導することができる。ＣＤ２７は通常、抗原活性化に応答して、Ｂ１ｂ細胞上で上方制御される。Ｂ１ａ細胞と同様に、Ｂ１ｂ細胞は通常、脾臓及び腹膜空などの特定の身体の場所に存在し、血液中では非常に少ない。Ｂ１ｂ分泌型天然ＩｇＭは通常、約２～３週間以内にクリアランスされ、その時点で、免疫系は、以前に投与された抗原に対して比較的ナイーブになる。同じ抗原が、この期間後（例えば、最初の曝露の約３週間後）に提示された場合、抗原は、急速にクリアランスされない。しかし、重大なことに、抗原がその期間内（例えば、１週間以内または数日以内を含む２週間以内）に提示される場合、抗原は急速にクリアランスされる。連続投与間の遅延により、特定の脂質含有治療薬または診断薬が使用に適さなくなる。
いくつかの実施形態では、Ｂ１ａ及び／またはＢ１ｂ細胞活性化を遮断することが望ましい。Ｂ１ａ及び／またはＢ１ｂ細胞活性化を遮断するための１つの方策は、脂質ナノ粒子のどの構成成分がＢ細胞活性化を促進するのかを決定し、それらの構成成分を中和することを含む。少なくともＰＥＧ及びホスファチジルコリン（ＰＣ）が、Ｂ１ａ及びＢ１ｂ細胞の他の細胞との相互作用及び／または活性化に寄与することが、本明細書では発見されている。ＰＥＧは、活性化をもたらし得る、Ｂ１細胞及び血小板の間の凝集を促進するのに関与し得る。ＰＣ（ＬＮＰ中のヘルパー脂質）は、おそらくＢ細胞表面上のＣＤ３６受容体との相互作用により、Ｂ１細胞の活性化にも関与する。多数の粒子は、ＰＥＧ脂質代替物、ＰＥＧレス、及び／またはＰＣ置換脂質（例えば、オレイン酸またはそのアナログ）がデザイン及び試験されている。別の方法では反復投与時にＡＢＣを促進することになるＬＮＰ内のこれらの１つ以上の構成成分の置換が、天然ＩｇＭの産生及び／またはＢ細胞活性化を低減させることによりＡＢＣを予防するのに有用であることを、出願人は確立している。従って、本発明は、Ｂ細胞トリガーの包含を排除するデザインの結果としてＡＢＣを低減させているＬＮＰを包含する。
Ｂ１ａ及び／またはＢ１ｂ細胞活性化を遮断するための別の方策は、ＬＮＰにより誘導される免疫応答を阻害する薬剤を使用することを含む。これらのタイプの薬剤は、以下でより詳細に検討される。いくつかの実施形態では、これらの薬剤は、Ｂ１ａ／Ｂ１ｂ細胞とＬＮＰまたは血小板またはｐＤＣの間の相互作用を遮断する。例えば、薬剤は、抗体または相互作用を物理的に遮断する他の結合剤であってよい。この一例は、ＣＤ３６またはＣＤ６に結合する抗体である。薬剤は、Ｂ１ａ／Ｂ１ｂ細胞が、一旦、活性化されるか、または活性化される前に、シグナル伝達することを防止または抑制する化合物であってもよい。例えば、ＬＮＰまたは他の免疫細胞とのＢ細胞の相互作用からもたらされるＢ１ａ／Ｂ１ｂシグナル伝達カスケード中の１つ以上の構成要素を遮断することが可能である。他の実施形態では、薬剤は、活性化後に、Ｂ１ａ／Ｂ１ｂ細胞により産生される１つ以上のエフェクターに作用し得る。これらのエフェクターは、例えば、天然ＩｇＭ及びサイトカインを含む。
本発明の態様によれば、ｐＤＣ細胞の活性化が遮断される時、ＬＮＰに応答するＢ細胞活性化を減少させることが示されている。従って、ＡＢＣ及び／または毒性を回避するために、ｐＤＣ活性化を防止することが望ましいことがある。上記の方策と同様に、ｐＤＣ細胞活性化は、ｐＤＣとＬＮＰ及び／またはＢ細胞／血小板の間の相互作用を阻害する薬剤により遮断され得る。あるいは、ｐＤＣに作用して活性化される能力を抑制するか、またはエフェクターに作用する薬剤は、ＬＮＰと共に使用してＡＢＣを回避することができる。
血小板は、ＡＢＣ及び毒性においても重要な役割を果たし得る。ＬＮＰの初回用量が対象に投与された後に非常に迅速に、血小板は、ＬＮＰと会合し、凝集し、活性化される。いくつかの実施形態では、血小板凝集及び／または活性化を遮断することが望ましい。血小板凝集及び／または活性化を抑制するための１つの方策は、脂質ナノ粒子のどの構成成分が血小板凝集及び／または活性化を促進するかを決定し、それらの構成成分を中和することを含む。本明細書では、少なくともＰＥＧは、血小板凝集、活性化、及び／または他の細胞との相互作用に寄与することが発見されている。多数の粒子は、ＰＥＧ脂質代替物を有し、ＰＥＧレスは、デザイン及び試験されている。別の方法では反復投与時にＡＢＣを促進することになるＬＮＰ内のこれらの１つ以上の構成成分の置換が、天然ＩｇＭの産生及び／または血小板凝集を低減させることによりＡＢＣを予防するのに有用であることを、出願人は確立している。従って、本発明は、血小板トリガーの包含を排除するデザインの結果としてＡＢＣを低減させているＬＮＰを包含する。あるいは、活性化されると、血小板に作用して活性を抑制するか、またはエフェクターに作用する薬剤は、ＬＮＰと共に使用してＡＢＣを回避することができる。
（ｉ）ＡＢＣ活動及び関連活性の測定
ＬＮＰを含む本明細書で提示される種々の化合物及び組成物は、ｉｎ ｖｉｖｏ投与時にＡＢＣ活性を促進しない。これらのＬＮＰは、任意の数のアッセイ、例えば、限定されないが、以下に記載されるもの、のうちのいずれか、及び実施例の方法のサブセクションを含む、実施例セクションに開示のアッセイのいずれかにより、特性決定し、且つ／または同定し得る。
いくつかの実施形態では、この方法は、ＡＢＣを促進する免疫応答を生ずることなくＬＮＰを投与することを含む。ＡＢＣを促進する免疫応答は、１つ以上のセンサー、例えば、Ｂ１細胞、ｐＤＣ、または血小板、及び１つ以上のエフェクター、例えば、天然ＩｇＭ、天然ＩｇＧ、またはＩＬ６などのサイトカインの活性化を含む。従って、ＡＢＣを促進する免疫応答を生じることないＬＮＰの投与は少なくとも、１つ以上のセンサーの著しい活性化及び１つ以上のエフェクターの著しい産生のないＬＮＰの投与を最低限含む。本文脈中で使用される「著しい」は、ＡＢＣ誘発ＬＮＰの２回目の投与の場合に予想される血液クリアランスのレベルに対して、２回目の用量の全部または一部の血液クリアランスが促進されるという生理学的結果をもたらす量を指す。例えば、第２の投与後に観察されるＡＢＣが、ＡＢＣ誘発ＬＮＰの場合に予測されているものよりも低くなるように、免疫応答を減衰させるべきである。
（ｉｉ）Ｂ１ａまたはＢ１ｂ活性化アッセイ
本開示で提供されるある特定の組成物は、Ｂ細胞、例えば、Ｂ１ａまたはＢ１ｂ細胞（ＣＤ１９＋ ＣＤ５＋）及び／または従来のＢ細胞（ＣＤ１９＋ ＣＤ５－）、を活性化しない。Ｂ１ａ細胞、Ｂ１ｂ細胞、または従来のＢ細胞の活性化は、いくつかの方法で決定され得、これらのいくつかは、以下に提示される。Ｂ細胞集団は、分別Ｂ細胞集団または脾細胞または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の未分画集団として提供され得る。後者の場合、細胞集団は、一定の期間、選択すべきＬＮＰとインキュベートされ、その後、さらなる分析のために採取され得る。あるいは、上清は、採取及び分析され得る。
（ｉｉｉ）活性化マーカー細胞表面発現の上方制御
Ｂ１ａ細胞、Ｂ１ｂ細胞、または従来のＢ細胞の活性化は、ＣＤ８６などの後期活性化マーカーを含むＢ細胞活性化マーカーの発現の増加として示され得る。例示的な非限定的なアッセイでは、未分画Ｂ細胞は、脾細胞集団として、またはＰＢＭＣ集団として提供され、特定の期間、選択されたＬＮＰと共にインキュベートされ、次に、ＣＤ１９などの標準的なＢ細胞マーカー及びＣＤ８６などの活性化マーカーについて染色され、例えば、フローサイトメトリーを使用して分析される。好適な陰性対照は、培地を用いて同じ集団をインキュベートすること、次に、同じ染色及び可視化のステップを実施することを含む。陰性対照と比較して、試験集団におけるＣＤ８６発現の増加は、Ｂ細胞活性化を示す。
（ｉｖ）前炎症性サイトカイン放出
Ｂ細胞活性化は、サイトカイン放出アッセイによっても評価され得る。例えば、活性化は、目的のＬＮＰと共に曝露された時の、ＩＬ－６及び／またはＴＮＦ－アルファなどのサイトカインの産生及び／または分泌を介して評価され得る。
そのようなアッセイは、当該技術分野で周知の所定のサイトカイン分泌アッセイを使用して実施され得る。サイトカイン分泌の増加は、Ｂ細胞活性化を示す。
（ｖ）Ｂ細胞によるＬＮＰ結合／会合及び／または取り込み
Ｂ細胞へのＬＮＰ会合または結合は、目的のＬＮＰを評価し、さらに、そのようなＬＮＰを特徴付けるために使用され得る。会合／結合及び／または取り込み／内在化は、検出可能に標識された、例えば、蛍光標識されたＬＮＰを使用し、種々の期間のインキュベーション後のＢ細胞内またはＢ細胞上のそのようなＬＮＰの場所を追跡して評価され得る。
本明細書で提示される組成物が、認識または検出、及び任意に、循環ＩｇＭ及び／または急性期タンパク質（例えば、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ））などの急性期応答メディエーターなどのＡＢＣの下流のメディエーターにより結合することを回避することが可能になり得ることを、本発明はさらに考察する。
（ｖｉ）ＡＢＣを低減させるための使用方法
ＡＢＣを促進することなく対象に治療薬などの薬剤を封入し得るＬＮＰを送達するための方法も本明細書で提供される。
いくつかの実施形態では、本方法は、ＡＢＣを促進せず、例えば、ＬＮＰに結合する天然ＩｇＭの産生を誘導せず、Ｂ１ａ及び／またはＢ１ｂ細胞を活性化しない、本明細書に記載のＬＮＰのいずれかを投与することを含む。本明細書で使用される場合、「ＡＢＣを促進しない」ＬＮＰは、実質的なＡＢＣをもたらす免疫応答を誘導しないか、または実質的なＡＢＣをもたらすには不十分な実質的に低いレベルの免疫応答を誘導するＬＮＰを指す。ＬＮＰに結合する天然ＩｇＭの産生を誘導しないＬＮＰは、ＬＮＰに結合する天然ＩｇＭまたは実質的なＡＢＣをもたらすには不十分な実質的に低いレベルの天然ＩｇＭ分子を誘導するＬＮＰを指す。Ｂ１ａ及び／またはＢ１ｂ細胞を活性化しないＬＮＰは、ＬＮＰに結合する天然ＩｇＭを産生するＢ１ａ及び／もしくはＢ１ｂ細胞の応答を誘導しないか、または実質的なＡＢＣをもたらすには不十分な実質的に低いレベルのＢ１ａ及び／もしくはＢ１ｂ細胞応答を誘導するＬＮＰを指す。
いくつかの実施形態では、産生を活性化しない及び誘導しないという用語は、参照値または状態に対する相対的な低減である。いくつかの実施形態では、参照値または条件は、ＭＣ３ ＬＮＰなどの標準的なＬＮＰによるＩｇＭなどの分子の産生の活性化または誘導の量である。いくつかの実施形態では、相対的な低減は、少なくとも３０％、例えば、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の低減である。他の実施形態では、Ｂ細胞などの細胞を活性化しない及びＩｇＭなどのタンパク質の産生を誘導しないという用語は、検出不可能な量の活性細胞または具体的なタンパク質を指し得る。
（ｖｉｉ）血小板の効果及び毒性
本発明は、部分的に、ＬＮＰ投与に関連する用量制限毒性の根底にある機序の解明をさらに前提とする。そのような毒性は、凝固障害、急性または慢性かどうかに関わらず、播種性血管内凝固（ＤＩＣ、消耗性凝固障害とも呼ばれる）及び／または血管血栓症を含み得る。いくつかの場合では、ＬＮＰに関連する用量制限毒性は、急性期応答（ＡＰＲ）または補体活性化関連偽アレルギー（ＣＡＲＰＡ）である。
本明細書で使用される場合、凝固障害は、ｉｎ ｖｉｖｏでの凝固（血液凝固）の増加を指す。本開示で報告される知見は、そのような凝固の増加と一致し、根本的な機序についての洞察を大幅に提供する。凝固は、多数の異なる因子及び細胞型を含むプロセスであり、従来、ＬＮＰ及び血小板の間の関係及び相互作用は、この点に関しては理解されていない。本開示は、そのような相互作用の証拠を提供し、血小板会合の低減、血小板凝集の低減、及び／または血小板凝集の低減を含む、血小板効果の低減を有するように改変される化合物及び組成物を提供する。そのような血小板効果を、好ましくは、下方調節する能力を含む調節する能力、ＬＮＰ投与後の凝固障害の発生率及び／または重症度を低減することができる。これは、順次、そのようなＬＮＰに関連する毒性を低減させ、それにより、より高い用量のＬＮＰ、重要なことに、それらのカーゴが、それを必要とする患者に投与されることが可能になる。
ＣＡＲＰＡは、ナノ医薬品及び生物製剤により誘発され得る、過敏反応（ＨＳＲ）に現れる急性免疫毒性のクラスである。アレルギー反応とは異なり、ＣＡＲＰＡは通常、ＩｇＥを含まないが、病原体を除去する身体の能力を増強する自然免疫系の一部である補体系の活性化の結果として生じる。以下の経路、すなわち古典補体経路（ＣＰ）、副経路（ＡＰ）、及びレクチン経路（ＬＰ）のうちの１つ以上がＣＡＲＰＡに関与し得る。Ｓｚｅｂｅｎｉ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６１：１６３－１７３（２０１４）。
古典経路は、Ｃ１ｑ、Ｃ１ｒ、Ｃ１ｓ、またはＣ１ｑｒ２ｓ２を含有するＣ１複合体の活性化により誘発される。Ｃ１複合体の活性化は、Ｃ１ｑが抗原と複合化されたＩｇＭまたはＩｇＧに結合する時、またはＣ１ｑが病原体の表面に直接結合する場合に生じる。そのような結合は、Ｃ１ｒの活性化をもたらし、次いでＣ１ｓを切断するＣ１ｑ分子の立体配座変化をもたらす。ここで、Ｃ１ｒ２ｓ２構成要素は、Ｃ４、次にＣ２を分解して、Ｃ４ａ、Ｃ４ｂ、Ｃ２ａ、及びＣ２ｂを生じる。Ｃ４ｂ及びＣ２ｂは結合して、古典経路Ｃ３転換酵素（Ｃ４ｂ２ｂ複合体）を形成し、Ｃ３のＣ３ａ及びＣ３ｂへの開裂を促進する。次に、Ｃ３ｂは、Ｃ３転換酵素と結合して、Ｃ５転換酵素（Ｃ４ｂ２ｂ３ｂ複合体）を形成する。副経路は、自発的なＣ３加水分解の結果として、連続的に活性化される。因子Ｐ（プロパージン）は、副経路の正の制御因子である。プロペルジンのオリゴマー化は、Ｃ３転換酵素を安定化させ、次に、これは、より多くのＣ３を切断することができる。Ｃ３分子は、表面に結合し、より多くのＢ、Ｄ、及びＰ活性を動員して、補体活性化の増幅をもたらすことができる。
急性期反応（ＡＰＲ）は、感染の予防及び潜在的な病原体のクリアランスのための複雑な全身免疫応答である。多数のタンパク質がＡＰＲに関与しており、Ｃ反応性タンパク質は、十分に特性決定されたタンパク質である。
本発明によれば、ある特定のＬＮＰは、ｉｎ ｖｉｖｏ投与のほぼ直後に、血小板と物理的に会合することができるが、他のＬＮＰは、血小板と全く会合しないか、またはバックグラウンドレベルでのみ会合することが見出されている。重大なことに、血小板と会合するＬＮＰは、その後形成される血小板凝集も明らかに安定化させる。血小板の特定のＬＮＰとの物理的接触は、そのような血小板が、凝集したままか、または投与後の長期間にわたり凝集体を継続的に形成する能力と相関する。そのような凝集体は、活性化血小板、さらに、マクロファージ及びＢ細胞などの自然免疫細胞も含む。
２５．使用方法
本明細書に記載のポリヌクレオチド、医薬組成物、及び製剤は、ＰＢＧＤ関連疾患、障害、または状態を処置及び／または予防するために、調製、製造、及び治療用途に使用される。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、組成物、及び製剤は、ＡＩＰを治療するために使用される。ＡＩＰ患者は、急性発作に罹患している可能性があり、急性発作（例えば、重度の疼痛）の間または後に治療することができる。再発する発作、例えば、１年に数回の発作を有する患者は、「予防的に」、すなわち、再発性発作のリスク低減する及び／または予防するために処置することができる。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物、及び製剤は、それを必要とする対象のポルフォビリノゲンのレベルを低減させるための方法に使用される。例えば、本発明の一態様は、ＰＢＧＤをコードするポリヌクレオチドを含む組成物または製剤（例えば、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするｍＲＮＡ）を対象に投与することを含む、対象のＡＩＰの徴候または症状を緩和する方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物、及び製剤は、ＡＩＰに関連する代謝産物（例えば、基質または産物、すなわち、ヒドロキシメチルビランまたはポルフォビリノゲン）のレベルを低減させるために使用され、方法は、ＰＢＧＤポリペプチドをコードする有効量のポリヌクレオチドを対象に投与することを含む。
いくつかの実施形態では、有効量の本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物、または製剤の投与は、ＡＩＰのバイオマーカー、例えば、ポルフォビリノゲン（ＰＢＧ）、アミノレブリン酸（ＡＬＡ）、ポルフィリン、アラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ）、ビリルビン、またはそれらの任意の組み合わせ、のレベルを低減させる。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物、または製剤の投与は、本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物、または製剤の投与後の短期間内（例えば、約６時間以内、約８時間以内、約１２時間以内、約１６時間以内、約２０時間以内、または約２４時間以内）に、ＡＩＰの１つ以上のバイオマーカー、例えば、ポルフォビリノゲン、のレベルの低減をもたらす。
補充療法は、ＡＩＰの可能な治療である。従って、本発明のある特定の態様では、本明細書に開示のポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡは、ＡＩＰの遺伝子補充療法での使用に適するＰＢＧＤポリペプチドをコードする１つ以上の配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡを、対象に提供することにより、対象のＰＢＧＤもしくはＰＢＧＤ活性の不足、またはＰＢＧＤ活性の減少もしくは異常を治療する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列最適化される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ＰＢＧＤポリペプチドをコードする核酸配列（例えば、ＯＲＦ）を含む、核酸は、例えば、そのＧ／Ｃ、ウリジン、もしくはチミジン含有量を改変することにより配列最適化され、及び／またはポリヌクレオチドは、少なくとも１つの化学修飾ヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、ｍｉＲＮＡ－１４２に結合するｍｉＲＮＡ結合部位及び／またはｍｉＲＮＡ－１２６に結合するｍｉＲＮＡ結合部位、を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドを含む組成物もしくは製剤、本発明の医薬組成物または製剤の対象への投与は、組成物または製剤の投与前に観察されたレベルよりも、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％低いレベルまでの、細胞内のポルフォビリノゲンの減少がもたらされる。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物、または製剤の投与は、対象の細胞内におけるＰＢＧＤタンパク質の発現をもたらす。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物、または製剤を投与すると、対象でのＰＢＧＤ発現及び／または酵素活性の増加がもたらされる。例えば、いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む組成物または製剤を対象に投与する方法に使用され、方法は、対象の少なくとも一部の細胞においてＰＢＧＤ発現及び／または酵素活性の増加をもたらす。
いくつかの実施形態では、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む組成物または製剤の対象への投与は、正常対象、例えば、ＡＩＰに罹患していないヒト、で予想される発現及び／または活性レベルの、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または、１００％以上のレベルまでの、対象の細胞におけるＰＢＧＤ発現及び／または酵素活性の増加をもたらす。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物、または製剤の投与は、著しいポルフォビリノゲン代謝を生じさせるのに十分な期間持続する対象の細胞の少なくとも一部におけるＰＢＧＤタンパク質の発現をもたらす。
いくつかの実施形態では、コードされたポリペプチドの発現及び／または酵素活性が増加する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、細胞内のＰＢＧＤ発現及び／または酵素活性レベルを、これらの細胞に導入された時に、ポリペプチドが細胞内に導入される前の細胞内のＰＢＧＤ発現及び／または酵素活性レベルに対して、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％増加させる。
いくつかの実施形態では、方法または使用は、配列番号９～３３及び８９～１１７の群から選択されるポリヌクレオチド（表２を参照のこと）、または配列番号１１８～１４８、例えば、１３３、１４１、１４４、もしくは１４５からなる群から選択されるポリヌクレオチド（表５を参照のこと）と配列類似性を有するヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡを投与することを含み、ポリヌクレオチドは、ＰＢＧＤポリペプチドをコードする。
本開示の他の態様は、ポリヌクレオチドを含有する細胞の哺乳動物対象への移植に関する。細胞の哺乳動物対象への投与は、当業者らに既知であり、局所移植（例えば、局所もしくは皮下投与）、器官送達、または全身注射（例えば、静脈内注射もしくは吸入）、及び薬学的に許容される担体中の細胞の製剤化を含むが、これらに限定されない。
本開示は、必要とする対象、例えばＡＩＰを有する対象の肝ＰＢＧＤ活性（例えば、ｐｍｏｌウロポルフィリノゲン／ｍｇタンパク質／時間として表される）を増加させる方法を提供し、方法は、本明細書に開示のＰＢＧＤポリペプチド、例えば、ヒトＰＢＧＤアイソフォームまたはその変異体（例えば、機能獲得ＳＭ二重変異体）、またはヒトＰＢＧＤアイソフォームを含む融合タンパク質もしくはその変異体（例えば、ＰＢＧＤ部分及びヒトアポリポタンパク質Ａ１部分を含む融合タンパク質）、をコードするｍＲＮＡを含む治療的有効量の組成物または製剤を対象に投与することを含む。
いくつかの態様では、必要とする対象、例えばＡＩＰを有する対象への投与後に測定される肝ＰＢＧＤ活性は、少なくとも健常ヒト対象で観察される正常なＰＢＧＤ活性レベルである。いくつかの態様では、健常ヒト対象で観察されるそのような正常なＰＢＧＤ活性レベルは、５±０．２単位（ｐｍｏｌウロポルフィリノゲン／ｍｇタンパク質／時間単位）である。いくつかの態様では、投与後に測定される肝ＰＢＧＤ活性は、ＡＩＰ患者、例えば、未治療のＡＩＰ患者で観察されるＰＢＧＤ活性レベルよりも高い。いくつかの態様では、ＡＩＰ患者で観察される肝ＰＢＧＤ活性レベルは、２±０．２単位（ｐｍｏｌウロポルフィリノゲン／ｍｇタンパク質／時間単位）である。いくつかの態様では、本明細書に開示のＰＢＧＤポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む治療的有効量の組成物または製剤を対象に投与した後の、それを必要とする対象、例えば、ＡＩＰを有する対象、での肝ＰＢＧＤ活性の増加（例えば、ｐｍｏｌウロポルフィリノゲン／ｍｇタンパク質／時間）は、（ｉ）健常ヒト対象で観察される正常なＰＢＧＤ活性レベル、または、（ｉｉ）ＡＩＰ患者、例えば未処置のＡＩＰ患者で観察されるＰＢＧＤ活性レベルよりも、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、または１０ｐｍｏｌウロポルフィリノゲン／ｍｇタンパク質／時間単位大きい。いくつかの態様では、本明細書に開示のＰＢＧＤポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む組成物または製剤を対象に投与した後の（例えば、単回用量の投与後の）、ＡＩＰ患者（例えば、約２ｐｍｏｌウロポルフィリノゲン／ｍｇタンパク質／時間単位）で観察されるＰＢＧＤ活性レベルを超える肝ＰＢＧＤ活性の増加は、少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、または１０日間維持される。
ＡＩＰ発作が起こる時、ポルフィリン前駆体ＡＬＡ（アミノレビリナート）及びＰＢＧ（ポルフォビリノゲン）の蓄積がある。ＡＬＡ及びＰＢＧは、当該技術分野で既知の方法を使用して、尿中で測定することができる。本開示は、本明細書に開示のＰＢＧＤポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む治療的有効量の組成物または製剤を対象に投与することを含む、必要とする対象、例えば、未治療ＡＩＰ患者のＡＬＡレベルを減少させる方法も提供する。いくつかの態様では、ＡＬＡレベルは、尿中ＡＬＡ排泄レベルである。本明細書に開示のＰＢＧＤポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む治療的有効量の組成物または製剤を対象に投与することを含む、必要とする対象、例えば、未処置のＡＩＰ患者のＰＢＧレベルを減少させる方法もまた提供される。いくつかの態様では、ＰＢＧレベルは、尿中ＰＢＧ排泄レベルである。
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に開示のＰＢＧＤポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む治療的有効量の組成物または製剤を対象に投与することを含む、ＡＩＰに罹患する対象を、ＡＩＰ発作におけるヘム前駆体（例えば、ＡＬＡ及び／またはＰＢＧ）の増加から防御する方法を提供する。本明細書に開示のＰＢＧＤポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む治療的有効量の組成物または製剤を対象に投与することを含む、ＡＩＰに罹患している対象におけるヘム前駆体（例えば、ＡＬＡ及び／またはＰＢＧ）の蓄積を低減させる方法もまた提供される。
本開示は、本明細書に開示のＰＢＧＤポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む治療的有効量の組成物または製剤を対象に投与することを含む、ＡＩＰ患者の疼痛を治療、予防、または改善する方法も提供する。いくつかの態様では、本明細書に開示のＰＢＧＤポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む治療的有効量の組成物または製剤をＡＩＰに罹患する対象に投与すると、疼痛の低減がもたらされる。いくつかの態様では、疼痛の低減が完全である（疼痛の解消）。いくつかの態様では、疼痛は、重度の疼痛である。
本明細書に開示のＰＢＧＤポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む治療的有効量の組成物または製剤を対象に投与することを含む、ＡＩＰ患者の神経障害の治療、予防、または改善する方法もまた提供される。いくつかの態様では、本明細書に開示のＰＢＧＤポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む治療的有効量の組成物または製剤をＡＩＰに罹患する対象に投与すると、神経障害の低減がもたらされる。いくつかの態様では、神経障害の低減が完全である（神経障害の解消）。いくつかの態様では、神経障害は、末梢神経障害である。
本明細書に開示のＰＢＧＤポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む治療的有効量の組成物または製剤を対象に投与することを含む、ＡＩＰ患者の生存を増加させる方法もまた提供される。
いくつかの態様では、本明細書に開示のＰＢＧＤポリペプチドをコードするｍＲＮＡの用量は、少なくとも約０．１ｎｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも約０．２ｎｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも約０．３ｎｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも約０．４ｎｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも約０．５ｎｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも約０．６ｎｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも約０．７ｎｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも約０．８ｎｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも約０．９ｎｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも約１ｎｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも約１．１ｎｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも約１．２ｎｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも約１．３ｎｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも約１．４ｎｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも約１．５ｎｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも約１．６ｎｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも約１．７ｎｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも約１．８ｎｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも約１．９ｎｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも約２ｎｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも約２．５ｎｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも約３ｎｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも約３．５ｎｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも約４ｎｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも約４．５ｎｍｏｌ／ｋｇ、または少なくとも約５ｎｍｏｌ／ｋｇである。いくつかの態様では、本明細書に開示のＰＢＧＤポリペプチドをコードするｍＲＮＡの用量は、少なくとも約０．０５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．３ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．３５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．４５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．５５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．７ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．７５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．８５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．９ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．９５ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも約１ｍｇ／ｋｇである。
本明細書に開示の方法のいくつかの態様では、ＡＩＰ患者は、無症候性患者である。
いくつかの実施形態では、本発明の方法で使用されるポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）、医薬組成物、及び製剤は、本明細書に開示のＰＢＧＤポリペプチドをコードするウラシル修飾配列及び本明細書に開示のｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、ｍｉＲ－１４２に結合するｍｉＲＮＡ結合部位及び／またはｍｉＲ－１２６に結合するｍｉＲＮＡ結合部位、を含む。いくつかの実施形態では、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするウラシル修飾配列は、少なくとも１つの化学修飾核酸塩基、例えば、５－メトキシウラシル、を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＰＢＧＤポリペプチドをコードするウラシル修飾配列中の１種の核酸塩基（例えば、ウラシル）の少なくとも９５％は、修飾核酸塩基である。いくつかの実施形態では、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするウラシル修飾配列中のウルシルの少なくとも９５％は、５－メトキシウリジンである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、例えば、式（Ｉ）を有する化合物、例えば、化合物１～２３２のいずれか、例えば、化合物１８、式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、もしくは（ＶＩ）を有する化合物、例えば、化合物２３３～３４２のいずれか、例えば、化合物２３６、または式（ＶＩＩＩ）を有する化合物、例えば、化合物４１９～４２８のいずれか、例えば、化合物４２８、あるいはそれらの任意の組み合わせ、を含む送達剤と共に製剤化される。いくつかの実施形態では、送達剤は、化合物１８、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物４２８を、例えば、約５０：１０：３８．５：１．５のモル比で含む。
本発明の薬剤または処置の治療効果は、対象（例えば、前臨床試験対象（齧歯動物、霊長動物など）または臨床対象（ヒト））から取られた試料（複数可）中のコードされたタンパク質（例えば、酵素）の発現のレベルを測定することにより、特性決定または決定することができることを、当業者は理解するであろう。同様に、本発明の薬剤または処置の治療効果は、対象（例えば、前臨床試験対象（齧歯動物、霊長動物など）または臨床対象（ヒト））から取られた試料（複数可）中のコードされたタンパク質（例えば、酵素）の活性のレベルを測定することにより、特性決定または決定することができる。さらに、本発明の治療的有効性の薬物または処置は、対象から取られた試料（複数可）中の適切なバイオマーカーのレベルを測定することにより、特性決定または決定することができる。タンパク質及び／またはバイオマーカーのレベルは、本発明のｍＲＮＡ治療薬の単回投与で投与後に、決定することができ、または単回用量で投与後のいくつかの時点で、決定及び／もしくは監視することができ、または処置、例えば、複数回投与の処置、の経過を通して、決定及び／もしくは監視することができる。
ＡＩＰは、急性発症及び無症状期を特徴とする。従って、ＡＩＰ患者は、無症候性保因者であるか、または再発性急性発作に罹患する可能性がある。ＡＩＰ患者は一般に、高アミノレブリン酸（ＡＬＡ）及びポルフォビリノゲン（ＰＢＧ）の血中及び尿中レベルを示し、その濃度は、急性発作中にさらに増加する。別途明記のない限り、本明細書に開示のＡＩＰ患者またはヒト対象を治療する方法は、急性間欠性ポルフィリン症（ＡＩＰ）の遺伝的変異を保有し、上昇したレベルのバイオマーカー、例えば、ＡＬＡ及びＰＢＧを有する無症候性「高排泄」（ＡＳＨＥ）患者と、ならびに再発性急性発作患者の両方の治療を含む。
ＰＢＧＤタンパク質発現レベル
本発明の特定の態様は、対象、例えば、動物（例えば、齧歯動物、霊長類など）またはヒト対象の発現レベルまたはポルフォビリノゲン脱アミノ酵素（ＰＢＧＤ）タンパク質のレベルを測定すること、決定すること、及び／または監視することを特徴とする。動物は、正常、健常、または野生型動物、ならびに急性間欠性ポルフィリン症（ＡＩＰ）及びその治療の理解に使用される動物モデルを含む。例示的な動物モデルは、齧歯動物モデル、例えば、ＡＩＰマウスとも呼ばれるＰＢＧＤ欠損マウスを含む。ＡＩＰマウスは、ＰＢＧＤ遺伝子の２つの異なる分裂の化合物のヘテロ接合体：Ｔ１株［Ｃ５７ＢＬ／６－ｐｂｇｄｔｍ１（ｎｅｏ）Ｕａｍ及びＴ２株（Ｃ５７ＢＬ／６－ｐｂｇｄｔｍ２（ｎｅｏ）Ｕａｍ］（Ｌｉｎｄｂｅｒｇ ＲＬ，ｅｔ ａｌ．”Ｐｏｒｐｈｏｂｉｌｉｎｏｇｅｎ ｄｅａｍｉｎａｓｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ ｍｉｃｅ ｃａｕｓｅｓ ａ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ ｒｅｓｅｍｂｌｉｎｇ ｔｈａｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｉｃ ｐｏｒｐｈｙｒｉａ．”Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．１９９６；１２：１９５－１９９）である。急性ポルフィリン症の発作は、ＡＩＰマウスのフェノバルビタール負荷により誘発される。フェノバルビタール負荷を受けたＡＩＰマウスは、ＡＩＰに生化学的に類似した症状、例えば、ポルフィリン前駆体の誘導、を呈し、ＡＩＰを有するヒト対象のものに似ている物理的徴候や症状を発症する。
ＰＢＧＤタンパク質発現レベルは、生体試料、例えば、針肝生検、中のタンパク質レベルを決定するための当該技術分野で認識されている任意の方法により、測定または決定することができる。本明細書で使用される「レベル」または「タンパク質のレベル」という用語は、好ましくは、試料または対象におけるタンパク質の重量、質量、または濃度を意味する。ある特定の実施形態では、試料が、例えば、以下の：精製、沈殿、分離、例えば、遠心分離及び／またはＨＰＬＣのいずれかに供されることがあり、続いて、例えば、質量分析及び／または分光分析を使用して、タンパク質のレベルの決定に供されることを、当業者は理解するであろう。例示的な実施形態では、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を、タンパク質発現レベルを決定するために使用することができる。他の例示的な実施形態では、タンパク質精製、分離、及びＬＣ－ＭＳを、本発明によるタンパク質のレベルを決定するための手段として使用することができる。いくつかの実施形態では、本発明のｍＲＮＡ療法（例えば、単回静脈内投与）は、ｍＲＮＡ療法の単回用量の投与後少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、少なくとも６０時間、少なくとも７２時間、少なくとも８４時間、少なくとも９６時間、少なくとも１０８時間、少なくとも１２２時間にわたって、対象の肝臓組織におけるＰＢＧＤタンパク質発現レベルの増加をもたらす（例えば、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍の増加及び／または正常レベルの少なくとも５０％、少なくとも６０倍％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％に増加する）。
ＰＢＧＤタンパク質活性
ＡＩＰ患者では、ＰＢＧＤ酵素活性が、例えば、正常値の約５０％に低減される。本発明のさらなる態様は、対象、例えば、動物（例えば、齧歯動物、霊長類など）またはヒト対象のＰＢＧＤタンパク質の活性レベル（複数可）（すなわち、酵素活性のレベル（複数可））の測定、決定、及び／または監視を特徴とする。活性レベルは、生体試料中の酵素活性レベルを決定するための任意の当該技術分野で認識されている方法により測定または決定することができる。本明細書で使用される「活性レベル」または「酵素活性レベル」という用語は、好ましくは、試料または試料中の全タンパク質の体積、質量、または質量当たりの酵素の活性を意味する。例示的な実施形態では、「活性レベル」または「酵素活性レベル」は、分泌液（例えば、体液、例えば、血清、血漿、尿など）のミリリットル当たりの単位に関して記載されるか、または、組織の重量当たり、もしくは試料内のタンパク質（例えば、総タンパク質）の重量当たりの単位に関して記載される。酵素活性の単位（「Ｕ」）は、単位時間当たり加水分解される基質の重量または質量に関して記載することができる。本発明の例示的な実施形態は、Ｕ／ｍｌ血漿またはＵ／ｍｇタンパク質（組織）に関して記載されるＰＢＧＤ活性を特徴とし、単位（「Ｕ」）は、１時間当たりのｎｍｏｌ加水分解される基質（またはｎｍｏｌ／ｈｒ）で記載される。例示的な酵素アッセイは、ウロポルフィリン産生（ＵＲＯ）を特徴とする。組織（例えば、肝臓）中のＰＢＧＤ活性は、例えば、１時間当たりタンパク質１ｍｇ当たり産生されるウロポルフィリンのｐｍｏｌとして、定量することができる。
例示的な実施形態では、本発明のｍＲＮＡ療法は、投与の６～１２時間後、または１２～２４時間後、２４～４８後、または４８～７２時間後（例えば、投与の４８もしくは７２時間後）に、組織（例えば、肝臓）中のＰＢＧＤ活性の少なくとも５Ｕ／ｍｇ、少なくとも１０Ｕ／ｍｇ、少なくとも２０Ｕ／ｍｇ、少なくとも３０Ｕ／ｍｇ、少なくとも４０Ｕ／ｍｇ、少なくとも５０Ｕ／ｍｇ、少なくとも６０Ｕ／ｍｇ、少なくとも７０Ｕ／ｍｇ、少なくとも８０Ｕ／ｍｇ、少なくとも９０Ｕ／ｍｇ、少なくとも１００Ｕ／ｍｇ、または少なくとも１５０Ｕ／ｍｇをもたらすのに有効なｍＲＮＡの用量を含む医薬組成物を特徴とする。
例示的な実施形態では、本発明のｍＲＮＡ療法は、上記レベルの活性をもたらすｍＲＮＡの単回静脈内投与を含む医薬組成物を特徴とする。別の実施形態では、本発明のｍＲＮＡ療法は、上記のレベルの活性を維持するｍＲＮＡの複数の単回単位の静脈内投与で投与することができる医薬組成物を特徴とする。
ＰＢＧＤバイオマーカー
本発明のさらなる態様は、例えば、同じ患者由来の、別の患者由来の、対照由来の、及び／または同じもしくは異なる時点の、別の試料中の同じまたは別のバイオマーカーのレベル（例えば、対照標準レベル）、ならびに／あるいは対照の生理学的レベル、及び／もしくは上昇したレベル、及び／もしくは超生理学的レベル、及び／または対象のレベルと比較して、試料中で測定されたバイオマーカー、例えば、尿中アミノレブリン酸（ＡＬＡ）排泄、尿中ポルフォビリノゲン（ＰＢＧ）排泄、尿中ポルフィリン排泄、血清中アミノ基転移酵素（例えば、アラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ）もしくはアスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ））及び／または血清中ビリルビンのレベル（複数可）を決定することを特徴とする。当業者は、バイオマーカーの生理学的レベル、例えば、正常または野生型動物、正常または健常対象などのレベル、特に、健常及び／または正常に機能する対象に特徴的なレベル（複数可）に精通しているであろう。本明細書で使用される場合、「上昇したレベル」という語句は、正常もしくは野生型前臨床動物または正常もしくは健常対象、例えば、ヒト対象に通常見出されるより多い量を意味する。本明細書で使用される場合、「超生理学的」という用語は、正常もしくは野生型前臨床動物または正常もしくは健常対象、例えば、ヒト対象に通常見出されるより多い量を意味し、任意に、著しく増強された生理学的応答を生じる。本明細書で使用される場合、「比較すること」または「比較する」という用語は、好ましくは、例えば、バイオマーカー（複数可）のレベルの２つ以上の値の数学的比較を意味する。従って、そのような値のうちの少なくとも２つが、互いに比較される場合、値のうちの１つが、別の値または値の群よりも高いか、低いか、またはこれと同一であるかどうかは、当業者には容易に明らかであろう。～と比較することまたは～との比較は、例えば、対照値と比較する、例えば、投与前の当該対象（例えば、ＡＩＰに罹患している者）または正常もしくは健常対象の対照標準である血清中ＡＬＴレベル、対照標準である血清中ＡＳＴレベル、及び／または対照標準である血清中ビリルビンレベルと比較される場合の文脈に存在することができる。～と比較することまたは～との比較は、例えば、対照値と比較する、例えば、投与前の当該対象（例えば、ＡＩＰに罹患している者）または正常もしくは健常対象の対照標準である尿中ＡＬＡ、ＰＢＧ、及び／またはポルフィリン排泄レベルと比較される場合の文脈に存在することができる。
本明細書で使用される場合、「対照」は、好ましくは、当該対象のＡＩＰ状態が既知の対象由来の試料である。一実施形態では、対照は、健常患者の試料である。別の実施形態では、対照は、既知のＡＩＰ状態、例えば、重度の、軽度の、または健康なＡＩＰ状態、を有する少なくとも１つの対象、例えば、対照患者、に由来の試料である。別の実施形態では、対照は、ＡＩＰの治療をされていない対象に由来の試料である。さらに別の実施形態では、対照は、単一の対象に由来の試料、または異なる対象に由来の試料のプール、及び／または異なる時点の対象（複数可）から取られた試料である。
本明細書で使用される「レベル」または「バイオマーカーのレベル」という用語は、好ましくは、試料または対象における本発明のバイオマーカーの質量、重量、または濃度を意味する。本発明のバイオマーカーは、例えば、アミノレブリン酸（ＡＬＡ）（例えば、約３．９ｍｍｏｌ ＡＬＡ／ｍｏｌ クレアチニン未満の正常尿中排泄レベル）、ポルフォビリノゲン（ＰＢＧ）（例えば、約１．６もしくは１．５ｍｍｏｌ ＰＢＧ／ｍｏｌ クレアチニンまたは０～４ｍｇ／Ｌ未満の正常尿中排泄レベル）、ポルフィリン（例えば、１４５μｇ／ｌ未満の正常な尿中排泄レベル）、アミノ基転移酵素（例えば、アラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ）（例えば、約１０～３５Ｕ／Ｌ未満の正常血清中レベル）またはアスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ）（例えば、約１５～４１Ｕ／Ｌの正常血清中レベル））、及び／あるいはビリルビン（例えば、約１．２ｍｇ／ｄｌの正常血清中レベル）を含む。ある特定の実施形態では、試料が、例えば、以下、物質の精製、沈殿、分離、例えば、遠心分離及び／またはＨＰＬＣ、のうちの１つ以上に供され、続いて、例えば、質量分析を使用したバイオマーカーのレベルの決定に供され得ることを、当業者は理解するであろう。例示的な実施形態では、ＬＣ－ＭＳは、本発明によるバイオマーカーのレベルを決定するための手段として使用することができる。
本発明のｍＲＮＡのある特定の実施形態は、（ｉ）投与後少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、もしくは少なくとも１２０時間にわたって、約２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、もしくは１ｍｍｏｌのＡＬＡ／ｍｏｌのクレアチニン未満まで、アミノレブリン酸（ＡＬＡ）の尿中排泄を低減させるのに十分なレベル、及び／または（ｉｉ）投与後少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、もしくは少なくとも１２０時間にわたって、約１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、もしくは１ｍｍｏｌのＰＢＧ／ｍｏｌのクレアチニン未満まで、ポルフォビリノゲン（ＰＢＧ）の尿中排泄を低減させるのに十分なレベルで、ＰＢＧＤポリペプチドを発現させるために使用することができる。
本明細書で使用されるバイオマーカーの「レベルを決定する」という用語は、対象由来の試料における、例えば、対象由来の体液（例えば、血清、血漿、尿、血液、リンパ、糞便など）における、または対象の組織（例えば、肝臓、心臓、脾臓、腎臓など）における少なくとも１つの物質の量を定量することを含む方法を意味することができる。
本明細書で使用される「参照レベル」という用語は、本発明のｍＲＮＡ療法の投与前の対象（例えば、ＡＩＰに罹患している者）または正常もしくは健常対象におけるレベル（例えば、バイオマーカーのもの）を指すことができる。
本明細書で使用される場合、「正常対象」または「健常対象」という用語は、ＡＩＰに関連する症状に罹患していない対象を指す。さらに、対象は、ＡＩＰと関連する症状をもたらす、（ヒドロキシメチルビラン合成酵素（ＨＭＢＳ）及びウロポルフィリノゲンＩ合成酵素とも呼ばれる）ポルフォビリノゲン脱アミノ酵素（ＰＢＧＤ）遺伝子の機能的部分またはドメインの変異、ならびに／または（ウロポルフィリノゲンＩ合成酵素もしくはヒドロキシメチルビラン合成酵素とも呼ばれる）酵素ＰＢＧＤもしくはその活性の低減もしくは欠損をもたらすＰＢＧＤ遺伝子の変異がない場合、正常（または健常）とみなされるであろう。当該変異は、対象由来の試料がそのようなＰＢＧＤ変異について遺伝子試験を受ける場合に検出されるであろう。本発明の例示的な実施形態では、健常対象由来の試料が対照試料として使用されるか、または、健常対象もくしは正常対象の試料のバイオマーカーのレベルに対する既知のもしくは標準化された値が対照として使用される。
いくつかの実施形態では、ＡＩＰの治療及び／もしくは急性ポルフィリン発作の予防を必要とする対象に由来の試料における、またはＡＩＰが治療されている対象における、バイオマーカーのレベルを、バイオマーカーの対照レベルと比較することは、（治療を必要とするか、またはＡＩＰが治療されている）対象に由来の試料におけるバイオマーカーのレベルを、ベースラインまたは対照標準レベルと比較することを含み、（治療を必要とするか、もしくはＡＩＰが治療されている）対象に由来の試料におけるバイオマーカーのレベルが、ベースラインもしくは対照標準レベルと比較して、上昇した、増加した、もしくは高い場合、これは、対象がＡＩＰに罹患し、及び／もしくは処置が必要であることを示しており、及び／または（治療を必要とするか、もしくはＡＩＰが治療されている）対象に由来の試料におけるバイオマーカーのレベルが、ベースラインレベルと比較して、減少した、もしくは低下した場合、これは、対象がＡＩＰに罹患していないか、ＡＰＩがうまく治療されているか、もしくはＡＩＰの治療を必要としないことを示している。ある特定の時間以内、例えば、６時間以内、１２時間以内、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、もしくは７２時間内に、及び／またはある特定の期間にわたって、例えば、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、１４４時間、１週間、２週間、３週間、４週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１８ヶ月、２４ヶ月にわたって、バイオマーカー、例えば、アミノレブリン酸（ＡＬＡ）、ポルフォビリノゲン（ＰＢＧ）、ポルフィリン、アミノ基転移酵素（例えば、アラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ）もしくはアスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ））及び／またはビリルビンのレベルの低減（例えば、少なくとも２分の１、少なくとも３分の１、少なくとも４分の１、少なくとも５分の１、少なくとも６分の１、少なくとも７分の１、少なくとも８分の１、少なくとも１０分の１、少なくとも２０分の１、少なくとも３０分の１、少なくとも４０分の１、少なくとも５０分の１の低減及び／または少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは少なくとも１００％の低減）が顕著なほど、例えば、本発明のｍＲＮＡ療法（例えば、単回用量または複数レジメン）などの療法がより成功する。
投与後の１日、２日、３日、４日、５日、６日またはそれ以上の日数以内の、特に、対象の体液（例えば、血漿、血清、尿、例えば、尿中沈降物）における、または組織（複数可）（例えば、肝臓、心臓、脾臓、腎臓、脳、もしくは肺）におけるバイオマーカー、例えば、ＡＬＡ、ＰＢＧ、ポルフィリン、アミノ基転移酵素（例えば、ＡＬＴもしくはＡＳＴ）、及び／または血清中ビリルビンのレベルが、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも１００％またはそれ以上低減することは、効を奏するＡＩＰの処置に適する用量を示し、本明細書で使用される低減は、好ましくは、（例えば、単回静脈内投与の、例えば、投与後の）特定された時間の最後に決定されるバイオマーカーのレベルが、当該時間の初めに（例えば、当該用量の投与前に）決定された同じバイオマーカーのレベルと比較されることを意味する。例示的な時間は、投与の１２、２４、４８、７２、９６、１２０、または１４４時間後、特に、投与の２４、４８、７２、または９６時間後を含む。
基質レベル（例えば、バイオマーカー、例えば、ＡＬＡ、ＰＢＧ、ポルフィリン、アミノ基転移酵素（例えば、ＡＬＴもしくはＡＳＴ）、及び／または血清中ビリルビン）の持続的な低減は、特に、ｍＲＮＡ治療的投与及び／またはＡＩＰの治療に成功した投与レジメンを示す。そのような持続的な低減は、本明細書では、効果の「持続時間」と呼ぶことができる。例示的な実施形態では、投与後の１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日またはそれ以上の日数以内に、特に、対象の体液（例えば、血漿、血清、尿、例えば、尿中沈降物）における、または組織（複数可）（例えば、肝臓、心臓、脾臓、腎臓、脳、もしくは肺）におけるバイオマーカー、例えば、ＡＬＡ、ＰＢＧ、ポルフィリン、アミノ基転移酵素（例えば、ＡＬＴもしくはＡＳＴ）、及び／または血清中ビリルビンのレベルが、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約１００％またはそれ以上低減することは、治療薬アプローチの成功を示す。例示的な実施形態では、１つ以上の試料（例えば、分泌液及び／または組織）の基質（例えば、バイオマーカー）レベルの持続的な低減が好ましい。任意に、少なくとも１つの組織、好ましくは、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上の組織中の当該バイオマーカーの持続的な低減と組み合わせて、例えば、（本明細書で定義されるような）ＡＬＡ、ＰＢＧ、ポルフィリン、アミノ基転移酵素（例えば、ＡＬＴもしくはＡＳＴ）、及び／または血清中ビリルビンの持続的な低減をもたらすｍＲＮＡ療法は、治療の成功を示す。
いくつかの実施形態では、本発明のｍＲＮＡ療法の単回用量は、約０．２～約０．８ｍｐｋ、約０．３～約０．７ｍｐｋ、約０．４～約０．８ｍｐｋ、または約０．５ｍｐｋである。別の実施形態では、本発明のｍＲＮＡ療法の単回用量は、１．５ｍｐｋ未満、１．２５ｍｐｋ未満、１ｍｐｋ未満、または０．７５ｍｐｋ未満である。
２６．使用のための組成物及び製剤
本発明のある特定の態様は、上で開示のポリヌクレオチドのいずれかを含む組成物または製剤に関する。
いくつかの実施形態では、組成物または製剤は、
（ｉ）ＰＢＧＤポリペプチド（例えば、野生型配列、機能性断片、またはそのバリアント）をコードする配列最適化ヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）（ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの化学修飾核酸塩基、例えば、５－メトキシウラシルを含み（例えば、ウラシルの少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％は、５－メトキシウラシルであり）、ポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、ｍｉＲ－１４２に結合するｍｉＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ－１４２－３ｐもしくはｍｉＲ－１４２－５ｐ結合部位）及び／またはｍｉＲ－１２６に結合するｍｉＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ－１２６－３ｐもしくはｍｉＲ－１２６－５ｐ結合部位）をさらに含む）、ならびに
（ｉｉ）例えば、式（Ｉ）を有する化合物、例えば、化合物１～２３２のいずれか、例えば、化合物１８、式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、または（ＶＩ）を有する化合物、例えば、化合物２３３～３４２のいずれか、例えば、化合物２３６、または式（ＶＩＩＩ）を有する化合物、例えば、化合物４１９～４２８のいずれか、例えば、化合物４２８、あるいはそれらの任意の組み合わせを含む送達剤、を含む。
いくつかの実施形態では、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の理論的最小ウラシルまたはチミン含有量に対するＯＲＦのウラシルまたはチミン含有量（％ＵＴＭまたは％ＴＴＭ）は、約１００％～約１５０％である。
いくつかの実施形態では、上記のポリヌクレオチド、組成物、または製剤は、ＰＢＧＤ関連疾患、障害、または状態、例えば、ＡＩＰ、を治療及び／または予防するために使用される。
２７．投与の形態
上記の本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物、及び製剤は、治療上有効な結果をもたらす任意の経路により投与することができる。これらは、経腸（腸内に）、胃腸内、硬膜外（硬膜内に）、経口（口から）、経皮、硬膜上、大脳内（大脳内に）、脳室内（脳室内に）、経皮（皮膚への適用）、皮内（皮膚自体に）、皮下（皮膚下に）、経鼻投与（鼻を通して）、静脈内（静脈内に）、静脈内ボーラス、静脈内点滴、動脈内（動脈内に）、筋肉内（筋肉内に）、心臓内（心臓内に）、骨内注入（骨髄内に）、髄腔内（脊髄管内）、腹腔内、（腹膜への注入もしくは注射）、膀胱内注入、硝子体内、（眼を通して）、空洞内注射（病理学的空洞内に）、腔内（陰茎の付け根に）、膣内投与、子宮内、羊膜外投与、経皮（全身分布のためのインタクトな皮膚を通した拡散）、経粘膜（粘膜を通した拡散）、経膣、吹送法（鼻で吸う）、舌下、唇の下、浣腸、点眼（結膜上に）、点耳、耳介（耳の中もしくは耳から）口内（頬に向かって）、結膜、皮膚、歯科用（歯（複数可））、電気浸透、子宮頸管内、副鼻腔内、気管内、体外、血液透析、浸潤、間質内、腹腔内、羊水内、関節内、胆管内、気管支内、嚢内、軟骨内（軟骨内に）、仙骨内（馬尾内に）大槽内（大槽小脳延髄槽（ｃｅｒｅｂｅｌｌｏｍｅｄｕｌａｒｉｓ）内に）、角膜内（角膜内に）、歯科内膜、冠動脈内（冠動脈内に）、海綿体内（陰茎の陰核海綿体の拡張可能な空間内の）、椎間板内（椎間板内に）、管内（腺管内に）、十二指腸内（十二指腸内に）、硬膜内（硬膜内もしくは硬膜下に）、表皮内（表皮へ）、食道内（食道へ）、胃内（胃内に）、歯肉内（歯肉内に）、回腸内（ｉｎｔｒａｉｌｅａｌ）（小腸の遠位部分内に）、病巣内（局所的な病変内にもしくは局所的な病変に直接導入された）、管腔内（管の管腔内に）、リンパ腺内（リンパ内に）、髄内（骨の髄腔内に）、髄膜内（髄膜内に）、眼内（眼内に）、卵巣内（卵巣内に）、心膜内（心膜内に）、胸膜腔内（胸膜内に）、前立腺内（前立腺内に）、肺内（肺もしくはその気管支内に）、洞内（ｉｎｔｒａｓｉｎａｌ）（鼻洞もしくは眼窩洞内に）、脊髄内（脊柱内に）、滑液嚢内（関節の滑液腔内に）、腱内（腱内に）、精巣内（精巣内に）髄腔内（脳脊髄軸の任意のレベルで脳脊髄液内に）、胸腔内（胸郭内に）、尿細管内（器官の尿細管内に）、鼓室内（中耳内に）、血管内（血管（複数可）内に）、脳室内（脳室内に）、イオントフォレーゼ（可溶性塩のイオンが身体の組織に移動する電流により）、潅注（開いた創傷もしくは体腔を浸し、もしくは洗浄する）、喉頭（喉頭に直接）、経鼻胃（鼻を通して、胃に）、閉塞性包帯技術（領域を閉塞する包帯剤で覆われる局所経路投与）、眼内（外眼部へ）、口咽頭（口及び咽頭に直接）、非経口、経皮、関節周囲、硬膜上、神経周囲、歯根膜、経直腸、呼吸器（局所的もしくは全身的効果のために経口的もしくは鼻的に吸入することにより気道内に）、眼球後（脳橋の後ろ、もしくは眼球の後ろ）、心筋内（心筋に入る）、軟組織、くも膜下、結膜下、粘膜下、局所用、経胎盤（胎盤を通して、もしくは胎盤を越えて）、経気管（気管の壁を通して）、経鼓室（鼓室を越えて、もしくは通して）、尿管（尿管への）、尿道（尿道への）、膣、仙骨ブロック、診断、神経ブロック、胆汁灌流、心臓灌流、フォトフェレシス、または脊髄を含むが、これらに限定されない。特定の実施形態では、組成物は、それらが、血液脳関門、血管関門、または他の上皮性関門を越えることができるように投与することができる。いくつかの実施形態では、投与経路のための製剤は、少なくとも１つの不活性成分を含むことができる。
本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＰＢＧＤポリペプチドまたはその機能性断片もしくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、ネイキッドで細胞に送達することができる。本明細書で使用される場合、「ネイキッド」は、形質移入を促進する薬剤を含まないポリヌクレオチドを送達することを指す。ネイキッドポリヌクレオチドは、当該技術分野で既知及び本明細書に記載の投与経路を使用して、細胞に送達することができる。
本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＰＢＧＤポリペプチドまたはその機能性断片もしくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、本明細書に記載の方法を使用して製剤化することができる。製剤は、修飾及び／または非修飾である可能性があるポリヌクレオチドを含有することができる。製剤は、細胞浸透剤、薬学的に許容される担体、送達剤、生体内分解性または生体適合性ポリマー、溶媒、及び徐放性送達デポーをさらに含むことができるが、これらに限定されない。製剤化されたポリヌクレオチドは、当該技術分野で既知及び本明細書に記載の投与経路を使用して細胞に送達することができる。
非経口投与のための医薬組成物は、少なくとも１つの不活性成分を含むことができる。ＵＳ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（ＦＤＡ）により、使用された不活性成分のいずれかが承認されているか、または、いずれもが承認されていない場合がある。非経口投与のための医薬組成物に使用される不活性成分の限定的なリストは、塩酸、マンニトール、窒素、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、及び水酸化ナトリウムを含む。
注射用調製物、例えば、滅菌注射用水性または油性懸濁液は、好適な分散剤、湿潤剤、及び／または懸濁化剤を使用して、既知の技術に従って製剤化することができる。滅菌注射用調製物は、例えば、１，３－ブタンジオール溶液として、非毒性の非経口的に許容される希釈剤及び／または溶媒中の滅菌注射用溶液、懸濁液、及び／またはエマルションとすることができる。用いることができる許容されるビヒクル及び溶媒には、水、リンゲル液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．、及び等張性塩化ナトリウム溶液がある。滅菌不揮発性油は従来、溶媒または懸濁媒体として用いられる。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の無刺激不揮発性油を用いることができる。オレイン酸などの脂肪酸を、注射剤の調製に使用することができる。滅菌製剤は、アジュバント、例えば、局所麻酔薬、防腐剤、及び緩衝剤、を含むこともできる。
注射製剤は、例えば、細菌保持フィルターに通した濾過により、且つ／または、使用前に滅菌水または他の滅菌注射媒体に溶解または分散することができる滅菌固体組成物の形態で滅菌剤を組み込むことにより、滅菌することができる。
注射製剤は、組織、器官、及び／または対象の領域への直接注射用とすることができる。非限定例として、組織、器官、及び／または対象に、虚血領域への心筋内注射により、製剤を直接注射することができる（例えば、Ｚａｎｇｉ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１３（この内容は、本明細書に全体が参照により組み込まれる）を参照のこと）。
活性成分の効果を延長するために、それは多くの場合、皮下または筋肉内注射からの活性成分の吸収を遅らせることが望ましい。これは、水溶性の低い結晶質または非晶質物質の液体懸濁液の使用により達成することができる。その場合、薬物の吸収速度は、溶解速度に依存し、次いで、これは、結晶サイズ及び結晶形に依存し得る。あるいは、非経口投与された薬物形態の遅延吸収は、薬物を油ビヒクルに溶解または懸濁させることにより達成される。注射用デポー形態は、ポリラクチド－ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中の薬物のマイクロ封入マトリックスを形成することにより作製される。薬物対ポリマーの比及び用いられる特定のポリマーの性質に応じて、薬物放出速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例は、ポリ（オルトエステル）及びポリ（無水物）を含む。デポー注射製剤は、薬剤を、身体組織に適合するリポソームまたはマイクロエマルションにトラップすることにより調製される。
２８．キット及びデバイス
ａ．キット
本発明は、本発明の特許請求されるヌクレオチドを、都合よく且つ／または効果的に使用するための様々なキットを提供する。通常は、キットは、ユーザが対象（複数可）の複数の処置を実施し、且つ／または複数の実験を実施することを可能にするのに十分な量及び／または数の構成成分を含む。
一態様では、本発明は、本発明の分子（ポリヌクレオチド）を含むキットを提供する。
当該キットは、翻訳可能領域を含む第１のポリヌクレオチドを含むタンパク質産生用とすることができる。キットは、製剤組成物を形成するパッケージ及び使用説明書及び／または送達剤をさらに含むことができる。送達剤は、本明細書に開示の生理食塩水、緩衝溶液、リピドイド、または任意の送達剤を含むことができる。
いくつかの実施形態では、緩衝溶液は、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、ホスファート、及び／またはＥＤＴＡを含むことができる。別の実施形態では、緩衝溶液は、生理食塩水、２ｍＭのカルシウムを含む生理食塩水、５％のスクロース、２ｍＭのカルシウムを含む５％のスクロース、５％のマンニトール、２ｍＭのカルシウムを含む５％のマンニトール、乳酸リンゲル液、塩化ナトリウム、２ｍＭのカルシウムを含む塩化ナトリウム、及びマンノースを含むことができるが、これらに限定されない（例えば、本明細書に全体が参照により組み込まれる米国公開第２０１２０２５８０４６号を参照のこと）。さらなる実施形態では、緩衝溶液を、沈殿させるか、または凍結乾燥させることができる。各構成成分の量は、均一な再現可能な高濃度の生理食塩水または単純な緩衝液製剤を可能にするように変動させることができる。構成成分は、時間を通して、及び／または様々な条件下で、緩衝溶液中の修飾ＲＮＡの安定性を増加させるように変動させることもできる。一態様では、本発明は、標的細胞に導入された時に、翻訳可能領域によりコードされる所望量のタンパク質を産生するのに有効な量で提供される翻訳可能領域を含むポリヌクレオチド、細胞の自然免疫応答を実質的に阻害するのに有効な量で提供される阻害性核酸を含む第２のポリヌクレオチド、ならびにパッケージ及び使用説明書を含む、タンパク質産生のためのキットを提供する。
一態様では、本発明は、翻訳可能領域を含むポリヌクレオチド、ならびにパッケージ及び説明書を含む、タンパク質産生のためのキットを提供し、ポリヌクレオチドは、細胞ヌクレアーゼによる分解の低減を示す。
一態様では、本発明は、翻訳可能領域を含むポリヌクレオチド、及び第１の核酸の翻訳可能領域の翻訳に適する哺乳動物細胞を含む、タンパク質産生のためのキットを提供し、ポリヌクレオチドは、細胞ヌクレアーゼによる分解の低減を示す。
ｂ．デバイス
本発明は、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを組み込むことができるデバイスを提供する。これらのデバイスは、ヒト患者などのそれを必要とする対象に直ちに送達するのに利用される製剤中でポリヌクレオチドを合成する試薬を、安定的な剤形で含有する。
投与のためのデバイスを、本明細書に教示の単回投与、複数回投与、または分割投与レジメンに従って、本発明のポリヌクレオチドを送達するために用いることができる。そのようなデバイスは、例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる国際出願公開第ＷＯ２０１３１５１６６６号に教示される。
本発明の実施形態として、本明細書に開示の方法及び組成物と組み合わせて使用するために、細胞、器官、及び組織への複数投与のための当該分野で既知の方法及びデバイスが企図される。これらは、例えば、複数のニードルを有する方法及び装置、例えば、ルーメンまたはカテーテルを用いるハイブリッドデバイス、ならびに熱、電流、または放射線駆動機序を利用するデバイスを含む。
本発明に従って、これらの複数投与デバイスは、本明細書で企図される単回用量、複数用量、または分割用量を送達するために利用することができる。そのような装置は、例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる国際出願公開第ＷＯ２０１３１５１６６６号に教示されている。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、同時に、または６０分の期間以内に、３つの異なる任意に隣接する部位に、少なくとも３本の針を介して、皮下投与または筋肉投与される（例えば、同時に、または６０分の期間以内に、４、５、６、７、８、９、または１０部位に投与される）。
ｃ．カテーテル及び／またはルーメンを利用する方法及び装置
カテーテル及びルーメンを使用する方法及び装置を、本発明のポリヌクレオチドを、単回投与、複数回投与、または分割投与スケジュールで投与することができる。そのような方法及びデバイスは、国際出願公開第ＷＯ２０１３１５１６６６号に記載され、この内容は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ｄ．電流を利用する方法及びデバイス
電流を利用する方法及びデバイスを、本明細書に教示の単回投与、複数回投与、または分割投与レジメンに従って、本発明のポリヌクレオチドを送達するために用いることができる。そのような方法及びデバイスは、国際出願公開第ＷＯ２０１３１５１６６６号に記載され、この内容は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
２９．定義
本開示をより容易に理解することができるように、ある特定の用語が最初に定義される。本出願で使用される場合、本明細書に別途明示のない限り、以下の用語のそれぞれは、下記の意味を有するものとする。追加の定義は、本出願の全体にわたって記載される。
本発明は、グループのちょうど１つのメンバーが、所与の生成物またはプロセスに存在するか、これらに用いられるか、または別の方法でこれらに関連する実施形態を含む。本発明は、グループメンバーの複数または全てが、所与の生成物またはプロセスに存在するか、これらに用いられるか、または別の方法でこれらに関連する実施形態を含む。
本明細書及び添付の特許請求の範囲では、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈に別途明示のない限り、複数の指示対象を含む。「ａ」（または「ａｎ」）という用語、ならびに「１つ以上」及び「少なくとも１つ」という用語は、本明細書では互換的に使用することができる。ある特定の態様では、「ａ」または「ａｎ」という用語は、「単一」を意味する。他の態様では、「ａ」または「ａｎ」という用語は、「２つ以上」または「複数」を含む。
さらに、本明細書で使用される「及び／または」は、他のものの有無に関わらず、２つの具体的な特徴または構成要素のそれぞれの具体的な開示とみるべきである。従って、「Ａ及び／またはＢ」などの語句で使用される「及び／または」という用語は、本明細書では、「Ａ及びＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、及び「Ｂ」（単独）を含むものとする。同様に、「Ａ、Ｂ、及び／またはＣ」などの語句で使用される「及び／または」という用語は、以下の態様：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）のそれぞれを包含するものとする。
別途記載のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が関連する当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。例えば、ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ－Ｓｈｏｗ，２ｎｄ ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｈｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、及びｔｈｅ Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ Ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓは、当業者に、本開示で使用される多くの用語の一般的な辞書を提供する。
態様が「含む」という文言を用いて本明細書に記載されている場合は、「からなる」及び／または「から本質的になる」という用語で別途記載された類似の態様もまた提供される。
単位、接頭語、及び記号は、Ｓｙｓｔｅｍｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅ Ｕｎｉｔｅｓ（ＳＩ）に認められた形態で表示される。数値範囲は、範囲を記載する数字を含む。値の範囲が列挙される場合、その範囲の列挙された上限値及び下限値の間の各介在整数値及びその各分数もまた、そのような値の間の各部分範囲に加えて、具体的に開示されることを理解すべきである。任意の範囲の上限及び下限は独立に、範囲に含まれるか、または範囲から除外される可能性があり、各範囲もまた、境界のいずれかが含まれるか、いずれもが含まれないか、または両方が含まれる場合、本発明に包含される。値が明示的に列挙される場合、列挙された値とほぼ同じ数量または量である値もまた、本発明の範囲内にあることを理解すべきである。組み合わせが開示される場合、その組み合わせの要素の各サブ組み合わせもまた、具体的に開示され、本発明の範囲内にある。逆に、異なる要素または要素群が個々に開示される場合、それらの組み合わせもまた開示される。発明の任意の要素が、複数の代替物を有するものとして開示される場合、各代替物が単独でまたは他の代替物との任意の組み合わせから除外される本発明の例もまた、本明細書に開示され、本発明の複数の要素は、そのような除外を有することができ、そのような除外を有する要素の組み合わせは全て、本明細書に開示される。
ヌクレオチドは、一般に認められている一文字コードにより参照される。別途指示のない限り、核酸は、５’から３’の方向で、左から右に書かれる。核酸塩基は、本明細書では、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される、一般に知られている一文字記号により参照される。従って、Ａはアデニンを表し、Ｃはシトシンを表し、Ｇはグアニンを表し、Ｔはチミンを表し、Ｕはウラシルを表す。
アミノ酸は、本明細書では、一般に知られている３文字の記号またはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字の記号のいずれかで参照される。別途指示のない限り、アミノ酸配列は、アミノからカルボキシの方向で、左から右に書かれる。
約：
本明細書及び特許請求の範囲の全体にわたって数値と関連して使用される「約」という用語は、当業者によく知られており、認められている精度の間隔を示す。そのような精度の間隔は、±１０％である。
範囲が与えられる場合は、端点が含まれる。さらに、別途指示のない限り、または、文脈及び当業者の理解から別途明らかでない限り、範囲として表される値は、文脈に別途明示のない限り、範囲の下限の単位の１０分の１までの、本発明の異なる実施形態の記載された範囲内の任意の特定の値または部分範囲とみなすことができる。
組み合わせて投与される：
本明細書中で使用される場合、「組み合わせて投与される」または「組み合わせ投与」という用語は、２つ以上の薬剤が、同時に、または各薬剤の患者への影響の重複が可能な間隔の範囲内で、対象に投与されることを意味する。いくつかの実施形態では、それらは、互いに約６０、３０、１５、１０、５、または１分以内に投与される。いくつかの実施形態では、薬剤の投与は、組み合わせ（例えば、相乗的）効果が達成されるように、互いに十分に接近して配置される。
アミノ酸置換：
「アミノ酸置換」という用語は、親配列または参照配列（例えば、野生型ＰＢＧＤ配列）に存在するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基で置換することを指す。アミノ酸は、親配列または参照配列（例えば、野生型ＰＢＧＤポリペプチド配列）内で、例えば、化学的ペプチド合成または当該技術分野で既知の組換え法により置換することができる。従って、「位置Ｘでの置換」への言及は、位置Ｘに存在するアミノ酸の、代替アミノ酸残基での置換を指す。いくつかの態様では、置換パターンは、スキーマＡｎＹに従って記載することができ、Ａは、ｎ位に天然にまたは元々存在するアミノ酸に対応する一文字コードであり、Ｙは、置換アミノ酸残基である。他の態様では、置換パターンは、スキーマＡｎ（ＹＺ）に従って記載することができ、Ａは、Ｘ位に天然にまたは元々存在するアミノ酸を置換するアミノ酸残基に対応する一文字コードであり、Ｙ及びＺは、代替置換アミノ酸残基であり、すなわち、Ｙ及びＺは、代替置換アミノ酸残基である。
本開示の文脈では、置換（それらが、アミノ酸置換と呼ばれる場合であっても）は、核酸レベルで行われ、すなわち、アミノ酸残基を代替アミノ酸残基で置換することは、第１のアミノ酸をコードするコドンを、第２のアミノ酸をコードするコドンと置換することにより行われる。
動物：
本明細書で使用される場合、「動物」という用語は、動物界の任意のメンバーを指す。いくつかの実施形態では、「動物」は、任意の発生期のヒトを指す。いくつかの実施形態では、「動物」は、任意の発達期の非ヒト動物を指す。ある特定の実施形態では、非ヒト動物は、哺乳類（例えば、齧歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長動物またはブタ）である。いくつかの実施形態では、動物は、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、及び虫を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子操作された動物、またはクローンである。
およそ：
本明細書で使用される場合、目的の１つ以上の値に付される「およそ」という用語は、記載された参照値に類似する値を指す。ある特定の実施形態では、「およそ」という用語は、別途記載のない限り、または別途文脈から明らかでない限り（そのような数が可能な値の１００％を超える場合を除き）、記載された参照値のいずれかの（より大きいまたはより小さい）方向に、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、以下の範囲に入る値を指す。
関連する：
疾患に対して本明細書で使用される場合、「関連する」という用語は、問題の症状、測定値、特徴、または状態が、その疾患の診断、発症、存在、または進行に関連することを意味する。関連は、原因として疾患との関連がある可能性があるが、そうで必要はない。例えば、徴候、症状、後遺症、またはＡＩＰの患者の生活の質の減少を引き起こす任意の効果は、ＡＩＰと関連するとみなされ、本発明のいくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与することにより、治療、改善、または予防することができる。
２つ以上の部分に対して使用される場合、「会合する」「コンジュゲートされる」、「連結される」、「結合される」、及び「繋がる」という用語は、２つ以上の部分に対して使用される場合、構造が使用される条件、例えば、生理学的条件下で、部分が物理的に会合したままであるように、十分に安定である構造を形成するように、部分が、直接、または結合剤としての働きをする１つ以上のさらなる部分を介してのいずれかで、互いに物理的に会合し、または連結されることを意味する。「会合」は、厳密に直接共有化学結合によるものである必要はない。それは、「会合する」実体が物理的に会合したままであるように十分に安定な連結性に基づくイオン結合または水素結合またはハイブリダイゼーションも示唆することができる。
二機能性：
本明細書で使用される場合、「二機能性」という用語は、少なくとも２つの機能の能力があるか、または維持する任意の物質、分子、または部分を指す。機能は、同じ結果または異なる結果に影響を与え得る。機能を生じる構造は、同じまたは異なる可能性がある。例えば、二機能性修飾ＲＮＡは、本発明のＰＢＧＤペプチドをコードすること（第１の機能）ができるが、コードＲＮＡを含むヌクレオシドは、それ自体、ＲＮＡの半減期を延長すること（第２の機能）ができる。この例では、二機能性修飾ＲＮＡを、タンパク質欠乏症に罹患する対象に送達すると、疾患または状態を改善または治療することができるペプチドまたはタンパク質分子を産生するだけでなく、長い期間、対象に存在する集団修飾ＲＮＡを維持もするであろう。他の態様では、二機能修飾ｍＲＮＡは、例えば、ＰＢＧＤペプチドをコードする（第１の機能）ＲＮＡ及び第１のタンパク質に融合されるか、または第１のタンパク質と同時発現される第２のタンパク質、例えば、ＡｐｏＡ１タンパク質、を含むキメラまたはキメラ（ｑｕｉｍｅｒｉｃ）分子とすることができる。
生体適合性：
本明細書で使用される場合、「生体適合性」という用語は、免疫系による傷害、毒性、または拒絶のリスクをほとんど乃至全く有さない生きた細胞、組織、器官、または系と適合することを意味する。
生分解性：
本明細書で使用される場合、「生分解性」という用語は、生物の作用により無害な産物に分解される可能性を意味する。
生物学的に活性な：
本明細書で使用される場合、「生物学的に活性な」という語句は、生物学的系及び／または生体内で活性を有する任意の物質の特徴を指す。例えば、生体に投与された時に、その生体に生物学的影響を有する物質は、生物学的に活性であるとみなされる。特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの一部でも生物学的活性であるか、または生物学的に関連するとみなされる活性を模倣する場合、生物学的活性であるとみなすことができる。
キメラ：
本明細書中で使用される場合、「キメラ」は、２つ以上の不調和または異種部分または領域を有する実体である。例えば、キメラ分子は、ＰＢＧＤポリペプチドを含む第１の部分及び（例えば、第１の部分と遺伝的に融合した）第２の治療用タンパク質を含む第２の部分（例えば、別個の酵素活性を有するタンパク質、抗原結合部分、またはＰＢＧＤの血漿半減期を延長することが可能な部分、例えば、抗体のＦｃ領域）を含むことができる。
配列最適化：
「配列最適化」という用語は、参照核酸配列内の核酸塩基が代替核酸塩基で置換されて、特性の向上、例えば、タンパク質発現の向上または免疫原性の減少をもたらすプロセスまたは一連のプロセスを指す。
一般に、配列最適化の目標は、参照ヌクレオチド配列によりコードされるのと同じポリペプチド配列をコードする同義ヌクレオチド配列を生成することである。従って、参照ヌクレオチド配列によりコードされたポリペプチドに対して、コドン最適化ヌクレオチド配列によりコードされたポリペプチドに（コドン最適化の結果としての）アミノ酸置換は存在しない。
コドン置換：
配列最適化の文脈での「コドン置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」または「コドン置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）」という用語は、参照核酸配列中に存在するコドンを、別のコドンで置換することを指す。コドンは、例えば、化学的ペプチド合成を介して、または当該分野で既知の組換え方法により、参照核酸配列中で置換することができる。従って、核酸配列（例えば、ｍＲＮＡ）中のある特定の場所での、または核酸配列（例えば、ｍＲＮＡ）の特定の領域もしくは部分配列内での「置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」または「置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）」への言及は、代替コドンを有するそのような場所または領域でのコドンの置換を指す。
本明細書で使用される場合、「コード領域」及び「コード化領域」という用語ならびにその文法的変形は、発現時に、ポリペプチドまたはタンパク質を生じるポリヌクレオチド中のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を指す。
化合物：
本明細書で使用される場合、「化合物」という用語は、示された構造の全ての立体異性体及び同位体を含むことを意味する。本明細書で使用される場合、「立体異性体」という用語は、化合物の任意の幾何異性体（例えば、シス及びトランス異性体）、エナンチオマー、またはジアステレオマーを意味する。本開示は、立体的に純粋な（例えば、幾何学的に純粋な、エナンチオマー的に純粋な、またはジアステレオマー的に純粋な）形態を含む、本明細書に記載の化合物のありとあらゆる立体異性体、ならびにエナンチオマー及び立体異性体混合物、例えば、ラセミ体を包含する。化合物のエナンチオマー及び立体的混合物、ならびにそれらを、構成成分であるエナンチオマーまたは立体異性体に分割する手段は、周知である。「同位体」は、原子核内の異なる数の中性子の結果として生じる、原子番号が同じであるが質量数が異なる原子を指す。例えば、水素の同位体は、三重水素及び重水素を含む。さらに、本開示の化合物、塩、または複合体は、所定の方法により溶媒和物及び水和物を形成するために、溶媒または水分子と組み合わせて調製することができる。
接触：
本明細書で使用される場合、「接触」という用語は、２つ以上の実体間の物理的接続を確立することを意味する。例えば、哺乳動物細胞をナノ粒子組成物と接触させることは、哺乳動物細胞及びナノ粒子が物理的接続を共有するように作製されることを意味する。ｉｎ ｖｉｖｏ及びｅｘ ｖｉｖｏの両方で、細胞を、外部実体と接触させる方法は、当該生物学的技術分野で周知である。例えば、ナノ粒子組成物及び哺乳動物内に位置する哺乳動物細胞を接触させることは、種々の投与経路（例えば、静脈内、筋肉内、皮内、及び皮下）により実施することができ、種々の量のナノ粒子組成物を含むことができる。さらに、２つ以上の哺乳動物細胞をナノ粒子組成物と接触させることができる。
保存的アミノ酸置換：
「保存的アミノ酸置換」は、タンパク質配列内のアミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるものである。塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、またはヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、またはシステイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、またはトリプトファン）、ベータ分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、またはヒスチジン）を含む、類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが、当該技術分野に規定されている。従って、ポリペプチド中のアミノ酸が、同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸で置換される場合、アミノ酸置換は、保存的であるとみなされる。別の態様では、アミノ酸のストリングは、側鎖ファミリーメンバーの順序及び／または組成が異なる構造的に類似したストリングで保存的に置換することができる。
非保存的アミノ酸置換：
非保存的アミノ酸置換は、（ｉ）正電荷側鎖を有する残基（例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、もしくはＬｙｓ）が、負電荷残基（例えば、ＧｌｕもしくはＡｓｐ）と置換され、もしくはこれにより置換される、（ｉｉ）疎水性残基（例えば、ＳｅｒもしくはＴｈｒ）が、親水性残基（例えば、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、もしくはＶａｌ）と置換され、もしくはこれにより置換される、（ｉｉｉ）システインもしくはプロリンが、他の任意の残基と置換される、もしくはこれにより置換される、または（ｉｖ）嵩高い疎水性もしくは芳香族側鎖を有する残基（例えば、Ｖａｌ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、もしくはＴｒｐ）が、より小さい側鎖を有するもの（例えば、ＡｌａもしくはＳｅｒ）、もしくは側鎖を有さないもの（例えば、Ｇｌｙ）と置換される、あるいはこれにより置換されるものを含む。
他のアミノ酸置換は、当業者により容易に同定することができる。例えば、アミノ酸アラニンの場合、置換は、Ｄ－アラニン、グリシン、β－アラニン、Ｌ－システイン、及びＤ－システインのいずれか１つから行うことができる。リシンの場合、置換は、Ｄ－リシン、アルギニン、Ｄ－アルギニン、ホモアルギニン、メチオニン、Ｄ－メチオニン、オルニチン、またはＤ－オルニチンのいずれか１つであり得る。一般に、単離ポリペプチドの特性の変化を誘導すると予想することができる機能上重要な領域での置換は、（ｉ）極性残基、例えば、セリンもしくはスレオニンが、疎水性残基、例えば、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、もしくはアラニンと（もしくはそれで）置換されるか、（ｉｉ）システイン残基が、他の任意の残基と（もしくはそれで）置換されるか、（ｉｉｉ）正電荷側鎖有する残基、例えば、リシン、アルギニン、もしくはヒスチジンが、負電荷側鎖を有する残基、例えば、グルタミン酸もしくはアスパラギン酸と（もしくはそれで）置換されるか、または、（ｉｖ）嵩高い側鎖を有する残基、例えば、フェニルアラニンが、そのような側鎖を有しないもの、例えば、グリシンで（もしくはそれで）置換されるものである。上述の非保存的置換の１つがタンパク質の機能的特性を変更させることができる可能性は、タンパク質の機能的に重要な領域に対する置換の位置とも関連しており：いくつかの非保存的置換は、それに応じて、生物学的特性にほとんどまたは全く影響がない可能性がある。
保存された：
本明細書で使用される場合、「保存された」という用語はそれぞれ、比較される２つ以上の配列の同じ位置で改変されていないものである、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列のヌクレオチドまたはアミノ酸残基を指す。比較的保存されているヌクレオチドまたはアミノ酸は、配列の他の箇所に現れるヌクレオチドまたはアミノ酸よりも関連している配列の間で保存されているものである。
いくつかの実施形態では、２つ以上の配列は、互いに１００％同一である場合、「完全に保存されている」と言われる。いくつかの実施形態では、２つ以上の配列は、互いに、少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一である場合、「高度に保存されている」と言われる。いくつかの実施形態では、２つ以上の配列は、互いに、約７０％同一、約８０％同一、約９０％同一、約９５％、約９８％、または約９９％同一である場合、「高度に保存されている」と言われる。いくつかの実施形態では、２つ以上の配列は、互いに、少なくとも３０％同一、少なくとも４０％同一、少なくとも５０％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一である場合、「保存されている」と言われる。いくつかの実施形態では、２つ以上の配列は、互いに、約３０％同一、約４０％同一、約５０％同一、約６０％同一、約７０％同一、約８０％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一、または約９９％同一である場合、「保存されている」と言われる。配列の保存は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの全長に適用することができ、またはその一部、領域、または機能に適用することができる。
徐放：
本明細書で使用される場合、「徐放」という用語は、治療結果を達成する放出の特定のパターンに適合する医薬組成物または化合物放出プロファイルを指す。
環状または環化：
本明細書で使用される場合、「環状」という用語は、連続ループの存在を指す。環状分子は、サブユニットの破壊されていない鎖を形成するために、環状である必要はなく、単に連結される。本発明の操作されたＲＮＡまたはｍＲＮＡなどの環状分子は、単一単位もしくは多量体であるか、または複合体もしくは高次構造の１つ以上の構成要素を含むことができる。
細胞傷害性：
本明細書で使用される場合、「細胞毒性」は、細胞（例えば、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞））、細菌、ウイルス、真菌、原生動物、寄生生物、プリオン、またはそれらの組み合わせを、死滅させること、または有害な、有毒な、もしくは致命的な影響を引き起こすことを指す。
送達：
本明細書で使用される場合、「送達」という用語は、実体を行き先に提供することを意味する。例えば、ポリヌクレオチドを対象に送達することは、ポリヌクレオチドを含むナノ粒子組成物を対象に（例えば、静脈内、筋肉内、皮内、または皮下経路により）投与することを含むことができる。ナノ粒子組成物の哺乳動物または哺乳動物細胞への投与は、１つ以上の細胞をナノ粒子組成物と接触させることを含むことができる。
送達剤：
本明細書で使用される場合、「送達剤」は、ポリヌクレオチドの標的細胞へのｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、またはｅｘ ｖｉｖｏ送達を、少なくとも部分的に促進する任意の物質を指す。
不安定化：
本明細書で使用される場合、「不安定な（ｄｅｓｔａｂｌｅ）」、「不安定化する」、または「不安定化領域」という用語は、同じ領域または分子の出発、野生型、または天然形態よりも安定性の低い領域または分子を意味する。
ジアステレオマー：
本明細書で使用される場合、「ジアステレオマー」という用語は、互いの鏡像でなく、且つ互いに重ね合わせることができない立体異性体を意味する。
消化：
本明細書で使用される場合、「消化」という用語は、より小さな断片または構成成分に分裂することを意味する。ポリペプチドまたはタンパク質に言及する場合、消化は、ペプチドの産生をもたらす。
遠位：
本明細書で使用される場合、「遠位」という用語は、中心から離れて、または目的の点もしくは領域から離れて位置することを意味する。
ドメイン：
本明細書で使用される場合、ポリペプチドに言及する時、「ドメイン」という用語は、１つ以上の同定可能な構造的または機能的特徴または特性（例えば、タンパク質－タンパク質相互作用の部位として働く結合能力）を有するポリペプチドのモチーフを指す。
投与レジメン：
本明細書で使用される場合、「投与レジメン」または「投与レジメン」は、投与スケジュールまたは医師が決定した治療、予防、または対症ケアのレジメンである。
有効量：
本明細書で使用される場合、薬剤の「有効量」という用語は、有益なまたは所望の結果、例えば、臨床結果、を達成するのに十分な量であり、したがって、「有効量」は、それが適用される文脈に依存する。例えば、タンパク質欠乏症（例えば、ＰＢＧＤ欠乏症）を治療する薬剤を投与する状況において、薬剤の有効量は、薬剤の投与なしに観察された症状の重篤度と比較して、例えば、ＰＢＧＤの欠乏に関連する徴候及び症状を改善、低減、排除または予防するのに十分なＰＢＧＤを発現するｍＲＮＡの量である。「有効量」という用語は、「有効用量」、「治療的有効量」、または「治療有効用量」と互換的に使用することができる。
エナンチオマー：
本明細書で使用される場合、「エナンチオマー」という用語は、少なくとも８０％（すなわち、１つのエナンチオマーが少なくとも９０％、他のエナンチオマーが多くとも１０％）、少なくとも９０％、または少なくとも９８％の（当該技術分野で標準的な方法により決定されるような）光学純度またはエナンチオマー過剰を有する本発明の化合物のそれぞれ個々の光学活性形態を意味する。
封入：
本明細書で使用される場合、「封入」という用語は、閉じ込めること、取り囲むこと、または内包することを意味する。
封入効率：
本明細書で使用される場合、「封入効率」は、ナノ粒子組成物の調製に使用されるポリヌクレオチドの初期総量と比較して、ナノ粒子組成物の一部となるポリヌクレオチドの量を指す。例えば、組成物に最初に提供された合計１００ｍｇのポリヌクレオチドのうち９７ｍｇのポリヌクレオチドが、ナノ粒子組成物に封入される場合、封入効率は９７％として与えられ得る。本明細書で使用される場合、「封入」は、完全な、実質的な、または部分的な閉じ込め、拘束、取り囲み、または内包を指すことができる。
コードされたタンパク質切断シグナル：
本明細書で使用される場合、「コードされたタンパク質切断シグナル」は、タンパク質切断シグナルをコードするヌクレオチド配列を指す。
操作された：
本明細書で使用される場合、本発明の実施形態は、出発点、野生型、または天然分子から変化する構造的または化学的に関わらず、特徴または性質を有するようにデザインされる場合、「操作される」。
増強された送達：
本明細書中で使用される場合、「増強された送達」という用語は、ポリヌクレオチドの対照ナノ粒子（例えばＭＣ３、ＫＣ２、またはＤＬｉｎＤＭＡ）による目的の標的組織への送達のレベルと比較して、より多く（例えば、少なくとも１．５倍多く、少なくとも２倍多く、少なくとも３倍多く、少なくとも４倍多く、少なくとも５倍多く、少なくとも６倍多く、少なくとも７倍多く、少なくとも８倍多く、少なくとも９倍多く、少なくとも１０倍多く）のポリヌクレオチドのナノ粒子による目的の標的組織（例えば、哺乳動物の肝臓）への送達を意味する。ナノ粒子の特定の組織への送達レベルは、組織中で産生されたタンパク質の量を当該組織の重量と比較すること、組織中のポリヌクレオチドの量を当該組織の重量と比較すること、組織中で産生されたタンパク質の量を当該組織中の総タンパク質の量と比較すること、または組織中のポリヌクレオチド量を、当該組織中の総ポリヌクレオチドの量と比較することにより測定することができる。ナノ粒子の標的組織への増強された送達は、治療される対象において決定される必要はなく、それは、動物モデル（例えば、ラットモデル）などの代用物で決定することができることが理解されるであろう。
エキソソーム：
本明細書で使用される場合、「エキソソーム」は、哺乳動物細胞により分泌される小胞、またはＲＮＡ分解に関与する複合体である。
発現：
本明細書で使用される場合、核酸配列の「発現」は、以下の事象のうちの１つ以上を指す：（１）（例えば、転写による）ｍＲＮＡ鋳型のＤＮＡ配列からの生成、（２）（例えば、スプライシング、編集、５’キャップ形成、及び／または３’末端プロセシングによる）ｍＲＮＡ転写のプロセシング、（３）ｍＲＮＡのポリペプチドまたはタンパク質への翻訳、及び（４）ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾。
ｅｘ ｖｉｖｏ：
本明細書で使用される場合、「ｅｘ ｖｉｖｏ」という用語は、生体（例えば、動物、植物、もしくは微生物、またはその細胞もしくは組織）の外側で発生する事象を指す。ｅｘ ｖｉｖｏ事象は、天然（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ）環境から最小限に変更された環境で行うことができる。
特徴：
本明細書で使用される場合、「特徴」は、特徴、特性、または特有の要素を指す。ポリペプチドに言及する時、「特徴」は、分子の異なるアミノ酸配列に基づく構成要素として定義される。本発明のポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドの特徴は、表面症状発現、局所立体配座形状、フォールディング、ループ、ハーフループ、ドメイン、ハーフドメイン、部位、末端、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
製剤：
本明細書で使用される場合、「製剤」は、少なくともポリヌクレオチドならびに担体、賦形剤、及び送達剤のうちの１つ以上を含む。
断片：
本明細書で使用される場合、「断片」は、部分を指す。例えば、タンパク質の断片は、培養細胞から単離された全長タンパク質を消化することにより得られるポリペプチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、断片は、Ｎ末端及び／またはＣ末端及び／または内部の部分配列が欠失している全長タンパク質（例えば、ＰＢＧＤ）の部分配列である。本発明のいくつかの好ましい態様では、本発明のタンパク質の断片は、機能性断片である。
機能的：
本明細書で使用される場合、「機能的」生物学的分子は、特徴とする特性及び／または活性を示す形態の生物学的分子である。従って、本発明のポリヌクレオチドの機能性断片は、機能的ＰＢＧＤ断片を発現することができるポリヌクレオチドである。本明細書で使用される場合、ＰＢＧＤの機能性断片は、野生型ＰＢＧＤの断片（すなわち、その天然に存在するアイソフォームのいずれかの断片）、またはその変異体もしくはバリアントを指し、断片は、対応する全長タンパク質の生物学的活性の少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％を保持する。
ヘルパー脂質：
本明細書で使用される場合、「ヘルパー脂質」という用語は、（脂質層、例えば、脂質二重層に挿入するための）脂質部分及び（脂質層の表面での生理学的溶液との相互作用のための）極性部分を含む化合物または分子を指す。通常は、ヘルパー脂質は、リン脂質である。ヘルパー脂質の機能は、例えば、アミノ脂質を「補完」して二重層の融合性を増加させること、及び／または、例えば、細胞に送達された核酸の、エンドソーム脱出を促進することである。ヘルパー脂質は、ＬＮＰの表面の重要な構造構成要素であるとも考えられている。
相同性：
本明細書で使用される場合、「相同性」という用語は、ポリマー分子間、例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子及び／もしくはＲＮＡ分子）間ならびに／またはポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。一般に、「相同性」という用語は、２つの分子間の進化的関係を意味する。従って、相同である２つの分子は、共通の進化的先祖を有するであろう。本発明の文脈では、相同性という用語は、同一性及び類似性の両方を包含する。
いくつかの実施形態では、ポリマー分子は、分子中のモノマーの少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％が同一であり（正確に同じモノマー）または類似している（保存的置換）場合、互いに「相同である」とみなされる。「相同である」という用語は、必然的に、少なくとも２つの配列（ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列）の間の比較を指す。
同一性：
本明細書で使用される場合、「同一性」という用語は、ポリマー分子間の、例えば、ポリヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡ分子及び／もしくはＲＮＡ分子）間の、ならびに／またはポリペプチド分子間の、全体的なモノマーの保存を指す。２つのポリヌクレオチド配列の同一性パーセントの計算は、例えば、最適な比較のための２つの配列（例えば、ギャップを、最適なアラインメントのための第１及び第２の核酸配列のうちの一方または両方に導入することができ、同一でない配列は、比較のために無視する）をアラインすることにより実施することができる。ある特定の実施形態では、比較のためにアラインされた配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％である。次に、対応するヌクレオチド位置のヌクレオチドを比較する。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同じヌクレオチドにより占有される時、分子は、その位置で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、配列により共有される同一位置の数の関数であり、２つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要があるギャップ数及び各ギャップ長さが考慮される。配列の比較及び２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。ＤＮＡ及びＲＮＡを比較する時、チミン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）は、同等とみなすことができる。
好適なソフトウェアプログラムが、種々の供給源から、タンパク質及びヌクレオチド配列の両方のアラインメントのために、入手可能である。配列同一性パーセントを決定するための１つの好適なプログラムは、米国政府のＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＢＬＡＳＴウェブサイト（ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から入手可能なプログラムのＢＬＡＳＴ ｓｕｉｔｅの一部であるｂｌ２ｓｅｑである。Ｂｌ２ｓｅｑは、ＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのいずれかを使用して、２つの配列間の比較を実施する。ＢＬＡＳＴＮは、核酸配列を比較するために使用される一方、ＢＬＡＳＴＰは、アミノ酸配列を比較するために使用される。他の好適なプログラムは、生命情報科学プログラムのＥＭＢＯＳＳ ｓｕｉｔｅの一部、例えば、Ｎｅｅｄｌｅ、Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ、Ｗａｔｅｒ、またはＭａｔｃｈｅｒであり、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａのＥｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＢＩ）からも入手可能である。
配列アラインメントは、例えば、ＭＡＦＦＴ、Ｃｌｕｓｔａｌ（ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、またはＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ）、ＭＵＳＣＬＥなどの当該技術分野で既知の方法を使用して行うことができる。
ポリヌクレオチドまたはポリペプチド参照配列とアラインする単一ポリヌクレオチドまたはポリペプチド標的配列と異なる領域はそれぞれ、それら自体の配列同一性パーセントを有することができる。配列同一性パーセント値は、少数第２位で四捨五入されることに注意する。例えば、８０．１１、８０．１２、８０．１３、及び８０．１４は、８０．１に切り下げられる一方、８０．１５、８０．１６、８０．１７、８０．１８、及び８０．１９は、８０．２に切り上げられる。長さの値は常に、整数であることにも注意する。
ある特定の態様では、第１のアミノ酸配列（または核酸配列）対第２のアミノ酸配列（または核酸配列）の同一性百分率「％ＩＤは」は、％ＩＤ＝１００ｘ（Ｙ／Ｚ）（式中、Ｙは、（視覚検査または特定の配列アラインメントプログラムによりアラインされた）第１及び第２の配列のアラインメントにおいて完全一致としてスコア化されたアミノ酸残基（または核酸塩基）の数であり、Ｚは、第２の配列中の残基の総数である）として計算される。第１の配列の長さが第２の配列よりも長い場合、第１の配列対第２の配列の同一性パーセントは、第２の配列対第１の配列の同一性パーセントよりも高くなるであろう。
配列同一性パーセントの計算のための配列アラインメントの生成は、一次配列データにより排他的に駆動されるバイナリー配列－配列比較に限定されないことを当業者は理解するであろう。配列アラインメントは、配列データを、構造データ（例えば、結晶学的タンパク質構造）、機能的データ（例えば、変異の位置）、または系統発生データなどの異種供給源からのデータと統合することにより生成することができることも理解されるであろう。多重配列アラインメントを生成するために、異種データを統合する好適なプログラムは、ｗｗｗ．ｔｃｏｆｆｅｅ．ｏｒｇで入手可能な、あるいは、例えば、ＥＢＩから入手可能なＴ－Ｃｏｆｆｅｅである。また、配列同一性パーセントを計算するために使用される最終的なアラインメントは、自動または手動のいずれかで管理することができることも理解されるであろう。
免疫応答：
「免疫応答」という用語は、例えば、リンパ球、抗原提示細胞、貪食細胞、顆粒球、ならびに上記細胞または肝臓により産生される可溶性巨大分子（抗体、サイトカイン、及び補体を含む）の作用を指し、これらは、侵入する病原体、病原体に感染した細胞もしくは組織、癌性細胞、または、自己免疫もしくは病理学的炎症の場合には、正常なヒト細胞もしくは組織の、人体からの選択的な損傷、破壊、または排除をもたらす。いくつかの場合では、脂質構成成分及び封入された治療薬を含むナノ粒子の投与は、（ｉ）封入された治療薬（例えば、ｍＲＮＡ）、（ｉｉ）そのような封入された治療薬（例えば、ｍＲＮＡによりコードされたポリペプチド）の産物の発現、（ｉｉｉ）ナノ粒子の脂質構成成分、または（ｉｖ）それらの組み合わせ、により引き起こすことができる免疫応答を誘発することができる。
炎症性応答：
「炎症性応答」は、特異的及び非特異的な防御系を含む免疫応答を指す。具体的な防御系反応は、抗原に対する特異的な免疫系反応である。特異的防御系反応の例としては、抗体応答が挙げられる。非特異的防御系反応は、免疫記憶が一般に不可能な白血球、例えば、マクロファージ、好酸球、及び好中球、により媒介される炎症応答である。いくつかの態様では、免疫応答は、炎症性サイトカインの分泌を含み、炎症性サイトカインレベルの上昇をもたらす。
炎症性サイトカイン：
「炎症性サイトカイン」という用語は、炎症応答において上昇するサイトカインを指す。炎症性サイトカインの例としては、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、ＧＲＯαとしても知られているＣＸＣＬ１（ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド１、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターフェロンγ誘導性タンパク質１０（ＩＰ－１０）、または顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）が挙げられる。炎症性サイトカインという用語は、当該技術分野で既知の炎症性応答と関連する他のサイトカイン、例えば、インターロイキン－１（ＩＬ－１）、インターロイキン－８（ＩＬ－８）、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン－１３（ＩＬ－１３）、インターフェロンα（ＩＦＮ－α）なども含む。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ：
本明細書で使用される場合、「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」という用語は、生体（例えば、動物、植物、または微生物）内の代わりに、人工環境、例えば、試験管または反応容器、細胞培養、ペトリ皿などで生じる事象を指す。
ｉｎ ｖｉｖｏ：
本明細書で使用される場合、「ｉｎ ｖｉｖｏ」という用語は、生体（例えば、動物、植物、もしくは微生物またはその細胞もしくは組織）内で発生する事象を指す。
挿入及び欠失バリアント：
ポリペプチドに言及する時の「挿入バリアント」は、天然配列または出発配列中の特定の位置のアミノ酸に直接隣接して挿入された１つ以上のアミノ酸を有するものである。アミノ酸に「直接隣接する」は、アミノ酸のアルファ－カルボキシまたはアルファ－アミノ官能基のいずれかに結合していることを意味する。ポリペプチドに言及する時の「欠失バリアント」は、天然または出発アミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸が除去されたものである。通常、欠失バリアントは、分子の特定の領域で１つ以上のアミノ酸が欠失しているであろう。
インタクト：
本明細書で使用される場合、ポリペプチドの文脈では、「インタクト」という用語は、野生型タンパク質に対応するアミノ酸を保持すること、例えば、野生型アミノ酸を変異させないまたは置換しないことを意味する。逆に、核酸との関連で、「インタクト」という用語は、野生型核酸に対応する核酸塩基を保持すること、例えば、野生型核酸塩基を変異させない、または置換しないことを意味する。
イオン性アミノ脂質：
「イオン性アミノ脂質」という用語は、１、２、３またはそれ以上の脂肪酸または脂肪アルキル鎖及びｐＨ滴定可能なアミノ頭部基（例えば、アルキルアミノまたはジアルキルアミノ頭部基）を有する脂質を含む。イオン性アミノ脂質は通常は、アミノ頭部基のｐＫａ未満のｐＨでプロトン化され（すなわち、正に荷電し）、ｐＫａを上回るｐＨで、実質的に荷電していない。そのようなイオン性アミノ脂質は、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）及び（１３Ｚ，１６５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－ノイドコサ－１３－１６－ジエン－１－アミン（Ｌ６０８）を含むが、これらに限定されない。
単離された：
本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、（天然または実験的設定に関わらず）それが関連した構成成分の少なくとも一部から分離されている物質または実体を指す。単離された物質（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）は、それらが単離されている物質に関して、様々なレベルの純度を有することができる。単離された物質及び／または実体は、最初に関連した他の構成成分の少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、またはそれ以上から分離することができる。いくつかの実施形態では、単離された物質は、約８０％を超える、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％を超える純度である。本明細書で使用される場合、他の構成成分を実質的に含まない場合、物質は、「純粋」である。
実質的に単離された：
「実質的に単離された」は、化合物が形成または検出された環境から実質的に分離されることを意味する。部分的な分離は、例えば、本開示の化合物が豊富な組成物を含むことができる。実質的な分離は、本開示の化合物またはその塩の少なくとも約５０重量％、少なくとも約６０重量％、少なくとも約７０重量％、少なくとも約８０重量％、少なくとも約９０重量％、少なくとも約９５重量％、少なくとも約９７重量％、または少なくとも約９９重量％を含有する組成物を含むことができる。
「単離された」ポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド、細胞、または本明細書に開示の任意の組成物は、天然にはみられない形態のポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド、細胞、または組成物である。単離されたポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド、または組成物は、もはや天然に存在する形態ではない程度に精製されているものを含む。いくつかの態様では、単離されるポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド、または組成物は、実質的に純粋である。
異性体：
本明細書で使用される場合、「異性体」という用語は、本発明の任意の化合物の任意の互変異性体、立体異性体、エナンチオマー、またはジアステレオマーを意味する。本発明の化合物は、１つ以上のキラル中心及び／または二重結合を有することができ、それ故、二重結合異性体（すなわち、幾何Ｅ／Ｚ異性体）などの立体異性体あるいはジアステレオマー（例えば、エナンチオマー（すなわち、（＋）もしくは（－））またはシス／トランス異性体）として存在する。本発明によれば、本明細書に記載の化学構造、それによる、本発明の化合物は、対応する立体異性体の全て、つまり、立体的に純粋な（例えば、幾何学的に純粋な、鏡像異性的に純粋な、またはジアステレオマー的に純粋な）形態とエナンチオマー及び立体異性体混合物、例えば、ラセミ体、との両方を包含する。本発明の化合物のエナンチオマー混合物及び立体異性体混合物は通常、周知の方法、例えば、キラル相ガスクロマトグラフィー、キラル相高速液体クロマトグラフィー、キラル塩複合体として化合物を結晶化すること、またはキラル溶媒中で化合物を結晶化することで、それらの構成成分のエナンチオマーまたは立体異性体に分離させることができる。エナンチオマー及び立体異性体は、周知の不斉合成法により、立体異性または鏡像異性的に純粋な中間体、試薬、及び触媒から得ることもできる。
リンカー：
本明細書で使用される場合、「リンカー」は、原子の群、例えば、１０～１，０００の原子、を指し、限定されないが、炭素、アミノ、アルキルアミノ、酸素、硫黄、スルホキシド、スルホニル、カルボニル、及びイミンなどの原子または基からなり得る。リンカーは、第１の末端で、核酸塩基または糖部分上の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドに、第２の末端で、ペイロード、例えば、検出可能な薬剤または治療薬に、結合させることができる。リンカーは、核酸配列への取り込みを阻害しない程度に十分であることができる。リンカーは、任意の有用な目的、例えば、（例えば、２つ以上のキメラポリヌクレオチド分子またはＩＶＴポリヌクレオチドの連結により）ポリヌクレオチド多量体またはポリヌクレオチドコンジュゲートを形成するために、及び、本明細書に記載されるようなペイロードを投与するために、使用することができる。リンカーに組み込むことができる化学基の例としては、アルキル、アルケニル、アルキニル、アミド、アミノ、エーテル、チオエーテル、エステル、アルキレン、ヘテロアルキレン、アリール、またはヘテロシクリルが挙げられるが、これらに限定されず、これらのそれぞれは、本明細書に記載の通り、任意に置換することができる。リンカーの例としては、不飽和アルカン、ポリエチレングリコール（例えば、エチレンまたはプロピレングリコールモノマー単位、例えば、ジエチレングリコール、ジプロピレングリコール、トリエチレングリコール、トリプロピレングリコール、テトラエチレングリコール、またはテトラエチレングリコール）、及びデキストランポリマー、ならびにその誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。他の例としては、還元剤または光分解を使用して切断することができる、例えば、ジスルフィド結合（－Ｓ－Ｓ－）またはアゾ結合（－Ｎ＝Ｎ－）などのリンカー内の切断可能部分が挙げられるが、これらに限定されない。選択的に切断可能な結合の非限定例としては、例えば、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、もしくは他の還元剤の使用及び／または光分解により切断することができるアミド結合、ならびに、例えば、酸性または塩基性の加水分解により切断することができるエステル結合が挙げられる。
投与方法：
本明細書で使用される場合、「投与方法」は、静脈内、筋肉内、皮内、皮下、または組成物を対象に送達する他の方法を含むことができる。投与方法は、身体の具体的な領域または系に標的送達するために（例えば、特異的に送達するために）、選択することができる。
修飾されている：
本明細書で使用される場合、「修飾されている」は、本発明の分子の変化した状態または構造を指す。分子は、化学的修飾、構造的修飾、及び機能的修飾を含む、多くの仕方で修飾することができる。いくつかの実施形態では、本発明のｍＲＮＡ分子は、例えば、それが天然リボヌクレオチドＡ、Ｕ、Ｇ、及びＣに関連するような、非天然ヌクレオシド及び／またはヌクレオチドの導入により修飾されている。キャップ構造などの非標準ヌクレオチドは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕリボヌクレオチドの化学構造とは異なるが、「修飾されている」とはみなされない。
粘液：
本明細書で使用される場合、「粘液」は、粘性であり、且つムチン糖タンパク質を含む天然物質を指す。
ナノ粒子組成物：
本明細書で使用される場合、「ナノ粒子組成物」は、１つ以上の脂質を含む組成物である。ナノ粒子組成物は通常、マイクロメートル台以下の大きさであり、脂質二重層を含むことができる。ナノ粒子組成物は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リポソーム（例えば、脂質小胞）、及びリポプレックスを包含する。例えば、ナノ粒子組成物は、５００ｎｍ以下の直径を有する脂質二重層を有するリポソームとすることができる。
天然に存在する：
本明細書で使用される場合、「天然に存在する」は、人工的な援助なしに、天然に存在することを意味する
非ヒト脊椎動物：
本明細書で使用される場合、「非ヒト脊椎動物」は、野生種及び家畜種を含む、ホモサピエンスを除く全ての脊椎動物を含む。非ヒト脊椎動物の例としては、哺乳動物、例えば、アルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、ウシ、シカ、イヌ、ロバ、ガヤール、ヤギ、モルモット、ウマ、ラマ、ラバ、ブタ、ウサギ、トナカイ、ヒツジ、水牛、及びヤク、が挙げられるが、これらに限定されない。
核酸配列：
「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、または「ポリヌクレオチド配列」という用語は、互換的に使用され、連続した核酸配列を指す。配列は、一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか、例えば、ｍＲＮＡ、とすることができる。
最も広い意味での「核酸」という用語は、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物及び／または物質を含む。これらのポリマーは多くの場合、ポリヌクレオチドと呼ばれる。本発明の例示的な核酸またはポリヌクレオチドとしては、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロック核酸（ＬＮＡ、β－Ｄ－リボ配置を有するＬＮＡ、α－Ｌ－リボ配置を有するα－ＬＮＡ（ＬＮＡのジアステレオマー）、２’－アミノ官能基化を有する２’－アミノ－ＬＮＡ、及び２’－アミノ官能基化を有する２’－アミノ－α－ＬＮＡを含む）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）、またはそれらのハイブリッドもしくは組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
「ヌクレオチド配列コード」という語句は、ポリペプチドをコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡまたはＤＮＡ分子）コード配列を指す。コード配列は、核酸が投与される個体または哺乳動物の細胞において発現を指向することができるプロモーター及びポリアデニル化シグナルを含む制御エレメントに作動可能に連結された開始シグナル及び終結シグナルをさらに含むことができる。コード配列は、シグナルペプチドをコードする配列をさらに含むことができる。
オフターゲット：
本明細書で使用される場合、「オフターゲット」は、任意の１つ以上の標的、遺伝子、または細胞転写物に対する任意の意図しない効果を指す。
オープンリーディングフレーム：
本明細書で使用される場合、「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」は、所与のリーディングフレームに終止コドンを含有しない配列を指す。
作動可能に連結された：
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」という語句は、２つ以上の分子、構築物、転写物、実体、部分などの間の機能的連結を指す。
任意に置換された：
本明細書では、「任意に置換されたＸ」（例えば、任意に置換されたアルキル）という形態の語句は、「Ｘ（式中、Ｘは任意に置換される）」（例えば、「アルキル（式中、当該アルキルは、任意に置換される）」と同等であることが意図れる。特徴「Ｘ」（例えば、アルキル）自体が任意であることを意味するものではない。
部：
本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドの「一部」または「領域」は、ポリヌクレオチドの全長よりも短いポリヌクレオチドの任意の部分として定義される。
患者：
本明細書で使用される場合、「患者」は、治療を望み得るか、もしくは治療を必要とし得るかか、治療を要求するか、治療を受けているか、治療を受けることになっている対象、または、特定の疾患もしくは状態のための、訓練を受けた専門家によるケアの下にある対象を指す。例えば、ＡＩＰ患者は、急性発作に見舞われる可能性があり、急性発作（例えば、重度の疼痛）の間または後に処置することができる。再発する発作を有する患者は、すなわち、再発性発作のリスクを低減させ、または再発性発作を防止するために、「予防的」に処置することができる。
ＰＢＧＤ関連疾患：
本明細書での使用の場合、「ＰＢＧＤ関連疾患」または「ＰＢＧＤ関連障害」という用語はそれぞれ、異常なＰＢＧＤ活性（例えば、活性の減少または活性の増加）に起因する疾患または障害を指す。非限定例として、急性間欠性ポルフィリン症は、ＰＢＧＤ関連疾患である。多数の臨床的変形形態の急性間欠性ポルフィリン症が、当該技術分野で既知である。例えば、ｗｗｗ．ｏｍｉｍ．ｏｒｇ／ｅｎｔｒｙ／６０９８０６を参照のこと。
「ＰＢＧＤ酵素活性」、「ＰＢＧＤ活性」、及び「ポルフォビリノゲン脱アミノ酵素活性」という用語は、本開示では互換的に使用され、４つのポルフォビリノゲン単位のヒドロキシメチルビランへの段階的に酵素的縮合を触媒するＰＢＧＤの能力を指す。それに応じて、ＰＢＧＤ酵素活性またはＰＢＧＤ活性を保持し、または有する断片またはバリアントは、ポルフォビリノゲン単位のヒドロキシメチルへの酵素的縮合を、測定可能に酵素的に触媒することを有する断片もしくはバリアントを指す。
薬学的に許容される：
「薬学的に許容される」という語句は、適切な医学的判断の範囲内であり、合理的な利益／リスク比に見合う、過度な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症のない、ヒト及び動物の組織との接触での使用に適する化合物、材料、組成物、及び／または剤形を指すために、本明細書では用いられる。
薬学的に許容される賦形剤：
「薬学的に許容される賦形剤」という語句は、本明細書で使用される場合、本明細書に記載の化合物以外の、患者においてほぼ無毒及び非炎症性である特性を有する、任意の成分（例えば、活性化合物を懸濁または溶解させることが可能なビヒクル）を指す。賦形剤は、例えば、付着防止剤、抗酸化剤、結合剤、コーティング剤、圧縮補助剤、崩壊剤、染料（色）、皮膚軟化剤、乳化剤、充填剤（希釈剤）、フィルム形成剤またはコーティング、風味剤、香料、流動促進剤（フローエンハンサー）、滑沢剤、保存剤、印刷インキ、吸着剤、懸濁剤または分散剤、甘味料、及び水和水を含むことができる。例示的な賦形剤としては、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム（二塩基性）、ステアリン酸カルシウム、クロスカルメロース、架橋ポリビニルピロリドン、クエン酸、クロスポビドン、システイン、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースラクトース、ステアリン酸マグネシウム、マルチトール、マンニトール、メチオニン、メチルセルロース、メチルパラベン、微晶質セルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポビドン、プレゼラチン化デンプン、プロピルパラベン、レチニルパルミタート、シェラック、二酸化ケイ素、カルボキシメチルセルロースナトリウム、クエン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、ソルビトール、デンプン（トウモロコシ）、ステアリン酸、スクロース、タルク、二酸化チタン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＣ、及びキシリトールが挙げられるが、これらに限定されない。
薬学的に許容される塩：
本開示は、本明細書に記載の化合物の薬学的に許容される塩も含む。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される塩」は、親化合物が、存在する酸または塩基部分をその塩形態に変換することにより（例えば、遊離塩基基を好適な有機酸と反応させることにより）修飾されている開示された化合物の誘導体を指す。薬学的に許容される塩の例としては、アミンなどの塩基性残基の無機または有機酸塩、カルボン酸などの酸性残基のアルカリまたは有機塩などが挙げられるが、これらに限定されない。代表的な酸付加塩としては、酢酸塩、酢酸、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、カンファー酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸、パモ酸塩、ペクチナート（ｐｅｃｔｉｎａｔｅ）、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、酒石酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが挙げられる。代表的なアルカリまたはアルカリ土類金属塩としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなど、ならびに、非毒性アンモニウム、四級アンモニウム、及び限定されないが、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどを含むアミンカチオンが挙げられる。本開示の薬学的に許容される塩は、例えば、非毒性無機または有機酸から形成される親化合物の従来の非毒性塩を含む。本開示の薬学的に許容される塩は、従来の化学的方法により塩基性または酸性部分を含有する親化合物から合成することができる。一般に、そのような塩は、水中もしくは有機溶媒中、またはその２つの混合物中で、遊離酸または塩基形態のこれらの化合物を、化学量論量の適切な塩基または酸と反応させることにより調製することができ、一般に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルなどの非水性媒体が使用される。好適な塩のリストは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．１４１８，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｕｓｅ，Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ ａｎｄ Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ，２００８，及びＢｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，６６，１－１９（１９７７）に見出され、これらのそれぞれは、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
薬学的に許容される溶媒和物：
本明細書で使用される「薬学的に許容される溶媒和物」という用語は、好適な溶媒の分子が結晶格子に組み込まれている本発明の化合物を意味する。好適な溶媒は、投与された投薬量で生理学的に許容される。例えば、溶媒和物は、有機溶媒、水、またはそれらの混合物を含む溶液からの結晶化、再結晶化、または沈殿により調製することができる。好適な溶媒の例は、エタノール、水（例えば、一水和物、二水和物、及び三水和物）、Ｎ－メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ’－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン（ＤＭＥＵ）、１，３－ジメチル－３，４，５，６－テトラヒドロ－２－（１Ｈ）－ピリミジノン（ＤＭＰＵ）、アセトニトリル（ＡＣＮ）、プロピレングリコール、酢酸エチル、ベンジルアルコール、２－ピロリドン、安息香酸ベンジルなどが挙げられる。水が溶媒である場合、溶媒和物は、「水和物」と呼ばれる。
薬物動態：
本明細書で使用される場合、「薬物動態」は、生体に投与される物質の運命の決定に関する分子または化合物の任意の１つ以上の特性を指す。薬物動態は、吸収、分布、代謝、及び排泄の程度及び速度を含むいくつかの領域に分けられる。これはＡＤＭＥと一般に呼ばれ、（Ａ）吸収が血液循環に入る物質のプロセスであり、（Ｄ）分布が身体の体液及び組織を通した物質の分散または拡散であり、（Ｍ）代謝（または生体内変換）が親化合物の娘代謝物への不可逆的変換であり、（Ｅ）排泄（または除去）が物質の身体からの除去を指す。まれに、一部の薬物が、体内組織に不可逆的に蓄積する。
物理化学的：
本明細書で使用される場合、「物理化学的」は、物理的及び／または化学的性質を意味し、またはそれに関連する。
ポリヌクレオチド：
「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書で使用される場合、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、それらのアナログ、またはそれらの混合物を含む、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指す。この用語は、分子の一次構造を指す。従って、この用語は、三本鎖、二本鎖、及び一本鎖デオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）ならびに三本鎖、二本鎖、及び一本鎖リボ核酸（「ＲＮＡ」）を含む。それはまた、例えば、アルキル化、及び／またはキャッピングによる修飾形態のポリヌクレオチド、ならびに非修飾形態のポリヌクレオチドを含む。より詳細には、「ポリヌクレオチド」という用語は、（２－デオキシ－Ｄ－リボースを含有する）ポリデオキシリボヌクレオチド、スプライシングまたは未スプライシングに関わらず、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、及びｍＲＮＡを含む、（Ｄ－リボースを含有する）ポリリボヌクレオチド、Ｎ－グリコシドまたはＣ－グリコシドのプリンまたはピリミジン塩基である他の任意のタイプのポリヌクレオチド、ならびに、ノルムクレオチド（ｎｏｒｍｕｃｌｅｏｔｉｄｉｃ）主鎖を含有する他のポリマー、例えば、ポリアミド（例えば、ペプチド核酸「ＰＮＡ」）及びポリモルホリノポリマー、ならびに他の合成配列特異的核酸ポリマーを含み、ポリマーは、ＤＮＡ及びＲＮＡにみられるような塩基対形成及び塩基スタッキングを可能にする立体配置の核酸塩基を含有する。特定の態様では、ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡを含む。他の態様では、ｍＲＮＡは、合成ｍＲＮＡである。いくつかの態様では、合成ｍＲＮＡは、少なくとも１つの非天然核酸塩基を含む。いくつかの態様では、ある特定のクラスの全ての核酸塩基は、非天然核酸塩基で置換されている（例えば、本明細書に開示のポリヌクレオチド中の全てのウリジンは、非天然核酸塩基、例えば、５－メトキシウリジン、で置換することができる）。いくつかの態様では、ポリヌクレオチド（例えば、合成ＲＮＡまたは合成ＤＮＡ）は、合成ＤＮＡの場合には、天然の核酸塩基、すなわち、Ａ（アデノシン）、Ｇ（グアノシン）、Ｃ（シチジン）、及びＴ（チミジン）のみを、または合成ＲＮＡの場合には、Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＵ（ウリジン）のみを含む。
本明細書に開示のコドンマップのＴ塩基が、ＤＮＡ中に存在するが、Ｔ塩基が、対応するＲＮＡ中のＵ塩基で置換されることになることを、当業者は理解するであろう。例えば、ＤＮＡ形態の本明細書に開示のコドン－ヌクレオチド配列、例えば、ベクター、または、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳（ＩＶＴ）鋳型は、その対応する転写されたｍＲＮＡ中のＵ塩基として転写されたＴ塩基を有するであろう。この点では、（Ｔを含む）コドン最適化ＤＮＡ配列及び（Ｕを含む）それらの対応するｍＲＮＡ配列の両方が、本発明のコドン最適化ヌクレオチド配列とみなされる。等価のコドンマップが、１つ以上の塩基を非天然塩基で置換することにより生成することができることも、当業者は理解するであろう。従って、例えば、ＴＴＣコドン（ＤＮＡマップ）は、ＵＵＣコドン（ＲＮＡマップ）に対応することになり、それにより、これは、ΨΨＣコドン（Ｕがシュードウリジンで置換されたＲＮＡマップ）に対応するであろう。
標準Ａ－Ｔ及びＧ－Ｃ塩基対は、チミジンのＮ３－Ｈ及びＣ４－オキシの間の水素結合ならびにアデノシンのＮ１及びＣ６－ＮＨ２の間の水素結合、ならびに、シチジンのＣ２－オキシ、Ｎ３、及びＣ４－ＮＨ２の間の水素結合ならびにグアノシンのＣ２－ＮＨ２、Ｎ’－Ｈ、及びＣ６－オキシの間の水素結合の形成を可能にする条件下で形成する。従って、例えば、グアノシン（２－アミノ－６－オキシ－９－β－Ｄ－リボフラノシルプリン）は、イソグアノシン（２－オキシ－６－アミノ－９－β－Ｄ－リボフラノシルプリン）を形成するために修飾することができる。そのような修飾は、もはや標準塩基対をシトシンと共に効果的に形成しないヌクレオシド塩基をもたらす。しかし、イソシトシン（１－β－Ｄ－リボフラノシル－２－アミノ－４－オキシピリミジン－）を形成するための、シトシン（１－β－Ｄ－リボフラノシル－２－オキシ－４－アミノピリミジン）の修飾は、修飾ヌクレオチドをもたらし、これは、グアノシンと共に塩基対を効果的に形成しないが、イソグアノシンと共に塩基対を形成するであろう（Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．に属する米国特許第５，６８１，７０２号）。イソシトシンは、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（ミズーリ州セントルイス）から入手可能であり、イソシチジンは、Ｓｗｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２：１０４８９－１０４９６及びその中で引用された参考文献で記載される方法により調製することができ、２’－デオキシ－５－メチルイソシチジンは、Ｔｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１５：４４６１－４４６７及びその中で引用された参考文献の方法により調製することができ、イソグアニンヌクレオチドは、Ｓｗｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３，ｓｕｐｒａ、及びＭａｎｔｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４：５５９３－５６０１で記載される方法を使用して、またはＣｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．に属する米国特許第５，７８０，６１０号に記載される方法により、調製することができる。他の非天然塩基対は、２，６－ジアミノピリミジン及びその相補体（１－メチルピラゾロ－［４，３］ピリミジン－５，７－（４Ｈ，６Ｈ）－ジオン）の合成のために、Ｐｉｃｃｉｒｉｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ ３４３：３３－３７に記載の方法により合成することができる。独自の塩基対を形成する他のそのような修飾ヌクレオチド単位は、上掲のＬｅａｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：３６７５－３６８３及びＳｗｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．に記載されるように既知である。
ポリペプチド：
「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために本明細書では互換的に使用される。ポリマーは、修飾アミノ酸を含むことができる。この用語は、天然にまたは介入：例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または他の任意の操作もしくは修飾、例えば、標識構成成分との複合化により修飾されているアミノ酸ポリマーも包含する。さらに、例えば、（例えば、非天然アミノ酸、例えば、ホモシステイン、オルニチン、ｐ－アセチルフェニルアラニン、Ｄ－アミノ酸、及びクレアチンを含む）アミノ酸の１つ以上のアナログを含有するポリペプチド、ならびに当該技術分野で既知の他の修飾は、定義内に含まれる。
本明細書で使用されるこの用語は、任意のサイズ、構造、または機能のタンパク質、ポリペプチド、及びペプチドを指す。ポリペプチドは、コードされたポリヌクレオチド産物、天然に存在するポリペプチド、合成ポリペプチド、相同体、オルソログ、パラログ、断片、ならびに上述の他の等価物、変形形態、及びアナログを含む。ポリペプチドは、モノマーとすることができ、または二量体、三量体、もしくは四量体などの多分子複合体とすることができる。それらは、一本鎖または多鎖ポリペプチドを含むこともできる。最も一般に、ジスルフィド結合が、多鎖ポリペプチドに見出される。ポリペプチドという用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学的アナログであるアミノ酸ポリマーに適用することもできる。いくつかの実施形態では、「ペプチド」は、５０アミノ酸長以下、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸長であることができる。
ポリペプチドバリアント：
本明細書で使用される場合、「ポリペプチドバリアント」という用語は、それらのアミノ酸配列が天然または参照配列と異なる分子を指す。アミノ酸配列バリアントは、天然または参照配列と比較して、アミノ酸配列内のある特定の位置に、置換、欠失、及び／または挿入を有することができる。通常、バリアントは、天然配列または参照配列と、少なくとも約５０％の同一性、少なくとも約６０％の同一性、少なくとも約７０％の同一性、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９９％の同一性を有するであろう。いくつかの実施形態では、それらは、天然配列または参照配列と、少なくとも約８０％同一または少なくとも約９０％同一であろう。
単位薬物当たりのポリペプチド（ＰＵＤ）：
本明細書で使用される場合、ＰＵＤまたは単位薬物当たりの産物は、体液または組織中で測定されるような産物（例えば、ポリペプチド）の総１日用量、通常は、１ｍｇ、ｐｇ、ｋｇなどの細別された部分として定義され、通常は、濃度、例えば、ｐｍｏｌ／ｍＬ、ｍｍｏｌ／ｍＬなどで定義され、体液中での測定値で分けられる。
予防すること：
本明細書で使用される場合、「予防すること」という用語は、感染、疾患、障害、及び／もしくは状態の発症を部分的もしくは完全に遅延させること；特定の感染、疾患、障害、及び／もしくは状態の１つ以上の徴候、症状、特徴、もしくは臨床症状発現を部分的にもしくは完全に遅延させること；特定の感染、疾患、障害、及び／もしくは状態の１つ以上の徴候、症状、特徴、もしくは症状発現を部分的もしくは完全に遅延させること；感染、特定の疾患、障害、及び／もしくは状態からの進行を部分的もしくは完全に遅延させること；ならびに／または感染、疾患、障害、及び／もしくは状態に関連する病状を発症するリスクを減少させること、を指す。
増殖する：
本明細書で使用される場合、「増殖する」という用語は、成長、拡大、もしくは増加すること、または急速に成長、拡大、もしくは増加させることを意味する。「増殖性」は、増殖能力を有することを意味する。「抗増殖性」は、増殖特性に反するか、または不適当な特性を有することを意味する。
予防的：
本明細書で使用される場合、「予防的」は、疾患の拡大を予防するために使用される治療薬または一連の作用を指す。
予防：
本明細書で使用される場合、「予防」は、健康を維持し、疾患の拡大を防ぐための措置を指す。「免疫予防」は、疾患の拡大を予防するための能動免疫または受動免疫を生じる手段を指す。
タンパク質切断部位：
本明細書中で使用される場合、「タンパク質切断部位」は、化学的、酵素的、または光化学的手段により、アミノ酸鎖の制御された切断が達成することができる部位を指す。
タンパク質切断シグナル：
本明細書で使用される場合、「タンパク質切断シグナル」は、切断のためにポリペプチドにフラグを立てるまたはマークする少なくとも１つのアミノ酸を指す。
目的のタンパク質：
本明細書中で使用される場合、「目的のタンパク質」または「所望のタンパク質」という用語は、本明細書で提供されるもの、ならびに、その断片、変異体、バリアント、及び改変体を含む。
近位：
本明細書で使用される場合、「近位」という用語は、中心または目的の点または領域のより近くに位置することを意味する。
シュードウリジン：
本明細書で使用される場合、シュードウリジン（Ψ）は、ヌクレオシドウリジンのＣ－グリコシド異性体を指す。「シュードウリジンアナログ」は、シュードウリジンの任意の改変体、バリアント、アイソフォーム、または誘導体である。例えば、シュードウリジンアナログとしては、１－カルボキシメチルシュードウリジン、１－プロピニルシュードウリジン、１－タウリノメチルシュードウリジン、１－タウリノメチル－４－チオ－シュードウリジン、１－メチルシュードウリジン（ｍ１Ψ）、１－メチル－４－チオシュードウリジン（ｍ１ｓ４Ψ）、４－チオ－１－メチルシュードウリジン、３－メチルシュードウリジン（ｍ３Ψ）、２－チオ－１－メチルシュードウリジン、１－メチル－１－デアザシュードウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザシュードウリジン、ジヒドロシュードウリジン、２－チオジヒドロシュードウリジン、２－メトキシウリジン、２－メトキシ－４－チオウリジン、４－メトキシシュードウリジン、４－メトキシ－２－チオシュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、１－メチル－３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）シュードウリジン（ａｃｐ３Ψ）、及び２’－Ｏ－メチルシュードウリジン（Ψｍ）が挙げられるが、これらに限定されない。
精製された：
本明細書で使用される場合、「精製する」、「精製した」、「精製」は、望ましくない構成成分、材料汚染、混合物、または不完全性から実質的に純粋またはクリアにすることを意味する。
参照核酸配列：
「参照核酸配列」または「参照核酸」または「参照ヌクレオチド配列」または「参照配列」という用語は、配列最適化することができる出発核酸配列（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ配列）を指す。いくつかの実施形態では、参照核酸配列は、野生型核酸配列、その断片またはバリアントである。いくつかの実施形態では、参照核酸配列は、以前に配列最適化核酸配列である。
塩：
いくつかの態様では、送達のための医薬組成物は、本明細書に開示され、それらの脂質成分のいくつかの塩を含む。「塩」という用語は、任意のアニオン性及びカチオン性複合体を含む。アニオンの非限定例としては、無機及び有機アニオンを含む、例えば、フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物、シュウ酸塩（例えば、ヘミシュウ酸塩）、リン酸塩、ホスホン酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素塩、酸化物、炭酸塩、重炭酸塩、硝酸塩、亜硝酸塩、窒化物、亜硫酸水素塩、硫化物、亜硫酸塩、重硫酸塩、硫酸塩、チオ硫酸塩、硫酸水素塩、ホウ酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、乳酸塩、アクリル酸塩、ポリアクリル酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、イタコン酸塩、グリコール酸塩、グルコン酸塩、リンゴ酸塩、マンデル酸塩、チグリン酸、アスコルビン酸塩、サリチル酸塩、ポリメタクリル酸塩、過塩素酸塩、塩素酸塩亜塩素酸塩、次亜塩素酸塩、臭素酸塩、次亜臭素酸塩、ヨウ素酸塩、アルキルスルホン酸塩、アリールスルホン酸塩、ヒ酸塩、亜ヒ酸塩、クロム酸塩、二クロム酸塩、シアン化物、シアン酸塩、チオシアン酸塩、水酸化物、過酸化物、過マンガン酸塩、及びそれらの混合物が挙げられる。
試料：
本明細書中で使用される場合、「試料」または「生物学的試料」という用語は、その組織、細胞、または構成要素部分（例えば、限定されないが、血液、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、羊水、臍帯血、尿、膣液、及び精液を含む体液）のサブセットを指す。試料は、限定されないが、例えば、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、皮膚の外部切片、呼吸器、腸、及び泌尿生殖路、涙液、唾液、乳、血液細胞、腫瘍、または器官を含む、完全な生体もしくはその組織のサブセット、細胞もしくは構成要素部分、または画分もしくはその一部から調製されるホモジネート、溶解物、もしくは抽出物をさらに含むことができる。試料はさらに、タンパク質または核酸分子などの細胞構成成分を含有することができる、栄養ブロスまたはゲルなどの培地を指す。
シグナル配列：
本明細書で使用される場合、「シグナル配列」、「シグナルペプチド」、及び「輸送ペプチド」という語句は、互換的に使用され、特定の細胞小器官、細胞区画、または細胞外排出へのタンパク質の輸送または局在化を導くことができる配列を指す。用語は、シグナル配列ポリペプチド及びシグナル配列をコードする核酸配列の両方を包含する。従って、核酸の文脈でのシグナル配列への言及は、実際には、シグナル配列ポリペプチドをコードする核酸配列を指す。
シグナル伝達経路：
「シグナル伝達経路」は、細胞のある部分から細胞の別の部分へのシグナルの伝達に関与している様々なシグナル伝達分子間の生化学的関係を指す。本明細書で使用される場合、「細胞表面受容体」という語句は、例えば、シグナル及びそのようなシグナルの、細胞の原形質膜を越える伝達を受け取ることができる分子及び分子の複合体を含む。
類似性：
本明細書で使用される場合、「類似性」という用語は、ポリマー分子間の、例えば、ポリヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡ分子及び／もしくはＲＮＡ分子）間の、ならびに／またはポリペプチド分子間の、全体的な関連性を指す。ポリマー分子の相互の類似性パーセントの計算は、類似性パーセントの計算が当該技術分野で理解されるような保存的置換を考慮に入れていることを除いて、同一性パーセントの計算と同じ方法で実施することができる。
単回単位用量：
本明細書で使用される場合、「単回単位用量」は、１回の用量で／一度に／単一経路で／単一の接触点、すなわち、単回投与イベントで、投与される任意の治療薬の用量である。
分割用量：
本明細書で使用される場合、「分割用量」は、単回単位用量または総１日用量の２回以上の用量への分割である。
特異的送達：
本明細書で使用される場合、「特異的送達」、「特異的に送達する」、または「特異的に送達すること」という用語は、オフターゲットの組織（例えば、哺乳動物の脾臓）と比較して、より多く（例えば、少なくとも１．５倍多く、少なくとも２倍多く、少なくとも３倍多く、少なくとも４倍多く、少なくとも５倍多く、少なくとも６倍多く、少なくとも７倍多く、少なくとも８倍多く、少なくとも９倍多く、少なくとも１０倍多く）のポリヌクレオチドのナノ粒子による目的の標的組織（例えば、哺乳動物の肝臓）への送達を意味する。ナノ粒子の特定の組織への送達レベルは、組織中で産生されたタンパク質の量を当該組織の重量と比較すること、組織中のポリヌクレオチドの量を当該組織の重量と比較すること、組織中で産生されたタンパク質の量を当該組織中の総タンパク質の量と比較すること、または組織中のポリヌクレオチド量を、当該組織中の総ポリヌクレオチドの量と比較すること、により測定することができる。例えば、腎血管の標的化の場合、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの全身投与後に肝臓または脾臓に送達されるものと比較して、組織１ｇ当たり、１．５、２倍、３倍、５倍、１０倍、１５倍、または２０倍多いポリヌクレオチドが、腎臓に送達される場合、肝臓及び脾臓と比較して、哺乳動物の腎臓に特異的に提供される。ナノ粒子が標的組織に特異的に送達する能力は、治療される対象において決定される必要はなく、動物モデル（例えば、ラットモデル）などの代用物で決定することができると理解されるだろう。
安定性：
本明細書で使用される場合、「安定性」は、反応混合物からの有用な程度の純度までの単離を耐え抜く十分な強さを有し、いくつかの場合では、有効な治療剤への製剤化が可能な化合物を指す。
安定化した：
本明細書中で使用される場合、「安定化する」、「安定化した」、「安定化した領域」という用語は、安定にさせるか、または安定になることを意味する。
立体異性体：
本明細書中で使用される場合、「立体異性体」という用語は、化合物（例えば、本明細書に記載の任意の式の化合物）が、基本分子構造の全てのジアステレオマー、エナンチオマー、及び／または立体配座異性体を有することができる全ての可能な異なる異性体形態及び立体配座形態、特に、全ての可能な立体化学的及び立体配座的異性体形態、を指す。本発明のいくつかの化合物は、異なる互変異性体形態で存在することができ、後者は全て本発明の範囲内に含まれる。
対象：
「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」は、診断、予後、または治療が望まれる任意の対象、特に、哺乳動物対象を意味する。哺乳動物対象は、ヒト、飼育動物、家畜、動物園動物、スポーツ動物、ペット動物、例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、雌ウシ；霊長類、例えば、類人猿、サル、オランウータン、及びチンパンジー；カニド、例えば、イヌ及びオオカミ；ネコ科動物、例えば、ネコ、ライオン、及びトラ；ウマ科動物、例えば、ウマ、ロバ、及びシマウマ；クマ、食用動物、例えば、雌ウシ、ブタ、及びヒツジ；有蹄動物、例えば、シカ及びキリン；齧歯動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター、及びモルモットなどを含むが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、哺乳動物は、ヒト対象である。他の実施形態では、対象は、ヒト患者である。ある特定の実施形態では、対象は、治療を必要とするヒト患者である。
実質的に：
本明細書で使用される場合、「実質的に」という用語は、目的の特徴または特性の全体またはほぼ全体の程度または程度を示す定性的条件を指す。生物学的及び化学的特徴が、あるとしても、完結し、且つ／または完全まで進行し、または絶対的な結果を達成もしくは回避することはほとんどないことを、生物学の当業者は、理解するであろう。それ故、「実質的に」という用語は、本明細書では、多くの生物学的及び化学的特徴に固有の完全性の潜在的な欠如を捕捉するために使用される。
実質的に同等：
用量間の時間差に関連して本明細書で使用される場合、用語は、プラス／マイナス２％を意味する。
実質的に同時：
本明細書で使用される場合且つ複数の用量に関連する場合、用語は、２秒以内を意味する。
罹患する：
疾患、障害、及び／または状態「に罹患する」個体は、疾患、障害、及び／または状態の１つ以上の徴候または症状と診断されており、またはこれを示す。
影響を受けやすい：
疾患、障害、及び／または状態の影響を受けやすい個体は、症状、障害、及び／もしくは状態の徴候もしくは症状と診断されておらず、及び／またはこれらを示すことができないが、疾患またはその徴候もしくは症状を発症する性質を有する。いくつかの実施形態では、疾患、障害、及び／または状態（例えば、ＡＩＰ）の影響を受けやすい個体は、以下、（１）疾患、障害、及び／または状態の発症に関連する遺伝的変異、（２）疾患、障害、及び／または状態の発症に関連する遺伝的多型、（３）疾患、障害、及び／または状態に関連するタンパク質及び／または核酸の発現及び／または活性の増加及び／または減少、（４）疾患、障害、及び／または状態の発症に関連する習慣及び／または生活様式、（５）疾患、障害、及び／または状態の家族歴、ならびに、（６）疾患、障害、及び／または状態の発症に関連する微生物への曝露及び／または感染のうちの１つ以上により特徴づけることができる。いくつかの実施形態では、疾患、障害、及び／または状態の影響を受けやすい個体は、疾患、障害、及び／または状態を発症するであろう。いくつかの実施形態では、疾患、障害、及び／または状態の影響を受けやすい個体は、疾患、障害、及び／または状態を発症しないであろう。
持続放出：
本明細書で使用される場合、「持続放出」という用語は、特定期間にわたる放出速度に適合する医薬組成物または化合物の放出プロファイルを指す。
合成：
「合成」という用語は、人の手により作成、調製、及び／または製造されることを意味する。本発明のポリヌクレオチドまたは他の分子の合成は、化学的または酵素的であることができる。
標的細胞：
本明細書で使用される場合、「標的細胞」は、目的の１つ以上の任意の細胞を指す。細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｓｉｔｕ、または生体の組織もしくは器官で見出すことができる。生体は、動物、例えば、哺乳動物、ヒト、対象、または患者とすることができる。
標的組織：
本明細書で使用される場合、「標的組織」は、ポリヌクレオチドの送達が所望の生物学的及び／または薬理学的効果をもたらす、目的の１つ以上の任意の組織型を指す。目的の標的組織の例としては、特定の組織、器官、及びそれらの系または群が挙げられる。特定用途では、標的組織は、肝臓、腎臓、肺、脾臓、または血管（例えば、冠動脈内または大腿内）内の血管内皮とすることができる。「オフターゲットの組織」は、コードされたタンパク質の発現が所望の生物学的及び／または薬理学的効果をもたらさない任意の１つ以上の組織型を指す。
オフターゲット問題における治療薬の存在は、（ｉ）拡散による、もしくは血流を通した、ポリヌクレオチドの投与部位から末梢組織もしくは離れたオフターゲットの組織への漏れ（例えば、特定の組織内でポリペプチドを発現するように意図されるポリヌクレオチドは、オフターゲットの組織に到達することになり、ポリペプチドは、オフターゲットの組織内で発現されることになる）、または（ｉｉ）拡散による、もしくは血流を通した、そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの投与後のポリペプチドの抹消組織もしくは離れたオフターゲットの組織への漏れ（例えば、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを標的組織内で発現することになり、ポリペプチドは、末梢組織へ拡散することになる）の結果とすることができる。
標的化配列：
本明細書で使用される場合、「標的化配列」という語句は、タンパク質またはポリペプチドの輸送または局在化を導くことができる配列を指す。
末端：
本明細書で使用される場合、「末端」（複数可）という用語は、ポリペプチドに言及する時、ペプチドまたはポリペプチドの末端を指す。そのような末端は、ペプチドまたはポリペプチドの最初または最終部位のみに限定されず、末端領域にさらなるアミノ酸を含むことができる。本発明のポリペプチドをベースとする分子は、（遊離アミノ基（ＮＨ２）を有するアミノ酸を末端とする）Ｎ末端及び（遊離カルボキシル基（ＣＯＯＨ）を有するアミノ酸を末端とする）Ｃ末端の両方を有することを特徴とすることができる。本発明のタンパク質は、いくつかの場合では、ジスルフィド結合または非共有結合力により１つにされた複数のポリペプチド鎖（多量体、オリゴマー）で構成されている。これらの種類のタンパク質は、複数のＮ末端及びＣ末端を有するであろう。あるいは、ポリペプチドの末端は、それらが、場合に応じて、有機コンジュゲートなどの非ポリペプチドをベースとする部分で、開始または終了するように修飾することができる。
治療薬：
「治療薬」という用語は、対象に投与される時、治療的、診断的、及び／もしくは予防的効果を有し、及び／または所望の生物学的及び／もしくは薬理学的効果を誘発する薬剤を指す。例えば、いくつかの実施形態では、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、治療薬とすることができる。
治療有効量：
本明細書で使用される場合、「治療的有効量」という用語は、感染、疾患、障害、及び／もしくは状態に罹患している、またはこれらの影響を受けやすい対象に投与される時、感染、疾患、障害、及び／または状態の発症を、治療し、これらの徴候もしくは症状を好転させ、診断し、予防し、且つ／または遅延させるのに十分である送達されるべき薬剤（例えば、核酸、薬物、治療薬、診断薬、予防薬など）の量を意味する。
治療上有効な結果：
本明細書で使用される場合、「治療上有効な結果」という用語は、感染、疾患、障害、及び／もしくは状態に罹患している、またはこれらの影響を受けやすい対象の、感染、疾患、障害、及び／または状態の発症を治療し、これらの徴候もしくは症状を好転させ、診断し、予防し、且つ／または遅延させるのに十分である結果を意味する。
総１日用量：
本明細書で使用される場合、「総１日用量」は、２４時間の期間に与えられるか、または処方される量である。総１日用量は、単回単位用量または分割用量として投与することができる。
転写因子：
本明細書で使用される場合、「転写因子」という用語は、例えば、転写の活性化または抑制により、ＤＮＡのＲＮＡへの転写を制御するＤＮＡ結合タンパク質を指す。いくつかの転写因子は、単独で転写の制御をもたらすが、他の転写因子は、他のタンパク質と一緒に作用する。いくつかの転写因子は、ある特定の条件下で転写を活性化することも抑制することもできる。一般に、転写因子は、標的遺伝子の制御領域において特定の標的配列または具体的なコンセンサス配列と高度に類似する配列と結合する。転写因子は、標的遺伝子の転写を単独で、または他の分子との複合体中で、調節することができる。
転写：
本明細書で使用される場合、「転写」という用語は、ＤＮＡ（例えば、ＤＮＡ鋳型または配列）からｍＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ配列または鋳型）を産生する方法を指す。
形質移入：
本明細書中で使用される場合、「形質移入」は、ポリヌクレオチド（例えば、外因性核酸）の細胞への導入を指し、ポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドが発現され（例えば、ｍＲＮＡ）、またはポリペプチドが細胞機能を調節する（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）。本明細書で使用される場合、核酸配列の「発現」は、のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）のポリペプチドもしくはタンパク質への翻訳、及び／または、ポリペプチドもしくはタンパク質の翻訳後修飾、を指す。形質移入の方法は、化学的方法、物理的処理、及びカチオン性脂質または混合物を含むが、これらに限定されない。
処置すること、処置、治療：
本明細書で使用される場合、「処置すること」または「処置」または「治療」という用語は、疾患、例えば、急性間欠性ポルフィリン症、の１つ以上の徴候、症状、または特徴を、部分的または完全に緩和すること、改善すること、好転させること、軽減すること、これらの発症を遅延すること、これらの進行を阻害すること、これらの重症度を低減すること、及び／またはこれらの発生率を低減すること、を指す。例えば、急性間欠性ポルフィリン症を「処置すること」は、疾患と関連する徴候または症状の減少、患者の寿命延長（生存率の増加）、疾患の重篤度の低減、疾患の発症の予防または遅延することなどを指すことができる。処置は、疾患、障害、及び／もしくは状態に関連する病状を発症するリスクを減少させるために、疾患、障害、及び／もしくは状態の徴候を示さない対象、ならびに／及び、疾患、障害、及び／もしくは状態の初期徴候のみを示す対象に投与することができる。
非修飾：
本明細書で使用される場合、「未修飾」は、一部の方法で、変更される前の任意の物質、化合物、または分子を指す。非修飾は、野生型または天然形態の生体分子を指すことができるが、必ずしも指すとは限らない。分子は、一連の修飾を受けることができ、それにより、それぞれの修飾分子は、その後の修飾のための「非修飾」出発分子として機能することができる。
ウラシル：
ウラシルは、ＲＮＡの核酸の４つの核酸塩基のうちの１つであり、それは、文字Ｕで表される。ウラシルは、β－Ｎ１－グリコシド結合を介して、リボース環、または、より具体的には、リボフラノースと結合させて、ヌクレオシドウリジンを得ることができる。ヌクレオシドウリジンはまた、一般に、１文字コードの核酸塩基、すなわち、Ｕと略記される。従って、本開示の文脈では、ポリヌクレオチド配列中のモノマーがＵである場合、そのようなＵは、「ウラシル」または「ウリジン」として互換的に称される。
ウリジン含有量：
「ウリジン含有量」または「ウラシル含有量」という用語は、互換的であり、ある特定の核酸配列中に存在するウラシルまたはウリジンの量を指す。ウリジン含有量またはウラシル含有量は、絶対値（配列中のウリジンまたはウラシルの総数）または相対値（核酸配列中の核酸塩基の総数に対するウリジンまたはウラシル百分率）として表すことができる。
ウリジン修飾配列：
「ウリジン修飾配列」という用語は、候補核酸配列のウリジン含有量及び／またはウリジンパターンに対する、異なる全体的なまたは局所ウリジン含有量（より高いまたはより低いウリジン含有量）を有する、または、異なるウリジンパターン（例えば、勾配分布またはクラスタリング）を有する配列最適化核酸（例えば、合成ｍＲＮＡ配列）を指す。本開示の文脈では、「ウリジン修飾配列」及び「ウラシル修飾配列」という用語は、同等であり、且つ互換性があるとみなされる。
「高ウリジンコドン」は、２つまたは３つのウリジンを含むコドンとして定義され、「低ウリジンコドン」は、１つのウリジンを含むコドンとして定義され、「無ウリジンコドン」は、いずれのウリジンもないコドンである。いくつかの実施形態では、ウリジン修飾配列は、高ウリジンコドンの低ウリジンコドンとの置換、高ウリジンコドンの無ウリジンコドンとの置換、低ウリジンコドンの高ウリジンコドンとの置換、低ウリジンコドンの無ウリジンコドンとの置換、無ウリジンコドンの低ウリジンコドンとの置換、無ウリジンコドンの高ウリジンコドンとの置換、及びそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、高ウリジンコドンは、別の高ウリジンコドンで置換することができる。いくつかの実施形態では、低ウリジンコドンは、別の低ウリジンコドンで置換することができる。いくつかの実施形態では、無ウリジンコドンは、別の無ウリジンコドンで置換することができる。ウリジン修飾配列は、ウリジン富化またはウリジン希薄化することができる。
ウリジン富化：
本明細書で使用される場合、「ウリジン富化」という用語及び文法上の変形は、対応する候補核酸配列のウリジン含有量に対する配列最適化核酸（例えば、合成ｍＲＮＡ配列）中の（絶対値で表されるか、または百分率値として表される）ウリジン含有量の増加を指す。ウリジン富化は、候補核酸配列中のコドンを、より少ないウリジン核酸塩基を含有する同義コドンで置換することにより実施することができる。ウリジン富化は、全体的（すなわち、候補核酸配列の全長に対する）または局所的（すなわち、候補核酸配列の部分配列もしくは領域に対する）であることができる。
ウリジン希薄化：
本明細書で使用される場合、「ウリジン希薄化」という用語及び文法上の変形は、対応する候補核酸配列のウリジン含有量に対する配列最適化核酸（例えば、合成ｍＲＮＡ配列）中の（絶対値で表されるか、または百分率値として表される）ウリジン含有量の減少を指す。ウリジン希薄化は、候補核酸配列中のコドンを、より少ないウリジン核酸塩基を含有する同義コドンで置換することにより実施することができる。ウリジン希薄化は、全体的（すなわち、候補核酸配列の全長に対する）または局所的（すなわち、候補核酸配列の部分配列もしくは領域に対する）であることができる。
バリアント：
本開示で使用されるバリアントという用語は、天然バリアント（例えば、多型、アイソフォームなど）及び天然または出発配列（例えば、野生型配列）中の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去されており、且つ異なるアミノ酸が同じ場所のその位置に挿入されている人工バリアントの両方を指す。これらのバリアントは、「置換バリアント」として記載することができる。置換は、分子中の１つのアミノ酸のみが置換されている単一であることができ、または置換は、２つ以上のアミノ酸が同じ分子中で置換されている複数であることができる。アミノ酸が挿入または欠失させる場合、得られるバリアントは、それぞれ、「挿入バリアント」または「欠失バリアント」であろう。
３０．実施形態
このセクションを通して、実施形態という用語は、序数が続く「Ｅ」と略記される。例えば、Ｅ１は、実施形態１と同等である。
Ｅ１．ポリヌクレオチドであって、ポルフォビリノゲン脱アミノ酵素（ＰＢＧＤ）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、前記ＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の理論的最小ウラシルまたはチミン含有量に対する、前記ＯＲＦのウラシルまたはチミン含有量（％ＵＴＭまたは％ＴＴＭ）が、約１００％～約１５０％である、前記ポリヌクレオチド。
Ｅ２．前記％ＵＴＭまたは％ＴＴＭが、約１０５％～約１４５％、約１０５％～約１４０％、約１１０％～約１４０％、約１１０％～約１４５％、約１１５％～約１３５％、約１０５％～約１３５％、約１１０％～約１３５％、約１１５％～約１４５％、または約１１５％～約１４０％である、Ｅ１に記載のポリヌクレオチド。
Ｅ３．前記％ＵＴＭまたは％ＴＴＭが、（ｉ）１１０％、１１１％、１１２％、１１３％、１１４％、１１５％、１１６％、１１７％、または１１８％及び（ｉｉ）１３２％、１３３％、１３４％、１３５％、１３６％、１３７％、１３８％、１３９％、または１４０％の間である、Ｅ２に記載のポリヌクレオチド。
Ｅ４．対応する野生型ＯＲＦのウラシルまたはチミン含有量に対する、前記ＯＲＦのウラシルまたはチミン含有量（％ＵＷＴまたは％ＴＷＴ）が、１００％未満である、Ｅ１～Ｅ３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
Ｅ５．前記％ＵＷＴまたは％ＴＷＴが、約９５％未満、約９０％未満、約８５％未満、８０％未満、７９％未満、７８％未満、７７％未満、７６％未満、７５％未満、７４％未満、または７３％未満である、Ｅ４に記載のポリヌクレオチド。
Ｅ６．前記％ＵＷＴまたは％ＴＷＴが、６５％～７３％である、Ｅ４に記載のポリヌクレオチド。
Ｅ７．前記ＯＲＦ中の総ヌクレオチド含有量に対する、前記ＯＲＦ中のウラシルまたはチミン含有量（％ＵＴＬまたは％ＴＴＬ）が、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、または約１９％未満である、Ｅ１～Ｅ６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
Ｅ８．前記％ＵＴＬまたは％ＴＴＬが、約１９％未満である、Ｅ７に記載のポリヌクレオチド。
Ｅ９．前記％ＵＴＬまたは％ＴＴＬが、約１３％～約１５％である、Ｅ１～Ｅ８のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
Ｅ１０．前記ＰＢＧＤのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の理論的最大グアニン含有量に対する、前記ＯＲＦのグアニン含有量（％ＧＴＭＸ）が、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％である、Ｅ１～Ｅ９のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
Ｅ１１．前記％ＧＴＭＸが、約７０％～約８０％、約７１％～約７９％、約７１％～約７８％、または約７１％～約７７％である、Ｅ１０に記載のポリヌクレオチド。
Ｅ１２．前記ＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の理論的最大シトシン含有量に対する、前記ＯＲＦのシトシン含有量（％ＣＴＭＸ）が、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％である、Ｅ１～Ｅ１１のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
Ｅ１３．前記％ＣＴＭＸが、約６０％～約８０％、約６２％～約８０％、約６３％～約７９％、または約６８％～約７６％である、Ｅ１２に記載のポリヌクレオチド。
Ｅ１４．前記ＰＢＧＤのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列中の理論的最大グアニン及びシトシン含有量（Ｇ／Ｃ）に対する、前記ＯＲＦのＧ／Ｃ含有量（％Ｇ／ＣＴＭＸ）が、少なくとも約８１％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％である、Ｅ１～Ｅ１３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
Ｅ１５．前記％Ｇ／ＣＴＭＸが、約８０％～約１００％、約８５％～約９９％、約９０％～約９７％、または約９１％～約９６％である、Ｅ１～Ｅ１３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
Ｅ１６．対応する野生型ＯＲＦ中のＧ／Ｃ含有量に対する、前記ＯＲＦ中のＧ／Ｃ含有量（％Ｇ／ＣＷＴ）が、少なくとも１０２％、少なくとも１０３％、少なくとも１０４％、少なくとも１０５％、少なくとも１０６％、少なくとも１０７％、少なくとも１１０％、少なくとも１１５％、または少なくとも１２０％である、Ｅ１～Ｅ１５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
Ｅ１７．前記ＯＲＦ内の第３のコドン位置での平均Ｇ／Ｃ含有量が、対応する野生型ＯＲＦ内の第３のコドン位置での平均Ｇ／Ｃ含有量よりも、少なくとも２０％、少なくとも２１％、少なくとも２２％、少なくとも２３％、少なくとも２４％、少なくとも２５％、少なくとも２６％、少なくとも２７％、少なくとも２８％、少なくとも２９％、または少なくとも３０％高い、Ｅ１～Ｅ１５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
Ｅ１８．前記ＯＲＦが、少なくとも１つの低頻度コドンをさらに含む、Ｅ１～Ｅ１７のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
Ｅ１９．（ｉ）前記ＯＲＦが、ＰＢＧＤ－ＣＯ３もしくはＰＢＧＤ－ＣＯ２５と、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一である、
（ｉｉ）前記ＯＲＦが、ＰＢＧＤ－ＣＯ１、ＰＢＧＤ－ＣＯ２、ＰＢＧＤ－ＣＯ７、ＰＢＧＤ－ＣＯ１１、ＰＢＧＤ－ＣＯ１３、ＰＢＧＤ－ＣＯ１４、ＰＢＧＤ－ＣＯ１６、もしくはＰＢＧＤ－ＣＯ２４、と少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一である、
（ｉｉｉ）前記ＯＲＦが、ＰＢＧＤ－ＣＯ５、ＰＢＧＤ－ＣＯ９、ＰＢＧＤ－ＣＯ１０、ＰＢＧＤ－ＣＯ１２、ＰＢＧＤ－ＣＯ１５、ＰＢＧＤ－ＣＯ１７、ＰＢＧＤ－ＣＯ１８、ＰＢＧＤ－ＣＯ１９、ＰＢＧＤ－ＣＯ２０、ＰＢＧＤ－ＣＯ２１、もしくはＰＢＧＤ－ＣＯ２２と、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一である、
（ｉｖ）前記ＯＲＦが、ＰＢＧＤ－ＣＯ６、ＰＢＧＤ－ＣＯ８、ＰＢＧＤ－ＣＯ２３と、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一である、または
（ｖ）前記ＯＲＦが、ＰＢＧＤ－ＣＯ４と、少なくとも９１％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一である、Ｅ１～Ｅ１８のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
Ｅ２０．ＯＲＦを含むポリヌクレオチドであって、
（ｉ）前記ＯＲＦが、ＰＢＧＤ－ＣＯ３もしくはＰＢＧＤ－ＣＯ２５と、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一である、
（ｉｉ）前記ＯＲＦが、ＰＢＧＤ－ＣＯ１、ＰＢＧＤ－ＣＯ２、ＰＢＧＤ－ＣＯ７、ＰＢＧＤ－ＣＯ１１、ＰＢＧＤ－ＣＯ１３、ＰＢＧＤ－ＣＯ１４、ＰＢＧＤ－ＣＯ１６、もしくはＰＢＧＤ－ＣＯ２４、と少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一である、
（ｉｉｉ）前記ＯＲＦが、ＰＢＧＤ－ＣＯ５、ＰＢＧＤ－ＣＯ９、ＰＢＧＤ－ＣＯ１０、ＰＢＧＤ－ＣＯ１２、ＰＢＧＤ－ＣＯ１５、ＰＢＧＤ－ＣＯ１７、ＰＢＧＤ－ＣＯ１８、ＰＢＧＤ－ＣＯ１９、ＰＢＧＤ－ＣＯ２０、ＰＢＧＤ－ＣＯ２１、もしくはＰＢＧＤ－ＣＯ２２と、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一である、
（ｉｖ）前記ＯＲＦが、ＰＢＧＤ－ＣＯ６、ＰＢＧＤ－ＣＯ８、ＰＢＧＤ－ＣＯ２３と、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一である、または
（ｖ）前記ＯＲＦが、ＰＢＧＤ－ＣＯ４と、少なくとも９１％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一である、前記ポリヌクレオチド。
Ｅ２１．前記ＯＲＦが、配列番号９～３３からなる群から選択される配列と、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する、Ｅ１～Ｅ２０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
Ｅ２２．前記ＰＢＧＤポリペプチドが、（ｉ）野生型ＰＢＧＤのポリペプチド配列、アイソフォーム１（配列番号１）、（ｉｉ）野生型ＰＢＧＤのポリペプチド配列、アイソフォーム２（配列番号３）、野生型ＰＢＧＤのポリペプチド配列、アイソフォーム３（配列番号５）、または野生型ＰＢＧＤのポリペプチド配列、アイソフォーム４（配列番号７）と、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含み、前記ＰＢＧＤポリペプチドが、ポルフォビリノゲン脱アミノ酵素活性を有する、Ｅ１～Ｅ２１のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
Ｅ２３．前記ＰＢＧＤポリペプチドが、ポルフォビリノゲン脱アミノ酵素活性を有するバリアント、誘導体、または変異体である、Ｅ２２に記載のポリヌクレオチド。
Ｅ２４．前記ポリヌクレオチド配列が、輸送ペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、Ｅ１～Ｅ２３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
Ｅ２５．前記ポリヌクレオチドが、一本鎖である、Ｅ１～Ｅ２４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
Ｅ２６．前記ポリヌクレオチドが、二本鎖である、Ｅ１～Ｅ２４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
Ｅ２７．前記ポリヌクレオチドが、ＤＮＡである、Ｅ１～Ｅ２６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
Ｅ２８．前記ポリヌクレオチドが、ＲＮＡである、Ｅ１～Ｅ２６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
Ｅ２９．前記ポリヌクレオチドが、ｍＲＮＡである、Ｅ２８の記載のポリヌクレオチド。
Ｅ３０．前記ポリヌクレオチドが、少なくとも１つの化学修飾核酸塩基、糖、主鎖、またはそれらの任意の組み合わせを含む、Ｅ１～Ｅ２９のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
Ｅ３１．前記少なくとも１つの化学修飾核酸塩基が、シュードウラシル（Ψ）、Ｎ１－メチルシュードウラシル（ｍ１Ψ）、２－チオウラシル（ｓ２Ｕ）、４’－チオウラシル、５－メチルシトシン、５－メチルウラシル、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、Ｅ３０に記載のポリヌクレオチド。
Ｅ３２．前記少なくとも１つの化学修飾核酸塩基が、５－メトキシウラシルである、Ｅ３０の記載のポリヌクレオチド。
Ｅ３３．前記ウラシルの少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％が、５－メトキシウラシルである、Ｅ３２に記載のポリヌクレオチド。
Ｅ３４．前記ポリヌクレオチドが、ｍｉＲＮＡ結合部位をさらに含む、Ｅ１～Ｅ３３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
Ｅ３５．前記ｍｉＲＮＡ結合部位が、配列番号３６及び配列番号３８から選択される１つ以上のヌクレオチド配列を含む、Ｅ３４に記載のポリヌクレオチド。
Ｅ３６．前記ｍｉＲＮＡ結合部位が、ｍｉＲ－１４２に結合する、Ｅ３４に記載のポリヌクレオチド。
Ｅ３７．前記ｍｉＲＮＡ結合部位が、ｍｉＲ－１４２－３ｐまたはｍｉＲ－１４２－５ｐに結合する、Ｅ３５またはＥ３６に記載のポリヌクレオチド。
Ｅ３８．前記ｍｉＲ１４２が、配列番号３４を含む、Ｅ３６またはＥ３７に記載のポリヌクレオチド。
Ｅ３９．前記ポリヌクレオチドが、５’ＵＴＲをさらに含む、Ｅ１～Ｅ３８のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
Ｅ４０．前記５’ＵＴＲが、配列番号３９～５６またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される５’ＵＴＲ配列と、少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一である核酸配列を含む、Ｅ３９に記載のポリヌクレオチド。
Ｅ４１．前記ポリヌクレオチドが、３’ＵＴＲをさらに含む、Ｅ１～Ｅ４０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
Ｅ４２．前記３’ＵＴＲが、配列番号５７～８１またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される３’ＵＴＲ配列と、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一である核酸配列を含む、Ｅ４１に記載のポリヌクレオチド。
Ｅ４３．前記ｍｉＲＮＡ結合部位が、前記３’ＵＴＲ内に位置する、Ｅ４１またはＥ４２に記載のポリヌクレオチド。
Ｅ４４．前記ポリヌクレオチドが、５’末端キャップをさらに含む、Ｅ１～Ｅ４３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
Ｅ４５．前記５’末端キャップが、Ｃａｐ０、Ｃａｐ１、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎ１－メチルグアノシン、２’－フルオログアノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソグアノシン、２－アミノグアノシン、ＬＮＡ－グアノシン、２－アジドグアノシン、Ｃａｐ２、Ｃａｐ４、５’メチルＧキャップ、またはそれらのアナログを含む、Ｅ４４に記載のポリヌクレオチド。
Ｅ４６．前記ポリヌクレオチドが、ポリＡ領域をさらに含む、Ｅ１～Ｅ４５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
Ｅ４７．前記ポリＡ領域が、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、または少なくとも約９０ヌクレオチド長である、Ｅ４６に記載のポリヌクレオチド。
Ｅ４８．前記ポリＡ領域が、約１０～約２００、約２０～約１８０、約５０～約１６０、約７０～約１４０、約８０～約１２０ヌクレオチド長を有する、Ｅ４７に記載のポリヌクレオチド。
Ｅ４９．前記ポリヌクレオチドが、１つ以上の異種ポリペプチドに融合されるＰＢＧＤポリペプチドをコードする、Ｅ１～Ｅ４８のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
Ｅ５０．前記１つ以上の異種ポリペプチドが、前記ＰＢＧＤポリペプチドの薬物動態特性を増加させる、Ｅ４９に記載のポリヌクレオチド。
Ｅ５１．対象への投与時に、前記ポリヌクレオチドが、配列番号２、４、６、または８を含む対応するポリヌクレオチドと比較して、
（ｉ）より長い血漿半減期、
（ｉｉ）前記ＯＲＦによりコードされるＰＢＧＤポリペプチドの増加した発現、
（ｉｉｉ）発現断片を生じる翻訳中断のより低い頻度、
（ｉｖ）より大きな構造安定性、または
（ｖ）それらの任意の組み合わせ、
を有する、Ｅ１～Ｅ５０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
Ｅ５２．前記ポリヌクレオチドが、
（ｉ）５’末端キャップ、
（ｉｉ）５’ＵＴＲ、
（ｉｉｉ）ＰＢＧＤポリペプチドをコードするＯＲＦ、
（ｉｖ）３’ＵＴＲ、及び
（ｖ）ポリＡ領域、
を含む、Ｅ１～Ｅ５１のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
Ｅ５３．前記３’ＵＴＲが、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む、Ｅ５２に記載のポリヌクレオチド。
Ｅ５４．Ｅ１～Ｅ５３に記載のポリヌクレオチドを製造する方法であって、前記方法が、少なくとも１つのウラシル核酸塩基を、アデニン、グアニン、もしくはシトシン核酸塩基で置換することにより、または、少なくとも１つのアデニン、グアニン、もしくはシトシン核酸塩基を、ウラシル核酸塩基で置換することにより、ＰＢＧＤポリペプチドをコードするＯＲＦを修飾することを含み、前記置換全てが、同義置換である、前記方法。
Ｅ５５．前記方法が、ウラシルの少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または約１００％を、５－メトキシラシルで置換することをさらに含む、Ｅ５４に記載の方法。
Ｅ５６．（ａ）Ｅ１～Ｅ５３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド、及び
（ｂ）送達剤
を含む組成物。
Ｅ５７．前記送達剤が、脂質様物質、リポソーム、リポプレックス、脂質ナノ粒子、ポリマー化合物、ペプチド、タンパク質、細胞、ナノ粒子模倣物、ナノチューブ、またはコンジュゲートを含む、Ｅ５６に記載の組成物。
Ｅ５８．前記送達剤が、脂質ナノ粒子を含む、Ｅ５６に記載の組成物。
Ｅ５９．前記脂質ナノ粒子が、３－（ジドデシルアミノ）－Ｎ１，Ｎ１，４－トリドデシル－１－ピペラジンエタンアミン（ＫＬ１０）、Ｎ１－［２－（ジドデシルアミノ）エチル］－Ｎ１，Ｎ４，Ｎ４－トリドデシル－１，４－ピペラジンジエタンアミン（ＫＬ２２）、１４，２５－ジトリデシル－１５，１８，２１，２４－テトラアザ－オクタトリアコンタン（ＫＬ２５）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノメチル）ブタノアート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、（１３Ｚ，１６５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－ノニドコサ－１３－１６－ジエン－１－アミン（Ｌ６０８）、２－（｛８－［（３β）－コレスタ－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ）、（２Ｒ）－２－（｛８－［（３β）－コレスタ－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｒ））、（２Ｓ）－２－（｛８－［（３β）－コレスタ－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｓ））、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される脂質を含む、Ｅ５８の組成物。
Ｅ６０．Ｅ５６～Ｅ５９のいずれか１つに記載の組成物であって、前記送達剤が、式（Ｉ）を有する化合物
Figure 2023062097000210
 （Ｉ）、
またはその塩もしくは立体異性体であり、式中、
Ｒ１は、Ｃ５－２０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立に、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１－６アルキルからなる群から選択され、式中、Ｑは、炭素環、複素環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、及び－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは独立に、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５は独立に、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は独立に、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’は独立に、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒは独立に、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は独立に、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立に、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は独立に、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは独立に、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘは独立に、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択され、
Ｒ４が－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、または－ＣＱ（Ｒ）２である場合、（ｉ）ｎが、１、２、３、４、もしくは５である時、Ｑは、－Ｎ（Ｒ）２ではなく、または（ｉｉ）ｎが、１もしくは２である時、Ｑは、５員、６員、もしくは７員ヘテロシクロアルキルではないことを条件とする、前記組成物。
Ｅ６１．ＰＢＧＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列及び送達剤を含む組成物であって、前記送達剤が、式（Ｉ）を有する化合物
Figure 2023062097000211
 （Ｉ）、
またはその塩もしくは立体異性体であり、式中、
Ｒ１は、Ｃ５－２０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立に、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１－６アルキルからなる群から選択され、式中、Ｑは、炭素環、複素環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、及び－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは独立に、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５は独立に、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は独立に、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’は独立に、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒは独立に、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は独立に、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立に、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は独立に、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは独立に、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘは独立に、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択され、
Ｒ４が－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、または－ＣＱ（Ｒ）２である場合、（ｉ）ｎが、１、２、３、４、もしくは５である時、Ｑは、－Ｎ（Ｒ）２ではなく、または（ｉｉ）ｎが、１もしくは２である時、Ｑは、５員、６員、もしくは７員ヘテロシクロアルキルではないことを条件とする、前記組成物。
Ｅ６２．前記化合物が、式（ＩＡ）の化合物：
Figure 2023062097000212
 （ＩＡ）、
またはその塩もしくは立体異性体であり、式中、
ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され、
ｍは、５、６、７、８、及び９から選択され、
Ｍ１は、結合またはＭ’であり、
Ｒ４は、非置換Ｃ１－３アルキル、または－（ＣＨ２）ｎＱであり、式中、ｎは、１、２、３、４、もしくは５であり、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、もしくは－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２であり、
Ｍ及びＭ’は独立に、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立に、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択される、Ｅ６０またはＥ６１に記載の組成物。
Ｅ６３．ｍが、５、７、または９である、Ｅ６０～Ｅ６２のいずれか１つに記載の組成物。
Ｅ６４．前記化合物が、式（ＩＩ）の化合物：
Figure 2023062097000213
 （ＩＩ）、
またはその塩もしくは立体異性体であり、式中、
ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され、
Ｍ１は、結合またはＭ’であり、
Ｒ４は、非置換Ｃ１－３アルキル、または－（ＣＨ２）ｎＱであり、式中、ｎは、２、３、もしくは４であり、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、もしくは－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２であり、
Ｍ及びＭ’は独立に、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立に、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択される、Ｅ６０～Ｅ６３のいずれか１つに記載の組成物。
Ｅ６５．Ｍ１が、Ｍ’である、Ｅ６２～Ｅ６４のいずれか１つに記載の組成物。
Ｅ６６．Ｍ及びＭ’が独立に、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－または－ＯＣ（Ｏ）－である、Ｅ６５に記載の組成物。
Ｅ６７．ｌが、１、３、または５である、Ｅ６２～Ｅ６６のいずれか１つに記載の組成物。
Ｅ６８．前記化合物が、化合物１～化合物１４７、それらの塩及び立体異性体、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、Ｅ６０またはＥ６１に記載の組成物。
Ｅ６９．前記化合物が、式（ＩＩａ）の化合物
Figure 2023062097000214
 （ＩＩａ）
またはその塩もしくは立体異性体である、Ｅ６０またはＥ６１に記載の組成物。
Ｅ７０．前記化合物が、式（ＩＩｂ）の化合物
Figure 2023062097000215
 （ＩＩｂ）
またはその塩もしくは立体異性体である、Ｅ６０またはＥ６１に記載の組成物。
Ｅ７１．前記化合物が、式（ＩＩｃ）または（ＩＩｅ）の化合物
Figure 2023062097000216
 （ＩＩｃ）、
Figure 2023062097000217
 （ＩＩｅ）、
またはその塩もしくは立体異性体である、Ｅ６０またはＥ６１に記載の組成物。
Ｅ７２．Ｒ４が、－（ＣＨ２）ｎＱ及び－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲから選択される、Ｅ６９～Ｅ７１のいずれか１つに記載の組成物。
Ｅ７３．前記化合物が、式（ＩＩｄ）の化合物
Figure 2023062097000218
 （ＩＩｄ）
またはその塩もしくは立体異性体であり、
式中、Ｒ２及びＲ３は独立に、Ｃ５－１４アルキル及びＣ５－１４アルケニルからなる群から選択され、ｎは、２、３、及び４から選択され、Ｒ’、Ｒ”、Ｒ５、Ｒ６、及びｍは、Ｅ６０またはＥ６１に規定される通りである、Ｅ６０またはＥ６１に記載の組成物。
Ｅ７４．Ｒ２が、Ｃ８アルキルである、Ｅ７３に記載の組成物。
Ｅ７５．Ｒ３が、Ｃ５アルキル、Ｃ６アルキル、Ｃ７アルキル、Ｃ８アルキル、またはＣ９アルキルである、Ｅ７４に記載の組成物。
Ｅ７６．ｍが、５、７、または９である、Ｅ７３～Ｅ７５のいずれか１つに記載の組成物。
Ｅ７７．各Ｒ５が、Ｈである、Ｅ７３～Ｅ７６のいずれか１つに記載の組成物。
Ｅ７８．各Ｒ６が、Ｈである、Ｅ７７に記載の組成物。
Ｅ７９．ナノ粒子組成物である、Ｅ６０～Ｅ７８のいずれか１つに記載の組成物。
Ｅ８０．前記送達剤が、リン脂質をさらに含む、Ｅ７９に記載の組成物。
Ｅ８１．前記リン脂質が、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジウンデカノイル－ｓｎ－グリセロホスホコリン（ＤＵＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０のジエーテルＰＣ）、１－オレオイル－２－コレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（Ｃ１６Ｌｙｓｏ ＰＣ）、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＭＥ １６：０ ＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、スフィンゴミエリン、及びそれらの任意の混合物からなる群から選択される、Ｅ８０に記載の組成物。
Ｅ８２．前記送達剤が、構造脂質をさらに含む、Ｅ６０～Ｅ８１のいずれか１つに記載の組成物。
Ｅ８３．前記構造脂質が、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、ブウルソル酸、アルファ－トコフェロール、及びそれらの任意の混合物からなる群から選択される、Ｅ８２に記載の組成物。
Ｅ８４．前記送達剤が、ＰＥＧ脂質をさらに含む、Ｅ６０～Ｅ８３のいずれか１つに記載の組成物。
Ｅ８５．前記ＰＥＧ脂質が、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの任意の混合物からなる群から選択される、Ｅ８４に記載の組成物。
Ｅ８６．前記送達剤が、３－（ジドデシルアミノ）－Ｎ１，Ｎ１，４－トリドデシル－１－ピペラジンエタンアミン（ＫＬ１０）、Ｎ１－［２－（ジドデシルアミノ）エチル］－Ｎ１，Ｎ４，Ｎ４－トリドデシル－１，４－ピペラジンジエタンアミン（ＫＬ２２）、１４，２５－ジトリデシル－１５，１８，２１，２４－テトラアザ－オクタトリアコンタン（ＫＬ２５）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノメチル）ブタノアート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、２－（｛８－［（３β）－コレスタ－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ）、（２Ｒ）－２－（｛８－［（３β）－コレスタ－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｒ））、及び（２Ｓ）－２－（｛８－［（３β）－コレスタ－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｓ））からなる群から選択されるイオン性脂質をさらに含む、Ｅ６０～Ｅ８５のいずれか１つに記載の組成物。
Ｅ８７．前記送達剤が、リン脂質、構造脂質、ＰＥＧ脂質、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む、Ｅ６０～Ｅ８６のいずれか１つに記載の組成物。
Ｅ８８．前記組成物が、ｉｎ ｖｉｖｏ送達のために製剤化される、Ｅ６０～Ｅ８７のいずれか１つに記載の組成物。
Ｅ８９．筋肉内、皮下、または皮内送達のために製剤化される、Ｅ６０～Ｅ８８のいずれか１つに記載の組成物。
Ｅ９０．Ｅ１～Ｅ５３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
Ｅ９１．前記宿主細胞が、真核細胞である、Ｅ９０に記載の宿主細胞。
Ｅ９２．Ｅ１～Ｅ５３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
Ｅ９３．Ｅ１～Ｅ５３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドを酵素的または化学的に合成することを含む、ポリヌクレオチドを作製する方法。
Ｅ９４．Ｅ１～Ｅ５３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド、Ｅ５６～Ｅ８９のいずれか１つに記載の組成物、Ｅ９０もしくはＥ９１に記載の宿主細胞、またはＥ９２に記載のベクター、もしくはＥ９３に記載の方法により製造されたポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチド。
Ｅ９５．活性ＰＢＧＤポリペプチドを、それを必要とする対象においてｉｎ ｖｉｖｏ発現させる方法であって、治療的有効量のＥ１～Ｅ５３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド、Ｅ５６～Ｅ８９のいずれか１つに記載の組成物、Ｅ９０もしくはＥ９１に記載の宿主細胞、またはＥ９２に記載のベクターを、前記対象に投与することを含む、前記方法。
Ｅ９６．急性間欠性ポルフィリン症（ＡＩＰ）を治療することを、それを必要とする対象において行う方法であって、治療的有効量のＥ１～Ｅ５３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド、Ｅ５６～Ｅ８９のいずれか１つに記載の組成物、Ｅ９０もしくはＥ９１に記載の宿主細胞、またはＥ９２に記載のベクターを、前記対象に投与することを含み、前記投与が、前記対象のＡＩＰの前記徴候または症状を緩和する、前記方法。
Ｅ９７．ＡＩＰの徴候または症状の発症を予防するか、または遅延させることを、それを必要とする対象において行う方法であって、ＡＩＰ徴候または症状が現れる前に、予防的有効量のＥ１～Ｅ５３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド、Ｅ５６～Ｅ８９のいずれか１つに記載の組成物、Ｅ９０もしくはＥ９１に記載の宿主細胞、またはＥ９２に記載のベクターを、前記対象に投与することを含み、前記投与が、前記対象のＡＩＰの徴候または症状の前記発症を予防するか、または遅延させる、前記方法。
Ｅ９８．ＡＩＰの徴候または症状を改善することを、それを必要とする対象において行う方法であって、ＡＩＰ徴候または症状が現れる前に、治療的有効量のＥ１～Ｅ５３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド、Ｅ５６～Ｅ８９のいずれか１つに記載の組成物、Ｅ９０もしくはＥ９１に記載の宿主細胞、またはＥ９２に記載のベクターを、前記対象に投与することを含み、前記投与が、前記対象のＡＩＰの徴候または症状を改善する、前記方法。
Ｅ９９．肝ＰＢＧＤ活性を増加させることを、それを必要とする対象において行う方法であって、有効量のＥ１～Ｅ５３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド、Ｅ５６～Ｅ８９のいずれか１つに記載の組成物、Ｅ９０もしくはＥ９１に記載の宿主細胞、またはＥ９２に記載のベクターを、前記対象に投与することを含む、前記方法。
Ｅ１００．ＡＬＡ（アミノレビリナート）及び／またはＰＢＧ（ポルフォビリノゲン）を減少させることを、それを必要とする対象において行う方法であって、有効量のＥ１～Ｅ５３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド、Ｅ５６～Ｅ８９のいずれか１つに記載の組成物、Ｅ９０もしくはＥ９１に記載の宿主細胞、またはＥ９２に記載のベクターを、前記対象に投与することを含む、前記方法。
Ｅ１０１．前記ＡＬＡ及び／またはＰＢＧレベルが、尿中排泄レベルである、Ｅ１００に記載の方法。
Ｅ１０２．ＡＩＰ発作におけるヘム前駆体の増加から、防御を必要とする対象を防御する方法であって、有効量のＥ１～Ｅ５３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド、Ｅ５６～Ｅ８９のいずれか１つに記載の組成物、Ｅ９０もしくはＥ９１に記載の宿主細胞、またはＥ９２に記載のベクターを、前記対象に投与することを含む、前記方法。
Ｅ１０３．ヘム前駆体の蓄積を低減させることを、それを必要とする対象において行う方法であって、有効量のＥ１～Ｅ５３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド、Ｅ５６～Ｅ８９のいずれか１つに記載の組成物、Ｅ９０もしくはＥ９１に記載の宿主細胞、またはＥ９２に記載のベクターを、前記対象に投与することを含む、前記方法。
Ｅ１０４．前記ヘム前駆体が、ＡＬＡ及び／またはＰＢＧである、Ｅ１０２またはＥ１０３に記載の方法。
Ｅ１０５．疼痛を治療、予防、または改善することを、それを必要とする対象において行う方法であって、有効量のＥ１～Ｅ５３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド、Ｅ５６～Ｅ８９のいずれか１つに記載の組成物、Ｅ９０もしくはＥ９１に記載の宿主細胞、またはＥ９２に記載のベクターを、前記対象に投与することを含む、前記方法。
Ｅ１０６．前記疼痛が、重度な疼痛である、Ｅ１０５記載の方法。
Ｅ１０７．疼痛の前記治療、予防、または改善が、疼痛の解消をもたらす、Ｅ１０５に記載の方法。
Ｅ１０８．ニューロパチーを処置、予防、または改善することを、それを必要とする対象において行う方法であって、有効量のＥ１～Ｅ５３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド、Ｅ５６～Ｅ８９のいずれか１つに記載の組成物、Ｅ９０もしくはＥ９１に記載の宿主細胞、またはＥ９２に記載のベクターを、前記対象に投与することを含む、前記方法。
Ｅ１０９．ニューロパチーの前記治療、予防、または改善が、ニューロパチーの解消をもたらす、Ｅ１０８に記載の方法。
Ｅ１１０．前記ニューロパチーが、末梢神経障害である、Ｅ１０８またはＥ１０９に記載の方法。
Ｅ１１１．生存を増加させることを、それを必要とする対象において行う方法であって、有効量のＥ１～Ｅ５３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド、Ｅ５６～Ｅ８９のいずれか１つに記載の組成物、Ｅ９０もしくはＥ９１に記載の宿主細胞、またはＥ９２に記載のベクターを、前記対象に投与することを含む、前記方法。
Ｅ１１２．前記対象が、ＡＩＰ患者である、Ｅ９５～Ｅ１１１のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１１３．前記ＡＩＰ患者が、無症状患者である、Ｅ１１２に記載の方法。
Ｅ１１４．前記ポリヌクレオチドが、ＰＢＧＤ－ＣＯ３（配列番号１１）を含む、Ｅ９５～Ｅ１１４のいずれか１つに記載の方法。
３１．均等物及び範囲
当業者らは、通常の実験のみを使用して、本明細書に記載の本発明による特定の実施形態に対する多くの均等物を認識し、または確認することができるであろう。本発明の範囲は、上記の記載に限定されるものではなく、むしろ添付の特許請求の範囲に記載されている。
特許請求の範囲では、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」などの冠詞は、反対の指示がない限り、または別途文脈から明らかでない限り、１つ以上を意味することができる。グループメンバーのうちの１つ、複数、または全てが、反対の指示がない限り、または文脈から別途明白でない限り、所与の産物またはプロセスに存在するか、これらに用いられ、または別の方法でこれらに関連する場合、「または」をグループの１つ以上のメンバー間に含む特許請求の範囲または記載は、条件を満たすとみなされる。本発明は、グループのちょうど１つのメンバーが、所与の生成物またはプロセスに存在するか、これらに用いられるか、または別の方法でこれらに関連する実施形態を含む。本発明は、グループメンバーの複数または全てが、所与の生成物またはプロセスに存在するか、これらに用いられるか、または別の方法でこれらに関連する実施形態を含む。
「含む」という用語は、非制限であることが意図されており、追加の要素またはステップを含むことを許容するが、必要としないことにも注意する。「含む」という用語が本明細書で使用される場合、「からなる」という用語もまた、このように包含及び開示される。
範囲が与えられる場合は、端点が含まれる。さらに、別途指示のない限り、または、文脈及び当業者の理解から別途明らかでない限り、範囲として表される値は、文脈に別途明示のない限り、範囲の下限の単位の１０分の１までの、本発明の異なる実施形態の記載された範囲内の任意の具体的な値または部分範囲とみなすことができることを理解すべきである。
加えて、先行技術の範囲に入る本発明の任意の特定の実施形態は、請求項のうちのいずれか１つ以上から明白に除外することができることを理解すべきである。そのような実施形態は、当業者に既知とみなされるので、除外が本明細書では明記されてないとしても、除外することができる。本発明の組成物の任意の特定の実施形態（例えば、それによりコードされた任意の核酸またはタンパク質、任意の製造方法、任意の使用方法など）は、先行技術の存在に関連するかどうかに関わらず、任意の理由で、任意の１つ以上の請求項から除外することができる。
引用された出典、例えば、本明細書で引用された参考文献、刊行物、データベース、データベースエントリ、及び技術、は全て、引用に明記されていなくても、参照により本出願に組み込まれる。引用された出典及び本出願の記載と矛盾する場合、本出願中の記載が優先されるものとする。
セクション及び表の見出しは、限定するものではない。
実施例１
キメラポリヌクレオチド合成
Ａ．三リン酸経路
キメラポリヌクレオチドの２つの領域または部分は、三リン酸化学を使用して、連結またはライゲーションすることができる。この方法によれば、１００ヌクレオチド以下の第１の領域または部分は、５’モノリン酸塩及び端末３’ｄｅｓＯＨまたはブロックされたＯＨで化学的に合成することができる。領域は、８０ヌクレオチドより長い場合、ライゲーション用の２つの鎖として合成することができる。
第１の領域または部分が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）を使用して非位置的に修飾されている領域または部分として合成される場合、その後の３’末端のキャッピングを伴う５’モノリン酸塩の変換が続き得る。モノリン酸塩保護基は、当該技術分野で既知のもののいずれかから選択することができる。
キメラポリヌクレオチドの第２の領域または部分は、化学合成法またはＩＶＴ法のいずれかを使用して合成することができる。ＩＶＴ法は、修飾キャップを有するプライマーを利用することができるＲＮＡポリメラーゼを含むことができる。あるいは、最大８０ヌクレオチドのキャップを、化学的に合成し、ＩＶＴ領域または部分に結合することができる。
ライゲーション法の場合、ＤＮＡ Ｔ４リガーゼによるライゲーション、続いて、ＤＮａｓｅによる処理は、連結を容易に回避することに注意する。
キメラポリヌクレオチド全体を、リン酸塩－糖主鎖で製造する必要はない。領域または部分のうちの１つがポリペプチドをコードする場合、そのような領域または部分は、リン酸塩－糖主鎖を含むことができる。
次に、ライゲーションは、任意の既知のクリック化学、オルソクリニック化学、ソルリンク、または当業者らに既知の他のバイオコンジュゲート化学を使用して実施することができる。
Ｂ．合成経路
キメラポリヌクレオチドは、一連の開始セグメントを使用して作成することができる。そのようなセグメントは、
（ａ）正常な３’ＯＨを含むキャップ化、保護５’セグメント（ＳＥＧ．１）、
（ｂ）ポリペプチドのコード領域を含むことができ、且つ正常な３’ＯＨを含む５’三リン酸セグメント（ＳＥＧ．２）、
（ｃ）コルジセピンを含むかまたは３’ＯＨを含まないキメラポリヌクレオチドの３’末端（例えば、尾部）に対する５’モノリン酸塩セグメント（ＳＥＧ．３）、を含む。
（化学的またはＩＶＴ）合成後、セグメント３（ＳＥＧ．３）は、５’モノホスフェートを生成させるために、コルジセピン、次に、ピロホスファターゼで処理することができる。
次に、セグメント２（ＳＥＧ．２）は、ＲＮＡリガーゼを使用して、ＳＥＧ．３にライゲーションすることができる。次に、ライゲーションしたポリヌクレオチドは、二リン酸塩を切断するために、精製して、ピロホスファターゼで処理することができる。次に、処理されたＳＥＧ．２－ＳＥＧ．３構築物を精製し、ＳＥＧ．１を５’末端にライゲーションする。キメラポリヌクレオチドのさらなる精製ステップを、実施することができる。
キメラポリヌクレオチドがポリペプチドをコードする場合、ライゲーションまたは連結されたセグメントは、５’ＵＴＲ（ＳＥＧ．１）、オープンリーディングフレームまたはＯＲＦ（ＳＥＧ．２）及び３’ＵＴＲ＋ポリＡ（ＳＥＧ．３）として表すことができる。
各ステップの収率は、９０～９５％ほどであり得る。
実施例２
ｃＤＮＡ産生のためのＰＣＲ
ｃＤＮＡの調製のためのＰＣＲ手順は、Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（マサチューセッツ州ウォーバーン）の２ｘ ＫＡＰＡ ＨＩＦＩ（商標）ＨｏｔＳｔａｒｔ ＲｅａｄｙＭｉｘを使用して実施することができる。このシステムは、２ｘ ＫＡＰＡ ＲｅａｄｙＭｉｘ １２．５μｌ、フォワードプライマー（１０μＭ）０．７５μｌ、リバースプライマー（１０μＭ）０．７５μｌ、鋳型ｃＤＮＡ－１００ｎｇ、及び２５．０μｌに希釈されたｄＨ２０を含む。ＰＣＲ反応条件は、９５℃で５分間、及び９８℃で２０秒間の２５サイクル、次に、５８℃１５秒間、次に、７２℃４５秒間、次に、７２℃５分間、次に、４℃で終了することができる。
本発明のリバースプライマーは、ポリ－Ｔ１２０を、ｍＲＮＡ中のポリＡ１２０に組み込むことができる。より長いまたはより短いポリ（Ｔ）トラクトを有する他のリバースプライマーは、ポリヌクレオチドｍＲＮＡ中のポリ（Ａ）尾部の長さを調整するために使用することができる。
反応は、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＰＵＲＥＬＩＮＫ（商標）ＰＣＲ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（カリフォルニア州カールスバッド）を使用して、製造者の指示（多くとも５μｇ）で、クリーンアップすることができる。より大きな反応は、より大きな容量を有する産物を使用したクリーンアップを必要とするであろう。クリーンアップ後、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（商標）を使用して、ｃＤＮＡを定量し、ｃＤＮＡが予想されたサイズであることを確認するために、アガロースゲル電気泳動により分析することができる。次に、ｃＤＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応に進む前に、配列決定分析のために提出することができる。
実施例３
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応は、均一に修飾されているポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを生成することができる。そのような均一に修飾されているポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドの領域または部分を含むことができる。入力ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）混合物は、天然及び非天然ＮＴＰを使用して作製することができる。
典型的なｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応は、以下を含むことができる：
１ 鋳型ｃＤＮＡ－１．０μｇ
２ １０×転写緩衝液（４００ｍＭのトリス－ＨＣｌ ｐＨ８．０、１９０ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＤＴＴ、１０ｍＭのスペルミジン）－２．０μＬ
３ 注文のＮＴＰ（各２５ｍＭ）－７．２μＬ
４ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ－２０Ｕ
５ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ－３０００Ｕ
６ ｄＨ２０－多くとも２０．０μｌ、及び
７ ３７℃で３時間～５時間のインキュベーション。
粗ＩＶＴ混合物は、翌日のクリーンアップのために、４℃で一晩保存することができる。次に、１ＵのＲＮａｓｅ不含ＤＮａｓｅを、元の鋳型を消化するために使用することができる。３７℃で１５分間インキュベートした後、ｍＲＮＡは、製造業者の指示に従って、ＡｍｂｉｏｎのＭＥＧＡＣＬＥＡＲ（商標）キット（テキサス州オースティン）を使用して精製することができる。このキットは、多くとも５００μｇのＲＮＡを精製することができる。クリーンアップ後、ＲＮＡが好適なサイズであり、ＲＮＡの分解が起こっていないことを確認するために、ＲＮＡを、ＮａｎｏＤｒｏｐを使用して定量化し、アガロースゲル電気泳動により分析することができる。
実施例４
酵素的キャッピング
ポリヌクレオチドのキャッピングは、ＩＶＴ ＲＮＡ６０μｇ～１８０μｇ及びｄＨ２０多くとも７２μｌを含む混合物を用いて実施することができる。混合物は、ＲＮＡを変性させるために、６５℃で５分間インキュベートすることができ、次に、直ちに氷に移すことができる。
次に、プロトコールは、１０×キャッピング緩衝液（０．５ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、６０ｍＭのＫＣｌ、１２．５ｍＭのＭｇＣｌ２）（１０．０μｌ）、２０ｍＭのＧＴＰ（５．０μｌ）、２０ｍＭのＳ－アデノシルメチオニン（２．５μｌ）、ＲＮａｓｅ阻害剤（１００Ｕ）、２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ（４００Ｕ）、ワクシニアキャッピング酵素（グアニリルトランスフェラーゼ）（４０Ｕ）、ｄＨ２０（最大２８μｌ）の混合、及び６０μｇのＲＮＡに対して３７℃で３０分、または１８０μｇのＲＮＡに対して最長２時間のインキュベーション、を含むことができる。
次に、ポリヌクレオチドは、製造者の指示に従って、ＡｍｂｉｏｎのＭＥＧＡＣＬＥＡＲ（商標）キット（テキサス州オースティン）を使用して精製することができる。クリーンアップ後、ＲＮＡが好適なサイズであり、ＲＮＡの分解が起こっていないことを確認するために、ＲＮＡを、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、マサチューセッツ州ウォルサム）を使用して定量し、アガロースゲル電気泳動により分析することができる。ＲＮＡ産物は、配列決定のためのｃＤＮＡを生成するために、逆転写ＰＣＲを実行することにより、配列決定することもできる。
実施例５
ポリＡ鎖付加反応
ｃＤＮＡ中にポリ－Ｔがなければ、ポリＡ鎖付加反応を、最終産物を洗浄する前に実施しなければならない。これは、キャップ化ＩＶＴ ＲＮＡ（１００μｌ）、ＲＮａｓｅ阻害薬（２０Ｕ）、１０×テーリング緩衝液（０．５ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２．５ＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのＭｇＣｌ２）（１２．０μｌ）、２０ｍＭのＡＴＰ（６．０μｌ）、ポリＡポリメラーゼ（２０Ｕ）、最大１２３．５μＬのｄＨ２０を混合すること、及び３７℃で３０分間インキュベーションすることにより行うことができる。ポリＡ鎖が転写物に既に存在する場合、鎖付加反応を省略し、ＡｍｂｉｏｎのＭＥＧＡＣＬＥＡＲ（商標）キット（テキサス州オースティン）（最大５００μｇ）を用いるクリーンアップに直接進むことができる。いくつかの場合では、ポリＡポリメラーゼは、酵母で発現される組換え酵素である。
ポリＡ鎖付加反応の進行性または完全性は、必ずしも正確なサイズのポリＡ鎖をもたらさないことを理解すべきである。従って、およそ４０～２００ヌクレオチド、例えば、約４０、５０、６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１５０－１６５、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、または１６５のポリＡテールが、本発明の範囲内である。
実施例６
天然５’キャップ及び５’キャップアナログ
ポリヌクレオチドの５’キャッピングは、製造者プロトコールに従って、５’－グアノシンキャップ構造を生成するために、以下の化学的ＲＮＡキャップアナログを使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応中に付随して完了させることができる：３’－Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ［ＡＲＣＡキャップ］、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、マサチューセッツ州イプスウィッチ）。修飾ＲＮＡの５’－キャッピングは、「Ｃａｐ０」構造：ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、マサチューセッツ州イプスウィッチ）を生成するために、ワクシニアウイルスキャッピング酵素を使用して転写後に完了させることができる。Ｃａｐ１構造は、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ－２’－Ｏ－メチルを生成するために、ワクシニアウイルスキャッピング酵素及び２’－Ｏメチルトランスフェラーゼの両方を使用して生成することができる。Ｃａｐ２構造は、Ｃａｐ１構造から生成し、続いて、２’－Ｏメチルトランスフェラーゼを使用して、５’末端から３番目のヌクレオチドの２’－Ｏ－メチル化を行うことができる。Ｃａｐ３構造は、Ｃａｐ２構造から生成し、続いて、２’－Ｏメチルトランスフェラーゼを使用して、５末端から４番目のヌクレオチドの２’－Ｏ－メチル化を行うことができる。酵素は、組換え供給源に由来することができる。
哺乳動物細胞に形質移入される場合、修飾ｍＲＮＡは、１２～１８時間または１８時間を超える、例えば、２４、３６、４８、６０、７２、または７２時間を超える安定性を有することができる。
実施例７
キャッピングアッセイ
Ａ．タンパク質発現アッセイ
本明細書で教示されるキャップのいずれかを含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、等しい濃度で細胞に形質移入することができる。形質移入の６、１２、２４、及び３６時間後、培地に分泌されたタンパク質の量は、ＥＬＩＳＡによりアッセイすることができる。より高レベルのタンパク質を培地に分泌する合成ポリヌクレオチドは、より高い翻訳能力を有するＣａｐ構造を有する合成ポリヌクレオチドに対応するであろう。
Ｂ．純度分析合成
本明細書で教示されるキャップのいずれかを含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、変性アガロース－尿素ゲル電気泳動またはＨＰＬＣ分析を使用して、純度について比較することができる。電気泳動による単一の固化したバンドを有するポリヌクレオチドは、複数のバンドまたはストリーキングバンドを有するポリヌクレオチドと比較して、より高純度の産物に対応する。単一のＨＰＬＣピークを有する合成ポリヌクレオチドは、より高純度の産物にも対応するであろう。より高い効率でのキャッピング反応は、より多くの純粋なポリヌクレオチド集団を提供するであろう。
Ｃ．サイトカイン分析
本明細書で教示されるキャップのいずれかを含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、複数の濃度で細胞に形質移入することができる。形質移入の６、１２、２４、及び３６時間後に、培地に分泌されたＴＮＦ－アルファ及びＩＦＮ－ベータなどの前炎症性サイトカインの量は、ＥＬＩＳＡによりアッセイすることができる。高レベルの前炎症性サイトカインの培地への分泌をもたらすポリヌクレオチドは、免疫活性化キャップ構造を含有するポリヌクレオチドに対応するであろう。
Ｄ．キャッピング反応効率
本明細書で教示するキャップのいずれかを含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ヌクレアーゼ処理後のＬＣ－ＭＳにより、キャッピング反応効率について分析することができる。キャップ化ポリヌクレオチドのヌクレアーゼ処理は、遊離ヌクレオチド及びＬＣ－ＭＳにより検出可能なキャップ化５’－５トリホスフェートキャップ構造体の混合物を生じるであろう。ＬＣ－ＭＳスペクトルによるキャップ化産物の量は、反応由来の総ポリヌクレオチドのパーセントとして表すことができ、キャッピング反応効率に対応するであろう。より高いキャッピング反応効率を有するキャップ構造は、ＬＣ－ＭＳにより、より多くの量のキャップ化産物を有するであろう。
実施例８
修飾ＲＮＡまたはＲＴ ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動
個々のポリヌクレオチド（２０μｌ体積中の２００～４００ｎｇ）または逆転写ＰＣＲ産物（２００～４００ｎｇ）は、ウェル中の非変性１．２％のアガロースＥ－Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）上にロードし、製造業者のプロトコールに従って、１２～１５分間実行することができる。
実施例９
ナノドロップ修飾ＲＮＡ定量化及びＵＶスペクトルデータ
ＴＥ緩衝液（１μｌ）中の修飾ポリヌクレオチドは、化学合成またはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応からの各ポリヌクレオチドの収率を定量するために、Ｎａｎｏｄｒｏｐ ＵＶ吸光度に使用することができる。
実施例１０
リピドイドを使用した改変ｍＲＮＡの製剤化
ポリヌクレオチドは、細胞に添加する前に、ポリヌクレオチドを、規定の比のリピドイドと混合することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験のために製剤化することができる。ｉｎ ｖｉｖｏ製剤は、身体全体の循環を促進するために追加の成分の添加を必要とすることができる。これらのリピドイドがｉｎ ｖｉｖｏ試験に適する粒子を形成する能力を試験するために、ｓｉＲＮＡ－リドイド製剤に使用される標準的な製剤化プロセスは、出発点として使用することができる。粒子の形成後に、ポリヌクレオチドは、添加し、複合体と一体化させることができる。封入効率は、標準的な色素排除アッセイを使用して決定することができる。
実施例１１
タンパク質発現のスクリーニング法
Ａ．エレクトロスプレーイオン化
対象に投与されるポリヌクレオチドによりコードされたタンパク質を含有することができる生物学的試料は、１、２、３、または４つの質量分析器を使用するエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）の製造業者のプロトコールに従って、調製及び分析することができる。生物学的試料は、タンデムＥＳＩ質量分析システムを使用して分析することもできる。
タンパク質断片またはタンパク質全体のパターンは、所与のタンパク質に対する既知の対照と比較することができ、識別は、比較により決定することができる。
Ｂ．マトリックス支援レーザー脱離／イオン化
対象に投与される１つ以上のポリヌクレオチドによりコードされたタンパク質を含有し得る生物学的試料は、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）の製造業者のプロトコールに従って、調製及び分析することができる。
タンパク質断片またはタンパク質全体のパターンは、所与のタンパク質に対する既知の対照と比較することができ、識別は、比較により決定することができる。
Ｃ．液体クロマトグラフィー－質量分析－質量分析
１つ以上のポリヌクレオチドによりコードされたタンパク質を含有し得る生物学的試料は、内部に含有されるタンパク質を消化するために、トリプシン酵素で処理することができる。得られたペプチドは、液体クロマトグラフィー－質量分析－質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）により分析することができる。ペプチドは、コンピュータアルゴリズムを介してタンパク質配列データベースに適合させることができる診断パターンを得るために、質量分析計内で、断片化することができる。消化された試料は、所定のタンパク質に対し１ｎｇ以下の出発材料を得るために希釈することができる。単純な緩衝液バックグラウンド（例えば、水または揮発性塩）を含有する生物学的試料は、直接溶液中消化に適しており、より複雑なバックグラウンド（例えば、界面活性剤、不揮発性塩、グリセロール）は、試料分析を容易にするために追加のクリーンアップステップを必要とする。
タンパク質断片またはタンパク質全体のパターンは、所与のタンパク質に対する既知の対照と比較することができ、識別は、比較により決定することができる。
実施例１２
ＰＢＧＤをコードするｍＲＮＡの合成
ＰＢＧＤポリペプチド、すなわち、配列番号１、３、５、または７、をコードする配列最適化ポリヌクレオチドを、実施例１～１１に記載されるように合成及び特性決定した。両方のヒトＰＢＧＤアイソフォームをコードするｍＲＮＡを、以下に記載の実施例のために調製し、実施例１～１１に記載されるように合成及び特性決定した。
ヒトＰＢＧＤをコードするｍＲＮＡは、例えば、配列番号２、４、６、または８で提示されるＯＲＦ配列を使用することにより構築することができる。ｍＲＮＡ配列は、５’ＵＴＲ領域及び３’ＵＴＲ領域の両方を含む（例えば、それぞれ、配列番号８３及び８４を参照のこと）。構築物では、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ配列は、
５’ＵＴＲ
ＴＣＡＡＧＣＴＴＴＴＧＧＡＣＣＣＴＣＧＴＡＣＡＧＡＡＧＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＡＡ
ＴＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＴＡＡＧＡＡＧＡＡＡＴＡＴＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ（配列番号８３）
３’ＵＴＲ
ＴＧＡＴＡＡＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＣＴＣＧＧＴＧＧＣＣＡＴＧＣＴＴＣＴＴＧＣＣＣＣＴＴＧＧＧＣＣＴＣＣ
ＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＣＣＴＴＣＣＴＧＣＡＣＣＣＧＴＡＣＣＣＣＣＧＴＧＧＴＣＴＴＴＧＡＡＴＡ
ＡＡＧＴＣＴＧＡＧＴＧＧＧＣＧＧＣ（配列番号８４）
または
３’ＵＴＲ
ＴＧＡＴＡＡＴＡＧＴＣＣＡＴＡＡＡＧＴＡＧＧＡＡＡＣＡＣＴＡＣＡＧＣＴＧＧＡＧＣＣＴＣＧＧＴＧＧＣＣＡＴＧＣＴＴＣＴＴＧＣＣＣＣＴＴＧＧＧＣＣＴＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＣＣＴＴＣＣＴＧＣＡＣＣＣＧＴＡＣＣＣＣＣＣＧＣＡＴＴＡＴＴＡＣＴＣＡＣＧＧＴＡＣＧＡＧＴＧＧＴＣＴＴＴＧＡＡＴＡＡＡＧＴＣＴＧＡＧＴＧＧＧＣＧＧＣ（配列番号１４９）［［ｍｉＲ１４２＋ｍｉＲ１２６ ３’ＵＴＲ］］である。
ＰＢＧＤ ｍＲＮＡ配列を、修飾ｍＲＮＡとして調製した。具体的には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳中に、修飾ｍＲＮＡを、ｍＲＮＡがウリジンの代わりに１００％の５－メトキシ－ウリジンを含有することを確実にするために、５－メトキシ－ＵＴＰを使用して生成することができる。さらに、ＰＢＧＤ－ｍＲＮＡを、ポリＡ鎖を導入するプライマーを用いて合成することができ、Ｃａｐ１構造が、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ－２’－Ｏ－メチルを生成するために、ワクシニアウイルスキャッピング酵素及び２’－Ｏメチルトランスフェラーゼを使用したｍＲＮＡの両方で生成される。
実施例１３
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの内因性ＰＢＧＤ発現の検出
マウス及びヒト供給源の両方に由来する様々な細胞株中で、ＰＢＧＤ発現を特性決定する。標準的な条件で培養し、細胞抽出物を緩衝液中に細胞を置くことにより、細胞を得る。比較のために好適な対照もまた調製される。ＰＢＧＤ発現を分析するために、溶解物試料を、試験した細胞から調製し、ドデシル硫酸リチウム試料ローディングバッファーと混合し、標準的なウェスタンブロット分析に供する。ＰＢＧＤの検出のために、使用される抗体は、市販の抗ＰＢＧＤ抗体である。負荷対照の検出のために、使用される抗体は、抗β－アクチン（マウスモノクローナル；Ａ２２２８；Ｓｉｇｍａ）である。内因性ＰＢＧＤの局在化を検査するために、免疫蛍光分析を細胞に実施する。市販の抗ＰＢＧＤを使用して、ＰＢＧＤ発現を検出する。具体的な細胞小器官の位置は、既存の市販製品で検出することができる。例えば、ミトコンドリアは、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒを使用して検出することができ、核は、ＤＡＰＩで染色することができる。画像解析を、Ｚｅｉｓｓ ＥＬＹＲＡイメージングシステムで実施する。
内因性ＰＢＧＤ発現は、ＰＢＧＤをコードする核酸を含むｍＲＮＡを用いる形質移入から生じるＰＢＧＤ発現の変化を決定するために、ベースラインとして使用することができる。
実施例１４
ＨｅＬａ細胞におけるＰＢＧＤのｉｎ ｖｉｔｒｏ発現
ＨｅＬａ細胞におけるヒトＰＢＧＤのｉｎ ｖｉｔｒｏ発現を測定するために、形質移入の１日前に、これらの細胞を１２ウェルプレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国サンノゼ）に播種する。ウェル当たり６０μＬのＯＰＴＩ－ＭＥＭ中、８００ｎｇのｍＲＮＡ及び２μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ ２０００を使用して、ヒトＰＢＧＤまたはＧＦＰ対照を含むｍＲＮＡ製剤を形質移入し、インキュベートする。
２４時間後、一定量の溶解バッファーを使用して、各ウェル中の細胞を溶解させる。適切な対照を使用する。製造者の指示に従ってＢＣＡアッセイを使用して、それぞれのタンパク質濃度を決定する。ＰＢＧＤの発現を分析するために、等しい量（５０μｇ）の各溶解物を、ローディングバッファー中で調製し、標準的なウェスタンブロット分析に供する。ＰＢＧＤの検出のために、市販の抗ＰＢＧＤ抗体が、製造者の使用説明書に従って使用される。
実施例１５
ＨｅＬａ細胞におけるｉｎ ｖｉｔｒｏＰＢＧＤ活性
ＰＢＧＤ配列を含むｍＲＮＡの導入後に外因的に発現されたＰＢＧＤが活性であるかどうかを決定するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏＰＢＧＤ活性アッセイを実施する。
Ａ．発現アッセイ
ＨｅＬａ細胞を、ヒトＰＢＧＤまたはＧＦＰ対照を含むｍＲＮＡ製剤で形質移入する。細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ ２０００で形質移入し、上記の実施例１４に記載されるように溶解させる。適切な対照もまた調製する。
Ｂ．活性アッセイ
外因性ＰＢＧＤが機能することができるかどうかを評価するために、形質移入されたＨｅＬａ細胞溶解物を酵素活性の供給源として使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性アッセイを実施する。まず、溶解物は、混合されたＰＢＧＤ基質である。反応を、５％のＴＣＡ及びボルテックスすることにより停止させる。次に、反応管を１０分間２，０００ｇで遠心分離し、上清を２０分間光に曝露し、蛍光定量化を使用して、ＰＢＧＤの活性から生じる酸化酵素産物の存在について分析する。
実施例１６
細胞におけるＰＢＧＤのｉｎ ｖｉｔｒｏ発現の測定
正常な対象及び急性間欠性ポルフィリン症患者由来の細胞を、外因性ＰＢＧＤを発現する能力について試験する。標準的なプロトコールを使用する電気穿孔法を介して、ヒトＰＢＧＤ、マウスＰＢＧＤ、またはＧＦＰ対照を含むｍＲＮＡ製剤で、細胞を形質移入する。各構築物を、別々に試験する。インキュベーション後、細胞を溶解させ、好適なアッセイ、例えば、ＢＣＡアッセイを使用して、各溶解物中のタンパク質濃度を測定する。ＰＢＧＤの発現を分析するために、等しい量の各溶解物を、ローディングバッファー中で調製し、標準的なウェスタンブロット分析に供する。ＰＢＧＤの検出のために、抗ＰＢＧＤを使用する。負荷対照の検出のために、使用される抗体は、抗β－アクチン（マウスモノクローナル；Ａ２２２８；Ｓｉｇｍａ）である。
実施例１７
溶解物中のｉｎ ｖｉｔｒｏでＰＢＧＤ活性の測定
Ａ．発現
正常ヒト対象及び急性間欠性ポルフィリン症患者由来の細胞を培養する。標準的なプロトコールを使用する電気穿孔法を介して、ヒトＰＢＧＤ、マウスＰＢＧＤ、またはＧＦＰ対照を含むｍＲＮＡ製剤で、細胞を形質移入する。
Ｂ．活性アッセイ
外因性ＰＢＧＤが機能するかどうかを評価するために、形質移入された細胞溶解物を酵素活性の供給源として使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性アッセイを実施する。発現されたＰＢＧＤタンパク質を含有する溶解物を、ＰＢＧＤ基質と共にインキュベートし、ＰＢＧＤの酵素活性から生じる酸化産物のレベルを測定することにより、ＰＢＧＤの活性を定量する。
実施例１８
動物モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏＰＢＧＤ発現
ＰＢＧＤ含有ｍＲＮＡがｉｎ ｖｉｖｏでのＰＢＧＤ発現を促進する能力を評価するために、ヒトＰＢＧＤをコードするｍＲＮＡを、ＣＤ１マウスに導入する。ＣＤ１マウスに、対照ｍＲＮＡ（ルシフェラーゼ）またはヒトＰＢＧＤ ｍＲＮＡのいずれかを静脈注射する。ｍＲＮＡを、マウスへの送達用に脂質ナノ粒子に製剤化する。２４時間または４８時間後にマウスを屠殺し、肝臓溶解物中のＰＢＧＤタンパク質レベルを、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）により決定する。β－アクチン発現を、負荷対照として使用するために試験する。対照ルシフェラーゼの注射の場合、４匹のマウスを、各時点について試験する。ヒトＰＢＧＤ ｍＲＮＡ注射のために、４匹のマウスを、各時点について試験する。
実施例１９
ヒトＰＢＧＤ変異体及びキメラ構築物
本発明のポリヌクレオチドは、ヒトＰＢＧＤをコードする連結されたヌクレオシドの少なくとも第１の領域を含むことができ、これは、上記の実施例に従って、構築、発現、及び特性決定することができる。同様に、ポリヌクレオチド配列は、活性の増加または減少を伴うＰＢＧＤの発現をもたらす１つ以上の変異を含有することができる。さらに、ＰＢＧＤをコードするポリヌクレオチド配列は、キメラ融合タンパク質をコードする構築物の一部とすることができる。
実施例２０
ナノ粒子組成物の製造
Ａ．ナノ粒子組成物の製造
ナノ粒子は、混合プロセス、例えば、マイクロ流体工学及び２つの流体ストリームのＴ接合混合、で作製することができ、流体ストリームのうちの１つは、ポリヌクレオチドを含有し、他方は、脂質構成成分を有する。
脂質組成物は、本明細書に開示のイオン性アミノ脂質、例えば、化合物１８などの式（Ｉ）による脂質または化合物２３６などの式（ＩＩＩ）、リン脂質（例えば、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（アラバマ州アラバスター）から入手可能なＤＯＰＥまたはＤＳＰＣ）、ＰＥＧ脂質（例えば、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（アラバマ州アラバスター）から入手可能なＰＥＧ－ＤＭＧとしても既知の１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロールメトキシポリエチレングリコールまたは化合物４２８）、及びエタノール中約５０ｍＭの濃度の構造脂質（例えば、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（独国タウフキルヘン）から入手可能なコレステロール、もしくはコルチコステロイド（例えば、プレドニゾロン、デキサメタゾン、プレドニゾン、及びヒドロコルチゾン）またはそれらの組み合わせ）を組み合わせることにより調製することができる。溶液は、例えば、－２０℃で保存するために冷蔵すべきである。所望のモル比を得るために、脂質を合わせ、約５．５ｍｍ～約２５ｍｍの最終脂質濃度まで、水及びエタノールで希釈する。
ポリヌクレオチド及び脂質組成物を含むナノ粒子組成物は、脂質溶液を、約５：１～約５０：１の脂質組成物対ポリヌクレオチドｗｔ：ｗｔ比でポリヌクレオチドを含む溶液と合わせることにより調製することができる。約１：１～約４：１の水対エタノール比を有する懸濁液を生成するために、約１０ｍｌ／分～約１８ｍｌ／分の流速のＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒマイクロ流体系システムを使用して、脂質溶液を、ポリヌクレオチド溶液中に迅速に注入する。
ＲＮＡを含むナノ粒子組成物の場合、原液を形成するために、脱イオン水中０．１ｍｇ／ｍｌの濃度のＲＮＡの溶液を、ｐＨ３～４の間の５０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液中で希釈する。
ナノ粒子組成物は、エタノールを除去して緩衝液交換を達成するために、透析により処理することができる。１０ｋＤの分子量カットオフを有するＳｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒカセット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、イリノイ州ロックフォード）を使用して、製剤を、ｐＨ７．４の、１次産物の２００倍の体積のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に対して２回透析する。最初の透析を、室温で３時間実施する。次に、製剤を、４℃で一晩透析する。得られたナノ粒子懸濁液を、ガラスバイアル中に０．２μｍの無菌フィルター（Ｓａｒｓｔｅｄｔ、ドイツニュームブレヒト）を通して濾過し、クリンプ栓で密封する。０．０１ｍｇ／ｍｌ～０．１０ｍｇ／ｍｌのナノ粒子組成物溶液が一般に得られる。
上記方法は、ナノ沈殿及び粒子形成を誘導する。限定されないが、Ｔ接合及び直接注入を含む代替プロセスは、同じナノ沈殿を得るために使用することができる。
Ｂ．ナノ粒子組成物の特性決定
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ Ｓ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ、英国ウスターシャーマルバーン）を、粒子サイズの決定には１×ＰＢＳ及びゼータ電位決定は１５ｍＭのＰＢＳ中で、ナノ粒子組成物の粒子サイズ、多分散指数（ＰＤＩ）、及びゼータ電位を決定するために使用することができる。
紫外可視分光法を、ナノ粒子組成物中のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ）の濃度を決定するために使用することができる。１×ＰＢＳ中の希釈製剤１００μＬを、メタノール及びクロロホルムの４：１（ｖ／ｖ）の混合物９００μＬに添加する。混合後、ＤＵ８００分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．、カルフォルニア州ブレア）で、例えば、２３０ｎｍ～３３０ｎｍの、溶液の吸光度スペクトルを記録する。ナノ粒子組成物中のポリヌクレオチドの濃度は、組成物に使用されるポリヌクレオチド減衰係数、及び例えば、２６０ｎｍの波長の吸光度と例えば、３３０ｎｍの波長のベースライン値の間の差に基づいて計算することができる。
ＲＮＡを含むナノ粒子組成物では、ＱＵＡＮＴ－ＩＴ（商標）ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州カールスバッド）を、ナノ粒子組成物によるＲＮＡの封入を評価するために、使用することができる。試料を、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）中、およそ５μｇ／ｍＬの濃度に希釈する。希釈された試料５０μＬを、ポリスチレン９６ウェルプレートに移し、ＴＥバッファー５０μＬまたは２％のトリトンＸ－１００溶液５０μＬのいずれかを、ウェルに添加する。プレートを、３７℃の温度で１５分間インキュベートする。ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）試薬を、ＴＥ緩衝液中で１：１００に希釈し、この溶液１００μＬを、各ウェルに添加する。蛍光強度は、蛍光プレートリーダー（Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ １４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｌｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ；Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、マサチューセッツ州ウォルサム）を使用して、例えば、約４８０ｎｍの励起波長及び例えば、約５２０ｎｍの発光波長で測定することができる。試薬ブランクの蛍光値を、試料のそれぞれのものから差し引き、遊離ＲＮＡの百分率は、（トリトンＸ－１００を添加しない）インタクトな試料の蛍光強度を、（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の添加により引き起こされる）破砕試料の蛍光値で除することにより決定される。
ナノ粒子組成物の例示的な製剤を、以下の表６に提示する。「化合物」という用語は、ＭＣ３、化合物１８、または化合物２３６などのイオン性脂質を指す。「リン脂質」は、ＤＳＰＣまたはＤＯＰＥとすることができる。「ＰＥＧ－脂質」は、ＰＥＧ－ＤＭＧまたは化合物４２８とすることができる。
表６．ナノ粒子の例示的な製剤
Figure 2023062097000219
実施例２１
ＰＢＧＤをコードする修正ｍＲＮＡの投与後のＡＩＰマウスにおける肝ＰＢＧＤ活性
ＰＢＧＤをコードするｍＲＮＡを投与されたＡＩＰマウスの肝ＰＢＧＤ活性を決定した。ＡＩＰマウスは、ＰＢＧＤ遺伝子の２つの異なる破壊の化合物ヘテロ接合体：Ｔ１株［Ｃ５７ＢＬ／６－ｐｂｇｄｔｍ１（ｎｅｏ）Ｕａｍ及びＴ２株（Ｃ５７ＢＬ／６－ｐｂｇｄｔｍ２（ｎｅｏ）Ｕａｍ］（Ｌｉｎｄｂｅｒｇ ＲＬ，ｅｔ ａｌ．”Ｐｏｒｐｈｏｂｉｌｉｎｏｇｅｎ ｄｅａｍｉｎａｓｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ ｍｉｃｅ ｃａｕｓｅｓ ａ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ ｒｅｓｅｍｂｌｉｎｇ ｔｈａｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｉｃ ｐｏｒｐｈｙｒｉａ．”Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．１９９６；１２：１９５－１９９）である。これらのＡＩＰマウスは、ＡＩＰを有するヒトのものを模倣する症状を発症する。例えば、ＡＩＰマウスの表現型は、例えば、フェノバルビタール処置に応答するアミノレブリン酸の過剰産生、フェノバルビタール処置に応答するアミノレブリン酸及びポルフォビリノゲンの尿中排泄の増加、ウロポルフィリンの排泄の僅かな増加、疼痛、運動失調、より緩慢な動き、より短い歩幅、骨格筋変性、及び赤尿症を含む。
１ｎｍｏｌ／ｋｇの野生型ＰＢＧＤをコードするＯＲＦ（ＰＢＧＤ ＣＯＶ１またはＰＢＧＤ ＣＯＶ２）、ＰＢＧＤ－ＳＭ（ＳＭ変異を有する機能獲得ＰＢＧＤ変異体）、及びＡｐｏＡ１－ＰＢＧＤ－ＳＭ（アポリポタンパク質Ａ１と融合されるＳＭ変異を有する機能獲得ＰＢＧＤ変異体）、を含む配列修飾（１－メチル－シュードウリジン）ｍＲＮＡｓを、ＡＩＰマウス（ｎ＝４）に静脈内投与し、肝ＰＢＧＤ活性を、蛍光定量アッセイ（ウロポルフィリンＩ ｐｍｏｌ／タンパク質ｍｇ／時間）で測定した。ＰＢＧＤ－ＳＭをコードする修飾ｍＲＮＡは、ｍｉＲ－１４２結合部位を含んでいた。野生型ＰＢＧＤ、ＰＢＧＤ ＣＯＶ１（コドン最適化バリアント１）、及びＰＢＧＤ ＣＯＶ２（コドン最適化バリアント２）をコードする修飾ｍＲＮＡは、ｍｉＲ－１４２結合部位を含まなかった。ｍＲＮＡを、ＭＣ３脂質ナノ粒子に製剤化した。
組織ホモジネート中のＰＢＧＤ活性を、ＰＢＧのウロポルフィリンへの変換を測定することにより決定した。要約すると、１ｇの組織を、４体積のＫＣｌ溶液１．１５％中、４℃で、均質化した。ホモジネートを、４℃、１２．０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、いかなる細胞破片も用いず、透明な上清を、タンパク質の決定（アルブミン標準を使用するＢｒａｄｆｏｒｄアッセイ）及びＰＢＧＤ活性のために同じ日に使用した。上清試料を、リン酸緩衝液（ｐＨ７．６）、ＤＴＴ、Ｃｌ２Ｍｇ、及びトリトンＸ－１００で１：３に希釈し、この混合物１００μｌを、３７℃で３分間０．１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．１）１．８ｍｌでプレインキュベートした。次に、混合物を、暗所で、３７℃、６０分間、１ｍＭのＰＢＧ基質０．５ｍｌでインキュベートした。反応を、４０％の冷ＴＣＡ３５０μｌで停止させ、形成されたウロポルフィリノゲンを、光照射後に、ウロポルフィリンに酸化させた。ウロポルフィリンを、４０５ｎｍの励起ピーク及び５５０～６６０ｎｍのウィンドウ発光ピーク値を有する分光光度計で、定量的に測定した。好適な標準物質を使用して、ＰＢＧＤ活性を、ウロポルフィリンｐｍｏｌ／タンパク質ｍｇ／時間を単位として表した。
ＰＢＧＤ ｍＲＮＡの投与後のＡＩＰマウスの肝ＰＢＧＤ活性を図１３に示す。比較のために、図１３の１２単位の閾値線は、野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）の肝臓で観察されたＰＢＧＤのレベルであり、３単位の閾値線は、処置なしのＡＩＰマウスの肝臓内のＰＢＧＤのレベルである。
結果は、２４時間後、肝ＰＢＧＤ活性が、投与後多くとも７日間、治療域内にあったことを示す。ヒトにおける急性ポルフィリン症の発作は、５～７日続く。ヒトでは、２単位から５単位への増加は、肝臓内のＰＢＧＤ活性を完全に回復させる。従って、これらの結果は、野生型ＰＢＧＤをコードするｍＲＮＡの単回投与が急性ポルフィリン症の発作を防御し得ることを示唆する。
実施例２２
ＰＢＧＤをコードするｍＲＮＡのＡＩＰマウスへの単回用量ＩＶ投与
複数回のフェノバルビタール誘導発作の後における、ＰＢＧＤ ｍＲＮＡがＡＩＰマウスの症状を低減する能力を試験した。ヒトＰＢＧＤの野生型もしくはＳＭバリアントをコードするＯＲＦを含む０．５ｍｇ／ｋｇ用量の１－メチル－シュードウリジン修飾ｍＲＮＡまたは０．５ｍｇ／ｋｇ用量の対照ルシフェラーゼｍＲＮＡを、脂質ナノ粒子（ＭＣ３）に製剤化し、図１４に提示される投与スケジュールに従って、ＡＩＰマウスに投与した（ｎ＝４）。ｍＲＮＡを、試験の２日目に単回静脈内投与として投与した。マウスに、３回のフェノバルビタール負荷実施し、これらのそれぞれは、フェノバルビタールの４回の別々の腹腔内注射で構成されていた。本試験のエンドポイントは、（Ａ）ポルフィリン及びポルフィリン前駆体の尿中排泄、（Ｂ）疼痛の測定、（Ｃ）ロータロッド及びフットプリント分析を使用した末梢神経障害、ならびに（Ｄ）坐骨神経機能を含んでいた。
Ａ．尿中ＡＬＡ及びＰＢＧ排泄の低減：
ＰＢＧＤ ｍＲＮＡまたはルシフェラーゼ対照を投与されたＡＩＰマウスで、尿中アミノレブリン酸（ＡＬＡ）排泄及び尿中ポルフォビリノゲン（ＰＢＧ）排泄を測定した。
定量イオン交換カラム法（ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ ＳＡ、バルセロナ）を使用して、アミノレブリン酸（ＡＬＡ）及びポルフォビリノゲン（ＰＢＧ）の尿中排泄を定量し、Ｕｌｔｒｏｓｐｃ ３０００分光光度計（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、英国バッキンガムシャー）で、５５５ｎｍで測定した。Ｕｎｚｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．１９（２）：２４３－５０（２０１１）。
経時的な尿中ＡＬＡ排泄（μｇＡＬＡ／ｍｇクレアチニン）及び尿中ＰＢＧ排泄（μｇＰＢＧ／ｍｇクレアチニン）レベルを、図１５及び図１６にそれぞれ示す。尿中ＡＬＡ及びＰＢＧの両方は、対照ルシフェラーゼｍＲＮＡで処置したＡＩＰマウスで顕著に増加し、平均ベースライン値と比較して、それぞれ２０倍及び６０倍高いレベルに達した。対照的に、最初のフェノバルビタール負荷後、ＰＢＧＤ ｍＲＮＡを投与したマウスで、ＡＬＡ及びＰＢＧの過剰排泄の完全な防御を得た。ＰＢＧＤ ｍＲＮＡの投与後、ＡＬＡ及びＰＢＧレベルは、ベースラインレベルの近くに維持された。防御効果は、２回目のフェノバルビタール負荷後の、ＰＢＧＤ ｍＲＮＡ処置マウスで観察され、これは、ｍＲＮＡ投与の約２週間後に起こった。３週間後、保護効果は、もはや観察されなかった。
これらの結果は、（ｉ）ＰＢＧＤ ｍＲＮＡ投与による防御効果の非常に急速な発症（１日以内）があり、（ｉｉ）ＡＬＡ及びＰＢＧ尿中排泄への観察された影響は、非常に強力であり（ベースラインレベルに近い）、（ｉｉｉ）観察された防御効果は、長持ちする、ことを示し、修飾ＰＢＧＤ ｍＲＮＡの半減期は非常に長い（少なくとも２週間）ことを示す。
Ｂ．疼痛の防御；
ＡＩＰに罹患するヒト患者の９５％が、重度の疼痛を経験する。ＰＢＧＤの野生型またはＳＭバリアントをコードするｍＲＮＡのＡＩＰマウスの疼痛への影響を試験した。疼痛を、眼窩のこわばり、鼻の膨らみ、頬の膨らみ、耳の位置、ひげの変化、腹部のグルーミング、及び呼吸困難の観察に基づいて測定した（Ｌａｎｇｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．７（６）：４４７－９（２０１０））。図１７に提示のデータは、ヒトＰＢＧＤの野生型またはＳＭバリアントをコードするｍＲＮＡの単回投与が、１回目のフェノバルビタール負荷後に誘導される疼痛を防御し、且つ、再発性フェノバルビタール誘導疼痛の長期の防御が、２回目のフェノバルビタール負荷後のＡＩＰマウスで観察されたことを示す。対照ルシフェラーゼｍＲＮＡは、フェノバルビタール負荷後のＡＩＰマウスにおいて疼痛の防御をもたらさなかった。
Ｃ．末梢神経障害の防御：
末梢神経障害を、フェノバルビタール負荷後のロータロッド性能（運動及びバランス）ならびに歩行パターン（歩幅及び基底面）を測定することにより評価した。運動協調を、ロータロッド試験で測定した。これは、マウスが増加する速度で回転する回転ダウエル（ｄｏｗｅｌ）に留まることができる時間（秒単位）を測定する（Ｕｎｚｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．１９（２）：２４３－５０（２０１１））。歩行パターンを評価するために、歩幅及び基底面（すなわち、後肢の肉趾の中心間の距離）を、実質的に、Ｌｉｎｄｂｅｒｇ ＲＬ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ，１２：１９５－９９（１９９６）に記載されるように決定した。各群のロータロッドに費やされた時間（秒）を、図１８Ａに示し、各群の歩幅（ｃｍ）を、図１８Ｂに示す。
図１８Ａに示される通り、各フェノバルビタール負荷後、対照ルシフェラーゼｍＲＮＡが投与されたＡＩＰマウスがロータロッド上に留まることができた時間は、有意に減少した。他方では、各フェノバルビタール負荷後、ＰＢＧＤ ｍＲＮＡが投与されたＡＩＰマウスがロータロッドに留まることができる時間は、ベースライン条件下（フェノバルビタール負荷なし）で観察された時間に匹敵した。
図１８Ｂに示すように、対照ルシフェラーゼｍＲＮＡが投与されたＡＩＰマウスは、ＰＢＧＤ ｍＲＮＡが投与された動物と比較して、歩幅が減少している。対照ルシフェラーゼｍＲＮＡで処置されたＡＩＰマウスの歩行は、各フェノバルビタール負荷に伴い低下した。他方では、歩行は、ＰＢＧＤ ｍＲＮＡで処置されたＡＩＰマウスで維持された。従って、これらの結果は、ヒトＰＢＧＤの野生型またはＳＭバリアントをコードする修飾ｍＲＮＡの投与が、ＡＩＰマウスをフェノバルビタールにより誘導される末梢運動障害から防御することを示す。
Ｄ．再発性急性発作により引き起こされる坐骨神経機能障害の好転：
実質的にＵｎｚｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．１９（２）：２４３－５０，２０１１に開示の方法を使用して、坐骨神経機能を、対照ルシフェラーゼｍＲＮＡまたはＰＢＧＤ ｍＲＮＡが投与されたＡＩＰマウスで評価した。
軸索測定。
坐骨神経を、ｐＨ７．２の４％のグルタルアルデヒドの０．１Ｍのカコジル酸ナトリウム緩衝液中、４℃で一晩固定し、１％のリン酸緩衝四酸化オスミウム中で、４℃で２．５時間後固定した。試料をエタノールで脱水し、プロピレンオキシドで洗浄し、Ｅｐｏｎ８１２に包埋した。半薄（厚さ１ｍｍ）の切片を、光学顕微鏡による検査のために、切断し、１％のトルイジンブルーで染色した。Ｍ１ Ｚｅｉｓｓ顕微鏡及びＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ Ｚｅｉｓｓイメージングソフトウェアを使用するＩＮＳＩＧＨＴ ＡｘｉｏＣａｍｍ ＩＣｃ３カメラで、軸索断面を得た。画像解析ソフトウェアは、ＯＳ Ｒｅｄ Ｈａｔ Ｌｉｎｕｘ ＡＳ ２．６．１８－５３．ｅｌ５下でＭＡＴＬＡＢ ｖ．７．１．０及びＤＩＰｌｉｂ ｖ１．６ Ｃライブラリーを使用して開発されている。軸索の内径及び密度を、コンピュータ支援画像解析により定量した。
神経生理学的試験。
電気生理学的試験は、坐骨神経の神経伝導速度及び活動電位振幅の測定を含んでいた。０．５ｍｍの間隔でカソードが遠位に位置して、臀部の坐骨神経の出口点付近の皮下に留置された数組の針を用いて、電気刺激を伝達した。記録装置と同期させたＧｒａｓｓ定電流装置（Ｇｒａｓｓ－ＡｓｔｒｏＭｅｄ、米国ウェストウォリック）を備えるＧｒａｓｓ Ｓ１８０刺激装置により、刺激を伝達した。最大応答振幅を確実にするために、刺激強度を徐々に増加させた。ヒラメ筋の中心（活動）（足首と膝の中間点）及びアキレス腱の挿入付近に位置するスチール針電極（Ｖｉａｓｙｓ Ｈｅａｔｈｃａｒｅ、英国）を用いて、運動電位を記録した。応答を、Ｇｒａｓｓ Ｐ５１１増幅器（Ｇｒａｓｓ Ａｓｔｒｏｍｅｄ、米国）により増幅し、ＣＥＤ ｐｏｗｅｒ １４０１ Ａ／Ｄ変換器（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｄｅｓｉｇｎ、英国ケンブリッジ）によりデジタル化し、Ｓｉｇｎａｌ３ソフトウェア（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｄｅｓｉｇｎ、英国ケンブリッジ）を使用してＰＣに保存した。応答の振幅がさらに以上増加しなくなるまで、刺激強度を、徐々に増加させた。測定された電位に使用された強度は、最大応答と関連する最小値よりも少なくとも２０％高かった。１０の適切な電位から最良の応答を、分析のために選択した。分析された応答は、全ての場合について、二相性の電位陰性／陽性で構成される。複合筋活動電位の振幅、潜時、及び持続時間を測定し、異なる者で二重に確認した。
潜時の増加及び振幅の消失は、急性発作のフェノバルビタール誘導を繰り返した後のＡＩＰマウスで発生した運動機能障害及び軸索喪失と相関する（Ｕｎｚｕ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１１）。ＡＩＰマウスでは、神経伝達速度の異常は、加齢と伴に、及びフェノバルビタールの用量を増加させることにより誘導された再発性急性発作後に生じる。ヒトポルフィリン症では、末梢神経障害は、高レベルのポルフィリン前駆体を維持した後の患者で経時的に観察される。末梢神経障害は、急性ポルフィリン症において非対称性であることができる。
坐骨神経の近位刺激により引き起こされる複合筋活動電位を、注射後２７日目に測定した。ルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡまたは野生型ＰＢＧＤをコードするｍＲＮＡまたはＰＢＧＤ－ＳＭタンパク質バリアントをコードするｍＲＮＡが投与されるＡＩＰマウスの２つの後肢におけるフェノバルビタール負荷は８時間続く。図１９Ａ、図１９Ｂ、及び図１９Ｃは、それぞれ、対照、ＰＢＧＤ ｍＲＮＡ、及びＰＧＢＤ－ＳＭ ｍＲＮＡ処置マウスに対する経時的な振幅（右脚）の例を示す。対照ルシフェラーゼｍＲＮＡ群は、短い振幅及び長い潜時測定値を有し、ＰＢＧＤ ｍＲＮＡ群は、より長い振幅及びより短い潜時間測定値を有した。各群の３回の連続したフェノバルビタール負荷（ｍｓ）後の潜時は、図１９Ｄに示される。各群の３つの連続したフェノバルビタール負荷（ｍＶ）後の振幅は、図１９Ｅに示される。従って、単回用量の、野生型ヒトＰＢＧＤをコードする修飾ｍＲＮＡの投与は、再発性急性発作後のＡＩＰマウスにおける潜時の増加及び振幅の消失を防御した。単回用量の、ヒトＰＢＧＤ－ＳＭをコードする修飾ｍＲＮＡの投与は、再発性急性発作後のＡＩＰマウスにおける潜時の増加を防御した。
これらの結果は、ｉｎ ｖｉｖｏでのＡＩＰ徴候及び症状の処置のためのＰＢＧＤをコードするｍＲＮＡの顕著な治療有効性を示す。ＰＢＧＤ ｍＲＮＡで処置したＡＩＰマウスは、フェノバルビタールで負荷したが、疼痛の徴候を示さず、野生型マウスのように活発に動き回ることができた。これに対して、フェノバルビタール誘導発作中のルシフェラーゼｍＲＮＡで処置したＡＩＰマウスは、激痛があるようにみえ、自由に動くことができず、運動にバランスの問題を示した。
実施例２３
ＡＡＶ－ＰＢＧＤ ＤＮＡ及びＰＢＧＤ ｍＲＮＡ投与後のＰＢＧＤタンパク質の肝発現
ＡＡＶ－ＰＢＧＤベクターまたはＰＢＧＤをコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡを注入したＡＩＰマウス由来の肝臓組織を、ウサギポリクローナル抗ＰＢＧＤ抗体（Ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ ＃ｓｃ－６７０３７）を使用した免疫組織化学（ＩＨＣ）により、及び未処置ＡＩＰマウス由来の肝臓と比較して分析した。
組織学及びＰＢＧＤ免疫組織化学染色。右左肝葉のホルマリン固定／パラフィン包埋切片（５μｍ）を、ヘマトキシリンエオシンで染色した。ウサギで産生されたポリクローナル抗ＰＢＧＤ抗体（希釈１：８００）で高度に染色された細胞の割合を決定するために、免疫組織化学を使用した。使用された二次抗体は、ペルオキシダーゼ標識デキストランポリマー（Ｄａｋｏ、Ｋ４００３）に結合したヤギ抗ウサギであった。ＤＡＢ＋（Ｄａｋｏ、Ｋ３４６８）を使用して、ペルオキシダーゼを可視化した。ヘマトキシリンで対比染色して、陽性細胞の茶色に対比する青色のバックグラウンドを得た後に、ＰＢＧＤ陽性細胞の百分率を、４０×の倍率の顕微鏡下で各試料の４～６視野から少なくとも１０００細胞で計算した。肝細胞及び非実質細胞を、形態学的基準に基づいて容易に見分け：肝細胞は、多面体形状、丸い核を有し、非実質細胞より大きく、これは、不規則形状である。
図２０Ａに示される通り、ＡＩＰマウスにおける遺伝子療法ベクターＡＡＶ－ＰＢＧＤの投与は、高いＰＢＧＤタンパク質レベル（６０Ｕ超）を示唆する肝臓の凝集染色を誘導した。未処置のＡＩＰマウス由来の代表的な肝臓組織試料は、図２０Ｂに示され、これにより、本質的に非常に低いＰＢＧＤタンパク質レベル（約３Ｕ）がＡＩＰマウスの肝臓で検出されたことが確認された。ＰＢＧＤ ｍＲＮＡで処置したＡＩＰマウスの肝臓では、ＰＢＧＤタンパク質の発現は、全ての肝細胞の全体にわたって均質であり、経時的に減少した。タンパク質発現の増加は、それぞれ、図２０Ｃ、２０Ｄ、及び図２０Ｅに示されるように、ＰＢＧＤ ｍＲＮＡの注射後１日目（約１９Ｕ）、２日目（約１４Ｕ）、及び４日目（約４．７Ｕ）に観察された。ＩＨＣにより観察されたＰＢＧＤタンパク質の発現は、実施例２１に示されるＰＢＧＤ肝活性と一致した。
実施例２４
野生型ヒトＰＢＧＤをコードするｍＲＮＡを投与するための脂質ナノ粒子送達系
ＰＢＧＤ ｍＲＮＡを封入する脂質ナノ粒子の異なる製剤を、複数回のフェノバルビタール誘導発作後に、ＡＩＰマウスの症状を低減する能力について試験した。０．５もしくは０．１ｍｇ／ｋｇ用量の野生型ヒトＰＢＧＤをコードするＯＲＦを含む１－メチルシュードウリジン修飾ｍＲＮＡまたは０．５ｍｇ／ｋｇ用量のルシフェラーゼをコードするＯＲＦを含む対照ｍＲＮＡを、脂質ナノ粒子（ＭＣ３または化合物１８のいずれか）に製剤化し、ＡＩＰマウスに投与した。ｍＲＮＡを、試験の２日目に単回静脈内投与として投与した。マウスに、３回のフェノバルビタール負荷実施し、これらのそれぞれは、フェノバルビタールの４回の別々の腹腔内注射で構成されていた。本試験のエンドポイントは、（Ａ）ポルフィリン及びポルフィリン前駆体の尿中排泄、（Ｂ）疼痛の測定、（Ｃ）ロータロッドを使用した末梢神経障害、を含み、これを、上記実施例２２に記載の同じ方法に従って試験した。ルシフェラーゼｍＲＮＡ－ＭＣ３（対照）群由来のマウス、ルシフェラーゼｍＲＮＡ－化合物１８（対照）群由来のマウス、及びＰＢＧＤ ｍＲＮＡ－ＭＣ３群由来のマウスは、２回目のフェノバルビタール負荷中の第３の用量の投与後に死亡した。３匹全ては、死亡前に急性ポルフィリン症の発作の症状を示した。
Ａ．尿中ＡＬＡ及びＰＢＧ排泄の低減：
ＭＣ３または化合物１８のいずれかに製剤化された野生型ＰＢＧＤをコードするｍＲＮＡは、１回目のフェノバルビタール負荷後に誘導されたポルフィリン前駆体ＡＬＡ及びＰＢＧの増加を完全に防御し、それぞれ図２１Ａ及び図２１Ｂに示される通り、２回目のフェノバルビタール負荷の蓄積を有意に低減させた。より低い０．１ｍｇ／ｋｇ用量の、化合物１８と共に製剤化されたＰＢＧＤ ｍＲＮＡの投与は、最初の誘導後にポルフィリン排泄の部分的な低減を示した。対照ルシフェラーゼｍＲＮＡは、いずれかの脂質ナノ粒子と共に製剤化された時、フェノバルビタール負荷後にＡＬＡまたはＰＢＧ増加の低減をもたらさなかった。
Ｂ．疼痛の防御；
ＭＣ３または化合物１８のいずれかと共に製剤化された野生型ＰＢＧＤをコードするｍＲＮＡの投与の、ＡＩＰマウスの疼痛への影響を評価した。ＭＣ３または化合物１８に製剤化されるルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡを、対照として使用した。図２２Ａに示される通り、０．５ｍｇ／ｋｇでＭＣ３と共に製剤化された、且つ０．５ｍｇ／ｋｇまたは０．１ｍｇ／ｋｇ用量の化合物１８と共に製剤化された、野生型ＰＢＧＤをコードするｍＲＮＡは全て、疼痛の低減を示した。０．１ｍｇ／ｍｇの化合物１８と共に製剤化されたＰＢＧＤ ｍＲＮＡの投与は、１回目のフェノバルビタール負荷が適用された時に、疼痛の有意な低減を示したが、２回目または３回目のフェノバルビタール負荷が適用された時に、対照に対して有意差はなかった。０．５ｍｇ／ｋｇの、ＭＣ３または化合物１８のいずれかに製剤化されたＰＢＧＤ ｍＲＮＡによる疼痛の低減は、１回目及び２回目のフェノバルビタール誘導の後で、同様であった。３回目のフェノバルビタール誘導後に、いずれの製剤でも疼痛の低減は観察されなかった。対照ルシフェラーゼｍＲＮＡは、疼痛の防御をもたらさなかった。
Ｃ．末梢神経障害の防御：
各群のロータロッドに費やされた時間（ベースライン値に対する％）は、図２２Ｂに示される。１回目及び２回目の誘導後のロータロッド結果は、化合物１８中の０．５ｍｇ／ｋｇのＰＢＧＤ ｍＲＮＡ製剤が、ロータロッドに費やされた最も長い時間をもたらしたことを示した。０．５ｍｇ／ｋｇのＭＣ３中のＰＢＧＤ ｍＲＮＡ製剤も、ベースラインに近いロータロッドに費やされた時間をもたらした。対照ルシフェラーゼで処置されたマウスは、ベースラインと比較して、ロータロッド上の時間を有意に低減させた。
実施例２５
修飾ＰＢＧＤ ｍＲＮＡ構築物が投与された野生型マウスにおけるＰＢＧＤ活性
配列最適化化学修飾ＰＢＧＤをコードするｍＲＮＡがｉｎ ｖｉｖｏでＰＢＧＤ活性を促進する能力を試験した。野生型ＣＤ１マウスに、（ｉ）対照１－メチルシュードウリジン修飾ルシフェラーゼｍＲＮＡ（ＯＲＦ 配列番号８６）（Ｎ＝３）、（ｉｉ）ヒトＰＢＧＤをコードする配列操作のないＯＲＦ（表８中のｗｔ ＰＢＧＤ（ＯＲＦ 配列番号８７））を含む１－メチルシュードウリジン修飾ｍＲＮＡ（Ｎ＝３）、（ｉｉｉ）ヒトＰＢＧＤ（構築物ＰＢＧＤ ＣＯＶ２及びＰＢＧＤ ＣＯＶ１、それぞれ、ＯＲＦ 配列番号８８及び８９）をコードする配列最適化ＯＲＦを含む１－メチルシュードウリジン修飾ｍＲＮＡ（Ｎ＝３）、または（ｉｖ）ヒトＰＢＧＤ（表７の構築物＃１～＃２６及び＃２９～＃３１）をコードする配列最適化ＯＲＦを含む５－メトキシウリジン修飾ｍＲＮＡ（Ｎ＝４）を静脈内注射した。５－メトキシウリジン修飾ＰＢＧＤ ｍＲＮＡは、構築物＃１～＃２７及び＃２９～＃３１の３’非翻訳領域にｍｉｒ－１４２及びｍｉｒ－１２６結合部位を含んでいたが、構築物＃２８は、３’非翻訳領域中のｍｉｒ－１４２結合部位を含んでいた（表７）。各マウスへの送達のために、ｍＲＮＡを、脂質ナノ粒子（化合物１８）に製剤化した。
表７．ヒトＰＢＧＤをコードする最適化ＯＲＦを含む修飾ｍＲＮＡ構築物。構築物＃１～＃２８のそれぞれは、Ｃａｐ１ ５’末端キャップ及び３’末端ポリＡ領域を含む。
Figure 2023062097000220
対照と比較した、化合物１８に製剤化された配列最適化化学的修飾ＰＢＧＤ ｍＲＮＡ構築物＃１～１８の注射の２４時間後の野生型マウスの肝ＰＢＧＤ活性を、表８に示す。
表８．ＰＢＧＤ ｍＲＮＡ構築物におけるＰＢＧＤ活性
Figure 2023062097000221
配列最適化化学修飾ＰＢＧＤ ｍＲＮＡは、対照と比較して、ＰＢＧＤ活性の増加を促進した。特に、化合物１８に製剤化された配列最適化５－メトキシウリジン修飾ＰＢＧＤ ｍＲＮＡ構築物＃１４及び＃１６は、他の５－メトキシウリジン修飾構築物よりも有意に高いＰＢＧＤ活性をもたらした。下記実施例２６～２７に記載のさらなる試験では、化合物１８に製剤化された配列最適化５－メトキシウリジン修飾ＰＢＧＤ ｍＲＮＡ（構築物＃１４）を使用した。下記実施例２８～３１に記載のさらなる試験では、化合物１８に製剤化された配列最適化５－メトキシウリジン修飾ＰＢＧＤ ｍＲＮＡ（構築物＃１６）を使用した。
図２３Ａ及び２３Ｂは、それぞれ、化合物１８に製剤化された配列最適化化学修飾ＰＢＧＤ ｍＲＮＡ構築物＃１１、＃１４、＃１６、＃１９～＃２６、及び＃２９～＃３１を注射の２４時間後の、野生型マウスにおける肝ＰＢＧＤ活性及びＰＢＧＤタンパク質発現を示す。試験された全ての構築物は、対照ルシフェラーゼ構築物を十分に上回るＰＢＧＤ活性及びタンパク質発現をもたらした。特に、化合物１８に製剤化された配列最適化５－メトキシウリジン修飾ＰＢＧＤ ｍＲＮＡ構築物＃２４及び＃２６は、試験された他の５－メトキシウリジン修飾構築物よりも有意に高いＰＢＧＤ活性及びタンパク質発現をもたらした。
実施例２６
修飾ＰＢＧＤ ｍＲＮＡが投与されたＡＩＰマウスの複数用量試験
複数回のフェノバルビタール誘導発作の後に、ＡＩＰマウスの疾患関連バイオマーカー、疼痛、及び末梢神経障害を低減させる、脂質ナノ粒子に製剤化されたヒトＰＢＧＤをコードするｍＲＮＡの複数用量投与の能力を、試験した。３つの用量（０．５ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、または０．０５ｍｇ／ｋｇ）の、化合物１８含有脂質ナノ粒子に製剤化されたＰＢＧＤをコードする配列最適化５－メトキシウリジン修飾（ｍｉＲ－１４２及びｍｉＲ－１２６）ｍＲＮＡ（表７の構築物＃１４）（化合物１８：コレステロール：ＤＳＰＣ：ＤＭＧ：ＰＥＧ）（Ｎ＝５、各用量）または０．５ｍｇ／ｋｇ用量の、化合物１８に製剤化されたルシフェラーゼをコードする対照１－メチルシュードウリジン修飾（ｍｉＲなし）ｍＲＮＡ（Ｎ＝５）を、図２４に提示された投与スケジュールに従って、ＡＩＰマウスに静脈内投与した。ｍＲＮＡを、試験の２週間に１回（すなわち、２日目、１５日目、及び２９日目に）ＩＶボーラスとして投与した。ＰＢＳ対照が投与されたＡＩＰマウスを、比較のために含めた（Ｎ＝４）。マウスに、３回のフェノバルビタール負荷実施し、これらのそれぞれは、フェノバルビタールの４回の別々の腹腔内注射で構成されていた。試験のエンドポイントは、（Ａ）ポルフィリン及びポルフィリン前駆体の尿中排泄、（Ｂ）疼痛の測定、（Ｃ）ロータロッド及びフットプリント分析を使用する末梢神経障害、（Ｄ）坐骨神経機能、（Ｅ）肝機能検査、ならびに（Ｆ）抗ＰＢＧＤ抗体レベルを含んでいた。
Ａ．尿中ＡＬＡ、ＰＢＧ、及びポルフィリン排泄の低減：
フェノバルビタール負荷後のＡＩＰマウスにおけるＡＬＡ、ＰＢＧ、及びポルフィリンの尿中排泄レベルを、上記実施例２２に記載されるように測定した。ＡＬＡの尿中排泄の結果は、図２５に示され、ＰＢＧ排出は、図２６に示され、ポルフィリン排泄は、図２７に示される。尿中ＡＬＡ、ＰＢＧ、及びポルフィリンは、フェノバルビタール負荷後に、対照ルシフェラーゼｍＲＮＡまたはＰＢＳが投与されたＡＩＰ対照マウスで増加した。ＰＢＧＤ ｍＲＮＡが投与されたＡＩＰマウスの用量応答効果があった。０．０５ｍｇ／ｋｇ用量のＰＢＧＤは、有意な効果を有さなかった。０．２ｍｇ／ｋｇ及び０．５ｍｇ／ｋｇの両方の用量のＰＢＧＤ ｍＲＮＡは、各フェノバルビタール負荷後のバイオマーカー排泄を低減させたが、０．５ｍｇ／ｋｇの用量は、３つの負荷全てを通して、最も大きい低減を一貫して達成した。０．２ｍｇ／ｋｇ及び０．５ｍｇ／ｋｇ用量のＰＢＧＤ ｍＲＮＡの投与後、ＡＬＡ、ＰＢＧ、及びプロフィリンレベルは、ベースラインレベルに近いものであった。これらの結果は、（ｉ）投与後にＰＢＧＤ ｍＲＮＡの防御効果の非常に速い発症があったこと、（ｉｉ）ＡＬＡ、ＰＢＧ、及びポルフィリン尿中排泄レベルは、非常に強力であったこと、ならびに（ｉｉｉ）観察された防御効果は、複数回投与後の各発作中に達成されたことを示す。
Ｂ．疼痛の防御：
フェノバルビタール誘導後のＡＩＰマウスの疼痛に対する複数回の０．５ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、及び０．０５ｍｇ／ｋｇ用量のＰＢＧＤ ｍＲＮＡを投与のする効果を評価した。眼窩のこわばり、鼻の膨らみ、頬の膨らみ、耳の位置、ひげの変化、腹部のグルーミング、及び呼吸困難を測定することにより、疼痛を評価した。疼痛測定結果（平均差スコア）は、図２８に提示される。データを、分散を平均化すために反復測定ＡＮＯＶＡ分析の前にｌｏｇ変換し、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較を使用して、ペアワイズ比較を行った。
結果は、０．２ｍｇ／ｋｇ及び０．５ｍｇ／ｋｇ用量のＰＢＧＤ ｍＲＮＡの投与は、３回全てのフェノバルビタール負荷後に誘導された疼痛を防御した。
Ｃ．末梢神経障害の防御：
末梢ニューロパチーの好転を、ロータロッド及びフットプリント測定（歩行パターン）により評価した。ロータロッド（秒単位で費やされた時間）及び歩行パターン（ｃｍ単位の歩幅）は、それぞれ、図２９及び図３０に示される。データは、平均として標準偏差と共に表される。統計分析の場合、データを、分散を平均化するために反復測定ＡＮＯＶＡ分析の前にｌｏｇ変換し、各誘導後に得られたベースライン及びマークの間の比較を、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較を使用して行った。いくつかの動物は、トレーニングに起因して、３回目の誘導でマークを増加させる。これらの結果は、０．０５ｍｇ／ｋｇ用量のＰＢＧＤ ｍＲＮＡが投与された時、弱い効果を有したことを示す。しかし、０．２ｍｇ／ｋｇ及び０．５ｍｇ／ｋｇ用量のＰＢＧＤ ｍＲＮＡの投与は、３回全てのフェノバルビタール負荷後に誘導される末梢運動障害を防御した。
Ｄ．再発性急性発作により引き起こされる坐骨神経機能障害の好転：
坐骨神経機能を、上記実施例２２に記載したように、ＡＩＰマウスで評価した。化合物の活動電位を、各動物の２つの後肢で測定した。図３１に示す振幅パラメータは、繊維の総体積の推定を与える。ＰＢＳまたは対照ルシフェラーゼｍＲＮＡが投与されたＡＩＰマウスは、３つの連続したフェノバルビタール負荷後に振幅の低減を示した。０．５ｍｇ／ｋｇのＰＢＧＤ ｍＲＮＡの投与は、ＡＩＰ負荷マウスの振幅のこの損失に対し最も高い防御を示した。
Ｅ．血清中アミノ基転移酵素及びビリルビンの評価：
血清中アミノ基転移酵素レベル（図３２Ａ及び図３２Ｂ）ならびに血清中ビリルビンレベル（図３２Ｃ）を、試験終了時のＡＩＰマウスで評価した。
屠殺時（野生型ＰＢＧＤをコードする修飾ｍＲＮＡの３回目の投与の６日後及び最終のフェノバルビタール投与の３日後）の血清中ＡＬＴ（アラニンアミノ基転移酵素）レベル及び血清中ＡＳＴ（アスパラギン酸アミノ基転移酵素）アミノ基転移酵素レベルは、群間で有意な変化を示さず、ＷＴマウスのレベルに類似していた。用量依存的効果はなかった。
血清中ビリルビンレベルは、同様に群間で同等であった。
Ｆ．抗薬物抗体（ＡＤＡ）アッセイ：
以下のプロトコールを使用して、この実施例に記載の実験で使用されたＰＢＧＤ ｍＲＮＡの用量が注射されたＡＩＰマウスの血清中の抗ＰＢＧＤ抗体の存在を決定した。
１．４℃で一晩、０．１Ｍの炭酸緩衝液中の抗原（ウェル当たり５０μｌ中の０．１μｇ）でコーティングする。
２．０．０５％のＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ（ウェル当たり２００μｌ）で３回洗浄する。
３．０．０５％のブロッキング溶液ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで、５％のミルク（ウェル当たり２００μｌ）で、ブロックし、室温で１時間ブロックする。
４．ブロッキング溶液中の１：２０希釈から開始して、各血清試料に対して１２回の希釈を行い、３７℃で１時間３０分間インキュベートする（Ｖｆ＝５０μＬ）。血清を１：２に希釈し、５０μｌの血清を５０μｌのアッセイ希釈剤と合わせ、５０μＬを使用した。
５．０．０５％のＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ（ウェル当たり２００μｌ）で５回洗浄する。
６．希釈１：５，０００でブロッキング溶液中のタンパク質Ａ ＨＰＲＯを添加し、３７℃で１時間３０分間インキュベートする。
７．０．０５％のＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ（ウェル当たり２００μｌ）で５回洗浄する。
８．ＴＭＢ（ウェル当たり５０μｌ）を添加し、３分間インキュベートする。
９．２Ｍの硫酸（ウェル当たり３０μｌ）で反応を停止させる。
１０．４５０ｎｍで吸光度を読む。
ＡＤＡアッセイは、ＡＩＰマウスの血清中の抗ＰＢＧＤ抗体の存在を検出しなかった（データ示さず）。
実施例２７
修飾ＰＢＧＤ ｍＲＮＡが投与されたＡＩＰマウスにおける急性期処置試験
急性ＡＩＰ発作の処置では、非常に高レベルのポルフィリン前駆体（ＡＬＡ及びＰＢＧ）ならびにポルフィリンをできるだけ速く低減させることが重要である。従って、ヒトＰＢＧＤをコードするｍＲＮＡの投与後に、ＡＬＡ、ＰＢＧ、及びプロフィリンの尿中レベルを低下させる発症の速度を評価するために、試験をデザインした。
急性ＡＩＰ発症を誘導するために、ＡＩＰマウスに、単回のフェノバルビタール負荷を実施した。（１、２、及び３日目の）フェノバルビタールの３回の腹腔内注射後であるが、（４日目の）負荷中の４回目のフェノバルビタール注射の２時間前に、化合物１８含有脂質ナノ粒子に製剤化されたＰＢＧＤをコードする配列最適化５－メトキシウリジン修飾（ｍｉＲ－１４２／１２６）ｍＲＮＡ（表７の構築物＃１４）（化合物１８：コレステロール：ＤＳＰＣ：ＤＭＧ：ＰＥＧ）を、単回投与（０．５ｍｇ／ｋｇ）の静脈内ボーラス（Ｎ＝５）として静脈内投与した。フェノバルビタール負荷と共に投与された化合物１８含有脂質ナノ粒子にも製剤化されるルシフェラーゼｍＲＮＡ（化合物１８：コレステロール：ＤＳＰＣ：ＤＭＧ：ＰＥＧ）（Ｎ＝４）及びフェノバルビタール負荷なしで投与されたＰＢＳ（Ｎ＝３）は、対照として含まれていた。４及び５日目のルシフェラーゼ対照において、高レベルの尿中バイオマーカーを維持するために、さらに５回目のフェノバルビタール注射を（５日目に）行った。試験投与のデザインは、図３３Ａ～３３Ｃにまとめられている。各フェノバルビタール注射後、ＡＬＡ、ＰＢＧ、及びポルフィリンレベルの測定のための以下の２４時間の全尿を得るために、マウスを代謝ケージに入れた。
結果は、０．５ｍｇ／ｋｇ ＰＢＧＤ ｍＲＮＡの投与で、尿ポルフィリン前駆体ＡＬＡ（図３３Ａ）及びＰＢＧ（図３３Ｂ）の急速な低下、ならびに、確認された急性発作を防ぐポルフィリンのレベル（図３３Ｃ）を示す。ＡＬＡ及びＰＢＧ排泄レベルは、ＰＢＧＤ ｍＲＮＡ及び４回目のフェノバルビタール注射の間の４日目の２時間以内に基礎値に急速に戻り、ポルフィリンレベルは、ＰＢＧＤ ｍＲＮＡの投与の１日後（５日目）に基礎レベルに戻った。対照的に、対照ルシフェラーゼｍＲＮＡが投与されたマウスで、ＡＬＡ及びＰＢＧレベルは、上昇し続け、ポルフィリンレベルは、５日目に上昇したままであった。
この試験では、バイオマーカーが（ルシフェラーゼ対照に対応する値により示されるように）ピークレベルに達していた時に、修飾ｍＲＮＡを、急性ＡＩＰエピソード中後半に投与した。これらの急性ＡＩＰ発作条件下で、ＰＢＧＤ ｍＲＮＡは、全てのバイオマーカーレベルをベースラインまで急速に低下させた。
実施例２８
野生型ＣＤ－１マウスにおける野生型ＰＢＧＤをコードする修飾ｍＲＮＡの薬物動態試験
ｉｎ ｖｉｖｏでのＰＢＧＤ ｍＲＮＡ投与の持続時間及び薬物動態を評価するための試験を行った。脂質ナノ粒子（化合物１８）に製剤化されたＰＢＧＤをコードする配列最適化５－メトキシウリジン修飾（ｍｉＲ－１４２／１２６）ｍＲＮＡ（表７の構築物＃１６）を、単回の０．５ｍｇ／ｋｇの静脈内ボーラスとして、野生型マウス（ＣＤ－１、９週齢）に投与した。試験の時点は、２時間、６時間、１０時間、１６時間、２４時間、２日、４日、７日、１０日、及び１４日であった。屠殺時、動物の肝臓及び脾臓を灌流した。ｂＤＮＡ試験を使用して、ｍＲＮＡレベルを決定した。２つの試料を、（多くとも４日）各時点の各動物の肝臓の左右中葉から、ｂＤＮＡ法の試験のために収集した。ＰＢＧＤ活性及びタンパク質レベルを、肝臓（１５ｍｌの管中の３．５ｍｌのＫＣｌ溶液中の肝臓組織１グラム）及び脾臓（１．５ｍｌのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管中の２００ｕｌのＫＣｌ溶液中の半分の脾臓、すなわちおよそ５０～１００ｍｇ）で測定した。肝臓及び脾臓組織の試験片を、組織学的分析（ＲＮＡｓｃｏｐｅ及びＩＨＣの両方）のために、１０％ホルマリンで固定した。肝臓試料を、左右中葉から取り、直ちに、１０％ホルマリンで固定した。脾臓試料を、まず横断的に切断し、次に、１０％ホルマリンで固定した。肝組織試料の小試験片を、ＬＣ／ＭＳＭＳによる絶対的定量化のために急速凍結した（ｎ＝２、各時点に対する左右中葉試料）。
対照ルシフェラーゼｍＲＮＡが投与されたマウスと比較した、ＰＢＧＤ ｍＲＮＡが投与されたマウスにおける経時的な肝ＰＢＧＤ活性は、図３４に示される。図３５Ａに示される通り、ｍＲＮＡにコードされたＰＢＧＤ活性の（ノンコンパートメント解析による）終末相ｔ１／２は、８日であった。ＰＢＧＤ活性は、６～１０時間でピークに達し、次に、注射のおよそ７日後にベースラインレベルに到達するまで、減衰した。ｍＲＮＡにコードされたＰＢＧＤ活性の半減期は、実施例２１で使用されたＰＢＧＤ構築物によりコードされたタンパク質の半減期と一致していた（図１３及び図３５Ｂを参照のこと）。野生型ＰＢＧＤをコードする修飾ｍＲＮＡの単回用量は、完全なＡＩＰ急性発作を処置するのに十分な半減期を有するようにみえる。肝臓におけるＰＢＧＤタンパク質レベル（図３６）は、活動データと一致した。ヒトＰＢＧＤ ｍＲＮＡの肝レベルもまた、肝臓におけるＰＢＧＤ活性レベルと良好に相関していた（図３７）。
マウスの脾臓ＰＢＧＤ活性のＰＫデータは、脾臓ＰＢＧＤの増加を示さず（データは示さず）、ＰＢＧＤ活性の増加が肝臓組織に特異的であることを示していた。脾臓におけるＰＢＧＤタンパク質レベルは、活性データと一致した（データは示さず）。
ＰＢＧＤ ｍＲＮＡで処置したＷＴ ＣＤ１マウスの肝臓では、ＩＨＣにより観察されたＰＢＧＤタンパク質発現は、図３４に示されるＰＢＧＤ活性と一致し、図３６に示されたＬＣ／ＭＳＭＳにより検出されたヒトＰＢＧＤタンパク質レベルと一致した。外因性ＰＢＧＤの発現は、全肝細胞にわたって均質であり、注射の１６時間後に減少した。それぞれ、図３８Ａ、３８Ｂ、３８Ｃ、３８Ｄ、及び３８Ｅに示される通り、ＰＢＧＤ ｍＲＮＡの注射の２時間後、６時間後、１０時間後、１６時間後、及び２４時間後に、基礎レベルを超えるＰＢＧＤタンパク質の発現の増加が観察された。ＰＢＧＤ基底レベルを評価するためのルシフェラーゼｍＲＮＡで処置されたＷＴ ＣＤ１マウス由来の代表的な肝臓組織試料を、図３８Ｆに示す。ＰＢＧＤのタンパク質の発現は、ルシフェラーゼ対照では検出されず、これは、マウス種を用いるＩＨＣ分析に使用されたＮｏｖｕｓ抗ＰＢＧＤ抗体の交差反応がなかったことを示した。
実施例２９
ＡＩＰマウスにおける野生型ＰＢＧＤをコードする修飾ｍＲＮＡの薬物動態試験
ｉｎ ｖｉｖｏでのＰＢＧＤ ｍＲＮＡ投与の持続時間及び薬物動態を評価するために試験を行った。ＭＣ３に製剤化されたコドン最適化ＯＲＦを含む野生型ＰＢＧＤをコードする１－メチルシュードウリジン修飾ｍＲＮＡ（ＰＢＧＤ ＣＯＶ１；ＯＲＦ 配列番号８９）を０．５ｍｇ／ｋｇで投与し、脂質ナノ粒子（化合物１８）に製剤化されたＰＢＧＤをコードする配列最適化５－メトキシウリジン修飾（ｍｉＲ－１４２及びｍｉＲ－１２６）ｍＲＮＡ（表７の構築物＃１６）を、単回静脈内ボーラスとして、ＡＩＰマウスに０．５ｍｇ／ｋｇ及び０．２ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。試験の時点は、１０時間、１日、２日、４日、７日、及び１０日であった。ＰＢＧＤ ｍＲＮＡの投与後のＡＩＰマウスの肝ＰＢＧＤ活性を図３９に示す。比較のために、図３９の１２単位の閾値線は、野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）の肝臓で観察されたＰＢＧＤのレベルであり、３単位の閾値線は、処置なしのＡＩＰマウスの肝臓内のＰＢＧＤのレベルである。
結果は、肝ＰＢＧＤ活性が、投与後最大７日間、治療域内であったことを示す。ヒトにおける急性ポルフィリン症の発作は、５～７日続く。ヒトでは、２単位から５単位への増加は、肝臓内のＰＢＧＤ活性を完全に回復させる。従って、これらの結果は、野生型ＰＢＧＤをコードするｍＲＮＡの単回投与が急性ポルフィリン症の発作を防御し得ることを示唆する。
実施例３０
修正ＰＢＧＤ ｍＲＮＡが投与されたＡＩＰマウスにおける血圧
脂質ナノ粒子中に製剤化されたＰＢＧＤ ｍＲＮＡの投与の、フェノバルビタール誘導発作中のＡＩＰマウスの血圧を低減させる能力を試験した（図４０Ａ及び図４０Ｂ）。ＡＩＰマウスに、フェノバルビタールの４回の腹腔内注射をして、急性発作を誘導させた。ＭＣ３に製剤化されたコドン最適化ＯＲＦ（ＰＢＧＤ ＣＯＶ１）を含む野生型ＰＢＧＤをコードする１－メチルシュードウリジン修飾ｍＲＮＡ（Ｎ＝５）及びＭＣ３に製剤化されたコドン最適化ＯＲＦ（ＰＢＧＤ ＣＯＶ１；ＯＲＦ 配列番号８９）を含む野生型ＰＢＧＤをコードする１－メチルシュードウリジン修飾ｍＲＮＡ（Ｎ＝５）及び化合物１８含有脂質ナノ粒子（化合物１８：コレステロール：ＤＳＰＣ：ＤＭＧ：ＰＥＧ）に製剤化されたコドン最適化ＯＲＦ（ＰＢＧＤ ＣＯＶ２；ＯＲＦ 配列番号８８）を含む野生型ＰＢＧＤをコードする１－メチルシュードウリジン修飾ｍＲＮＡ（Ｎ＝６）を、最初のフェノバルビタール注射の前に、それぞれ、０．５ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇの用量で、ＡＩＰマウスに静脈内投与した。フェノバルビタール負荷を受けたが、ＰＢＧＤ ｍＲＮＡの投与を受けていないＡＩＰマウスを、比較のために含めた（Ｎ＝９）。任意の処置なしの、ＡＩＰマウス（Ｎ＝１１）及び野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｎ＝９）を、対照として含まれた。
ＡＩＰマウスは、野生型マウスの範囲で血圧読み値を有する。ＡＩＰマウスにおける４回のフェノバルビタール注射は、収縮期血圧値及び拡張期血圧値の両方を有意に増加させた。フェノバルビタール負荷により誘導された高血圧及びポルフィリン前駆体の蓄積の完全な防御は、ＭＣ３及び化合物１８の両方の製剤中の治療用量のＰＢＧＤ ｍＲＮＡが注射されたＡＩＰマウスで達成された。これらのデータは、肝臓で生成されたポルフィリン前駆体が高血圧と相関することを初めて示す。
実施例３１
野生型Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットにおける野生型ＰＢＧＤをコードする修飾ｍＲＮＡの薬物動態試験
単回の静脈内ボーラスとして０．５ｍｇ／ｋｇ用量の、脂質ナノ粒子（化合物１８）に製剤化された配列最適化５－メトキシウリジン修飾ＰＢＧＤ ｍＲＮＡ（表７の構築物＃１６）が投与されたＷＴ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｙｌｅｙラットで、肝ＰＢＧＤ活性を決定した。ＰＢＧＤ ｍＲＮＡの投与の２４時間後及び４８時間後における肝ＰＢＧＤ活性は、図４１に示される。対照ルシフェラーゼｍＲＮＡが投与されたラットにおける基底ＰＢＧＤ活性レベルと比較した、ＰＢＧＤ ｍＲＮＡ注射の結果としての、ラットにおけるＰＢＧＤ活性の増加は、図３４に示される通り、投与の２４時間後及び４８時間後のＷＴ ＣＤ１マウスにおけるＰＢＧＤ活性の類似の程度までであった。
ＰＢＧＤ ｍＲＮＡで処置されたＷＴ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットの肝臓において、ＰＢＧＤタンパク質の発現レベルを、図４２Ａ及び４２Ｂに示される通り、ＩＨＣにより評価した。外因性ＰＢＧＤの発現は、全ての肝細胞を通して均質であった。基底レベルを超えるＰＢＧＤタンパク質の発現の増加は、図４２Ａに示される通り、１ｍｇ／ｋｇの化合物１８に製剤化されたＰＢＧＤ ｍＲＮＡの注射の２４時間後に観察された。対照ＰＢＳが注射されたＷＴ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット由来の代表的な肝臓組織試料は、図４２Ｂに示される。ＰＢＳ対照においては、最小のＰＢＧＤタンパク質発現（約＿Ｕ）を検出し、これは、ラット種を用いるＩＨＣ分析に使用されたＮｏｖｕｓ抗ＰＢＧＤ抗体の非常に低いレベルの交差反応を示した。
実施例３２
修飾ＰＢＧＤ ｍＲＮＡ構築物の投与後の非ヒト霊長類におけるＰＢＧＤ活性
肝ＰＢＧＤ活性を、ｍｉＲ１４２及びｍｉＲ１２６結合部位を含む５－メトキシウリジン修飾ＰＢＧＤ ｍＲＮＡのＩＶ投与の２４時間後のカニクイザルで決定した。化合物１８または化合物２３６を含む脂質ナノ粒子に、ｍＲＮＡを製剤化した。動物に、（ｉ）化合物２３６と共に製剤化された０．５ｍｇ／ｋｇのｍＲＮＡまたは（ｉｉ）化合物１８と共に製剤化された１ｍｇ／ｋｇのｍＲＮＡ、の単回静脈内ボーラスを投与した。対照動物に、ＰＢＳを投与した。ＰＢＧＤ ｍＲＮＡの投与の２４時間後の肝ＰＢＧＤ活性及び発現は、図４３Ａ及び４３Ｂに示される。化合物２３６を含む脂質ナノ粒子に製剤化された０．５ｍｇ／ｋｇのｍＲＮＡを投与された動物は、ＰＢＳが投与された対照動物にみられるレベルと比較して、約４０％のＰＢＧＤ活性の増加及び約９０％のＰＢＧＤ発現の増加を示した。
発明の概要及び要約書のセクションではなく、発明を実施するための形態のセクションが、特許請求の範囲を解釈するために使用されるものとすることを理解すべきである。概要及び要約のセクションは、発明者（複数可）が企図した、全てではないが１つ以上の本発明の例示的実施形態を記載することができ、従って、決して、本発明及び添付の特許請求の範囲を制限するものではない。
本発明は、特定の機能及びその関係の実施を示す機能的構成単位を用いて、上に記載されている。これらの機能的構成単位の境界は、説明の便宜上、本明細書に任意に記載されている。別の境界を、具体的な機能及びその関係が適切に実施される限り、定義することができる。
特定の実施形態の上述の説明は、本発明の一般的な性質を十分に明らかにするので、他の者は、当業者の技能範囲内の知識を適用することにより、本発明の一般的な概念を逸脱することなく、過度な実験をすることなく、具体的な実施形態などの種々の用途を容易に修正し、及び／またはこれらに適合させることができる。従って、そのような適応及び修正は、本明細書に提示の教示及び指導に基づいて、意味の範囲及び開示された実施形態の均等物の範囲内にあることが意図される。本明細書の語法または用語は、本明細書の用語または語法が教示及び指導に照らして当業者により解釈されるように、説明のためのものであり、制限するものではないことを理解すべきである。
本発明の広がり及び範囲は、上記の例示的な実施形態のいずれによっても制限されるべきではなく、以下の特許請求の範囲及びそれらの等価物に従ってのみ定義されるべきである。
本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先される。

Claims (1)

  1. 本願の明細書及び図面に記載の発明。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11364292B2 (en) 2015-07-21 2022-06-21 Modernatx, Inc. CHIKV RNA vaccines
WO2017031232A1 (en) 2015-08-17 2017-02-23 Modernatx, Inc. Methods for preparing particles and related compositions
WO2017070624A1 (en) 2015-10-22 2017-04-27 Modernatx, Inc. Tropical disease vaccines
JP6921833B2 (ja) 2015-10-22 2021-08-18 モデルナティーエックス， インコーポレイテッド ヒトサイトメガロウイルスワクチン
JP6925688B2 (ja) 2015-10-22 2021-08-25 モデルナティーエックス， インコーポレイテッド 水痘帯状疱疹ウイルス（ｖｚｖ）のための核酸ワクチン
MD3718565T2 (ro) 2015-10-22 2022-09-30 Modernatx Inc Vaccinuri împotriva virusului respirator
MD3386484T2 (ro) 2015-12-10 2022-11-30 Modernatx Inc Compoziții și metode de livrare a unor agenți terapeutici
CA3007108A1 (en) 2015-12-17 2017-06-22 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding methylmalonyl-coa mutase
MA45036A (fr) 2016-05-18 2019-03-27 Modernatx Inc Polynucléotides codant pour la citrine pour le traitement de la citrullinémie de type 2
US11801227B2 (en) 2016-05-18 2023-10-31 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding cystic fibrosis transmembrane conductance regulator for the treatment of cystic fibrosis
US11001861B2 (en) 2016-05-18 2021-05-11 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding galactose-1-phosphate uridylyltransferase for the treatment of galactosemia type 1
CA3036831A1 (en) 2016-09-14 2018-03-22 Modernatx, Inc. High purity rna compositions and methods for preparation thereof
WO2018075980A1 (en) 2016-10-21 2018-04-26 Modernatx, Inc. Human cytomegalovirus vaccine
US10925958B2 (en) 2016-11-11 2021-02-23 Modernatx, Inc. Influenza vaccine
WO2018107088A2 (en) 2016-12-08 2018-06-14 Modernatx, Inc. Respiratory virus nucleic acid vaccines
US11384352B2 (en) 2016-12-13 2022-07-12 Modernatx, Inc. RNA affinity purification
WO2018170245A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Broad spectrum influenza virus vaccine
US11752206B2 (en) * 2017-03-15 2023-09-12 Modernatx, Inc. Herpes simplex virus vaccine
US11045540B2 (en) 2017-03-15 2021-06-29 Modernatx, Inc. Varicella zoster virus (VZV) vaccine
US11464848B2 (en) 2017-03-15 2022-10-11 Modernatx, Inc. Respiratory syncytial virus vaccine
EP3595676A4 (en) 2017-03-17 2021-05-05 Modernatx, Inc. RNA VACCINES AGAINST ZOONOSES
EP3607074A4 (en) 2017-04-05 2021-07-07 Modernatx, Inc. REDUCTION OR ELIMINATION OF IMMUNE RESPONSES TO NON-INTRAVENOUS THERAPEUTIC PROTEINS, FOR EXAMPLE SUBCUTANEOUSLY
WO2018206125A1 (en) * 2017-05-09 2018-11-15 Fundacion Para La Investigacion Medica Aplicada Human porphobilinogen deaminase derived proteins and polynucleotides and uses thereof
WO2018232357A1 (en) 2017-06-15 2018-12-20 Modernatx, Inc. Rna formulations
WO2019036685A1 (en) 2017-08-18 2019-02-21 Modernatx, Inc. METHODS FOR HPLC ANALYSIS
CN111212905A (zh) 2017-08-18 2020-05-29 摩登纳特斯有限公司 Rna聚合酶变体
US11866696B2 (en) 2017-08-18 2024-01-09 Modernatx, Inc. Analytical HPLC methods
WO2019046809A1 (en) 2017-08-31 2019-03-07 Modernatx, Inc. METHODS OF MANUFACTURING LIPID NANOPARTICLES
EP3681514A4 (en) 2017-09-14 2021-07-14 ModernaTX, Inc. RNA VACZINE AGAINST ZIKA VIRUS
MA54676A (fr) 2018-01-29 2021-11-17 Modernatx Inc Vaccins à base d'arn contre le vrs
US11851694B1 (en) 2019-02-20 2023-12-26 Modernatx, Inc. High fidelity in vitro transcription
WO2021204179A1 (en) 2020-04-09 2021-10-14 Suzhou Abogen Biosciences Co., Ltd. Nucleic acid vaccines for coronavirus
TW202204309A (zh) 2020-04-09 2022-02-01 大陸商蘇州艾博生物科技有限公司 脂質奈米粒子組成物
WO2021213924A1 (en) 2020-04-22 2021-10-28 BioNTech SE Coronavirus vaccine
US11406703B2 (en) 2020-08-25 2022-08-09 Modernatx, Inc. Human cytomegalovirus vaccine
CN114469996B (zh) * 2021-12-23 2023-10-20 中国医学科学院医学生物学研究所 一种包含miR-135b-5p的外泌体及在抗轮状病毒感染中的应用
WO2023196615A1 (en) * 2022-04-07 2023-10-12 RNAimmune, Inc. Compounds and compositions for drug delivery
WO2024002985A1 (en) 2022-06-26 2024-01-04 BioNTech SE Coronavirus vaccine

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2507540T3 (es) * 2008-09-29 2014-10-15 Uniqure Ip B.V. Terapia génica de porfobilinógeno deaminasa
JP2013095755A (ja) * 2011-11-02 2013-05-20 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd カチオン性脂質
WO2013151667A1 (en) * 2012-04-02 2013-10-10 modeRNA Therapeutics Modified polynucleotides

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