MX2013001181A - Formacion de complejos de acidos nucleicos con componentes cationicos entrelazados por disulfuro para transfeccion e inmunoestimulacion. - Google Patents

Formacion de complejos de acidos nucleicos con componentes cationicos entrelazados por disulfuro para transfeccion e inmunoestimulacion.

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Abstract

La presente invención está dirigida a un complejo de carga portador polimérico que comprende como una carga al menos un ácido nucleico (molécula) y componentes catiónicos entrelazados por disulfuro como un portador polimérico (de preferencia no tóxico y no inmunogénico). El complejo de carga portador polimérico de la invención permite tanto una transfección eficiente de ácidos nucleicos en células in vivo e in vitro y/o la inducción de una respuesta inmune (innata y/o adaptiva), de preferencia dependiente en el ácido nucleico que será transportado como una carga. La presente invención proporciona también composiciones farmacéuticas, particularmente vacunas y adyuvantes, que comprenden el complejo de carga portador polimérico de la invención y opcionalmente un antígeno, así como al uso de este complejo de carga portador polimérico de la invención y opcionalmente un antígeno para transfectar una célula, un tejido o un organismo, para propósitos terapéuticos (génicos) como los descritos aquí, y/o como un agente inmunoestimulador o adyuvante, por ejemplo, para provocar una respuesta inmune para el tratamiento o profilaxis de enfermedades como las mencionadas arriba. Finalmente, la invención se refiere a kits que contienen el complejo de carga portador polimérico de la invención y/o la composición farmacéutica, adyuvante o vacuna de la invención, en una o más partes del kit.

Description

FORMACIÓN DE COMPLEJOS DE ÁCIDOS NUCLEICOS CON COMPONENTES CATIÓNICOS ENTRELAZADOS POR DISULFURO PARA TRANSFECCIÓN E INMUNOESTIMULACIÓN DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención está dirigida a un complejo de carga portador polimérico, que comprende como una carga al menos una molécula de ácido nucleico y como un portador polimérico (de preferencia no tóxico y no inmunogénico) componentes catiónicos entrelazados por disulfuro . El complejo de carga portador polimérico de la invención permite tanto una transfección eficiente de ácidos nucleicos en células in vivo e in vitro como para la inducción de una respuesta inmune (innata y/o adaptiva), de preferencia dependiendo del ácido nucleico que se transportará como una carga. La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas, particularmente vacunas, que comprenden el complejo de carga portador polimérico de la invención y opcionalmente un antígeno, así como al uso del complejo de carga portador polimérico de la invención y opcionalmente un antígeno para transfectar una célula, un tejido o un organismo, para efectos terapéuticos (génicos) como los descritos aquí, y/o como un agente inmunoestimulador o adyuvante, por ej emplo, para provocar una respuesta inmune para el tratamiento o profilaxis de enfermedades como las mencionadas arriba. Finalmente, la invención se refiere a kits que contienen el complejo de carga portador polimérico de la invención, la composición farmacéutica de la invención y/o la vacuna de la invención o cualquiera de sus componentes en una o más partes del kit.
Muchas enfermedades actualmente requieren administración de adyuvantes para proporcionar una respuesta inmune innata y, opcionalmente, para soportar una respuesta inmune adaptiva, particularmente en el contexto de vacunas. Algunas pero no necesariamente todas de estas enfermedades como alternativa o además requieren administración de fármacos a base de péptidos, proteínas y ácidos nucleicos, por ejemplo, la transfección de ácidos nucleicos en células o tejidos. Estos requisitos normalmente representan aspectos diferentes en el tratamiento de estas enfermedades y son típicamente difíciles de resolver en un enfoque. Como consecuencia, la técnica anterior manej a normalmente sus aspectos por medio de enfoques separados.
En el contexto anterior, la vacunación se cree generalmente que es una de las formas más efectivas y económicas para prevenir o tratar enfermedades . No obstante varios problemas en el desarrollo de vacunas han probado ser difíciles de resolver: Las vacunas son comúnmente ineficientes para los muy jóvenes y los muy ancianos; muchas vacunas tienen que ser dadas varias veces, y la protección que confieren se desvanece con el tiempo, requiriendo de administraciones de refuerzo, y, para algunas enfermedades tales como VIH, el desarrollo de vacunas eficientes se requiere urgentemente. Como se acepta generalmente, muchas de estas vacunas serían habilitadas o mejoradas si pudieran provocar una respuesta inmune más potente y más duradera.
En consecuencia, el desarrollo de nuevos adyuvantes eficientes y seguros para efectos de vacunación que soporten la inducción y mantenimiento de una respuesta inmune adaptiva al iniciar o reforzar una respuesta inmune innata paralela representa un gran problema desafiante.
Los adyuvantes se definen normalmente como compuestos que pueden incrementar y/o modular la inmunogenicidad intrínseca de un antígeno . Para reducir efectos secundarios negativos, nuevas vacunas tienen una composición más definida que comúnmente lleva a inmunogenicidad más baj a en comparación con las vacunas a base de células enteras o virus previas. Se requieren por lo tanto adyuvantes para ayudar a nuevas vacunas a inducir respuestas inmunes potentes y persistentes, con el beneficio adicional de que se requieren menos antígenos y menos inyecciones. Ahora es claro que la respuesta inmune adaptiva depende principalmente del nivel y especificidad de las señales de peligro iniciales percibidas por las células inmunes innatas después de infección y vacunación (Guy, B . (2007), Nat Rev Microbiol 5(7) : 505- 1 7). En particular para candidatos a vacuna de nueva generación, los cuales comprenderán cada vez más proteínas recombinantes altamente purificadas y, aunque muy seguras, son deficientemente inmunogénicos, adyuvantes eficientes se volverán cada vez más necesarios.
Desafortunadamente, sólo pocos adyuvantes licenciados están disponibles hasta la fecha. El más prominente es el alumbre, el cual se sabe que es seguro, pero también representa un adyuvante muy débil. Muchos adyuvantes adicionales han sido desarrollados, por ej emplo, incluyendo la administración de patógenos, nucl eótidos CpG, etc. Muchos de estos adyuvantes nuevos o "establecidos", sin embargo, aún no satisfacen los requisitos anteriores, toda vez que muchos problemas nuevos y emergentes tienen que ser considerados y resueltos. Estos problemas incluyen entre otros enfermedades infecciosas nuevas y re-emergentes, administraciones repetidas, amenaza de gripe pandémica, etc.
Además, los nuevos obj etivos de vacuna normalmente son más difíciles de desarrollar y - debido a sus respuestas inmunes diseñadas específicamente - requieren adyuvantes más potentes para lograr éxito. Además, aún sigue habiendo un número significativo de patógenos importantes para los cuales ni siquiera tenemos vacunas efectivas actualmente. Esto representa un obj etivo futuro muy retador. Para hacer posible el desarrollo de vacunas contra estos obj etivos, serán necesarios adyuvantes más potentes. Estos nuevos adyuvantes tendrán que ofrecer ventaj as, incluyendo respuestas de anticuerpo más heterólogas, cobertura de la diversidad de patógenos, inducción de respuestas de anticuerpo funcionales potentes, aseguramiento de una eliminación o neutralización de patógenos e inducción de respuestas de células T más efectivas, para eliminación de patógenos directa e indirecta, particularmente la inducción de células T citotóxicas que son parte de una respuesta inmune Thl . Además, podrían ser necesarios adyuvantes para lograr efectos más pragmáticos, incluyendo reducción de dosis de antígenos y superar la competencia de antígenos en vacunas de combinación. Además, ya que el antecedente de una población cada vez más anciana, la cual es cada vez más susceptible a enfermedades infecciosas, nuevos adyuvantes serán necesarios para superar el deterioro natural de la respuesta inmune con la edad (O ' Hagan, D. T. y E. De Gregorio (2009), Drug Discov Today 14( 1 1 - 12): 541 -5 1 ).
La revisión de O ' Hagan (2009; citado arriba) resume algunas razones para la urgente necesidad de nuevos adyuvantes efectivos, por ej emplo, la necesidad de una dosis de antígeno más baj a en vacunas, la necesidad de incrementar el alcance de una respuesta inmune y la actividad heteróloga, de hacer posible vacunas de combinación complej as y de superar la competencia antigénica, de superar una respuesta inmune limitada en algunos grupos de la población, tales como los más ancianos, los niños jóvenes y bebés, pacientes con enfermedades crónicas y los inmunocomprometidos, de incrementar la respuesta de células T efectoras y títulos de anticuerpos, para producir respuestas protectoras más rápidamente y también para extender la duración de respuesta al incrementar las respuestas de células B y T de memoria.
Resumiendo lo anterior, nuevos agentes o adyuvantes inmunoestimuladores eficientes y seguros son necesarios, los cuales sean preferiblemente eficientes para inducir una respuesta inmune innata, particularmente para inducir la citocina antiviral IFN-alfa; los cuales sean, de preferencia, también eficientes para soportar una respuesta inmune adaptiva; seguros, es decir, no asociados con ningún efecto a largo plazo; los cuales sean bien tolerados; los cuales sean di sponibles por una vía sintética simple; los cuales exhiban condiciones de almacenamiento económicas (particularmente liofilización fehacible); los cuales requieran componentes simples y económicos; los cuales sean biodegradables; los cuales sean compatibles con muchos tipos diferentes de antígenos de vacuna; los cuales sean capaces del co-suministro de antígeno y potenciador inmune, etc.
Como ya se explicó arriba los adyuvantes o agentes inmunoestimuladores normalmente actúan por medio de su capacidad para inducir una respuesta inmune innata. El sistema inmunológico innato forma el sistema dominante de la defensa del anfitrión en muchos organismos y comprende barreras tales como barreras humorales y químicas que incluyen, por ej emplo, inflamación, el sistema de complemento y barreras celulares. El sistema inmune innato se basa típicamente en un pequeño número de receptores, llamados receptores de reconocimiento de patrones. Reconocen patrones moleculares conservados que distinguen a los organismos extraños, como virus, bacterias, hongos y parásitos, de células del anfitrión. Estos patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) incluyen ácidos nucleicos virales, componentes de paredes bacterianas y fúngicas, proteínas flagelares, y más. La primera familia de receptores de reconocimiento de patrones (receptores de PAMP) estudiada en detalle fue la familia del receptor tipo Toll (TLR). Las TLRs son proteínas de transmembrana que reconocen ligandos del medio extracelular o del lúmen de endosomas. Después de la unión a ligando transducen la señal por medio de proteínas adaptadoras citoplásmicas lo cual lleva al desencadenamiento de una respuesta de defensa del anfitrión e implica la producción de péptidos antimicrobianos, quimiocinas y citocinas proinflamatorias, citocinas antivirales, etc. (véase, por ejemplo, Meylan, E. , J. Tschopp, et al. (2006), Nature 442(7098) : 39-44). Componentes relevantes adicionales del sistema inmunológico incluyen, por ej emplo, las TLRs endosómicas, receptores citoplásmicos, interferones tipo 1 y receptores citoplásmicos. Por lo tanto, los agentes inmunoestimuladores o adyuvantes se definen en la presente de preferencia como inductores de una respuesta inmune innata, los cuales activan receptores de reconocimiento de patrones (receptores de PAMP). Aquí, e provoca una cascada de señales, las cuales pueden por ej emplo, dar como resultado la liberación de citocinas (por ejemplo, IFN-alfa) que soportan la respuesta inmune innata. En consecuencia, es de preferencia una característica de un agente inmunoestimulador o adyuvante unirse a estos receptores y activar estos receptores de PAMP . Idealmente, tal como un agente o adyuvante soporta adicionalmente la respuesta inmune adaptiva por ej emplo desplazar la respuesta inmune de tal manera que la clase preferida de células Th sea activada. Dependiendo de la enfermedad o trastorno que se tratará un desplazamiento a una respuesta inmune a base de Th l puede ser preferido o, en otros casos, se puede preferir un desplazamiento a una respuesta inmune Th2.
En la técnica anterior existen algunos candidatos adyuvantes promisorios que cumplen al menos algunas, pero no todas, de las características requeridas definidas arriba.
Como un ej emplo, entre los nuevos adyuvantes desarrollados anteriores, algunos ácidos nucleicos tales como oligonucleótidos de ADN CpG o ARNis (ARN inmunoestimulador) resultaron ser candidatos promisorios para nuevos agentes o adyuvantes inmunoestimuladores toda vez que permiten la inducción terapéutica o profiláctica de una respuesta inmune innata. De manera comprensible, estos adyuvantes a base de ácidos nucleicos normalmente tienen que ser suministrados en forma efectiva al sitio de acción para permitir la inducción de una respuesta inmune innata efectiva sin una pérdida innecesaria de actividad adyuvante y, en algunos casos, sin la necesidad de incrementar el volumen administrado por arriba de los niveles tolerados sistémicamente.
Un enfoque para resolver este aspecto puede ser la transfección de células que sean parte del sistema inmune innato (por ej emplo, células dendríticas, células dendríticas plasmocitoides (pDCs)) con ácidos nucleicos inmunoestimuladores, los cuales son ligandos de los receptores de PAMP (por ej emplo, receptores tipo Toll (TLRs)), y de esta manera pueden llevar a inmunoestimulación por el ligando de ácido nucleico. Enfoques adicionales pueden ser la transfeccion directa de adyuvantes a base de ácido nucleico . Todos estos enfoques, sin embargo, serán típicamente deteriorados por un suministro ineficiente del ácido nucleico y en consecuencia actividad adyuvante disminuida, en particular cuando se administran localmente.
Sin embargo, una desventaj a principal de estos enfoques adyuvantes a base de ácido nucleico hasta la fecha es su capacidad limitada para cruzar la membrana de plasma de células de mamíferos, dando como resultado acceso celular deficiente y eficacia terapéutica inadecuada. Hasta la fecha este obstáculo representa un gran reto para las aplicaciones a base de transfeccion de ácido nucleico, por ej emplo, desarrollos biomédicos y en consecuencia el éxito comercial de muchos biofarmacéuticos (véase, por ej emplo, Foerg, C . & Merkle, H.P. , J Pharm Sci 97, 144-62 (2008).
La transfeccion de ácidos nucleicos o genes en células o tejidos ha sido investigada hasta la fecha en el contexto de propósitos de transfeccion in vitro y en el contexto de enfoques terapéuticos génicos. Sin embargo, no hay disponibles hasta el momento adyuvantes que se basen en estas técnicas de suministro génico los cuales sean eficientes y seguros, en particular no hay adyuvantes licenciados. Esto se debe presuntamente a los complejos requerimientos de los adyuvantes en general en combinación con aspectos de estabilidad que tienen que ser resueltos en el caso de adyuvantes a base de ácido nucleico.
No obstante, la transfección de ácidos nucleicos o genes en células o tejidos para provocar una respuesta inmune (innata y/o adaptiva) parece proporcionar un enfoque promisorio para proporcionar nuevos adyuvantes.
Sin embargo, muchos de estos enfoques utilizan transfección de ácidos nucleicos o genes en células o tej idos sin inducción de una respuesta inmune innata. Hay incluso algunas terapias terapéuticas génicas, las cuales tienen que evitar estrictamente la inducción de una respuesta inmune innata. Incluso en casos raros, en donde la vacunaci ón se lleva a cabo para inducir una respuesta inmune específica de antígeno adaptiva usando administración de ácidos nucleicos, por ej emplo, en vacunaciones de tumores usando antígenos codificados por ADN o ARNm, la inducción de una respuesta inmune adaptiva se lleva a cabo típicamente como una inmunización activa contra el antígeno codificado pero no como una terapia adyuvante acompañante y requiere entonces administración adicional de un adyuvante separado para inducir una respuesta inmune innata.
Incluso si demasiados métodos de transfección se conocen en la técnica, la transferencia o inserción de ácidos nucleicos o genes en las células de un individuo representa aún un gran reto actualmente y aún no se ha resuelto de manera satisfactoria. Para resolver este aspecto complejo se desarrollaron una variedad de métodos en la última década. Estos incluyen transfección por fosfato de calcio, lípidos catiónicos, polímeros catiónicos y liposomas. Los métodos adicionales para la transfección son electroporación y transducción viral.
Sin embargo, como se sabe por una persona capacitada, los sistemas para transferencia o inserción de ácidos nucleicos o genes tienen que cumplir varios requisitos para aplicaciones in vivo que incluyen un suministro eficiente de ácido nucleico en las células de un individuo con alta funcionalidad, protección del ácido nucleico contra nucleasas que se presentan ubicuamente, liberación del ácido nucleico en la célula, ninguna preocupación de seguridad, fabricación posible en una forma comercialmente aceptable disponible a una escala en ascenso y estabilidad baj o almacenamiento en condiciones de bajo costo (por ejemplo, liofilización viable) . Estos requisitos tienen que ser añadidos a los complejos requerimientos de un adyuvante particularmente si está en forma de un ácido nucleico como se delineó arriba.
Algunas estrategias exitosas para la transferencia o inserción de ácidos nucleicos o genes disponibles actualmente se basan en el uso de vectores virales, tales como adenovirus, virus adeno-asociados, retrovirus y virus del herpes. Los vectores virales son capaces de mediar la transferencia génica con alta eficiencia y la posibilidad de una expresión génica a largo plazo. Sin embargo, la respuesta inmune aguda ("tormenta de citocinas"), inmunogenicidad y mutagénesis de inserción descubierta en las pruebas clínicas de terapia génica han creado serias preocupaciones de seguridad acerca de algunos vectores virales usados comúnmente.
Otra solución para el problema de la transferencia o inserción de ácidos nucleicos o genes puede encontrarse en el uso de vectores no virales. Aunque los vectores no virales no son tan eficientes como los vectores virales, muchos vectores no virales han sido desarrollados para proporcionar una alternativa más segura. Los métodos de suministro de ácido nucleico no viral han sido explorados usando enfoques físicos (suministro de ácido nucleico libre de portadores) y químicos (suministro de ácido nucleico a base de vectores sintéticos) . Los enfoques físicos normalmente incluyen inyección con aguj a, electroporación, pistola génica, ultrasonido y suministro hidrodinámico, emplean una fuerza física que permea la membrana celular y facilita la transferencia génica intracelular. Los enfoques químicos usan típicamente compuestos sintéticos o naturales (por ej emplo, lípidos catiónicos, polímeros catiónicos, sistemas híbridos de polímeros lípidos) como portadores para suministrar el ácido nucleico a las células. Aunque se ha hecho progreso significativo en la ciencia básica y aplicaciones de varios sistemas de suministro de ácido nucleico no virales, la mayoría de los enfoques no virales, la mayoría de los enfoques no virales aún son mucho menos eficientes que los vectores virales, especialmente para suministro génico in vivo (véase, por ejemplo, Gao, X. , Kim, K. & Liu, D. , AAPSJ9, E92- 1 04 (2007)).
Estos agentes de transfección como los definidos arriba se han usado típicamente de manera exitosa únicamente en reacciones in vitro. Para la aplicación de ácidos nucleicos in vivo, sin embargo, se tiene que cumplir requisitos adicionales. Por ej emplo, los complej os entre ácidos nucleicos y agentes de transfección tienen que ser estables en soluciones salinas fisiológicas con respecto a aglomeración. Además, estos complejos típicamente no deben interactuar con partes del sistema de complemento del anfitrión y entonces no deben ser a su vez inmunogénicos ya que el propio portador no deberá inducir una respuesta inmune adaptiva en el individuo. Además, el complej o deberá proteger al ácido nuclei co contra degradación extracelular prematura por nucleasas que se presentan de manera ubicua.
Hay en la técnica muchos reactivos de transfección disponibles, especialmente lípidos catiónicos, los cuales muestran excelente actividad de transfección en cultivo celular. Sin embargo, la mayoría de estos reactivos de transfección no se desempeñan bien en presencia de suero, y sólo pocos son activos in vivo. Un dramático cambio en tamaño, carga superficial y composición de lípidos se presentan cuando los lipoplejos son expuestos a la avasalladora cantidad de proteínas negativamente cargadas y comúnmente anfifáticas y polisacáridos que están presentes en sangre, moco, fluido de revestimiento epitelial o matriz tisular. Una vez administrados in vivo, los lipoplejos tienden a interactuar con componentes sanguíneos cargados negativamente y formar grandes agregados que podrían ser absorbidos sobre la superficie de los glóbulos rojos circulantes, atrapados en una capa de moco espesa, o embolizados en microvasculaturas, impidiéndoles alcanzar las células obj etivo deseadas en la ubicación distal . Algunos incluso sufren disolución después de que son introducidos en la circulación sanguínea (véase, por ejemplo, Gao, X. , Kim, K. & Liu, D. , AAPSJ9, E92- 1 04 (2007)).
Un enfoque más promisorio utiliza polímeros catiónicos. Los polímeros catiónicos resultaron ser eficientes en la transfección de ácidos nucleicos, toda vez que pueden acomplej arse estrechamente y condensar un ácido nucleico cargado negativamente. Así, un número de polímeros catiónicos han sido explorados como portadores para suministro génico in vitro e in vivo . Estos incluyen polietilenimina (PEI), poliamidoamina y dendrímeros de polipropilamina, polialilamina, dextrano catiónico, quitosan, proteínas catiónicas y péptidos catiónicos. Aunque la mayoría de los polímeros catiónicos comparten la función de condensar ADN en partículas pequeñas y facilitar la absorción celular por medio de endocitosis a través de interacción carga-carga con sitios amónicos sobre superficies celulares, su actividad de transfección y toxicidad difiere dramáticamente.
Sólo en un enfoque en la técnica, el efecto inmunoestimulador de ARN acomplejado con péptidos catiónicos cortos fue demostrado por fotin-Mleczek et al. (WO 2009/03048 1 ). Estas formulaciones parecen inducir eficientemente la producción de citocinas en células inmunocompetentes. Desafortunadamente Fotin-Mleczek et al. no evaluaron la inducción de la citocina anti-viral IFN-a preferible por estos complejos. Además, estos complejos resultaron ser inestables durante liofilización.
En el contexto anterior, los polímeros catiónicos exhiben mej or eficiencia de transfección con peso molecular cada vez más alto. Sin embargo, un peso molecular cada vez más alto lleva también a una toxicidad cada vez más alta del polímero catiónico . En este contexto anterior, PEI (de alto peso molecular) es tal vez el polímero más activo y más estudiado para transfección de ácidos nucleicos, en particular para propósitos de suministro génico. Desafortunadamente, exhibe l a misma desventaja debido a su naturaleza no biodegradable y toxicidad. Además, incluso a pesar de que los poliplej os formados por polímeros de alto peso molecular exhiben estabilidad mejorada bajo condiciones fisiológicas, los datos han indicado que estos polímeros pueden impedir el desempaque de vectores. Para superar este impacto negativo, Read et al. (véase Read, M. L. et al. , J Gene Med. 5, 232-245 (2003); y Read, M. L. et al. , Nucleic Acids Res 33 , e86 (2005)) desarrollaron un nuevo tipo de vector sintético a base de un policatión reducible lineal (RPC) preparado mediante policondensación oxidante del péptido Cys-Lys i 0-Cys. Este péptido Cys-Lysi 0-Cys puede sr cortado por el ambiente intracelular para facilitar liberación de ácidos nucleicos. En este contexto, Read et al. (2003 , citado arriba) podrían demostrar que los poliplejos formados por estos RPCs son desestabilizados al reducir las condiciones que hacen posible una liberación eficiente de ADN y ARNm. Sin embargo, al examinar la eficiencia de transmisión in vitro Read et al. (2003 , citado arriba) también observaron que las relaciones N/P (átomos de nitrógeno a fósforo) de 2 fueron no satisfactorias y relaciones N/P más altas fueron necesarias para mejorar la eficiencia de transfección. Además, Read et al. (2003 , citado arriba) observaron que la cloroquina o el lípido catiónico DOTAP fue además necesario para incrementar la eficiencia de transfección a niveles adecuados. Como una consecuencia, Read et al. (2005, citado arriba) incluyeron residuos de histidina en los RPCs que tienen una capacidad de regulación endosómica conocida y demostraron que estos RPCs ricos en histidina pueden ser cortados por el ambiente reductor intracelular. Este enfoque hizo posible un suministro citoplásmico eficiente de una amplia variedad de ácidos nucleicos, incluyendo ADN plasmídico, ARNm y moléculas de ARNsi sin la necesidad del agente endosomolítico cloroquina.
Desafortunadamente, ni Read et al. (2003 , citado arriba) ni Read et al. (2005 , citado arriba) evaluaron en cuanto a si los RPCs pueden usarse directamente para aplicaciones in vivo . En su estudio en 2005, se llevaron a cabo transfecciones en ausencia de suero para evitar enmascarar la capacidad de los residuos de histidina para incrementar la transferencia génica que pudiera haberse originado a partir de la unión de proteínas de suero a poliplejos que restringen la absorción celular. No obstante, los experimentos preliminares indicaron que las propiedades de transfección de los poliplej os de RPC ricos en histidina pueden ser afectadas por la presencia de proteínas séricas con una reducción del 50% en células positivas para GFP observada en 1 0% de FCS . Para aplicación in vivo Read et al. (2005, citado arriba) propusieron modificaciones con el polímero hidrófilo poli-[N-(2-hidroxi-propil)metacrilamida] . Desafortunadamente, no pudieron impedir la agregación de poliplejos y la unión de complejos policatiónicos a proteínas séricas. Además, fuertes complejos cargados catiónicos se forman (potencial zeta positivo) cuando se crean complejos del ácido nucleico debido al gran exceso de polímero catiónico, el cual se caracteriza por la alta relación N/P . En consecuencia, estos complejos sólo son de uso limitado in vivo debido a su fuerte tendencia de aglomeración inducida por sal e interacciones con contenido de suero (opsonización). Además, estos complej os (cargados positivamente) pueden excitar una activación de complemento, cuando se usen para propósitos de terapia génica. También ha resultado que estos complejos a base de RPC cargados positivamente mostraron reducción deficiente de la carga de ácido nucleico después de la administración local en la dermis.
En un enfoque similar al de Read et al., McKenzie et al. (McKenzie, D. L. , . Y. wok, et al. (2000), J Biol Chem 275( 14) : 9970-7 y McKenzie, D. L. , E. Smiley, et al. (2000), Bioconjug Chem 1 1 (6) : 901 -9) desarrollaron péptidos de entrelazamiento como agentes de suministro génico al insertar varias cisteínas en péptidos sintéticos cortos. En sus estudios examinaron la formación de complej os óptima con ADN y como resultado pudieron demostrar que una relación N/P de al menos 2 es necesaria para condensados de ADN de péptidos completamente formados. Por lo tanto sólo los complejos cargados positivamente parecieron mostrar una condensación de ADN óptima. En contraste con estos datos propusieron el desarrollo de complejos cargados negativamente para suministro génico in vivo, toda vez que se demostró en estudios anteriores que la aplicación intravenosa de condensados de AD N electropositivos lleva a una rápida opsonización y biodistribución no específica al pulmón e hígado (Collard, W. T. , Evers, D. L. , McKenzie, D. L. , y Rice, K. G. (2000), Carbohydr. Res. 323 , 1 76- 1 84). Por lo tanto McKenzie et al. (2000; citado arriba) propusieron la derivación de los portadores con polietilenglicol y ligandos de dirección. Cabe mencionar el enfoque de McKenzie et al. (2000; citado arriba) es adicionalmente obj eto de una patente (US 6, 770,740 B l ) que describe particularmente la transfección de ácidos nucleicos de codificación, ácidos nucleicos antisentido y ribozimas.
Así, la aplicación in vivo de ácidos nucleicos parece ser aún uno de los problemas más retadores debido a que las proteínas plasmáticas con cargas aniónicas pueden unirse no específicamente a complejos cargados positivamente y eliminarlos rápidamente, por ejemplo, por medio del sistema reticuloendotelial. La opsonización y activación del sistema de complemento por complejos catiónicos son fenómenos fisiológicos adicionales que pueden participar en reducir la eficacia de complej os catiónicos administrados in vivo. Esto aplica particularmente a la administración de fármacos a base de ácido nucleico, por ejemplo, se intenta la transfección de ácidos nucleicos en células o tej idos, particularmente si la expresión de una proteína o péptido codificado o la transcripción de un ARN del ácido nucleico transfectado.
Resumiendo lo anterior, la técnica anterior no proporciona medios o métodos viables que, por un lado, permitan establecer adyuvantes eficientes y seguros para propósitos de vacunación, y los cuales, por el otro lado, sean además adecuados para suministro in vivo de ácidos nucleicos, en particular para compactar y estabilizar un ácido nucleico para efectos de transfección de ácido nucleico in vivo sin exhibir los efectos secundarios negativos como los descritos arriba. En forma más precisa, no se conocen medios o métodos en la técnica anterior en el contexto anterior, los cuales sean, por un lado, lo suficientemente estables para llevar una carga de ácido nucleico al obj etivo antes de que sean cortados metabólicamente, y los cuales, por el otro lado, puedan ser depurados del tej ido antes de que puedan acumularse y alcanzar niveles tóxicos. Además, no se conocen medios o métodos que, además de los requisitos anteriores, induzcan un patrón deseable de citocinas, particularmente la citocina antiviral IFN- Q!.
En consecuencia, el objetivo de la presente invención es proporcionar estos medios o métodos, los cuales resuelvan estos problemas.
El obj etivo debajo de la presente invención es resuelto por la materia de la presente invención, de preferencia por la materia de las reivindicaciones anexas.
De acuerdo con una primera modalidad, el objeto debaj o de la presente invención es resuelto por un complejo de carga portador polimérico que comprende: a) (como un portador) un portador polimérico formado por componentes catiónicos entrelazados por disulfuro, y b) (como una carga) al menos un ácido nucleico (molécula), de preferencia para usarse como un medicamento, muy preferiblemente para usarse como un agente inmunoestimulador o adyuvante, por ej emplo, en el tratamiento de una enfermedad como la definida en la presente.
Como alternativa, el objeto debajo de la presente invención es resuelto por un complejo de carga polimérico portador que consi ste en a) un portador polimérico formado por componentes catiónicos entrelazados por disulfuro (como un portador), y b) al menos un ácido nucleico (molécula) (como una carga), de preferencia para usarse como un medicamento, muy preferiblemente para usarse como un agente inmunoestimulador o adyuvante, por ej emplo, en el tratamiento de una enfermedad como la definida en la presente.
El término "agente inmunoestimulador" se entiende típicamente que no incluye agentes como por ejemplo antígenos (de cualquier estructura química), que provoquen una respuesta inmune adaptiva/citotóxica, por ej emplo, una respuesta inmune "humoral" o "celular", en otras palabras provoque respuestas inmunes (y confiere inmunidad por ellos mismos) que se caracteriza por una respuesta específica a propiedades estructurales de un antígeno reconocido como extraño por las células competentes inmunes.
Más bien, por "agente inmunoestimulador", se entiende típicamente que significa agentes/compuestos/complejos que no desencadenan ninguna respuesta inmune adaptiva/citotóxica por ellos mismos, pero los cuales pueden incrementar exclusivamente esta respuesta inmune adaptiva/citotóxica de una manera no específica, al por ej emplo activar receptores de "PAMP" y de esta manera desencadenar la liberación de citocinas que soporten la respuesta inmune adaptiva/citotóxica real . En consecuencia, cualquier inmunoestimulación por agentes (por ej emplo, antígenos) que evoquen una respuesta inmune adaptiva y/o citotóxica por ellos mismos (que confiere inmunidad por ellos mismos directa o indirectamente) es típicamente no contemplada por la frase "agente inmunoestimulador".
El término "adyuvante" también se entiende que no comprende agentes que confieren inmunidad por ellos mismos. En consecuencia, los adyuvantes no confieren por ellos mismos inmunidad, sino que ayudan al sistema inmunológico de varias maneras para incrementar la respuesta inmune específica de antígenos al, por ej emplo, promover la presentación de un antígeno al sistema inmunológico. De esta manera, un adyuvante puede por ej emplo de preferencia modular la respuesta inmune específica de antígeno al por ej emplo desplazar la respuesta especí fica de antígeno a base de Th l dominante a una respuesta específica de antígeno más a base de Th2 o viceversa. En consecuencia, los términos "agente inmunoestimulador" y "adyuvante" en el contexto de la presente invención se entiende típicamente que significan agentes, compuestos o complej os que no confieren inmunidad por ellos mismos, sino que exclusivamente soportan la respuesta inmune de una manera no específica (en contraste con una respuesta inmune específica de antígeno) por efectos que modulan la respuesta específica de antígeno (respuesta inmune celular y/o humoral adaptiva) por medidas no específicas, por ejemplo, expresión/secreción de citocinas, presentación de antígenos mejorada, desplazamiento de la naturaleza de los brazos de la respuesta inmune, etc. En consecuencia, cualquier agente que evoque por ellos mismos inmunidad son típicamente no contemplados por los términos "adyuvante" o "agente inmunoestimulador".
El complejo de carga portador polimérico de la invención permite la provisión de adyuvantes eficientes y seguros para propósitos de vacunación y portadores para transfeccion, ya sea en el campo de vacunación, terapia adyuvante o aplicaciones terapéuticas génicas, etc. Adecuadamente, el complejo de carga portador polimérico de la invención es adecuado para el suministro in vivo de ácidos nucleicos, en particular para compactar y estabilizar un ácido nucleico para los efectos de transfeccion de ácido nucleico sin exhibir los efectos secundarios negativos de polímeros de alto peso molecular como los descritos arriba, de tal manera que ninguna biodegradabilidad o incluso alta toxicidad, aglomeración, baj a actividad de transfeccion in vivo, etc. El complej o de carga portador polimérico de la invención proporciona también una transferencia de ácido nucleico in vivo eficiente particularmente por medio de rutas intradérmica o intramuscular, incluyendo estabilidad en suero, estabilidad en sal, absorción eficiente, sin activación de complemento, liberación de ácido nucleico, etc. Este complejo de carga portador polimérico de la invención, cuando es provisto como un adyuvante, soporta además la inducción y mantenimiento de una respuesta inmune adaptiva al iniciar o reforzar una respuesta inmune innata paralela. Además, el complejo de carga portador polimérico de la invención exhibe excelente estabilidad de almacenamiento, particularmente durante liofilización.
El complejo de carga portador polimérico de la invención como el definido arriba comprende como un componente un portador polimérico formado por componentes catiónicos entrelazados por disulfuro. El término "componente catiónico" se refiere típicamente a una molécula cargada, la cual se carga positivamente (catión) a un valor de pH de aproximadamente 1 a 9, de preferencia a un valor de pH de o debajo de 9, o debajo de 8, de o debajo de 7, muy preferiblemente a valores de pH fisiológicos, por ejemplo, alrededor de 7.3 a 7.4. En consecuencia, un péptido, proteína o polímero catiónico de acuerdo con la presente invención se carga positivamente bajo condiciones fisiológicas, particularmente bajo condiciones salinas fisiológicas de la célula in vivo. La definición "catiónico" también se puede referir a componentes "policatiónicos" .
En este contexto los componentes catiónicos, los cuales forman la base del portador polimérico del complejo de carga portador polimérico de la invención por entrelazamiento de disulfuro, se seleccionan típicamente de cualquier péptido, proteína o polímero catiónico o policatiónico adecuado para este propósito, particularmente cualquier péptido, proteína o polímero catiónico o policatiónico capaz de formar un complejo con un ácido nucleico como se define de acuerdo con la presente invención, y de esta manera condensar de preferencia el ácido nucleico . El péptido, proteína o polímero catiónico o policatiónico es de preferencia una molécula lineal, sin embargo, también se pueden usar péptidos, proteínas o polímeros catiónicos o policatiónicos ramificados.
Cada proteína, péptido o polímero catiónico o policatiónico del portador polimérico contiene al menos una porción -SH, muy preferiblemente al menos un residuo de cisteína o cualquier grupo químico adicional que exhiba una porción -SH, capaz de formar un enlace de disulfuro después de la condensación con por lo menos una proteína, péptido o polímero catiónico o policatiónico adicional como componente catiónico del portador polimérico como el mencionado aquí .
Cada proteína, péptido o polímero catiónico, policatiónico o cualquier componente adicional del portador polimérico se enlaza de preferencia a sus componentes adyacentes (proteínas, péptido, polímeros catiónicos u otros componentes) por medio de entrelazamiento de disulfuro. De preferencia, el entrelazamiento por disulfuro es un enlace de disulfuro (reversible) (-S-S-) entre al menos una proteína, péptido o polímero catiónico o policatiónico y al menos una proteína, péptido o polímero catiónico o policatiónico adicional u otro componente del portador polimérico. El entrelazamiento por disulfuro se forma típicamente por condensación de porciones -SH de los componentes del portador polimérico particularmente de los componentes catiónicos. Esta porción -SH puede ser parte de la estructura de la proteína, péptido o polímero catiónico o policatiónico o cualquier componente adicional del portador polimérico antes del entrelazamiento por disulfuro o se puede añadir antes del entrelazamiento por disulfuro mediante una modificación como la definida abajo . En este contexto, los azufres adyacentes a un componente del portador polimérico, necesarios para proporcionar un enlace de disulfuro, pueden ser provistos por el propio componente, por ej emplo, por una porción -SH como la definida aquí o se pueden proporcionar al modificar el componente en consecuencia para exhibir una porción -SH. Estas porciones -SH se proporcionan típicamente por cada uno de los componentes, por ej emplo, por medio de una cisteína o cualquier aminoácidos (modificado) adicional o compuesto del componente, que porte una porción -SH. En caso de que el componente catiónico o cualquier componente adicional del portador polimérico sea un péptido o proteína, se prefiere que la porción -SH sea provista por al menos un residuo de cisteína. Como alternativa, el componente del portador polimérico puede ser modificado en consecuencia con una porción -SH, de preferencia por medio de una reacción química con un compuesto que porte una porción -SH, de tal manera que cada uno de los componentes del portador polimérico porte al menos una de estas porciones -SH. Este compuesto que porte una porción -SH puede ser, por ejemplo, una cisteína (adicional) o cualquier aminoácido (modificado) adicional o compuesto del componente del portador polimérico, que porte una porción -SH. Este compuesto puede ser también cualquier compuesto o porción no amino, que contenga o permita introducir una porción -SH en el componente como el definido aquí. Estos compuestos no amino pueden ser fij ados al componente del portador polimérico de acuerdo con la presente invención por medio de reacciones químicas o unión de compuestos, por ej emplo, por la unión de un ácido 3-tiopropiónico o 2-iminotiolano (reactivo de Traut), por formación de amida (por ejemplo, ácidos carboxílicos, ácidos sulfónicos, aminas, etc.), por adición de Michael (por ej emplo, porciones de maleinimida, carbonilos ,ß insaturados, etc.), por química simplificada (por ej emplo, azidas o alquinos), por metátesis de alqueno/alquinos (por ej emplo, alquenos o alquinos), formación de imina o hidrazona (aldehidos o cetonas, hidrazinas, hidroxilaminas, aminas), reacciones de formación de complej os (avidina, biotina, proteína G) o componentes que permitan reacciones de sustitución tipo Sn (por ej emplo, halogenalcanos, tioles, alcoholes, aminas, hidrazinas, hidrazidas, ésteres de ácido sulfónico, sales de oxifosfonio) u otras porciones químicas que pueden utilizarse en la fij ación de componentes adicionales. En algunos casos la porción -SH puede ser enmascarada por grupos protectores durante la fijación química al componente. Estos grupos protectores se conocen en la técnica y pueden ser eliminados después del acoplamiento químico. En cada caso, la porción -SH, por ej emplo, de una cisteína o cualquier aminoácido o compuesto (modificado) adicional, puede estar presente en los extremos terminales o internamente en cualquier posición del componente del portador polimérico. Como se define aquí, cada uno de los componentes del portador polimérico exhibe típicamente al menos una porción -SH, pero también puede contener dos, tres, cuatro, cinco o incluso más porciones -SH . Además de la unión de componentes catiónicos, se puede usar una porción -SH para fij ar componentes adicionales del portador polimérico como el definido aquí, particularmente un componente de aminoácido, por ej emplo, epítopos de antígeno, antígenos, anticuerpos, péptidos penetradores de células (por ej emplo, TAT), ligandos, etc.
Como se definió arriba, el portador polimérico de la molécula de carga portadora polimérica de la invención se forma por componentes catiónicos (o policatiónicos) entrelazados por disulfuro.
De acuerdo con una primera alterantiva, al menos un componente catiónico (o policatiónico) del portador polimérico se puede seleccionar de péptidos o proteínas catiónicos o policatiónicos. Estos péptidos o proteínas catiónicos o policatiónicos exhiben de preferencia una longitud de aproximadamente 3 a 100 aminoácidos, de preferencia una longitud de alrededor de 3 a 50 aminoácidos, muy preferiblemente una longitud de alrededor de 3 a 25 aminoácidos, por ej emplo, una longitud de aproximadamente 3 a 10; 5 a 20; 5 a 1 5 ; 8 a 15 ; 1 6 ó 17; 1 0 a 15 ; 1 6, 1 7, 18 , 1 9 ó 20; o 1 5 a 25 aminoácidos. Como alternativa o además, estos péptidos o proteínas catiónicos o policatiónicos pueden exhibir un peso molecular de aproximadamente 0.01 kDa a alrededor de 1 00 kDa, incluyendo un peso molecular de aproximadamente 0.5 kDa a alrededor de 100 kDa, de preferencia de aproximadamente 10 kDa a alrededor de 50 kDa, aún más preferiblemente de alrededor de 1 0 kDa a aproximadamente 30 kDa.
En el caso específico de que el componente catiónico del portador polimérico comprenda un péptido o proteína catiónico o policatiónico, las propiedades catiónicas del péptido o proteína catiónico o policatiónico o del portador polimérico completo, si el portador polimérico está compuesto completamente de péptidos o proteínas catiónicos o policatiónicos, se pueden determinar según su contenido de aminoácidos catiónicos. De preferencia, el contenido de aminoácidos catiónicos en el péptido o proteína catiónico o policatiónico y/o el portador polimérico es de al menos 10%, 20% o 30%, de preferencia al menos 40%, muy preferiblemente al menos 50%, 60% o 70%, pero también preferiblemente por lo menos 80%, 90%, o incluso 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%, más preferiblemente al menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95 %, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%, o puede estar en el intervalo de aproximadamente 1 0% a 90%, muy preferiblemente en el intervalo de alrededor de 15% a 75%, más preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 20% a 50%, por ej emplo, 20, 30, 40 ó 50%, o en un intervalo formado por cualesquiera dos de los valores mencionados arriba, siempre y cuando el contenido de todos los aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos catiónicos, lipófilos, hidrófilos, aromáticos y más, en el péptido o proteína catiónico o policatiónico, o en el portador polimérico completo, si el portador polimérico está compuesto completamente de péptidos o proteínas catiónicos o policatiónicos, sea de 100%.
En este contexto, los aminoácidos catiónicos son de preferencia los aminoácidos naturales Arg (Arginina), Lys (lisina), His (histidina, y Orn (Ornitina). Sin embargo, en un sentido más amplio cualquier aminoácido (no natural) que porte una carga catiónica sobre su cadena lateral también se puede contemplar para llevar a cabo la invención. De preferencia, sin embargo, son aquellos aminoácidos catiónicos, cuyas cadenas laterales son cargadas positivamente bajo condiciones de pH fisiológicas. En una modalidad más preferida, estos aminoácidos son Arg, Lys y Orn.
De preferencia, estos péptidos o proteínas catiónicos o policatiónicos del portador polimérico que comprenden o son modificados adicionalmente para comprender al menos una porción -SH, se seleccionan de, sin estar restringidos a éstos, péptidos o proteínas catiónicos tales como protamina, nucleolina, espermina o espermidina, oligo- o poli-L-lisina (PLL), polipéptidos básicos, oligo o poli-arginina, péptidos penetradores de células (CPPs), CPPs quiméricos tales como Transportan, o péptidos MPG, péptidos de unión a VIH, Tat, Tat de VIH- 1 (VIH), péptidos derivados de Tat, miembros de la familia penetratina, por ej emplo, penetratina, péptidos derivados de antenapedia (particularmente de Drosophila antennapedia), pAntp, plsl, etc., CCPs derivados de antimicrobianos, por ej emplo, Buforin-2, Bac715-24, SynB, SynB(l), pVEC, péptidos derivados de hCT, SAP, MAP, KALA, PpTG20, Loligomere, FGF, Lactoferrina, histonas, péptidos derivados de VP22 o análogos, HSV, VP22 (herpes simple), MAP, KALA o dominios de transducción de proteínas (PTDs, PpT620, péptidos ricos en prolina, péptidos ricos en arginina, péptidos ricos en lisina, Pep-1, L-oligómeros, péptidos de calcitonina, etc.
Como alternativa o además, estos péptidos o proteínas catiónicos o policatiónicos del portador polimérico que comprenden o son modificados adicionalmente para comprender al menos una porción -SH, se seleccionan de, sin estar restringidos a los mismos, los siguientes péptidos catiónicos que tienen la siguiente fórmula de suma (I): {(Arg)i;(Lys)m;(His)n;(Orn)0;(Xaa)x}; en donde l + m + n + o + x = 3-100, y 1, m, n u o, o independientemente unos de otros son cualquier número seleccionado de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21-30, 31-40, 41-50, 51-60, 61-70, 71-80, 81-90 y 91-100 siempre que el contenido total de Arg (Arginina), Lys (Lisina), His (Histidina) y Orn (Ornitina) represente al menos 10% de todos los aminoácidos del oligopéptido; y Xaa es cualquier aminoácido seleccionado de aminoácidos nativos (es decir, naturales) o no nativos excepto de Arg, Lys, His u Orn; y x es cualquier número seleccionado de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21-30, 31- 40, 41-50, 51-60, 61-70, 71-80, 81-90, siempre y cuando el contenido total de Xaa no exceda 90% de todos los aminoácidos del oligopéptido. Cualquiera de los aminoácidos Arg, Lys, His, Orn y Xaa puede ser colocado en cualquier lugar del péptido. En este contexto, se prefiere particularmente los péptidos o proteínas catiónicos en el intervalo de 7-30 aminoácidos. Los péptidos de esta fórmula que se refieren todavía más son oligoargininas tales como, por ejemplo, Arg7, Arg8, Arg9, Arg]2, His3Arg9, Arg9His3, His3Arg9His3, His6Arg9His6, His3Arg4His3, His6Arg4His6, TyrSer2Arg9Ser2Tyr, (ArgLysHis)4, Tyr(ArgLysHis)2Arg, etc. de acuerdo con una modalidad preferida particular, estos péptidos o proteínas catiónicos o policatiónicos del portador polimérico que tienen la fórmula de suma empírica (I) como la mostrada arriba, pueden, sin estar restringidos a los mismos, comprender por lo menos uno del siguiente subgrupo de fórmulas: Arg7, Arg8, Arg9, Arg10, Arg,,, Argi2, Arg]3, Arg14, Argi5-30; Lys7, Lys8, Lys9, Lysio, Lysn, Lysi2, Lysi3, Lysi4, Lysi5-30; His7, His8, His9, His10, Hisu, Hisi2, His)3, Hisi4, Hisi5-3o; Orn7, Orn8, Orn9, Orni0, Ornn, Orni2, Orni3, Ornu, Orni5-3o; De acuerdo con una modalidad preferida particularmente y adicional, los péptidos o proteínas catiónicos o policatiónicos del portador polimérico que tienen la fórmula de suma empírica (I) como la mostrada arriba y que comprenden o son modificadas adicionalmente para comprender al menos una porción -SH, se pueden seleccionar preferiblemente de, sin estar restringidos a los mismos, al menos uno del siguiente subgrupo de fórmulas. Las siguientes fórmulas (al igual que con la fórmula empírica (I)) no especifica ningún orden de aminoácido, sino que intentan reflej ar fórmulas empíricas al especificar exclusivamente el (número de) aminoácidos como componentes del péptido respectivo. En consecuencia, como un ej emplo, la fórmula empírica Arg( 7.29)Lys, intenta significar que los péptidos que estén dentro de esta fórmula contienen 7 a 1 9 residuos de Arg y 1 residuo de Lys de cualquier orden. Si los péptidos contienen 7 residuos de Arg y 1 residuo de Lys, todas las variantes que tengan 7 residuos de Arg y 1 residuo de Lys son abarcadas. El residuo de Lys puede por lo tanto ser colocado en cualquier lado en la secuencia de por ej emplo 8 aminoácidos de largo compuesta de 7 residuos de Arg y 1 de Lys. El subgrupo comprende de preferencia: Arg(4-29)Lysi, Arg(4.29)His1, ?¾4-290p??, Lys^.^His!, Lys(4-29)Orni, His(4-29)Orni, Arg(3-28)Lys2, Arg(3-28)HÍS2, Arg 3-28)Orn2, Lys(3-28)His2, Lys(3-28)Orn2, His(3-28)Orn2, Arg(2-27)Lys3, Arg(2-27)His3, Arg(2-27)Orn3, Lys(2-27)His3, Lys(2-27)Orn3, His(2-27)Orn3, Arg(i-26)Lys4, Arg(i.26)His4, Arg( 1 -26)Orn4, Lys(1-26)His4, Lys(1-26)Orn4, His^^On^, Arg(3-28)LysiHisi, Arg^.^LysiOrn!, Arg(3-28)HisiOrni, ArgjLys^^Hisi, Arg!Lysp^Orn,, Lys(3-28)HisiOrni, ArgiLysiHis(3-28), ArgiHist ^On !, Lys1His(3-28)Orni; Ar¾2-27)Lys2Hisi, Arg(2-27)LysiHis2, Arg(2-27)Lys20rn1, Ar¾2.27)LysiOrn2, Arg(2.27)His20rni, Arg(2-27)HisiOrn2, Arg2Lys(2-27)Hisi, Arg1Lys(2-27)His2, Arg2Lys(2-27)Orni, ArgiLys(2-27)Orn2, LyS(2-27)HiS20rn] , LyS(2-27)HisiOrn2, Arg2Lys1His(2-27), ArgiLys2His(2.27), A^His^ rni, ArgiHis(2-27)Om2, Lys2His(2-27)Orni, Lys1His(2-27)Orn2; Ar¾i-26)Lys3Hisi, Arg(1-26)Lys2His2, Arg i-26)LysiHis3, Arg(i.26)Lys30rni, Arg(1.26)Lys20m2, Arg^^LysiOn ,, Ar¾1-26)His30rni, Argd.26)His20rn2, Arg(i-26)HisiOrn3, Arg3Lys(i-26)Hisi, Arg2Lys(1 -26)His2, ArgiLys(i-26)His3, Arg3Lys(1-26)Orni, Arg2Lys(i.26)Ora2, ArgiLys(i-26)Om3, Lys(i-26)His30rni, Lys(1-26)His20rn2, Lys(i-26)HisiOrn3, Arg3LysiHis(i-26), Arg2Lys2HiS(i-26), ArgiLys3His(i-26), A^His^ ni!, Arg2His(i-26)Ora2, ArgiHiS(i.26)Orn3, Lys3His(i.26)Orn1, Lys2His( i -26)Om2, Lys i His(] -26)Om3 ; Arg(2-27)Lys1HisiOrn,, ArgiLyS(2-27)HisiOrni, Arg^ysiHis^.^Orni, Arg^ySiHisiOrn^); Arg(i-26)Lys2HisiOmi, Arg(i-26)LysiHis20rni, Arg(i-26)LysiHisiOrn2, Arg2Lys(i-26)HisiOrni, ArgiLyS(i-26)His20mi, ArgiLys(i-26)HisiOrn2, Arg2LysiHis(1-26)Orni, Arg1Lys2HiS(i-26)OrnI, ArgiLysiHiS(i-26)Orn2, Arg2Lys1His1 Orr^i^), Arg1Lys2HisiOrn(i-26), Arg1LysiHis20rn(i-26); De acuerdo con una modalidad preferida particular, los péptidos o proteínas catiónicos o policatiónicos del portador polimérico, que tienen la fórmula de suma empírica 1 como la mostrada arriba y que comprenden o son modificadas además para comprender al menos una porción -SH, pueden ser, sin estar restringidos a los mismos, seleccionados del grupo que consiste en las fórmulas genéricas Arg7 (también llamada R7), Argg (también llamada R9), Argi 2 (también llamada R 1 2) .
De acuerdo con una modalidad preferida particular adicional, el péptido o proteína catiónico o policatiónico del portador polimérico, cuando se define de acuerdo con la fórmula {(Arg)i;(Lys)m;(his)n;(Orn)0;(Xaa)x} (fórmula (I)) como la mostrada arriba y que comprende o son modificadas además para comprender al menos una porción -SH, pueden ser, sin estar restringidos a los mismos, seleccionados de la sub-fórmula (la) : {(Arg)i;(Lys)m;(His)n;(Orn)0;(Xaa' )x (Cys)y} fórmula (la) en donde (Arg)i;(Lys)m;(His)n;(Orn)0; y x son como se definió en la presente, Xaa' es cualquier aminoácido seleccionado de aminoácidos nativos (es decir, naturales) o no nativos excepto de Arg, Lys, His, Orn o Cys y y es cualquier número seleccionado de 0, 1 , 2 , 3 , 4, 5 , 6, 7, 8, 9, 1 0, 1 1 , 12, 13 , 14, 15 , 1 6, 1 7, 1 8 , 1 9, 20, 21 -30, 3 1 -40, 41 -50, 5 1 -60, 61 -70, 71 -80 y 81 -90, siempre y cuando el contenido total de Arg (Arginina), Lys (Lisina), His (Histidina) y Orn (Ornitina) represente al menos 1 0% de todos los aminoácidos del oligopéptido.
Esta modalidad puede aplicar a situaciones en las que el péptido o proteína catiónico o policatiónico del portador polimérico, por ej emplo, cuando se define de acuerdo con la fórmula empírica (Arg)i;(Lys)m;(His)n;(Orn)0;(Xaa)x (fórmula (I)) como se mostró arriba, comprenda o haya sido modificado con al menos una cisteína como porción -SH en el significado anterior de tal manera que el péptido catiónico o policatióhico como componente catiónico porte al menos una cisteína, la cual sea capaz de formar un enlace de disulfuro con otros componentes del portador polimérico .
De acuerdo con otra modalidad preferida particular, el péptido o proteína catiónico o policatiónico del portador polimérico, cuando se define de acuerdo con la fórmula {(Arg)1;(Lys)m;(His)n;(Orn)0;(Xaa)x } (fórmula (I)) como la mostrada arriba, puede ser, sin estar restringido a los mismos, seleccionado de la sub-fórmula (Ib): Cys , {(Arg),;(Lys)m;(His)n;(Orn)0;(Xaa)x} Cys2 (fórmula (Ib)) en donde la fórmula empírica {(Arg)i;(Lys)m;(His)n;(Orn)0;(Xaa)x} (fórmula (I)) es como la definida aquí y forma un núcleo de una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la fórmula (I) (semiempírica) y en donde Cys i y Cys2 son cisteínas cercas de, o terminales a (Arg)i;(Lys)m;(His)n;(Orn)0;(Xaa)x. Algunos ej emplos pueden comprender cualquiera de las secuencias anteriores flanqueadas por dos Cys y las siguientes secuencias: Cys(Arg7)Cys, Cys(Arg8)Cys, Cys(Arg9)Cys, Cys(Arg]0)Cys, Cys(Argn)Cys, Cys(Arg12)Cys, Cys(Argi3)Cys, Cys(Arg14)Cys, Cys(Argi5)Cys, Cys(Argi6)Cys, Cys(Arg,7)Cys, Cys(Arg18)Cys, Cys(Arg19)Cys, Cys(Arg20)Cys (SEQ ID NOs:l-14): CysArg7Cys Cys-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Cys (SEQ ID NO. 1) CysArgsCys Cys-Arg- Arg- Arg- Arg- Arg- Arg- Arg-Arg-Cys (SEQ ID NO. 2) CysArggCys: Cys-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Cys (SEQ ID NO. 3) CysArgioCys Cys-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Cys (SEQ ID NO. 4) CysArgnCys Cys-Arg- Arg- Arg- Arg- Arg- Arg- Arg- Arg- Arg- Arg-Arg-Cys (SEQ ID NO. 5) CysArg12Cys: Cys-Arg- Arg- Arg- Arg- Arg- Arg- Arg- Arg- Arg- Arg- Arg-Arg-Cys (SEQ ID NO. 6) CysArgi 3Cys : Cys-Arg- Arg- Arg- Arg-Arg- Arg- Arg- Arg-Arg-Arg- Arg- Arg- Arg-Cys (SEQ ID NO. 7) CysArgnCys: Cys-Arg- Arg- Arg- Arg- Arg- Arg- Arg- Arg- Arg- Arg- Arg- Arg- Arg- Arg-Cys (SEQ ID NO. 8) CysArg]5Cys: Cys-Arg- Arg-Arg- Arg-Arg-Arg- Arg-Arg-Arg- Arg- Arg-Arg-Arg- Arg-Arg-Cys (SEQ ID NO. 9) CysArgi6Cys: Cys-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Cys (SEQ ID NO. 10) CysArg17Cys: Cys-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg- Arg-Cys (SEQ ID NO. 1 1) CysArgisCys: Cys-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg- Arg- Arg-Cys (SEQ ID NO. 12) CysArgi 9Cys: Cys-Arg- Arg- Arg- Arg- Arg- Arg- Arg- Arg- Arg- Arg- Arg- Arg- Arg-Arg- Arg-Arg- Arg- Arg-Cys (SEQ ID NO. 13) CysArg20Cys: Cys-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg- Arg- Arg- Arg Cys (SEQ ID NO. 14) Esta modalidad puede aplicar a situaciones en las que el péptido o proteína catiónico o policatiónico del portador polimérico, por ej emplo, cuando se defina de acuerdo con la fórmula empírica (Arg)i;(Lys)m;(His)n;(Orn)0;(Xaa)x (fórmula (I)) como la mostrada arriba, haya sido modificado con al menos dos cisteínas como porciones -SH en el significado anterior de tal manera que el péptido catiónico o policatiónico del complejo de carga portador polimérico de la invención como componente catiónico porte al menos dos cisteínas (terminales), las cuales sean capaces de formar un enlace de disulfuro con otros componentes del portador polimérico.
De acuerdo con una segunda alternativa, al menos un componente catiónico (o policatiónico) del portador polimérico se puede seleccionar de por ej emplo cualquier polímero catiónico o policatiónico (no peptídico) adecuado en este contexto, siempre y cuando este polímero catiónico o policatiónico (no peptídico) exhiba o sea modificado para exhibir al menos una porción -SH, que proporcione un enlace de uniones por disulfuro al polímero catiónico o policatiónico con otro componente del portador polimérico como el definido aquí. Así, igualmente que como se definió en la presente, el portador polimérico puede comprender los mismos o diferentes polímeros catiónicos o policatiónicos.
En el caso específico de que el componente catiónico del portador polimérico comprenda un polímero catiónico o policatiónico (no peptídico), las propiedades catiónicas del polímero catiónico o policatiónico (no peptídico) pueden determinarse según su contenido de cargas catiónicas cuando se comparen con las cargas totales de los componentes del polímero catiónico. De preferencia, el contenido de cargas catiónicas en el polímero catiónico a un pH (fisiológico) como el definido aquí es de al menos 1 0%, 20% o 30%, de preferencia al menos 40%, muy preferiblemente al menos 50%, 60% o 70%, pero también de preferencia al menos 80%, 90% o incluso 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%, muy preferiblemente al menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 1 00%, o puede estar en el intervalo de aproximadamente 10% a 90%, muy preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 30% a 1 00%, incluso preferiblemente en el intervalo de alrededor de 50% a 100%, por ej emplo, 50, 60, 70, 80%, 90% o 100%, o en un intervalo formado por cualesquiera dos de los valores mencionados arriba, siempre y cuando el contenido de todas las cargas, por ejemplo, cargas positivas y negativas a un pH (fisiológico) como el definido aquí, en el polímero catiónico completo sea 1 00%.
De preferencia, el componente catiónico (no peptídico) del portador polimérico representa un polímero catiónico o policatiónico, que exhibe típicamente un peso molecular de alrededor de 0.1 ó 0.5 kDa a aproximadamente 100 kDa, de preferencia de alrededor de 1 kDa a aproximadamente 75 kDa, muy preferiblemente de alrededor de 5 kDa a aproximadamente 50 kDa, todavía más preferiblemente de alrededor de 5 kDa a aproximadamente 30 kDa, o un peso molecular de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 50 kDa, aún más preferiblemente de alrededor de 1 0 kDa a aproximadamente 30 kDa. Además, el polímero catiónico o policatiónico (no peptídico) exhibe típicamente al menos una porción -SH, la cual es capaz de formar un enlace de disulfuro después de su condensación con cualquier otro componente catiónico u otros componentes del portador polimérico como el definido aquí.
En el contexto anterior, el componente catiónico (no peptídico) del portador polimérico se puede seleccionar de acrilatos, acrilatos modificados, tales como pDMAEMA (metilacrilato de poli(dimetilaminoetilo)), quitosanos, aziridinas o 2-etil-2-oxazolina (que forma oligo etileniminas u oligoetileniminas modificadas), polímeros obtenidos por la reacción de bisacrilatos con aminas que forman aminoésteres oligo beta o poli amido aminas, u otros polímeros tales como poliésteres, policarbonatos, etc. Cada molécula de estos polímeros catiónicos o policatiónicos (no peptídicos) exhibe típicamente al menos una porción -SH, en donde ésta por lo menos una porción -SH se puede introducir en el polímero catiónico o policatiónico (no peptídico) por modificaciones químicas, por ejemplo, usando inmunotiolano, ácido 3 -tio propiónico o introducción de porciones -SH que contengan aminoácidos, tales como cisteína o cualquier aminoácido (modificado) adicional. Estas porciones -SH son de preferencia como las ya definidas arriba.
En el contexto del portador polimérico, los componentes catiónicos, los cuales forman la base del portador polimérico por entrelazamiento de di sulfuro, pueden ser iguales o diferentes entre sí . Se prefiere también particularmente que el portador polimérico de la presente invención comprenda mezclas de péptidos, proteínas o polímeros catiónicos y opcionalmente componentes adi cionales como lo s definidos aquí, los cuales sean entrelazado s por enlaces de disulfuro como se describ e en la presente.
En este contexto, el complej o de carga portador polimérico de la invención gracias a su portador polimérico vari able permite adecuadamente combinar propi edades deseadas de diferentes péptido s, proteínas o polímeros catiónicos o policatiónicos (corto s) u otros componentes. El portador polimérico, por ej emplo , permite compactar efici entemente ácidos nucleicos con el propósito de una transfección eficiente de ácidos nucleicos, para terapia adyuvante, con el propósito de terapia génica, para supresión génica u otras estrategias sin pérdida de actividad, exhibiendo particularmente una transfección efi ci ente de un ácido nucleico en diferentes líneas de células \n vitro pero particularmente transfección in vivo . El portador polimérico y de esta manera el complej o de carga portador polimérico de la invención además no es tóxico para células, proporciona la liberación eficiente de su carga de ácido nucleico, es estable durante la liofilización y puede aplicarse como agente inmunoestabilizador o adyuvante. De preferenci a, el complej o de carga portador polimérico puede inducir la citocina antiviral IFN-al fa.
En particular, el portador polimérico formado por componentes catiónicos enlazados a disulfuro permite considerablemente variar su contenido de péptidos o polímeros y de esta manera modular sus propiedades biofísicas/bioquímicas, particularmente las propiedades catiónicas del portador polimérico, de manera bastante fácil y rápida, por ej emplo, al incorporar como componentes catiónicos los mismos o diferentes péptidos de polímeros catiónicos y añadir adicionalmente otros componentes al portador polimérico . Incluso a pesar de que consiste en unidades monoméricas no tóxicas bastante pequeñas, el portador polimérico forma una secuencia de unión catiónica larga que proporciona una fuerte condensación de la carga de ácido nucleico y estabilidad del complej o. B ajo las condiciones reductoras del citosol (por ej emplo, GSH citosólico), el complejo se degrada rápidamente en sus componentes (catiónicos); los cuales se degradan más (por ej emplo, oligopéptidos). Esto soporta la deliberación de la carga de ácido nucleico en el citosol . Debido a la degradación en oligopéptidos o polímeros pequeños en el citosol, no se observa toxicidad como la conocida para los oligopéptidos o polímeros de alto peso molecular, por ej emplo, a partir de poliarginina de alto peso molecular.
En consecuencia, el portador polimérico de complejo de carga portador polimérico de la invención puede comprender diferentes péptidos, proteínas o polímeros catiónicos o policatiónicos (cortos) seleccionados de péptidos, proteínas o polímeros (no peptídicos) catiónicos o policatiónicos como los definidos arriba, opcionalmente junto con componentes adicionales como los definidos aquí .
Además, el portador polimérico del complejo de carga portador polimérico de la invención como el definido arriba, muy preferiblemente al menos uno de los diferentes péptidos o polímeros (no peptídicos) catiónicos o policatiónicos (cortos) diferentes que forman la base del portador pol imérico por medio de entrelazamiento de disulfuro, pueden ser, de preferencia antes del entrelazamiento con disulfuro, modificados con al menos un componente adicional. Como alternativa, el portador polimérico puede como tal ser modificado con al menos un componente adicional . También puede comprender opcionalmente al menos un componente adicional, el cual forme típicamente el portador polimérico unido por disulfuro con los demás péptidos catiónicos o policatiónicos (cortos) como los definidos arriba mediante entrelazamiento de disulfuro .
Para permitir la modificación de un péptido catiónico o policatiónico o un polímero (no peptídico) como el definido arriba, cada uno de los componentes del portador polimérico puede (de preferencia justo antes del entrelazamiento por disulfuro) contener también al menos una porción funcional adicional, la cual permita la fij ación de estos componentes adicionales como los definidos aquí . Estas porciones funcionales pueden seleccionarse de funcionalidades que permitan la fij ación de componentes adicionales, por ej emplo, funcionalidades como las definidas en la presente, por ej emplo, por formación de amida (por ej emplo, ácidos carboxílicos, ácidos sulfónicos, aminas, etc.), por adición de Michael (por ej emplo, porciones de maleinimida, carbonilos a,ß insaturados, etc.), por química simplificada (por ej emplo, azidas o alquinos), por metátesis de alquenos/alquinos (por ejemplo, alquenos o alquinos), formación de imina o hidrazona (aldehidos o cetonas, hidrazinas, hidroxilaminas, aminas), reacciones de formación de complejos (avidina, biotina, proteína G) o componentes que permitan reacciones de sustitución tipo Sn (por ej emplo, halogenalcanos, tioles, alcoholes, aminas, hidrazinas, hidrazidas, ésteres de ácido sulfónico, sales de oxifosfonio) u otras porciones químicas que puedan utilizarse en la fijación de componentes adicionales.
De acuerdo con una modalidad particularmente preferida, el componente adicional, el cual puede estar contenido en el portador polimérico o el cual se puede usar para modificar los diferentes péptidos catiónicos o policatiónicos (cortos) o polímeros (no peptídicos) que forman la base del portador polimérico del complejo de carga portador polimérico de la invención es un componente de aminoácido (AA), el cual puede por ej emplo modificar las propiedades biofísicas/bioquímicas del portador polimérico como el definido aquí. De acuerdo con la presente invención, el componente de aminoácido (AA) comprende un número de aminoácidos de preferencia en un intervalo de aproximadamente 1 a 100, preferiblemente en un intervalo de alrededor de 1 a 50, muy preferiblemente seleccionado de un número que comprende 1 , 2, 3 , 4, 5, 6, 7, 8, 9, 1 0, 1 1 , 12, 13 , 14 ó 1 5- 20, o se puede seleccionar de un intervalo formado por cualesquiera dos de los valores mencionados arriba. En este contexto los aminoácidos del componente de aminoácido (AA) se pueden seleccionar independientemente unos de otros. Por ej emplo, si en el portador polimérico están presentes dos o más componentes (AA) pueden ser iguales o pueden ser diferentes unos de otros.
El componente de aminoácido (AA) puede contener o puede ser flanqueado (por ej emplo, terminalmente) por una porción que contenga -SH, la cual permita introducir este componente (AA) mediante enlace de disulfuro en el portador polimérico como el definido en la presente. En el caso específico de que la porción que contenga -SH represente una cisteína, el componente de aminoácido (AA) también puede ser leído como -Cys-(AA)-Cys-, en donde Cys representa cisteína y proporciona la porción -SH necesaria para un enlace por disulfuro. La porción que contiene -SH también se puede introducir en el componente de aminoácido (AA) usando cualquiera de las modificaciones o reacciones como las mostradas arriba para el componente catiónico o cualquiera de sus componentes.
Además, el componente de aminoácido (AA) puede ser provi sto con dos porciones -SH (o incluso más), por ejemplo en una forma representada por la fórmula HS-(AA)-SH para permitir la unión a dos funcionalidades por medio de enlaces de disulfuro, por ejemplo, si el componente de aminoácido (AA) se usa como un enlazador entre dos componentes adicionales (por ejemplo, como un enlazador entre dos polímeros catiónicos). En este caso, una porción -SH se protege de preferencia en una primera etapa usando un grupo protector como se conoce en la técnica, llevando a un componente de aminoácido (AA) de la fórmula SH-(AA)-S-grupo protector. Luego, el componente de aminoácido (AA) puede ser unido a un componente adicional del portador polimérico, para formar un primer enlace de disulfuro por medio de la porción -SH no protegida. La porción -SH protegida es luego típicamente desprotegida y unida a una porción -SH libre adicional de un componente adicional del portador polimérico para formar un segundo enlace de disulfuro.
Como alternativa, el componente de aminoácido (AA) puede ser provisto con otras funcionalidades como ya se describió arriba para los demás componentes del portador polimérico, los cuales permitan la unión del componente de aminoácido (AA) a cualesquiera componentes del portador polimérico .
Así, de acuerdo con la presente invención, el componente de aminoácido (AA) puede ser unido a componentes adicionales del portador polimérico con o sin usar un enlace de disulfuro. La unión sin usar un enlace de disulfuro se puede lograr mediante cualquiera de las reacciones descritas arriba, de preferencia al unir el componente de aminoácido (AA) a otro componente del portador polimérico usando una química de amida como la definida en la presente. Si se desea o es necesario, el otro extremo del componente de aminoácido (AA), por ej emplo, el extremo N o C, se puede usar para acoplar otro componente, por ej emplo, un ligando L. Para este fin, el otro extremo del componente de aminoácido (AA) comprende de preferencia o es modificado para comprender una funcionalidad adicional, por ej emplo, una especie de alquino (véase arriba), que se puede usar para añadir el otro componente por medio de química simplificada. Si el ligando se une por medio de un enlace ácido lábil, el enlace es de preferencia cortado en el endosoma y el portador polimérico presenta el componente de aminoácido (AA) en su superficie.
El componente de aminoácido (AA) se puede presentar como un componente adicional del portador polimérico como el definido arriba, por ej emplo, como un enlazador entre componentes catiónicos, por ej emplo, como un enlazador entre un péptido catiónico y un péptido catiónico adicional, como un enlazador entre un polímero catiónico y un polímero catiónico adicional, como un enlazador entre un péptido catiónico y un polímero catiónico, todo de preferencia como se definió en la presente, o como un componente adicional del portador polimérico, por ej emplo, al unir el componente de aminoácido (AA) al portador polimérico o un componente del mismo, por ej emplo, por medio de cadenas laterales, porciones SH o por medio de porciones adicionales como las definidas en la presente, en donde el componente de aminoácido (AA) se modifique de preferencia en consecuencia.
De acuerdo con una alternativa adicional y preferida particularmente, el componente de aminoácido (AA) se puede usar para modificar el portador polimérico, particularmente el contenido de componentes catiónicos en el portador polimérico como el definido arriba.
En este contexto es preferible que el contenido de componentes catiónicos en el portador polimérico sea de al menos 1 0%, 20% o 30%, preferiblemente al menos 40%, muy preferiblemente al menos 50%, 60% o 70%, pero también de preferencia al menos 80%, 90%, o incluso 95%, 96%, 97%, 98 %, 99% o 1 00%., más preferiblemente al menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 1 00%, o puede estar en el intervalo de alrededor de 30% a 100%, muy preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 50% a 100%, todavía más preferiblemente en el intervalo de alrededor de 70% a 100%, por ej emplo, 70, 80, 90 ó 100%, o en un intervalo formado por cualesquiera dos de los valores mencionados arriba, siempre y cuando el contenido de todos los componentes en el portador polimérico sea 100%.
En el contexto de la presente invención, el componente de aminoácido (AA) se puede seleccionar de las siguientes alternativas.
De acuerdo con una primera alternativa, el componente de aminoácido (AA) puede ser un componente de aminoácido (AA) aromático. La incorporación de aminoácidos aromáticos o secuencias como componente de aminoácido (AA) aromático en el portador polimérico de la presente invención hace posible una unión diferente (segunda) del portador polimérico al ácido nucleico debido a interacciones de los aminoácidos aromáticos con las bases de la carga de ácido nucleico en contraste con la unión de los mismos por secuencias cargadas catiónicas de la molécula portadora polimérica al esqueleto de fosfato. Esta interacción se puede presentar, por ej emplo, por intercalaciones o por unión a ranuras menores o mayores. Este tipo de interacción no es propensa a descompactación por socios de formación de complejos aniónicos (por ejemplo, heparina, ácidos hialurónicos) los cuales se encuentran principalmente en la matriz extracelular in vivo y también es menos susceptible a los efectos de sal .
Para este fin, los aminoácidos en el componente de aminoácido (AA) aromático pueden seleccionarse ya sea de los mismos o diferentes aminoácidos aromáticos, por ej emplo, seleccionados de Trp, Tyr, o Phe. Como alternativa, los aminoácidos (o el componente de aminoácido aromático completo (AA)) se puede seleccionar de las siguientes combinaciones de péptidos Trp-Tyr, Tyr-Trp, Trp-Trp, Tyr-Tyr, Trp-Tyr-Trp, Tyr-Trp-Tyr, Trp-Trp-Trp, Tyr-Tyr-Tyr, Trp-Tyr-Trp-Tyr, Tyr-Trp-Tyr-Trp, Trp-Trp-Trp-Trp, Phe-Tyr, Tyr-Phe, Phe-Phe, Phe-Tyr-Phe, Tyr-Phe-Tyr, Phe-Phe-Phe, Phe-Tyr-Phe-Tyr, Tyr-Phe-Tyr-Phe, Phe-Phe-Phe-Phe, Phe-Trp, Trp-Phe, Phe-Phe, Phe-Trp-Phe, Trp-Phe-Trp, Phe-Trp-Phe-Trp, Trp-Phe-Trp-Phe, o Tyr-Tyr-Tyr-Tyr, etc. (SEQ ID NOs: 1 5 - 42). Estas combinaciones de péptidos pueden ser repetidas, por ej emplo, 1 , 2, 3 , 4, 5 , 6, 7, 8 , 9, 10, 12 , 13 , 14, 15 o todavía más veces. Estas combinaciones de péptidos también se pueden combinar entre sí como sea adecuado.
Además, el componente de aminoácido (AA) aromático puede contener o puede ser flanqueado por una porción que contenga -SH, que permita introducir este componente por medio de un enlace de disulfuro como una parte adicional del portador polimérico como el definido arriba, por ej emplo, como un enlazador. Esta porción que contiene -SH puede ser cualquier porción como la definida aquí adecuada para acoplar un componente como el definido en la presente o un componente adicional como el definido en la presente. Como un ej emplo, esta porción que contiene -SH puede ser una cisteína. Después, el componente de aminoácido (AA) aromático se puede seleccionar por ej emplo de combinaciones de péptidos Cys-Tyr-Cys, Cys-Trp-Cys, Cys-Trp-Tyr-Cys, Cys-Tyr-Trp-Cys, Cys-Trp-Trp-Cys, Cys-Tyr-Tyr-Cys, Cys-Trp-Tyr-Trp-Cys, Cys-Tyr-Trp-Tyr-Cys, Cys-Trp-Trp-Trp-Cys, Cys-Tyr-Tyr-Tyr-Cys, Cys-Trp-Tyr-Trp-Tyr-Cys, Cys-Tyr-Trp-Tyr-Trp-Cys, Cys-Trp-Trp-Trp-Trp-Cys, Cys-Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Cys, Cys-Phe-Cys, Cys-Phe-Tyr-Cys, Cys-Tyr-Phe-Cys, Cys-Phe-Phe-Cys, Cys-Tyr-Tyr-Cys, Cys-Phe-Tyr-Phe-Cys, Cys-Tyr-Phe-Tyr-Cys, Cys-Phe-Phe-Phe-Cys, Cys-Tyr-Tyr-Tyr-Cys, Cys-Phe-Tyr-Phe-Tyr-Cys, Cys-Tyr-Phe-Tyr-Phe-Cys, or Cys-Phe-Phe-Phe-Phe-Cys, Cys-Phe-Trp-Cys, Cys-Trp-Phe-Cys, Cys-Phe-Phe-Cys, Cys-Phe-Trp-Phe-Cys, Cys-Trp-Phe-Trp-Cys, Cys-Phe-Trp-Phe-Trp-Cys, Cys-Trp-Phe-Trp-Phe-Cys, etc. Cada Cys arriba también se puede reemplazar por cualquier péptido o compuesto químico modificado que porte una porción -SH libre como la definida aquí. (SEQ ID NOS : 43 -75). Estas combinaciones de péptidos pueden ser repetidas, por ej emplo, 1 , 2, 3 , 4, 5, 6, 7, 8, 9, 1 0, 12, 1 3 , 14, 1 5 o todavía más veces. Estas combinaciones de péptidos también se pueden combinar entre sí según sea adecuado .
Además, el componente de aminoácido (AA) aromático puede contener o representar al menos una prolina, la cual puede servir como un rompedor de estructura de secuencias más largas de Trp, Tyr y Phe en el componente de aminoácido (AA) aromático, de preferencia dos, tres o más prolinas.
De acuerdo con una segunda alternativa, el componente de aminoácido (AA) puede ser un componente de aminoácido (AA) hidrófilo (y de preferencia polar no cargado). La incorporación de aminoácidos hidrófilos (y de preferencia polares no cargados) o secuencias como componente de aminoácido (AA) hidrófilo (y de preferencia polar no cargado) en el portador polimérico de la presente invención hace posible una unión más flexible a la carga de ácido nucleico. Esto lleva a una compactacion más efectiva de la carga de ácido nucleico y por consiguiente a una mejor protección contra nucleasas y descompactación no deseada. Permite también la provisión de un portador polimérico (largo) que exhiba una carga catiónica reducida sobre el portador completo y en este contexto que se ajuste más a las propiedades de unión, si se desea o es necesario.
Para este propósito, los aminoácidos en el componente de aminoácido (AA) hidrófilo (y de preferencia polar no cargado) pueden seleccionarse ya sea de los mismos o diferentes aminoácidos hidrófilos (y de preferencia polares no cargados) seleccionados por ejemplo de Thr, Ser, Asn o Gln. Como alternativa, los aminoácidos (o el componente de aminoácido (AA) hidrófilo completo (y de preferencia polar no cargado) se pueden seleccionar de las siguientes combinaciones de péptidos Ser-Thr, Thr-Ser, Ser-Ser, Thr-Thr, Ser-Thr-Ser, Thr-Ser-Thr, Ser-Ser-Ser, Thr-Thr-Thr, Ser-Thr-Ser-Thr, Thr-Ser-Thr-Ser, Ser-Ser-Ser-Ser, Thr-Thr-Thr-Thr, Gln-Asn, Asn-Gln, Gln-Gln, Asn-Asn, Gln-Asn-Gln, Asn-Gln-Asn, Gln-Gln-Gln, Asn-Asn-Asn, Gln-Asn-Gln-Asn, Asn-Gln-Asn-Gln, Gln-Gln-Gln-Gln, Asn-Asn-Asn-Asn, Ser-Asn, Asn-Ser, Ser-Ser, Asn-Asn, Ser-Asn-Ser, Asn-Ser-Asn, Ser-Ser-Ser, Asn-Asn-Asn, Ser-Asn-Ser-Asn, Asn-Ser-Asn-Ser, S er-Ser-S er-S er, o Asn-Asn-Asn-Asn, etc. (SEQ ID NOs : 76 - 1 1 1 ). Estas combinaciones de péptidos pueden repetirse, por ej emplo, 1 , 2, 3 , 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13 , 14, 1 5 o todavía más veces . Estas combinaciones de péptidos también se pueden combinar entre sí según sea adecuado .
Además, el componente de aminoácido (AA) hidrófilo (y de preferencia polar no cargado) puede contener o puede ser bloqueado por una porción que contenga -SH , la cual permite introducir este componente por medio de un enlace de disulfuro como una parte adicional de la fórmul a genérica (I) arriba, por ej emplo, como un enlazador. Esta porción que contiene -SH puede ser cualquier porción como la definida en la presente adecuada para acoplar un componente como el definido aquí a un componente adicional como el definido en la presente. Como un ej emplo, esta porción que contiene -SH puede ser una cisteína. Después, por ej emplo, el componente de aminoácido (AA) hidrófilo (y de preferencia polar no cargado) puede seleccionarse de por ej emplo combinaciones de péptidos Cys-Thr-Cys, Cys-Ser-Cys, Cys-Ser-Thr-Cys, Cys-Thr-Ser-Cys, Cys-Ser-Ser-Cys, Cys-Thr-Thr-Cys, Cys-Ser-Thr-Ser-Cys, Cys-Thr-Ser-Thr-Cys, Cys-Ser-Ser-Ser-Cys, Cys-Thr-Thr-Thr-Cys, Cys-S er-Thr-Ser-Thr-Cys, Cys-Thr-Ser-Thr-Ser-Cys, Cys-Ser-Ser-Ser-Ser-Cys, Cys-Thr-Thr-Thr-Thr-Cys, Cys-Asn-Cys, Cys-Gln-Cys, Cys-Gln-Asn-Cys, Cys-Asn-Gln-Cys, Cys-Gln-Gln-Cys, Cys-Asn-Asn-Cys, Cys-Gln-Asn-Gln-Cys, Cys-Asn-Gln-Asn-Cys, Cys-Gln-Gln-Gln-Cys, Cys-Asn-Asn-Asn-Cys, Cys-Gln-Asn-Gln-Asn-Cys, Cys-Asn-Gln-Asn-Gln-Cys, Cys-Gln-Gln-Gln-Gln-Cys, Cys-Asn-Asn-Asn-Asn-Cys, Cys-Asn-Cys, Cys-Ser-Cys, Cys-Ser-Asn-Cys, Cys-Asn-Ser-Cys, Cys-Ser-Ser-Cys, Cys-Asn-Asn-Cys, Cys-Ser-Asn-Ser-Cys, Cys-Asn-Ser-Asn-Cys, Cys-Ser-Ser-Ser-Cys, Cys-Asn-Asn-Asn-Cys, Cys-Ser-Asn-Ser-Asn-Cys, Cys-Asn-Ser-Asn-Ser-Cys, Cys-Ser-Ser-Ser-Ser-Cys, o Cys-Asn-Asn-Asn-Asn-Cys, etc. Cada Cys arriba también se puede reemplazar por cualquier péptido o compuesto químico modificado que porte una porción -SH libre como la definida aquí. (SEQ ID NOs: 1 1 2 -153). Estas combinaciones de péptidos pueden repetirse, por ej emplo, 1 , 2, 3 , 4, 5 , 6, 7, 8, 9, 1 0, 12, 1 3 , 14, 15 o todavía más veces. Estas combinaciones de péptidos también se pueden combinar entre sí según sea adecuado.
Además, el componente de aminoácido (AA) hidrófilo (y de preferencia polar no cargado) puede contener al menos una prolina, la cual puede servir como un rompedor de estructura de secuencias más largas de Ser, Thr y Asn en el componente de aminoácido (AA) hidrófilo (y de preferencia polar no cargado), de preferencia dos, tres o más prolinas.
De acuerdo con una tercera alternativa, el componente de aminoácido (AA) puede ser un componente de aminoácido (AA) lipófilo. La incorporación de aminoácidos lipófilos o secuencias como componente de aminoácido (AA) lipófilo en el portador polimérico de la presente invención hace posible una compactación más fuerte de la carga de ácido nucleico y/o el portador polimérico y su carga de ácido nucleico cuando se forma un complejo . Esto se debe particularmente a interacciones de una o más hebras de polímero del portador polimérico, particularmente de secciones lipófilas del componente de aminoácido (AA) lipófilo y la carga de ácido nucleico. Esta interacción de preferencia añadirá estabilidad adicional al complejo entre el portador polimérico y su carga de ácido nucleico. Esta estabilización se puede comparar en cierta forma con una especie de entrelazamiento no covalente entre diferentes hebras de polímero. Especialmente en un ambiente acuoso esta interacción es típicamente fuerte y proporciona un efecto significativo.
Para este propósito, los aminoácidos en el componente de aminoácido (AA) lipófilo puede seleccionarse ya sea de los mismos o diferentes aminoácidos lipófilos, por ejemplo, seleccionados de Leu, Val, lie, Ala, Met. Como alternativa, el aminoácido AA (o el componente de aminoácido (AA) lipófilo completo) pueden seleccionarse de las siguientes combinaciones de péptidos Leu-Val, Val-Leu, Leu-Leu, Val-Val, Leu-Val-Leu, Val-Leu-Val, Leu-Leu-Leu, Val-Val-Val, Leu-Val-Leu-Val, Val-Leu-Val-Leu, Leu-Leu-Leu-Leu, Val-Val-Val-Val, lie-Ala, Ala-Ile, Ile-Ile, Ala-Ala, Ile-Ala-Ile, Ala-Ile-Ala, Ile-Ile-Ile, Ala-Ala-Ala, Ile-Ala-Ile-Ala, Ala-Ile-Ala-Ile, Ile-Ile-Ile-Ile, Ala-Ala-Ala-Ala, Met-Ala, Ala-Met, Met-Met, Ala-Ala, Met-Ala-Met, Ala-Met-Ala, Met-Met-Met, Ala-Ala-Ala, Met-Ala-Met-Ala, Ala-Met-Ala-Met, o Met-Met-Met-Met etc. (SEQ ID NOs : 1 54 -1 88). Estas combinaciones de péptidos pueden repetirse, por ej emplo, 1 , 2, 3 , 4, 5 , 6, 7, 8 , 9, 10, 12, 13 , 14, 1 5, o todavía más veces. Estas combinaciones de péptidos también se pueden combinar entre sí según sea adecuado.
Además, el componente de aminoácido (AA) lipófilo puede contener o puede ser flanqueado por una porción que contenga -SH, la cual permita introducir este componente por medio de un enlace de disulfuro como una parte adicional del portador polimérico anterior, por ejemplo, como un enlazador. Esta porción que contenga -SH puede cualquier porción como la definida en la presente adecuada para acoplar un componente como el definid aquí a un componente adicional como el definido en la presente. Como un ej emplo, esta porción que contenga -SH puede ser una cisteína. Luego, por ej emplo, el componente de aminoácido (AA) lipófilo puede seleccionarse de por ej emplo, las combinaciones de péptidos Cys-Val-Cys, Cys-Leu-Cys, Cys-Leu-Val-Cys, Cys-Val-Leu-Cys, Cys-Leu-Leu-Cys, Cys-Val-Val-Cys, Cys-Leu-Val-Leu-Cys, Cys-Val-Leu-Val-Cys, Cys-Leu-Leu- Leu-Cys, Cys-Val-Val-Val-Cys, Cys-Leu-Val-Leu-Val-Cys, Cys-Val-Leu-Val-Leu-Cys, Cys-Leu-Leu-Leu-Leu-Cys, Cys-Val-Val-Val-Val-Cys, Cys-Ala-Cys, Cys-Ile-Cys, Cys-Ile-Ala-Cys, Cys-Ala-Ile-Cys, Cys-Ile-Ile-Cys, Cys-Ala-Ala-Cys, Cys-Ile-Ala-Ile-Cys, Cys-Ala-Ile-Ala-Cys, Cys-Ile-Ile-Ile-Cys, Cys-Ala-Ala-Ala-Cys, Cys-Ile-Ala-Ile-Ala-Cys, Cys-Ala-Ile-Ala-Ile-Cys, Cys-Ile-Ile-Ile-Ile-Cys, or Cys-Ala-Ala-Ala-Ala-Cys, Cys-Met-Cys, Cys-Met-Ala-Cys, Cys-Ala-Met-Cys, Cys-Met-Met-Cys, Cys-Ala-Ala-Cys, Cys-Met-Ala-Met-Cys, Cys-Ala-Met-Ala-Cys, Cys-Met-Met-Met-Cys, Cys-Ala-Ala-Ala-Cys, Cys-Met-Ala-Met-Ala-Cys, Cys-Ala-Met-Ala-Met-Cys, Cys-Met-Met-Met-Met-Cys, o Cys-Ala-Ala-Al a-Ala-Cys, etc. Cada Cys arriba también se puede reemplazar por cualquier péptido o compuesto químico modificado que porte una porción -SH libre como la definida aquí . (SEQ ID NOs: 1 89 - 229). Estas combinaciones de péptidos pueden repetirse, por ejemplo, 1 , 2, 3 , 4, 5 , 6, 7, 8 , 9, 10, 12, 1 3 , 14, 1 5 o todavía más veces. Estas combinaciones de péptidos también se pueden combinar entre sí según sea adecuado.
Además, el componente de aminoácido (AA) lipófilo puede contener al menos una prolina, que puede servir como un rompedor de estructura de secuencias más largas de Leu, Val, lie, Ala y Met en el componente de aminoácido (AA) lipófilo, de preferencia dos, tres o más prolinas.
Finalmente, de acuerdo con una cuarta alternativa, el componente de aminoácido (AA) puede ser un componente de aminoácido (AA) básico débil. La incorporación de los aminoácidos básicos débiles o secuencias como componente de aminoácidos (AA) básico débil en el portador polimérico de la presente invención puede servir como una esponj a de protones y facilite el escape endosómico (llamado también liberación endosómica) (efecto de esponja de protones). La incorporación de este componente de aminoácido (AA) básico débil incrementa de preferencia la eficiencia de transfección.
Para este propósito, los aminoácidos en el componente de aminoácidos (AA) básico débil puede seleccionarse ya sea de los mismos o diferentes aminoácidos débiles, por ej emplo, seleccionado de histidina o aspartato (ácido aspártico) . Como alternativa, los aminoácidos básicos débiles (o el componente de aminoácido (AA) básico débil completo) puede seleccionarse de las siguientes combinaciones de péptidos Asp-His, His-Asp, Asp-Asp, His-His, Asp-His-Asp, His-Asp-His, Asp-Asp-Asp, His-His-His, Asp-His-Asp-His, His-Asp-His-Asp, Asp-Asp-Asp-Asp, o His-His-His-His, etc. (SEQ ID NOs : 230-241 ). Estas combinaciones de péptidos pueden repetirse, por ej emplo, 1 , 2, 3 , 4, 5, 6, 7, 8, 9, 1 0, 12, 13 , 14, 1 5 o todavía más veces. Estas combinaciones de péptidos también se pueden combinar entre sí según sea adecuado.
Además, el componente de aminoácido (AA) básico débil puede contener o puede ser flanqueado por una porción que contenga -SH, la cual permita introducir este componente por medio de un enlace de disulfuro como una parte adicional de la fórmula genérica (1) arriba, por ejemplo, como un enlazador. Esta porción que contenga -SH puede ser cualquier porción como la definida en la presente acoplada para acoplar un componente como el definido aquí a un componente adicional como el definido en la presente. Como un ej emplo, esta porción que contenga -SH puede ser una cisteína. Después, por ej emplo, el componente de aminoácido (AA) básico débil puede seleccionarse de, por ej emplo, las combinaciones de péptidos Cys-His-Cys, Cys-Asp-Cys, Cys-Asp-His-Cys, Cys-His-Asp-Cys, Cys-Asp-Asp-Cys, Cys-His-His-Cys, Cys-Asp-His-Asp-Cys, Cys-His-Asp-His-Cys, Cys-Asp-Asp-Asp-Cys, Cys-His-His-His-Cys, Cys-Asp-His-Asp-His-Cys, Cys-His-Asp-His-Asp-Cys, Cys-Asp-Asp-Asp-Asp-Cys, o Cys-His-His-His-His-Cys, etc. Cada Cys arriba también se puede reemplazar por cualquier péptido o compuesto químico modificado que porte una porción -SH libre como la definida en la presente. (SEQ ID NOs: 242-255). Estas combinaciones de péptidos pueden repetirse, por ej emplo, 1 , 2, 3 , 4, 5 , 6, 7, 8, 9, 10, 12, 1 3 , 14, 1 5 ó incluso aún más veces. Estas combinaciones de péptidos también se pueden combinar entre sí según sea adecuado.
Además, el componente de aminoácidos (AA) débil puede contener al menos una prolina, que puede servir como un rompedor de estructura de secuencias más largas de histidina o aspartato (ácido aspártico) en el componente de aminoácido (AA) básico débil, de preferencia dos, tres o más prolinas.
De acuerdo con una quinta alternativa, el componente de aminoácido (AA) puede ser un péptido de señal o secuencia de señal, una señal o secuencia de localización, una señal de localización nuclear o secuencia (NLS), un anticuerpo, un péptido de penetración celular, (por ej emplo TAT), etc. De preferencia, este componente de aminoácido (AA) se une al portador polimérico o a otro componente del portador polimérico por medio de un enlace de disulfuro (reversible). En este contexto el péptido de señal o secuencia de señal, una señal o secuencia de ubicación, una señal o secuencia de ubicación nuclear (NLS), un anticuerpo, un péptido de penetración celular (por ejemplo, TAT), etc. ; comprende además al menos una porción -SH. En este contexto, una señal o secuencia de ubicación o una señal o secuencia de ubicación nuclear (NLS), se puede usar para dirigir el complejo de carga portador polimérico de la invención a células obj etivo específicas (por ej emplo, hepatocitos o células presentadoras de antígenos y permite de preferencia una translocalización del portador polimérico a un obj etivo específico, por ej emplo, dentro de la célula, dentro del núcleo, dentro del compartimiento endosómico, secuencias para la matriz mitocondrial, secuencias de localización para la membrana de plasma, secuencias de localización para el aparato de Golgi, el núcleo, el citoplasma y el citoesqueleto, etc. Este péptido de señal, una señal o secuencia de localización o una señal de localización nuclear se puede usar para el transporte de cualquiera de los ácidos nucleicos definidos aquí, de preferencia un ARN o un ADN, muy preferiblemente un ARNsh o un ADNp, por ej emplo, dentro del núcleo. Sin estar limitado a los mismo, este péptido de señal, una señal o secuencia de ubicación o una señal de ubicación nuclear puede comprender, por ej emplo, secuencias de localización para el retículo endoplásmico. Las señales o secuencias de localización particulares o señales de localización nucleares pueden incluir, por ej emplo, KDEL (SEQ ID NO: 256), DDEL (SEQ ID NO: 257), DEEL (SEQ ID NO: 258), QEDL (SEQ ID NO: 259), RDEL (SEQ ID NO: 260), y GQNLSTSN (SEQ ID NO: 261 ), secuencias de localización nuclear, incluyendo PKKKRKV (SEQ ID NO: 262), PQKKIKS (SEQ ID NO: 263), QPKKP (SEQ ID NO: 264), RKKR (SEQ ID NO : 265), RKKRRQRRRAHQ (SEQ ID NO : 266), RQARRNRRRRWRERQR (SEQ ID NO: 267), MPLTRRRPAASQALAPPTP (SEQ ID NO: 268), GAALTILV (SEQ ID NO: 269), y GAALTLLG (SEQ ID NO : 270), secuencias de localización para el compartimiento endosómico, incluyendo MDDQRDLISNNEQLP (SEQ ID NO: 27 1 ), secuencias de localización para la matriz mitocondrial, incluyendo MLFNLRXXLNNAAFRHGHNFMVRNFRCGQPLX (SEQ ID NO: 272), secuencias de localización para la membrana de plasma: GCVCSSNP (SEQ ID NO: 273), GQTVTTPL (SEQ ID NO: 274), GQELSQHE (SEQ ID NO : 275), GNSPSYNP (SEQ ID NO: 276), GVSGSKGQ (SEQ ID NO: 277), GQTITTPL (SEQ ID NO : 278), GQTLTTPL (SEQ ID NO: 279), GQIFSRSA (SEQ ID NO: 280), GQIHGLSP (SEQ ID NO : 28 1 ), GARASVLS (SEQ ID NO: 282), y GCTLSAEE (SEQ ID NO : 283), secuencias de localización para el retículo endoplásmico y el núcleo, incluyendo GAQVS SQK (SEQ ID NO : 284), y GAQLSRNT (SEQ ID NO : 285), secuencias de localización para el aparato de Golgi, el núcleo, el citoplasma y el citoesqueleto, incluyendo GNAAAAKK (SEQ ID NO: 286), secuencias de localización para el citoplasma y citoesqueleto, incluyendo GNEASYPL (SEQ ID NO : 287), secuencias de localización para la membrana de plasma y citoesqueleto, incluyendo GSSKSKPK (SEQ ID NO: 288), etc. Ej emplos de secuencias de péptidos de señal secretora como los definidos aquí incluyen, sin estar limitados a los mismos, secuencias de señal de moléculas MHC clásicas o no clásicas (por ej emplo, secuencias de señal de moléculas MHC I y II, por ej emplo, de la molécula MHC clase I HLA-A*0201 ), secuencias de señal de citocinas o inmunoglobulinas como las definidas aquí, secuencias de señal de la cadena invariante de inmunoglobulinas o anticuerpos como las definidas aquí, secuencias de señal de Lamp l , Tapasina, Erp57, Calreticulina, Calnexina, y proteínas asociadas a membrana adicionales o de proteínas asociadas con el retículo endoplásmico (ER) o el compartimiento endosómico-lisosómico . De manera particularmente preferible, las secuencias de señal de la molécula MHC clase I HLA-A*0201 se pueden usar de acuerdo con la presente invención. Este componente adicional puede unirse, por ej emplo, a un polímero catiónico o a cualquier otro componente del portador polimérico como el definido aquí. De preferencia este péptido de señal, señal o secuencia de ubicación o señal o secuencia de ubicación nuclear (NLS), se une al portador polimérico o a otro componente del portador polimérico por medio de un enlace de disulfuro (reversible) . Para este propósito el componente (AA) comprende además al menos una porción -SH como la definida en la presente. La unión de cualquiera de los componentes del portador polimérico también se puede lograr usando un enlace ácido lábil, de preferencia por medio de una cadena lateral de cualquiera de los componentes del portador polimérico, que permita desprender o liberar al componente adicional a valores de pH más bajos, por ej emplo, a valores de pH fisiológicos como los definidos aquí.
Además, de acuerdo con otra alternativa, el componente de aminoácido (AA) puede ser un péptido o proteína funcional, el cual puede modular la funcionalidad del portador polimérico en consecuencia. Estos péptidos o proteínas funcionales como el componente aminoácido (AA) comprenden de preferencia cualesquiera péptidos o proteínas como los definidos en la presente, por ej emplo, como los definidos abaj o como proteínas terapéuticamente activas. De acuerdo con una alternativa, estos péptidos o proteínas funcionales adicionales pueden comprender los llamados péptidos de penetración celular (CPPs) o péptidos catiónicos para transportación. S e prefieren particularmente los CPPs que incluyen un cambio de conformación mediado por pH en el endosoma y llevan a una liberación mejorada del portador polimérico (en complejo con un ácido nucleico) del endosoma por inserción en la capa de lípidos de liposoma. Estos péptidos de penetración celular (CPPs) o péptidos catiónicos para transportación, pueden incluir, sin estar limitados a los mismos, protamina, nucleolina, espermina o espermidina, oligo- o poli-L-lisina (PLL), polipéptidos básicos, oligo o poli-arginina, péptidos de penetración celular (CPPs), CPPs quiméricos, tales como Transportan, o péptidos MPG, péptidos de unión a VIH, Tat, VIH- 1 Tat (VIH), péptidos derivados de Tat, miembros de la familia de penetratina, por ej emplo, Penetratina, péptidos derivados de Antenapedia (particularmente de Drosophila antennapedia), pAntp, plsl, etc. , CPPs derivados de antimicrobianos, por ejemplo, Buforin-2, Bac71 5-24, SynB , SynB(l ), pVEC, péptidos derivados de hCT, SAP, MAP, KALA, PpTG20, Loligomere, FGF, Lactoferrina, histonas, péptidos derivados de VP22 o análogos, HSV, VP22 (Herpes simple), MAP, KALA o dominios de transducción de proteínas (PTDs, PpT620, péptidos ricos en prolina, péptidos ricos en arginina, péptidos ricos en lisina, Pep- 1 , L-oligómeros, péptidos de calcitonina, etc. Este componente de aminoácido (AA) también se puede unir a cualquier componente del portador polimérico como el definido aquí. Se une de preferencia al portador polimérico o a otro componente del portador polimérico por medio de un enlace de disulfuro (reversible) . Para el propósito anterior, el componente de aminoácido (AA) comprende de preferencia al menos una porción -SH como la definida aquí . La unión a cualquiera de los componentes del portador polimérico también se puede lograr usando una porción SH o un enlace ácido lábil, de preferencia por medio de una cadena lateral de cualquiera de los componentes del portador polimérico que permita desprender o liberar el componente adicional a valores de pH más bajos, por ejemplo, a valores de pH fisiológicos como los definidos en la presente.
De acuerdo con una última alternativa, el componente de aminoácido (AA) puede consistir en cualquier péptido o proteína que pueda ej ecutar una función favorable en la célula. Se prefiere particularmente los péptidos o proteínas seleccionados de péptidos o proteínas terapéuticamente activos, de antígenos, por ejemplo, antígenos de tumor, antígenos patógenos (antígenos animales, antígenos virales, antígenos protozoarios, antígenos bacterianos, antígenos alérgicos), antígenos autoinmunes o antígenos adicionales, de alérgenos, de anticuerpos, de proteínas o péptidos inmunoestimuladores, de receptores de células T específicas de antígenos o de cualquier otra proteína o péptido adecuado para una aplicación (terapéutica) específica como la definida abajo para codificar ácidos nucleicos. Se prefiere particularmente los epítopos de péptidos a partir de antígenos como los definidos aquí.
El portador polimérico puede comprender al menos uno de los péptidos, proteínas o polímeros catiónicos o policatiónicos mencionados arriba o componentes adicionales, por ej emplo, (AA), en donde cualquiera de las alternativas anteriores puede combinarse entre sí, y se pueden formar al polimerizar los mismos en una reacción de condensación de polimerización por medio de sus porciones -SH.
De acuerdo con otro aspecto, el portador polimérico del complej o de carga portador polimérico de la invención o componentes individuales del mismo, por ej emplo, de los péptidos, proteínas o polímeros catiónicos o policatiónicos mencionados arriba o componentes adicionales, por ej emplo (AA), se puede modificar más con un ligando, de preferencia un carbohidrato, muy preferiblemente un azúcar, todavía más preferiblemente mañosa. De preferencia este ligando se une al portador polimérico o a un componente del portador polimérico por medio de un enlace de disulfuro (reversible) o por medio de adición de Michael. En caso de que el ligando se una por un enlace de disulfuro el ligando comprende además al menos una porción -SH. Estos ligandos se pueden usar para dirigir el complejo de carga portador polim érico de la invención a células objetivo específicas (por ej emplo, hepatocitos o células presentadoras de antígeno). En este contexto se prefiere particularmente mañosa como ligando en caso de que las células dendríticas sean el obj etivo especialmente para propósitos de vacunación o adyuvantes.
De acuerdo con un aspecto más de la invención, el complej o de carga portador polimérico de la invención puede comprender componentes (AA) como los definidos arriba que no comprendan porciones -SH. Estos componentes (AA) pueden añadirse antes o durante la reacción de formación de complejos de la por lo menos una molécula de ácido nucleico. De esta manera, los componentes (AA) son incorporados (no covalentemente) en el complejo de carga portador polimérico de la invención sin la inclusión de los componentes (AA) en el propio portador polimérico por polimerización (covalente) .
De acuerdo con una modalidad específica, el complejo de carga portador polimérico de la invención completo puede formarse a partir de una condensación de polimerización (de por lo menos uno) de los péptidos, proteínas o polímeros catiónicos o policatiónicos mencionados arriba o componentes adicionales, por ej emplo, (AA), por medio de sus porciones -SH en una primera etapa y formando complejo del ácido nucleico al portador polimérico en una segunda etapa. El portador polimérico puede contener entonces un número de al menos uno o todavía más de los péptidos, proteínas o polímeros catiónicos o policatiónicos o componentes adicionales, por ejemplo, (AA) definidos arriba, el número determinado de preferencia por el intervalo anterior.
De acuerdo con una modalidad específica alternativa, el complejo de carga portador polimérico de la invención se forma al llevar a cabo la condensación de polimerización de al menos uno de los péptidos, proteínas o polímeros catiónicos o policatiónicos mencionados arriba o componentes adicionales, por ej emplo, (AA), mencionados arriba, por medio de sus porciones -SH simultáneamente para formar complejos de la carga de ácido nucleico al portador polimérico (preparado in situ). Asimismo, el portador polimérico también puede entonces contener aquí un número de al menos uno o todavía más de los mismos o diferentes de los péptidos, proteínas o polímeros catiónicos o policatiónicos mencionados arriba o componentes adicionales, por ej emplo, (AA), mencionados arriba, el número siendo de preferencia determinado por el intervalo anterior.
El complejo de carga portador polimérico de la invención comprende además como una carga al menos un ácido nucleico (molécul a). En el contexto de la presente invención, esta molécula de ácido nucleico puede ser cualquier ácido nucleico adecuado, seleccionado, por ej emplo, de cualquier ADN (de una sola hebra o de doble hebra), de preferencia, sin estar limitado a los mismos, por ej emplo, ADN genómico, moléculas de ADN de una sola hebra, moléculas de ADN de doble hebra, ADN de codificación, cebadores de ADN, sondas de ADN, ADN inmunoestimulador, oligodesoxirribonucleótidos (cortos de un oligonucleótido de ADN (corto)), o se puede seleccionar, por ej emplo, de cualquier PNA (ácido nucleico péptido) o puede seleccionarse, por ejemplo, de cualquier ADN (hebra individual o doble hebra), de preferencia sin estar limitado a los mismos, oligorribonucleótido (corto) de un oligonucleótido de ARN (corto)), un ARN de codificación, un ARN mensaj ero (ARNm), un ARN inmunoestimulador, un ARN de interferencia pequeño (ARNsi), un ARN antisentido, un micro ARN, un ARN nuclear pequeño (ARNsn), un ARN de pasador pequeño (sh) o ribointerruptores, ribozimas o aptámeros; etc. La molécula de ácido nucleico del complejo de carga portador polimérico de la invención también puede ser un ARN ribosómico (ARNr), un ARN de transferencia (ARNt), un ARN mensaj ero (ARNm) o un ARN viral (ARNv). De preferencia, la molécula de ácido nucleico del complejo de carga portador polimérico de la invención es un ARN. Muy preferiblemente, la molécula de ácido nucleico del complejo de carga portador polimérico de la invención es un ARN de hebra individual (lineal), aún más preferiblemente un ARNm o un ARN inmunoestimulador. En el contexto de la presente invención, un ARNm es típicamente un ARN que está compuesto de varios elementos estructurales, por ej emplo, una estructura 5 ' -CAP opcional, una región 5 ' -UTR opcional, un sitio de unión ribosómico colocado hacia el extremo 5 ' seguido por una región de codificación, una región 3 ' -UTR opcional, que puede ser seguida por una cola poli-A (y/o una cola poli-C). Un ARNm puede ocurrir como un ARN mono-, di- o incluso multicistrónico, es decir, un ARN que porte las secuencias de codificación de uno, dos o más proteínas o péptidos. Estas secuencias de codificación en ARNm di- o incluso multicistrónico se pueden separar por al menos una secuencia IRES, por ej emplo, como la definida aquí .
Más aún, el ácido nucleico del complejo de carga portador polimérico de la invención puede ser un ácido nucleico (molécula) de una sola o de doble hebra (que también se puede considerar como un ácido nucleico (molécula) debido a asociación no covalente de dos ácidos nucleicos (moléculas) de hebra individual) o un ácido nucleico parcialmente de doble hebra o parcialmente de una sola hebra, los cuales al menos parcialmente son auto-complementarios (ambos de ellos parcialmente moléculas de ácido nucleico parcialmente de doble hebra o parcialmente de una sola hebra se forman típicamente por una molécul a de ácido nucleico de hebra individual más larga y más corta o por dos moléculas de ácido nucleico de una sola hebra, las cuales tienen casi la misma longitud, en donde una molécula de ácido nucleico de una sola hebra es en parte complementaria a la otra molécula de ácido nucleico de una sola hebra y ambas forman entonces una molécula de ácido nucl eico de doble hebra en esta región, es decir, un ácido nucleico (molécula) parcialmente de doble hebra o parcialmente de una sola hebra. Preferiblemente, el ácido nucleico (molécula) puede ser una molécula de ácido nucleico de una sola hebra. Más aún, el ácido nucleico (molécula) puede ser una molécula de ácido nucleico circular o lineal, de preferencia una molécula de ácido nucleico lineal .
De acuerdo con una alternativa, la molécula de ácido nucleico del complejo de carga portador polimérico de la invención puede ser un ácido nucleico de codificación, por ej emplo, un ADN o ARN. Este ADN o ARN de codificación puede ser cualquier ADN o ARN como el definido aquí. Preferiblemente, este ADN o ARN de codificación puede ser un ADN o ARN de una sola o de doble hebra, muy preferiblemente un ADN o ARN de una sola hebra y/o ADN o ARN circular o lineal, muy preferiblemente un ADN o ARN lineal. De manera aún más preferible, el ADN o ARN de codificación puede ser un ADN o ARN de una sola hebra (lineal). Más preferiblemente, la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención puede ser un ARN mensaj ero (ARNm) (de una sola hebra) (lineal). Este ARNm se puede presentar como un ARN mono-, di- o incluso multicistrónico, es decir, un ARN que porte las secuencias de codificación de una, dos o más proteínas o péptidos. Estas secuencias de codificación en ARNm di- o incluso multicistrónico pueden ser separadas por al menos una secuencia IRES, por ejemplo, como la definida en la presente. Ácidos nucleicos de codificación : La molécula de ácido nucleico del complejo de carga portador polimérico de la invención puede codificar para una proteína o un péptido, que se puede seleccionar, sin estar restringido a los mismos, por ejemplo, de proteínas o péptidos terapéuticamente activos, incluyendo proteínas adyuvantes, de antígenos, por ej emplo, antígenos tumorales, antígenos patógenos (por ej emplo, seleccionado de antígenos animales, de antígenos virales, de antígenos de protozoarios, de antígenos bacterianos), antígenos alergénicos, antígenos autoinmunes o antígenos adicionales, de alérgenos, de anticuerpos, de proteínas o péptidos inmunoestimuladores, de receptores de células T específicas de antígenos, o de cualquier otra proteína o péptido adecuado para una aplicación (terapéutica) específica, en donde el ácido nucleico de codificación puede ser transportado en una célula, un tejido o un organismo y la proteína puede expresarse subsecuentemente en esta célula, tejido u organismo. a) Proteínas terapéuticamente activas En el contexto de la presente invención, las proteínas o péptidos terapéuticamente activos pueden codificarse por la molécula de ácido nucleico del complejo de carga portador polimérico de la invención definido aquí. Las proteínas terapéuticamente activas se definen aquí como proteínas que tienen un efecto en la sanación, de preferencia profilácticamente o para tratar terapéuticamente una enfermedad, de preferencia como la definida aquí, o son proteínas de las cuales un individuo tiene necesidad. Estas pueden seleccionarse de cualquier proteína recombinante o aislada que se presente naturalmente o que se diseña sintéticamente conocida por una persona experta en la técnica anterior. Sin estar restringidas a las mismas, las proteínas terapéuticamente activas pueden comprender proteínas, capaces de estimular o inhibir la transducción de señales en la célula, por ejemplo citocinas, linfocinas, monocinas, factores de crecimiento, receptores, mol éculas de transducción de señales, factores de transcripción, etc. ; anticoagulantes; antitrombinas; proteínas antialérgicas; factores apoptócicos o proteínas relacionadas con apoptosis, enzimas terapéuticas activas y cualquier proteína conectada con cualquier enfermedad adquirida o cualquier enfermedad hereditaria.
Una proteína terapéuticamente activa, la cual se puede codificar por la molécula de ácido nucleico del complejo de carga portador polimérico de la invención definido aquí también puede ser una proteína adyuvante. En este contexto, una proteína adyuvante se debe entender de preferencia como cualquier proteína que sea capaz de provocar una respuesta inmune innata como la definida en la presente. Preferiblemente, esta respuesta inmune innata comprende activación de un receptor de reconocimiento de patrón, tal como por ejemplo un receptor seleccionado de la familia del receptor tipo Toll (TLR), incluyendo por ej emplo, un receptor tipo Toll seleccionado de TLR 1 a TLR 1 0 humanos o de receptores tipo Toll de murino TLR 1 a TLR 13. Muy preferiblemente, la proteína adyuvante se selecciona de proteínas adyuvantes humanas o de proteínas adyuvantes patógenas seleccionadas del grupo que consiste en, sin estar limitadas a las mismas, proteínas bacterianas, proteínas de protozoarios, proteínas virales, o proteínas fúngicas, proteínas animales, en particular de proteínas adyuvantes bacterianas. Además, los ácidos nucleicos que codifican para proteínas humanas implicadas en efectos adyuvantes (por ej emplo, ligandos de receptores de reconocimiento de patrones, receptores de reconocimiento de patrones, proteínas de las vías de transducción de señales, factores de transcripción o citocinas) pueden usarse también. b) A ntígenos La molécula de ácido nucleico del complejo de carga portador polimérico de la invención definido aquí puede como alternativa codificar para un antígeno. De acuerdo con la presente invención, el término "antígeno" se refiere a una sustancia que es reconocida por el sistema inmunológico y es capaz de desencadenar una respuesta inmune específica de antígeno, por ejemplo, mediante la formación de anticuerpos o células T específicas de antígenos como parte de una respuesta inmune adaptiva. En este contexto, la primera etapa de una respuesta inmune adaptiva es la activación de las células T específicas de antígenos naives por células presentadoras de antígenos. Esto se presenta en los tejidos linfoides y órganos a través de los cuales las células T naives están pasando constantemente. Los tres tipos de células que pueden servir como células presentadoras de antígenos son células dendríticas, macrófagos y células B. Cada una de estas células tiene una función distinta para provocar respuestas inmunes. Las células dendríticas tisulares absorben antígenos por fagocitosis y macropinocitosis y son estimuladas por infección para migrar al tejido linfoide local, en donde se diferencian en células dendríticas maduras. Los macrófagos ingieren antígenos en partículas tales como bacterias y son inducidos por agentes infecciosos a expresar moléculas MHC clase II. La capacidad única de las células B para unirse e internalizar antígenos de proteínas solubles por medio de sus receptores puede ser importante para inducir células T. Al presentar el antígeno sobre moléculas MHC se logra la activación de células T que induce su proliferación y diferenciación en células T efectoras de brazos. La función más importante de las células T efectoras es la eliminación de células infectadas por células T citotóxicas CD8+ y la activación de macrófagos por células TH l que juntos constituyen la inmunidad mediada por células, y la activación de células B por células tanto TH2 como TH l para producir diferentes clases de anticuerpos, conduciendo así la respuesta inmune humoral. Las células T reconocen un antígeno o sus receptores de células T que no reconocen y se unen al antígeno directamente, sino que en su lugar reconocen fragmentos de péptidos cortos, por ej emplo, de antígenos de proteínas de patógenos, que se unen a moléculas MHC sobre las superficies de otras células.
Las células T entran dentro de dos clases principales que tienen diferentes funciones efectoras. Las dos clases se distinguen por la expresión de las proteínas de superficie celular CD4 y CD8. Estos dos tipos de células T difieren en la clase de molécula MHC que reconocen. Hay dos clases de moléculas MHC - moléculas MHC clase I y MHC clase II - que difieren en su estructura y patrón de expresión en tejidos del cuerpo. Las células T CD4+ se unen a una molécula MHC clase II y las células T CD8+ a una molécula MHC clase I. Las moléculas MHC clase I y MHC clase II tienen distintas distribuciones entre células que reflejan las funciones efectoras diferentes de las células T que las reconocen. Las moléculas MHC. clase I presentan péptidos de patógenos, comúnmente virus para células T CD8+, que se diferencian en células T citotóxicas que son especializadas para matar cualquier célula que reconozcan específicamente. Casi todas las células expresan moléculas MHC clase I, aunque el nivel de expresión constitutiva varía de un tipo de célula al siguiente. Sin embargo no sólo los péptidos patógenos de virus son presentados por moléculas MHC clase I, también auto-antígenos tales como antígenos tumorales son presentados por ellas. Las moléculas MHC clase I se unen a péptidos de proteínas degradadas en el citosol y transportadas al retículo endoplásmico . De esta manera las moléculas MHC clase I sobre la superficie de células infectadas con virus u otros patógenos citosólicos presentan péptidos de este patógeno. Las células T CD8+ que reconocen complejos MHC clase I: péptido se especializan en matar cualquier célula que presente péptidos extraños y de esta manera liberan al cuerpo de células infectadas con virus y otros patógenos citosólicos. La función principal de las células T CD4+ (células T auxiliares CD4+) que reconoce moléculas MHC clase II es la de activar otras células efectoras en el sistema inmuno lógico. De esta manera las moléculas MHC clase II se encuentran normalmente en linfocitos B, células dendríticas y macrófagos, células que participan en respuestas inmunes, pero no en otras células tisulares. Los macrófagos, por ej emplo, son activados para matar los patógenos intravesiculares que portan, y las células B para secretar inmunoglobulinas contra moléculas extrañas. Se impide que las moléculas MHC clase II se unan a péptidos en el retículo endoplásmico y entonces las moléculas MHC clase II se unen a péptidos de proteínas que son degradas en endosomas. Pueden capturar péptidos de patógenos que hayan entrado al sistema vesicular de macrófagos, o de antígenos internalizados por células dendríticas inmaduras o los receptores de inmunoglobulina de células B . Los patógenos que se acumulan en grandes números dentro de macrófagos y vesículas de células dendríticas tienden a estimular la diferenciación de células TH 1 , mientras que los antígenos extracelulares tienden a estimular la producción de células TH2. Las células TH 1 activan las propiedades microbicidas de macrófagos e inducen a las células B a hacer anticuerpos IgG que son muy efectivos para opsonizar patógenos extracelulares para su ingestión por células fagocíticas, mientras que las células TH2 inician la respuesta humoral al activar células B naives para secretar IgM, e inducen la producción de anticuerpos de débil opsonización tales como IgG l e IgG3 (ratón) e IgG2 e IgG4 (humano) así como IgA e IgE (ratón y humano) : En el contexto de la presente invención, los antígenos codificados por la molécula de ácido nucleico del complej o de carga portador polimérico de la invención definido en la presente comprenden típicamente cualquier antígeno, epítopo antigénico o péptido antigénico, que esté dentro de la definición anterior, muy preferiblemente antígenos de proteínas y péptidos, por ej emplo, antígenos tumorales, antígenos alergénicos, auto-antígenos autoinmunes, antígenos patógenos, etc. en particular, los antígenos codificados por la molécula de ácido nucleico del complejo de carga portador polimérico de la invención definido en la presente pueden ser antígenos generados fuera de la célula, más típicamente antígenos no derivados del propio organismo anfitrión (por ejemplo un humano) (es decir no auto-antígenos) sino más bien derivados de las células hospederas fuera del organismo anfitrión, por ej emplo, antígenos virales, antígenos bacterianos, antígenos fúngicos, antígenos protozoológicos, antígenos animales, antígenos alergénicos, etc. Los antígenos alergénicos (antígenos de alergia) son típicamente antígenos que causan una alergia en un humano y pueden derivarse ya sea de humanos o de otras fuentes. Además, los antígenos codificados por la molécula de ácido nucleico del complej o de carga portador polimérico de la invención definido en la presente pueden ser además antígenos generados dentro de la célula, el tej ido o el cuerpo. Estos antígenos incluyen antígenos derivados del propio organismo anfitrión (por ej emplo, un humano), por ej emplo antígenos tumorales, auto-antígenos o antígenos propios, tales como auto-antígenos autoinmunes, etc., pero también antígenos (no propios) como los definidos aquí, los cuales hayan sido derivados originalmente de células hospederas fuera del organismo anfitrión, pero que sean fragmentados o degradados dentro del cuerpo, tejido o célula, por ejemplo, mediante degradación (proteasas), metabolismo, etc.
Una clase de antígenos codificados por la molécula de ácido nucleico del complejo de carga portador polimérico de la invención definido en la presente comprende antígenos tumorales. Los "antígenos tumorales" se ubican de preferencia sobre la superficie de la célula (tumoral). Los antígenos tumorales también pueden seleccionarse de proteínas que sean sobreexpresadas en células tumorales en comparación con una célula normal. Además, los antígenos tumorales también incluyen antígenos expresados en células que no son a su vez (u originalmente no ellas mismas) generados sino asociados con el tumor supuesto . Los antígenos que están relacionados con vasos de suministro a tumor o reformación de los mismos, en particular aquellos antígenos que están asociados con neovascularización, por ej emplo, factores de crecimiento, tales como VEGF, bFGF, etc. , también están incluidos aquí. Los antígenos relacionados con un tumor incluyen además antígenos de células o tej idos, que típicamente infiltran el tumor. Además, algunas sustancias (normalmente proteínas o péptidos) son expresadas en pacientes que sufren (sabiendo o no sabiendo) de una enfermedad cancerosa y se presentan en concentraciones incrementadas en los fluidos corporales de dichos pacientes. Estas sustancias se conocen también como "antígenos tumorales", sin embargo no son antígenos en el estricto significado de una sustancia inductora de respuesta inmune. La clase de antígenos tumorales pueden dividirse más en antígenos específicos de tumor (TSAs) y antígenos asociados con tumor (TAAs). Los TSAs sólo pueden ser presentados por células tumorales y nunca por células "sanas" normales. Son típicamente resultado de una mutación específica de tumor. Los TAAs, los cuales son más comunes, se presentan normalmente por células tanto tumorales como saludables. Estos antígenos son reconocidos y la célula presentadora de antígenos puede ser destruida por células T citotóxicas. Además, los antígenos tumorales también se pueden presentar sobre la superfi cie del tumor en forma de, por ej emplo, un receptor mutado. En este caso, pueden ser reconocidos por anticuerpos. Los antígenos tumorales que se prefieren particularmente se seleccionan del grupo que consiste en 5T4, 707-AP, 9D7, AFP, AlbZIP HPG 1 , alfa-5-beta- 1 -integrina, alfa-5-beta-6-integrina, alfa-actinin-4/m, alfa-metilacil-coenzima A racemato, ART-4, ARTC l /m, B7H4, BAGE- 1 , BCL-2, bcr/abl, beta-catenina/m, BING-4. BRCA 1 /, BRCA2/m, CA 1 5-3/CA 27-29, CA 19-9, CA72-4, CA 125, calreticulina, CAMEL, CASP-8/m, catepsina B, catepsina L, CD 1 9, CD20, CD22, CD25 , CDE30, CD33, CD4, CD52, CD55, CD56, CD80, CDC27/m, CDK4/m, CDKN2A/m, CEA, CLCA2, CML28, CML66, COA-l/m, proteína similar a coactosina, collage XXIII, COX-2, CT-9/BRD6, Cten, ciclina Bl, cicina Dl, cip-B, CYPB1, DAM-10, DAM-6, DEK-CAN, EFTUD2/m, EGFR, ELF2/m, EMMPRIN, EpCam, EphA2, EphA3, ErbB3, ETV6-AML1, EZH2, FGF-5, FN, Frau-1, G250, GAGE-1 , GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE7b, GAGE-8, GDEP, GnT-V, gplOO, GPC3, GPNMB/m, HAGE, HAST-2, hepsina, Her2/neu, HERV-K-MEL, HLA-A*0201-R17I, HLA-All/m, HLA-A2/m, HNE, homeobox NKX3.1, HOM-TES-14/SCP-1, HOM-TES-85, HPV-E6, HPV-E7, HSP70-2M, HST-2, hTERT, iCE, IGF-1R, IL-13Ra2, IL-2R, IL-5, receptor de laminina inmadura, kalikreína-2, kalikreína-4, Ki67, KIAA0205, IAA0205/m, K-LC-1, K-Ras/m, LAGE-Al, LDLR-FUT, MAGE-Al, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-Al 0, MAGE-A12, MAGE-B1, MAGE-B2, MAGE-B3, MAGE-B4, MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-B 10, MAGE-B16, MAGE-B 17, MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-D1, MAGE-D2, MAGE-D4, MAGE-El, MAGE-E2, MAGE-Fl, MAGE-Hl, MAGEL2, mamaglobina A, MART-l/melan-A, MART-2, MART-2/m, proteína de matriz 22, MC1R, M-CSF, MEl/m, mesotelina, MG50/PXDN, MMP11, MN/CA IX-antígeno, MRP-3, MUC-1, MUC-2, MUM-l/m, MUM-2/m, MUM-3/m, miosina clase I/m, NA88-A, N-acetilglucosaminiltransferasa-V, Neo-PAP, Neo-PAP/m, NFYC/m, NGEP, NMP22, NPM/ALK, N-Ras/m, NSE, NY-ESO-1, NY-ESO-B, OA1, OFA-iLRP, OGT, OGT/m, OS-9, OS-9/m, osteocalcina, osteopontina, pl5, pl90 menor bcr-abl, p53, p53/m, PAGE-4, PAI-1, PAI-2, PART-1, PATE, PDEF, Pim- 1 -cinase, Pin-1, Pml/PARalfa, POTE, PRAME, PRDX5/m, prosterna, proteinasa-3, PSA, PSCA, PSGR, PSM, PSMA, PTPRK/m, RAGE-1, RBAF600/m, RHAMM/CD 168, RUI, RU2, S-100, SAGE, SART-1, SART-2, SART-3, SCC, SIRT2/m, Spl7, SSX-1, SSX-2/HOM-MEL-40, SSX-4, STAMP-1, STEAP, survivina, survivina-2B, SYT-SSX-1, SYT-SSX-2, TA-90, TAG-72, TARP, TEL-AML , TGF beta, TGFbetaRII, TGM-4, TPI/m, TRAG-3, TRG, TRP-1, TRP-2/6b, TRP/INT2, TRP-p8, tirocinasa, UPA, VEGF, VEGFR-2/FLK-1 , and WT1. Estos antígenos tumorales de preferencia pueden seleccionarse del grupo que consiste en MAGE-A1 (por ejemplo, MAGE-A1 de acuerdo con el número de registro M77481), MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A6 (por ejemplo, MAGE-A6 de acuerdo con el número de registro NM 005363), MAGE-Cl, MAGE-C2, melan-A (por ejemplo, melan-A de acuerdo con el número de registro NM_005511), GP100 (por ejemplo, GP100 de acuerdo con el número de registro M77348), tirocinasa (por ejemplo, tirocinasa de acuerdo con el número de registro NM_000372), survivina (por ejemplo, survivina de acuerdo con el número de registro AF077350), CEA (por ejemplo, CEA de acuerdo con el número de registro NM_004363), Her-2/neu (por ejemplo, Her-2/neu de acuerdo con el número de registro MI 1730), WT1 (por ejemplo, WT1 de acuerdo con el número de registro NM_000378), PRAME (por ejemplo, PRAME de acuerdo con el número de registro NM_006115), EGFRI (receptor de factor de crecimiento epidérmico 1) (por ejemplo, EGFRI (receptor de factor de crecimiento epidérmico 1 ) de acuerdo con el número de registro AF288738), MUC l , mucina- 1 (por ej emplo, mucina- 1 de acuerdo con el número de registro NM_002456), SEC61 G (por ej emplo, SEC61 G de acuerdo con el número de registro NM 014302), hTERT (por ej emplo, hTERT número de registro NM_198253), 5T4 (por ej emplo, 5T4 de acuerdo con el número de registro NM_006670), NY-Eso- 1 (por ej emplo, NY-Eso l de acuerdo con el número de registro NM 001 327), TRP-2 (por ej emplo, TRP-2 de acuerdo con el número de registro NM_001922), STEAP, PCA, PSA, PSMA, etc.
De acuerdo con otra alternativa, una clase más de antígenos codificados por la molécula de ácido nucleico del complejo de carga portador polimérico de la invención definido en la presente comprende antígenos alergénicos. Estos antígenos alergénicos pueden seleccionarse de antígenos derivados de diferentes fuentes, por ej emplo, de animales, plantas, hongos, bacterias, etc. los alérgenos en este contexto incluyen por ej emplo céspedes, pólenes, mohos, fármacos o numerosos activadores ambientales, etc. Los antígenos alergénicos pertenecen típicamente a diferentes clases de compuestos, tales como ácidos nucleicos y sus fragmentos, proteínas o péptidos y sus fragmentos, carbohidratos, polisacáridos, azúcares, lípidos, fosfolípidos, etc. De particular interés en el contexto de la presente invención son los antígenos que pueden ser codificados por la molécula de ácido nucleico del complejo de carga portador polimérico de la invención, es decir, antígenos de proteínas o péptidos y sus fragmentos o epítopos, o ácidos nucleicos y sus fragmentos, particularmente ácidos nucleicos y sus fragmentos, que codifican para estos antígenos de proteínas o péptidos y sus fragmentos o epítopos. c) Anticuerpos De acuerdo con una alternativa más, la molécula de ácido nucleico del complejo de carga portador polimérico de la invención definido en la presente puede codificar para un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. De acuerdo con la presente invención, este anticuerpo puede seleccionarse de cualquier anticuerpo, por ej emplo, cualquier anticuerpo producido recombinantemente o de origen natural, conocido en la técnica, en particular anticuerpos adecuados para propósitos terapéuticos, de diagnóstico o científicos, o anticuerpos que hayan sido identificados en relación con enfermedades cancerosas específicas. Aquí, el término "anticuerpo" se usa en su sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales y policlonales (incluyendo anticuerpos agonistas, antagonistas y bloqueadores o neutralizantes) y especies de anticuerpos con la especificidad poliepitópica. De acuerdo con la invención, el término "anticuerpo" comprende típicamente cualquier anticuerpo conocido en la técnica (por ej emplo, anticuerpos IgM, IgD, IgG, IgA e IgE), tales como anticuerpos de origen natural, anticuerpos generados por inmunización en un organismo anfitrión, anticuerpos que fueron aislados e identificados a partir de anticuerpos de origen natural o anticuerpos generados por inmunización en un organismo anfitrión y producidos recombinantemente por métodos biomoleculares conocidos en la técnica, así como anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anti cuerpos biespecíficos, intracuerpo s, es decir, anti cuerpo s expresados en célul as y ubicados opcionalmente en compartimientos celulares específicos, y fragmentos y variantes de los anticuerpos mencionados arriba. En general , un anticuerpo consiste en una cadena ligera y una cadena pesad a que ambas tienen dominios variables y constantes . La cadena ligera consiste en un dominio variable N-terminal, VL, y un dominio constante C-terminal, C L-En contraste, la cadena pesada del anticuerpo IgG, por ej emplo, comprende un dominio variable N-terminal, VH, y tres dominios constantes, C H 1 , C H2 y C H3 .
En el contexto de la presente invención, los anticuerpos codificados por la molécula de ácido nucleico del complej o de carga portador polimérico de la invención definido en la presente pueden comprender de preferencia anticuerpos de longitud completa, es decir, anticuerpo s compuestos de las cadenas pesada completa y ligera compl eta, como se describió arriba. Sin embargo, derivados de anticuerpos tales como fragmentos, variantes o aducios de anticuerpo s también pueden ser codificados por l a molécul a de ácido nucleico del complej o de carga portador polimérico de l a invención definido en la presente. Los fragmentos de anticuerpo se seleccionan de preferencia de fragmentos F ab , Fab ' , F(ab ' )2, Fe, Facb, pFc ' , Fd y Fv de los anticuerpos (de longitud completa) mencionados arriba. En general, los fragmentos de anticuerpo se conocen en la técnica. Por ej emplo, un fragmento Fab ("fragmento, unión a antigeno") está compuesto de un dominio constante y uno variable de cada una de las cadenas pesada y ligera. Los dos dominios variables se unen al epítopo sobre antígenos específicos. Las dos cadenas son conectadas por medio de un enlace de disulfuro. Un fragmento scFv ("fragmento variable de cadena individual"), por ej emplo, consiste típicamente en los dominios variables de las cadenas ligera y pesada. Los dominios son enlazados por un enlace artificial, en general un enlace de polipéptido tal como un péptido compuesto de 1 5-25 residuos de glicina, prolina y/o serina.
En el presente contexto es preferible que las cadenas diferentes del anticuerpo o fragmento de anticuerpo sean codificadas por una molécula de ácido nucleico multicistrónica. Como alternativa, las diferentes cepas del anticuerpo o fragmento de anticuerpo son codificadas por varios ácidos nucleicos (secuencias) monocistrónicos.
ARNsi: De acuerdo con una alternativa más, la molécula de ácido nucleico del complej o de carga portador polimérico de la invención definido en la presente puede estar en forma de ARNds, de preferencia ARNsi. Un ARNds, o un ARNsi, es de interés particularmente en relación con el fenómeno de interferencia de ARN. La técnica in vitro de interferencia de ARN (ARNi) se basa en moléculas de ARN de doble hebra (ARNds), que desencadenan la supresión específi ca de secuencia de la expresión génica (Zamore (2001 ) Nat. Struct. Biol. 9 :746-750; Sharp (2001 ) Genes Dev. 5 :485-490: Hannon (2002) Nature 41 : 244-25 1 ). En la transfección de células de mamífero con ARNds largo, la activación de proteína cinasa R y RnasaL ocasiona efectos no específicos, tales como, por ej emplo, una respuesta a interferón (Stark et al. ( 1 998) Annu. Rev . Biochem. 67 : 227-264; He y Katze (2002) Viral Immunol . 1 5 : 95- 1 19). Estos efectos no específicos se evitan cuando se usa el llamado ARNsi (ARN de interferencia pequeño) más corto, por ejemplo, de 21 a 23 meros, porque los efectos no específicos no son desencadenados por ARNsi que es más corto que 30 pb (Elbashir et al. (2001 ) Nature 41 1 :494-498) .
La molécula de ácido nucleico del complej o de carga portador polimérico de la invención definido en l a presente puede entonces ser un ADN de doble hebra (ARNds) que tenga una lon gitud de 1 7 a 29, de preferencia de 1 9 a 25 y preferiblemente sea al menos 90%, muy preferiblemente 95% y especialmente 100% (de los nucleótidos de un ARNds) complementaria a una sección de la molécula de ácido nucleico de una proteína o antígeno (terapéuticamente relevante) descrita anteriormente en la presente (como ingrediente activo) o de cualquier proteína adicional como la descrita aquí, ya sea una sección de codificación o no codificación, de preferencia una sección de codificación. Esta molécula de ácido nucleico (parte de) puede ser llamada aquí una "secuencia obj etivo" y puede ser cualquier molécula de ácido nucleico como la definida en la presente, de preferencia un ADN genómico, un ADNc, un ARN, por ejemplo, un ARNm, etc., 90% complementario significa que con una longitud de ARNds descrito aquí de, por ejemplo, 20 nucleótidos, el ARNds contiene no más de 2 nucleótidos que no muestra complementariedad con la sección correspondiente de la secuencia objetivo. La secuencia del ARN de doble hebra usado de acuerdo con la invención es, sin embargo, de preferencia completamente complementaria en su estructura general con una sección de la secuencia objetivo. En este contexto la molécula de ácido nucleico del complejo de carga portador polimérico de la invención puede ser un ARNds que tenga la estructura general 5'-(Ni7-2>)-3 ', de preferencia que tenga la estructura general 5'-(N19-25)-3 ', muy preferiblemente que tenga la estructura general 5'-(Ni9-24)-3', o aún más preferiblemente que tenga la estructura general 5 '-(N2i_23)-3 ', en donde para cada estructura general cada N es un nucleótido (de preferencia diferente) de una sección de la secuencia objetivo, de preferencia se selecciona de un número continuo de 17 a 29 nucleótidos de una sección de la secuencia objetivo, y está presente en la estructura general 5'-(N17-29)-3' en su orden natural. En principio, todas las secciones que tienen una longitud de 17 a 29, de preferencia de 19 a 25 pares de bases que se presenten en la secuencia objetivo pueden servir para la preparación de un ARNds como el definido aquí. Igualmente, las moléculas de ARNds usadas como molécula de ácido nucleico del complejo de carga portador polimérico de la invención también se pueden dirigir contra secuencias de nucleótidos de una proteína o antígeno (terapéuticamente relevante) descrito anteriormente en la presente (como ingrediente activo) que no descanse en la región de codificación, en particular en la región de no codificación 5 ' de la secuenci a objetivo, por ej emplo, de esta manera contra regiones de no codificación de la secuencia obj etivo que tengan una función reguladora. La secuencia obj etivo del ARNds usado como una molécula de ácido nucleico del complejo de carga portador polimérico de la invención puede por lo tanto descansar en la región traducida y no traducida de la secuencia obj etivo y/o en la región de los elementos de control de una proteína o antígeno descrito anteriormente aquí. La secuencia obj etivo para un ARNds usada como la molécula de ácido nucleico del complejo de carga portador polimérico de la invención también puede descansar en la región de superposición de una secuencia no traducida y traducida; en particular, la secuencia objetivo puede comprender al menos un nucleótido hacia el extremo 5 ' del triplete de inicio de la región de codificación, por ej emplo, de un ADN genómico, un ADNc, un ARN o un ARNm, etc. Ácidos nucleicos inmunoestimuladores: a) Ácidos nucleicos inmunoestimuladores CpG : De acuerdo con otra alternativa, la molécula de ácido nucleico del complejo de carga portador polimérico de la invención definido aquí puede estar en forma de un ácido nucleico CpG (inmunoestimulador), en particular CpG-ARN o CpG-ADN, que induzca de preferencia una respuesta inmune innata. Un CpG-ARN o CpG-ADN usado de acuerdo con la invención puede ser un CpG-ADN de hebra individual (ss CpG-ADN), un CpG-ADN de doble hebra (ADNds), un CpG-ARN de hebra individual (ss CpG-ARN) o un CpG-ARN de doble hebra (ds CpG-ARN). El ácido nucleico CpG usado de acuerdo con la invención está de preferencia en forma de CpG-ARN, muy preferiblemente en forma de CpG-ARN de hebra individual (ss CpG-ARN). También de preferencia, estos ácidos nucleicos CpG tienen una longitud como la descrita arriba. Preferiblemente los motivos CpG son no metilados. b) ARN inmunoestimulador (ARNsi) : asimismo, de acuerdo con una alternativa más, la molécula de ácido nucleico (inmunoestimuladora) del complejo de carga portador polimérico de la invención puede estar en forma de un ARN inmunoestimulador (ARNsi), que provoque de preferencia una respuesta inmune innata. Este ARN inmunoestimulador puede ser cualquier ARN (doble hebra o hebra individual), por ej emplo un ARN de codificación, como el definido en la presente. De preferencia, el ARN inmunoestimulador puede ser un ARN de hebra individual, doble hebra o parcialmente doble hebra, muy preferiblemente un ARN de hebra individual, y/o un ARN circular o lineal, muy preferiblemente un ARN lineal. Más preferiblemente, el ARN inmunoestimulador puede ser un ARN de hebra individual (lineal). Todavía más preferiblemente, el ARN inmunoestimulador puede ser un ARN de no codificación (largo) (lineal) de una sola hebra)). En este contexto, se prefiere particularmente que el ARNsi porte un trifosfato en su extremo 5 ' que es el caso para el ARN transcrito in vitro . Un ARN inmunoestimulador también se puede presentar como un oligonucleótido de ARN corto como el definido aquí. Un ARN inmunoestimulador según se usa en la presente puede seleccionarse además de cualquier clase de moléculas de ARN, encontradas en la naturaleza o que se preparen sintéticamente, y que pueda inducir una respuesta inmune innata y pueda soportar una respuesta inmune adaptiva inducida por un antígeno. En este contexto, una respuesta inmune puede presentarse de varias maneras. Un factor sustancial para una respuesta inmune (adaptiva) adecuada es la estimulación de diferentes sub-poblaciones de células T. Los linfocitos T se dividen típicamente en dos sub-poblaciones, las células T auxiliares 1 (Th l ) y las células T auxiliares 2 (Th2), con las cuales el sistema inmunológico es capaz de destruir patógenos intracelulares (Th l ) y extracelulares (Th2) (por ejemplo, antígenos). Las dos poblaciones de células Th difieren en el patrón de las proteínas efectoras (citocinas) producidas por ellos. Así, las células Thl asisten en la respuesta inmune celular por la activación de macrófagos y células T citotóxicas. Las células Th2, por otro lado, promueven la respuesta inmune tumoral mediante estimulación de células B para su conversión en células plasmáticas y por la formación de anticuerpos (por ejemplo, contra antígenos). La relación Th l /Th2 es por lo tanto de gran importancia en la inducción y mantenimiento de una respuesta inmune adaptiva. En relación con la presente invención, la relación Th l /Th2 de la respuesta inmune (adaptiva) se desplaza de preferencia en la dirección hacia la respuesta celular (respuesta Thl ) y una respuesta inmune celular es entonces inducida. De acuerdo con un ej emplo, el sistema inmunológico innato que puede soportar una respuesta inmune adaptiva se puede activar por ligandos de receptores tipo Toll (TLRs). Los TLRs son una familia de polipéptidos de receptor de reconocimiento de patrón (PRR) altamente conservados que reconocen patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs) y juegan un papel crítico en inmunidad innata en mamíferos. Actualmente por lo menos trece miembros de la familia, designados TLR 1 -TLR1 3 (receptores tipo Toll : TLR1 , TLR2, TLR3 , TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR 10, TLR 1 1 , TLR 12 o TLR 13), han sido identificados. Además, un número de ligandos TLR específicos han sido identificados. Se encontró por ej emplo que el ADN bacteriano no metilado y análogos sintéticos del mismo (ADN CpG) son ligandos para TLR (Hemmi H et al , (2000) Nature 408 : 740-5; Bauer S et al. (2001 ) Proc NatlAcadSci E.U.A. 98 , 9237-42) . Además, se ha reportado que los ligandos para ciertos TLRs incluyen ciertas moléculas de ácido nucleico y que ciertos tipos de ARN son inmunoestimuladores de una manera independiente de secuencia o dependiente de secuencia, en donde estos diferentes ARNs inmunoestimuladores pueden por ej emplo estimular TLR3 , TLR7 o TLR8 , o receptores intracelulares tales como RIG- 1 , MDA-5, etc. Por ej emplo, Lipford y otros determinaron ciertos oligorribonucleótidos que contienen G,U como inmunoestimuladores al actuar por medio de LTR7 y TLR8 (véase WO 03/086280) . Los oligorribonucl eótidos que contienen G,U inmunoestimuladores descritos por Lipford et al. , se creía que podían derivarse de fuente de ARN incluyendo ARN ribosómico, ARN de transferencia y ARN viral.
El ARN inmunoestimulador (ARNsi) usado como la molécula de ácido nucleico del complej o de carga portador polimérico de la invención definido en la presente puede entonces comprender cualquier secuencia de ARN que se conozca como inmunoestimuladora incluyendo, sin estar limitada a las mismas, secuencias de ARN que representen y/o codifiquen para ligandos de los TLRs, seleccionados de preferencia de miembros de la familia humana TLR 1 -TLR 10 o miembros de la familia murino TLR1 -TLR1 3 , muy preferiblemente seleccionados de la familia TLR 1 -TLR 1 0 (humana), todavía más preferiblemente de TLR7 y TLR8, ligandos para receptores intracelulares para ARN (tales como RIG-I o MDA-5 , etc.) (véase, por ejemplo, Meylan, E. , Tschopp, J. (2006). Toll-like receptors and RNA helicases: two parallel ways to trigger antiviral responses. Mol. Cell 22 , 561 -569), o cualquier otra secuencia de ARN inmunoestimuladora. Más aún las (clases de) moléculas de ARN inmunoestimuladoras, usadas como la molécula de ácido nucleico del complejo de carga portador polimérico de la invención pueden incluir cualquier otro ARN capaz de provocar una respuesta inmune innata. Sin estar limitados a los mismos, este ARN inmunoestimulador puede incluir ARN ribosómico (ARNr), ARN de transferencia (ARNt), ARN mensaj ero (ARNm) y ARN viral (ARNv) . Éste ARN inmunoestimulador puede comprender una longitud de 1 ,000 a 5,000, de 500 a 5,000, de 5 a 5 ,000, o de 5 a 1 ,000, 5 a 500, 5 a 250, de 5 a 1 00, de 5 a 50, o de 5 a 30 nucleótidos.
De acuerdo con una modalidad particularmente preferida, estas secuencias de ácido nucleico inmunoestimuladoras son de preferencia ARN que consiste de preferencia en o comprende un ácido nucleico de la fórmula (II) o (III) : GiXmGn, (fórmula (II)) en donde: G es guanosina, uracilo o un análogo de guanosina o uracilo; X es guanosina, uracilo, adenosina, timidina, citosina o un análogo de los nucleótidos mencionados arriba; 1 es un entero de 1 a 40, en donde cuando 1 = 1 G es guanosina o un análogo de la misma, cuando 1 > 1 al menos 50% de los nucleótidos son guanosina o un análogo de los mismos; m es un entero y es al menos 3 ; en donde cuando m = 3 X es uracilo o un análogo del mismo, cuando m > 3 al menos 3 uracilos sucesivos o análogos de uracilo se presentan; n es un entero de 1 a 40, en donde cuando n = 1 G es guanosina o un análogo de la misma, cuando n > 1 al menos 50% de los nucleótidos son guanosina o un análogo de la misma, C,XmCn, (fórmula (III)) en donde: C es citosina, uracilo o un análogo de citosina o uraicio ; X es guanosina, uracilo, adenosina, timidina, citosina o un análogo de los nucleótidos mencionados arriba; 1 es un entero de 1 a 40, en donde cuando 1 = 1 C es citosina o un análogo de la misma, cuando 1 > 1 al menos 50% de los nucleótidos son citosina o un análogo de la misma; m es un entero y es al menos 3 ; en donde cuando m = 3 X es uracilo o un análogo del mismo, cuando m > 3 al menos 3 uracilos sucesivos o análogos de uracilo se presentan; n es un entero de 1 a 40, en donde cuando n = 1 C es citosina o un análogo de la misma, cuando n > 1 al menos 50% de los nucleótidos son citosina o un análogo de la misma.
Los ácidos nucleicos de la fórmula (II) o (III), los cuales pueden usarse en la carga de ácido nucleico del complejo de carga portador polimérico de la invención pueden ser moléculas de ácido nucleico relativamente cortas con una longitud típica de aproximadamente 5 a 100 (pero también pueden ser más largas que 100 nucleótidos para modalidades específicas, por ejemplo, hasta 200 nucleótidos), de 5 a 90 o de 5 a 80 nucleótidos, de preferencia una longitud de aproximadamente 5 a 70, muy preferiblemente una longitud de aproximadamente 8 a 60 y más preferiblemente una longitud de alrededor de 1 5 a 60 nucleótidos, muy preferiblemente de 20 a 60, más preferiblemente de 30 a 60 nucleótidos. Si el ácido nucleico del complejo de carga de ácido nucleico de la invención tiene una longitud máxima de por ej emplo 100 nucleótidos, m será típicamente <=98. El número de nucleótidos G en el ácido nucleico de la fórmula (II) se determina por I o n. 1 y n, Independientemente uno del otro, son cada uno un entero de 1 a 40, en donde cuando 1 o n = 1 G es guanosina o un análogo de la misma, y cuando 1 o n > 1 al menos 50% de los nucleótidos son guanosina o un análogo de la misma. Por ejemplo, sin implicar ninguna limitación, cuando 1 o n = 4 Gi o Gn pueden ser, por ejemplo, un GUGU, GGUU, UGUG, UUGG, GUUG, GGGU, GGUG, GUGG, UGGG o GGGG, etc. ; cuando 1 o n = 5 G| o Gn pueden ser, por ejemplo, un GGGUU, GGUGU, GUGGU, UGGGU, UGGUG, UGUGG, UUGGG, GUGUG, GGGGU, GGGUG, GGUGG, GUGGG, UGGGG o GGGGG, etc. ; etc. Un nucleótido adyacente a Xm en el ácido nucleico de la fórmula (II) de acuerdo con la invención de preferencia no es un uracilo. De manera similar, el número de nucleótidos C en el ácido nucleico de la fórmula (III) de acuerdo con la invención se determina por I o n. 1 y n, Independientemente uno del otro, son cada uno un entero de 1 a 40, en donde cuando 1 o n = C es citosina o un análogo de la misma, y cuando 1 o n > 1 al menos 50% de los nucleótidos son citosina o un análogo de la misma. Por ej emplo, sin implicar ninguna limitación, cuando 1 o n = 4, Ci o Cn pueden ser, por ejemplo, un CUCU, CCUU, UCUC, UUCC, CUUC, CCCU, CCUC, CUCC, UCCC o CCCC, etc. ; cuando 1 o n = 5 C, o C„ pueden ser, por ej emplo, un CCCUU, CCUCU, CUCCU, UCCCU, UCCUC, UCUCC, UUCCC, CUCUC, CCCCU, CCCUC, CCUCC, CUCCC, UCCCC o CCCCC, etc. ; etc. Un nucleótido adyacente Xm en el ácido nucleico de la fórmula (III) de acuerdo con la invención de preferencia no es un uracilo . Preferiblemente, para la fórmula (II), cuando 1 o n > 1 , al menos 60%, 70%, 80%, 90% o incluso 1 00% de los nucleótidos son guanosina o un análogo de la misma, como se definió arriba. Los nucleótidos restantes hasta 100% (cuando guanosina constituye menos del 100% de los nucleótidos) en la secuencias de flanqueo Gi y/o Gn son uracilo o un análogo del mismo, como se definió anteriormente aquí. También de preferencia, 1 y n, independientemente uno del otro, son cada uno un entero de 2 a 30, muy preferiblemente un entero de 2 a 20 y todavía más preferiblemente un entero de 2 a 15. El límite inferior de 1 o n puede variar si es necesario y es al menos 1 , de preferencia al menos 2, muy preferiblemente al menos 3 , 4, 5, 6, 7, 8 , 9 ó 1 0. Esta definición aplica correspondientemente a la fórmula (III) .
De acuerdo con una modalidad particularmente preferida, un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las fórmulas (II) o (III) arriba, que se puede usar como un ácido nucleico del complejo de carga portador polimérico de la invención, se puede seleccionar de una secuencia que consista o comprenda cualquiera de las siguientes secuencias: - GGUUUUUUUUUUUUUUUGGG (SEQ ID NO: 289); - GGGGGUUUUUUUUUUGGGGG (SEQ ID NO: 290); - GGGGGUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGGGG (SEQ ID NO: 291); - GUGUGUGUGUGUUUUUUUUUUUUUUUUGUGUGUGUGUGU (SEQ ID NO: 292); - GGUUGGUUGGUUUUUUUUUUUUUUUUUGGUUGGUUGGUU (SEQ ID NO: 293); - GGGGGGGGGUUUGGGGGGGG (SEQ ID NO: 294); - GGGGGGGGUUUUGGGGGGGG (SEQ ID NO: 295); - GGGGGGGUUUUUUGGGGGGG (SEQ ID NO: 296); - GGGGGGGUUUUUUUGGGGGG (SEQ ID NO: 297); - GGGGGGUUUUUUUUGGGGGG (SEQ ID NO: 298); - GGGGGGUUUUUUUUUGGGGG (SEQ ID NO: 299); GGGGGGUUUUUUUUUUGGGG (SEQ ID NO: 300); GGGGGUUUUUUUUUUUGGGG (SEQ ID NO: 301); GGGGGUUUUUUUUUUUUGGG (SEQ ID NO: 302); GGGGUUUUUUUUUUUUUGGG (SEQ ID NO: 303); GGGGUUUUUUUUUUUUUUGG (SEQ ID NO: 304); GGUUUUUUUUUUUUUUUUGG (SEQ ID NO: 305); GUUUUUUUUUUUUUUUUUUG (SEQ ID NO: 306); GGGGGGGGGGUUUGGGGGGGGG (SEQ ID NO: 307); GGGGGGGGGUUUUGGGGGGGGG (SEQ ID NO: 308); GGGGGGGGUUUUUUGGGGGGGG (SEQ ID NO: 309); GGGGGGGGUUUUUUUGGGGGGG (SEQ ID NO: 310); GGGGGGGUUUUUUUUGGGGGGG (SEQ ID NO: 311); GGGGGGGUUUUUUUUUGGGGGG (SEQ ID NO: 312); GGGGGGGUUUUUUUUUUGGGGG (SEQ ID NO: 313); GGGGGGUUUUUUUUUUUGGGGG (SEQ ID NO: 314); GGGGGGUUUUUUUUUUUUGGGG (SEQ ID NO: 315); GGGGGUUUUUUUUUUUUUGGGG (SEQ ID NO: 316); GGGGGUUUUUUUUUUUUUUGGG (SEQ ID NO: 317); GGGUUUUUUUUUUUUUUUUGGG (SEQ ID NO: 318); GGUUUUUUUUUUUUUUUUUUGG (SEQ ID NO: 319); GGGGGGGGGGGUUUGGGGGGGGGG (SEQ ID NO: 320); GGGGGGGGGGUUUUGGGGGGGGGG (SEQ ID NO: 321); GGGGGGGGGUUUUUUGGGGGGGGG (SEQ ID NO: 322); - GGGGGGGGGUUUUUUUGGGGGGGG (SEQ ID NO: 323); - GGGGGGGGUUUUUUUUGGGGGGGG (SEQ ID NO: 324); - GGGGGGGGUUUUUUUUUGGGGGGG (SEQ ID NO: 325); - GGGGGGGGUUUUUUUUUUGGGGGG (SEQ ID NO: 326); - GGGGGGGUUUUUUUUUUUGGGGGG (SEQ ID NO: 327); - GGGGGGGUUUUUUUUUUUUGGGGG (SEQ ID NO: 328); - GGGGGGUUUUUUUUUUUUUGGGGG (SEQ ID NO: 329); - GGGGGGUUUUUUUUUUUUUUGGGG (SEQ ID NO: 330); - GGGGUUUUUUUUUUUUUUUUGGGG (SEQ ID NO: 331); - GGGUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGG (SEQ ID NO: 332); - GUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUG (SEQ ID NO: 333); - GGUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGG (SEQ ID NO: 334); - GGGUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGG (SEQ ID NO: 335); - GGGGUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGG (SEQ ID NO: 336); - GGGGGUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGGG (SEQ ID NO: 337); - GGGGGGUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGGGG (SEQ ID NO: 338); - GGGGGGGUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGGGGG (SEQ ID NO: 339); - GGGGGGGGUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGGGGGG (SEQ ID NO: 340); - GGGGGGGGGUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGGGGGGG (SEQ ID NO: 341); - GGUUUGG (SEQ ID NO: 342); - GGUUUUGG (SEQ ID NO: 343); - GGUUUUUGG (SEQ ID NO: 344); - GGUUUUUUGG (SEQ ID NO: 345); - GGUUUUUUUGG (SEQ ID NO: 346); - GGUUUUUUUUGG (SEQ ID NO: 347); - GGUUUUUUUUUGG (SEQ ID NO: 348); - GGUUUUUUUUUUGG (SEQ ID NO: 349); - GGUUUUUUUUUUUGG (SEQ ID NO: 350); - GGUUUUUUUUUUUUGG (SEQ ID NO: 351); - GGUUUUUUUUUUUUUGG (SEQ ID NO: 352); - GGUUUUUUUUUUUUUUGG (SEQ ID NO: 353); - GGUUUUUUUUUUUUUUUGG (SEQ ID NO: 354); - GGGUUUGGG (SEQ ID NO: 355); - GGGUUUUGGG (SEQ ID NO: 356); - GGGUUUUUGGG (SEQ ID NO: 357); - GGGUUUUUUGGG (SEQ ID NO: 358); - GGGUUUUUUUGGG (SEQ ID NO: 359); - GGGUUUUUUUUGGG (SEQ ID NO: 360); - GGGUUUUUUUUUGGG (SEQ ID NO: 361); - GGGUUUUUUUUUUGGG (SEQ ID NO: 362); - GGGUUUUUUUUUUUGGG (SEQ ID NO: 363); - GGGUUUUUUUUUUUUGGG (SEQ ID NO: 364); - GGGUUUUUUUUUUUUUGGG (SEQ ID NO: 365); - GGGUUUUUUUUUUUUUUUGGGUUUUUUUUUUUUUUUGGGUUUUUUUUU UUUUUUGGG (SEQ ID NO: 366); - GGGUUUUUUUUUUUUUUUGGGGGGUUUUUUUUUUUUUUUGGG (SEQ ID NO: 367); - GGGUUUGGGUUUGGGUUUGGGUUUGGGUUUGGGUUUGGGUUUGGGUUU GGG (SEQ ID NO: 368); - GGUUUUUUUUUUUUUUUGGG (short GU-rich, SEQ ID NO: 369) o - CCCUUUUUUUUUUUUUUUCCCUUUUUUUUUUUUUUUCCCUUUUUUUUUU uuuuuccc (SEQ ID NO: 370) - cccuuucccuuucccuuucccuuucccuuucccuuucccuuucccuuucc C (SEQ ID NO: 371) - CCCUUUUUUUUUUUUUUUCCCCCCUUUUUUUUUUUUUUUCCC (SEQ ID NO: 372) o de una secuencia que tenga al menos 60%, 70%, 80%, 90%, o todavía 95% de identidad de secuencia con cualquiera de estas secuencias.
De acuerdo con una modalidad que se prefiere particularmente más, estas secuencias de ácido nucleico inmunoestimuladoras particularmente ARNsi consisten en o comprenden un ácido nucleico de la fórmula (IV) o (V) : (NuG1XmGnNv)a, (fórmula (IV)) en donde: G es guanosina (guanina), uridina (uracilo) o un análogo de guanosina (guanina) o uridina (uracilo), de preferencia guanosina (guanina) o un análogo de la misma; X es guanosina (guanina), uridina (uracilo), adenosina (adenina), timidina (timina), citidina (citosina), o un análogo de estos nucleótidos (nucleósidos), de preferencia uridina (uracilo) o un análogo de la misma; N es una secuencia de ácido nucleico que tiene una longitud de aproximadamente 4 a 50, de preferencia alrededor de 4 a 40, muy preferiblemente alrededor de 4 a 30 o 4 a 20 ácidos nucleicos, cada N se selecciona independientemente de guanosina (guanina), uridina (uracilo), adenosina (adenina), timidina (timina), citidina (citosina) o un análogo de estos nucleótidos (nucleósidos); a es un entero de 1 a 20, de preferencia de 1 a 1 5 , muy preferiblemente de 1 a 10; 1 es un entero de 1 a 40, en donde cuando 1 = 1 , G es guanosina (guanina) o un análogo de la misma, cuando 1 > 1 , al menos 50% de estos nucleótidos (nucleósidos) son guanosina (guanina) o un análogo de la misma; m es un entero y es al menos 3 ; en donde cuando m = 3 , X es uridina (uracilo) o un análogo de la misma, y cuando m > 3 , al menos 3 uridinas (uracilos) sucesivas o análogos de uridina (uracilo) se presentan; n es un entero de 1 a 40, en donde cuando n = 1 , G es guanosina (guanina) o un análogo de la misma, cuando n > 1 , al menos 50% de estos nucleótidos (nucleósidos) son guanosina (guanina) o un análogo de la misma; u, v puede ser independientemente uno del otro un entero de 0 a 50, de preferencia en donde cuando u = 0, v > 1 , o cuando v = 0, u > 1 ; en donde la molécula de ácido nucleico de la fórmula (IV) tiene una longitud de al menos 50 nucleótidos, de preferencia de al menos 1 00 nucleótidos, muy preferiblemente de al menos 1 50 nucleótidos, todavía más preferiblemente de al menos 200 nucleótidos y demasiado preferiblemente de al menos 250 nucléotidos.
(NuC1XmCnNv)a, (fórmula (V)) en donde: C es citidina (citosina), uridina (uracilo) o un análogo de citidina (citosina) o uridina (uracilo), de preferencia citidina (citosina) o un análogo de la misma; X es guanosina (guanina), uridina (uracilo), adenosina (adenina), timidina (timina), citidina (citosina) o un análogo de los nucleótidos (nucleósidos) mencionados arriba, de preferencia uridina (uracilo) o un análogo de la misma; N es cada uno una secuencia de ácido nucleico que tienen independientemente unos de otros una longitud de aproximadamente 4 a 50, de preferencia de alrededor de 4 a 40, muy preferiblemente de alrededor de 4 a 30 o 4 a 20 ácidos nucleicos, cada N se selecciona independientemente de guanosina (guanina), uridina (uracilo), adenosina (adenina), timidina (timina), citidina (citosina) o un análogo de estos nucleótidos (nucleósidos); a es un entero de 1 a 20, de preferencia de 1 a 1 5, muy preferiblemente de 1 a 1 0; 1 es un entero de 1 a 40, en donde cuando 1 = 1 , C es citidina (citosina) o un análogo de la misma, cuando 1 > 1 , al menos 50% de estos nucleótidos (nucleósidos) son citidina (citosina) o un análogo de la misma; m es un entero y es al menos 3 ; en donde cuando m = 3 , X es uridina (uracilo) o un análogo de la misma, cuando m > 3 , al menos 3 uridinas (uracilos) sucesivos o análogos de uridina (uracilo) ocurren; n es un entero de 1 a 40, en donde cuando n = 1 , C es citidina (citosina) o un análogo de la misma, cuando n > 1 , al menos 50% de estos nucleótidos (nucleósidos) son citidina (citosina) o un análogo de l a misma, u, v puede ser independientemente uno de otro un entero de 0 a 50, de preferencia en donde cuando u = 0, v > 1 , o cuando v = 0, u = 1 ; en donde la molécula de ácido nucleico de la fórmula (V) de acuerdo con la invención tiene una longitud de al menos 50 nucleótidos, preferiblemente de al menos 1 00 nucleótidos, muy preferiblemente de al menos 1 50 nucleótidos, todavía más preferiblemente de al menos 200 nucleótidos y demasiado preferiblemente de al menos 250 nucleótidos.
Para la fórmula (V), cualquiera de las definiciones dadas arriba para los elementos N (es decir, Nu y Nv) y X (Xm), particularmente la estructura central como la definida arriba, así como para los enteros a, 1, m, n, u y v, aplica similarmente a los elementos de la fórmula (V) correspondientemente, en donde la fórmula (V) la estructura central se define por CiXmCn. La definición de los elementos de borde Nu y Nv es idéntica a las definiciones dadas arriba para Nu y Nv.
De acuerdo con una modalidad muy particularmente preferida, la molécula de ácido nucleico de la invención de acuerdo con la fórmula (IV) puede seleccionarse de, por ej emplo, cualquiera de las siguientes secuencias : UAGCGAAGCUCUUGGACCUAGGUUUUUUUUUUUUUUUGGGUGCGUUCCUAG AAGUACACG (SEQ ID NO: 373) UAGCGAAGCUCUUGGACCUAGGUUUUUUUUUUUUUUUGGGUGCGUUCCUAG AAGUACACGAUCGCUUCGAGAACCUGGAUCCAAAAAAAAAAAAAAACCCAC GCAAGGAUCUUCAUGUGC (SEQ ID NO: 374) GGGAGAAAGCUCAAGCUUGGAGCAAUGCCCGCACAUUGAGGAAACCGAGUU GCAUAUCUCAGAGUAUUGGCCCCCGUGUAGGUUAUUCUUGACAGACAGUGG AGCUUAUUCACUCCCAGGAUCCGAGUCGCAUACUACGGUACUGGUGACAGAC CUAGGUCGUCAGUUGACCAGUCCGCCACUAGACGUGAGUCCGUCAAAGCAGU UAGAUGUUACACUCUAUUAGAUC (SEQ ID NO: 375) GGGAGAAAGCUCAAGCUUGGAGCAAUGCCCGCACAUUGAGGAAACCGAGUU GCAUAUCUCAGAGUAUUGGCCCCCGUGUAGGUUAUUCUUGACAGACAGUGG AGCUUAUUCACUCCCAGGAUCCGAGUCGCAUACUACGGUACUGGUGACAGAC CUAGGUCGUCAGUUGACCAGUCCGCCACUAGACGUGAGUCCGUCAAAGCAGU UAGAUGUUACACUCUAUUAGAUCUCGGAUUACAGCUGGAAGGAGCAGGAGU AGUGUUCUUGCUCUAAGUACCGAGUGUGCCCAAUACCCGAUCAGCUUAUUA ACGAACGGCUCCUCCUCUUAGACUGCAGCGUAAGUGCGGAAUCUGGGGAUCA AAUUACUGACUGCCUGGAUUACCCUCGGACAUAUAACCUUGUAGCACGCUGU UGCUGUAUAGGUGACCAACGCCCACUCGAGUAGACCAGCUCUCUUAGUCCGG ACAAUGAUAGGAGGCGCGGUCAAUCUACUUCUGGCUAGUUAAGAAUAGGCU GCACCGACCUCUAUAAGUAGCGUGUCCUCUAG (SEQ ID NO: 376) GGGAGAAAGCUCAAGCUUGGAGCAAUGCCCGCACAUUGAGGAAACCGAGUU GCAUAUCUCAGAGUAUUGGCCCCCGUGUAGGUUAUIJCUUGACAGACAGUGG AGCUUAUUCACUCCCAGGAUCCGAGUCGCAUACUACGGUACUGGUGACAGAC CUAGGUCGUCAGUUGACCAGUCCGCCACUAGACGUGAGUCCGUCAAAGCAGU UAGAUGUUACACUCUAUUAGAUCUCGGAUUACAGCUGGAAGGAGCAGGAGU AGUGUUCUUGCUCUAAGUACCGAGUGUGCCCAAUACCCGAUCAGCUUAUUA ACGAACGGCUCCUCCUCUUAGACUGCAGCGUAAGUGCGGAAUCUGGGGAUCA AAUUACUGACUGCCUGGAUUACCCUCGGACAUAUAACCUUGUAGCACGCUGU UGCUGUAUAGGUGACCAACGCCCACUCGAGUAGACCAGCUCUCUUAGUCCGG ACAAUGAUAGGAGGCGCGGUCAAUCUACUUCUGGCUAGUUAAGAAUAGGCU GCACCGACCUCUAUAAGUAGCGUGUCCUCUAGAGCUACGCAGGUUCGCAAUA AAAGCGUUGAUUAGUGUGCAUAGAACAGACCUCUUAUUCGGUGAAACGCCA GAAUGCUAAAUUCCAAUAACUCUUCCCAAAACGCGUACGGCCGAAGACGCGC GCUUAUCUUGUGUACGUUCUCGCACAUGGAAGAAUCAGCGGGCAUGGUGGU AGGGCAAUAGGGGAGCUGGGUAGCAGCGAAAAAGGGCCCCUGCGCACGUAG CUUCGCUGUUCGUCUGAAACAACCCGGCAUCCGUUGUAGCGAUCCCGUUAUC AGUGUUAUUCUUGUGCGCACUAAGAUUCAUGGUGUAGUCGACAAUAACAGC GUCUUGGCAGAUUCUGGUCACGUGCCCUAUGCCCGGGCUUGUGCCUCUCAGG UGCACAGCGAUACUUAAAGCCUUCAAGGUACUCGACGUGGGUACCGAUUCG UGACACUUCCUAAGAUUAUUCCACUGUGUUAGCCCCGCACCGCCGACCUAAA CUGGUCCAAUGUAUACGCAUUCGCUGAGCGGAUCGAUAAUAAAAGCUUGAA UU (SEQ ID NO: 377) GGGAGAAAGCUCAAGCUUAUCCAAGUAGGCUGGUCACCUGUACAACGUAGC CGGUAUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGACCGUCUCAAGGUCCAAGUUAGU CUGCCUAUAAAGGUGCGGAUCCACAGCUGAUGAAAGACUUGUGCGGUACGG UUAAUCUCCCCUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUAGUAAAUGCGUCUACUGAA UCCAGCGAUGAUGCUGGCCCAGAUC (SEQ ID NO: 378) GGGAGAAAGCUCAAGCUUAUCCAAGUAGGCUGGUCACCUGUACAACGUAGC CGGUAUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGACCGUCUCAAGGUCCAAGUUAGU CUGCCUAUAAAGGUGCGGAUCCACAGCUGAUGAAAGACUUGUGCGGUACGG UUAAUCUCCCCUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUAGUAAAUGCGUCUACUGAA UCCAGCGAUGAUGCUGGCCCAGAUCUUCGACCACAAGUGCAUAUAGUAGUCA UCGAGGGUCGCCUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGCCCAGUUCUGAGAC UUCGCUAGAGACUACAGUUACAGCUGCAGUAGUAACCACUGCGGCUAUUGC AGGAAAUCCCGUUCAGGUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUCCGCUCACUAUGA UUAAGAACCAGGUGGAGUGUCACUGCUCUCGAGGUCUCACGAGAGCGCUCG AUACAGUCCUUGGAAGAAUCUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGUGCGACGA UCACAGAGAACUUCUAUUCAUGCAGGUCUGCUCUA (R 722 SEQ ID NO: 379) GGGAGAAAGCUCAAGCUUAUCCAAGUAGGCUGGUCACCUGUACAACGUAGC CGGUAUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGACCGUCUCAAGGUCCAAGUUAGU CUGCCUAUAAAGGUGCGGAUCCACAGCUGAUGAAAGACUUGUGCGGUACGG UUAAUCUCCCCUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUAGUAAAUGCGUCUACUGAA UCCAGCGAUGAUGCUGGCCCAGAUCUUCGACCACAAGUGCAUAUAGUAGUCA UCGAGGGUCGCCUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGCCCAGUUCUGAGAC UUCGCUAGAGACUACAGUUACAGCUGCAGUAGUAACCACUGCGGCUAUUGC AGGAAAUCCCGUUCAGGUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUCCGCUCACUAUGA UUAAGAACCAGGUGGAGUGUCACUGCUCUCGAGGUCUCACGAGAGCGCUCG AUACAGUCCUUGGAAGAAUCUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGUGCGACGA UCACAGAGAACUUCUAUUCAUGCAGGUCUGCUCUAGAACGAACUGACCUGAC GCCUGAACUUAUGAGCGUGCGUAUUUUUUUUUUUUIJUUUUUUUUUUCCUCC CAACAAAUGUCGAUCAAUAGCUGGGCUGUUGGAGACGCGUCAGCAAAUGCC GUGGCUCCAUAGGACGUGUAGACUUCUAUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUCC CGGGACCACAAAUAAUAUUCUUGCUUGGUUGGGCGCAAGGGCCCCGUAUCA GGUCAUAAACGGGUACAUGUUGCACAGGCUCCUUUUUUUUUUUUUUUUUUU UUUUCGCUGAGUUAUUCCGGUCUCAAAAGACGGCAGACGUCAGUCGACAAC ACGGUCUAAAGCAGUGCUACAAUCUGCCGUGUUCGUGUUUUUUUUUUUUUU UUUUUUGUGAACCUACACGGCGUGCACUGUAGUUCGCAAUUCAUAGGGUAC CGGCUCAGAGUUAUGCCUUGGUUGAAAACUGCCCAGCAUACUUUUUUUUUU UUUUUUUUUUCAUAUUCCCAUGCUAAGCAAGGGAUGCCGCGAGUCAUGUUA AGCUUGAAUU (SEQ ID NO: 380) De acuerdo con otra modalidad que se prefiere muy particularmente, la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la fórmula (V) puede seleccionarse de, por ej emplo cualquiera de las siguientes secuencias : UAGCGAAGCUCUUGGACCUACCUUUUUUUUUUUUUUCCCUGCGUUCCUAGA AGUACACG (SEQ ID NO: 381) o UAGCGAAGCUCUUGGACCUACCUUUUUUUUUUUUUUUCCCUGCGUUCCUAG AAGUACACGAUCGCUUCGAGAACCUGGAUGGAAAAAAAAAAAAAAAGGGAC GCAAGGAUCUUCAUGUGC (SEQ ID NO: 382) En una modalidad que se prefiere más la molécula de ácido nucleico del complejo de carga portador polimérico de la invención definido aquí también se puede presentar en forma de un ácido nucleico modificado.
De acuerdo con un primer aspecto, la molécula de ácido nucleico del complejo de carga portador polimérico de la invención definido aquí puede proporcionarse como un "ácido nucleico estabilizado", preferiblemente como un A N o ADN estabilizado, muy preferiblemente como un ARN que sea esencialmente resistente a degradación in vivo (por ej emplo, por una exo- o endo-nucleasa).
En este contexto, la molécula de ácido nucleico del complejo de carga portador polimérico definido aquí puede contener modificaciones en el esqueleto, modificaciones de azúcar o modificaciones de base. Una modificación de esqueleto en relación con la presente invención es una modificación en la cual los fosfatos del esqueleto de los nucleótidos contenidos en la molécula de ácido nucleico del complejo de carga portador polimérico de la invención se modifican químicamente. Una modificación de azúcar en relación con la presente invención es una modificación química del azúcar de los nucleótidos de la molécula de ácido nucleico del complej o de carga portador polimérico de la invención. Además, una modificación de base en relación con la presente invención es una modificación química de la conexión de base de los nucleótidos de la molécula de ácido nucleico del complejo de carga portador polimérico de la invención.
De acuerdo con un aspecto más, la molécula de ácido nucleico del complejo de carga portador polimérico de la invención definido en la presente puede contener una modificación de lípidos. Este ácido nucleico modificado en lípidos comprende típicamente un ácido nucleico como el definido en la presente. Esta molécula de ácido nucleico modificado en lípidos del complejo de carga portador polimérico de la invención típicamente comprende además al menos un enlazador enlazado covalentemente con esa molécula de ácido nucleico, y por lo menos un lípido enlazado covalentemente con el enlazador respectivo. Como alternativa, la molécula de ácido nucleico modificada en lípidos comprende al menos una molécula de ácido nucleico como la definida en la presente y al menos un lípido (bifuncional) enlazado covalentemente (sin un enlazador) con esa molécula de ácido nucleico . De acuerdo con una tercera alternativa, la molécula de ácido nucleico modificada en lípidos comprende una molécula de ácido nucleico como la definida aquí, al menos un enlazador enlazado covalentemente con esa molécula de ácido nucleico, y por lo menos un lípido enlazado covalentemente con el enlazador respectivo, y también por lo menos un lípido (bifuncional) enlazado covalentemente (sin un enlazador) con esa molécula de ácido nucleico.
La molécula de ácido nucleico del complejo de carga portador polimérico de la invención puede asimismo ser estabilizada para de esta manera evitar la degradación de la molécula de ácido nucleico por varios enfoques, particularmente, cuando se use ARN o ARNm como una molécula de ácido nucleico para el propósito de la invención. Se sabe en la técnica que la inestabilidad y degradación (rápida) de ARN en general pueden representar un serio problema en la aplicación de composiciones a base de ARN. Esta inestabilidad del ARN se debe típicamente a enzimas degradadoras de ARN, "ARNasas" (ribonucleasas), en donde la contaminación con estas ribonucleasas puede algunas veces degradar completamente al ARN en solución. En consecuencia, la degradación natural del ARN en el citoplasma de las células se regula de manera muy fina y las contaminaciones por RNasa pueden eliminarse generalmente por un tratamiento especial antes del uso de dichas composiciones, en particular con pirocarbonato de dietilo (DEPC). Se conoce un número de mecanismos de degradación natural en este sentido en la técnica anterior, los cuales se pueden utilizar también. Por ejemplo, la estructura terminal es típicamente de importancia crítica particularmente para un ARNm. Como un ejemplo, en el extremo 5 ' de moléculas de ARNm de origen natural normalmente hay una llamada "estructura de tapa" (un nucleótido de guanosina modificado), y en el extremo 3 ' típicamente se encuentra una secuencia de hasta 200 nucleótidos de adenosina (la llamada cola poli-A).
De acuerdo con otro aspecto, la molécula de ácido nucleico del complej o de carga portador polimérico de la invención definido en la presente puede ser modificada, y de esta manera estabilizada, especialmente si la molécula de ácido nucleico está en forma de un ácido nucleico, por ej emplo, un ARNm, al modificar el contenido de G/C de la molécula de ácido nucleico, particularmente un ARNm, de preferencia de la región de codificación de la misma.
En un aspecto particularmente preferido de la presente invención, el contenido de G/G de la región de codificación de la molécula de ácido nucleico del complejo de carga portador polimérico de la invención definido en la presente, especialmente si la molécula de ácido nucleico está en forma de un ARNm, se modifica, particularmente se incrementa, en comparación con el contenido de G/C de la región de codificación de su secuencia de codificación tipo silvestre particular, es decir, el ARNm no modificado. La secuencia de aminoácidos codificada de la secuencia de ácido nucleico de preferencia no se modifica en comparación con la secuencia de aminoácidos codificada del ARNm tipo silvestre particular.
La modificación del contenido de G/C de la molécula de ácido nucleico del complejo de carga portador polimérico de la invención definido en la presente, especialmente si la molécula de ácido nucleico está en forma de un ARNm o codifica para un ARNm, se basa en el hecho de que la secuencia de cualquier región de ARNm que será traducida es importante para una traducción eficiente de ese ARNm. Así, la composición y la secuencia de varios nucleótidos son importantes . En particular, las secuencias que tienen un contenido incrementado de G (guanosina) C (citosina) son más estables que las secuencias que tienen un contenido incrementado de A (adenosina)/U (uracilo) . De acuerdo con la invención, los codones de la secuencia de codificación o ARNm son por lo tanto vari ados en comparación con su secuencia de codificación tipo silvestre o ARNm, mientras conservan la secuencia de aminoácidos traducida, de tal manera que incluyan una cantidad incrementada de nucleótidos de G/C. Con respecto al hecho de que varios codones codifican para uno y el mismo aminoácido (la llamada degeneración del código genético), los codones más favorables para la estabilidad pueden ser determinados (el llamado uso de codones alternativos).
De preferencia, el contenido de G/C de la región de codificación de la molécula de ácido nucleico del complejo de carga portador polimérico de la invención definido en la presente, especialmente si el ácido nucleico está en forma de un ARNm o codifica para un ARNm, se incrementa en al menos 7%, muy preferiblemente en al menos 1 5 %, de manera particularmente preferible en al menos 20%, en comparación con el contenido de G/C de la región codificada del ARNm de tipo silvestre. De acuerdo con un aspecto específico por lo menos 5%, 1 0%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, muy preferiblemente al menos 70%, todavía más preferiblemente al menos 80% y demasiado preferiblemente al menos 90%, 95% o incluso 100% de los codones sustituibles en la región que codifica para una proteína o péptido como el definido aquí o su fragmento o variante del mismo o la secuencia completa de la secuencia de ARNm tipo silvestre o secuencia de codificación son sustituidos, incrementando de esta manera el contenido de G/C de dicha secuencia.
En este contexto, es particularmente preferible incrementar el contenido de G/C de la molécula de ácido nucleico del complejo de carga portador polimérico de la invención definido en la presente, especialmente si el ácido nucleico está en forma de un ARNm o codifica para un ARNm, al máximo (es decir, 1 00% de los codones sustituibles), en particular en la región que codifica para una proteína, en comparación con la secuencia tipo silvestre.
De acuerdo con la invención, una modificación que se prefiere más de la molécula de ácido nucleico del complejo de carga portador polimérico de la invención definido en la presente, especialmente si el ácido nucleico está en forma de un ARNm o codifica para un ARNm, se basa en el descubrimiento de que la eficiencia de traducción también se determina por una frecuencia diferente en la ocurrencia de moléculas de ARNt en células. Así, si los llamados "codones raros" están presentes en la molécula de ácido nucleico del complejo de carga portador polimérico de la invención, especialmente si el ácido nucleico está en forma de un ARNm o codifica para un ARNm, en un grado incrementado, la molécula de ácido nucleico modificada correspondiente se traduce en un grado significativamente más deficiente que en el caso cuando están presentes los codones que codifican para moléculas de ARNt relativamente "frecuentes".
Especialmente si la molécula de ácido nucleico modificada del complej o de carga portador polimérico de la invención definido en la presente está en forma de un ARNm o codifica para un ARNm, la región de codificación del ácido nucleico modificado se modifica de preferencia en comparación con la región correspondiente del ARNm tipo silvestre o secuencia de codificación de tal manera que al menos un codón de la secuencia tipo silvestre que codifique para un ARNt que sea relativamente raro en la célula se intercambie por un codón que codifique para un ARNt que sea relativamente frecuente en la célula y porte el mismo aminoácido que el ARNt relativamente raro. Mediante esta modificación, las secuencias de la molécula de ácido nucleico del complej o de carga portador polimérico de la invención, especialmente si el ácido nucleico está en forma de un ARNm o codifica para un ARNm, se modifica de tal manera que se inserten codones para los cuales están disponibles moléculas de ARNt que se presentan frecuentemente. En otras palabras, de acuerdo con la invención, mediante esta modificación todos los codones de la secuencia tipo silvestre que codifican para un ARNt que es relativamente raro en la célula pueden en cada caso ser intercambiados por un codón que codifique para un ARNt que sea relativamente frecuente en la célula y el cual, en cada caso, porte el mismo aminoácido que el ARNt relativamente raro.
Qué moléculas de ARNt se presentan de manera relativamente frecuente en la célula y cuáles, en contraste, se presentan de forma relativamente rara se desconoce por una persona experta en la técnica; véase, por ej emplo, Akashi, Curr. Opin. Genet. Dev. 2001 , 1 1 (6) : 660-666. Los codones que usan el aminoácido particular cuyo ARNt se presenta más frecuentemente, por ejemplo, el codón Gly, que usa el ARNt que se presenta más frecuentemente en la célula (humana), se prefiere particularmente.
De acuerdo con la invención, es particularmente preferible enlazar el contenido de G/C secuencial que es incrementado, en particular maximizado, en la molécula de ácido nucleico modificada del complejo de carga portador polimérico de la invención definido en la presente, especialmente si el ácido nucleico está en forma de un ARNm o codifica para un ARNm, con los codones "frecuentes" sin modificar la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por la región de codificación de la molécula de ácido nucleico. Este aspecto preferido permite la provisión de una molécula de ácido nucleico traducida de manera particularmente eficiente y estabilizada (modificada) del complejo de carga portador polimérico de la invención, especialmente si el ácido nucleico está en forma de un ARNm o codifica para un ARNm.
De acuerdo con un aspecto preferido m ás de la invención, la molécula de ácido nucleico del complejo de carga portador polimérico de la invención definido en la presente, especialmente si el ácido nucleico está en forma de una molécula de ácido nucleico de codificación, tiene de preferencia al menos una secuencia de estabilización 5 ' y/o 3 ' . Estas secuencias de estabilización en las regiones no traducidas 5 ' y/o 3 ' tienen el efecto de incrementar la vida media del ácido nucleico en el citosol. Estas secuencias de estabilización pueden tener 1 00% de identidad de secuencia con secuencias de origen natural que se presenten en virus, bacterias y eucariontes, pero también pueden ser parcial o completamente sintéticas. Las secuencias no traducidas (UTR) del gen de (alfa)-globina, por ej emplo, de Homo sapiens o Xenopus laevis, pueden mencionarse como un ej emplo de secuencias de estabilización que se pueden usar en la presente invención para un ácido nucleico estabilizado. Otro ej emplo de una secuencia de estabilización tiene la fórmula general (C/U)CCANxCCC(U/A)PyxUC(C/U)CC (SEQ ID NO : 383 ), que está contenida en la 3 'UTR del ARN muy estable que codifica para (alfa)-globina, colágeno tipo (I), 1 5-lipoxigenasa o para torisina hidroxilasa (véase, Holcik et al., Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 1 997, 94: 241 0 a 241 4). Estas secuencias de estabilización pueden por supuesto usarse individualmente o en combinación unas con otras y también en combinación con otras secuencias de estabilización conocidas por una persona experta en la técnica.
No obstante, sustituciones, adiciones o eliminaciones de bases se llevan a cabo de preferencia con la molécula de ácido nucleico del complej o de carga portador polimérico de la invención como el definido en la presente, especialmente si el ácido nucleico está en forma de un ARNm, usando una matriz de ADN para la preparación de la molécula de ácido nucleico mediante técnicas de la bien conocida mutagénesis dirigida a sitio o con una estrategia de ligación de oligonucleótidos (véase, por ejemplo, Maniatis et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3a edición, Cold Spring Harbor, NY, 2001 ). En ese proceso, para la preparación de la molécula de ácido nucleico del complej o de carga portador polimérico de la invención definido en la presente, especialmente si el ácido nucleico está en forma de un ARNm, una molécula de ADN correspondiente puede transcribirse in vitro. Esta matriz de ADN comprende de preferencia un promotor adecuado, por ej emplo, un promotor T7 o SP6, para transcripción in vitro, el cual es seguido por la secuencia de nucleótidos deseada para la molécula de ácido nucleico, por ej emplo, ARNm, que se preparará y una señal de terminación para transcripción in vitro. La molécula de ADN, que forma la matriz del por lo menos un ARN de interés, puede prepararse mediante proliferación fermentativa y subsecuente aislamiento como parte de un plásmido que pueda replicarse en bacterias. Los plásmidos que pueden mencionarse como adecuados para la presente invención son, por ej emplo, los plásmidos pT7Ts (GenBank número de registro U26404; Lai et al. , Development 1995 , 121 : 2349 a 2360), la serie pGEM®, por ej emplo, pGEM®- l (GenBank número de registro X65300; de Promega) y pSP64 (GenBank número de registro X65327); véase también Mezei y Storts, Purification of PCR Products, in: Griffin and Griffin (ed.)> PCR Technology: Current Innovation, CRC Press, Boca Ratón, FL, 2001 .
Las moléculas de ácido nucleico usadas de acuerdo con la invención como las definidas en la presente pueden prepararse usando cualquier método conocido en la técnica, incluyendo métodos sintéticos tales como, por ej emplo, síntesis en fase sólida, así como métodos in vitro, tales como reacciones de transcripción in vitro.
De acuerdo con otro aspecto particularmente preferido, la molécula de ácido nucleico del complejo de carga portador polimérico de la invención como el definido en la presente, especialmente si el ácido nucleico está en forma de una molécula de ácido nucleico de codificación puede como alternativa o además codificar para un péptido de señal secretora. Estos péptidos de señal son secuencias que exhiben típicamente una longitud de aproximadamente 1 5 a 30 aminoácidos y se ubican de preferencia en el extremo N del péptido codificado, sin estar limitadas a las mismas. Los péptidos de señal como los definidos aquí permiten de preferencia el transporte de la proteína o péptido codificado por la molécula de ácido nucleico del complejo de carga portador polimérico de la invención definido en la presente, especialmente si el ácido nucleico está en forma de un ARNm, en un compartimiento celular definido, de preferencia la superficie celular, el retículo endoplásmico (ER) o el compartimiento endosómico-lisosómico. Ej emplos de secuencias de péptidos de señal secretora como las definidas en la presente incluyen, sin estar limitadas a las mismas, secuencias de señal de moléculas MHC clásicas o no clásicas (por ej emplo, secuencias de señal de moléculas MHC I y II, por ejemplo, de la molécula MHC clase I HLA-A* 0201 ), secuencias de señal de citocinas o inmunoglobulinas como las definidas en la presente, secuencias de señal de la cadena invariante de inmunoglobulinas o anticuerpos como las definidas aquí, secuencias de señal de Lamp l , Tapasina, Erp57, Calreticulina, Calnexina y proteínas asociadas a membrana adici onales o de proteínas asociadas con el retículo endoplásmico (ER) o el compartimiento endosómico-lisosómico. De manera particularmente preferible, pueden usarse de acuerdo con la presente invención secuencias de señal de la molécula MHC clase I HLA-A* 0201 .
Cualquiera de las modificaciones anteriores se puede aplicar a la molécula de ácido nucleico del complejo de carga portador polimérico de la invención definido en la presente y además a cualquier ácido nucleico usado en el contexto de la presente invención y pueden ser, si es adecuado o necesario, combinadas entre sí en cualquier combinación, siempre y cuando estas combinaciones de modificaciones no interfieran unas con otras en el ácido nucleico respectivo. Una persona experta en la técnica será capaz de hacer esta elección en consecuencia.
La molécula de ácido nucleico del complejo de carga portador polimérico de la invención definido en la presente así como proteínas o péptidos codificados por esta molécula de ácido nucleico pueden comprender fragmentos o variantes de esas secuencias. Estos fragmentos o variantes pueden comprender típicamente una secuencia que tenga una identidad de secuencia con uno de los ácidos nucleicos mencionados arriba, o con una de las proteínas o péptidos o secuencias, si es codificada por la por lo menos una molécula de ácido nucleico, de al menos 5 %, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, de preferencia al menos 70%, muy preferiblemente al menos 80%, igualmente de manera muy preferible por lo menos 8%, todavía más preferiblemente al menos 90% y demasiado preferiblemente al menos 95% o incluso 97%, 98 % o 99%, con la secuencia tipo silvestre completa, ya sea a nivel de ácido nucleico o a nivel de aminoácido.
Los "fragmentos" de proteínas o péptidos en el contexto de la presente invención (codificados por un ácido nucleico como el definido aquí) pueden comprender una secuencia de una proteína o péptido como la definida en la presente la cual sea, con respecto a su secuencia de aminoácidos (o su molécula de ácido nucleico codificada), truncada N-terminalmente, C-terminalmente y/o intrasecuencialmente en comparación con la secuencia de aminoácidos de la proteína original (nativa) (o su molécula de ácido nucleico codificada). Este truncamiento puede entonces presentarse ya sea a nivel de aminoácido o correspondientemente a nivel de ácido nucleico. Una identidad de secuencia con respecto a este fragmento como el definido en la presente puede por lo tanto referirse de preferencia a la proteína o péptido completo como el definido en la presente o a la molécula de ácido nucleico (de codificación) completa de esta proteína o péptido . Asimismo, "fragmentos" de ácidos nucleicos en el contexto de la presente invención pueden comprender una secuenci a de un ácido nucleico como el definido aquí, que sea, con respecto a su molécula de ácido nucleico truncada 5 ' , 3 ' y/o intrasecuencialmente en comparación con la molécula de ácido nucleico de la molécula de ácido nucleico original (nativa). Una identidad de secuencia con respecto a este fragmento como el definido aquí puede por lo tanto referirse de preferencia al ácido nucleico completo como el definido en la presente.
Los fragmentos de proteínas o péptidos en el contexto de la presente invención (por ej emplo, como los codificados por la molécula de ácido nucleico del complejo de carga portador polimérico de la invención) pueden comprender además una secuencia de una proteína o péptido como la definida aquí, que tenga una longitud de aproximadamente 6 a alrededor de 20 o incluso más aminoácidos, por ejemplo, fragmentos como los procesados o presentados por moléculas MH clase I, de preferencia que tengan una longitud de aproximadamente 8 a alrededor de 1 0 aminoácidos, por ej emplo, 8 , 9 ó 10 (o incluso 6, 7, 1 1 ó 12 aminoácidos), o fragmentos procesados y presentados por moléculas MHC clase II, que tengan de preferencia una longitud de aproximadamente 1 3 o más aminoácidos, por ej emplo, 13 , 14, 1 5, 16, 17, 1 8, 19, 20 o incluso más aminoácidos, en donde estos fragmentos pueden seleccionarse de cualquier parte de la secuencia de aminoácidos. Estos fragmentos son típicamente reconocidos por células T en forma de un complejo que consiste en el fragmento de péptido y una molécula MHC, es decir, los fragmentos típicamente no son reconocidos en su forma nativa.
Los fragmentos de proteínas o péptidos como los definidos aquí (por ejemplo, como los codificados por la molécula de ácido nucleico del complej o de carga portador polimérico de la invención) también pueden comprender epítopos de esas proteínas o péptidos. Los epítopos (también llamados "determinantes antigénicos") en el contexto de la presente invención son típicamente fragmentos ubicados sobre la superficie exterior de proteínas o péptidos (nativos) como los definidos aquí, que tienen de preferencia 5 a 1 5 aminoácidos, muy preferiblemente que tienen 5 a 1 2 aminoácidos, todavía más preferiblemente que tienen 6 a 9 aminoácidos, los cuales pueden ser reconocidos por anticuerpos o receptores de células B, es decir, en su forma nativa. Estos epítopos de proteínas o péptidos pueden además seleccionarse de cualquiera de las variantes mencionadas en la presente de estas proteínas o péptidos. En este contexto los determinantes antigénicos pueden ser epítopos de conformación o discontinuos que estén compuestos de segmentos de las proteínas o péptidos como las definidos aquí que sean discontinuos en la secuencia de aminoácidos de las proteínas o péptidos como los definidos en la presente pero que se junten en la estructura tridimensional o epítopos continuos o lineales que estén compuestos de una sola cadena de polipéptidos.
Las "variantes" de proteínas o péptidos como las definidas en el contexto de la presente invención (por ejemplo, como las codificadas por el ácido nucleico como el definido aquí) pueden ser codificadas por la molécula de ácido nucleico del complejo de carga portador polimérico de la invención. De esta manera, se puede generar una proteína o péptido que tenga una secuencia de aminoácidos que difiera de la secuencia original en una o más mutaciones, tal como uno o más aminoácidos sustituidos, insertados y/o suprimidos. De preferencia, estos fragmentos y/o variantes tienen la misma función biológica o actividad específica en comparación con la proteína nativa de longitud completa, por ej emplo, su propiedad antigénica específica.
Las "variantes" de proteínas o péptidos como las definidas en el contexto de la presente invención (por ejemplo, como las codificadas por un ácido nucleico como el definido en la presente) pueden comprender sustituciones de aminoácidos conservadoras en comparación con su secuencia nativa, es decir, fisiológica no rriutada. Esas secuencias de aminoácidos así como sus secuencias de nucleótidos de codificación en particular están dentro del término variantes como el definido aquí. Las sustituciones en las cuales aminoácidos, que se originan de la misma clase, son intercambiados unos por otros son llamadas sustituciones conservadoras. En particular, estos son aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas, cadenas laterales cargadas positiva o negativamente, grupos aromáticos en las cadenas laterales o aminoácidos, cuyas cadenas laterales pueden entrar en puentes de hidrógeno, por ejemplo, cadenas laterales que tienen una función hidroxilo. Esto significa que por ej emplo un aminoácido que tenga una cadena lateral polar es reemplazado por otro aminoácido que tiene una cadena lateral igualmente polar, o, por ejemplo, un aminoácido caracterizado por una cadena lateral hidrófoba es sustituido por otro aminoácido que tiene una cadena lateral igualmente hidrófoba (por ej emplo, serina (treonina) por treonina (serina) o leucina (isoleucina) por isoleucina (leucina)). Son posibles inserciones y sustituciones, en particular, en aquellas posiciones de secuencia que no causen modificaciones en la estructura tridimensional o no afecten la región de unión. Las modificaciones a una estructura tridimensional por inserciones o supresiones pueden determinarse fácilmente por ej emplo usando espectros CD (espectros de dicroísmo circular) (Urry, 1 985, Absorption, Circular Dichroism and ORD of Polypeptides, in: Modern Physical Methods in Biochemistry, Neuberger et al. (ed.), Elsevier, Amsterdam).
Más aún, las variantes de proteínas o péptidos como los definidos en la presente, que pueden ser codificadas por la molécula de ácido nucleico del complejo de carga portador polimérico de la invención, también pueden comprender aquellas secuencias en las que los nucleótidos del ácido nucleico sean intercambiados de acuerdo con la degeneración del código genético, sin llevar una alteración de la secuencia de aminoácidos de la proteína o péptido respectiva, es decir, la secuencia de aminoácidos o al menos parte de la misma puede no diferir de la secuencia original en una o más mutaciones dentro del significado anterior.
Para determinar el porcentaj e al cual dos secuencias son idénticas, por ej emplo, secuencias de ácido nucleico o secuencias de aminoácido como las definidas aquí, de preferencia las secuencias de aminoácidos codificadas por una secuencia de ácido nucleico del portador polimérico como el definido en la presente o las propias secuencias de aminoácidos, las secuencias pueden alinearse para que de esta manera se comparen subsecuentemente unas con otras. Por lo tanto, por ej emplo una posición de una primera secuencia se puede comparar con la posición correspondiente de la segunda secuencia. Si una posición de la primera secuencia es ocupada por el mismo componente como es el caso en una posición en la segunda secuencia, las dos secuencias son idénticas en esta posición. Si este no es el caso, las secuencias difieren en esta posición. Si se presentan inserciones en la segunda secuencia en comparación con la primera secuencia, se pueden insertar espacios en la primera secuencia para permitir una alineación adicional. Si se presentan supresiones en la segunda secuencia en comparación con la primera secuencia, pueden insertarse espacios en la segunda secuencia para permitir una alineación adicional. El porcentaj e al cual dos secuencias son idénticas es entonces una función del número de posiciones idénticas dividido entre el número total de posiciones que incluyen aquellas posiciones que sólo son ocupadas en una secuencia. El porcentaje al cual dos secuencias son idénticas puede determinarse usando un algoritmo matemático. Un ej emplo preferido pero no limitativo de un algoritmo matemático que se puede usar es el algoritmo de Karlin et al. ( 1 993), PNAS, E.U.A., 90 : 5873 -5877 o Altschul et al. ( 1 997), Nucleic Acids Res. , 25 : 3389-3402. Este algoritmo se integra en el programa B LAST. Las secuencias que sean idénticas a las secuencias de la presente invención hasta cierto grado pueden ser identificadas por este programa.
En el complejo de carga portador polimérico de la invención, el componente catiónico del portador polimérico como el definido aquí y la carga de ácido nucleico se proporcionan típicamente en una relación molar de alrededor de 1 a 1 0,000, de preferencia en una relación molar de aproximadamente 5 a 5 ,000, muy preferiblemente en una relación molar de aproximadamente 10 a 2,500, todavía más preferiblemente en una relación molar de aproximadamente 25 a 2,000, y demasiado preferiblemente en una relación molar de alrededor de 25 a 1 ,000 de portador polimérico a ácido nucleico.
Más aún, en el complejo de carga portador polimérico de la invención, el componente catiónico del portador polimérico como el definido en la presente y la carga de ácido nucleico se proporcionan de preferencia en una relación N/P de al menos 0.1 , 0.2 , 0.3 , 0.4, 0.5 , 0.75, 1 , 1 .5 ó 2. De preferencia, la relación N/P descansa dentro de un intervalo de aproximadamente 0. 1 , 0.3 , 0.4, 0.5, 0.75 , 1 .0, 1 .5 ó 2 a 20, preferiblemente en un intervalo de alrededor de 0.2 (0.5 ó 0.75 ó 1 .0) a 1 2, y aún más preferiblemente en una relación N/P de aproximadamente 0.4 (0.75 ó 1 .0). En este contexto, la relación N/P es una medida de la carga iónica del componente catiónico (cadena lateral) del portador polimérico o del portador polimérico como tal. En particular, si las propiedades catiónicas del componente catiónico se generan por nitrógenos (de las cadenas laterales de aminoácidos), la relación N/P expresa la relación de átomos de nitrógeno básicos a residuos de fosfato en el esqueleto del nucleótido, considerando que los átomos de nitrógeno (cadena lateral) en el componente catiónico del portador polimérico contribuyen a cargas positivas y el fosfato del esqueleto de fosfato del ácido nucleico contribuye a la carga negativa. Se da una fórmula en los ej emplos. La relación N/P se define como la relación nitrógeno/fosfato (relación N/P) del complejo de carga portador polimérico de la invención completo. Esto es típicamente ilustrativo del contenido/cantidad de componentes catiónicos en el portador polimérico y característico del contenido/cantidad de ácidos nucleicos unidos o acomplej ados en el complejo de carga portador polimérico de la invención. Se puede calcular sobre la base de que. por ej emplo, 1 µg de ARN contiene típicamente alrededor de 3 mmol de residuos de fosfato, siempre que el ARN exhiba una distribución estadística de bases. Además, 1 mmol de péptido contiene típicamente alrededor de x nmol de residuos de nitrógeno, dependiendo del peso molecular y el número de sus aminoácidos (catiónicos).
En este contexto es preferible que en el complejo de carga portador polimérico de la invención, el componente catiónico del portador polimérico como el definido aquí y la carga de ácido nucleico se proporcionen en una relación N/P de al menos aproximadamente 1 o, de preferencia, de un intervalo de alrededor de 1 a 20 para efectos de transfección in vitro .
Si la expresión de una proteína codificada o la transcripción de un ácido nucleico codificado, por ej emplo, un ARN o ARNsi de la carga de ácido nucleico se intenta para propósitos terapéuticos (aplicación in vivo) una relación N/P de al menos 0. 1 (0.2, 0.3 , 0.4, 0.5 , 0.6), de preferencia de un intervalo de aproximadamente 0. 1 (0.2, 0.3 , 0.4, 0.5 ó 0.6) a 1 .5 se prefiere. Se prefiere todavía más un intervalo de relación N/P de 0.2 a 0.9 o un intervalo de relación N/P de 0.5 a 0.9. En caso de que el complejo de carga portador polimérico de la invención se use para inmunoestimulación (in vivo), por ejemplo, como un agente inmunoestimulador o adyuvante (con la intención de inducir una respuesta inmune innata), se prefiere una relación N/P de aproximadamente 0. 1 a 20, más particularmente una relación N/P de 0. 1 a 5 ó 0. 1 a 1 .5.
En el caso específico de que la inducción de IFN-a se intente usando el complejo de carga polimérico de la invención como un agente inmunoestimulador (in vivo) o adyuvante se prefiere una relación N/P de al menos 0. 1 (0.2, 0.3 , 0.4, 0.5 ó 0.6) o un intervalo de relación N/P de 0. 1 a 1 , o se prefiere más un intervalo de relación N/P de 0.2 a 0.9 o un intervalo de relación N/P de 0.5 a 0.9. De otra manera si la inducción de TNFa se intenta usando el complejo de carga polimérico de la invención como un agente inmunoestimulador (in vivo) o adyuvante, se prefiere particularmente una relación N/P de 1 a 20.
La relación N/P influencia significativamente la carga superficial del complejo de carga portador polimérico de la invención resultante. De esta manera es preferible que el complejo de carga portador polimérico de la invención resultante se cargue positivamente para efectos de transfección in vitro y negativamente o se cargue neutramente para efectos de transfección in vivo, especialmente si la expresión de una proteína codificada o la transcripción de un ácido nucleico codificado de la carga de ácido nucleico se desea. La carga superficial del complej o de carga portador polimérico de la invención resultante puede ser indicada como potencial Z que se puede medir por un método de electroforesis Doppler usando un Zetasizer Nano (Malvern Instruments, Malvern, RU).
La presente invención proporciona también un método para preparar complej o de carga portador polimérico de la invención como el definido aquí, que comprende las siguientes etapas: a) proporcionar al menos una proteína o péptido catiónico como el definido en la presente y/o por lo menos un polímero catiónico o policatiónico y opcionalmente al menos un componente de aminoácido (AA) como el definido aquí, cada uno comprendiendo al menos una porción -SH, b) proporcionar por lo menos una molécula de ácido nucleico como la definida en la presente, de preferencia en las relaciones mencionadas arriba, c) mezclar los componentes proporcionados en las etapas a) y b), de preferencia en un medio básico o neutro como el definido aquí, preferiblemente en presencia de oxígeno o un iniciador adicional como el definido en la presente, de preferencia a un pH, a una temperatura y en un momento como el definido aquí, y de esta manera condensando y entonces polimerizando los componentes catiónicos provistos en la etapa a) unos con otros mediante enlaces de disulfuro (en una condensación por polimerización o policondensación) para obtener el portador polimérico y acomplej ar la molécula de ácido nucleico provista en la etapa b) con los componentes catiónicos provistos en la etapa a) . d) opcionalmente purificar el complej o de carga portador polimérico de la invención obtenido de acuerdo con la etapa c), usando de preferencia un método como el definido aquí ; e) opcionalmente la liofilización del complejo de carga portador polimérico de la invención obtenido de acuerdo con la etapa c) o d).
El método para preparar el complejo de carga portador polimérico de la invención como el definido aquí comprende una reacción de polimerización o policondensacion de condensación de varias etapas por medio de porciones -SH de los eductos, por ejemplo, péptidos o polímeros catiónicos como los definidos aquí y opcionalmente componentes de aminoácido (AA) adicionales en la etapa c) . La reacción de polimerización por condensación o policondensacion que ocurre simultáneamente con la formación de complejos o unión electrostática de la molécula de ácido nucleico lleva de preferencia al complejo de carga portador polimérico de la invención en donde el portador polimérico es un polímero de condensación, en donde los componentes individuales son enlazados por enlaces de disulfuro.
Según se define en la presente en una etapa a) del método de la invención para preparar el complejo de carga portador polimérico de la invención, al menos una proteína o péptido catiónico o policatiónico como el definido aquí y/o por lo menos un polímero catiónico o policatiónico como el definido en la presente son proporcionados, de preferencia en las relaciones indicadas arriba. Estos componentes se mezclan en la etapa c) con la molécula de ácido nucleico provista en la etapa b), de preferencia en un medio básico o neutro como el definido aquí, de preferencia en presencia de oxígeno o un iniciador adicional como el definido en la presente, preferiblemente a un pH, y a una temperatura y en un momento como el definido aquí, y de esta manera condensando y entonces polimerizando estos componentes unos con otros por medio de enlaces de disulfuro (en una condensación de polimerización o policondensacion) para obtener un portador polimérico acomplej ado con la molécula de ácido nucleico como la definida en la presente.
De acuerdo con una alternativa, en la etapa a) del método de la invención para preparar el complejo de carga portador polimérico de la invención, al menos una proteína o péptido catiónico o policatiónico y/o por lo menos un polímero catiónico o policatiónico se proporcionan como se define aquí, y opcionalmente al menos un componente de aminoácido (AA), se proporciona en la etapa (A) como se define en la presente, y se usan para una reacción de condensación por polimerización o policondensación y acomplej ación antes de añadir el ácido nucleico de la etapa b) pero usando las mismas condiciones de polimerización delineadas para la etapa c). El portador polimérico polimerizado y el ácido nucleico de la etapa b) se mezclan después en la etapa c) . Preferiblemente, los componentes se proporcionan todos en las relaciones indicadas arriba y se mezclan, de preferencia en un medio básico o neutro como el definido aquí, preferiblemente en presencia de oxígeno o un iniciador adicional como el definido aquí, de preferencia un pH, a una temperatura y en un momento como el definido aquí. Después de mezclar e iniciar la reacción, los componentes se condensan y de esta manera se polimerizan unos con otros por medio de enlaces de disulfuro (en una condensación de polimerización o policondensación) para obtener un portador polimérico acomplej ado a la molécula de ácido nucleico como la definida aquí.
En ambas de las alternativas anteriores, diferentes portadores poliméricos, particularmente diferentes péptidos y/o diferentes polímeros, se pueden seleccionar en la polimerización por condensación como se indicó arriba. En este contexto, la selección de diferentes componentes del portador polimérico depende típicamente de las propiedades deseadas del portador polimérico final y la fuerza catiónica deseada del portador polimérico final. En consecuencia, el contenido de componentes catiónicos puede además ser "diluido" o modificado en la alternativa anterior de la etapa a), por ej emplo, al introducir un componente de aminoácido (AA) como el definido aquí, preferiblemente en las relaciones definidas arriba. De esta manera, se puede obtener un portador polimérico modificado en donde el carácter catiónico del portador polimérico no modificado permanezca típicamente en las limitaciones definidas aquí. Las propiedades del portador polimérico final pueden entonces ajustarse según se desee con propiedades de los componentes (AA) al insertar el componente de aminoácido (AA) como el definido aquí en las etapas a) .
En la etapa c), el por lo menos una proteína o péptido catiónico o policatiónico como el definido en la presente y/o al menos un polímero catiónico o policatiónico como el definido aquí, y opcionalmente por lo menos un componente de aminoácido (AA) y el por lo menos un ácido nucleico como el definido en la presente, se contienen de preferencia en un medio básico neutro en la etapa a) del método de la invención para preparar el complejo de carga portador polimérico de la invención. Este medio básico o neutro exhibe típicamente un intervalo de pH de aproximadamente 5 a alrededor de 10, preferiblemente un intervalo de PH de alrededor de 6 a aproximadamente 9, muy preferiblemente un intervalo de pH de alrededor de 7 a aproximadamente 8, por ej emplo, aproximadamente 6.5 , 7, 7.5 , 8 , 8.5 ó 9 o cualquier intervalo seleccionado de cualesquiera dos de estos valores mencionados arriba.
Además, la temperatura de la solución en la etapa c) está de preferencia en un intervalo de aproximadamente 5 °C a alrededor de 60°C, muy preferiblemente en un intervalo de 15 °C a aproximadamente 40°C, todavía más preferiblemente en un intervalo de alrededor de 20°C a aproximadamente 30°C, y demasiado preferiblemente en un intervalo de alrededor de 20°C a aproximadamente 25 °C, por ejemplo, alrededor de 25°C.
En la etapa c) del método de la invención para preparar el complej o de carga portador polimérico de la invención como el definido aquí se pueden usar reguladores de pH según sea adecuado . Los reguladores de pH que se prefieren pueden comprender, pero no están limitados a reguladores de pH de carbonato, reguladores de pH de borato, regulador de pH de bicina, regulador de pH CHES, regulador de pH CAPS, reguladores de pH que contengan etanolamina, HEPES, regulador de pH MOPS, regulador de pH de fosfato, regulador de pH PIPES, regulador de pH Tris, regulador de pH de tricina, regulador de pH TAPS y/o regulador de pH TES como agentes de regulación de pH. Se prefiere particularmente un regulador de pH de carbonato .
Después de mezclar los componentes, preferiblemente en presencia de oxígeno, de preferencia en presencia de un medio básico o neutro como el definido aquí, la reacción de polimerización por condensación o policondensación y la complej ación de la por lo menos una molécula de ácido nucleico es iniciada. Para este propósito, la mezcla en la etapa c) es de preferencia expuesta a oxígeno o puede usarse usando un iniciador adicional, por ejemplo, una cantidad catalítica de un agente oxidante, por ej emplo, DMSO, etc. Después del inicio de la reacción de polimerización por condensación o policondensación de la por lo menos una proteína o péptido catiónico o policatiónico y/o al menos un polímero catiónico o policatiónico y opcionalmente al menos un componente de aminoácido (AA) como el definido aquí, se condensan y de esta manera se polimerizan unos con otros por medio de enlaces de disulfuro (condensación por polimerización o policondensación). En esta etapa de reacción a) de preferencia se crean polímeros lineales usando monómeros con al menos una porción -SH reactiva, es decir, al menos una proteína o péptido catiónico o policatiónico y/o al menos un polímero catiónico o policatiónico y opcionalmente al menos un componente de aminoácido (AA) como el definido aquí, cada componente exhibiendo al menos una porción -SH libre como la definida en la presente, por ej emplo en sus extremos terminales. Sin embargo, componentes con más de una, de preferencia dos porciones - SH libres pueden ser usados, los cuales pueden llevar a polímeros ramificados. Simultáneamente a la reacción de polimerización los polímeros catiónicos se unen a la por lo menos una molécula de ácido nucleico y de esta manera la complej an.
De acuerdo con una alternativa, el complejo de carga portador polimérico de la invención puede ser además modificado con un componente (AA) como el definido aquí.
De acuerdo con un primer ej emplo, un componente (AA) (por ej emplo, un ligando) es unido al componente catiónico antes de proporcionar el componente catiónico en la etapa a) por medio de cualquier funcionalidad como la definida en la presente, por ej emplo, una porción -SH. Este componente (AA) o (por ej emplo, un ligando) se une de preferencia al componente catiónico en un extremo de estos componentes. Si la fij ación se lleva a cabo por medio de enlaces -SH, los componentes catiónicos se proporcionan de preferencia con dos (o incluso más) porciones -SH. El componente (AA) o (por ej emplo, un ligando) porta de preferencia sólo una porción -SH. En este caso, una porción -SH del componente catiónico se protege de preferencia en una primera etapa usando un grupo protector como se conoce en la técnica. Luego, el componente catiónico puede ser unido a un componente L para formar un primer enlace de disulfuro por medio de la porción -SH no protegida. La porción -SH protegida del componente catiónico es luego típicamente desprotegida para reacciones adicionales.
Como alternativa, el componente (AA) mencionado arriba o (por ejemplo, un ligando) puede usarse en la etapa c) para ser acoplado con los componentes catiónicos provistos en la etapa a) arriba, por ej emplo, por medio de enlaces de disulfuro sin bloquear las porciones -SH libres. Sin embargo en este contexto todos los métodos conocidos por una persona capacitada o definidos en la presente se pueden usar para fij ar el componente (AA) al componente catiónico o al componente polimérico .
Como alternativa, un componente (AA) o (por ejemplo un ligando) se puede unir al complejo de carga portador polimérico de la invención después de la etapa c) mediante cualquier funcionalidad como la definida aquí, por ej emplo, una porción -SH. En este contexto es preferible que el componente (AA) (por ej emplo, un ligando), se una por medio de porciones -SH libres de los componentes portadores poliméricos.
De acuerdo con la etapa c) del método de la invención para preparar el complejo de carga portador polimérico de la invención como el definido aquí, al menos una molécula de ácido nucleico como la definida en la presente se mezcla con los componentes catiónicos provistos en la etapa b), preferiblemente en las relaciones mencionadas arriba. Típicamente, en el complejo de carga portador polimérico de la invención, los componentes catiónicos como los definidos en la presente, y la por lo menos una molécula de ácido nucleico se proporcionan en una relación molar de aproximadamente 5 a 1 0,000, de preferencia en una relación molar de alrededor de 5 a 5,000, muy preferiblemente en una relación molar de aproximadamente 1 0 a 2,500, aún más preferiblemente en una relación molar de aproximadamente 10 a 1 ,000 polímeros catiónicos a ácidos nucleicos. Las relaciones N/P son de preferencia como se indicó arriba. En este contexto se prefiere particularmente que l as relaciones N/P se seleccionen evitando entonces la aglomeración y toxicidad in vivo.
En una modalidad específica, los componentes (AA) como los definidos arriba los cuales no comprenden porciones -SH pueden añadirse en la etapa c) los cuales sean de esta manera incorpo rados en el complejo de carga portador polimérico de la invención sin polimerización por porciones -SH (terminales). De esta manera estos componentes (AA) típicamente no son enlazados de manera covalente y se incluyen en forma no covalente en el complejo de la invención como un componente adicional.
De acuerdo con una etapa d) adicional del método de la invención para preparar el complejo de carga portador polimérico de la invención como el definido aquí, el complej o de carga portador polimérico de la invención obtenido de acuerdo con la etapa c) es opcionalmente purificado. La purificación se puede presentar usando métodos cromatográficos, tales como HPLC, FPLC, GPS, diálisis, etc.
De acuerdo con una etapa e) adicional del método de la invención para preparar el complejo de carga portador polimérico de la invención como el definido aquí, el complej o de carga portador polimérico obtenido de acuerdo con la etapa c) o d) es opcionalmente liofilizado. Para este propósito puede añadirse cualquier crioprotector o lioprotector adecuado al complej o de carga portador polimérico de la invención obtenido en la etapa c) o d).
El método de la invención para preparar el complejo de carga portador polimérico de la invención como el definido aquí es particularmente adecuado para adaptar las propiedades químicas del complej o de carga portador polimérico de la invención deseado debido a selección específica de sus componentes del portador polimérico evitando de esta manera la aglomeración y toxicidad in vivo.
De acuerdo con una modalidad más, la presente invención proporciona también un método para transfectar una célula, un tej ido o un organismo, aplicando o administrando de esta manera el complej o de carga portador polimérico de la invención, particularmente para efectos terapéuticos. En este contexto, típicamente después de preparar el complejo de carga portador polimérico de la invención, como el descrito arriba, el complejo de carga portador polimérico de la invención es de preferencia administrado a una célula, un tejido o un organismo, de preferencia en una forma desnuda o como una composición farmacéutica o vacuna como la descrita aquí, muy preferiblemente usando cualquiera de los modos de administración como los definidos en la presente. El método para transfectar una célula se puede llevar a cabo in vitro, in vivo o ex vivo.
Asimismo, de acuerdo con otra modalidad, la presente invención se refiere también al uso del complej o de carga portador polimérico de la invención, particularmente para propósitos terapéuticos, para transfectar una célula, un tejido o un organismo, aplicando o administrando de esta manera el complej o de carga portador polimérico de la invención como el descrito arriba a una célula, un tejido o un organismo, de preferencia en forma desnuda o como una composición farmacéutica o vacuna como la descrita aquí, muy preferiblemente usando cualquiera de los modos de administración descritos en la presente. La administración se puede llevar a cabo in vitro, in vivo o ex vivo.
En consecuencia, en una modalidad preferida, la presente invención proporciona también una composición farmacéutica, que comprende el complejo de carga portador polimérico formado por una carga de ácido nucleico como la definida en la presente y el portador polimérico como el definido aquí. La composición farmacéutica comprende opcionalmente un portador y/o vehículo farmacéuticamente aceptable.
Como un primer ingrediente, la composición farmacéutica de la invención comprende el complej o de carga portador polimérico formado por la carga de ácido nucleico y el portador polimérico como el definido en la presente (y opcionalmente, componentes (AA)).
Como un segundo ingrediente la composición farmacéutica de la invención puede comprender al menos un componente farmacéuticamente activo adicional. Un componente farmacéuticamente activo en este sentido es un compuesto que tiene un efecto terapéutico para sanar, reducir o prevenir una indicación particular, de preferencia enfermedades cancerosas, enfermedades autoinmunes, alergias o enfermedades infecciosas. Estos compuestos incluyen, sin implicar ninguna limitación, péptidos o proteínas, de preferencia como los definidos aquí, ácidos nucleicos, de preferencia como los definidos aquí (terapéuticamente activos) compuestos orgánicos o inorgánicos de bajo peso molecular (peso molecular de menos de 5 ,000, de preferencia menos de 1 ,000), azúcares, antígenos o anticuerpos, preferiblemente como los definidos en la presente, agentes terapéuticos ya conocidos en la técnica anterior, células antigénicas, fragmentos celulares antigénicos, fracciones celulares; componentes de pared celular (por ej emplo, polisacáridos), patógenos modificados, atenuados o desactivados (por ej emplo, químicamente o por irradiación) (virus, bacterias, etc.)» adyuvantes, de preferencia como los definidos en la presente, etc.
Más aún, la composición farmacéutica de la invención puede comprender un portador y/o vehículo farmacéuticamente aceptable. En el contexto de la presente invención, un portador farmacéuticamente aceptable incluye típicamente la base líquida o no líquida de la composición farmacéutica de la invención. Si la composición farmacéutica de la invención se proporciona en forma líquida, el portador típicamente será agua libre de pirógenos, solución salina isotónica o soluciones de pH regulado (acuosas), por ej emplo, soluciones de pH regulado con fosfato y citrato, etc. El regulador de pH de inyección puede ser hipertónico, isotónico o hipotónico con referencia al medio de referencia específico, es decir, el regulador de pH puede tener un contenido de sal más alto, idéntico o más bajo con referencia al medio de referencia específico, en donde de preferencia estas concentraciones de las sales mencionadas arriba pueden ser usadas, las cuales no lleven a daño de las células debido a osmosis u otros efectos de concentración. Los medios de referencia son por ej emplo líquidos que se presentan en métodos "in vivo", tales como sangre, linfa, líquidos citosólicos u otros líquidos corporales, o por ejemplo, líquidos que pueden usarse como medios de referencia en métodos "in vitro", tales como reguladores de pH o líquidos comunes. Estos reguladores de pH o líquidos comunes se conocen por una persona experta. Soluci ón de lactato de Ringer es particularmente preferida como una base líquida.
Sin embargo, uno o más rellenos o diluyentes sólidos o líquidos compatibles o compuestos encapsulantes pueden usarse también para la composición farmacéutica de la invención, los cuales son adecuados para su administración a un paciente que será tratado. El término "compatible" según se usa aquí significa que estos constituyentes de la composición farmacéutica de la invención son capaces de ser mezclados con el complejo de carga portador polimérico de la invención como el definido aquí de tal manera que no se presente ninguna interacción que pudiera reducir sustancialmente la efectividad farmacéutica de la composición farmacéutica de la invención bajo condiciones de uso típicas. Los portadores, cargas y diluyentes farmacéuticamente aceptables deben, por supuesto, tener pureza suficientemente alta y toxicidad suficientemente baj a como para hacerlos adecuados para su administración a una persona que será tratada. Algunos ej emplos de compuestos que se pueden usar como portadores, cargas o constituyentes farmacéuticamente aceptables de los mismos son azúcares, tales como, por ej emplo, lactosa, glucosa y sucrosa; almidones, tales como, por ej emplo, almidón de maíz o almidón de papa; celulosa y sus derivados, tales como, por ej emplo, carboximetilcelulosa de sodio, etilcelulosa, acetato de celulosa; tragacanto en polvo; malta; gelatina; cebo; deslizantes sólidos, tales como, por ej emplo, ácido esteárico, estearato de magnesio; sulfato de calcio; aceites vegetales, tales como, por ejemplo, aceite de cacahuate, aceite de semilla de algodón, aceite de ajonjolí, aceite de olivo, aceite de maíz y aceite de teobroma; polioles, tales como, por ej emplo, polipropilenglicol, glicerol, sorbitol, manitol y polietilenglicol; ácido algínico.
De acuerdo con un aspecto específico, la composición farmacéutica de la invención puede comprender un adyuvante (adicional). En este contexto, se puede entender que un adyuvante es cualquier compuesto que sea adecuado para iniciar o incrementar una respuesta inmune del sistema inmunológico innato, es decir, una respuesta inmune no específica. En otras palabras, cuando se administra, la composición farmacéutica de la invención provoca típicamente una respuesta inmune innata debido al adyuvante, contenido opcionalmente en la misma. Este adyuvante puede seleccionarse de cualquier adyuvante conocido por una persona experta y adecuado para el presente caso, es decir, que soporte la inducción de una respuesta inmune innata en un mamífero .
La composición farmacéutica de la invención se puede administrar oralmente, parenteralmente, por spray de inhalación, tópicamente, rectalmente, nasalmente, bucalmente, vaginalmente o por medio de un depósito implantado. El término parenteral según se usa en la presente incluye técnicas de inyección o infusión subcutánea, intravenosa, intramuscular, intra-articular, intranodal, intrasinovial, intraesternal, intratecal , intrahepática, intralesional, intracraneal, transdémica, intradérmica, intrapulmonar, intraperitoneal, intracardiaca, intra-arterial y sublingual.
De preferencia, la composición farmacéutica de la invención puede administrarse por inyección parenteral, muy preferiblemente por inyección subcutánea, intravenosa, intramusuclar, intra-articular, intranodal, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intrahepática, intralesional, intracranial, transdémica, intradérmica, intrapulmonar, intraperitoneal, intracardiaca, intra-arterial y sublingual o por medio de técnicas de infusión. Se prefiere particularmente la inyección intradérmica e intramuscular. Las formas inyectables estériles de las composiciones farmacéuticas de la invención pueden ser suspensión acuosa u oleaginosa. Estas suspensiones pueden formularse de acuerdo con técnicas conocidas en la técnica usando agentes de dispersión o humectación y agentes de suspensión adecuados. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o solvente parenteralmente aceptable y no tóxico, por ej emplo, como una solución en 1 ,3 -butanodiol. Entre los vehículos y solventes aceptables que pueden emplearse están agua, solución de Ringer y solución de cloruro de sodio isotónica. Además, aceites fij os y estériles se emplean convencionalmente como un solvente o medio de suspensión. Para este fin, cualquier aceite fijo blando puede emplearse incluyendo mono- o diglicéridos sintéticos. Los ácidos grasos, tales como ácido oleico y sus derivados glicéridos son útiles en la preparación de inyectables, al igual que los aceites farmacéuticamente aceptables naturales, tales como aceite de oliva o aceite de ricino, especialmente en sus versiones polioxietiladas. Estas soluciones o suspensiones en aceite también pueden contener un diluyente o dispersante de alcohol de cadena larga, tal como carboximetilcelulosa o agentes de dispersión similares que se usen comúnmente en la formulación de formas de dosificación farmacéuticamente aceptables incluyendo emulsiones y suspensiones. Otros tensioactivos comúnmente usados, tales como Tweens, Spans y otros agentes emulsionantes o potenciadores de biodisponibilidad que se usen comúnmente en la fabricación de formas de dosificación sólidas, líquidas u otras farmacéuticamente aceptables también se pueden usar para los propósitos de formulación de la composición farmacéutica de la invención.
La composición farmacéutica de la invención como la definida aquí también se puede administrar oralmente en cualquier forma de dosis oralmente aceptable incluyendo, pero no limitada a, cápsulas, tabletas, suspensiones o soluciones acuosas. En el caso de tabletas para uso oral, los portadores comúnmente usados incluyen lactosa y almidón de maíz. Agentes lubricantes, tales como estearato de magnesio, también se añaden típicamente. Para administración oral en forma de cápsula, los diluyentes útiles incluyen lactosa y almidón de maíz seco. Cuando se requieren suspensiones acuosas para uso oral, el ingrediente activo, es decir, el complejo de carga portador polimérico de la invención, se combina con agentes emulsionantes y de suspensión. Si se desea, se pueden añadir también ciertos agentes edulcorantes, saborizantes o colorantes.
La composición farmacéutica de la invención también se puede administrar tópicamente, especialmente cuando el obj etivo de tratamiento incluya áreas u órganos fácilmente accesibles por aplicación tópica, por ej emplo, incluyendo enfermedades de la piel o de cualquier otro tejido epitelial accesible. Las formulaciones tópicas adecuadas se preparan fácilmente para cada una de estas áreas u órganos. Para aplicaciones tópicas, la composición farmacéutica de la invención se puede formular en un ungüento adecuado, que contenga el complejo de carga portador polimérico de la invención suspendido o disuelto en uno o más portadores. Los portadores para administración tópica incluyen, pero no están limitados a, aceite mineral, petrolato líquido, petrolato blanco, propilenglicol, polioxietileno, compuesto de polioxipropileno, cera emulsionante y agua. Como alternativa, la composición farmacéutica de la invención se puede formular en una loción o crema adecuada. En el contexto de la presente invención, los portadores adecuados incluyen, pero no están limitados a, aceite mineral, monoestearato de sorbitan, polisorbato 60, cera de ésteres cetílicos, alcohol cetearílico, 2-octildodecanol, alcohol bencílico y agua.
La composición farmacéutica de la invención comprende típicamente una "cantidad segura y efectiva" de los componentes de la composición farmacéutica de la invención, particularmente del complej o de carga portador polimérico de la invención como el definido aquí o el ácido nucleico como tal . Según se usa en la presente, una "cantidad segura y efectiva" significa una cantidad del complejo de carga portador polimérico de la invención tal cual que sea suficiente para inducir significativamente una modificación positiva de una enfermedad o trastorno como el definido en la presente. Sin embargo, al mismo tiempo, una "cantidad segura y efectiva" es lo suficientemente pequeña como para evitar serios efectos secundarios y permitir una relación sensible entre la ventaj a y riesgo. La determinación de estos límites descansa típicamente dentro del alcance de juicio médico sensible. Una "cantidad segura y efectiva" de los componentes de la composición farmacéutica de la invención, particularmente del complejo de carga portador polimérico de la invención como el definido aquí, variará además en relación con la condición particular que se tratará y también con la edad y condición física del paciente que será tratado, el peso corporal, salud general, sexo, dieta, tiempo de administración, velocidad de excreción, combinación de fármacos, la actividad del complejo de carga portador polimérico de la invención, la severidad de la afección, la duración del tratamiento, la naturaleza de la terapia acompañante, del portador farmacéuticamente aceptable particular usado, y factores similares, con el conocimiento y experiencia del médico acompañante. La composición farmacéutica de la invención se puede usar para propósitos médicos y humanos y también veterinarios, de preferencia para propósitos médicos en humanos, como una composición farmacéutica en general o como una vacuna, agente inmunoestimulador o adyuvante.
De acuerdo con una modalidad preferida particular, la composición farmacéutica de la invención (o el complejo de carga portador polimérico de la invención) puede ser provisto o usado como un agente inmunoestimulador. En este contexto, la composición farmacéutica de la invención es de preferencia como se definió arriba. Más preferiblemente, el ácido nucleico del complejo de carga portador polimérico de la invención, contenido de preferencia en la composición farmacéutica, es típicamente un ácido nucleico inmunoestimulador como el definido en la presente, por ej emplo, un CpG-ADN o un ARN inmunoestimulador (ARNsi) . Como alternativa o además, el ácido nucleico del complejo de carga portador polimérico de la invención, contenido de preferencia en la composición farmacéutica, es un ácido nucleico de codificación como el definido aquí, de preferencia un ADNc o un ARNm, muy preferiblemente que codifica para una proteína adyuvante de preferencia como la definida en la presente.
En una modalidad específica en este contexto, se prefiere que una proteína adyuvante sea un componente del complejo de carga portador polimérico de la invención y, de preferencia, del portador polimérico.
De acuerdo con una modalidad que se prefiere aún más, la composición farmacéutica de la invención (o el complejo de carga portador polimérico de la invención) puede ser provista o usada como un adyuvante. En este contexto, el adyuvante se define de preferencia como la composición farmacéutica de la invención anterior. Muy preferiblemente, el ácido nucleico del complejo de carga portador polimérico de la invención, contenido de preferencia en el adyuvante, es típicamente un ácido nucleico inmunoestimulador como el definido aquí, por ejemplo, un CpG-ADN o un ARN inmunoestimulador (ARNsi). Como alternativa o además, el ácido nucleico del complejo de carga portador polimérico de la invención, contenido de preferencia en el adyuvante, es un ácido nucleico de codificación como el definido aquí, de preferencia un ADNc o un ARNm, muy preferiblemente que codifica para una proteína adyuvante, de preferencia como la definida aquí. El complejo de carga portador polimérico de la invención, contenido de preferencia en el adyuvante, típicamente inicia una respuesta inmune innata en el paciente que será tratado. Este adyuvante puede utilizarse en cualquier terapia acompañante, con cualquier vacuna conocida o cualquier agente terapéutico adicional (conocido), de preferencia antes de, junto con o después de la administración de la terapia principal, antes de, junto con o después de la administración de una vacuna (conocida) adicional o un agente terapéutico (conocido) adicional .
El complejo de carga portador polimérico de la invención o la composición farmacéutica de la invención como la definida aquí proporcionada o usada como un adyuvante es de preferencia capaz de desencadenar una reacción inmune (innata) no específica de antígenos (como la provista por el sistema inmunológico innato), de preferencia de una manera inmunoestimuladora. Una reacción inmune generalmente puede ser causada de varias formas. Un factor importante para una respuesta inmune adecuada es la estimulación de diferentes subpoblaciones de células T. Los linfocitos T se diferencian típicamente en dos subpoblaciones, las células T auxiliares 1 (Th l ) y las células T auxiliares 2 (Th2), con las cuales el sistema inmunológico es capaz de destruir patógenos intracelulares (Thl ) y extracelulares (Th2) (por ej emplo, antígenos). Las dos poblaciones de células Th difieren en el patrón de proteínas efectoras (citocinas) producidas por ellas. Así, las células Th l ayudan a la respuesta inmune celular por la activación de macrófagos y células T citotóxicas. Las células Th2, por otro lado, promueven la respuesta inmune humoral mediante la estimulación de células B para su conversión en células plasmáticas y mediante la formación de anticuerpos (por ej emplo, contra antígenos). La relación Th l /Th2 es por lo tanto de gran importancia en la respuesta inmune. En relación con la presente invención, la relación Th l/Th2 de la respuesta inmune es de preferencia desplazada por el agente inmunoestimulador, en particular el complej o de carga portador polimérico de la invención en la dirección hacia la respuesta celular, es decir, la respuesta Th l y una respuesta inmune predominantemente celular es de esta manera inducida. Como se definió arriba, el complejo de carga portador polimérico de la invención ej erce por sí mismo una respuesta inmune innata no específica, lo cual permite al complejo de carga portador polimérico de la invención ser usado tal cual (sin añadir otro componente farmacéuticamente activo) como un agente inmunoestimulador. Si se administra junto con otro componente farmacéuticamente activo, de preferencia un componente específicamente inmunogénico, preferiblemente un antígeno, el ácido nucleico de la invención sirve como un adyuvante que soporta la respuesta inmune adaptiva específica provocada por el otro componente farmacéuticamente activo, por ej emplo, un antígeno .
Determinación de la capacidad inmunoestimuladora (innata) o adyuvante de un compuesto de la invención o un complejo inventivo: Para la determinación de la capacidad inmunoestimuladora de un compuesto de la invención o un complejo de la invención, se conocen varios métodos en la técnica y pueden usarse. Por ejemplo, los métodos in vitro son adecuados para tamizar compuestos en cuanto a su capacidad para inducir citocinas, las cuales son (exclusivamente o algunas típicamente) parte del sistema inmunológico innato y de esta manera (como un brazo adicional del sistema inmunológico) mejoran típicamente la inducción de una respuesta inmune específica de antígeno causada por un antígeno . Para este propósito, por ejemplo, PBMCs pueden ser aisladas de muestras de sangre y estimularse con el compuesto o complejo particular. Después de la incubación, la secreción de las citocinas deseadas (por ejemplo, como una reacción de una activación de los receptores PAMP) que son típicamente parte del sistema inmunológico innato (y no del sistema inmunológico específico de antígenos) se determina por ELISA. Estas citocinas seleccionadas pueden usarse en la técnica como determinantes de la inducción de una respuesta inmune innata en el cuerpo. En este contexto, la secreción de TNF-alfa e IFN-alfa se mide de preferencia para determinar la respuesta no específica (respuesta inmune innata) evocada por un compuesto o complejo. Especialmente, IFN-alfa juega un papel importante en la inducción de una respuesta inmune inespecífica después de infección viral. En consecuencia, se prefiere particularmente que el compuesto o complej o inmunoestimulador, el cual se identificará por el ensayo de tamizado, induzca la secreción de, por ej emplo, IFN-alfa. Este compuesto o complej o puede ser luego aplicado por ejemplo para usarse como un agente inmunoestimulador (que desencadene la respuesta inmune (innata) inespecífica) en terapias de vacunación.
IFN-alfa es parte de la familia de inteferones tipo I. Los interferones tipo I (IFN) son citocinas pleiotrópicas que son esenciales para soportar las respuestas inmunes antivirales. Inducen apoptosis de células infectadas con virus y resistencia celular a infección viral, además de activar células asesinas naturales (NK) y T. Los interferones tipo I tienen efectos en un gran conjunto de citocinas y quimiocinas que entre otras co sas influencian la maduración, el reclutamiento, funciones efectoras y apoptosis de inmunocitos . Típicamente, un papel principal de IFN-a//3 es la inducción de un estado de cebado que afecta la producción y regulación de otros mediadores, incluyendo citocinas . Por ej emplo, la señalización de lVN- a/ß sobrerregula la producción de IFN- ? por células dendríticas (DCs) y células T y de esta manera favorece la inducción y mantenimiento de células Th l . El desplazami ento de una respuesta inmune en dirección a una respuesta inmune Th l puede volverse importante, una vez que vacunas de proteínas o péptidos se usen, debido a que estas vacunas normalmente inducen una respuesta inmune a base de Th que en consecuencia previene la inducción de células T citotóxicas .
Por lo tanto, se prefiere que un compuesto o complej o que se usará como un adyuvante pueda de preferencia tener la propiedad de desplazar una respuesta inmune específica de antígeno causada por una vacuna a una respuesta inmune a base de Th l . La dirección de una respuesta inmune inducida por una vacuna se mide normalmente por la determinación de la inducción de varios subtipos de anticuerpos específicos de antígenos y la inducción de células T CD8+ citotóxicas especi ficas de antígenos . En este contexto, el subtipo de anticuerpo IgG l representa la inducción de una respuesta inmune a base de Th2 y la inducción del anticuerpo de subtipo IgG2a y la inducción de células T citotóxicas representa la inducción de una respuesta inmune a base de Th l . La inducción de anticuerpos específicos de antígenos se determina por la revisión del título de anticuerpos en la sangre del vacunado por ELISA. La inducción de células T citotóxicas específicas de antígenos se determina por la medición de la secreción de IFN-gamma en esplenocitos después de la estimulación con péptidos específicos de antígenos por ELISPOT. En este contexto, la inducción de secreción de IFN-gamma prueba que las células T citotóxicas específicas de antígenos están presentes en el bazo que pueden atacar específicamente células que presentan epítopos del antígeno en moléculas MHC I sobre su superficie.
Así, para la determinación de propiedades benéficas de un adyuvante se llevan a cabo vacunaciones in vivo. Con éstas, es posible encontrar si el adyuvante o compuesto o complej o inmunoestimulador mejora una respuesta inmune específica de antígeno causada por la vacuna y, además, si puede desplazar una respuesta inmune específica de antígeno en la dirección deseada para desplegar propiedades adyuvantes. Particularmente, en la inducción de una respuesta inmune antitumoral la inducción de una respuesta inmune desplazada por Th l , especialmente la inducción de células T citotóxicas juega un papel principal, debido a que la inducción de células T citotóxicas específicas de antígenos representa un prerrequisito indispensable para el combate exitoso de un tumor.
En consecuencia, los métodos para tamizar compuestos o complej os que realmente exhiban propiedades como agentes inmunoestimuladores y/o adyuvantes se conocen bien en la técnica y pueden aplicarse fácilmente por ej emplo por pruebas ELISA que midan la respuesta inmune provocada por los compuestos/complej os probados.
De acuerdo con otra modalidad particularmente preferida, la composición farmacéutica de la invención (o el complejo de carga portador polimérico de la invención) puede ser provista o usada como una vacuna.
En este contexto, la vacuna se define de preferencia como un adyuvante o como una composición farmacéutica de la invención como la descrita arriba. Más preferiblemente, el ácido nucleico del complejo de carga portador polimérico de la invención, contenido de preferencia en esta vacuna, puede ser cualquier ácido nucleico como el definido arriba, de preferencia un ácido nucleico inmunoestimulador como el definido aquí, por ej emplo, un CpG-ADN o un ARN inmunoestimulador (ARNsi). Como alternativa o además, el ácido nucleico del complejo de carga portador polimérico de la invención, de preferencia contenido en la vacuna, es un ácido nucleico de codificación como el definido aquí, preferiblemente un ADNc o un ARNm, muy preferiblemente que codifica para una proteína adyuvante, de preferencia como la definida aquí. Como alternativa o además, el ácido nucleico del complejo de carga portador polimérico de la invención, contenido de preferencia en la vacuna, es un ácido nucleico de codificación como el definido en la presente, de preferencia un ADNc o un A Nm, más preferiblemente que codifica para un antígeno, de preferencia como el definido aquí . Además, particularmente si el ácido nucleico del complej o de carga portador polimérico de la invención no codifica para un antígeno, la vacuna de la invención puede contener un antígeno, de preferencia como el definido arriba, ya sea como una proteína o péptido o codificado por un ácido nucleico, o células antigénicas, fragmentos celulares antigénicos, fracciones celulares; componentes de pared celular (por ej emplo, polisacáridos), patógenos modificados, atenuados o desactivados (por ej emplo, químicamente o por irradiación) (virus, bacterias, etc.).
De acuerdo con un primer aspecto esta vacuna de la invención está compuesta típicamente al igual que el adyuvante de la invención y soporta o provoca de preferencia una respuesta inmune innata del sistema inmunológico de un paciente que será tratado, si un ácido nucleico inmunoestimulador se usa como la molécula de ácido nucleico del complej o de carga portador polimérico de la invención.
De acuerdo con un segundo aspecto la vacuna de l a invención puede provocar una respuesta inmune adaptiva, de preferencia si el ácido nucleico del complej o de carga portador polimérico de la invención como el definido aquí codifica para un antígeno como el definido en la presente, adecuado para provocar una respuesta inmune adaptiva. Como alternativa, este antígeno puede estar en forma de un péptido, una proteína o un epítopo o se puede proporcionar como un ácido nucleico adicional que codifique para dicho antígeno. El antígeno puede ser también un componente del portador polimérico de la invención, por ej emplo, como un componente (AA), como el definido aquí.
La vacuna, agente inmunoestimulador o adyuvante de la invención también pueden comprender un portador, adyuvante y/o vehículo farmacéuticamente aceptable como el definido en la presente para la composición farmacéutica de la invención. En el contexto específico de la vacuna de la invención, la elección de un portador farmacéuticamente aceptable se determina en principio por la manera en la cual se administra la vacuna de la invención. La vacuna de la invención puede administrarse, por ej emplo, sistémicamente o localmente. Las rutas para administración sistémica en general incluyen, por ejemplo, las rutas transdérmica, oral, parenteral, incluyendo inyecciones subcutáneas, intravenosas, intramusculares, intraarteriales, intradérmicas e intraperitoneales y/o rutas de administración intranasales. Las rutas para administración local en general incluyen, por ejemplo, rutas de administración tópica pero también las inyecciones intradérmicas, transdérmicas, subcutáneas o inyecciones intramusculares o intralesionales, intracraneales, intrapulmonares, intracardiacas y sublinguales. Muy preferiblemente, las vacunas pueden administrarse por una ruta intradérmica, subcutánea o intramuscular. Las vacunas de la invención son por lo tanto formuladas de preferencia en forma líquida (o algunas veces sólida). La cantidad adecuada de la vacuna de la invención que se administrará puede determinarse por experimentos de rutina con modelos animales. Estos modelos incluyen, sin implicar ninguna limitación, conejo, borrego, ratón, rata, perro y modelos de primates no humanos. Las formas de dosis única que se prefieren para inyección incluyen soluciones estériles de agua, solución salina fisiológica o mezclas de las mismas. El pH de estas soluciones debe ajustarse a aproximadamente 7.4. Los portadores adecuados para inyección incluyen hidrogeles, dispositivos para liberación controlada o retrasada, ácido poliláctico y matrices de colágeno. Los portadores farmacéuticamente aceptables útiles para administración tópica incluyen aquellos que son adecuados para usarse en lociones, cremas, geles y similares. Si la vacuna de la invención se va a administrar oralmente, tabletas, cápsulas y similares son la forma de dosis única que se prefiere. Los portadores farmacéuticamente aceptables para la preparación de formas de dosis única que pueden usarse para administración oral se conocen bien en la técnica anterior. La elección de los mismos dependerá de consideraciones secundarias tales como sabor, costos y capacidad de almacenamiento, las cuales no son críticas para los efectos de la presente invención, y se pueden hacer sin dificultad por una persona capacitada en la técnica.
La vacuna, agente inmunoestimulador o adyuvante de la invención puede contener además una o más sustancias auxiliares para de esta manera incrementar su inmunogenicidad o capacidad inmunoestimuladora, si se desea. Una acción sinérgica del complejo de carga portador polimérico de la invención como el definido aquí y de una sustancia auxiliar, que se puede contener opcionalmente en la vacuna, agente inmunoestimulador o adyuvante de la invención como el definido en la presente, se logra de preferencia de esta manera. Dependiendo de los diferentes tipos de sustancias auxiliares, varios mecanismos pueden entrar en consideración a este respecto. Por ej emplo, compuestos que permitan la maduración de células dendríticas (DCs), por ej emplo lipopolisacáridos, TNF-alfa o ligando CD40, forman una primera clase de sustancias auxiliares adecuadas. En general, es posible usar como sustancia auxiliar cualquier agente que influencie el sistema inmunológico de la manera de una "señal de peligro" (LPS, GP96, etc.) o citocinas, tales como GM-CFS, que permitan que se incremente y/o influencie una respuesta inmune de una manera seleccionada. Las sustancias auxiliares que se prefieren particularmente son citocinas, tales como monocinas, linfocinas, interleucinas o quimiocinas, que promueven además la respuesta inmune innata, tales como IL- 1 , IL-2, IL-3 , IL-4, IL-5 , IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL- 12, IL- 1 3 , IL- 14, IL- 1 5, IL- 1 6, IL- 1 7, IL- 1 8, IL- 19, IL-20, IL-2 1 , IL-22, IL-23 , IL-24, IL-25 , IL-26, IL-27, IL-28 , IL-29, IL-30, IL-3 1 , IL-32, IL-33 , IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gamma, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, LT-beta o TNF-alfa, factores de crecimiento, tales como hGH.
Los aditivos adicionales que pueden incluirse en la vacuna, agente inmunoestimulador o adyuvante de la emulsión son emulsionantes, tales como, por ejemplo, Tween®; agentes humectantes, tales como, por ej emplo, lauril sulfato de sodio, agentes colorantes; agentes de impartición de sabor, portadores farmacéuticos; agentes formadores de tabletas; estabilizadores; antioxidantes; conservadores.
La vacuna, agente inmunoestimulador o adyuvante de la invención también puede contener además cualquier compuesto adicional, que se sepa sea inmunoestimulador gracias a su afinidad de unión (como ligandos) a receptores tipo Toll humanos TLR 1 , TLR2, TLR3 , TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8 , TLR9, TLR 1 0 o gracias a su afinidad de unión (como ligandos) a receptores tipo Toll de murino TLR 1 , TLR2, TLR3 , TLR4, TLR5 , TLR6, TLR7, TLR8 , TLR9, TLR10, TLR 1 1 , TLR 12 o TLR 13.
La vacuna, agente inmunoestimulador o adyuvante de la invención también puede como alternativa o además contener un ARN inmunoestimulador, es decir, un ARN derivado de un ARN inmunoestimulador, que desencadene o incremente una respuesta inmune (innata). De preferencia, este ARN inmunoestimulador puede ser en general como el definido anteriormente en la presente.
Otra clase de compuestos que se pueden añadir a una vacuna, agente inmunoestimulador o adyuvante de la invención en este contexto, pueden ser ácidos nucleicos CpG, en particular CpG-ARN o CpG-ADN, A CpG-ARN o CpG-ADN pueden ser un CpG-ADN de hebra individual (ss CpG-ADN), un CpG-ADN de doble hebra (dsADN), un CpG-ARN de hebra individual (ss CpG-ARN) o un CpG-ARN de doble hebra (ds CpG-ARN). El ácido nucleico CpG está de preferencia en forma de CpG-ARN, muy preferiblemente en forma de CpG-ARN de hebra individual (ss CpG-ARN). 1 1 El ácido nucleico CpG contiene de preferencia al menos una o más secuencias de dinucleótidos de citosina/guanina (mitogénicas) (motivos CpG)) . De acuerdo con una primera alternativa preferida, al menos un motivo CpG contenido en estas secuencias, es decir la C (citosina) y la G (guanina) del motivo CpG, es no metilado. Todas las citosinas o guaninas adicionales contenidas opcionalmente en estas secuencias pueden ser ya sea metiladas o no metiladas. De acuerdo con una alternativa preferida más, sin embargo, la C (citosina) y la G (guanina) o el motivo CpG también pueden estar presentes en forma metilada.
La presente invención proporciona además varias aplicaciones y usos del complejo de carga portador polimérico de la invención como el definido en la presente, la composición farmacéutica de la invención, el agente inmunoestimulador de la invención o adyuvante y la vacuna de la invención que comprende los mismos o kits que comprenden los mismos.
De acuerdo con una modalidad específica, la presente invención está dirigida al primer uso médico del complejo de carga portador polimérico de la invención como el definido aquí como un medicamento, de preferencia como un agente inmunoestimulador, adyuvante o vacuna o en el campo de terapia génica.
De acuerdo con otra modalidad, la presente invención está dirigida al segundo uso médico del complej o de carga portador polimérico de la invención como el definido en la presente, para el tratamiento de enfermedades como las definidas aquí, de preferencia al uso del complejo de carga portador polimérico de la invención como el definido en la presente, de una composición farmacéuti ca, vacuna, agente inmunoestimulador, adyuvante o vacuna que comprenden los mismos o de kits que comprenden los mismos en la preparación de un medicamento para la profilaxis, tratamiento y/o disminución de varias enfermedades como las definidas aquí, particularmente profilaxis, tratamiento y/o reducción de estas enfermedades como las definidas en la presente. De preferencia, la composición farmacéutica, un agente inmunoestimulador, un adyuvante o una vacuna se usa o administra a un paciente que lo requiera para este fin.
De preferencia, las enfermedades mencionadas en la presente se seleccionan de cáncer o enfermedades tumorales, enfermedades infecciosas, de preferencia enfermedades infecciosas (vi rales, bacteri anas o protozoológicas), enfermedades autoinmunes, alergias o enfermedades alérgicas, enfermedades monogenéticas, es decir, (hereditarias), o enfermedades genéticas en general, enfermedades que tengan un antecedente genético heredado y las cuales sean causadas típicamente por un sol defecto génico y se hereden de acuerdo con las leyes de Mendel, enfermedades cardiovasculares, enfermedades neuronales o cualquier enfermedad que pueda ser influenciada por la presente invención.
Estas enfermedades incluyen cáncer o enfermedades tumorales, seleccionadas de preferencia de melanomas, melanomas malignos, carcinomas de colon, linfomas, sarcomas, blastomas, carcinomas renales, tumores gastrointestinales, gliomas, tumores de próstata, cáncer de vejiga, tumores rectales, cáncer de estómago, cáncer esofágico, cáncer pancreático, cáncer de hígado, carcinomas mamarios (= cáncer de mama), cáncer uterino, cáncer cervical, leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfoide aguda (ALL), leucemia mieloide crónica (CML), leucemia linfocítica crónica (CLL), hepatomas, varios tumores inducidos por virus tales como, por ej emplo, carcinomas inducidos por virus de papiloma (por ej emplo, carcinoma cervical = cáncer cervical), adenocarcinomas, tumores inducidos por virus del herpes (por ej emplo, linfoma de Burkitt, linfoma de células B inducido por EBV), tumores inducidos por hepatitis B (carcinomas hepatocelulares), linfomas inducidos por HTLV- 1 y HTLV-2, neuroma acústico, carcinomas pulmonares (= cáncer de pulmón = carcinoma bronquial), carcinomas pulmonares microcíticos, cáncer faríngeo, carcinoma anal, glioblastoma, carcinoma rectal, astrocitoma, tumores cerebrales, retinoblastoma, basalioma, metástasis cerebrales, meduloblastomas, cáncer vaginal, cáncer pancreático, cáncer testicular, síndrome de Hodgkin, meningiomas, enfermedad de Schneeberger, tumor de hipófisis, micosis fungoide, carcinoides, neurinoma, espinalioma, linfoma de Burkitt, cáncer de laringe, cáncer renal, timoma, carcinoma corporal, cáncer de hueso, linfomas no Hodgkin, cáncer uretral, síndrome CUP, tumores de cabeza/cuello, oligodendroglioma, cáncer vulvar, cáncer intestinal, carcinoma de colon, carcinoma esofágico (= cáncer de esófago), implicación de verrugas, tumores del intestino delgado, craneofaringeomas, carcinoma ovárico, tumores genitales, cáncer ovárico (= carcinoma ovárico), carcinoma pancreático (= cáncer pancreático), carcinoma endometrial, metástasis hepáticas, cáncer de pene, cáncer de lengua, cáncer de vesícula biliar, leucemia, plasmocitoma, tumor de pestaña, tumor de párpado, cáncer de próstata (= tumores de próstata), etc.
De acuerdo con una modalidad específica adicional, las enfermedades definidas en la presente comprenden enfermedades infecciosas, de preferencia enfermedades infecciosas (virales, bacterianas o protozoológicas). Estas enfermedades infecciosas, de preferencia enfermedades infecciosas (virales, bacterianas o protozoológicas), se seleccionan típicamente de influenza, malaria, SARS, fiebre amarilla, SIDA, borreliosis de Lyme, Leishmaniasis, ántrax, meningitis, enfermedades infecciosas virales tales como SIDA, condiloma acuminata, verrugas huecas, fiebre del Dengue, fiebre de tres días, virus del Ebola, resfriado, meningoencefalitis de verano inicial (FSME), herpes zoster, hepatitis, sarampión, virus herpes simple tipo I, herpes simple tipo II, herpes zoster, influenza, encefalitis Japonesa, fiebre de Lassa, virus de Marburg, sarampión, fiebre aftosa, mononucleosis, paperas, infección de virus de Norwalk, fiebre grandular de Pfeiffer, viruela, polio (cojera de niñez), pseudo-croup, enfermedad de fifth, rabia, verrugas, fiebre del Nilo Occidental, viruela, virus citomegálico (CMV), enfermedades infecciosas bacterianas tales como aborto espontáneo (inflamación de próstata), ántrax, apendicitis, borreliosis, botulismo, Camphylobacter, Chlamydia trachomatis (inflamación de la uretra, conjuntivitis), cólera, difteria, donavanosis, epiglotitis, fiebre de tifo, gangrena gaseosa, gonorrea, fiebre de conej o, Heliobacter pylori, tos con silbido, bubo climático, osteomielitis, enfermedad de Legionario, lepra, listeriosis, neumonía, meningitis, meningitis bacteriana, ántrax, otitis media, micoplasma hominis, sepsis neonatal (corioamnionitis), noma, paratifus, plaga, síndrome de Reiter, fiebre moteada de las Montañas Rocallosas, paratifus por salmonela, tifus por salmonella, fiebre escarlata, sífilis, tétanos, tripper, enfermedad de tsutsugamushi, tuberculosis, tifus, vaginitis (colpiti s), chancro suave y de enfermedades infecciosas causadas por parásitos, protozoarios u hongos, tales como amibiásis, bilharziosis, enfermedad de Chagas, pie de atleta, machas por hongos de levadura, escabies, mal aria, oncocercosis (ceguera de río) o enfermedades fúngicas, toxoplasmosis, tricomoniasis, tripanosomiasis (enfermedad del sueño), Leishmaniosis visceral, dermatitis por braga/pañal, esquistosomiasis, envenenamiento por pescado (Ciguatera), candidosis, Leishmaniosis cutánea, lambliasis (giardiasis) o enfermedad del sueño, o de enfermedades infecciosas causadas por equinococos, tenia de pescado, tenia de zorro, tenia de caninos, piojos, tenia de bovino, tenia de porcina, tenia en miniatura.
De acuerdo con otra modalidad específica, las enfermedades definidas en la presente comprenden enfermedades autoinmunes como las definidas a continuación. Las enfermedades autoinmunes pueden dividirse ampliamente en trastornos autoinmunes sistémicos y específicos de órganos o localizados, dependiendo de las características clinicopatológicas principales de cada enfermedad. Las enfermedades autoinmunes pueden dividirse en las categorías de síndromes sistémicos, incluyendo lupus eritematoso sistémico (SLE), síndrome de Sjogren, escleroderma, artritis reumatoide y polimiositis o síndromes locales que pueden ser endocrinológicos (diabetes tipo I (diabetes mellitus tipo 1 ), tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Addison, etc.), dermatológicas (pénfigo vulgar), hematológicas (anemia hemolítica autoinmune), neurales (esclerosis múltiple) o pueden incluir virtualmente cualquier masa circunscrita de tejido corporal. Las enfermedades autoinmunes que serán tratadas pueden seleccionarse del grupo que consiste en enfermedades autoinmunes tipo I o enfermedades autoinmunes tipo II o enfermedades autoinmunes tipo III o enfermedades autoinmunes tipo IV, tales como, por ej emplo, esclerosis múltiple (EM), artritis reumatoide, diabetes, diabetes tipo I (diabetes mellitus tipo 1 ), poliartritis crónica, enfermedad de Basedow, formas autoinmunes de hepatitis crónica, colitis ulcerosa, enfermedades de alergia tipo I, enfermedades de alergia tipo II, enfermedades de alergia tipo III, enfermedades de alergia tipo IV, fibromialgia, caída de cabello, enfermedad de Bechterew, enfermedad de Crohn, miastenia grave, neurodermitis, polimialgia reumática, escl erosis sistémi ca progresiva (PSS), síndrome de Reiter, artritis reumatoide, psoriasis, vasculitis, etc. , o diabetes tipo II. Aunque el modo exacto en cuanto a cómo el sistema inmunológico induce una reacción inmune contra autoantígenos aún no ha sido elucidado hasta el momento, existen varios descubrimientos con respecto a la etiología. En consecuencia, la autorreacción puede deberse a una derivación de células T. Un sistema inmunológico normal requiere la activación de células B por células T antes de que las primeras puedan producir anticuerpos en grandes cantidades. Este requisito de una célula T puede ser derivado en casos raros, tales como infección por organismos que produzcan superantígenos, los cuales sean capaces de iniciar activación poli clonal de células B , o incluso de células T, al unirse directamente a la subunidad ß de receptores de células T de una forma no específica. Otra explicación deduce a las enfermedades autoinmunes a partir de una simulación molecular. Un antígeno exógeno puede compartir similitudes estructurales con ciertos antígenos anfitriones; de esta manera, cualquier anticuerpo producido contra este antígeno (el cual simula los auto-antígenos) también puede, en teoría, unirse a los antígenos anfitriones y amplificar la respuesta inmune. La forma más desconcertante de simulación molecular se observa en los estreptococos hemolíticos beta del grupo A, que comparten antígenos con miocardio humano y son responsables de las manifestaciones cardiacas de la fiebre reumática.
Además, de acuerdo con una modalidad específica adicional, enfermedades como las definidas en la presente comprenden alergias o enfermedades alérgicas, es decir enfermedades relacionadas con alergias. La alergia es una condición que típicamente incluye una hipersensibilidad inmunológica anormal y adquirida a ciertos antígenos o alérgenos extraños, tales como los antígenos de alergia como los definidos aquí. Estos antígenos de alergia o alérgenos pueden seleccionarse de antígenos de alergia como los definidos en la presente, antígenos derivados de diferentes fuentes, por ej emplo, de animales, plantas, hongos, bacterias, etc. Los alérgenos en este contexto incluyen, por ej emplo, céspedes, pólenes, mohos, fármacos o numerosos activadores ambientales, etc. Las alergias normalmente resultan en respuesta inflamatoria local o sistémica a estos antígenos o alérgenos y llevan a inmunidad en el cuerpo contra estos alérgenos. Sin estar limitados por teoría, se supone que varios mecanismos de enfermedad diferentes están implicados en el desarrollo de alergias. De acuerdo con un esquema de clasificación por P. Gell and R. Coombs the word "allergy" se restringió a hipersensibilidades tipo I, las cuales son causadas por el clásico mecanismo IgE . La hipersensibilidad tipo I se caracteriza por una excesiva activación de células cebadas y basófilos por IgE, dando como resultado una respuesta inflamatoria sistémica que puede resultar en síntomas tan benignos como una nariz irritada, hasta un potencialmente amenazador de vida choque anafiláctico y muerte. Los tipos bien conocidos de alergias incluyen, sin estar limitados a estos, asma alérgica (que lleva a hinchazón de la mucosa nasal), conjuntivitis alérgica (que lleva a enroj ecimiento y comezón de la conjuntiva), rinitis alérgica ("fiebre del heno"), anafilaxis, angioderma, dermatitis atópica (eczema), urticaria, eosinofilia, alergias respiratorias a picaduras de insectos, alergias de piel (que llevan e incluyen varias erupciones, tales como eczema, (urticaria) y dermatitis (por contacto), alergias de alimentos, alergias a medicina, etc. El tratamiento de estos trastornos o enfermedades alérgicos puede presentarse de preferencia al desensibilizar la reacción inmune que desencadena una respuesta inmune específica. Esta desensibilización se puede llevar a cabo al administrar una cantidad efectiva del alérgeno o antígeno alérgico codificado por el ácido nucleico como el definido en la presente, de preferencia cuando se formula como una composición farmacéutica, para inducir una ligera reacción inmune. La cantidad del alérgeno o antígeno alérgico puede ser luego elevada gradualmente en administraciones subsecuentes hasta que el sistema inmunológico del paciente que será tratado tolere una cantidad específica de alérgeno o antígeno alérgico.
Además, las enfermedades que serán tratadas en el contexto de la presente invención igualmente incluyen enfermedades (hereditarias), o enfermedades genéticas en enfermedades monogenéticas generales, es decir, enfermedades (hereditarias), o enfermedades genéticas en general. Estas enfermedades monogenéticas, enfermedades (hereditarias) o enfermedades genéticas en general son típicamente causadas por defectos genéticos, por ej emplo, debido a mutaciones génicas que se traducen en pérdida de actividad de proteínas o mutaciones reguladoras que no permiten la transcripción o traducción de la proteína. Frecuentemente, estas enfermedades llevan a trastornos metabólicos y otros síntomas, por ej emplo, distrofia muscular. La presente invención permite tratar las siguientes enfermedades (hereditarias) o enfermedades genéticas: deficiencia de 3- beta-hidroxiesteroide deshidrogenasa (tipo II) ; deficiencia de 3 -cetotiolasa; sensibilidad a 6-mercaptopurina; síndrome de Aarskog-Scott; abetalipoproteinemia; acatalasemia; acondrogénesis; acondrogénesis-hipocondrogénesis; acondroplasia; acromatopsia; displasia acromesomélica (tipo Hunter-Thompson); deficiencia de ACTH; deficiencia de Acil-CoA deshidrogenasa (cadena corta, cadena media, cadena larga); poliposis coli adenomatosa; deficiencia de adenosina-desaminasa; deficiencia de adenilosuccinasa; adalinopatía; hiperplasia adrenal; congénita (debida a deficiencia de 1 1 -beta-hidroxilasa; debida a deficiencia de 17-alfa-hidroxilasa; debida a deficiencia de 2 1 -hidroxilasa); hipoplasia adrenal, congénita, con hipogonadismo hipogonadotrópico; síndrome adrenogenital; adrenoleucodistrofia; adrenomieloneuropatía; afibrinogenemia; agammaglobulinemia; síndrome de Alagille; albinismo (café, ocular, oculocutáneo, rufo); intolerancia al alcohol, aguda; deficiencia de aldolasa A; aldosteronismo; remediable por glucocorticoides; enfermedad de Alexander; alcaptonuria; alopecia universal; deficiencia de alfa- 1 -antiquimiotripsina; deficiencia de alfa-me.tilacil-CoA racemasa; síndrome de retraso mental/alfa-talasemia; síndrome de Alport; enfermedad de Alzheimer- 1 (relacionada con APP); enfermedad de Alzheimer-3 ; enfermedad de Alzheimer-4; amelogénesis imperfecta; neuropatía amiloide (familiar, tipos alélicos severos); amiloidosis (tipo Holandés; tipo finlandés; renal hereditaria; renal; sistémica senil); esclerosis lateral amiotrófica; analbuminemia; insensibilidad a andrógenos; anemia (Diamond-Blackfan); anemia (hemolítica, debido a deficiencia de PK); anemia (hemolítica, nula en Rh, tipo supresor); anemia (hemolítica neonatal, fatal y casi fatal); anemia (sideroblástica, con ataxia); anemia (sideroblástica/hipocrómica); anemia debida a deficiencia en G6PD; aneurismo (arterial familiar); síndrome de Angelman; angioedema; aniridia; anomalías en el segmento anterior y cataratas; disgénesis mesenquimática del segmento anterior; disgénesis mesenquimática del segmento anterior y catarata; deficiencia de antitrombina III; rasgos de personalidad relacionadas con ansiedad; síndrome de Apert; apnea (postanestécica); deficiencia de ApoA-I y apoC-III (combinada); deficiencia de apolipoproteína A-II; apolipoproteína B- 100 (defectuosa en ligandos); exceso de mineralocorticoides aparente (debido a hipertensión); argininemia; argininosuccinicaciduria; artropatia (pseudorreumatoide progresiva, de niñez); aspartilglucosaminuria; ataxia (episódica); ataxia con deficiencia de vitamina E aislada; ataxia-telangiectasia; atelosteogénesis II; deficiencia de ADN ligasa I dependiente de ATP; defecto séptico atrial con defectos de conducción atrioventricular; atricia con lesiones papulares; autismo (succinilpurinémico); enfermedad poliglandular autoinmune, tipo I; disfunción del sistema nervioso autonómico; anomalía de Axenfeld; azoospermia; síndrome de Bamforth-Lazarus; síndrome de Bannayan-Zonana; síndrome de Barth; síndrome de Bartter (tipo 2 o tip 3); carcinoma de células básales; síndrome del nevo celular basal ; infección por BCG; síndrome de cutis gyrata de Beare-Stevenson; distrofia muscular de Becker; síndrome de B eckwith-Wiedemann; síndrome de Bernard-Soulier (tipo B ; tipo C); miopatía de Bethlem; mala absorción de ácidos biliares, primaria; deficiencia de biotinidasa; cáncer de vejiga; trastorno de hemorragia debido a receptor de tromboxano A2 defectuoso; síndrome de Bloom; braquidactilia (tipo B l o tipo C); síndrome branquiootico ; síndrome branquiootorrenal; cáncer de seno (intraductal invasivo; lobular; masculino, con síndrome de Reifenstein; esporádico); cáncer de mama- 1 (inicio temprano); cáncer de mama-2 (inicio temprano); miopatía de Brody; síndrome de Brugada; síndrome de Brunner; linfoma de Burkitt; distrofia de mariposa (retinal); deficiencia de C l q (tipo A; tipo B ; tipo C); deficiencia de C l r/C l s; deficiencia de C l s, aislada; deficiencia de C2 ; deficiencia de C3 ; deficiencia de inactivador de C3b; deficiencia de C4; deficiencia de C8, tipo II; deficiencia de C9 ; displasia campomélica con inversión de sexo autosómica; camptodactililia-artropatía-coxa síndrome de varapericarditis; enfermedad de Canavan; deficiencia de carbamoilfosfato sintetasa I; síndrome de glicoproteína deficiente en carbohidratos (tipo I; tipo Ib; tipo II); tumor carcinoide de pulmón; cardioencefalomiopatía (infanti l fatal, debida a deficiencia en citocromo c oxidasa); cardiomiopatía (dilatada; dilatada de relación X; hipertrófica familiar; hipertrófica); deficiencia de carnitina (primaria sistémica); deficiencia de carnitina-acilcarnitina translocasa; síndrome del túnel Carpal (familiar); catarata (cerúlea; congénita; cristalina aculeiforme; de inicio juvenil; polimórfica y laminar; punteada; pulverulenta zonular); catarata, tipo Coppock; deficiencia de CD59; enfermedad de núcleo central; ataxia cerebelar; angiopatía amiloide cerebral; arteriopatía cerebral con infartos subcorticales y leucoencefalopatía; malformaciones cavernosas cerebrales- 1 ; síndrome cerebrooculafocioesquelético; Cerebrotendinous xantomatosis; enfermedad cerebrovascular; lipfuscinosis ceroide (neuronal, tipo juvenil variante, con depósitos osmiofílicos granulares); lipofuscinosis ceroide (neuronal- 1 , infantil); lipofuscinosis ceroide (neuronal-3 , juvenil); síndrome de Char; enfermedad de Charcot-Marie-Tooth; neuropatía de Charcot-Marie-Tooth; tipo Charlevoix-Saguenay; síndrome de Chediak-Higashi ; diarrea por cloruro (tipo finlandés); colestasis (intrahepática recurrente benigna); col estasis (intrahepática familiar); colestasis (intrahepática familiar progresiva); enfermedad de almacenamiento de éster colesterílico; condrodisplasia punteada (braquitelefalángica; rizomélica; dominante ligada a X; recesiva ligada a X; tipo Grebe); condrosarcoma; coroideremia; enfermedad granulomatosa crónia (autosómica, debida a deficiencia de CYBA); enfermedad granulomatosa crónica (ligada a X) ; enfermedad granulomatosa crónica debida a deficiencia de NCF- 1 ; enfermedad granulomatosa crónica debida a deficiencia de NCF-2; síndrome de quilomicronemia, familiar; citrulinemia; síndrome de Cockayne clásico- 1 ; labio leporino, mandíbula hendida, paladar hendido ; síndrome de displasia ectodérmica por labio leporino/paladar hendido; displasia cleidocraneal; deficiencia de CMO II; enfermedad de Coats ; síndrome de Cockayne-2, tipo B ; síndrome de Coffin-Lowry; resistencia a Colchicina; adenocarcinoma de colon; cáncer de colon; daltonia (deutana; protana; tritana) ; cáncer colorrectal; deficiencia de factor V y VIII combinados ; hiperlipemia combinada (familiar); inmunodeficiencia combinada (ligada a X, moderada); deficiencia de complej o I; trastorno neurológico complejo; distrofia de cono-3 ; distrofia de cono-barra 3 ; distrofia de cono-barra 6; distrofia retinal de cono-barra-2; ausencia bilateral congénita de vasos deferentes; conjuntivitis; ligneosa; aracnodactilia contractural; coproporfiria; córnea plana congénita; enturbecimiento corneal ; distrofia corneal (tipo Avellino; tipo gota gelatinosa; tipo de Groenouw I; tipo retícula I; tipo Reis-Bucklers); resistencia a cortisol; resistencia a coumarina; enfermedad de Cowden; deficiencia de CPT, hepática (tipo I; tipo II) ; calambres (familiares, agravados por potasio); síndrome de sordera craneofacial-manual; craneosinostosis (tipo 2); cretinismo; enfermedad de Creutzfeldt-Jakob; síndrome de Crigler-Najjar; síndrome de Crouzon; síndrome de Currarino; cutis laxo; hematopoyesis cíclica; ictiosis cíclica; cilindromatosis; fibrosis quística; cistinosis (nefropática) ; cistinuria (tipo II; tipo III); daltonismo; enfermedad de Darier; deficiencia de proteína bifuncional D ; sordera; dominante autosómica 1 ; sordera; dominante autosómica 1 1 ; sordera, dominante autosómica 12; sordera, dominante autosómica 1 5 ; sordera, dominante autosómica 2; sordera, dominante autosómica 3 ; sordera, dominante autosómica 5 ; sordera, dominante autosómica 8 ; sordera, dominante autosómica 9; sordera, recesiva autosómica 1 ; sordera, recesiva autosómica 2 ; sordera, recesiva autosómica 2 1 ; sordera, recesiva autosómica 3 ; sordera, recesiva autosómica 4; sordera, recesiva autosómica 9 ; sordera, sensorineural nonsindrómica 1 3 ; sordera, ligada a X 1 ; sordera, ligada a X 3 ; sensibilidad a debrisoquina; enfermedad de Dejerine-Sottas; demencia (danesa familiar) ; demencia (frontotemporal, con parkinsonismo) ; enfermedad de Dent; anomalías dentales; atrofia dentatorubro-palidoluisiana; síndrome de Denys-Drash; dermatofibrosarcoma protuberante; enfermedad desmolde; diabetes insípida (nefrogénica); diabetes insípida (neurohipofisea); diabetes mellitus (resistente a insulina); diabetes mellitus (forma rara); diabetes mellitus (tipo II) ; displasia diastrófica; dihidropirimidinuria; inversión de sexo sensible a dosis; degeneración alveolar de retina de Doyne; síndrome de Dubin-Johnson; distrofia muscular de Duchenne; anemia diseritropoyética con trombocitopenia; disfibrinogenemia (tipo alfa; tipo beta; tipo gamma); disqueratosis congénita- 1 ; disprotrombinemia; distonía (responsiva a DOPA); distonía (mioclónica); distonía- 1 (torsión); displasia ectodérmica; ectopia lentis; ectopia de pupila; ectrodactilia (displasia ectodérmica y síndrome de labio/paladar hendido 3); síndrome de Ehlers-Danlos (forma progeroide); síndrome de Ehlers-Danlos (tipo I ; tipo II; tipo III; tipo IV; tipo VI; tipo VII); estenosis aórtica supravalvular por elastina; eliptocitosis- 1 ; eliptocitosis-2; eliptocitosis-3 ; síndrome de Ellis-van Creveld; distrofia muscular de Emery-Dreifuss; enfisema; encefalopatía; fibroelastosis endocárdica-2 ; carcinoma endometrial ; deficiencia de acetilcolinesterasa de placa final; síndrome de cono S incrementado; acueducto vestibular incrementado, epidermólisis hullosa; epidermólisis hullosa distrófica (dominante o recesiva); epidermólisis hullosa simple; hiperqueratosis epidermólica; queratoderma palmoplantar epidermolítico; epilepsia (generalizada; juvenil; mioclónica; lóbulo frontal nocturno; mioclónica progresiva); epilepsia, benigna, neonatal (tipo 1 o tipo 2); displasia epifisea (múltiple); ataxia episódica (tipo 2); ataxia episódica/síndrome de mioquimia; eritremias (alfa; displasia); eritrocitosis; eritroqueratoderma; resistencia a estrógenos; mioglobinuria ejercional debida a deficiencia de LDH-A; exostoses múltiple (tipo 1; tipo 2); vitreorretinopatía exudativa, ligada a X; enfermedad de Fabry; deficiencia de factor H; deficiencia de factor VII; deficiencia de factor X; deficiencia de factor XI; deficiencia de factor XII; deficiencia de factor XIIIA; deficiencia de factor XIIIB; fiebre mediterránea familiar; anemia de Fanconi; síndrome de Fanconi-Bickel; lipogranulomatosis de Farber; hígado graso (agudo); favismo; enfermedad de ojo de pescado; hipoplasia foveal; síndrome X frágil; síndrome de Frasier; ataxia de Friedreich; intolerancia a fructosa-bisfosfatasa fructosa; fucosidosis; deficiencia de fumarasa; Fundus albipunctatus; Fundus flavimaculatus; deficiencia de G6PD; deficiencia de GAB A-transaminasa; deficiencia de galactocinasa con cataratas; deficiencia de galactosa epimerasa; galactosemia; galactosialidosis; deficiencia de GAMT; síndrome de Gardner; cáncer gástrico; enfermedad de Gaucher; epilepsia generalizada con ataques febriles adicionales; tumores de células germinales; enfermedad de Gerstmann-Straussler; hepatitis de células gigantes (neonatal); trastorno de plaquetas gigantes; fibroblastoma de células gigantes; síndrome de Gitelman; trombastenia de Glanzmann (tipo A; tipo B); glaucoma 1 A; glaucoma 3A; glioblastoma multiforme; glomerulosclerosis (segmental focal); defecto en transporte de glucosa (barrera hematoencefálica); mala absorción de glucosa/galactosa; deficiencia de glucosidasa I; glutaricaciduria (tipo I; tipo IIB ; tipo IIC); deficiencia de glutationa sintetasa; deficiencia de glicerol cinasa; receptor de glicina (polipéptido alfa- 1 ); enfermedad de almacenamiento de glicógenos I; enfermedad de almacenamiento de gli cógenos II; enfermedad de almacenamiento de glicógenos III; enfermedad de almacenamiento de glicógenos IV; enfermedad de almacenamiento de glicógenos VI; enfermedad de almacenamiento de glicógenos VII; glicogenosis (hepática, autosómica) ; glicogenosis (hepática ligada a X); GM l -gangliosidosis; GM2-gangliosidosis; Goiter (multinodular adolescente); Goiter (congénito); Goiter (no edémico, simple); disgénesis gonadal (tipo XY); granulomatosis, séptica; enfermedad de Graves; síndrome de cefalopolisindactilia de Greig; síndrome de Griscelli ; enanismo deficiente de hormona de crecimiento; retraso de crecimiento con sordera y retraso mental; ginecomastia (familiar, debida a actividad aromatasa incrementada) ; atrofia girada de coroide y retina con ornitinemia (sensible o no sensible a B6); enfermedad de Hailey-Hailey; síndrome de Haim-Munk; síndrome de mano-pie-útero; harderoporfirinuria; deficiencia de HDL (familiar); bloque cardiaco (no progresivo o progresivo9; anemia de cuerpos de Heinz; síndrome de HELLP; hematuria (benigna familiar); deficiencia de Heme oxigenasa- 1 ; migraña hemiplégica; hemocromotosis; enfermedad de hemoglobina H; anemia hemolítica debida a exceso de ADA; anemia hemolítica debida a deficiencia en adenilato cinasa; anemia hemolítica debida a defecto en banda 3 ; anemia hemolítica debida a deficiencia en glucosefosfato isomerasa; anemia hemolítica debida a deficiencia en glutationa sintetasa; anemia hemolítica debida a deficiencia en hexocinasa; anemia hemolítica debida a deficiencia en PGK; síndrome hemolítico-urémico; linfohistiocitosis hemofagocítica; hemofilia A; hemofilia B; diátesis hemorrágica debida a deficiencia en factor V; hemosiderosis (sistémica, debida a aceruloplasminemia); deficiencia de lipasa hepática; hepatoblastoma; carcinoma hepatocelular; telangiectasia hemorrágica hereditaria- 1 ; telangiectasia hemorrágica hereditaria-2 ; síndrome de Hermansky-Pudlak; heterotaxia (visceral ligada a X) ; heterotopia (periventricular); síndrome de Hippel-Lindau; enfermedad de Hirschprung; trombofilia de glicoproteínas ricas en histidina debida a deficiencia en HRG; deficiencia de HMG-CoA liasa; holoprosencefalia-2; holoprosencefalia-3 ; holoprosencefalia-4; holoprosencefalia-5 ; síndrome de Holt-Oram; homocistinuria; Hoyeraal-Hreidarsson; HPFH (tipo supresión o tipo no supresión); gota relacionada con HPRT; enfermedad de Huntington; hidrocefalia debida a estenosis acueductal; Hydrops fetalis; hiperbetalipoproteinemia; hipercolesterolemia, familiar; síndrome de hiperferritinemia-catarata; hiperglicerolemia; hiperglucinemia; hiperinmunoglobulinemia D y síndrome de fiebre periódica; hiperinsulinismo; síndrome de hiperinsulinismo-hiperamonemia; parálisis periódica hipercalcémica; hiperlipoproteinemia; hiperlisinemia; hipermetioninemia (persistente, autosómica, dominante, debida a metionina, deficiencia de adenosiltransferasa I/III) ; síndrome de hiperornitinemia-hiperamonemiahomocitrulinemia; hiperoxaluria; hiperparatiroidismo; hiperfenilalaninemia debida a deficiencia en pterin-4acarbinolamina deshidratasa; hiperproinsulinemia; hiperproli nemia; hipertensión; hipertiroidismo (congénito); hipertrigliceridemia; hipoalfalipoproteinemia; hipobetalipoproteinemia; hipocalcemia; hipocondroplasia; anemia microcítica hipocrómica; hipodontia; hipofibrinogenemia; hipoglobulinemia y células B ausentes; hipogonadismo (hipergonadotrópico); hipogonadotrópico (hipogonadismo); parálisis periódica hipocalcémica; hipomagnesemia; hipomielinación (congénita) ; hipoparatiroidismo; hipofosfatasia (adulto ; niñez; infantil; hereditaria); hipoprotrombinemia; hipotiroidismo (congénito; congénito hereditario; no bocioso); eritroderma ictiosiforme; ictiosis; ictiosis hullosa de Siemens; deficiencia de IgG2; síndrome de cilia inmóvil- 1 ; inmunodeficiencia (complej o de receptor de células T/CD3) ; inmunodeficiencia (ligada a X, con hiper-IgM); inmunodeficiencia debida a defecto en CD3 -gamma; síndrome de anomalías de inestabilidad facial por inmunodeficiencia Centroamérica; incontinencia pigmentosa; insensibilidad a dolor (congénita, con anhidrosis) ; insomnio (familiar fatal); deficiencia del receptor de interleucina-2 (cadena alfa); enfermedad de discos intervertebrales; iridogoniodi sgénesis; deficiencia de hormona de crecimiento aislada (tipo Illig con GH ausente y tipo Kowarski con GH bioinactiva); isovalericacidemia; síndrome de Jackson-Weiss; síndrome de Jensen; síndrome de Jervell y Lange-Nielsen ; síndrome de Joubert; síndrome de Juberg-Marsidi; síndrome de Kallmann; enfermedad de Kanzaki ; queratitis; queratoderma (palmoplantar); Keratosis palmoplantaris striata I; keratosis plamoplantaris striata II; cetoacidosis debida a deficiencia en SCOT; síndrome de Keutel ; síndrome de Klippel-Trenaurnay; displasia de Kniest; neutropenia de Kostmann; enfermedad de Krabbe; síndrome de Kurzripp-Polydaktylie; lacticacidemia debida a deficiencia en PDX 1 ; displasia mesomélica de Langer; enanismo de Laron ; síndrome de Laurence-Moon-Biedl-Bardet; deficiencia de LCHAD ; amaurosis congénita de Leber; malformación del ej e izquierdo-derecho; síndrome de Leigh; leiomiomatosis (difusa, con síndrome de Alport); leprecaunismo; discondrosteosis de Leri-Weill; síndrome de Lesch-Nyhan; leucemia (mieloide aguda; promielocítica aguda; linfoblástica de células T aguda; mieloide crónica; mielomonocitica juvenil; leucemia- 1 (linfocítica aguda de células T); deficiencia de adhesión de leucocitos; adenomas de células de Leydig; síndrme de Lhermitte-Duclos; síndrome de Liddle; síndrome de Li-Fraumeni; deficiencia de lipoamida deshidrogenasa; lipodistrofia; hiperplasia adrenal lipoide; deficiencia de lipasa de lipoproteína; lisencefalia (ligada a X) ; lisencefalia- 1 ; enfermedad de almacenamiento de glicógenos en hígado (tipo 0); síndrome de QT largo 1 ; síndrome de QT largo 2 ; síndrome de QT largo 3 ; síndrome de QT largo 5 ; síndrome de QT largo 6; síndrome de Lowe; cáncer pulmonar; cáncer pulmonar (no microcítico); cáncer pulmonar (microcítico); linfoedema; linfoma (no Hodgkin de células B); linfoma (macrocítico difuso); linfoma (folicular); linfoma (MALT) ; linfoma (células de manto); síndrome linfoproliferativo (ligado a X); intolerancia a proteínas lisinúricas; enfermedad de Machado-Joseph; anemia macrocítica refrataria (de síndrome 5q); distrofia macular; mesotelioma maligno; deficiencia de malonil-CoA descarboxilasa; manosidosis (alfa o beta); enfermedad de orina en j arabe de arce (tipo (la; tipo Ib ; tipo II) ; síndrome de Marfan; síndrome de Maroteaux-Lamy; síndrome de Marschall; síndrome de MASA; leucemia de mastocitos; mastocitosis con trastorno hematológico asociado; enfermedad de McArdle; displasia fibrosa poliostótica de McCune-Albright; síndrome de McKusick-Kaufman; fenotipo de McLeod; carcinoma de tiroides medular; meduloblastoma; distrofia corneal de Meesmann ; anemia megaloblástica- 1 ; melanoma; glomerulonefritis membroproliferativa; enfermedad de Meniere; meningioma (relacionado con NF2 ; relacionado con S IS); enfermedad de Menkes; retraso mental (ligado a X); metabolizador deficiencia de mefentoína; mesotelioma; leucodistrofia metacromática; condrodisplasia metafísea (tipo Murk Jansen; tipo Schmid); metemoglobinemia; deficiencia de metionina adenosiltransferasa (autosómica recesiva) ; deficiencia de metilcobalamina (tipo clbl G); metilmalonicaciduria (tipo deficiencia de mutasa); mevalonicaciduria; deficiencia de MHC clase II; microftalamia (cataratas, y anormalidades de iris); miopatía de Miyoshi; MODY; síndrome de Mohr-Tranebj aerg; deficiencia de cofactor de molibdeno (tipo A o tipo B); moniletrix; Morbus Fabry; Morbus Gaucher; mucopolisacaridosis; mucoviscidosis; síndrome de Muencke; síndrome de Muir-Torre; enanismo de Mulibrey; deficiencia de carboxilasa múltiple (sensible a biotina); neoplasia endocrina múltiple; glicogénesis muscular; distrofia muscular (merosindeficiente congénita); distrofia muscular (congénita de Fukuyama); distrofia muscular (de extremidades-cintura); distrofia muscular) tipo Duchenne); distrofia muscular con epidermólisis hullosa simple; síndrome miasténico (congénito de canal lento); infección micobacteriana (atípica, diseminada familiar); síndrome mielodisplásico; leucemia mielógena; malignidad mielógena; deficiencia de mieloperoxidasa; deficiencia en mioadenilato desaminasa; mioglobinuria/hemólisis debida a deficiencia en PGK; síndrome de encefalomiopatía mioneurogastrointestinal; miopatía (actina; congénita; relacionada con desmina; cardioesquelética; distal; nemalina); miopatía debida a deficiencia en CPT II; miopatía debida a deficiencia en fosfoglicerato mutasa; miotonia congénita; miotonia levior; distrofia miotónica; liposarcoma mixoide; deficiencia de NAGA; síndrome de Nailpatella; miopatía de Nemaline 1 (dominante autosómica); miopatía de nemalina 2 (recesiva autosómica); hiperparatiroidismo neonatal; nefrolitiasis; nefronoftisis (juvenil); nefropatía (hipocomplementérmica crónica); nefrosis- 1 ; síndrome nefrótico; síndrome de Netherton; neuroblastoma; neurofibromatosis (tipo 1 o tipo 2); neurolemomatosis; lipofuscinosis ceroide neuronal 5 ; neuropatía; neutropenia (neonatal aloinmune); enfermedad de Niemann-Pick (tipo A; tipo B ; tipo C l ; tipo D); ceguera nocturna (estacionaria congénita); síndrome de ruptura de Nijmegen; no compactación de miocardio ventricular izquierdo; queratoderma palmoplantar no epidermolítico; enfermedad de Norrie; enfermedad de Norum; deficiencia de nucleósido fosforilasa; obesidad; síndrome occipital; alpinismo ocular (tipo Nettleship-Falls) ; distrofia muscular oculofaríngea; enfermedad de Oguchi ; oligodontia; síndrome de Omenn; síndrme de Opitz G; coloboma de nervio óptico con enfermedad renal ; deficiencia de ornitina transcarbamilasa; oroticaciduria; intolerancia ortostática; síndrome de OSMED; osificación de ligamento longitudinal posterior de la espina; osteartrosis; osteogénesis imperfecta; osteolisis; osteopetrosis (recesiva o idiopática) ; osteosarcoma; carcinoma ovárico; disgenesis ovárica; paquionicia congénita (tipo Jackson-Lawler o tipo Jadassohn-Lewandowsky); enfermedad ósea de Paget; síndrome de Pallister-Hall; agenesis pancreática; cáncer pancreático; pancreatitis; síndrome de Papillon-Lefevre; paragangliomas; paramiotonia congénita; foramina parietal ; mal de Parkinson (familiar o juvenil); hemoglobinuria nocturna paroxismal; enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher; síndrome de Pendred; hipospadias perineales; fiebre periódica; trastorno de biogénesis peroxisómica; hipoglucemia hiperinsulinémica persistente de infancia; síndrome de ducto muleriano persistente (tipo II) ; anomalía de Peters; síndrome de Peutz-Jeghers; síndrome de Pfeiffer; fenilcetonuria; gota relacionada con fosforribosil pirofosfato sintetasa; deficiencia de fosforilasa cinasa hepática y muscular; piebaldismo; pilomatricoma; pinealoma con retinoblastoma bilateral; adenoma de secreción de ACTH pituitaria; deficiencia de hormona pituitaria; tumor de pituitaria; deficiencia de sulfatasa esteroide placentaria; deficiencia de inhibidor de plasmina; deficiencia de plasminógeno (tipos I y II); enfermedad de Tochigi por plasminógenos; trastorno de plaquetas; deficiencia de glicoproteína IV de plaquetas; deficiencia de acetilhidrolasa de factor de activación de plaquetas; enfermedad renal poliquística; osteodisplasia lipomembranosa poliquística con leucoencefalopatía esclerosante; polidactilia, postaxial; poliposis; síndrome de pterigio popliteal; Porfiria (hepática aguda o intermitente aguda o eritropoyética congénita); Porfiria cutánea tarda; Porfiria hepatoeritropoyética; Porfiria variegata; síndrme de Prader-Willi; pubertad precoz; insuficiencia ovárica prematura; progeria tipo I; progeria tipo II; oftalmoplegia externa progresiva; colestasis intrahepática progresiva-2 ; prolactinoma (hiperparatiroidismo; síndrome carcinoide); deficiencia de prolidasa; propionicacidemia; cáncer de próstata; deficienci a de proteína S ; proteinuria; protoporfiria (eritropoyética); pseudoacondroplasia; pseudohermafroditismo; pseudohipoaldesteronismo; pseudohipoparatiroidismo; hipospadias perineoscrotal pseudovaginales; raquitismo por deficiencia en pseudovitamina D ; Pseudoxanthoma elasticum (dominante autosómica; recesiva autosómico); proteinosis alveolar pulmonar; hipertensión pulmonar; púrpura fulminante; picnodisostosis; piropiquilocitosis; deficiencia de piruvato carboxilasa; deficiencia de piruvato deshidrogenasa; síndrome de Rabson-Mendenhall ; enfermedad de Refsum; carcinoma de células renales; acidosis tubular renal; acidosis tubular renal con sordera; síndrome de acidosis tubular renal-osteopetrosis; reticulosis (histiocítica familiar); degeneración retinal; distrofia retinal; retinitis pigmentosa; retinitis punctata albescens; retinoblastoma; deficiencia de proteína de unión a retinol; retinoschisis ; síndrome de Rett; síndrome de Rh(mod); síndrome de predisposici ón Rabdoide; tumores rabdoides; rabdomiosarcoma; rabdomiosarcoma (alveolar); Rhizomelic chondrodysplasia punctata; síndrome de Ribbing; raquitismo (resistente a vitamina D); anomalía de rieger; síndrome de Robinow; síndrome de Rothmund-Thomson; síndrome de Rubenstein-Taybi; sacaropinuria; síndrome de Saethre-Chotzen; enfermedad de Salla; enfermedad de Sandhoff (formas infantil, juvenil y adulta); síndrome de Sanfilippo (tipo A o tipo B); enfermedad de S chindler; esquizencenfalia; esquizofrenia (crónica) ; Schwannoma (esporádico) ; SCID (recesivo autosómico, tipo T negativo/Bpositivo); w/TMD de vía secretora; SED congénita; síndrome de Segawa; defecto de células T selectivo; SEMD (tipo Pakistaní); SEMD (tipo Strudwick); displasia septooptica; inmunodeficiencia combinada severa (negativa a células B); inmunodeficiencia combinada severa (negativa a células T, tipo positivo a células B/células asesinas naturales) ; inmunodeficiencia combinada severa (ligada a X); inmunodeficiencia combinada severa debida a deficiencia en ADA; inversión de sexo (XY, con insuficiencia adrenal) ; síndrome de Sezary; síndrome de Shah-Waardenburg; estatura corta; síndrome de Shprintzen-Goldberg; trastorno de almacenamiento de ácido siálico; sialidosis (tipo I o tipo II) ; sialuria; anemia de células falciformes; síndrome de Simpson-Golabi-Behmel ; Situs ambiguas; síndrome de Sjogren-Larsson; síndrome de Smith-Fineman-Myers; síndrome de Smith-Lemli-Optiz (tipo I o tipo II); smatotrofinoma; distrofia de fondo de sorsby; paraplejia espástica; esferocitosis; esferocitosis- 1 ; esferocitosis-2; atrofia muscular espinal y bulbar de Kennedy; atrofia muscular espinal; ataxia espi nocerebelar; disostosis espondilocostal ; displasia tardía espondi loepifísea; displasia espondilometafísea; (tipo Japonés); enfermedad de Stargardt- 1 ; esteatocistoma múltiple; síndrome de Stickler; síndrome de Sturge-Weber; heteropia laminar subcortical; heteropia laminar subcortical ; deficiencia de semialdehído deshidrogenasa succínica; intolerancia a sacarosa; síndrome de Sutherland-Haan; elevación de cloruro en sudor sin CF; sinfalangismo ; síndrome de sinostoses; sinpolidactilia; enfermedad de Tangier; enfermedad de Tay-Sachs; leucemia linfoblástica aguda de células T; inmunodeficiencia de células T; leucemia prolinfocítica de células T; talasemia (alfa o delta); talasemia debida a leporo Hb; displasia tanatofórica (tipos I o II) ; síndrome de anemia megaloblástica sensible a tiamina; trombocitemia; trombofilia (displasminogenémica); trombofilia debida a deficiencia en cofactor de heparina II; trombofilia debida a deficiencia en proteína C; trombofilia debida a defecto en trombomodulina; adenoma de tiroides; resistencia a hormona tiroides; deficiencia de yodo peroxidasa en tiroides; síndrome de Tietz; metabolizador deficiente de tolbutamida; síndrome de Townes-Brocks; deficiencia de transcobalamina II; disostosis mandibulofacial de Treacher Collins; síndrome tricondotóseo; síndrome tricorinofalángeo; tricotiodistrofia; deficiencia de proteína trifuncional (tipo I o tipo II) ; deficiencia de tripsinógeno; esclerosis tuberosa- 1 . esclerosis tuberosa-2 ; síndrome de Turcot; tirosina fosfatasa; tirosinemi a; síndrome de Ulnar-mamario; urolitiásis (2,8-dihidroxiadenina); síndrome de Usher (tipo I B o tipo 2A); malformaciones venosas; taquicardia ventricular; virilización; defectos de coagulación dependientes de vitamina K; deficiencia de VLCAD; síndrome de Vohwinkel; síndrome de von Hippel-Lindau; enfermedad de von Willebrand; síndrome de Waardenburg; síndrome de Warrdenburg/albinismo ocular; variante neurológica de Waardenburg-Shah; síndrome de Waardenburg-Shah; síndrome de Wagner; sensibilidad a warfarina; síndrome de Watson; síndrome de Weissenbacher-Zweymuller; síndrome de Werner; disostosis acrodental de Weyers; nevus despigmentado; síndrome de Williams-Beuren; tumor de Wilms (tipo 1 ); enfermedad de Wilson; síndrome de Wiskott-Aldrich ; síndrome de Wolcott-Rallison; síndrome de Wolfram; enfermedad de Wolman; xantinuria (tipo I); xeroderma pigmentoso; X-SCID; síndrome de hipopigmentación de sordera-ceguera Yemenite; hipercalcemia ipocalciúrica (tipo I); síndrome de Zellweger y síndrome de Zlotogora-Ogur.
Las enfermedades a ser tratadas en el contexto de la presente invención igualmente incluyen también enfermedades que tienen un antecedente genético heredado y las cuales son causadas típicamente por un solo defecto génico y se heredan de acuerdo con las leyes de Mendel se seleccionan de preferencia del grupo que consiste en enfermedades heredadas autosómicas-recesivas, tales como, por ej emplo, deficiencia de adenosina desaminasa, hipercolesterolemia familiar, síndrome de Canavan, enfermedad de Gaucher, anemia de Fanconi, lipofuscinosis ceroide neuronal, mucoviscidosis (fibrosis quística), anemia de células falciformes, fenilcetonuria, alcaptonuria, albinismo, hipotireosis, galactosemia, deficiencia de alfa- l -anti-tripsina, xeroderma pigmentoso, síndrome de Ribbing, mucopolisacaridosis, labio leporino, paladar hendido, síndrome de Laurence Moon Biedl Bardet, síndrome de polidactilia de costilla corta, cretinismo, síndrome de Joubert, progeria tipo II, braquidactilia, síndrome adrenogenital y enfermedades heredadas por cromosoma X, tales como, por ej emplo, ceguera de color, por ej emplo, ceguera a roj o/verde, síndrome X frágil, distrofia muscular (tipo Duchenne y Becker-Kiener), hemofilia A y B , deficiencia de G6PD, enfermedad de Fabry, mucopolisacaridosis, síndrome de Norrie, retinitis pigmentosa, granulomatosis séptica, X-SCID, deficiencia de ornitina transcarbamilasa, síndrome de Lesch-Nyhan, o de enfermedades heredadas dominantes autosómicas, tales como, por ejemplo, angioedema hereditario, síndrome de Marfan, neurofibromatosis, progeria tipo I, osteogénesis imperfecta, síndrome de Klippel-Trenaurnay, síndrome de Sturge-Weber, síndrome de Hippel-Lindau y esclerosis por tuberosis.
La presente invención también permite el tratamiento de enfermedades que no han sido heredadas o las cuales podrían no ser resumidas bajo las categorías anteriores. Estas enfermedades pueden incluir, por ejemplo, el tratamiento en pacientes que requieran de un factor de proteína específico, por ej emplo, una proteína terapéuticamente efectiva específica como la mencionada arriba. Esto puede, por ej emplo, incluir pacientes de diálisis, por ejemplo, pacientes que sufran una diálisis renal (regular), y los cuales puedan estar en necesidad de proteínas terapéuticamente activas específicas como las definidas aquí, por ej emplo, eritropoyetina (EPO), etc.
Igualmente, las enfermedades en el contexto de la presente invención pueden incluir enfermedades cardiovasculares seleccionadas de, sin estar limitadas a éstas, enfermedad cardiaca coronaria, arteriosclerosis, apoplexia e hipertensión, etc.
Finalmente, las enfermedades en el contexto de la presente invención se pueden seleccionar de enfermedades neuronales incluyendo por ejemplo enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica, distonía, epilepsia, esclerosis múltiple y mal de Parkinson, etc.
De acuerdo con otra modalidad, la presente invención está dirigida al segundo uso médico del complejo de carga portador polimérico de la invención como el definido aquí, para el tratamiento de enfermedades como las definidas aquí por medio de terapia génica .
En una modalidad preferida más, el complejo de carga portador polimérico de la invención puede usarse para la preparación de una composición farmacéutica, un agente inmunoestimulador, un adyuvante o una vacuna.
La composición farmacéutica de la invención, agente inmunoestimulador, adyuvante o vacuna puede además usarse para el tratamiento de una enfermedad o un trastorno como el definido aquí .
De acuerdo con una modalidad final, la presente invención también proporciona kits, particularmente kits de partes, que comprenden como componentes solos o en combinación con ingredientes adicionales al menos un complejo de carga portador polimérico de la invención como el definido aquí, por lo menos una composición farmacéutica, agente inmunoestimulador, adyuvante o vacuna que comprende los mismos y/o kits que comprenden los mismos, y opcionalmente instrucciones técnicas con información sobre la administración y dosis de la molécula portadora polimérica, el ácido nucleico, el complejo o portador polimérico de la invención y/o la composición farmacéutica de la invención. Estos kits, de preferencia kits de partes, pueden ser aplicados, por ej emplo, para cualquiera de las aplicaciones o usos mencionados arriba. Estos kits, cuando se presentan como un kit de partes, pueden contener además cada componente de la composición farmacéutica de la invención, agente inmunoestimulador, adyuvante o vacuna en una parte diferente del kit.
En la presente invención, si no se indica lo contrario, las diferentes características de alternativas y modalidades pueden combinarse unas con otras, cuando sea adecuado . Además, el término "que comprende" no se deberá considerar como significando "que consiste en", si no se menciona específicamente. Sin embargo, en el contexto de la presente invención, el término "que comprende" puede sustituirse con el término "que consiste en", cuando sea adecuado .
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las siguientes figuras intentan ilustrar más la invención. No se intenta que limiten la materia de la invención a las mismas.
La figura 1 muestra la expresión de luci ferasa en células HepG2 después de transfección con complejos de carga portadores poliméricos que comprenden 5 µg de ARNm que codifica para luciferasa (R 1 1 80). CRi2C/R1 1 80 indica el complej o de carga portador polimérico de la invención formado por el péptido catiónico entrelazado por disulfuro CR i 2C (Cys-Arg i 2-Cys) y el ARNm R 1 1 80 como carga de ácido nucleico. R] 2/R 1 1 80 indica un complejo de carga portador no inventivo formado por el péptido catiónico no polimerizado i2 (Argi 2) y el ARNm R 1 1 80 como carga de ácido nucleico para efectos de comparación.
Los complejos contienen péptido catiónico y ácido nucleico en una relación de masa a 1:2 (p/p) o 2:1 (p/p) como se indica.
R1180 Representa células que fueron transfectadas con ARN no complejado. Regulador de pH representa el control negativo para células no transfectadas.
Después de 24 horas se cuantificó el nivel de luciferasa en los lisados por medición por quimioluminiscencia de oxidación de luciferina.
Los puntos de datos indican réplicas biológicas individuales.
Los resultados muestran primero que nada que los complejos de carga portadores poliméricos de la invención (CRi2C/Rl 180) inducen niveles más altos de expresión de luciferasa que los complejos de carga portadores no inventivos (Ri2/R1180) con el péptido Ri2 no polimerizado. Y en segundo lugar se podría mostrar que relaciones N/P de más de 1 son adecuadas para transfección in vitro.
La figura 2 muestra la expresión de luciferasa (in vitro) en células HepG2 y B16F10 después de transfección con complejos de carga portadores poliméricos que comprenden 5 µg de ARNm que codifica para luciferasa (R1180). CRi2C/R1180 Indica el complejo de carga portador polimérico de la invención formado por el péptido catiónico entrelazado por disulfuro CRj2C (Cys-Argj2-Cys) y el ARNm R1180 como carga de ácido nucleico. Ri2/R1180 Indica un complejo de carga portador no inventivo formado por el péptido catiónico no polimerizador R12 (Argi2) y el ARNm R1180 como carga de ácido nucleico para efectos de comparación.
CR9C/RII8O Indica el complejo de carga portador polimérico de la invención formado por el péptido catiónico polimerizado CR9C (Cys-Argg-Cys) y el ARNm R1180 como carga de ácido nucleico.
Los complejos contienen un péptido catiónico y ácido nucleico en una relación másica a 2:1 (p/p).
R1180 Representa células que fueron transfectadas con ARN no complejado.
Regulador de pH representa el control negativo para células no transfectadas.
Después de 24 horas se cuantificó el nivel de luciferasa en los lisados por medición de quimioluminiscencia de oxidación de luciferina.
Los puntos de datos indican réplicas biológicas individuales. Los resultados muestran que los complejos de carga portadores poliméricos de la invención (CR12C/R1180 y CR9/CRII8O) inducen niveles más altos de expresión de luciferasa que los complejos de carga portadores no de la invención (R12/R1180 y R9/II8O) con los péptidos no polimerizados R9 y R12.
La figura 3 muestra la expresión in vivo de luciferasa después de inyección intradérmica en ratones BALB/c hembra de 5 µg de ARNm que codifica para luciferasa (R1180). CR12C/RII8O Indica el complejo de carga portador polimérico de la invención formado por el péptido catiónico entrelazado por disulfuro CR12C (Cys-Argi2-Cys) y el ARNm R1180 como carga de ácido nucleico. R12/R1180 Indica un complejo de carga portador no inventivo formado por el péptido catiónico no polimerizador R 1 2 (Argi 2) y el ARNm R 1 1 80 como carga de ácido nucleico para efectos de comparación. CR9C/R I I 8 O Indica el complej o de carga portador polimérico de la invención formado por el péptido catiónico polimerizado CR9C (Cys-Arg9-Cys) y el ARNm R1 1 80 como carga de ácido nucleico.
Los complejos contienen un péptido catiónico y ácido nucleico en una relación de 2 : 1 (p/p) como se indica.
Después de 24 horas el nivel de luciferasa se cuantificó en los Usados de tejido por un ensayo de quimioluminiscencia.
Los resultados muestran primero que nada que los complej os de carga portadores poliméricos de la invención (CR] C/R 1 1 80) inducen niveles más altos de expresión de luciferasa que los complej os de carga portadores no inventivos (Ri 2/R 1 180) con el péptido R 1 2 no polimerizado (de hecho no pudo detectarse expresión de luciferasa en la muestra con el péptido no polimerizado R12). Y en segundo lugar se podría mostrar que relaciones N/P de más de 1 son adecuadas para trans fección in vitro.
La figura 4 muestra la curva de correlación en bruto para los complejos de carga poliméricos portadores de la invención formados por los péptidos catiónicos entrelazados por disulfuro CR 1 2 C y CR7C como portador para liofilización en comparación con los complejos no de la invención con péptidos catiónicos no polimerizadores como portadores (Ri 2 y R7) mediante dispersión de luz dinámica usando Zetasizer Nano (Malvern Instruments, Malvern, RU). Los diámetros hidrodinámicos fueron medidos con complejos recién preparados y con complejos reconstituidos después de liofilización. La relación másica de péptido :ARN fue 1 :2. Como resultado se puede mostrar que los complejos de carga portadores poliméricos de la invención que comprenden péptidos que contienen cisteína como componentes catiónicos que llevan a una polimerización del portador polimérico por enlaces de disulfuro no cambian en tamaño en contraste por los complejos formados por péptidos no polimerizadores con incremento en tamaño y por lo tanto no son estables durante la etapa de liofilización. Por lo tanto los complejos con péptidos polimerizados como portadores poliméricos muestran propiedades adecuadas para liofilización.
La figura 5 muestra el potencial Zeta de complej os de carga portadores poliméricos de la invención formados por el péptido catiónico entrelazado por disulfuro CRi 2C y R722 como carga de ácido nucleico a diferentes relaciones p/p de acuerdo con la invención. Como se puede ver, el potencial zeta cambia de positivo a negativo cuando la relación p/p cambia de exceso de péptido a una relación 1 : 1 (péptido/ARN).
La figura 6A muestra la secreción de citocina hlFNa (in vitro) en hPBMCs después de estimulación con complej os de carga portadores poliméricos formados por el péptido catiónico entrelazado por disulfuro CR] 2C y el CpG 221 6 como carga de ácido nucleico en una relación de masa de 1 :2.5 (p/p C/CpG 22 16) de acuerdo con la invención. Como puede verse, los complejos de carga portadores poliméricos de la invención llevaron a un incremento de liberación de citocina hlFNa en hPBMCs en comparación con la carga de ácido nucleico sola o el péptido catiónico solo.
La figura 6B muestra la secreción de citocina hTNFa (in vitro) en hPBMCs después de estimulación con complejos de carga portadores polimé ricos formados por el péptido catiónico entrelazado por disulfuro CRi2C y el CpG 221 6 como carga de ácido nucleico en una relación de masa de 1 : 2.5 (p/p) (CRi 2C/CpG 2216) de acuerdo con l a invención. Como se puede ver, los complejos de carga portadores poliméricos de la invención no llevaron a un incremento en liberación de citocina hTNFa en hPBMCs en comparación con la carga de ácido nucleico sola o el péptido catiónico solo .
La figura 7A muestra la secreción de citocina hlFNa (in vitro) en hPBMCs después de estimulación con complejos de carga portadores poliméricos formados por el péptido catiónico entrelazado por disulfuro CRj 2 y el ARNm R491 que codifica para luciferasa como carga de ácido nucleico en una relación de masa de 1 :2 (p/p) (CRi2C/R49 1 ) de acuerdo con la invención. Como se puede ver, los complejos de carga portadores poliméricos de la invención llevaron a un incremento en la liberación de citocina hlFNa en hPBMCs en comparación con la carga de ácido nucleico sola o el péptido catiónico solo.
La figura 7B muestra la secreción de citocina hTNFa (in vitro) en hPBMCs después de estimulación con complej os de carga portadores poliméricos formados por el péptido catiónico entrelazado por disulfuro CR1 2 y el ARNm R491 que codifica para luciferasa como carga de ácido nucleico en una relación de masa de 1 :2 (p/p) (CRi2C/R491 ) de acuerdo con la invención. Como puede verse, los complejos de carga portadores poliméricos de la invención llevaron a un incremento de liberación de citocina hTNFa en hPBMCs en comparación con la carga de ácido nucleico sola o el péptido catiónico solo.
La figura 8A muestra la secreción de la citocina hlFNa (in vitro) en hPBMCs después de estimulación con complejos de carga portadores poliméricos formados por el péptido catiónico entrelazado por disulfuro CRi2C y un oligonucleótido de ARN rico en GU corto (rico en GU corto) como carga de ácido nucleico en una relación de masa de 1 :2.5 (p/p) (CR] 2C/rico en GU corto) de acuerdo con la invención. Como puede verse, los complejos de carga portadores poliméricos de la invención llevaron a un incremento en la liberación de citocinas hlFNa en hPBMCs en comparación con la carga de ácido nucleico sola o el péptido catiónico solo .
La figura 8B muestra la secreción de ci tocina hTNFa (in vitro) en hPBMCs después de estimulación con complejos de carga portadores poliméricos formados por el péptido catiónico entrelazado por disulfuro CRi2C y un oligonucleótido de ARN rico en GU corto (rico en GU corto) como carga de ácido nucleico en una relación de masa de 1 : 2.5 (p/p) (CRi 2C/rico en GU corto) de acuerdo con la invención. Como puede verse, los complej os de carga portadores poliméricos de la invención llevaron a un incremento de liberación de citocina hTNFa en hPBMCs en comparación con la carga de ácido nucleico sola o el péptido catiónico solo.
La figura 9A muestra la secreción de citocina hlFNa (in vitro) en hPBMCs después de estimulación con complej os de carga portadores poliméricos formados por el péptido catiónico entrelazado por disulfuro CR7C y el ARNsi R722 rico en GU de no codificación largo como carga de ácido nucleico de acuerdo con la invención. Como puede verse, los complej os de carga portadores poliméricos de l a invención (CR7C/R722) llevaron a un incremento de liberación de citocina hlFNa en hPBMCs en comparación con complejos de carga portadores no de la invención (R7/R722) formados por el péptido no polimerizado R7.
La figura 9B muestra la secreción de citocina hTNFa (in vitro) en hPBMCs después de estimulación con complej os de carga portadores poliméricos formados por el péptido catiónico entrelazado por disulfuro CR7C y el ARNsi R722 rico en GU de no codificación largo como carga de ácido nucleico de acuerdo con la invención. Como puede verse, los complejos de carga portadores poliméricos de la i nvención (CR7C/R722) sólo llevaron a un incremento débil de liberación de citocina hTNFa en hPBMCs en comparación con complejos de carga portadores no de la invención (R7/R722) formados por el péptido no polimerizado R7.
La figura 10A muestra la secreción de citocina hlFNa (in vitro) en hPBMCs después de estimulación con complej os de carga portadores poliméricos formados por el péptido catiónico entrelazado por disulfuro CR9C y el ARNsi R722 rico en GU de no codificación largo como carga de ácido nucleico de acuerdo con la invención. Como se puede ver, los complej os de carga portadores poliméricos de la invención (CR.9C/R722) llevaron a un incremento de la liberación de citocina hlFNa en hPBMCs en comparación con complejos de carga portadores no inventivos (R9/R.722) formados por el péptido no polimerizado R9.
La figura 10B muestra la secreción de citocina hTNFa {in vitro) en hPBMCs después de estimulación con complej os de carga portadores poliméricos formados por el péptido catiónico entrelazado por disulfuro CR9C y el ARNsi R722 rico en GU de no codificación largo como carga de ácido nucleico de acuerdo con la invención. Como puede verse, los complejos de carga portadores poliméricos de la invención (R9C/R722) no llevan a un incremento de la liberación de citocina hTNFa en hPBMCs en comparación con los complej os de carga portadores no de la invención (R9/R722) formados por el péptido no polimerizado R9.
La figura 1 1 A muestra la secreción de citocina hlFNa {in vitro) en hPBMCs después de estimulación con complejos de carga portadores poliméricos formados por el péptido catiónico entrelazado por disulfuro CR] 2C y el ARNsi R722 como carga de ácido nucleico a diferentes relaciones p/p de acuerdo con la invención. Como se puede ver, los complejos de carga portadores poliméricos de la invención llevaron a un incremento en la liberación de citocina hlFNa en hPBMCs en comparación con la carga de ácido nucleico sola o el péptido catiónico solo .
La figura 1 1 B muestra la secreción de citocina hlFNa {in vitro) en hPBMCs después de estimulación con complej os de carga portadores poliméricos formados por el péptido catiónico entrelazado por disulfuro CR 12C y el ARNsi R722 como carga de ácido nucleico a diferentes rel aciones p/p de acuerdo con la invención. Como se puede ver, los complej os de carga portadores poliméricos de la invención llevaron a un incremento en la liberación de citocina hlFNa en hPBMCs en comparación con la carga de ácido nucleico sola o el péptido catiónico solo .
La figura 12A muestra la secreción de citocina hlFNa (in vitro) en hPBMCs después de estimulación con complej os de carga portadores poliméricos formados por el péptido catiónico entrelazado por disulfuro CH6R4H6C, CH3R4H3C y CHK7HC y el ARNsi R722 como carga de ácido nucleico a diferentes relaciones N/P de acuerdo con la invención. Como se puede ver, los complejos de carga portadores poliméricos de la invención llevaron a un incremento en la liberación de citocina hlFNa en hPBMCs en comparación con la carga de ácido nucleico sola o el péptido catiónico solo.
La figura 12B muestra la secreción de citocina hlFNa (in vitro) en hPBMCs después de estimulación con complej os de carga portadores poliméricos formados por el péptido catiónico entrelazado por disulfuro CH6R4H6C, CH3R4H3C y CHK7HC y el ARNsi R722 como carga de ácido nucleico a diferentes relaciones N/P de acuerdo con la invención. Como se puede ver, los complejos de carga portadores poliméricos de la invención llevaron a un incremento en la liberación de citocina hlFNa en hPBMCs en comparación con la carga de ácido nucleico sola o el péptido catiónico solo .
Particularmente complej os de carga poliméricos de la invención con una relación N/P más grande o igual que 1 resultan en secreción de TNFalfa.
La figura 13 muestra el efecto (in vivo) de la adición del complejo de carga portador polimérico de la invención formado por el péptido catiónico entrelazado por disulfuro CRi 2C como portador y el ARNsi R722 como carga de ácido nucleico a la vacuna de proteína ovalbúmina (proteína OVA) para usarse como un adyuvante en experimentos de reto de tumor. Como se puede ver, el complejo de carga portador polimérico de la invención desacelera extremadamente el crecimiento de tumor en comparación con la vacuna de proteína sola, que no tiene efecto en el crecimiento de tumor en comparación con el control de regulador de pH.
La figura 14 muestra el efecto (in vivo) de la adición del complej o de carga portador polimérico de la invención formado por el péptido catiónico entrelazado por disulfuro CRi2C como portador y el ARNsi R722 como carga de ácido nucleico a la vacuna de proteína ovalbúmina (proteína OVA) para usarse como un adyuvante en la inducción de anticuerpos IgG2a específicos de ovalbúmina. Como se puede ver, el complej o de carga portador polimérico de la invención incrementa fuertemente la respuesta de células B, lo cual prueba las propiedades adyuvantes benéficas de los complejos de carga portadores poliméricos de la invención, particularmente con respecto a la inducción de una respuesta inmune desplazada por Thl . figura 1 5 muestra el efecto (in vivo) de la adición del complej o de carga portador polimérico de la invención formado por el péptido catiónico entrelazado por disulfuro CR 12C como portador y el ARNsi R722 como carga de ácido nucleico a la vacuna de proteína ovalbúmina (proteína OVA) o la vacuna de péptido específico de ovalbúmina SIINFEKL para usarse como un adyuvante en la inducción de células T citotóxicas específicas de ovalbúmina. Como se puede ver, el complejo de carga portador polimérico de la invención incrementa fuertemente la inducción de células T citotóxicas específicas de ovalbúmina, lo cual prueba las propiedades adyuvantes benéficas de los complej os de carga portadores poliméricos de la invención, particularmente con respecto a la inducción de una respuesta inmune desplazada por Th l .
EJEMPLOS Los siguientes ej emplos intentan ilustrar más la invención. No se intenta que limiten la materia de la invención a los mismos. 1. Reactivos : Péptidos catiónicos como componente catiónico : R7: Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg (Arg7) CR7C : Cys-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Cys (CysArg7Cys) R9: Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg (Arg9) R1 2 : Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg (Argi 2) CR9C : Cys-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Cys (Cys-Arg9-Cys) CR] 2C : Cys-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg- Arg-Arg (Cys-Arg1 2-Cys) Ácidos nucleicos como carga: R 1 180 : ARNm que codifica para luciferasa (SEQ ID NO: 384) R722 : ARN rico en isGU de no codificación largo (SEQ ID NO: 385) R491 : ARNm que codifica para luciferasa (SEQ ID NO: 386) CpG 221 6 : oligonucleótido CpG (SEQ ID NO : 387) Rico en GU corto : oligonucleótido de ARN rico en GU (SEQ ID NO : 369). 2. Preparación de secuencias de ácido nucleico : Para los presentes ejemplos se prepararon secuencias de ácido nucleico como se indicó en el ej emplo 1 y se usaron para la formación de los complejos de carga portadores poliméricos polimerizados de la invención o para complejos de carga portadores no polimerizados para comparación. Estos complejos de carga portadores poliméricos se usaron para transacción in vitro e in vivo, para inmunoestimulación in vitro y para caracterizaciones de partículas.
De acuerdo con una primera preparación, las secuencias de ADN que codifican para las secuencias de ADN R l 1 80, R722 y R491 fueron preparadas. Las secuencias de las moléculas de ARN correspondientes se muestran en el listado de secuencias (SEQ ID NOS : 384, 385 y 386).
Las secuencias ricas en GU cortas y los oligonucleótidos CpG 22 16 se prepararon mediante síntesis en fase sólida automática por medio de química de fosforamidita. Las secuencias se muestra en el listado de secuencias (SEQ ID NOS : 387 y 369). 2. Transcripción in vitro: Los plásmidos de ADN respectivos preparados de acuerdo con el ej emplo 2 para R 1 1 80, R722 y R91 fueron transcritos in vitro usando T7-pol imerasa (T7-Opti ARNm kit, CureVac, Tübingen, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante. Posteriormente el ARNm se purificó usando PureMessenger® (CureVac, Tübingen, Alemania). 3. Síntesis de complejos de carga portadores poliméricos Las secuencias de ácido nucleico definidas arriba en el ej emplo 1 se mezclaron con los componentes catiónicos como los definidos en el ejemplo 1 . Por lo tanto, la cantidad indicada de secuencia de ácido nucleico se mezcló con el componente catiónico respectivo en relaciones de masa como se indican, formando así un complejo. Si se usaban componentes catiónicos de polimerización de acuerdo con la presente invención, la polimerización de los componentes catiónicos tuvo lugar simultáneamente la complej ación de la carga de ácido nucleico . Posteriormente la solución resultante se ajustó con agua a un volumen final de 50 µ? y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las diferentes relaciones de componente catiónico/ácido nucleico usadas en los experimentos se muestran en la tabla 1 .
Tabla 1 Relación N/P = Es una medida de la carga iónica del componente catiónico del portador polimérico o del portador polimérico como tal . En caso de que las propiedades cati ónicas del componente catiónico se proporcionen por átomos de nitrógeno, la relación N/P es la relación de átomos de nitrógeno básicos a residuo de fosfato, considerando que los átomos de nitrógeno confieren a cargas positivas y fosfato del esqueleto de fosfato del ácido nucleico confiere a la carga negativa.
N/P S e calcula de preferencia por la siguiente fórmula: N/P = pmol [ARN] * relación*catiónico AS µg ARN*3 * 1000 Como un ej emplo el ARN R722 de acuerdo con SEQ ID NO : 385 fue aplicado, el cual tiene un peso molecular de 1 86 kDa. Por lo tanto 1 µg de ARN R722 confiere a 5.38 pmol de ARN. 4. Transfeccion de células HepG2 y B16F10 ; Se prepararon complejos de carga portadores poliméricos que contenían 5 pg de ARN que codificaba para luciferasa (R 1 1 80) como se indica en el ej emplo 3. Células HepG2 o B 16F 10 ( 1 50x l 03/pocillo) fueron sembradas 1 día antes de la transfeccion en placas de microtitulación de 24 pocilios llevando a una confluencia del 70% cuando se llevó a cabo la transfeccion. Para la transfeccion, 50 µ? de la solución de complejo de carga portador polimérico se mezclaron con 250 µ? de medio libre de suero y se añadieron a las células (concentración final de ARN: 13 g/ml). Antes de la adición de la solución de transfección libre de suero las células fueron lavadas suavemente y cuidadosamente 2 veces con 1 mi de Optimen (Invitrogen) por pocilio. Luego, se añadió la solución de transfección (300 µ? por pocilio) a las células y las células se incubaron durante 4 horas a 37°C. Posteriormente se añadieron 100 µ? de medio RPMI (Camprex) que contenía 1 0% de FCS por pocilio y las células se incubaron durante 20 horas más a 37°C. La solución de transfección fue succionada 24 horas después de la transfección y las células se lisaron en 300 µ? de regulador de pH de lisis (25 mM de Tris-P04, 2 mM de EDTA, 10% de glicerol, 1 % de Triton-X 1 00, 2 mM de DTT). Los sobrenadantes fueron luego mezclados con regulador de pH de luciferina (25 mM de glicilglicina, 1 5 mM de MgS04, 5 mM de ATP, 62.5 µ? de luciferina) y se detectó la luminiscencia usando un luminómetro (Lumat LB 9507 (Berthold Technologies, B ad Wildbad, Alemania). 5. Expresión de luciferasa in vivo: Complejos de carga portadores poliméri cos que contenían 5 ig de ARNm que codificaba para luciferasa (R 1 180) fueron preparados como se indicó en el ejemplo 3. Posteriormente la solución resultante se ajustó con solución de lactato de Ringer hasta un volumen final de 1 00 µ? y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente, produciendo una solución con una concentración de 0. 1 g/1 de complejos de carga portadores poliméricos. Se administraron intradérmicamente 100 µ? de esta solución (en la espalda) de ratones BALB/c de 7 semanas de edad. Después dé 24 horas los ratones fueron sacrificados y las muestras (piel de la espalda) fueron recuperadas, congeladas a -78 °C y Usadas durante 3 minutos a velocidad completa en un lisador de tejido (Qiagen, Hilden, Alemania). Posteriormente se añadieron 600 µ? de regulador de pH de lisis y las soluciones resultantes se sometieron otros 6 minutos a velocidad completa en el lisador de tejidos. Después de 10 minutos de centrifugación a 1 3 ,500 rpm a 4°C los sobrenadantes se mezclaron con regulador de pH de luciferina (25 mM de glicilglicina, 1 5 mM de MgS04, 5 mM de ATP, 62.5 µ? de luciferina) y la luminiscencia se detectó usando un luminómetro (Lumat LB 9507 (Berthold Technologies, Bad Wilbbad, Alemania)) . 6. Estimulación de citocinas en hPBMCs : Células HPBMC de sangre periférica de donadores sanos se aislaron usando un gradiente Ficoll y se lavaron posteriormente con 1 (PB S (solución salina de pH regulado con fosfato). Las células se sembraron después en placas de microtitulación de 96 pocilios (200x 1 03/pocillo). Las células hPBMC fueron incubadas durante 24 horas con 1 0 µ? del complejo de carga portador polimérico de la invención del ej emplo 3 que contenía la cantidad indicada de ácido nucleico en medio X-VIVO 1 5 Médium (BioWhittaker). El efecto inmunoestimulador se midió al detectar la producción de citocinas de las hPBMCs (factor de necrosis tumoral alfa e interferón alfa) . Por lo tanto, las placas de microtitulación de ELISA (Nunc Maxisorb) se incubaron durante la noche (o/n) con regulador de pH de unión (0.02% de NaN3 , 15 mM de Na2C03 , 1 5 mM de NaHC03 , pH 9.7), que contenía además un anticuerpo de citocina específico . Las células se bloquearon después con l xPBS , que contenía 1 % de BSA (albúmina de suero bovino). El sobrenadante celular se añadió y se incubó durante 4 horas a 37°C . Posteriormente la placa de microtitulación se lavó con l xPBS, que contenía 0.05% de Tween-20 y luego se incubó con un anticuerpo secundario marcado con biotina (BD Pharmingen, Heidelberg, Alemania). Se añadió peroxidasa de rábano acoplada a estreptavidina a la placa. Luego, la placa se lavó de nuevo con l xPBS, que contenía 0.05% de Tween-20 y ABTS (ácido 2,2 ' -azino-bis(3 -etil-benztiazolin-6-sulfóni co) fue añadido como un substrato. La cantidad de citocina se determinó al medir la absorción a 405 nm (OD 405) usando una curva estándar con citocinas recombinantes (BD Pharmingen, Heidelberg, Alemania) con el lector de ELISA Sunrise de Tecan (Crailsheim, Alemania). 7. Mediciones de potencial zeta: El potencial zeta de los complejos de carga portadores poliméricos se evaluó por el método de electroforesis con láser Doppler usando un Zetasizer Nano (Malvern Instruments, Malvern, RU). La medición se llevó a cabo a 25 °C y se usó un ángulo de dispersión de 1 73 °. 8. Estabilidad de complejos después de liofilización: Los diámetros hidrodinámicos de complejos de carga portadores poliméricos preparados arriba se midieron mediante dispersión de luz dinámica usando un Zetasizer Nano (Malvern Instruments, Malvern, RU) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las mediciones se llevaron a cabo a 25°C en regulador de pH analizado por un método acumulativo para obtener los diámetros hidrodinámicos e índices de polidispersión de los complejos de carga portadores poliméricos. Los complejos de carga portadores poliméricos se formaron como se indicó en el ej emplo 3 y los diámetros hidrodinámicos se midieron con complejos recién preparados y con complejos reconstituidos después de liofilización. 9. Experimentos de inmunización: Para la inmunización las vacunas proteína ovalbúmina (OVA) (5 µg) o péptido específico de ovalbúmina SIINFEKL (50 g) se combinaron con los complejos de carga poliméricos de la invención R722/CR1 2C (a una relación de 2 : 1 p/p) (30 µg R722/ 1 5 µg CR, 2C). Como adyuvante y se inyectaron intradérmicamente en ratones C57BL/6 hembra (7 ratones por grupo para reto de tumor y 5 ratones por grupo para detección de una respuesta inmune). La vacunación se repitió 2 veces en 2 semanas. Para comparación los ratones fueron inyectados sin los complejos de carga portadores poliméricos de la invención. 10. Detección de una respuesta inmune específica de antígeno (respuesta inmune de células B): La detección de una respuesta inmune específica de antígenos (respuesta inmune de células B) se llevó a cabo al detectar anticuerpos específicos de antígenos. Por lo tanto, se tomaron muestras de sangre de ratones vacunados 5 días después de la última vacunación y se prepararon los sueros. Placas MaxiSorb (Nalgene Nunc International) se recubrieron con proteína de ovalbúmina de Gallus gallus. Después de bloquear con l xPBS que contenía 0.05% de T een-20 y 1 % de BSA, las placas se incubaron con suero de ratón diluido. Posteriormente se añadió un anticuerpo secundario acoplado a biotina (anti-mouse-IgG2a Pharmingen). Después de lavar, la placa se incubó con peroxidasa de rábano-estreptavidina y posteriormente se midió la conversión del substrato de ABTS (ácido 2,2 ' -azino-bis(3 -etil-benztriazolin-6-sulfónico). 11. Detección de una respuesta inmune celular específica de antígeno por ELISPOT : 5 Días después de la última vacunación los ratones fueron sacrificados, los bazos se removieron y los esplenocitos se aislaron. Para la detección de INFgamma una placa de recubrimiento de varias pantallas (Millipore) se incubó durante la noche con regulador de pH de recubrimiento (regulador de pH de carbonato-bicarbonato 0.1 M pH 9.6, 1 0.59 g/1 de Na2C03, 8.4 g/1 de NaHC03) que comprendía anticuerpo contra INFy (BD Pharmingen, Heidelberg, Alemania). Al día siguiente, se añadieron 1 x 106 célula/pocilio y se volvieron a estimular con 1 µg/pocillo de péptido relevante (SIINFEKL de ovalbúmina); péptido irrelevante (conexina = péptido de control) o regulador de pH sin péptido. Posteriormente las células se incubaron durante 24 horas a 37°C . Al día siguiente las placas se lavaron 3 veces con PBS, una vez con agua y una vez con PB S/0.05% de Tween-20 y posteriormente se incubaron con un anticuerpo secundario acoplado a biotina durante 1 1 -24 horas a 4°C. Después las placas se lavaron con PBS/0.05% de Tween-20 y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente con fosfatasa alcalina acoplada a estreptavidina en regulador de pH de bloqueo. Después de lavar con PB S/0.05 % de Tween-20, el substrato (sistema de substrato líquido de fosfato de 5 -bromo-4-cloro-3 -indolilo/azul de nitro tetrazolio de Sigma Aldrich, Taufkirchen, Alemania) se añadió a la placa y la conversión del substrato pudo detectarse visualmente. La reacción se detuvo después al lavar las placas con agua. Las placas secas fueron luego leídas por un lector de placa ELISPOT. Para visualización de los niveles de puntos los números se corrigieron por sustracción de fondo. 12. Ataq ue con tumor: Una semana después de la última vacunación l x l O6 células E.G7-OVA (células tumorales que expresan establemente ovalbúmina) se implantaron subcutáneamente en los ratones vacunados. El crecimiento de tumor se monitoreó al medir el tamaño de tumor en 3 dimensiones usando un calibre.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1 . Un complejo de carga portador polimérico, caracterizado porque comprende: a) como un portador, un portador polimérico formado por componentes catiónicos entrelazados por disulfuro, y b) como una carga, por lo menos una molécula de ácido nucleico, para usarse como un agente inmunoestimulador o un adyuvante.
2. El complejo de carga portador polimérico para usarse como un agente inmunoestimulador o un adyuvante de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque la por lo menos una molécula de ácido nucleico es un ARN.
3. El complejo de carga portador polimérico para usarse como un agente inmunoestimulador o un adyuvante de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque la por lo menos una molécula de ácido nucleico es un ácido nucleico inmunoestimulador.
4. El complejo de carga portador polim érico para usarse como un agente inmunoestimulador o un adyuvante de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 3 , caracterizado porque la por lo menos una molécula de ácido nucleico es un ARN inmunoestimulador (ARNsi) o un ARNm.
5. El complejo de carga portador polimérico para usarse como un agente inmunoestimulador o un adyuvante de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la relación nitrógeno/fosfato (N/P) de los componentes catiónicos a la por lo menos una molécula de ácido nucleico está en el intervalo de 0. 1 -20, o en el intervalo de 0. 1 -5, o en el intervalo de 0. 1 - 1 .
6. El complejo de carga portador polimérico para usarse como un agente inmunoestimulador o un adyuvante de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el portador polimérico comprende péptidos o proteínas funcionales además de los componentes catiónicos.
7. El complejo de carga portador polimérico para usarse como un agente inmunoestimulador o un adyuvante de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque los péptidos o proteínas funcionales son antígenos de péptidos o proteínas o epítopos antigénicos.
8. El complejo de carga portador polimérico para usarse como un agente inmunoestimulador o un adyuvante de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el portador polimérico comprende además un ligando.
9. El complejo de carga portador polimérico para usarse como un agente inmunoestimulador o un adyuvante de conformidad con la reivindicación 8 , caracterizado porque el ligando es mañosa.
10. El complejo de carga portador polimérico para usarse como un agente inmunoestimulador o un adyuvante de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque los componentes catiónicos son péptidos catiónicos.
1 1 . El complej o de carga portador polimérico para usarse como un agente inmunoestimulador o un adyuvante de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque los péptidos catiónicos se seleccionan de péptidos de acuerdo con la fórmula (I) (Arg)i;(Lys)m;(His)n;(Orn)0;(Xaa)x, en donde l + m + n + o + x = 3 - 100, y 1, m, n u o = independientemente unos de otros cualquier número seleccionado de 0, 1 , 2, 3 , 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 1 2, 1 3 , 14, 1 5 , 16, 17, 18, 19, 20, 21-30, 31-40, 41-50, 51-60, 61-70, 71-80, 81-90 y 91-100, siempre que el contenido total de Arg, Lys, His y Orn represente al menos 10% de todos los aminoácidos del péptido catiónico; y Xaa es cualquier aminoácido seleccionado de aminoácidos nativos (= origen natural) o no nativos excepto de Arg, Lys, His u Orn; y x = cualquier número seleccionado de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21-30, 31-40, 41-50, 51-60, 61-70, 71-80, 81-90, siempre y cuando el contenido total de Xaa no exceda 90% de todos los aminoácidos del péptido catiónico, o se seleccionan de péptidos de acuerdo con la subfórmula (la) {(Arg)1;(Lys)m;(His)n;(Orn)0;(Xaa')x (Cys)y} o de péptidos de acuerdo con la subfórmula (Ib) Cysj {(Arg)i;(Lys)m;(His)n;(Orn)0;(Xaa)x} Cys2 en donde (Arg)i; (Lys)m; (His)n; (Orn)0; y x son como se definió arriba; Xaa' es cualquier aminoácido seleccionado de aminoácidos nativos (= origen natural) o no nativos excepto por Arg, Lys, His, Orn; o Cys y y es cualquier número seleccionado de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21-30, 31-40, 41-50, 51-60, 61-70, 71-80 y 81-90, siempre y cuando el contenido total de Arg (Arginina), Lys (Lisina), His (Histidina) y Orn (Ornitina) represente al menos 10% de todos los aminoácidos del oligopéptido y en donde Cys\ y Cys2 son cisteínas cerca de, o terminales a (Arg)i;(Lys)m;(His)n;(Orn)0;(Xaa)x.
12. El complejo de carga portador polimérico para usarse como un agente inmunoestimulador o un adyuvante de conformidad con una de las reivindicaciones 10 a 11, caracterizado porque los enlaces de disulfuro se forman por residuos de cisteína contenidos en los péptidos catiónicos.
13. El complejo de carga portador polimérico para usarse como un agente inmunoestimulador o un adyuvante de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el residuo de cisteína se ubica cerca de, de preferencia en los extremos terminales de los péptidos catiónicos.
14. Un complejo de carga portador polimérico para usarse como un agente inmunoestimulador o un adyuvante de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque comprende: a. como un portador, un portador polimérico formado por polímeros catiónicos entrelazados por disulfuro, y b. como una carga, al menos una molécula de ácido nucleico, en el tratamiento o profilaxis de una enfermedad seleccionada de un tumor o una enfermedad cancerosa, una enfermedad cardiovascular, una enfermedad infecciosa, una enfermedad autoinmune o una alergia, o para usarse como un agente inmunoestimulador o adyuvante en el tratamiento o profilaxis de una enfermedad seleccionada de un tumor o una enfermedad cancerosa, una enfermedad cardiovascular, una enfermedad infecciosa, una enfermedad autoinmune o una alergia. 1 5. Una vacuna caracterizada porque comprende el complejo de carga portador polimérico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 1 3 y un antígeno .
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