CA2184409A1 - Adenovirus recombinants codant pour le facteur de croissance des fibroblastes acides (afgf) - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne des adénovirus recombinants comportant une séquence d ADN hétérologue codant pour le facteur de croissance des fibroblastes acides (aFGF), leur préparation, et leur utilisation pour le traitement et/ou la prévention des maladies neurodégénératives.

Description

21 ~4409 wo ss/2sso3 Adenov~rus recomb1nants codant pour le facteur de cro~ssance des f~broblastes ac~des (afGF) La présente invention c-~ncerne des vecteurs recomhin~nt.c d'origine virale et leur utilisation pour le tr~itement et/ou la pr~vw~lion des maladies neurodegenératives.
5 Plus particulièrement, elle concerne des adénovirus reccmhin~nt.c comportant une séquence d'ADN codant pour le facteur de croi~s~n~e des fibroblastes acide (aFGF, "acidic fib,.)bla~l grow~ factor"). L'invention concerne eg~lPmPnt la ~.~p~dlion de ces vecteurs, les compositions pharm~cel~tiques les contenant et leur utilisation thérapeutique, notamment en thérapie génique.
0 Les m~ iPs neurodégénératives représentent une large part des dépenses de santé dans les pays occident~tlx, part qui ne cesse de s'accroitre suite au vieillissement de la population. Au titre de ces affections, on peut citer notamment la maladied'~ P;-..e~, le maladie de Parkinson, la chorée de Huntington, la sclérose latérale allJyul~ophique~ etc. Les signes pathologiques et l'étiologie de ces m~l~clies sont fort variés, mais toutes ces maladies résultent d'une perte progressive de cellules neuronales dans le système nerveux central, parfois au sein de structure très loc~li.
comme la subst~nce noire dans la maladie de Parkinson. Bien que certains traitements pha.lnacologiques p~ tif.s soient déjà disponibles, leurs effets sont relativement limités. La présente invention décrit une approche thérapeutique nouvelle, particulièrement avantageuse pour le traitement de ces maladies. Plus particulièrement, la présente invention décrit des vecteurs permettant de promouvoir directement la survie des cellules neuronales impliquées dans ces pathologies, par expression efficace et localisée de certains facteurs trophiques.
Les facteurs trophiques sont une classe de molécules ayant des propriétés de 2s stimulation de la croi~s~n-~e neuritique ou de la survie des cellules nerveuses. Le lier facteur po.~éd~nt des propriétés nellrotl~,phiques, le NGF ("Nerve Growth Factor"), a été caractérisé il y a une quaralllaine d'années (pour revue, voir Levi-Mont~l~ini et Angelleti, Physiol. Rev. 48 (1968) 534). Ce n'est que récemment que d'autres facteurs neurotrophiques ont été identifiés, et notamment le facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF) (Thoenen, Trends in NeuroSci. 14 (1991) 165), le CNTF, etc. La demanderesse s'est .nlé-es~ee plus particulièrement au facteur de croi~s~nce des fibroblastes acide (aFGF). Le aFGF est une protéine de 134 à 155 acides aminés environ et de poids moléculaire compris entre 15 et 17 kD selon les Woss/2s803 2 1 8 4 4 0 9 PCT/~h9s,~249 formes. Le aFGF a été décrit initi~l~ment pour ses propriétés de c--~iss~lce desfibroblastes, qui lui confé,aient un intérêt dans le traitement de certaines pathologies telles que not~mment la Gic~tri.~sion. Récemm~nt, il a été montré que le aFGF
sub,ssait un transport rétrograde dans pll~ciel-rs populations neuronales, dont le système nigro-strié (Fer~us~oll et Johnson, J. Comp. Neurol. 313 (1991) 693), et qu'il pouvait permettre, in vitro, la survie de neurones dop~minergiques du m~nf~é~h~le (Knusel et al., J. Neurosci. 10 (1990) 558). Toutefois, bien que ses propriétés soient i"~ére~ les, l'application thérapeutique du aFGF se heurte à différents ob.staGles. En particulier, l'absence de biodisponibilité du aFGF limite toute utilisation thé,~peu~ique.
0 Par ailleurs, il n'existe pas de moyens efficaces permettant de délivrer le aFGF de manière durable et localisée à certaines régions désirées de l'org~ni.cm~ Enfin, il est ~entiel que le aFGF délivré soit actif et puisse exercer une activité thérapeutique in vivo.

La présente invention apporte une solution particulièrement avantageuse à ces problèmes. La présente invention réside en effet dans la mise au point de vecteurs particulièrement efficaces pour délivrer in vivo et de manière localisée, des quantités thérapeutiquement actives de aFGF. Dans la demande cop~nd~nte n PCT/EP93/02519, il a été montré que les adénovirus pouvaient être utilisés pour le transfert de gènes in vivo dans le système nerveux. La présente invention con- ~rne des constructions nouvelles, particulièrement adaptées et efficac~-c pour le transfert d'un gène spécifique dans le système nerveux. Plus particulièrement, la présente invention concerne un adénovirus recombin~nt comprenant une séquence d'ADN codant pour le facteur de croissance des fibroblastes acide (aFGF), sa préparation, et son utili.c~tion pour le traitement et/ou la pl~venlion des maladies neurodégénératives.
La clem~n~leresse a m~inten~nt montré qu'il est possible de construire des adénovirus recombinants conten~nt une séquence codant pour le aFGF, d'~lmini.~trer ces adénovirus recombinants in vivo, et que cette ~imini~tration permet une expression stable et localisée de quantités thérapeutiquement actives de aFGF in vivo, et en particulier dans le système nerveux, et sans effet cytopathologique. Les propriétés particulièrement avantageuses des vecteurs de l'invention découlent notamment de la construction utilisée (adénovirus défectif, délété de certaines régions virales), du promoteur utilisé pour l'expression de la séquence codant pour le aFGF
(promoteur viral ou tissu-spécifique de préférence), et des méthodes d'aministration dudit vecteur, permettant l'expression efficace et dans les tissus app,~priés du aFGF.
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21 ~440q WO9S/25803 P~-/r~9S/00249 La présente invention fournit ainsi des vecteurs viraux utili~bles direct~m~nt en thérapie génique, particulièrell-enl adaptés et effic~c~s pour diriger l~eA~ès~ion du aFGF in vivo. La p~èsell~e invention offre ainsi une nouvelle approche particulièlelllenl avantageuse pour le tl~ile~ nl et/ou la prévention des maladies neuro~légén~-ratives.
Un premier objet de l'invention réside donc dans un adénovirus ~ècolnh;n~
défectif complellant une séquence d'ADN codant pour le factêur de cn~;s~ e des fibroblastes acide (aFGF) ou un dérivé de celui-ci.
L'invention a ég~lemçnt pour objet l'utilisation d'un tel adénovirus recombin~nt défectif pour la préparation d'une composition ph~rma-e~1tique destinée lo au traitement ou à la ~l~vell~ion des maladies neurodégénératives.
Le facteur de croissance des fibroblastes acide (aFGF) produit dans le cadre de la présente invention peut être le aFGF humain ou un aFGF animal. En particulier, la séquence d'ADN codant pour le aFGF humain a été clonée et séquencée ~Jaye et al., Science 273 (1986) 541). Préalablement à leur incorporation dans un vecteur adénovirus selon l'invention, ces séquences sont avantageusement modifiées, par exemple par mut~g~ne~se dirigée, en particulier pour l'insertion de sites de restriction appropl;és. Les séquences décrites dans l'art antérieur ne sont en effet pas construites pour une utilisation selon l'invention, et des adaptations préalables peuvent s'avérer n~cess~ires, pour obtenir des expressions importantes (voir exemple 1.2.). Dans le cadre de la présente invention, on préfère utiliser une séquence d'ADN codant pour le facteur de croissance des fibroblastes acide humain (haFGF). Par ailleurs, commeindiqué ci-avant, il est également possible d'tltiliser une construction codant pour un dérivé du aFGF, en particulier un dérivé du aFGF hllm~in Un tel dérivé col--prend par exemple toute séquence obtenue par mutation, délétion et/ou addition par rapport à la 2s séquence native, et codant pour un produit conservant l'une au moins des propriétés biologiques du aFGF (effet trophique et/ou différentiateur). Ces mo-lific~tions peuvent être réalisées par les techniques connues de l'homme du métier (voir techniques générales de biologie moléculaire ci-après et exemple 2). L'activité biologique des dérivés ainsi obtenus peut ensuite être aisément ~ét~nin~e, comme indiqué
notamment dans l'exemple 3. Les dérivés au sens de l'invention peuvent ég~ m~nt être obtenus par hybridation à partir de banques d'acides nucléiques, en utilisant comme sonde la séquence native ou un fragment de celle-ci.

wo 9S/25803 PCr/FR95/00249 Ces dérivés sont notamment des molécules ayant une plus grande affinité
pour leurs sites de fixation, des séquences permettant une ~p,e~ion améliorée invivo, des molécules p-~se~ une plus grande r.osict~n~e aux protéases, des moléc~ s ayant une efficacité thérapeutique plus grande ou des effets secondaires moindres, ou S éventuellement de nouvelles propriétés biologiques.
Parmi les dérivés préférés, on peut citer plus particulièle,l,e,ll les variants naturels du aFGF. Ainsi, comme décrit par exemple dans le brevet US 4,868,113, diffél~llles formes de aFGF existent, et notamment une forme compre,lant 154 acides aminés, une forme co-"prenant 140 acides aminés, et une forme co",pr~,lant 134 10 acides aminés. Il est ent~n~ que le terme aFGF comprend ces dif~e~ es formes.D'autres dérivés préférés sont not~.~m~e"l les molécules dans lesquelles un ou plusieurs résidus ont été substitués, les dérivés obtenus par délétion de régions n'~l~el venant pas ou peu dans l'interaction avec les sites de liaison considérés ou exprimant une act*ité
indésirable, et les dérivés comportant par rapport à la séquence native des résidus 15 supplem~ns~ires, tels que par exemple un signal de sécrétion et/ou un peptide de jonction.
De manière particuliel~ll,elll avantageuse, la séquence utilisée dans le cadre de la présente invention contient égalemPnt un signal de sécrétion permettant dediriger le aFGF synthétisé dans les voies de sécrétion des cellules infectées, de manière 20 à ce que le aFGF synthétisé soit libéré plus efficacement dans les co",pa"iments extracellulaires et puisse activer ses récepteurs. Le signal de sécrétion utilisé peut être un signal de sécrétion hétérologue ou même artificiel. Avantageusement, on utilise un signal de sécrétion fonctionnel dans les cellules nerveuses, tel que le signal de sécrétion d'une cytokine. A titre d'exemple, on peut citer le signal de sécrétion de l'intel~ér-Jn de 25 fibroblastes hum~inc qui permet la sécrétion importante de aFGF.
La séquence d'ADN codant pour le facteur de croissance des fibroblastes acide utilisée dans le cadre de la présente invention peut être un ADNc, un ADN
g~nomillue (ADNg), ou une construction hybride concict~nt par exemple en un ADNcdans lequel seraient insérés un ou plusieurs introns. Il peut ég~l~m~nt s'agir de 30 séquences synthétiques ou semisynthétiques. De manière particulièrement avantageuse, on utilise un ADNc ou un ADNg. En particulier, l'utilisation d'un ADNg peut permettre une meilleure expression dans les cellules hllm~in~s Dans un premier mode de réalisation de l'invention, l'adénovirus comprend donc une séquence d'ADNc codant pour le facteur de croissance des fibroblastes acide 35 (aFGF). Dans un autre mode de réalisation préféré de l'invention, l'adénovirus ~1 ~4DQ9 WO 95/25803 P~lirr.SS/00249 comprend une séquence d'ADNg codant pour le facteur de croissance des fibrobl~stes acide (aFGF). Av~nt~g~ucem~nt, la séquence d'ADN code pour le aFGF précéde d'un signal de sécrétion hétérologue fonctionnel dans les cellules ne, ~ellses.

s Av~nt~u~ment. la séquence codant pour le aFGF est placée sous le contrôle de signaux permettant son eApression dans les cellules nerveuses.
Préférenti-?llem~nt, il s'agit de signaux d'expression hétérologues, c'est-à-dire de signaux différents de ceux natur~ m~nt responsables de l'eAplession du aFGF. Il peut s'agir en particulier de séquences responsables de l'expression d'autres protéines, ou de séquences synthétiques. Not~mm~nt, il peut s'agir de séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraux. Par exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule que l'on désire infecter. De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus, y compris l'adénovirus utilisé. A cet égard, on peut citer par exemple les promoteurs ElA, MLP, CMV, LTR-RSV, etc. En outre, ces séquences d'expression peuvent etre modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, ou permettant une expression tissu-spécifique. Il peut en effet etre particulièrement intéressant d'utiliser des signaux d'expression actifs spécifiquement ou majoritairement dans les cellules nerveuses, de manière à ce que la séquence d'ADN ne soit exprimée et ne produise son effet que lorsque le virus a effectivement infecté une cellule nerveuse. A cet égard, on peut citer par exemple les promoteurs de l'énolase neurone-spécifique, de la GFAP, etc.
Dans un premier mode de réalisation particulier, l'invention concerne un adénovirus recombinant défectif comprenant une séquence d'ADNc codant pour le facteur de croissance des fibroblastes acide humain (haFGF) sous le contrôle du promoteur LTR-RSV.
Dans un autre mode de réalisation particulier, l'invention concerne un adénovirus recombin~nt défectif col"prenant une séquence d'ADNg codant pour le facteur de cloissance des fibroblastes acide humain (haFGF) sous le contrôle du promoteur LTR-RSV.
La clem~n~l~resse a en effet montré que le promoteur LTR du virus du sarcome de rous (RSV) permettait une expression durable et importante du aFGF dans les cellules du système nerveux, no~a,~"l,~nl central.
Toujours dans un mode préféré, l'invention concerne un adénovirus recombinant défectif comprenant une séquence d'ADN codant pour le facteur de

2 1 84409 Wo 95/25803 PCT~R95/00249 croi~s~nre des fibroblastes acide humain (haFGF) sous le contrôle d'un promoteurpe".,~U~t une eA~,e~ion majoritaire dans le système nerveux.
Un mode particulièr~menl préféré de mise en oeuvre de la présente i~v~l~tion réside dans un adénovirus recombinant défectif co,npre,lant les séquences ITR, une 5 séquence permettant l'encapsidation, une séquence d'ADN codant pour le facteur de croissance des fibroblastes acide humain (haFGF) ou un dérivé de celui-ci sous le contrôle d'un promoteur permettant une expression majoritaire dans le système nerveux, et dans lequel le gène E1 et au moins un des gènes E2, E4, L1-L5 est non fonctionnel.
Les adénovirus défectifs selon l'invention sont des adénovirus inrapables de se répliquer de façon autonome dans la cellule cible. Génér~lement, le génome des adénovirus défectifs utilisés dans le cadre de la présente invention est donc dépourvu au moins des séquences neces~ires à la réplication dudit virus dans la cellule infectée.
Ces régions peuvent être soit éliminees (en tout ou en partie), soit rendues non-15 fonctionnelles, soit substituées par d'autres séquences et not~mm~nt par la séquence d'ADN codant pour le aFGF.
~ r~fe,en~iellement, le virus défectif de l'invention conserve les séquences de son génome qui sont necçs~ires à l'encaps~ tion des particules virales. Encore plus pr~ nli~llem~nt, comme indiqué ci-avant, le génome du virus recombin~nt défectif20 selon l'invention comprend les séquences ITR, une séquence permettant l'encapsidation, le gène E1 non fonctionnel et au moins un des gènes E2, E4, L1-L5 non fonctionnel. Il s'agit préférentiellement des gènes E1 et E4.
Il existe différents sérotypes d'adénovirus, dont la structure et les propriétésvarient quelque peu. Parmi ces sérotypes, on préfère utiliser dans le cadre de la 25 présente invention les adénovirus h~ in.~ de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir lem~n(le FR 93 05954). Parmi les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, (exemple: Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple: SAV). De 30 préférence, l'adénovirus d'origine animale est un adénovirus canin, plus préférentiellement un adénovirus CAV2 [souche m~nh~ n ou A26/61 (ATCC VR-800) par exemple]. De préférence, on utilise dans le cadre de l'invention des adénovirus d'origine humaine ou canine ou mixte.
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Wo 95/25803 Pcr~R95/00249 -Les adénovirus recombin~nt.c défectifs selon l'invention peuvent être pr~pa,~s par toute technique connue de l'homme du métier (Levrero et al., Gene 101 (1991)195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). En particulier, ils peuvent être pt~parés par recombinaison homologue entre un adénovirus et un plasmide portant 5 entre autre la séquence d'ADN codant pour le aFGF. La reco."binaiscn homologue se produit après co-transfection desdits adénovirus et plasmide dans une ligné~e cellulaire appr~,iée. La lignée cellulaire utilisée doit de préférence (i) être transformable par lesdits é1em~nt~, et (ii), comporter les séquences capables de complémen~er la partie du génome de l'adénovirus défectif, de préférence sous forme intégrée pour éviter les o risques de recombinaison. A titre d'exemple de lignée, on peut mentionner la lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) qui contient nul~ e-~l, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12 ~o). Des stratégies de construction de vecteurs dérivés des adénovirus ont ég~lem~?nt été décrites dans les demandes n FR 93 05954 et FR 93 08596 qui sont incorporées à la présente par référence.
F.n~uite, les adénovirus qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés selonles techniques classiques de biologie moléculaire, comme illustré dans les exemples.
Comme indiqué ci-avant, la présente invention conceme ég~lem~nt toute ~tili~qtion d~un adénovirus tel que décrit ci-dessus pour la pr~pa,~ion d'une 20 composition pharmaceutique destinée au traitement et/ou à la pt~ve"~ion des m~ c neurodégénératives. Plus particulièrement, elle concerne toute utilisation de ces adénovirus pour la ~,epaldtion d'une composition pharmaceutique destinée au tr~itement et/ou à la prévention de la maladie de Parkinson, de la maladie d'.Al7heimf~r, de la sclérose latérale a-ryotl~,phique (ALS), de la maladie d'HllntinEton, de l'épilepsie 25 et de la démence vasculaire.
La présente invention concerne également une composition pharm~cel-tique col"pte,lant un ou plusieurs adénovirus recombinants défectifs tels que décrits précédemm.?nt Ces compositions pharmaceutiques peuvent être formulées en vue d'~lmini~trations par voie topique, orale, parentérale, intr~n~c~le, inllaveineuse, 30 intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc. De préférence, les compositions ph~ ceutiques de l'invention contiennent un véhicule ph~rm~ceu-tiquement acceptable pour une formulation injectable, notamment pour une injection directe dans le système nerveux du patient. Il peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment Iyophili.~ees, qui, par i 2 1 84~0~
Wo 9S/25803 PCTIFR95/00249 addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la con~titution de solutés injectables. L'injection directe dans le système nerveux du patient est avantageuse car elle permet de concentrer l'effet thérapeutique au niveau des tissus affectés. L'injection directe dans le système nerveux central du patient est 5 avantageucem~nt réalisée au moyen d'un appareil d'injection stéréotaxique. L'emploi d'un tel appareil permet en effet de cibler avec une grande précision le site d'injection.
A cet égard, l'invention concerne ég~lçm~nt une méthode de traitement des m~ s neurodégénératives co~-~prenan~ .n;.~ lion à un patient d'un adénovirus recombinant tel que défini ci-avant. Plus particulièrement, l'invention concerne une 10 méthode de traitement des maladies neurodégénératives comprenant l'ar~ ;n;.,lla~ion stéréotaxique d'un adénovirus recombin~nt tel que défini ci-avant.
Les doses d'adénovirus recombinant défectif utili~é~s pour l'injection peuvent être adaptées en fonction de dirrél~nls paramètres, et notamment en fonction du mode d'~mini~tration utilisé, de la pathologie concernée ou encore de la durée du traitement 15 recherchée. D'une manière générale, les adénovirus recombin~nt~ selon l'invention sont formulés et a~mini~trés sous forme de doses comprises entre 104 et 10l4 pfu/ml, et de ple~érence 106 à 10l pfu/ml. Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond aupouvoir infectieux d'une solution de virus, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire appr ,p iée, puis mesure, généralement après 48 heures, du nombre de plages 20 de cellules infectées. Les techniques de détermination du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la littérature.
Un autre objet de l'invention concerne toute cellule de m~mmifère infectée par un ou plusieurs adénovirus recomhin~nt.c défectifs tels que décrits ci-dessus. Plus particulièrement, l'invention concerne toute population de cellules hurn~ines infectée 25 par ces adénovirus. Il peut s'agir en particulier de fibroblastes, myoblastes, hépatocytes, kératinocytes, cellules endothéliales, cellules gliales, etc.
Les cellules selon l'invention peuvent être issues de cultures pri~,aires. Celles-ci peuvent être prélevées par toute technique connue de l'homme du métier, puis mises en culture dans des conditions permettant leur prolifération. S'~gi~sant plus 30 particulièrement de fibroblastes, ceux-ci peuvent être aisément obtenus à partir de biopsies, par exemple selon la technique décrite par Ham [Methods Cell.Biol. 21a(1980) 255]. Ces cellules peuvent être utilisées directement pour l'infection par les adénovirus, ou conservées, par exemple par congélation, pour l'ét~bli~mçnt de banques autologues, en vue d'une utilisation ultérieure. Les cellules selon l'invention Wo 95/25803 Pcr/FR95/00249 -peuv~ égal~m~nt être des cultures secondaires, obtenues par PYemrle à partir de banques préétablies.
Les cellules en culture sont ensuite infectées par des adénovirus recombin~nt~, pour leur conférer la capacité de produire du aFGF. L'infection est 5 réalisée in vitro selon des techniques connues de l'homme du métier. En particulier, selon le type de cellules utilisé et le nombre de copies de virus par cellule désiré, l'homme du métier peut adapter la multiplicité d'infection et éventuellement le nombre de cycles d'infection réalisé. Il est bien ~ntenrlll que ces étapes doivent être effectuées dans des conditions de stérilité applupriées lorsque les cellules sont cl~-stin~s à une 10 ~-lmini~tration in vivo. Les doses d'adénovirus recombinant utilicees pour l'infection des cellules peuvent être adaptées par l'homme du métier selon le but ~cl~el.,hé. Les conditions décrites ci-avant pour l'administration in vivo peuvent être appliquées à
l'infection in vitro.
Un autre objet de l'invention concerne un implant compr~nant des cellules 15 n~,.n;~ infectées par un ou plusieurs adénovirus recomhin~nt~c défectifs telles que décrites ci-dessus, et une matrice extracellulaire. Préférlontiell.om~nt les impl~ntc selon l'invention c~.l,pl~ ent 105 à 101 cellules. Plus prerel~llliellement, ils en conlplelment 106 à 108.
Plus particulièrement, dans les implants de l'invention, la matrice extracellulaire con,p~end un composé gélifiant et éventuellement un support permettant l'ancrage des cellules.
Pour la yl~pal~tion des implants selon l'invention, difrél~ types de gélifiants peuvent être employés. Les gélifiants sont utilisés pour l'inclusion des cellules dans une matrice ayant la constitution d'un gel, et pour favoriser l'ancrage des cellules 2~ sur le support, le cas échéant. Différents agents d'adhésion cellulaire peuvent donc être utilisés comme ~lifi~nt~, tels que notamment le collagène, la gel~tin~, les glycosaminoglycans, la fibronectine, les lectines, etc. De préférence, on utilise dans le cadre de la présente invention du collagène. Il peut s'agir de coll~ne d'originehumaine, bovine ou murine. Plus préférenciellement, on utilise du collagène de type I.
Comme indiqué ci-avant, les compositions selon l'invention co-llpl~lment avantageusement un support permettant l'ancrage des cellules. Le terme ancrage désigne toute forme d'interaction biologique et/ou chimique et/ou physique enlldînant l'adhésion et/ou la fixation des cellules sur le support. Par ailleurs, les cellules peuvent soit recouvrir le support utilisé, soit pénétrer à l'intérieur de ce support, soit les deux.

WO 9S/25803 P~l/rl~9S/00249 On préfère utiliser dans le cadre de l'invention un support solide, non toxique et/ou bio-cnmpatihle. En particulier, on peut utiliser des fibres de polytétrafluoroéthylène ) ou un support d'origine biologique.
Les imr~nt~ selon l'invention peuvent être implantés en différents sites de 5 l'or~ ~,s,l,e. En particulier, l'impl~nt~tion peut être effectuée au niveau de la cavité
péritonéale, dans le tissu sous-cutané (région sus-pubienne, fosses iliaques ou inguinales, etc), dans un organe, un muscle, une tumeur, le système ne,v~ux central, ou encore sous une muqueuse. Les impl~nt~ selon l'invention sont particuliè~-ne"l avantageux en ce sens qu'ils permettent de contrôler la libération du produit 10 thé,c.peulique dans l'organisme: Celle-ci est tout d'abord déterminée par la mllltipli~ite d'infection et par le nombre de cellules implantées. Ensuite, la libération peut être contrôlée soit par le retrait de l'implant, ce qui arrête deLn,~ivement le tr~itement, soit par l'utilisation de systèmes d'expression régulable, permettant d'induire ou de réprimer l'expression des gènes thérapeutiques.

La présente invention offre ainsi un moyen très efficace pour le tr~ite-ment ou la p,ev~"lion des maladies neurodégénératives. Elle est tout particuliè~el"~nL adaptée au traitem~nt des m~ s d'Alzheimer, de Parkinson, de Huntington, et de l'ALS. Les vecteurs adénoviraux selon l'invention présentent en outre des avantages impo~L~L~, 20 liés notamment à leur très haute efficacité d'infection des cellules nerveuses, permettant de réaliser des infections à partir de faibles volumes de suspension virale.
De plus, l'infection par les adénovirus de l'invention est très localisée au site d'injection, ce qui évite les risques de diffusion aux structures cérébrales voisines.
En outre, ce traitement peut concerner aussi bien l'homme que tout animal tel 2s que les ovins, les bovins, les an""aux domestiques (chiens, chats, etc), les chevaux, les poissons, etc.
La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
~ ~pende des fgures Figure 1: Représentation du vecteur pXL2244 Figure 2: ReprésPnt~tion du vecteur pSh-Ad-aFGF

wo 95/25803 PCT~R95/00249 Techniques ~énérales de biolo~ie moléculaire Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions p,~pal~lives d'ADN pl~mi~ique~ la centrifugation d'ADN p~ que en gradient de chlorure de césium, l'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la 5 pllrifi~ation de fr~gment~ d'ADN par électroélution, les extraction de protéines au phénol ou au phénol-chlol~folme, la précipitation d'ADN en milieu salin par de l'éthanol ou de l'iso~,opanol, la tran~fo".lalion dans F~rh~ichi~ coli, etc ... sont bien connl~es de l'homme de métier et sont abondament décrites dans la li~léLa~ [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Labo,~loLy Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, n Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley 8c Sons, New York, 1987].
Les pl~mi~i~s de type pBR322, pUC et les phages de la série M13 sont d'origine commerciale (Bethesda Research Laboratories).
Pour les ligatures, les fragments d'ADN peuvent être séparés selon leur taille l5 par électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mélange phénoVchlol. foll-le, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de l'ADN
ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recomm~n~l~tions du fournisseur.
Le remplissage des extrémités 5' proéminentes peut être effectué par le fragment de Klenow de l'ADN Polymérase I d'E. coli (Biolabs) selon les spécifications 20 du fournisseur. La destruction des extrémités 3' proéminentes est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les recornm~n~i~tions du fabricant. La destruction des extrémités 5' proéminentes est effectuée par un traitement ménagé par la nucléase S1.
La mutag~nèse dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthétiques peut 25 être effectuée selon la méthode développée par Taylor et al. lNucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764] en l~tilisant le kit distribué par Amersham.
L'amplification enzymatique de fragments d'ADN par la technique dite de PCR
[E~olymérase-catalyzed_hain Reaction, Saiki R.K. et al., Science ~ (1985) 1350-1354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzyrn. 155 (1987) 335-350] peut être 30 effectuée en utili~c~nt un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les spécificafions du fabricant.
La vérification des séquences nucléotidiques peut être effectuée par la méthode développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467] en utilisant le kit distribué par Amersham.

Wo 95/2s803 Pcr/l~h5S,'~249 F,xempl~c Exemple l: Construction du vecteur pSh-Ad-aFGF.
Cet exemple décrit la construction d'un vecteur co,--prenalll une séquence d'ADN codant pour le aFGF précédée d'une séquence de sécrétion hétérologue, sous5 le contrôle d'un promoteur con~itué par le LTR du virus du sarcome de rous (LTR-RSV).
1.1. Vecteur de départ (pXL2244): Le plasmide pXL2244 contient l'ADNc de l'ApoAI sous le contrôle du promoteur LTR du virus RSV, ainsi que des séquences de l'adénovirus Ad5 (figure 1). Il a été con~ uil par insertion d'un fragment ClaI-EcoRV
lO contenant l'ADNc codant pour la préproApoAI dans le vecteur pLTR RSV-~gal (Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest. 90 (1992) 626), digéré par les même enzymes.

1.2. Construction d'une séquence ADNc codant pour le aFGF.
lS Pour permettre la réalisation de vecteurs selon l'invention, une séquence d'ADNc codant pour le aFGF humain a été construite comme suit:
- Une séquence d'ADNc codant pour le aFGF humain comprenant 134 acides aminés (aFGF134) a été isolée à partir du plasmide pMJ26 ~Jaye et al., J. Biol. Chem.
262 (1987) 16612). Le pl~cmi~e pMJ26 contient une séquence d'ADNc codant pour le20 aFGF humain précédée de la séquence du site de restriction EcoRI. La séquence du plasmide au niveau de cette région est la suiv~ e (site EcoRI sollligné et codon start en gras):
...GA~TTCATG...
Après digestion par l'enzyme EcoRI, les extrémités du site de restriction ont 2s été rendues franches par traitement à la nucléase mung bean. Les fr~gm~ntc obtenus possèdent les e~rén,i~es suivantes (codon start en gras):
...GAATTCATG... (pMJ26) ...G CATG... (EcoRI + Nucléase mung bean) Cette séquence a ensuite été modifiée par insertion d'une séquence de sécrétion. L'introduction de cette séquence est particulièrement avantageuse puisqu'elle permet la libération extr~cell~ ire plus efficace du aFGF synthétisé par les cellules infectées par les vecteurs de l'invention. Plus particulièrement, la séquence obtenue ci-dessus a été modifiée par insertion, à l'exllémi~e 5' et en phase de Wo 95/25803 PCT~s5/00249 la séquence codante du aFGF, d'un oligonucléotide synthétique double brin correspondant à la séquence de sécrétion de l'in~rén~n de fibroblastes h~ ;n~
(Taniguchi et al., Gene 10 (1980) 11). Chaque brin de cet olig~ n~cléoti~ie a été
synthétisé chimiquement au moyen d'un synth~ti~ r d'acides nucléiques, puis hybridé
5 pour recon~tittler l'ADN double brin. La séquence utilisée conti~nt l'~n~h~in~m~nt des 70 pb suivantes (SEQ ID n 1):

GGCTCGAG ATG ACC AAC AAG TGT CTC CTC CAA ATT GCT CTC CTG TTG TGC

Met Thr Asn Lys Cys Leu Leu Gln Ile Ala Leu Leu Leu Cys TTC TCC ACT ACA GCT CTT TC

Phe Ser Thr Thr Ala Leu Se - Cet oligonucléotide comprend, à l'extrémité 5' de la séquence de sécrétion, un site XhoI (souligné dans la séquence ci-dessus). Cet oligon~lrléotide double brin a été
ligaturé avec la séquence codant pour le aFGF digérée par EcoRI et la mlcle~e mung bean comme décrit ci-avant. Un clone prés~nt~nt l'insert dans l'orientation correcte a ensuite été isolé et vérifié par séquençage. Le fragment complet présent dans ce clone, contenant la séquence codant pour le aFGF précédée de la séquence de sécrétion, a ensuite été isolé par digestion par les enzymes XhoI et BglII (site BglII situé après Ie codon stop), puis ligaturé avec le vecteur p267 ~Jaye et al., EMBO J. 7 (1988) 963) préalablement ouvert par les mêmes enGy",es. Le vecteur résultant a été désigné
pMJ35.
- La séquence préparée ci-dessus a ensuite été modifiée par la technique de PCR, en l1tili.~nt comme amorce les oligonucléotides suivants:
Oligonucléotide 5': 5'-GCGATCGATCTCGAGATGACCAACAAG-3' (SEQ ID n2) Oligonucléotide 3': 5'-CTCGGTACCTCTTTAATCAGAAGAGAC-3' (SEQ ID n3) Les étapes d'amplification par PCR sur le plasmide pMJ35 permettent d'introduire de part et d'autre de la séquence chimPrique "séquence de sécrétion/aFGF"
des sites de restriction applopliés. Plus précisément, ces étapes perrnettent l'incor~d~ion d'un site ClaI à l'extrémité 5' (séquence soulignée en simple dansl'oligonucléotide 5', qui indique sa position par rapport au codon start souligné en double) et d'un site KpnI à l'~ e~l,ilé 3' (séquence soulignée en simple dans l'oligonucléotide 3'). Les sites créés permettent l'insertion de la séquences dans des conditions d'expression dans les vecteurs de l'invention.
1.3. Construction du vecteur pSh-Ad-aFGF

2 1 ~4409 wo 95/25803 P~ l/1'~55~D249 Cet exemple décrit la construction du vecteur pSh-Ad-aFGF cont~n~nt la séquence codant pour le aFGF précédée d'une séquence de sécrétion, sou~. contrôle du LTR du virus RSV, ainsi que des séquences de l'adénovirus Ad5 permettant la recornbin~i~n in vivo.
Le fragment de PCR préparé dans l'exemple 1.2. a été digéré par les er~ym~s ClaI et KpnI, et le fragment de 0,5 kb résultant, cont~n~nf la séquence codant pour le aFGF précédée du signal de sécrétion de l'.nt~,~élon de fibroblastes hurnain a ensuite été isolé et purifié par électrophorèse sur un gel d'agarose LMP ("Low Melting Point"). Parallèlement, le vecteur pXL2244 a été digéré par les mêmes en~ymes delo restriction ClaI et KpnI, puis précipité après inactivation de ces dernières. Le vecteur linéaire résultant, préalablement isolé et purifié par électrophorèse sur un gel d'agarose, et le fragment de 0,5 kb ont ensuite été ligaturés pour générer le vecteur pSh-Ad-aFGF (figure 2). L'ensemble de la séquence nucléotidique de l'insert aFGF a ensuite été vérifiée par séquençage didéoxynucléotides.
Exemple 2. Fonctionalité du vecteur pSh-Ad-aFGF
La c~pacité du vecteur pSh-Ad-aFGF à exprimer sur culture cellulaire une forme biologiquement active du aFGF a été démontrée par transfection transitoire de cellules COS1. Pour cela, les cellules (2.106 cellules par boite de 10 cm de diamètre) ont été transfectées (8 ~lg de vecteur) en présence de Transfectam. Après 48 heures, le surn~ge~nt de culture des cellules a été récolté. Des dilutions sérielles (1/200 et 1/50) de ce surnageant ont ensuite été ajoutées à des cultures de cellules NIH 3T3. L'effet trophique sur ces cultures a été observé par incorporation de thymidine radiomarquée.
Parallèlement, la production de aFGF par les cellules transfectées a ég~l~ment été
démc-ntrée par immunodétection.
Exemple 3. Construction d'un adénovirus recombinant Ad-aFGF contenant une séquence codant pour le aFGF
Le vecteur pSh-Ad-aFGF a été linéarisé et cotransfecté avec un vecteur adénoviral déficient, dans les cellules helper (lignée 293) apportant en t7ans les fonctions codées par les régions E1 (ElA et ElB) d'adénovirus.
Plus précisément, l'adénovirus Ad-aFGF a été obtenu par recombinaison homologue in vivo entre l'adénovirus mutant Ad-dll324 (Thimm~ppaya et al., Cell 31 (1982) 543) et le vecteur pSh-Ad-aFGF, selon le protocole suivant: le plasrnide pSh-

3 P~l/r~9S/00249 -Ad-aFGF et l'adénovirus Ad-dll324, line~ri~é par l'enzyme ClaI, ont été co-transfectés dans la lignée 293 en présence de phosph~te de s~ m, pour permettre la recombinaison homologue. Les adénovirus recomhin~nt~ ainsi générés ont été
sélectionnés par purific~ticn sur plaque. Après i.colemPtlt, l'ADN de l'adénovirus 5 recombinant a été ~mplifie dans la lignée cellulaire 293, ce qui conduit à un surnageant de culture co..len~.l l'adénovirus défectif recomhin~nt non purifié ayant un titre d'environ 101 pfu/ml.
Les particules virales sont ensuite p Irifiées par centrifugation sur gradient de chlorure de césium selon les techniques connues (voir notamment Graham et al., lo Virology 52 (1973) 456). L'adénovirus Ad-aFGF peut être conservé à -80C dans 20 % de glycérol.
Exemple 4. Fonctionalité de l'adénovirus Ad-aFGF
La c~p~cité de l'adénovirus Ad-aFGF à infecter des cellules en culture et à
exprimer dans le milieu de culture une forme biologiquement active du aFGF a été1S démontrée par infection des lignées 293 hum~ine et PC12 de rat. La présence de aFGF
actif dans le surnageant de culture a ensuite été dherminée dans les mêmes conditions que dans l'exemple 2.
Ces études permettent de montrer que l'adénovirus exprime bien une forme biologiquement active du aFGF en culture cellulaire.
20 Exemple 5: Transfert in vivo du gène aFGF par un adénovirus recombinant à
des rats p. e~ tant une lésion du fimbria-fornix Cet exemple décrit le transfert du gène aFGF in vivo au moyen d'un vecteur adénoviral selon l'invention. Il montre sur un modèle animal de la lésion du fimbria-fornix, que les vecteurs de l'invention permettent d'induire l'expression in vivo de 25 quantités thérapeutiques de aFGF.
Sur des rats préalablement ~n~sthé~ies, la voie septo-hippocampique (fimbria-fornix) a été sectionnée au niveau de l'hélJ,is~hère gauche. Cette lésion m~c~nique a été réalisée à l'aide d'un couteau chirurgical rétractable. Les coordonnées stéréotaxiques utilisées à cet effet sont, par rapport au bregma: AP: -1,7; ML: +1,5;
V: -5,5 à -0,5.

Wo ss/2s803 Pcr/FR95/00249 L'adénovirus recombinant aFGF a été injecté immét~i~tem~nt après la lésion, dans le noyau médian du septum et dans la partie dorsale de l'hippocampe déaf~élelllé
(hippocampe du coté de la lésion). Plus particuliè~elllen~, l'adénovirus injecté est l'adénovirus Ad-aFGF préparé dans l'exemple 3.1., utilisé sous forme purifiée (3,5 106 5 pfu/lll), dans une solution saline phQsph~te (PBS).

Les injections sont réalisées à l'aide d'une canule (tli~mptre extérieur 280 ~m)connectée à une pompe. La vitesse d'injection est fixée à 0,5 ~I/min, après quoi, la canule reste en place pendant 4 minutes suppli~m~ntaires avant d'être remontée. Les 10 volumes d'injection dans l'hippocampe et le septum sont respectivement 3 ~l et 2 ~l.
La concentration d'adénovirus injectée est de 3,5. 106 pfu/~l.
Pour l'injection dans l'hippocampe, les coordonn~çs stéréotaxiques sont les suivantes: AP=-4; ML=3,5; V=-3,1 (les coordonnées AP et ML sont déterminées par rapport au bregma, la coordonnée V par rapport à la surface de l'os crânien au niveau 15 du bregma.
Pour l'injection dans le septum, les coordonnées stéréotaxiques sont les suivantes: AP=1; ML=1; V=-6 (les coordonnées AP et ML sont déterminées par rapport au bregma, la coordonnée V par rapport à la surface de l'os crânien au niveau du bregma. Dans cette condition, la canule présente un angle de 9 degrés par rapport à
20 la verticale (dans le sens médio-latéral) afin d'éviter le sinus veineux mérli~n Les effets thérapeutiques de l'~mini.~tration de l'adénovirus selon l'invention ont été mis en évidence par trois types d'analyse: une analyse histologique et immunohi~tochimique, une analyse quan~i~a~ive et une analyse comportement~
Analyse histologique et immunohistochimique La lésion mécanique du fimbria-fornix induit une perte de neurones cholinergiques (révélée en immunohistologie par un anticorps anti-choline acétyltransférase, ChAT) dans le septum médian, ainsi que la dénervation cholinergique dans l'hippocampe (detectee en histochimie par l'activité de l'acétyl choline estérase, AChE).
L'analyse histologique des cerveaux injectés est réalisée 3 s~m~in~s après I'injection intracérébrale de l'adénovirus Ad-aFGF. Pour cela, les animaux sont sacrifiés, sous anesthésie, par perfusion intracardiaque de 4% paraformaldéhyde. Après prélèvement, post-fixation et cryoprotection, le cerveau est coupé au cryomat selon le WO 95l25803 PcrlFRssloo249 plan coronal: des coupes sériées coronales de 30 ,um d~épai~el~r sont réalisées sur toute la longueur du septum médian et aux niveaux ~nt~riellr, médian et postérieur de l'hippocampe. Pour le septum médian, des coupes espacées de 180 ,um (1 coupe sur 6) sont colorées au crésyl violet (pour évaluer la densité neuronale) et ;.. ~no.. ~uées 5 par un anticorps anti ChAT (Biochem) (pour identifier les neurones cholinergiques).
La méthode immlmc)hi~to~himique est celle de la ~ t~vidine-biotine pe~u~y~se révélée par la DAB. Pour l'hippocampe, des coupes espacéos de 180 ,um sont colorées selon la méthode hi~tochimique pour l'AChE (acétyl choline estérase) afin de détecter l'imlel va~ion cholinergique. Les coupes sont montées sur lames de verre.
lO Analyse qua"li~alive Le nombre de neurones cholinergiques (ChAT positifs) dans le septum médian est le paramètre d'évaluation des effets de l'adénovirus Ad-aFGF. Le dénombrement est réalisé sur un échantillon (1 coupe sur 6 sur toute la longueur du septum médian). Pour chaque coupe, les neurones ChAT positifs sont tlenomhrés 15 sépali~ ent des 2 cotés du septum. Les résultats cumulés pour toutes les coupes sont exprimés par le rapport du nombre de neurones ChAT positifs du coté lésé sur le nombre de neurones ChAT positifs du coté non lésé.
Analyse comportementale Il est connu qu'une lésion bilatérale de la voie septo-hippocampique conduit à
20 des déficits mnésiques. Les effets fonctionnels protecteurs d'une injection d'adénovirus Ad-aFGF sur ce type de lésion sont mis en évidence par analyse des performances mnésiques des animaux au cours de 2 tests comportementaux: le test de la piscine de Morris (mémoire de référence visuo-spatiale) et le test TMTT (I'two-trials memory task"; "mémoire à court-terme d'un environnement nouveau").
25 Exemple 6: Transfert in vivo du gène aFGF par un adénovirus recombinant à
des rats présentant une lésion de la voie nigro-striée Cet exemple décrit le transfert du gène aFGF in vivo au moyen d'un vecteur adénoviral selon l'invention. Il montre sur un modèle animal de la lésion de la voie nigro-striée, que les vecteurs de l'invention permettent d'induire l'expression in vivo de 30 qllal~ és thérapeutiques de aFGF.

21 ~4~0~
WO9S/25803 PCIlr~5;~ 249 Sur des rats préalablement anesthésiés, la voie nigro-striée a été lésée au niveau du f~iscea,l me~ncéph~lique médian (MFB) par injection de la toxine 6-llydl~y dopa",-ne (60H-DA). Cette lésion chimique par injection a été unilatérale, suivant les coordonnees stéréotaxiques S~livdnl~s: AP: 0 et -1; ML: +1,6; V: -8,6 et -9 (les coordonnées AP et ML sont déterminées par rapport au bregma, la coordonnée V par rapport à la dure-mère). La barre d'incisive est fixée au niveau +5 mm.
L'adénovirus recombin~nt aFGF a été injecté imme~i~t~m~nt après la lésion, dans la subst~nce noire et le stri~hlm, du coté de la lésion. Plus particulièrement, l'adénovirus injecté est l'adénovirus Ad-aFGF préparé dans l'exemple 3.1., utilisé sous forme purifiée (3,5 106 pfu/,ul), dans une solution saline phQ~ph~te (PBS).

- Les injections ont été réalisées à l'aide d'une canule (diamètre extérieur 280 m) connectée à une pompe. La vitesse d'injection est fixée à 0,5 ~l/min, après quoi, la canule reste en place pendant 4 minutes supplémentaires avant d'être remontée Les volumes d'injection dans le striatum et la substance noire sont respectivement 2x3 ~l et 2 ~1. La concentration d'adénovirus injectée est de 3,5. 106 pfu/~l.
Pour l'injection dans la substance noire, les coordonnées stéréotaxiques sont les suivantes: AP=-5,8; ML=+2; V=-7,5 (les coordonnées AP et ML sont (leterminées par rapport au bregma, la coordonnée V par rapport à la dure-mère).
Pour les injections dans le striatum, les coordonnées stéréotaxiques sont les suivantes: AP=+0,5 et -0,5; ML=3; V=-5,5 (les coordonnées AP et ML sont déterminées par rapport au bregma, la coordonnée V par rapport à la dure-mère).
Les effets thérapeutiques de l'administration de l'adénovirus selon l'invention ont été mis en évidence par trois types d'analyse: une analyse histologique et immunohi~to~himique~ une analyse quantil~tive et une analyse comportem~nt~le.
Analyse histologique et immunohistochimique La lésion chimique de la voie nigro-striée induit une perte neuronale dans la substance noire ainsi que la dénervation dopaminergique dans le striatum (révélées en immunohistologie par un anticorps anti-tyrosine hydroxylase, TH).
L'analyse histologique des cerveaux injectés est réalisée 3 s~m~in~s après l'injection intracérébrale de l'adénovirus Ad-aFGF dans les conditions décrites dans W095/25803 2 1 8 4 4 0 9 P~l/r~S/00249 l'~Y~mple 6. Les coupes sériées coronales de 30 ,um d'ép~ e~ sont réalisées dans la subst~nce noire et le stnatl~m. Des coupes espacées de 180 ,um (1 coupe sur 6) sont colorées au crésyl violet (pour évaluer la densité neuronale) et immuno."af~,lées par un anticorps anti ty~sine },y~ylase (TH) (pour détecter les neurones 5 dop~minergiques dans la suhst~nce noire et leur innervation dans le stri~t..m).
Analyse qua,~ alive Le nombre de neurones dopaminergiques (TH positifs), dans la subst~nre noire est le paramètre d'évaluation des effets de l'adénovirus Ad-aFGF. Le dénombrement est réalisé sur un é~h~ntillon (1 coupe sur 6 sur toute la longueur de la o substance noire). Pour chaque coupe, les neurones TH positifs sont dénombrés séparément des 2 cotés de la subst~n~e noire. Les résultats cumulés pour toutes les coupes sont exprimés en propol~ion: nombre de neurones TH positifs du coté lésé par rapport au nombre de neurones TH positifs du coté non lésé.
Analyse comportementale Les effets fonctionnels protecteurs d'une injection d'adénovirus Ad-aFGF sur la lésion de la voie nigro-striée sont mis en évidence par analyse des performances sensori-motrices des animaux au cours de 2 tests comportementaux: le test de la rotation induite par des agonistes dopaminergiques (apomorphine, ~mphet~mine et lévodopa), et le test de préhension ("paw-reaching").
Exemple 7: Transfert in vivo du gène aFGF par un adénovirus recombinant à
des rats présentant une lésion de la voie perforante Cet exemple décrit le transfert du gène aFGF in vivo au moyen d'un vecteur adénoviral selon l'invention. Il montre sur un modèle animal de la lésion de la voie perforante, que les vecteurs de l'invention permettent d'induire l'expression in vivo de quantités thérapeutiques de aFGF.
Sur des rats préalablement anesthésiés, la voie entorhino-hippocampique (voie perforante) a été sectionnée unilatéralement à l'aide d'un couteau chirurgical. Les coordonnées stéréotaxiques utilisées à cet effet sont, par rapport au lambda: AP:
+0,75; ML: +4,1 à 6,6; V: -7,7 (coordonnée V déterminée par rapport à la dure-mère).

w095/25803 21 84409 Pcr~95/00249 L'adénovirus recombinant aFGF est injecté immé~ tem~nt après la lésion, soit au niveau de la lésion, soit au niveau de l'hippocampe et du cortex e-.lo.l.;l-~l Plus particulièrement, l'adénovirus injecté est l'adénovirus Ad-aFGF préparé dans l'~xemr'e 3.1., utilisé sous forme purifiée (3,5106 pfu/,ul), dans une solution saline phosphate 5 (PBS).

Les injections ont été réalisées à l'aide d'une canule (diamètre extérieur 280 m) connectée à une pompe. La vitesse d'injection est fixée à 0,5 ~l/min, après quoi, la canule reste en place pendant 4 minutes suppl~om~nt~ires avant d'être rem~ntée. Les lo volumes d'injection dans l'hippocampe, le cortex ~ o.l~ l et le site de lésion de la voie ~,~anle sont respectivement 3 ~l, 2 ~ll et 2 ~l. La concentration d'adénovirus injectée est de 3,5. 106 pfu/~l.
Les effets thérapeutiques de l'administration de l'adénovirus selon l'invention peuvent être mis en évidence par une analyse comportementale dans les conditions de 5 l'exemple 5.

W 095/25803 2 1 &4 'T O~ P~l/rh9S/00249 T.TST~ DF~. SEOUT~'N~T~'~

(1) INFORMATION GENERALE:
s (i) DEPOSANT:
(A) NOM: RHONE-POULENC RORER S.A.
(B) RUE: 20, avenue Raymond ARON
(C) VILLE: ANTONY
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 92165 (ii) TITRE DE L' INVENTION: Virus rec~mhinAnts, préparation et utilisation en thérapie génique (iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 3 (iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Tape (B) ORDINATEUR: IBM PC co~patible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (OEB) (2) TNFORMATION POUR T-~ SEO ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 70 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Homo sapiens (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
(D) AUTRE INFORMATION: /product= Séquence Signal (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:

Met Thr Asn Lys Cys Leu Leu Gln Ile Ala Leu Leu Leu Cys Phe Ser Thr Thr Ala Leu (2) INFORMATION POUR T-~ SEO ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 27 paires de bases (B) TYPE: acide nuclélque (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON

WO95/25803 2 1 ~ 4 i~ o 9 P~lrn95loo249 (iii) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:

(2) INFORMATION POUR T,~ S~O Tn NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 27 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:

Claims (26)

REVENDICATIONS

1. Adénovirus recombinant défectif comprenant une séquence d'ADN codant pour le facteur de croissance des fibroblastes acide (aFGF) ou un dérivé de celui-ci.

2. Adénovirus selon la revendication 1 caractérisé en ce que la séquence d'ADN contient, en 5' et en phase de lecture de la séquence codant pour le aFGF, une séquence de sécrétion.

3. Adénovirus selon la revendication 2 caractérisé en ce que la séquence de sécrétion est choisie parmi les séquences de sécrétion fonctionnelles dans les cellules nerveuses, de préférence provenant d'une cytokine.

4. Adénovirus selon les revendications 1 à 3 caractérisé en ce que la séquence d'ADN est une séquence d'ADNc.

5. Adénovirus selon les revendications 1 à 3 caractérisé en ce que la séquence d'ADN est une séquence d'ADNg.

6. Adénovirus selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que la séquence d'ADN code pour le aFGF humain de 154, 140 ou 134 acides aminés, de préférence la forme 134.

7. Adénovirus selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisé en ce que la séquence d'ADN est placée sous le contrôle de signaux permettant son expression dans les cellules nerveuses.

8. Adénovirus selon la revendication 7 caractérisé en ce que les signaux d'expression sont choisis parmi les promoteurs viraux, de préférence parmi les promoteurs E1A, MLP, CMV et LTR-RSV.

9. Adénovirus recombinant défectif comprenant une séquence d'ADNc codant pour le aFGF humain précédée d'une séquence de sécrétion, sous le contrôle du promoteur LTR-RSV.

10. Adénovirus recombinant défectif comprenant une séquence d'ADNg codant pour le aFGF humain précédée d'une séquence de sécrétion, sous le contrôle du promoteur LTR-RSV.

11. Adénovirus recombinant défectif comprenant une séquence d'ADN
codant pour le aFGF humain ou un dérivé de celui-ci sous le contrôle d'un promoteur permettant une expression majoritaire dans les cellules nerveuses.

12. Adénovirus recombinant défectif selon la revendication 11 caractérisé en ce que le promoteur est choisi parmi le promoteur de l'énolase neurone spécifique et le promoteur de la GFAP.

13. Adénovirus selon l'une des revendications 1 à 12 caractérisé en ce qu'il estdépourvu des régions de son génome qui sont nécessaires à sa réplication dans lacellule cible.

14. Adénovirus selon la revendication 13 caractérisé en ce qu'il comprend les ITR et une séquence permettant l'encapsidation, et dans lequel le gène E1 et au moins un des gènes E2, E4, L1-L5 sont non fonctionnels.

15. Adénovirus selon la revendication 13 ou 14 caractérisé en ce qu'il sagit d'un adénovirus humain de type Ad 2 ou Ad 5 ou canin de type CAV-2.

16. Utilisation d'un adénovirus selon l'une des revendications 1 à 15 pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement et/ou à la prévention des maladies neurodégénératives.

17. Utilisation selon la revendication 16 pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement et/ou à la prévention de la maladie de Parkinson, d'Alzheimer, de Huntington ou de l'ALS.

18. Composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs adénovirus recombinants défectifs selon l'une des revendications 1 à 15.

19. Composition pharmaceutique selon la revendication 18 caractérisée en ce qu'elle est sous forme injectable.

20. Composition pharmaceutique selon la revendication 18 ou 19 caractérisée en ce qu'elle comprend entre 104 et 1014 pfu/ml, et de préférence 106 à 1010 pfu/ml adénovirus recombinants défectifs.

21. Cellule de mammifère infectée par un ou plusieurs adénovirus recombinants défectifs selon l'une des revendications 1 à 15.

22. Cellule selon la revendication 21 caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule humaine, choisie de préférence parmi les fibroblaste, myoblaste, hépatocyte, cellule endothéliale, cellule gliale et kératynocyte.

23. Implant comprenant des cellules infectées selon les revendications 21 à 22 et une matrice extracellulaire.

24. Implant selon la revendication 23 caractérisé en ce que la matrice extracellulaire comprend un composé gélifiant choisi de préférence parmi le collagène, la gélatine, les glycosaminoglycans, la fibronectine et les lectines.

25. Implant selon les revendications 23 ou 24 caractérisé en ce que la matrice extracellulaire comprend également un support permettant l'ancrage des cellules infectées.

26. Implant selon la revendication 25 caractérisé en ce que le support est constitué préférentiellement par des fibres de polytétrafluoroéthylène.