FR3023483A1 - Procede de preparation de nanoparticules d'arn messager et composition aqueuse hypotonique comprenant les nanoparticules d'arnm - Google Patents

Abstract

L'invention a pour objet un procédé de préparation de nanoparticules d'ARN messager (ARNm) codant une protéine thérapeutique, comprenant la condensation d'ARNm avec des composés cationiques de type A en milieu aqueux dans des conditions hypotoniques, conduisant à la formation de liaisons non covalentes avec l'ARNm, réversibles dans le cytoplasme de cellules de mammifères. L'invention a également pour objet les nanoparticules ainsi obtenues ainsi qu'une composition aqueuse hypotonique les comprenant. L'invention concerne enfin l'utilisation thérapeutique de ces compositions hypotoniques.

Description

Procédé de préparation de nanoparticules d'ARN messager et composition aqueuse hypotonique comprenant les nanoparticules d'ARNm L'expression de protéines thérapeutiques dans un tissu pathologique peut actuellement être obtenue par l'administration de vecteurs de gène ou de protéines recombinantes produites in vitro. Les vecteurs de gène ont trois grands défauts. Tout d'abord, le transgène peut s'intégrer de manière aléatoire dans le génome d'une cellule. Cela accroît le risque de transformation cellulaire, à l'origine de la survenue d'un cancer. Le niveau maximal d'expression de la protéine codée par le transgène est atteint 72 heures après l'injection du vecteur. Le traitement de certaines affections nécessiterait que le pic d'expression soit atteint dans les 24 premières heures suivant l'administration du produit pharmaceutique. De plus, le transgène s'exprime durablement, ce qui n'est pas approprié pour le traitement de pathologies aiguës, qui requiert une expression transitoire d'une protéine thérapeutique. La production de protéines recombinantes est en plein essor. Cependant, ces protéines s'accumulent difficilement dans un tissu pathologique à partir de la circulation sanguine et le temps de résidence d'une protéine thérapeutique dans un tissu est de courte durée. Or, le traitement d'affections aiguës nécessite l'expression locale d'une protéine pendant plusieurs jours, afin d'obtenir un bénéfice clinique. Ainsi, il existe une demande pour un système d'expression transitoire de protéines thérapeutiques extracellulaires, membranaires ou intracellulaires. La stratégie alternative à la protéine recombinante et à la thérapie génique est le transfert d'ARN messager (ARNm) codant pour une protéine thérapeutique. Les avantages de l'ARN messager Le transfert d'un ARNm dans une cellule aboutit à l'expression transitoire de la protéine d'intérêt. En effet, l'ARNm et la protéine codée par celui-ci sont entièrement dégradés en nucléotides et acides aminés en l'espace de quelques jours. La réversibilité de l'expression protéique est un gage de sécurité pour le patient. Cette expression transitoire de protéines thérapeutiques permettrait d'éviter les effets délétères, qui peuvent résulter d'une expression durable et incontrôlée.

Un ARNm ne peut pas s'intégrer dans le génome, contrairement à une molécule d'ADN. L'absence totale de génotoxicité des vecteurs d'ARNm représente un avantage de poids par rapport aux vecteurs de gène. Cela contribue aussi à la grande sécurité de ce type de vecteur pour le patient.

L'ARNm est introduit dans le cytosol de la cellule-cible, tandis que l'ADN d'un vecteur de gène doit être transféré dans le noyau. De plus, l'ARNm est d'emblée accessible aux ribosomes pour être traduit en protéine. Ainsi, l'expression de la protéine d'intérêt est plus précoce dans le cas d'un vecteur d'ARNm. Cela représente un avantage pour le traitement d'une pathologie aiguë, qui nécessite que la protéine thérapeutique apparaisse le plus tôt possible dans le tissu-cible. Production d'ARN messager in vitro Dans un premier temps, un plasmide doit être construit par les techniques classiques de biologie moléculaire. Le gène codant pour la protéine d'intérêt est inséré dans le plasmide en aval du promoteur de l'ARN polymérase du phage T7. Le plasmide est amplifié, purifié et linéarisé en aval du gène d'intérêt par une enzyme de restriction. Le plasmide linéarisé est ensuite incubé avec l'ARN polymérase T7 recombinante, les quatre ribonucléotides triphosphates et un analogue de coiffe. L'enzyme se fixe sur son promoteur et transcrit le gène jusqu'à l'extrémité de l'ADN. L'ARNm ainsi produit est ensuite purifié par chromatographie d'affinité et par précipitation au chlorure de lithium. La concentration d'ARNm purifié est déterminée par mesure de son absorbance à 260 nm. Caractéristiques générales d'un vecteur d'ARN messager Tout d'abord, l'ARNm doit être protégé et condensé sous la forme de particules nanométriques, constituant un vecteur, afin d'être hors d'atteinte des nucléases extracellulaires et lysosomales. La nanoparticule doit aussi avantageusement exposer à sa surface une molécule susceptible d'interagir avec un ou des composants de la membrane plasmique des cellules-cible. Ce ligand permet ainsi l'adsorption de la nanoparticule sur la surface cellulaire, afin de favoriser son internalisation par endocytose.

L'invention a pour objet un procédé permettant d'obtenir une telle nanoparticule ainsi que les nanoparticules mises au point, et les compositions le comprenant. Il a été découvert, de manière surprenante qu'il était possible d'obtenir des nanoparticules d'ARNm comprenant de l'ARNm condensé avec des composés cationiques dans des conditions hypotoniques. Ces nanoparticules comprenant de l'ARNm condensé vont pouvoir pénétrer dans les cellules de mammifère où ils vont libérer l'ARNm. Il a également été découvert que, d'une manière surprenante, l'administration des nanoparticules dans une composition hypotonique permet d'améliorer significativement la libération de l'ARNm dans le cytoplasme de cellules de mammifères. On constate un effet synergique de l'association nanoparticules ARNm selon l'invention et choc hypotonique. Une solution hypotonique est une solution dont la tonicité, c'est-à-dire l'osmolarité efficace, est très inférieure à celle du milieu intracellulaire de la cellule cible.

L'invention a pour objet un procédé de préparation de nanoparticules d'ARN messager (ARNm) codant une protéine thérapeutique, comprenant la condensation d'ARNm avec des composés cationiques de type A en milieu aqueux dans des conditions hypotoniques, conduisant à la formation de liaisons non covalentes avec l'ARNm, réversibles dans le cytoplasme de cellules de mammifères.

Il a été découvert qu'en condensant l'ARNm, avec les composés cationiques de type A, dans des conditions hypotoniques on obtient des nanoparticules, stables ne précipitant pas dans le milieu. Par stable, on entend que l'ARNm assemblé avec les composés cationiques de type A, autrement appelé ici nanoparticule ou vecteur, ne se dissocie pas dans le milieu extracellulaire. Le milieu dans lequel l'ARNm est assemblé avec les composés cationiques de type A est un milieu aqueux hypotonique. Avantageusement, le pH du milieu est compris entre 6,5 et 8,5 inclus, avantageusement entre 7 et 7,5 inclus. Le milieu comprend avantageusement un tampon hypotonique préférentiellement constitué d'un ou de cation(s) monovalent(s). En particulier, le tampon est l'Hépès de sodium. On utilise de préférence un milieu dépourvu de cations multivalents. Avantageusement, la grande majorité des cations dans le milieu est apportée par le tampon. La concentration en cations du milieu est avantageusement inférieure à 150 mM, plus avantageusement inférieure à 50 mM, encore plus avantageusement inférieure à 20 mM. Le milieu a avantageusement une osmolarité inférieure à 300 mosM, avantageusement comprise entre 0 et 100 mosM, plus avantageusement comprise entre 0 et 50 mosM.

L'assemblage, encore appelé condensation, de l'ARNm dans ces conditions permet d'obtenir des nanoparticules d'ARNm ayant une taille inférieure ou égale à 200 nm, avantageusement inférieure ou égale à 100 nm. La taille de nanoparticules peut être mesurée par microscopie électronique. Elle peut aussi être mesurée par diffraction de la lumière d'un laser (dynamic light scattering) émise par un « particle sizer ». A concentration saline supérieure, les particules sont significativement plus grosses qu'à faible osmolarité et ont tendance à s'agréger avec le temps. Or, il est indispensable que le vecteur d'ARNm soit de petite taille (avantageusement 200 nm), afin de pénétrer efficacement dans les cellules-cibles par endocytose.

Le second intérêt de la solution hypo-osmotique est qu'elle induit un choc hypotonique aux cellules-cibles. Celui-ci participe grandement à l'entrée du vecteur dans les cellules. Le milieu comprend avantageusement également des composés de type A'-E-L, où - A' est un composé cationique, permettant lui aussi la condensation de l'ARNm, par liaisons non covalentes avec l'ARNm réversibles dans le cytoplasme de cellules de mammifères. - E est un espaceur non chargé et soluble dans l'eau - L est un peptide ligand neutre ou quasi-neutre Neutre ou quasi neutre signifie que le ligand n'est pas chargé ou qu'il comprend des charges positives et des charges négatives qui s'équilibrent ou s'équilibrent presque. Les composés cationiques de type A ou de type A' répondent à la même définition générique. Ils peuvent être identiques ou différents, ils sont avantageusement identiques. Les composés cationiques de type A ou de type A' possèdent des charges positives, qui peuvent interagir avec les charges négatives portées par l'ARN, ce qui aboutit à la condensation de ce dernier en nanoparticule. Un vecteur est une nanoparticule contenant de l'ARN messager. Au sein de la nanoparticule, l'ARNm est condensé et protégé vis-à-vis des nucléases. De plus, la nanoparticule peut aussi exhiber un peptide ligand à sa surface. L'assemblage des nanoparticules implique donc que des interactions s'établissent entre la molécule d'ARNm et la ou les molécules de condensation de l'ARN. On décrit ci-après particulièrement des peptides, car ces derniers sont biodégradables et aisément synthétisés chimiquement. Les interactions les plus fréquemment utilisées pour fixer l'ARN à la molécule de condensation de ce dernier, sont les interactions électrostatiques. En effet, l'ARN est un long polyanion. Une molécule portant plusieurs charges positives ou un assemblage de molécules portant une seule charge positive peuvent interagir avec de l'ARN et former une particule. D'autres interactions non covalentes peuvent compléter ces interactions électrostatiques, parmi lesquelles les interactions hydrogène, Van der Walls et hydrophobes. Il est aussi possible de former un vecteur avec un polymère cationique naturel ou synthétique, biodégradable ou non. Le polymère cationique de synthèse, poly-D-lysine, est avantageux. D'autres polymères cationiques que la poly-D-lysine peuvent remplacer les peptides, tels que la polyéthylènimine et la spermine polymérisée. Il est également possible de former un vecteur avec un assemblage de molécules portant une ou plusieurs charges positives. L'exemple classique est le liposome. Ce dernier est constitué d'un grand nombre de molécules lipidiques, formant une membrane, sous la forme d'une bicouche de lipides amphipathiques. Si le lipide porte une ou plusieurs charges positives, le liposome cationique peut établir un grand nombre d'interactions électrostatiques avec l'ARNm, formant ainsi un complexe. Le liposome peut contenir ce seul lipide cationique ou il peut aussi contenir un autre lipide, tel que le cholestérol ou la dioléylphosphatidyléthanolamine. A titre de lipide cationique de synthèse on peut citer le DOTAP (1,2-Dioleoy1-3- trimethylammoniumpropane), le DOTMA (N-[2,3-(dioleyloxy)propyI]-N,N,N-trimethylammonium chloride) et le MVL5 (N142-((15)-1-[(3-aminopropypamino]-4-[di(3-amino-propypamino] butylcarboxamido)ethy1]-3,4-di[oleyloxebenzamide).

La stabilité des nanoparticules peut également être augmentée par multimérisation des composés cationiques entre eux, les liaisons formées étant toutefois réversibles dans le cytoplasme de cellules de mammifères. Ainsi, par exemple, des ponts disulfure sont rompus par des composés réducteurs, tel que le glutathion. Cette multimérisation peut faire suite à une oxydation, par exemple les groupements thiols présents aux extrémités peuvent s'oxyder en présence de l'oxygène dissous dans le milieu pour former des ponts disulfure. Ainsi, avantageusement, le composé cationique de type A, et/ou le cas échéant le composé cationique de type A', comprend des groupements capables de former des liaisons intermoléculaires réversibles dans le cytoplasme de cellules de mammifères. Les liaisons intermoléculaires sont avantageusement des liaisons covalentes réversibles, en particulier des ponts disulfures.

Bien entendu, on préfère utiliser un composé cationique de type A, et le cas échéant un composé cationique de type A', soluble dans l'eau. Le composé cationique de type A ou A' est avantageusement choisi dans le groupe constitué des peptides cationiques, des lipides cationiques sous forme de liposomes, des polymères cationiques, et des tensioactifs cationiques sous forme de micelles.

En particulier, le composé cationique de type A ou A' est un peptide cationique de formule X-(Y),-X' dans laquelle - X et X' sont identiques ou différents et représentent chacun une molécule portant un groupement thiol - Y est un acide aminé ou un dérivé d'acide aminé dont la chaine latérale est chargée positivement, et - n est un nombre entier allant de 4 à 20. Avantageusement, X et X' représentent chacun un acide aminé ou un dérivé d'acide aminé ou homologue d'acide aminé portant un groupement thiol, avantageusement la cystéine ou l'homocystéine.

Y représente avantageusement un acide aminé ou un dérivé d'acide aminé de formule NH2- alk-COOH où - alk représente une chaîne alkyle linéaire, comprenant de 3 à 8 atomes de carbones, un de ces atomes de carbones pouvant être substitué par un atome d'azote - alk est substituée par un radical R, où R représente un radical chargé positivement au pH du milieu, avantageusement un radical NH2 ; - alk peut également être substituée, en particulier par une fonction =Het, où Het représente 0 ou NH. Y est avantageusement choisi parmi l'arginine, la lysine et l'ornithine, de préférence l'arginine, chargés positivement au pH du milieu. En particulier, le peptide cationique est choisi parmi les peptides de séquences suivantes : (SEQ ID N°: 1 à 24) Cys(Arg8)Cys, Cys(Arg8)Cys, Cys(Argio)Cys, Cys(Argii)Cys, Cys(Arg12)Cys, Cys(Arg13)Cys, Cys(Arg14)Cys, Cys(Arg18)Cys; Cys(Lys8)Cys, Cys(Lys8)Cys, Cys(Lysio)Cys, Cys(Lysii)Cys, Cys(Lysi2)Cys, 15 Cys(Lysi3)Cys, Cys(Lysi4)Cys, Cys(Lysi8)Cys; Cys(Orn8)Cys, Cys(Orn8)Cys, Cys(Ornio)Cys, Cys(Ornii)Cys, Cys(0rn12)Cys, Cys(0rn13)Cys, Cys(0rn14)Cys, et Cys(0rn18)Cys. Dans une autre variante, X représente un acide organique portant une fonction thiol, avantageusement l'acide thioglycolique, et X' représente un aminothiol, avantageusement la cystéamine. 20 Lors de l'assemblage des nanoparticules, un processus d'oxydation s'opère entre les groupements thiols créant de nouvelles liaisons covalentes (ponts disulfure). Le plus souvent, l'oxygène dissous présent dans le milieu est suffisant pour que les réactions d'oxydation aient lieu. Cette multimérisation du peptide cationique au contact de l'ARNm, apporte une grande stabilité à l'assemblage d'ARNm et de peptides, ce qui permet d'augmenter la stabilité des 25 nanoparticules qui ne se dissocient pas dans le milieu extracellulaire, après leur injection dans un tissu. Pour augmenter la stabilité des nanoparticules, il est également possible d'utiliser un composé cationique plus grand. Ainsi, dans une autre variante de l'invention, le composé cationique de type A ou A' est un peptide cationique de formule (Y),, dans laquelle Y est un acide 30 aminé ou un dérivé d'acide aminé tel que défini précédemment et m est un nombre entier supérieur à 20. Avantageusement, m varie entre 20 et 100, plus avantageusement entre 20 et 50. En particulier, Y est avantageusement choisi parmi l'arginine, la lysine et l'ornithine, de préférence l'arginine.

E est un espaceur (ou en anglais spacer) non chargé et soluble dans l'eau. Par non chargé, on entend que la molécule ne comprend pas de charges électriques. On préfère utiliser des molécules biodégradables, dont les produits de dégradation sont des métabolites non toxiques pour les cellules de mammifères.

Avantageusement, l'espaceur est un polymère hydrosoluble, linéaire ou réticulé, ayant une taille variant de 0,5 kDa à 50 kDa, avantageusement de 0,5 à 20 kDa, plus avantageusement de 2 kDa à 5 kDa. Pour permettre de dissoudre aisément le composé A'-E-L, sous forme lyophilisée, dans le milieu aqueux, on utilise avantageusement un polymère soluble dans l'eau. On préfère les polymères considérés comme étant non toxiques. Plus particulièrement, l'espaceur est choisi parmi le polyéthylène glycol (PEG), les poly(hydroxyalkyl)-L-glutamine et les poly(hydroxyalkyl)-L- asparagine ; où les groupements alkyles sont avantageusement des alkyles en C1-C4, plus avantageusement le radical éthyle. Les produits de dégradation de ces deux derniers composés sont l'éthanloamine et le glutamate ou l'aspartate. On peut aussi tout particulièrement utiliser le PEG de 2 à 5 kDa, encore plus particulièrement de 3,5 kDa.

Les composés A'-E-L comprennent à leur extrémité un peptide ligand, L. Ce dernier se fixe à des molécules présentes dans la membrane plasmique, ce qui permet à la nanoparticule de s'adsorber sur la surface cellulaire. La nanoparticule d'ARN messager et le choc hypotonique servent à favoriser l'introduction de l'ARNm dans les cellules-cibles. La présence d'un peptide ligand permet à la nanoparticule de se fixer sur la membrane plasmique, afin d'être ultérieurement endocytée. Cela améliore l'efficacité de l'entrée de l'ARNm dans les cellules. Le choix du peptide ligand s'est porté sur un peptide pénétrant les cellules (CPP). La première caractéristique d'un CPP est de se fixer à la membrane plasmique et d'être internalisé par une cellule.

Le peptide ligand est avantageusement choisi parmi les peptides de pénétration cellulaire ou CPP, notamment de cellules de mammifères, les ligands RGD, la transferrine, le folate, les anticorps, les ligands d'un récepteur (par exemple : cytokines, hormones, facteurs de croissance), les petites molécules (par exemple : carbohydrates tels que mannose or galactose ou ligands synthétiques), les agonistes de petites molécules, les inhibiteurs ou antagonistes de récepteurs (par exemple : RGD peptidomimétiques analogues). Avantageusement, le peptide ligand est de formule PQRDTVGGRTTPPSWGPAKA (SEQ ID n°25). Pour ce peptide, il a été démontré qu'il est capable de se fixer à la membrane plasmique et d'être internalisé par une cellule. Cela a été démontré en conjuguant un composé marqueur au CPP, en incubant des cellules en culture avec le CPP marqué et en suivant l'entrée du CPP dans ces cellules (Screening of cell-penetrating peptides using mRNA display, Jae-Hun Lee et al., Biotechnol. J 2012, 7, 387-396). De plus, la démonstration a été faite avec un CPP conjugué à une grande molécule ou une particule, afin de prouver que le CPP possède cette caractéristique de pénétration dans les cellules dans le contexte d'un assemblage macromoléculaire. En effet, il ne faut pas que le CPP soit efficace isolément et inefficace lorsqu'il est présent à la surface d'une nanoparticule d'ARNm. Après son injection dans un tissu, la nanoparticule d'ARNm doit se fixer sur les cellules, non seulement pour y pénétrer, mais aussi pour que la nanoparticule diffuse le moins possible en dehors de ce tissu. Cette rétention de la nanoparticule par le tissu dans lequel il a été injecté, est importante, car l'ARNm ne doit pas être introduit dans les cellules d'autres organes. Il doit y avoir le moins possible d'expression ectopique de la protéine codée par l'ARN messager. Le CPP ne doit pas être notablement chargé positivement ou négativement. En effet, seules les portions cationiques de type A et A' doivent interagir avec les groupements phosphodiester de l'ARNm. La présence d'un nombre important des charges électriques sur le CPP, lui permettrait d'interagir soit avec l'ARN soit avec le composé cationique. Cela altérerait profondément la formation des nanoparticules d'ARNm. Le CPP choisit, PQRDTVGGRTTPPSWGPAKA, possède trois charges positives pour une charge négative dispersées dans l'ensemble de la séquence. Il possède donc toutes les caractéristiques nécessaires. Un CPP cationique interagirait également in vivo avec la matrice extracellulaire présente dans le tissu injecté. Le vecteur d'ARNm serait ainsi retenu sur la matrice extracellulaire au lieu de pénétrer dans les cellules. L'efficacité de l'introduction de l'ARNm dans les cellules-cibles serait donc très faible. Le composé A'-E-L lyophilisé doit facilement se dissoudre dans un tampon aqueux. Cela implique que la portion CPP de ce composé doit avantageusement être soluble dans l'eau, elle aussi. Cela est le cas du CPP choisit. Il faut éviter tout CPP hydrophobe, comportant trop de phénylalanine, leucine, isoleucine, alanine, valine, cystéine et méthionine, et trop peu d'acides aminés hydrophiles, tels que l'arginine, la lysine, l'histidine, l'acide glutamique, l'acide aspartique, la proline, l'asparagine et la glutamine.

Dans une variante préférée de l'invention, le composé cationique de type A est le peptide cationique Cys(Arg8)Cys (SEQ ID n°1). Dans une variante préférée de l'invention, le composé de type A'-E-L est le peptide cationique Cys(Arg8)Cys (SEQ ID n°1) prolongée à son extrémité N-terminale par du polyéthylène glycol conjugué à un peptide ligand. On préfère le PEG de 2 à 5 kDa, plus particulièrement de 3,5 kDa. Le peptide ligand est avantageusement de formule PQRDTVGGRTTPPSWGPAKA (SEQ ID n°25). Le procédé comprend avantageusement les étapes suivantes : a. Préparer un milieu aqueux tamponné comprenant l'ARNm, b. Préparer un milieu aqueux tamponné comprenant le composé cationique de type A, et le cas échéant le composé A'-E-L, tel(s) que défini(s) à l'une quelconque des revendications précédentes, c. Mélanger pendant un court laps de temps le milieu aqueux préparé à l'étape b) et le milieu aqueux de l'étape a). Les deux milieux des étapes a) et b) sont hypotoniques. En particulier, le milieu de l'étape a) a une concentration en cations inférieure à 150 mM, avantageusement inférieure à 50 mM, plus avantageusement inférieure à 20 mM, et le milieu de l'étape b) a une concentration en cations inférieure à 150 mM, avantageusement inférieure à 50 mM, plus avantageusement inférieure à 20 m M. A l'étape a) et à l'étape b), les tampons sont des tampons monovalents, tels que l'Hépès de sodium. Le choix s'est porté sur l'Hépès, car ce dernier peut être utilisé dans les produits de santé administrés aux patients. Cependant, d'autres tampons peuvent être utilisés, à l'exclusion de ceux qui contiennent des ions divalents ou multivalents. Par exemple, le tampon phosphate ne peut pas être utilisé, car le phosphate est présent sous une forme divalente (P042-). Cet anion divalent interagit, en compétition avec l'ARNm, avec les charges positives des composés de type A ou A' (en particulier des arginines des peptides cationiques). Cela aboutit également à la formation de grosses particules ARNm. Tout tampon ajusté à pH 7-7,5, constitué d'ions monovalents, peut remplacer l'Hépès de sodium.

Le ratio volumique milieu de l'étape a) : milieu de l'étape b) varie avantageusement de 1:100 à 100:1, plus avantageusement il est de 1 :1. Les nanoparticules d'ARNm sont assemblées en mélangeant les milieux des étapes a) et b). Avantageusement on introduit le milieu de l'étape b) dans celui de l'étape a). Cependant, l'ordre inverse est possible. Après ajout, on mélange le plus rapidement possible (de 1 à 10 secondes selon l'échelle de production), afin d'obtenir un mélange homogène. Cette homogénéité est importante, car elle permet à chaque molécule d'ARN de se complexer à un nombre similaire d'exemplaires des composés de type A et des composés A'-E-L et de former une population de nanoparticules ayant un diamètre semblable.

Avantageusement, l'assemblage des nanoparticules a lieu à température ambiante (soit 2025°C), pendant un temps suffisant, le plus souvent quelques heures. L'assemblage des nanoparticules a lieu dans une solution à très faible concentration saline, c'est-à-dire hypo-osmotique ou hypotonique. En effet, les cations et les anions dissous dans une solution aqueuse sont en compétition avec les radicaux chargés positivement des composés A et A' (par exemple arginines du peptide cationique) et les groupements phosphodiester de l'ARN. A concentration saline supérieure ou égale à 150 mM (NaCI par exemple), les particules peptides / ARN sont significativement plus grosses qu'à faible osmolarité et ont tendance à s'agréger avec le temps.

La quantité de composé de type A et le cas échéant de composé A'-E-L, mélangé à l'ARNm dépend du ratio de charges positives / négatives que l'on souhaite atteindre. Avantageusement, ce ratio varie de 1 à 3, plus avantageusement de 1,5 à 2,5. Le ratio molaire composé de type AI composé A'-E-L varie avantageusement de 99 % / 1 % à 96 % / 4 %.

Le milieu de l'étape b) peut facilement être préparé par ajout du composé cationique de type A, et le cas échéant le composé A'-E-L, sous forme lyophilisée dans la solution aqueuse tamponnée. L'invention a également pour objet des nanoparticules d'ARNm obtenus par le procédé selon l'invention. La nanoparticule est très stable à l'extérieur des cellules, où l'environnement est oxydant. La nanoparticule ne se dissocie pas et ne s'agrège pas à l'extérieur des cellules. En présence des composés A'-E-L, l'espaceur n'étant pas chargé, au cours de l'assemblage de la nanoparticule, le ligand se retrouve préférentiellement à la surface de la nanoparticule. L ligand peut ainsi être efficacement exposé, afin d'interagir avec la membrane plasmique des cellules-cibles. Ainsi, les groupements L sont majoritairement en surface externe. Les nanoparticules sont telles que décrites précédemment. En particulier, elles ont une taille inférieure à 200 nm, plus avantageusement inférieure à 100 nm. Comme exposé ci-avant, les nanoparticules sont obtenues par condensation et éventuellement multimérisation. Les multimères de peptides comportent des dizaines, voire des centaines de radical Y (avantageusement des arginines).

L'invention a pour autre objet une composition aqueuse hypotonique comprenant les nanoparticules d'ARNm selon l'invention. Les nanoparticules sont en suspension de le milieu aqueux, avantageusement sans qu'elles ne précipitent. Cette composition est elle aussi hypotonique. En particulier, sa concentration en cations est inférieure à 150 mM, avantageusement inférieure à 50 mM, plus avantageusement inférieure à 20 mM. La composition peut être identique ou différente de celle utilisée pour la préparation des nanoparticules. La composition aqueuse hypotonique a avantageusement une osmolarité inférieure à 300 mosM, avantageusement comprise entre 0 et 100 mosM, plus avantageusement comprise entre 0 et 50 mosM. L'efficacité de l'introduction de l'ARNm dans les cellules dépend du degré d'hypotonicité de la solution de nanoparticules. Une solution légèrement hypotonique apporte un bénéfice modéré, tandis qu'une solution à très faible osmolarité améliore grandement l'entrée de la nanoparticule dans les cellules, in vivo.

Lorsqu'une cellule de mammifère est incubée dans un milieu hypo-osmotique, elle subit un choc hypotonique. En effet, l'eau rentre dans la cellule, ce qui étire sa membrane plasmique. Cette traction ouvre des canaux calciques, qui permettent la fusion de vésicules intracellulaires avec la membrane plasmique, par exocytose. Cela augmente la superficie de la membrane plasmique et prévient l'éclatement de la cellule.

Par la suite, de l'ATP est libéré dans le milieu extracellulaire. L'ATP se fixe et active des récepteurs purinergiques P2Y. Une voie de transduction du signal entraîne l'ouverture de canaux potassique et chlorure. La baisse de l'osmolarité intracellulaire et l'augmentation de l'osmolarité extracellulaire draine l'eau à l'extérieur de la cellule. Le volume de cette dernière diminue, ce qui autorise l'internalisation de l'excès de membrane plasmique issu de la fusion de vésicules intracellulaires. Cette endocytose massive peut être exploitée par le vecteur d'ARNm pour pénétrer dans la cellule. A l'intérieur de la cellule, le vecteur atteint des compartiments intracellulaires, tels que des endosomes. Il semble que le choc hypotonique perméabilise transitoirement les membranes de ces compartiments intracellulaires, ce qui permet au vecteur de s'en échapper et d'atteindre le cytosol. Dans le cytosol, le vecteur libère progressivement l'ARN messager grâce à des agents réducteurs, tel que le glutathion. A la force ionique prévalent dans le cytosol, les charges positives des composés A et A' ne suffisent pas pour maintenir l'intégrité de la nanoparticule. L'ARNm est ainsi progressivement dénudé. Il devient alors accessible aux facteurs de traduction et aux ribosomes. La protéine d'intérêt est alors produite par la cellule transfectée.

L'invention repose sur deux éléments complémentaires, qui agissent de manière synergique : la nanoparticule d'ARNm et le tampon hypotonique dans lequel elle est en suspension. Lorsque la nanoparticule est constituée de peptides, ces molécules sont dégradées par les cellules en acides aminés, qui peuvent ensuite être recyclés par celles-ci pour la synthèse de protéines cellulaires. Cette composition peut également comprendre une ou plusieurs molécule(s) non chargée(s), telle(s) que le glucose, le mannitol, le saccharose. Ces molécules peuvent être présentes dès l'assemblage des nanoparticules.

L'invention a enfin pour objet une composition selon l'invention pour son utilisation en tant que médicament. L'indication thérapeutique va bien entendu dépendre de la protéine qui va pouvoir être codée par l'ARNm. L'invention présente le grand avantage que, contrairement à la thérapie génique, le transfert d'ARNm oblige un tissu à ne produire une protéine thérapeutique que pendant quelques jours. En particulier, la composition peut être utilisée pour traiter ou prévenir des maladies, des troubles ou des états pathologiques, choisis parmi les pathologies cardiaques telles que l'infarctus du myocarde, l'angine de poitrine, les pathologies respiratoires telles que l'asthme, les troubles dues à une infection virale (notamment par voie respiratoire ou par nébulisation), les troubles dues à une réaction inflammatoire (injection locale au lieu de l'inflammation), les troubles dues à une infection bactérienne, pour la cicatrisation des plaies diabétiques, des escarres. La composition selon l'invention peut tout particulièrement être utilisée pour le traitement de l'infarctus du myocarde. L'infarctus du myocarde (IDM) est une destruction du muscle cardiaque due à une thrombose occlusive d'une artère coronaire. Cette pathologie coronaire aiguë survient le plus souvent sur une plaque d'athérome devenue instable à la suite d'une érosion ou d'une fissuration. La rupture d'une plaque d'athérome ou l'érosion de l'endothélium vasculaire entraîne l'adhésion de plaquettes et l'initiation de la cascade de coagulation, aboutissant à la formation d'agrégats de plaquettes et de fibrine, capables de réduire la lumière du vaisseau sanguin ou de l'obstruer complètement. Cette embolie provoque une forte baisse de l'approvisionnement en oxygène et en nutriments des cellules du myocarde, principalement les cardiomyocytes et les cellules endothéliales. La partie du myocarde atteinte par cet épisode ischémique est appelée la zone infarcie. La destruction du caillot sanguin par thrombolyse ou son écrasement par angioplastie primaire provoque la reperfusion de la zone infarcie du myocarde. Les cardiomyocytes peuvent ainsi retrouver un métabolisme et une fonction normaux, après une période de sidération au cours de laquelle ils n'ont qu'une activité mécanique restreinte. La prise en charge de l'IDM commence par l'hospitalisation en urgence des patients présentant les symptômes de la maladie dans une unité de soins intensifs cardiologiques. La reperfusion de la coronaire obstruée est la priorité. En effet, il s'agit de rétablir le plus tôt possible la circulation sanguine dans l'artère responsable de l'IDM. Pour cela, la technique privilégiée est l'angioplastie coronaire primaire. La limitation de la taille de la zone infarcie peut être obtenue par l'inhibition de la mort cellulaire par apoptose et par la stimulation de la formation de nouveaux vaisseaux sanguins, la néoangiogenèse. En effet, l'augmentation de la vascularisation entraîne une amélioration des apports en oxygène et en nutriments. La viabilité des cellules, ayant survécu à l'ischémie et à la reperfusion, est ainsi maintenue. A l'heure actuelle, aucun traitement anti-apoptotique et angiogénique n'est utilisé en routine clinique. La biotechnologie de transfert d'ARNm dans le myocarde est particulièrement bien adaptée. L'inhibition de l'apoptose et la formation de nouveaux vaisseaux sanguins peuvent être obtenues par l'expression transitoire d'une protéine de la famille des facteurs de croissance. Contrairement à la thérapie génique, la technologie de transfert d'ARNm oblige en effet un tissu à ne produire une protéine thérapeutique que pendant quelques jours. La composition selon l'invention peut également être utilisée pour améliorer le bien-être d'un patient, et notamment pour lutter contre la douleur (notamment postopératoire), pour la cicatrisation de la peau. L'invention a donc également pour objet l'utilisation de la composition selon l'invention pour lutter contre la douleur ou pour favoriser la cicatrisation cutanée, notamment dans des conditions non pathologiques. L'invention porte également sur une méthode de traitement thérapeutique d'une de ces maladies ou conditions comprenant l'administration d'une quantité efficace de la composition à un patient en ayant besoin. L'invention a enfin pour objet l'utilisation d'une composition hypotonique comprenant des nanoparticules d'ARNm telles que définies précédemment pour améliorer l'efficacité de transfert dudit ARNm dans des cellules de mammifères.

L'invention va maintenant être illustrée par les exemples ci-dessous, non limitatifs. Description des figures : Figure 1 : Transfection de cellules H9c2 avec les nanoparticules d'ARNm en présence ou en l'absence d'un choc hypotonique. Mesure de l'activité luciférase (RLU/mg protéine) De gauche à droite : ARNm/pepM B1, isotonicité ARNm/pepMB1/pepMB2, isotonicité ARNm nu, choc hypotonique ARNm/pepMB1, choc hypotonique ARNm/pepMB1/pepMB2, choc hypotonique Figure 2 : Transfection de cellules H9c2 avec de l'ARNm nu ou des nanoparticules d'ARNm grâce à un choc hypotonique. Mesure de l'activité luciférase (RLU/mg protéine) A gauche : ARNm nu Puis, nanoparticules ARNm/pepMB1/pepM B2 avec un pourcentage molaire de pepMB2 de 0 ou 1,25 ou 2,5 ou 3,75 Figure 3 : Transfection du myocarde sain de rat avec les nanoparticules d'ARNm luciférase dissoutes dans des solutions de tonicité variable. Mesure de l'activité luciférase (RLU/mg protéine). Le dernier histogramme à droite correspond à une solution isotonique. Les autres correspondent à des solutions hypotoniques.

Figure 4: Modèle de rat d'infarctus du myocarde. En A, coupe représentative d'un coeur de rat ayant subi un infarctus et reçu le placebo. En B, coupe représentative d'un coeur de rat ayant subi un infarctus et reçu le vecteur d'ARNm codant pour un facteur de croissance. L'astérisque indique la position de l'infarctus. Efficacité du transfert d'ARN messager : La quantité d'ARNm, introduit dans des cellules en culture ou les cellules d'un tissu, peut être précisément estimée en utilisant l'ARNm codant pour une protéine-marqueur. La luciférase est la protéine-marqueur la plus utilisée. Elle est détectée par un spectrophotomètre spécialisé, le luminomètre. Il y a une relation directe entre la quantité d'ARNm luciférase transféré dans une cellule et la quantité de protéine luciférase produite par cette cellule. Les peptides cationiques A et A'-E-L, où A et A' représentent chacun le peptide de SEQ ID n°1, E est les PEG de 3,5 kDa et L est le peptide de SEQ ID n°25, ont été mélangées à l'ARNm luciférase, afin de former des nanoparticules. Ces dernières se sont avérées très efficaces pour transférer l'ARNm dans les cellules de la lignée H9c2 in vitro.

Le transfert de l'ARNm luciférase dans le myocarde sain de rats Sprague-Dawley a nécessité de mettre au point les différents paramètres de l'administration du vecteur. En effet, ce dernier est injecté dans la paroi du ventricule gauche grâce à une thoracotomie. Le volume d'injection, la dose d'ARN, la concentration saline et la vitesse d'injection ont été optimisés, ce qui a permis d'introduire une grande quantité d'ARNm luciférase dans les cellules du myocarde. Exemple 1 : PREPARATION DU VECTEUR D'ARN MESSAGER a) Linéarisation du plasmide Cinquante microgrammes d'un plasmide, comportant le gène de la luciférase (Firefly) sous le contrôle du promoteur du phage T7, ont été digérés par cent unités de l'enzyme de restriction Sspl-HF (New England Biolabs) dans le tampon NEBuffer 4 (50 mM acétate de potassium, 20 mM Tris acétate, 10 mM acétate de magnésium, 1 mM DTT, pH 7,9 à 25 °C), pendant quatre heures, à 37°C. Un site de restriction Sspl se situe en aval du gène luciférase. L'ADN linéarisé a ensuite été précipité avec 5 ul d'EDTA 0,5 M, 10 ul d'acétate de sodium 3 M et 235 ul d'éthanol 100%. Le mélange a été refroidi à -20°C pendant une heure, avant d'être centrifugé à vitesse maximale, pendant trente minutes. Le culot d'ADN a ensuite été resuspendu dans 50 ul de TE pH 8,0. La concentration de la solution d'ADN a été déterminée par la mesure de l'absorbance à 260 nm, à l'aide d'un spectrophotomètre. b) Transcription in vitro La transcription in vitro du plasmide linéarisé a été réalisée à l'aide du kit mMessage m Machine (Ambion). 4,65 ul d'eau pure ont été mélangés à 10 ul de NTP/CAP 2X, 2 ul de tampon de réaction 10X, 1,35 ul de plasmide linéarisé (1 lig d'ADN) et 2 ul d'enzyme mix. La synthèse d'ARN s'est effectuée à 37°C, pendant deux heures, dans un bain à sec. L'ARN polymérase T7 a transcrit le gène luciférase grâce au promoteur T7 situé en amont du gène. Après la transcription du gène luciférase, un ul de TURBO DNase a été ajouté, afin de dégrader le plasmide et ainsi faciliter la purification ultérieure de l'ARN. c) Purification de l'ARN messager La purification de l'ARN messager luciférase a été réalisée à l'aide du kit MegaClear (Ambion). Soixante dix neuf ul d'Elution Solution, 350 ul de Binding Solution Concentrate et 250 ul d'éthanol 100% ont été ajoutés aux 21 ul du mélange précédent. Ces 700 ul ont été déposés sur un Filter Cartridge et centrifugés à 10000 g, pendant une minute. Le filtre a retenu l'ARN messager. Deux lavages ont été effectués avec 500 ul de Wash Solution, en centrifugeant à 10000 g, pendant une minute. L'ARN a ensuite été élue du filtre en ajoutant, à deux reprises, 50 ul d'Elution Solution et en chauffant à 70°C, pendant dix minutes, dans un bain à sec. L'élution a été obtenue par centrifugation à 10000 g, pendant une minute. Une seconde étape de purification a été effectuée par précipitation au chlorure de lithium.

Soixante ul de LiCI Precipitation Solution ont été ajoutés aux 100 ul de l'éluât. Le mélange a été refroidi à -20°C pendant 45 minutes, avant d'être centrifugé à vitesse maximale à quatre degrés, pendant 15 minutes. Le culot a été lavé avec 500 ul d'éthanol 70% et une dernière centrifugation a été effectuée à vitesse maximale à quatre degrés, pendant 5 minutes. Le culot d'ARN messager, séché pendant quelques minutes à l'air, a été resuspendu dans de l'Hepes 20 mM pH 7,5. La concentration de la solution d'ARNm a été déterminée par la mesure de l'absorbance à 260 nm, à l'aide d'un spectrophotomètre. d) Peptides A et A'-E-L : pepMB1 et pepMB2 Les deux peptides capables d'interagir avec l'ARN ont été synthétisés par Proteogenix. La séquence en acides aminés de A est la suivante : CRRRRRRRRC (pepMB1). Le lyophilisat a été resuspendu dans de l'Hepes 20 mM pH 7,5 à 1 mg/ml. La séquence de L-E-A' est la suivante : PQRDTVGGRTTPPSWGPAKA-PEG(3,5 kDa)- CRRRRRRRRC (pepMB2). PEG(3,5 kDa) est du polyéthylène glycol de 3,5 kilodaltons. Le lyophilisat de L-E-A' a été resuspendu dans de l'Hepes 20 mM pH 7,5 à 100 ug/ml. e) Assemblage des nanoparticules d'ARN messager La solution concentrée d'ARN messager luciférase a été diluée dans de l'Hepes 20 mM pH 7,5 pour atteindre 100 ug/ml. Les solutions de pepMB1 et pepMB2 ont été successivement mélangées à de l'Hepes 20 mM pH 7,5, afin d'atteindre la quantité nécessaire de peptides pour condenser l'ARN messager luciférase. Un volume de la solution de peptides a ensuite été rapidement mélangé par pipetage à un volume de la solution diluée d'ARN. L'assemblage des nanoparticules a eu lieu à température ambiante, pendant quatre heures. La fixation des peptides à l'ARN est très rapide, tandis que l'oxydation des cystéines aux extrémités des peptides, par le dioxygène dissout dans le tampon, est beaucoup plus lente. Cette oxydation entraîne la formation de ponts disulfure entre les peptides, ce qui aboutit à leur multimérisation au contact de l'ARN. La nanoparticule constituée d'ARNm, piégé dans une gangue de peptides multimérisés, est très stable dans le milieu extracellulaire. La quantité de peptides mélangée à l'ARN messager luciférase dépend du ratio de charge +/- que l'on souhaite atteindre. A un ratio de charge + /- de 2, il faut ajouter suffisamment de peptides pour qu'il y ait deux arginines sur les peptides, pour une liaison phosphodiester au niveau de l'ARN. Exemple 2 : TRANSFECTION IN VITRO a) Culture et plating de la lignée H9c2 Toutes les manipulations de cellules ont été réalisées sous une hotte à flux laminaire. La lignée cellulaire H9c2 issue de cardiomyoblastes de rat (ECACC) a été cultivée dans du DMEM Glutamax (Gibco) additionné d'un mélange de pénicilline et de streptomycine et de sérum de veau foetal (10% final). La culture a été effectuée à 37°C dans des flasques de 75 cm2 (Corning).

Lorsque le nombre de cellules nécessaire à l'ensemencement d'une plaque de 48 puits (Corning) a été atteint, les cellules ont été détachées du fond de la flasque à l'aide de 2,5 ml de TryPLE Select (Gibco) à 37°C, pendant 5 à 10 minutes. 7,5 ml de DMEM ont été ajoutés, afin de neutraliser le TryPLE Select. Les cellules ont été centrifugées à 100 g, pendant 10 minutes, à température ambiante. Le culot cellulaire a ensuite été resuspendu dans du DMEM. 250 ul de cette suspension cellulaire ont été introduits dans chaque puits d'une plaque de 48 puits et cette dernière a été placée dans un incubateur à 37°C, contenant 5% de CO2. Environ 16 heures plus tard, le milieu de culture a été remplacé par 250 ul de DMEM, préchauffé à 37°C. b) Transfection des cellules H9c2 Chaque transfection a été réalisée dans trois puits différents. 160 ul d'ARNm luciférase (16 lig) ont été mélangés à 160 ul de pepMB1 seul ou à 160 ul d'un mélange pepMB1/pepMB2 (pepMB1 et pepMB2 sont tels que définis à l'exemple 1). L'assemblage des complexes a eu lieu à température ambiante, pendant quatre heures. Alternativement, la solution d'ARNm a été diluée avec 160 ul d'Hepes 20 mM pH7,5, afin de comparer l'ARN nu aux nanoparticules. 160 ul de DMEM 1X ne contenant ni sérum ni antibiotiques ont été ajoutés aux solutions d'ARN nu ou de nanoparticules, afin de constituer les solutions hypotoniques d'ARNm. Les solutions isotoniques ont été obtenues en mélangeant 320 ul de nanoparticules dans de l'Hepes 20 mM pH 7,5 à 160 ul de DMEM 3X. Les puits ont été vidés du milieu de culture qu'ils contenaient, afin d'introduire 150 ul de solution hypotonique ou isotonique de nanoparticules ou d'ARN nu (5 lig d'ARNm par puits). Les cellules ont été incubées pendant une heure, à 37°C, dans un incubateur. La solution de nanoparticules ou d'ARNm nu a ensuite été aspirée et remplacée par 250 ul de DMEM. Les cellules ont alors été incubées, pendant 16 heures, à 37°C, dans un incubateur. c) Lyse des cellules H9c2 et mesure de l'activité luciférase Le milieu de culture a été aspiré et remplacé par 500 ul de Dulbecco's PBS 1X. Les cellules H9c2 ont ensuite été lysées par l'ajout de 250 ul de tampon de lyse (Luciferase Assay System, Promega). Le lysat de chaque puits a été centrifugé à vitesse maximale, à 20°C, pendant cinq minutes, afin de le clarifier. 20 ul de chaque lysat cellulaire ont été introduits dans un tube adapté au luminomètre (Berthold Technologies). 100 ul de substrat de la luciférase (Promega) ont été ajoutés au lysat cellulaire par le luminomètre. Ce dernier a ensuite mesuré la quantité de lumière émise par la réaction enzymatique catalysée par la luciférase. Les résultats s'expriment en unités relatives de lumière (RLU). La quantité de protéine luciférase, produite par les cellules H9c2, grâce à l'ARNm luciférase, a été normalisée en dosant les protéines cellulaires totales avec le kit 660 nm Protein Assay (Pierce). Pour cela, 100 ul de lysat cellulaire ont été mélangés à 1,5 ml de réactif et l'absorbance a été mesurée à 660 nm. Une gamme d'étalonnage a été réalisée à l'aide de solutions de sérum albumine bovine. L'activité luciférase s'exprime donc en RLU par milligramme de protéines. Chaque expérience a été effectuée en triplicata d) Résultats Dans une solution isotonique, le vecteur d'ARNm constitué avec le seul peptide pepMB1 a transféré une quantité extrêmement faible d'ARN dans les cellules H9c2 (Fig.1). L'ajout du peptide pepMB2 au vecteur a significativement amélioré le transfert d'ARNm luciférase. Cependant, l'efficacité de la transfection est restée très faible (< 1e RLU/mg protéine). Le même vecteur constitué de pepMB1 et pepMB2 a très efficacement transfecté les cellules H9c2 (> le RLU/mg protéine), lorsque la solution de vecteur était hypotonique (Fig.1). Dans une solution hypotonique, l'ARNm nu a transfecté les cellules H9c2 plus de 100 fois moins efficacement que le même ARNm luciférase complexé au peptide pepMB1 (Fig.2). L'ajout de peptide pepMB2 au vecteur a amélioré l'efficacité de la transfection. L'augmentation la plus forte de l'activité luciférase a été obtenue avec 2,5 mol% de pepMB2 (Fig.2). D'après ces résultats, la formation d'un vecteur d'ARNm, constitué des peptides pepMB1 et pepMB2, et l'utilisation d'une solution hypotonique ont eu un effet synergique sur l'efficacité de la transfection des cellules H9c2 par l'ARNm luciférase.

Exemple 3 : TRANSFECTION IN VIVO a) Préparation des nanoparticules d'ARNm luciférase Des solutions d'ARNm, de pepMB1 et de pepMB2, dissoutes dans de l'Hepes 20 mM, ont été diluées avec de l'eau pure, avant d'être mélangées, afin d'assembler les nanoparticules (pepMB1 et pepMB2 sont tels que définis à l'exemple 1). La solution résultante contenait 8 mM de sodium. Le ratio de charge +/- était de 1,75 et le ratio molaire pepMB1 / pepMB2 était de 39. Des solutions d'ARNm, de pepMB1 et de pepMB2 ont alternativement été diluées dans des solutions aqueuses contenant du chlorure de sodium, afin d'obtenir des solutions de nanoparticules d'ARNm à 24 mM, 68 mM, 112 mM et 160 mM de sodium. Chaque expérience a été réalisée sur trois rats différents. b) Anesthésie, thoracotomie, injection transépicardique et réveil Des rats de la souche Sprague-Dawley ont été anesthésiés par injection intrapéritonéale de kétamine (100 mg/kg de poids corporel) et de xylazine (10 mg/kg de poids corporel). Les animaux ont alors subi une intubation intratrachéale. Le tube a ensuite été connecté à un respirateur artificiel. Une incision de la peau et des muscles intercostaux a été pratiquée sur le côté gauche du thorax, afin d'accéder au coeur. Des écarteurs ont été utilisés pour élargir la thoracotomie. Le péricarde a été disséqué, afin de pouvoir pratiquer l'injection transépicardique. Une seringue à insuline a été remplie avec 60 ul de solution hypotonique de nanoparticules d'ARNm luciférase, correspondant à 3 lig d'ARN par rat. La solution a été injectée à un débit de 20 ul par seconde, dans la paroi du ventricule gauche. La thoracotomie a été refermée à l'aide d'agrafes. Les rats ont été placés dans une cage remplie d'oxygène pur et surveillés jusqu'à leur réveil. c) Stabulation, euthanasie, biopsie du myocarde et mesure de l'activité luciférase Après leur réveil, les rats ont été replacés dans leur cage. La stabulation a duré environ 17 heures.

Les animaux ont ensuite reçu une dose massive de kétamine (500 mg/kg de poids corporel) par voie intrapéritonéale. Leur coeur a été expiante et un fragment de la paroi du ventricule gauche, correspondant à la région injectée la veille, a été prélevé et débarrassé du sang de l'animal, à l'aide de sérum physiologique. Cette biopsie a été découpée en petits morceaux, à l'aide d'une paire de ciseaux.

Ces morceaux de biopsie ont été introduits dans un tube contenant 250 ul de tampon de lyse 1X (Luciferase Assay System, Promega). Ce tube a été immédiatement plongé dans de l'azote liquide, afin de conserver la biopsie. Les différentes biopsies de myocarde tranfecté ont été décongelées à température ambiante et recongelées à -80°C, pendant 10 minutes. Trois cycles de congélation / décongélation ont été accomplis, afin de lyser les cellules du myocarde et de libérer la protéine luciférase, codée par l'ARNm. Les lysats tissulaires ont été centrifugés à 13000 g, à 20°C, pendant cinq minutes. La luciférase étant présente dans le surnageant, 20 ul de ce dernier ont été introduits dans un tube pour la détermination de l'activité luciférase, à l'aide d'un luminomètre. 10 ul du surnageant ont été dilués dans 90 ul d'eau pour le dosage des protéines totales, à l'aide du kit 660 nm Protein Assay (Pierce). d) Résultats Le vecteur d'ARNm luciférase dissout dans une solution isotonique, contenant 160 mM de sodium, a donné lieu à une très faible efficacité de transfert d'ARN, dans les cellules du myocarde de rats Sprague-Dawley (Fig.3). Plus la concentration en sodium a été diminuée, plus la solution de vecteur d'ARNm a été hypotonique, plus l'efficacité de la transfection a été augmentée (Fig.3). Les résultats obtenus in vivo confirment ainsi les résultats obtenus sur la lignée H9c2, selon lesquels une solution hypo-osmotique induit un choc hypotonique, qui agit de concert avec la vectorisation de l'ARNm, par les peptides pepMB1 et pepMB2, pour transférer une grande quantité d'ARN dans les cellules de mammifère. Exemple 4 : Thérapie par ARN messager de l'infarctus du myocarde chez l'animal Un infarctus a été provoqué sur la face ventrale du ventricule gauche de rats Sprague- Dawley par la ligature permanente de l'artère coronaire descendante antérieure gauche, via une thoracotomie. 60 pl d'une solution placebo (tampon hypotonique) ou 60u.L d'une solution hypotonique de nanoparticules d'ARNm, telle que décrite à l'exemple 3, codant pour un facteur de croissance a ensuite été injectée dans la face latérale du ventricule gauche. La thoracotomie a été refermée et les animaux ont été sacrifiés une semaine après l'opération. Les coeurs ont été expiantes et des coupes histologiques ont été réalisées dans la zone à risque d'infarctus. Six rats ont été inclus dans chaque groupe. Les animaux témoins ayant reçus le placebo ont effectivement subi une destruction notable du myocarde de leur ventricule gauche. Cela est mis en évidence par l'amincissement de la paroi du ventricule, au niveau de la zone infarcie, ainsi que la fibrose caractérisée par un dépôt de collagène (Fig.4A). Par contre, la zone à risque d'infarctus des rats ayant bénéficiés du vecteur d'ARNm a été préservée de la destruction. En effet, la paroi du ventricule au niveau de cette région n'est pas amincie et aucun signe de fibrose n'est visible (Fig.4B).

Le traitement par ARN messager codant pour un facteur de croissance a ainsi protégé la zone du myocarde à risque d'infarctus, dans ce modèle animal.

Claims (17)

1. REVENDICATIONS1. Procédé de préparation de nanoparticules d'ARN messager (ARNm) codant une protéine thérapeutique, comprenant la condensation d'ARNm avec des composés cationiques de type A en milieu aqueux dans des conditions hypotoniques, conduisant à la formation de liaisons non covalentes avec l'ARNm, réversibles dans le cytoplasme de cellules de mammifères.
2. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le pH du milieu est compris entre 6,5 et 8,5 inclus, avantageusement entre 7 et 7,5 inclus, et la concentration en cations du milieu est inférieure à 150 mM.
3. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le milieu comprend un tampon hypotonique, qui est préférentiellement constitué d'un ou de cation(s) monovalent(s), avantageusement le tampon est l'Hépès de sodium
4. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le milieu comprend également des composés de type A'-E-L, où A' est un composé cationique, permettant lui aussi la condensation de l'ARNm, par liaisons non covalentes avec l'ARNm, réversibles dans le cytoplasme de cellules de mammifères. E est un espaceur non chargé et soluble dans l'eau L est un peptide ligand neutre ou quasi-neutre
5. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le composé cationique de type A, et/ou le cas échéant le composé cationique de type A', comprend des groupements capables de former des liaisons intermoléculaires réversibles, dans le cytoplasme de cellules de mammifères.
6. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le composé cationique de type A ou A' est un peptide cationique de formule X-(Y),-X' dans laquelle - X et X' sont identiques ou différents et représentent chacun une molécule portant un groupement thiol- Y est un acide aminé ou un dérivé d'acide aminé dont la chaine latérale R est chargée positivement, et - n est un nombre entier allant de 4 à 20.
7. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que X et X' représentent chacun un acide aminé ou un dérivé d'acide aminé ou homologue d'acide aminé portant un groupement thiol, avantageusement la cystéine ou l'homocystéine ou X représente un acide organique portant une fonction thiol, avantageusement l'acide thioglycolique, et X' représente un aminothiol, avantageusement la cystéamine.
8. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le composé cationique de type A ou A' est un peptide cationique de formule (Y),,' dans laquelle Y est un acide aminé ou un dérivé d'acide aminé dont la chaine latérale R est chargée positivement et m est un nombre entier supérieur à 20, avantageusement compris entre 20 et 100.
9. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, caractérisé en ce que Y est choisi parmi l'arginine, la lysine et l'ornithine, de préférence l'arginine.
10. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 9, caractérisé en ce que l'espaceur est un polymère hydrosoluble, linéaire ou réticulé, ayant une taille variant de 0,5 kDa à 50 kDa, avantageusement de 0,5 à 20 kDa, plus avantageusement de 2 kDa à 5 kDa ; en particulier l'espaceur est choisi parmi le polyéthylène glycol (PEG), les poly(hydroxyalkyl)-L-glutamine et les poly(hydroxyalkyl)-L-asparagine.
11. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 10, caractérisé en ce que le peptide ligand est de formule PQRDTVGGRTTPPSWGPAKA (SEQ ID n°25).
12. 12. Nanoparticules d'ARNm obtenus par le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, avantageusement ayant une taille inférieure ou égale à 200 nm, plus avantageusement inférieure ou égale à 100 nm.
13. 13. Composition aqueuse hypotonique comprenant les nanoparticules d'ARNm selon la revendication 12.
14. 14. Composition aqueuse hypotonique selon la revendication 13, caractérisée en ce que sa concentration en cations est inférieure à 150 mM., avantageusement inférieure à 50 mM, plus avantageusement inférieure à 20 mM ; et/ou en ce que la composition a une osmolarité inférieure à 300 mosM, avantageusement comprise entre 0 et 100 mosM, plus avantageusement comprise entre 0 et 50 mosM.
15. 15. Composition selon l'une quelconque des revendications 13 à 14, pour son utilisation en tant que médicament. 10
16. 16. Composition selon l'une quelconque des revendications 13 à 15 pour son utilisation pour traiter ou prévenir des maladies, des troubles ou des états pathologiques, choisis parmi les pathologies cardiaques telles que l'infarctus du myocarde, l'angine de poitrine, les pathologies respiratoires telles que l'asthme, les troubles dues à une 15 infection virale, respiratoire ou autre, les troubles dus à une réaction inflammatoire, les troubles dus à une infection bactérienne, pour la cicatrisation des plaies diabétiques, des escarres.
17. 17. Composition hypotonique comprenant des nanoparticules d'ARNm telles que 20 définies à l'une quelconque des revendications précédentes pour son utilisation pour améliorer l'efficacité de transfert dudit ARNm dans des cellules de mammifères.