KR20110050531A - 백신 - Google Patents

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랄프 레온 비만스
압델라티프 에로우아하비
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글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이.
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Abstract

본 발명은, 하나 이상의 항원 전달 입자 및 하나 이상의 항원을 포함하는 면역원성 조성물로서, 상기 항원 및 항원 전달 입자가 중간 링커를 사용하여 연결된 면역원성 조성물에 관한 것이다.

Description

백신{Vaccine}
본 발명은 중간 링커를 사용하여 항원에 연결된 미립자 항원 전달 시스템을 포함하는 백신 및 면역원성 조성물에 관한 것이다.
면역원성이 개선된 신규 조성물 또는 백신이 항상 요구되고 있다. 하나의 전략으로서 보조제를 사용하여 임의의 소정의 항원에 대해 유도된 면역 반응을 시도하고 개선시켜왔다.
WO05/014110는 a) 리포좀 및 b) 하나 이상의 A형 CpG를 포함하는 조성물을 기재하고 있고, 여기서, A형 CpG는 리포좀에 결합되거나 이에 포집되어 있다. 문헌[참조: Shahum & Therin [Immunology (1988) 65:315-317]]은 유리된 상태로 리포좀내에 캅셀화되어 있거나 헤테로-이작용성 시약 N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)-프로피오네이트(SPDP)를 사용하여 리포좀 표면에 공유적으로 연결된 소 혈청 알부민을 포함하는 조성물을 기재하고 있다. 상기 통상적인 접합(conjugation) 방법을 사용하여 항원은 제형화 초기 단계에서 직접 공유적으로 리포좀에 접착된다. 상기 접착은 효소적으로 또는 화학적으로 분해되지 않는 다면 가역적이지 않다. 한편, 캅셀화 방법은 항원의 변성 및/또는 분해의 위험성과 관련되어 있다.
또 다른 방법은 정전기 상호작용을 통해 이온 하전된 리포좀으로 항원을 결합시키는 것으로 이루어진다. HSV 항원 gB는 양이온성 지질 DOTAP와 복합체화되었고 백신접종된 마우스에서 면역 반응, 특히 CTL 반응(문헌참조: Walker et al. 1992- PNAS, 89: 7915-7918)을 유도하는데 성공적으로 사용되었다. 양이온성 지질 DC-콜과 조합된 HBsAg는 B형 간염 백신에 대한 마우스의 무응답성을 극복할 수 있는 개선되고 균형잡힌 면역성을 생성하였다(문헌참조: Brunei at al. 1999.Vaccine 17: 2192-2203).
적합한 면역반응을 제공하는 개선된 백신 및 면역원성 조성물이 여전히 요구되고 있다.
발명의 내용
본 발명은 항원 및 입자가 중간 링커를 사용하여 연결되어 있는 미립자 항원 전달 시스템 및 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물이, 입자 및 항원이 중간 링커를 사용하여 연결되어 있지 않은 조성물에 비해 개선된 면역 반응인 면역 반응을 유도함을 입증하였다. 특히, 본 발명의 면역원성 조성물은 개선된 CD8+ T-세포 면역 반응을 유도한다.
본 발명의 특정 양태는 항원 및 항원 전달 입자가 중간 링커를 사용하여 연결된 하나 이상의 항원 전달 입자 및 하나 이상의 항원을 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.
특히, 본 발명의 하나의 양태에서, 링커가 서로 상보적인 2개 이상의 성분을 포함하고, 상기 링커 성분중 하나가 항원 전달 입자에 연결되어 있고 상보적 링커 성분이 항원에 연결되어 있고; 항원 전달 입자 및 항원이 이어서 이들이 접착된 상보적 성분의 하이브리드화 및/또는 결합을 통해 연결된 면역원성 조성물이 제공된다.
발명의 하나의 양태에서, 링커는 상보적 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드로 구성된다. 올리고뉴클레오타이드 매개 접착은 상기 올리고뉴클레오타이드의 길이 및 서열을 다양화하여 강도가 조정될 수 있는 가역적 접착을 가능하게 한다. 이어서 이것은 항원이 세포에 의해 취득된 후 방출될 수 있도록 한다. 더욱이, 상기 항원은 항원이 B 세포에 의해 인지될 수 있도록 하는 임의의 길이를 갖는 링커와 함께 항원 전달 입자의 표면에 위치한다.
본 발명은 또한 미립자 항원 전달 시스템 및 항원이 팩키징 및 수송동안에 별개로 유지될 수 있고, 예를 들어, 이들이 적당한 시점(능히 투여 직전)에서 조합될 수 있도록 하는 2개 바이알(vial) 개념을 허용한다. 본 발명은 추가로 목적하는 임의의 항원과 조합될 수 있는 포괄적 미립자 항원 전달 시스템에 대한 개념을 허용한다. 더욱이, 미립자 항원 전달 시스템에 접착되는 상이한 올리고를 사용함에 의해 상기 동일한 입자에 상이한 항원(경우에 따라 상이한 비율로)이 접착될 수 있도록 한다.
따라서, 본 발명의 제1 측면에서, 중간 링커를 사용하여 연결된 항원 전달 입자 및 하나 이상의 항원을 포함하는 면역원성 조성물이 제공된다.
본 발명의 하나의 측면에서, 링커가 서로 상보적인 2개 이상의 성분을 포함하고 여기서 링커 성분중 하나가 입자에 연결되어 있고 다른 상보적 링커 성분이 항원에 연결되어 있는, 중간 링커를 사용하여 연결된 하나 이상의 항원 전달 입자 및 하나 이상의 항원을 포함하는 면역원성 조성물이 제공된다.
본 발명의 추가의 측면에서, 링커가 서로 상보적인 2개 이상의 성분을 포함하고 여기서 링커 성분중 하나가 입자에 연결되고 다른 상보적인 링커 성분이 항원에 연결되어 있으며 2개의 상보적인 링커 성분이 하이브리드화된, 중간 링커를 사용하여 연결된 하나 이상의 항원 전달 입자 및 하나 이상의 항원을 포함하는 면역원성 조성물이 제공된다.
본 발명의 하나의 측면에서, 한쌍 이상의 상보적 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 중간 링커를 사용하여 연결된 하나 이상의 항원 전달 입자 및 하나 이상의 항원을 포함하는 면역원성 조성물이 제공된다.
본 발명의 추가의 측면에서, 감염 및/또는 질환 예방용 면역원성 조성물을 제조하는데 있어서, 한쌍 이상의 상보적 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 중간 링커를 사용하여 연결된 하나 이상의 항원 전달 입자 및 하나 이상의 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물의 용도가 제공된다.
본 발명의 추가의 측면에서, 감염 및/또는 질환 예방 및/또는 치료용 면역원성 조성물을 제조하는데 있어서 본원에 기재된 백신 또는 면역원성 조성물의 용도가 제공된다.
추가의 측면에서, 면역원성 조성물중의 항원이 유래된 병원체의 변이체인 병원체에 의해 유발된 감염 또는 질환으로부터 보호하기 위한, 본원에서 정의된 바와 같은 백신 또는 조성물의 방법 또는 용도가 제공된다.
또 다른 양태에서, 면역원성 조성물중의 항원의 변이체인 항원을 포함하는 병원체에 의해 유발된 감염 또는 질환으로부터 보호하기 위한, 본원에 제공된 바와 같은 백신 또는 면역원성 조성물의 방법 또는 용도가 제공된다.
본 발명의 추가의 양태에서, 환자에게 본 발명의 면역원성 조성물을 투여함을 포함하는 항원 특이적 CD8+ T-세포 면역 반응을 유도하기 위한, 본원에 정의된 바와 같은 면역원성 조성물의 방법 또는 용도가 제공된다.
본 발명의 추가의 측면에서, 포유류에서 질환 치료를 위한 본원에 정의된 바와 같은 백신 또는 면역원성 조성물의 방법 또는 용도가 제공된다.
본 발명의 추가의 측면에서, i) 올리고뉴클레오타이드에 연결된 하나 이상의 항원 전달 입자 및 ii) i)의 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 올리고뉴클레오타이드에 연결된 하나 이상의 항원을 포함하는 키트가 제공된다.

도 1 : 상이한 용출 분획물의 SDS-PAGE/쿠마시 분석.
도 2: 상이한 용출 분획물의 SDS-PAG/BET 분석.
도 3a 및 3b: 하이드리드화 반응 혼합물의 초원심분리 후 펠렛 및 상등액의 SDS-PAGE 분석.
도 4: 연구 디자인.
도 5: 사이토킨 생성 CD8+ T-세포 빈도(CD8+ 집단내 %).
도 6: 사이토킨 생성 CD4+ T-세포 빈도(CD4+ 집단내 %).
도 7: 생체내 검출된 세포 매개 세포독성.
도 8: 항-p27 항체 역가 (총 IgG - 풀링된 혈청).
본원에서 용어 "포함하는", "포함한다(comprise)" 및 "포함한다(comprises)"는 각각 발명자가 모든 경우에 용어 "로 이루어진", "로 이루어진다(consist of)" 및 "로 이루어진다(consists of)"로 대체할 수 있는 것으로 의도된다.
본 발명의 "백신 조성물"에 관한 본원의 양태는 또한 본 발명의 "면역원성 조성물"에 관한 양태에 적용할 수 있고 그 반대의 경우도 적용할 수 있다.
본 발명자는 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 백신 또는 면역원성 조성물이, 항원 전달 입자 및 항원이 중간체 링커를 사용하여 연결되어 있지 않는 조성물에 비해 개선된 면역 반응을 유발함을 입증하였다. '개선된 면역 반응'이란 면역 반응이 하기의 방식중 하나 이상에서 변형된 것을 의미한다: 증가된 이펙터 세포(예를 들어, CD8+ 및/또는 CD4+ T-세포, B-세포) 수; 하나 이상의 이펙터 세포 유형의 증가된 효과; 하나 이상의 세포 유형에 의한 하나 이상의 사이토킨의 증가된 생성; 및 총 사이토킨 프로필 중의 비율로서 하나 이상의 사이토킨의 증가된 생성. 특히, 본 발명의 면역원성 조성물은 개선된 CD8+ T-세포 면역 반응을 유도한다. 개선된 CD8+ T-세포 반응은 표적 세포가 세포내 세균 또는 바이러스, 예를 들어, HIV 로 감염될 수 있거나 표적 세포가 종양 세포일 수 있는 특정 질환의 예방 및/또는 치료에 중요하다.
따라서, 본 발명의 제1 측면에서, 중간 링커를 사용하여 연결된 하나 이상의 항원 전달 입자 및 하나 이상의 항원을 포함하는 면역원성 조성물이 제공된다.
상보적인 성분과 함께 중간 링커를 사용하는 추가의 잇점은 상이한 크기의 입자/항원이 각각 상이한 항원(들)/항원 전달 입자(들)과 용이하게 연합될 수 있다는 것이다. 이것은 직접적인 공유 결합 보다 추가의 잇점이다.
특히, 링커가 서로 상보적인 2개 이상의 성분을 포함하고 상기 링커 성분중 하나가 항원 전달 입자에 연결되어 있고 상보적인 링커 성분이 항원에 연결되어 있으며; 이어서 항원 전달 입자 및 항원이 이들이 부착된 상보적인 성분의 하이브리드화 및/또는 결합을 통해 연결되어 있는 면역원성 조성물이 제공된다.
따라서, 본 발명의 특정 측면에서, 한쌍 이상의 상보적인 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 중간 링커를 사용하여 연결된 하나 이상의 항원 전달 입자 및 하나 이상의 항원을 포함하는 면역원성 조성물이 제공된다.
본 발명의 특정 측면에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 제1 올리고뉴클레오타이드가 항원 전달 입자에 연결되어 있고 제1 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 제2 올리고뉴클레오타이드가 항원에 연결되어 있는 한쌍 이상의 상보적 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 중간 링커를 사용하여 연결된 하나 이상의 항원 전달 입자 및 하나 이상의 항원을 포함한다.
본 발명의 추가의 측면에서, 한쌍 이상의 상보적 올리고뉴클레오타이드를 통해 하나 이상의 항원에 연결된 하나 이상의 항원 전달 입자를 포함하는 면역원성 조성물이 제공된다. 추가의 양태에서, 면역원성 조성물은 하나 이상의 항원에 연결된 하나 이상의 항원 전달 입자를 포함하고; 상기 항원은 모두 동일하거나 항원중 하나 이상이 상이할 수 있다. 본 발명의 추가의 양태에서, 항원 전달 입자중 하나 이상이 상이한 항원 전달 입자 조성물을 포함하는 면역원성 조성물이 제공된다. 본 발명의 추가의 양태에서, 하나 이상의 상이한 항원 전달 입자 및 하나 이상의 상이한 항원을 포함하는 면역원성 조성물이 제공된다.
미립자 항원 전달 시스템
미립자 전달 시스템은 당업계에 널리 공지되어 있고[예를 들어, 문헌참조( Singh and O'Hagan 2002 Pharmaceutical Research 19(6): 715- 727)] 수중유 에멀젼, 마이크로입자[문헌참조: O'Hagen & Singh 2003 Expert Rev. Vaccines 2(2): 269-283], 면역자극 복합체(ISCOM), 프로테오좀, 오일 소적(droplet) 및 리포좀을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 '항원 전달 입자'는 미립자 항원 전달 시스템의 단일 입자를 언급하고 수중유 에멀젼의 오일 소적, 단일 마이크로입자 또는 나노입자, 단일 프로테오좀, 단일 오일 소적, 단일 리포좀, 마이셀, 프로테오좀 또는 단일 ISCOM을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
리포좀
본 발명의 특정 양태는 중간 링커를 사용하여 항원에 연결된 리포좀 제형을 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 하나의 측면에서, 링커가 서로 상보적인 2개 이상의 성분을 포함하고 상기 링커 성분중 하나가 리포좀에 연결되고 다른 상보적인 링커 성분이 항원에 연결된 중간 링커를 사용하여 연결된 하나 이상의 리포좀 및 하나 이상의 항원을 포함하는 면역원성 조성물이 제공된다.
본 발명의 추가의 측면에서, 링커가 서로 상보적인 2개 이상의 성분을 포함하고 상기 링커 성분중 하나가 리포좀에 연결되어 있고 다른 상보적 링커 성분이 항원에 연결되어 있으며 2개의 상보적 링커 성분이 하이드리드화된 중간 링커를 사용하여 연결된 하나 이상의 리포좀 및 하나 이상의 항원을 포함하는 면역원성 조성물이 제공된다.
본 발명의 특정 양태에서, 중간 링커는 한쌍 이상의 상보적 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
상기 용어 "리포좀"은 수성 내부를 포위하는 단일- 또는 다중적층(특히 지질막 수에 따라 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 적층(lamellar)이 형성됨) 지질 구조를 언급한다. 리포좀 및 리포좀 제형은 당업계에 널리 공지되어 있다. 리포좀을 형성할 수 있는 지질은 지방산 또는 지방형 성질을 갖는 모든 물질을 포함한다. 리포좀내 지질을 구성할 수 있는 지질은 글리세라이드, 글리세로포스포리피드, 글리세로포스피노리피드, 글리세로포스포노리피드, 설포리피드, 포스포리피드, 이소프레놀리드, 스테로이드, 스테아린, 스테롤, 아케올리피드, 합성 양이온 지질 및 탄수화물 함유 지질로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
하나의 양태에서, 상기 리포좀은 포스포리피드를 포함한다. 적합한 포스포리피드는 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 포스파티딜콜린의 합성에서 중간체인 포스포콜린 (PC); 천연 포스포리피드 유도체: 천연 포스포리피드로서 난포스포콜린, 난포스포콜린, 대두 포스포콜린, 스핑고마이엘린; 및 합성 포스포리피드 유도체: 포스포콜린(디데카노일-L-α-포스파티딜콜린[DDPC], 딜라우로일포스파티딜콜린[DLPC], 디미리스토일포스파티딜콜린[DMPC], 디팔미토일 포스파티딜콜린[DPPC], 디스테아로일 포스파티딜콜린 [DSPC], 디올레오일 포스파티딜콜린[DOPC], 1-팔미토일, 2-올레오일포스파티딜콜린[POPC], 디엘라이도일 포스파티딜콜린 [DEPC]), 포스포글리세롤(1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포글리세롤 [DMPG], 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포글리세롤 [DPPG], 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포글리세롤 [DSPG], 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포글리세롤 [POPG]), 포스파티드산(1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스파티드산 [DMPA], 디팔미토일 포스파티드산[DPPA], 디스테아로일-포스파티드산[DSPA]), 포스포에탄올아민(1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민[DMPE], 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민[DPPE], 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 DSPE 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민[DOPE]), 포스포세린, 폴리에틸렌 글리콜 [PEG] 포스포리피드 (mPEG-포스포리피드, 폴리글리세린-포스포리피드, 작용화된-포스포리피드, 말단 활성화된-포스포리피드). 하나의 양태에서, 상기 리포좀은 1-팔미토일-2-올레오일-글리세로-3-포스포에탄올아민을 포함한다. 하나의 양태에서, 고도로 정제된 포스파티딜콜린이 사용되고 포스파티딜콜린 (EGG), 포스파티딜콜린 수소화된 (EGG), 포스파티딜콜린 (SOY) 및 포스파티딜콜린 수소화된(SOY)로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 추가의 양태에서, 리포좀은 포스파티딜에탄올아민 [POPE] 또는 이의 유도체를 포함한다.
리포좀 크기는 포스포리피드의 조성 및 이의 제조에 사용되는 방법에 따라 30nm 내지 수 μm로 다양할 수 있다. 본 발명의 특정 양태에서, 리포좀 크기는 50nm 내지 500nm 범위이고 추가의 양태에서 50nm 내지 200nm 범위이다. 동력학적 레이져 광 산란은 당업자에게 널리 공지된 리포좀의 크기를 측정하기 위해 사용되는 방법이다.
본 발명의 추가의 양태에서, 본 발명의 리포좀은 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드, 예를 들어, 1 내지 10,000개, 1 내지 15,000개, 1 내지 25,000개, 1 내지 50,000개, 1 내지 90,000개, 1 내지 100,000개 이상의 올리고뉴클레오타이드에 연결된다. 항원에 연결된 올리고뉴클레오타이드는 동일할 수 있거나 하나 이상이 상이할 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명의 리포좀은 스테롤을 추가로 포함한다. 적합한 스테롤은 β-시토스테롤, 스티그마스테롤, 에르고스테롤, 에르고칼시페롤 및 콜레스테롤을 포함한다. 하나의 특정 양태에서, 리포좀은 스테롤로서 콜레스테롤을 포함한다. 이들 스테롤은 당업계에 널리 공지되어 있고, 예를 들어, 콜레스테롤은 동물 지방에서 발견되는 천연 스테롤로서 문헌[Merck Index, 11th Edn., page 341]에 기재되어 있다.
본 발명의 면역원성 조성물은 하나 이상 유형의 리포좀을 포함할 수 있다. 리포좀은 이들의 조성이 상이할 수 있고 따라서 본 발명의 하나의 양태에서, 하나 이상의 상이한 리포좀을 포함하는 면역원성 조성물이 제공된다. 리포좀은 이들이 상이한 요소로 이루어지거나 이를 포함하거나, 추가의 요소를 포함하거나 특정 요소가 부재인 점에서 상이할 수 있거나 리포좀을 구성하는 요소중 하나 이상이 상이한 비율로 존재한다는 점에서 상이할 수 있다. 리포좀은 이들의 조성, 즉 이들이 유래하는 포스포리피드가 상이할 수 있다. 추가의 양태에서, 리포좀은 리포좀에 존재하는 스테롤의 양이 상이할 수 있고, 예를 들어, 하나의 양태에서 면역원성 조성물은 스테롤을 포함하는 리포좀 부분 및 스테롤을 포함하지 않는 리포좀 부분을 포함하거나 리포좀은 스테롤의 양이 상이할 수 있다. 추가의 양태에서, 면역원성 조성물은 존재하는 면역자극제가 상이한 리포좀을 포함할 수 있고, 예를 들어, 하나의 양태에서, 면역원성 조성물은 면역자극제, 예를 들어, 사포닌 및/또는 TLR 리간드를 포함하는 리포좀 부분 및 추가의 면역자극제가 부재인 리포좀을 포함할 수 있다. 추가의 양태에서, 연결된 올리고뉴클레오타이드가 상이한 리포좀을 포함하는 면역원성 조성물이 제공된다. 예를 들어, 본 발명의 면역원성 조성물은 특정 올리고뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 세트에 연결된 리포좀 부분을 포함할 수 있는 반면, 잔여 리포좀은 또 다른 올리고뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 세트를 포함할 수 있다. 면역원성 조성물은 임의의 수의 상이한 유형의 리포좀, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30개 이상의 상이한 리포좀을 포함할 수 있다. 물론, 몇몇 리포좀은 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 없지만 다른 리포좀은 하나 이상의 상이한 유형의 올리고뉴클레오타이드에 연결된다.
수중유 에멀젼
본 발명의 하나의 양태에서, 중간 링커를 사용하여 연결된, 수중유 에멀젼에서 하나 이상의 오일 소적 및 하나 이상의 항원을 포함하는 본 발명의 조성물이 제공된다.
본 발명의 하나의 측면에서, 링커가 서로 상보적인 2개의 이상의 성분을 포함하고 링커 성분중 하나가 오일 소적에 연결되고 다른 상보적인 링커 성분이 항원에 연결된 중간 링커를 사용하여 연결된, 수중유 에멀젼에서 하나 이상의 오일 소적 및 하나 이상의 항원을 포함하는 면역원성 조성물이 제공된다.
본 발명의 추가의 측면에서, 링커가 서로 상보적인 2개 이상의 성분을 포함하고 링커 성분중 하나가 오일 소적에 연결되어 있고 다른 상보적 링커 성분이 항원에 연결되어 있으며 2개의 상보적인 링커 성분이 하이브리드화된 중간 링커를 사용하여 연결된, 수중유 에멀젼에서 하나 이상의 오일 소적 및 하나 이상의 항원을 포함하는 면역원성 조성물이 제공된다.
본 발명의 특정 양태에서, 중간 링커는 한쌍 이상의 상보적 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
본 발명의 수중유 에멀젼은 대사가능한 오일 및 유화제를 포함한다. 임의의 수중유 조성물이 사람 투여용으로 적합할 수 있도록 하기 위해서, 에멀젼 시스템의 오일상은 대사가능한 오일을 포함해야만 한다. 용어 대사가능한 오일의 의미는 당업계에 널리 공지되어 있다. 대사가능한은 '대사에 의해 전환될 수 있는'으로서 정의될 수 있다[문헌참조: Dorland's Illustrated Medical Dictionary, W. B. Sanders Company, 25th edition (1974)]. 오일은 수용자에게 독성이 아니고 대사에 의해 전환될 수 있는 임의의 식물성 오일, 어유, 동물오일 또는 합성 오일일 수 있다. 견과류, 종자 및 곡물은 공통된 식물성 오일의 공급원이다. 합성 오일은 또한 본 발명의 일부이고 시판되는 오일, 예를 들어 NEOBEE® 및 기타 오일을 포함할 수 있다.
특히 적합한 대사가능한 오일은 스쿠알렌이다. 스쿠알렌 (2,6,10,15,19,23-헥사메틸-2,6,10,14,18,22-테트라코사헥사엔)은 상어 간유에서 대량으로 발견되고 올리브 오일, 맥아유, 쌀겨유 및 효모에서는 소량으로 발견되는 불포화 오일이고 특히 본 발명에 사용하기 위해 바람직한 오일이다. 스쿠알렌은 콜레스테롤 합성에서 중간체라는 사실때문에 대사가능한 오일이다(문헌참조: Merck index, 10th Edition, entry no.8619). 본 발명의 추가의 양태에서, 대사가능한 오일은 면역원성 조성물중에 조성물 총 용적의 0.5% 내지 10% (v/v)의 양으로 존재한다.
수중유 에멀젼은 추가로 유화제를 포함한다. 유화제는 적합하게 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트일 수 있다. 추가로, 상기 유화제는 적합하게 조성물의 총 용적의 0.125 내지 4% (v/v)의 양으로 백신 또는 면역원성 조성물중에 존재한다.
본 발명의 수중유 에멀젼은 임의로 토콜을 포함한다. 토콜은 당업계에 널리 공지되어 있고 EP0382271에 기재되어 있다. 적합한 토콜은 알파-토코페롤 또는 이의 유도체(예를 들어, 알파-토코페롤 숙시네이트(또한 비타민 E 숙시네이트로서 공지됨))일 수 있다. 상기 토콜은 적합하게 면역원성 조성물의 총 용적의 0.25% 내지 10% (v/v)의 양으로 보조제 조성물에 존재한다.
수중유 에멀젼의 제조 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 일반적으로, 상기 방법은 오일상(임의로 토콜을 포함하는)을 PBS/TWEEN80™ 용액과 같은 계면활성제와 혼합함에 이어서 파쇄기로 균질화시킴을 포함하고, 상기 혼합물을 주사기 바늘에 2회 통과시킴을 포함하는 방법이 소량의 액체를 균질화시키기 위해 적합할 수 있다는 것은 당업자에게 자명하다. 동일하게, 미세유동화기(M110S Microfluidics 기계, 6바의 최대 가압(생성 압력 약 850바))에서 2분동안 최대 50회 통과)중에서의 유화 공정을 당업자가 채택하여 보다 적은 용적 또는 보다 큰 용적의 에멀젼을 생성시킬 수 있다. 상기 채택은 요구되는 직경의 오일 소적으로 제조될 때까지 수득한 에멀젼의 측정을 포함하는 통상적인 실험에 의해 성취될 수 있다.
수중유 에멀젼에서, 오일 및 유화제는 수성 담체중에 존재해야만 한다. 상기 수성 담체는 예를 들어, 인산 완충 식염수일 수 있다.
특히, 본 발명의 수중유 에멀젼 시스템은 서브마이크로미터 범위의 작은 크기의 오일 소적을 갖는다. 적합하게 소적 크기는 직경 120 내지 750 nm 범위, 보다 특히 120 내지 600nm 범위이다. 보다 더 특히, 수중유 에멀젼은 오일 소적을 함유하고 이중에서 70% 이상 강도(intensity)는 직경이 500nm 미만이고 보다 특히 80% 이상 강도는 직경이 300nm 미만이고 보다 특히 90% 이상 강도는 직경이 120 내지 200nm 범위이다.
오일 소적 크기, 즉, 본 발명에 따른 직경은 강도로 나타낸다. 오일 소적 크기의 직경을 강도로 결정하는 수개의 방법이 있다. 강도는 크기 분석 장치, 적합하게는 동력학적 광 산란(예를 들어, Malvern Zetasizer 4000 또는 바람직하게 Malvern Zetasizer 3000HS)을 사용하여 측정한다. 제1 가능성은 동력하적 광 산란(PCS-광자 대비 분광측정기)에 의해 z 평균 직경 ZAD를 측정하는 것이고, 상기 방법은 추가로 다중분산성 지수(PDI)를 제공하고 ZAD 및 PDI 둘다는 누적 알고리듬으로 계산한다. 이들 값은 입자 굴절 지수의 숙지를 필요로 하지 않는다. 제2 평균은 또 다른 알고리듬, Contin 또는 NNLS, 또는 자동 "Malvern" 알고리듬(크기 분석 장치에 의한 것을 위해 제공된 디폴트 알고리듬)에 의해 전체 입자 크기 분포를 측정함으로써 오일 소적의 직경을 계산하는 것이다. 대부분 복합 조성물의 입자 굴절 지수가 공지되지 않기 때문에 강도 분포만이 고려되고 경우에 따라 상기 분포로부터 기원하는 강도 평균이 고려된다.
본 발명의 면역원성 조성물은 하나 이상 유형의 오일 소적을 포함할 수 있다. 수중유 에멀젼내 오일 소적은 이들의 조성이 상이할 수 있고 따라서 본 발명의 하나의 양태에서, 하나 이상의 상이한 오일 소적을 포함하는 면역원성 조성물이 제공된다. 오일 소적은 이들이 상이한 요소로 구성되거나 이를 포함하거나 추가의 요소를 포함하거나 특정 요소가 부재라는 점에서 상이할 수 있거나 오일 소적을 구성하는 요소중 하나 이상이 상이한 비율로 존재한다는 점에서 상이할 수 있다. 오일 소적은 이들의 조성, 즉 이들이 유래하는 지질이 상이할 수 있다. 추가의 양태에서, 연결된 올리고뉴클레오타이드가 상이한 오일 소적을 포함하는 면역원성 조성물이 제공된다. 예를 들어, 본 발명의 면역원성 조성물은 특정 올리고뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 세트에 연결된 부분의 오일 소적을 포함할 수 있는 반면, 잔여 리포좀은 또 다른 올리고뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 세트를 포함할 수 있다. 면역원성 조성물은 임의의 수의 상이한 유형의 오일 소적, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20 또는 30개 이상의 상이한 오일 소적을 포함할 수 있다.
ISCOM
본 발명의 한 양태에서, 중간 링커를 사용하여 연결된 하나 이상의 ISCOM 및 하나 이상의 항원을 포함하는 본 발명의 면역원성 조성물이 제공된다.
본 발명의 하나의 측면에서, 링커가 서로 상보적인 2개 이상의 성분을 포함하고 링커 성분중 하나가 ISCOM에 연결되어 있고 다른 상보적 링커 성분이 항원에 연결된 중간 링커를 사용하여 연결된 하나 이상의 ISCOM 및 하나 이상의 항원을 포함하는 면역원성 조성물이 제공된다.
본 발명의 추가의 측면에서, 링커가 서로 상보적인 2개 이상의 성분을 포함하고 링커 성분중 하나가 ISCOM에 연결되어 있고 다른 상보적 링커 성분이 항원에 연결되어 있으며 2개의 상보적인 링커 성분이 하이브리드화된 중간 링커를 사용하여 연결된 하나 이상의 ISCOM 및 하나 이상의 항원을 포함하는 면역원성 조성물이 제공된다.
본 발명의 특정 양태에서, 중간 링커는 한쌍 이상의 상보적 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
ISCOM은 당업계에 널리 공지되어 있다(문헌참조: Kersten & Crommelin [1995] Biochimica et Biophysica Acta 1241 :117-138). ISCOM은 사포닌, 콜레스테롤 및 포스포리피드를 포함하고 전형적으로 크기가 40nm인 개방-케이지형 구조를 형성한다. ISCOM은 사포닌, 콜레스테롤 및 추가의 포스포리피드의 상호작용으로부터 비롯된다. ISCOM의 제조를 위한 전형적인 반응 혼합물은 사포닌이 5mg/ml이고 콜레스테롤 및 포스포리피드 각각이 1mg/ml이다.
본 발명의 ISCOM에 사용하기위해 적합한 포스포리피드는 포스포콜린 (디데카노일-L-α-포스파티딜콜린[DDPC], 디라우로일포스파티딜콜린[DLPC], 디미리스토일포스파티딜콜린[DMPC], 디팔미토일 포스파티딜콜린[DPPC], 디스테아로일 포스파티딜콜린[DSPC], 디올레오일 포스파티딜콜린[DOPC], 1-팔미토일, 2-레오일포스파티딜콜린[POPC], 디엘라이도일 포스파티딜콜린[DEPC]), 포스포글리세롤 (1,2- 디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포글리세롤[DMPG], 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-S-포스포글리세롤[DPPG], 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-S-포스포글리세롤[DSPG], 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포글리세롤[POPG]), 포스파티드산(1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스파티드산 [DMPA], 디팔미토일 포스파티드산[DPPA], 디스테아로일-포스파티드산 [DSPA]), 포스포에탄올아민(1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민[DMPE], 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민[DPPE], 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 DSPE 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민[DOPE]), 포스포세린, 폴리에틸렌 글리콜 [PEG] 포스포리피드(mPEG-포스포리피드, 폴리글리세린-포스포리피드, 작용화된-포스포리피드, 말단 활성화된-포스포리피드)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 하나의 양태에서, ISCOM은 1-팔미토일-2-올레오일-글리세로-3-포스포에탄올아민을 포함한다. 추가의 양태에서, 고도로 정제된 포스파티딜콜린이 사용되고 포스파티딜콜린 (EGG), 포스파티딜콜린 수소화된(EGG) 포스파티딜콜린 (SOY) 포스파티딜콜린 수소화된(SOY) 것을 포함하는 그룹으로부터 선택될 수 있다. 추가의 양태에서, ISCOM은 포스파티딜에탄올아민[DOPE] 또는 이의 유도체를 포함한다.
다수의 사포닌이 본 발명의 ISCOM에 사용하기에 적합하다. 개별 사포닌의 보조제 및 용혈 활성은 당업계에서 광범위하게 연구되었다(문헌참조: Lacaille-Dubois and Wagner, supra). 예를 들어, 쿠일(Quil) A (남아메리카 나무(Quillaja Saponaria Molina)의 나무껍질로부터 유래함), 및 이의 분획물은 문헌[참조: US 5,057,540 and "Saponins as vaccine adjuvants", Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2):1-55; 및 EP 0 362 279 B1]에 기재되어 있다.
쿠일 A의 분획물을 포함하는 ISCOM이 백신 제조에 사용되어 왔다(문헌참조: Morein, B., EP 0 109 942 B1). 이들 구조는 보조제 활성을 갖는 것으로 보고되었다(EP 0 109 942 B1 ; WO 96/11711).
쿠일 A의 분획물, 쿠일 A의 유도체 및/또는 이의 배합물은 본 발명의 ISCOM에 사용하기 위해 적합한 사포닌 제제이다. 용혈성 사포닌 QS21 및 QS17 (쿠일 A의 HPLC 정제된 분획물)은 잠재적인 보조제로서 기재되어 왔고 이들의 제조 방법은 미국 특허 제5,057,540호 및 EP 0 362 279 B1에 기재되어 있다. 또한 이들 문헌에는 전신성 백신에 대한 강력한 보조제로서 작용하는 QS7(쿠일-A의 비용혈성 분획물)의 용도가 기재되어 있다. QS21의 용도는 추가로 문헌[참조: Kensil et al. (1991. J. Immunology vol 146, 431-437)]에 기재되어 있다. QS21 및 폴리소르베이트 또는 사이클로덱스트린의 배합물은 또한 공지되어 있다(WO 99/10008). QS21 및 QS7과 같은 쿠일 A의 분획물을 포함하는 미립자 보조제 시스템은 WO 96/33739 및 WO 96/11711에 기재되어 있고 이들은 본원에 인용된다. QH-A, QH-B, QH-C로 지정된 다른 특정 쿠일 A 분획물 및 QH-703으로 지정된 QH-A 및 QH-C의 혼합물은 ISCOM의 형태로 WO1996011711에 기재되어 있고 이것은 본원에 인용된다.
마이크로입자
본 발명의 하나의 양태에서, 중간 링커를 사용하여 연결된 하나 이상의 마이크로입자 및 하나 이상의 항원을 포함하는 본 발명의 면역원성 조성물이 제공된다.
마이크로입자, 마이크로입자를 포함하는 조성물 및 마이크로입자의 제조 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다(문헌참조: Singh et al. [2007 Expert Rev. Vaccines 6(5):797-808] and WO/1998/033487). 본원에 사용된 바와 같은 용어 "마이크로입자" 는 직경이 약 1000nm 내지 약 150㎛이고 다양한 분자량을 갖고 PLG와 같은 공중합체인 경우, 다양한 락티드:글리콜리드 비율을 갖는 중합체 물질로부터 유래하는 입자를 언급한다. 특히, 상기 마이크로입자는 바늘 및 모세관을 폐색시키는 것 없이 비경구 투여를 허용하는 직경일 것이다. 마이크로입자는 또한 미소구로서 공지되어 있다. 마이크로입자 크기는 광자 대비 분광측정기, 레이져 회절 측정기 및/또는 스캐닝 전자 현미경과 같은 당업계에 널리 공지된 기술에 의해 용이하게 측정된다.
본원에 사용하기 위한 마이크로입자는 멸균가능하고 비독성이고 생분해될 수 있는 물질로부터 형성된다. 상기 물질은 제한없이, 폴리(a-하이드록시산), 폴리하이드록시부티르산, 폴리카프롤락톤, 폴리카프롤락톤, 폴리오르토에스테르, 폴리언하이드라이드를 포함한다.
특히, 본 발명의 마이크로입자는 폴리(u-하이드록시산)으로부터, 특히 폴리(락티드)("PLAII) 또는 D,L-락티드 및 글리콜산의 공중합체, 예를 들어, 폴리(D,L-락티드-co-글리콜리드) ("PLGII 또는 "PLGAII), 또는 D,L-락티드 및 카프롤락톤의 공중합체로부터 유래한다.
본 발명의 마이크로입자를 제조하기 위한 생분해가능한 중합체는 예를 들어, 제조원[Boehringer Ingelheim, Germany and Birmingham Polymers, Inc., Birmingham, AL]으로부터 용이하게 구입할 수 있다. 예를 들어, 본원에서 마이크로입자를 형성시키기 위해 유용한 중합체는 폴리하이드록시부티르산; 폴리카프롤락톤; 폴리오르토에스테르; 폴리언하이드라이드; 및 폴리(어하이드록시산), 예를 들어, 폴리(L-락티드), 폴리(D,L-락티드)(둘다 본원에서 "PLAN으로서 공지됨), 폴리(하이드록시부티레이트), D,L-락티드 및 글리콜리드의 공중합체, 예를 들어, 폴리(D,L-락티드-코-글리콜리드(본원에서 "PLG" 또는 "PLGA"로서 지정됨) 또는 D,L-락티드와 카프롤락톤으로부터 유래하는 것들을 포함한다. 특정 중합체는 PLA 및 PLG 중합체이다. 이들 중합체는 다양한 분자량으로 시판되고 소정의 항원을 위해 적당한 분자량은 당업자에 의해 용이하게 측정된다. 따라서, 예를 들어, PLA를 위해 적합한 분자량은 약 2000 내지 5000 정도이다. PLG에 대해서, 적합한 분자량은 일반적으로 10,000 내지 200,000 범위, 특히 약 15,000 내지 약 150,000 범위, 및 보다 더 특히 약 50,000 내지 약 100,000범위이다. PLG와 같은 공중합체가 마이크로입자를 형성하기 위해 사용되는 경우 다양한 락티드:글리콜리드 비율이 사용될 수 있다.
락티드:글리콜리드 비율이 다양한 마이크로입자의 혼합물은 소정의 항원에 대해 목적하는 방출 역학을 성취하고 1차 및 2차 면역 반응 둘다를 제공하기 한 제형중에 사용된다. 본 발명의 마이크로입자의 분해율은 또한 중합체 분자량 및 중합체 결정성과 같은 인자에 의해 조절될 수 있다. 락티드:글리콜리드 비율 및 분자량이 다양한 PLG 공중합체는 제조원[Boehringer Ingelheim, Germany 및 Birmingham Polymers, Inc., Birmingham, AL]을 포함하는 다수의 공급원으로부터 용이하게 구입할 수 있다. 이들 중합체는 또한 문헌[참조: Tabata et al., J. Biomed. Mater.Res. (1988) 22:837-858]에 기재된 바와 같은, 당업계에 널리 공지된 기술을 사용하여 락트산 성분의 단순한 중축합에 의해 합성할 수 있다.
나노입자
본 발명의 하나의 양태에서, 중간 링커를 사용하여 연결된 하나 이상의 나노입자 및 하나 이상의 항원을 포함하는 본 발명의 조성물이 제공된다.
나노입자는 당업계에 널리 공지되어 있다. 나노입자를 포함하는 조성물 및 나노입자의 제제는 문헌[참조: WO/2008/051245 및 Singh et al. (2007 Expert Rev. Vaccines 6(5):797-808)]에 기재되어 있고 이는 본원에 참조로서 인용된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "나노입자"는 중합체 물질로부터 유래된 직경이 1000nm 미만인 입자를 언급한다. 나노입자는 마이크로입자의 조성과 동일하거나/유사한 조성을 갖고 단지 이들의 크기가 상이하다. 나노입자는 또한 나노구(nanosphere)로서 공지되어 있다. 본 발명의 조성물내 나노입자는 전형적으로 Z 평균 및/또는 D(v,0.5) 값이 250nm 미만이고 보다 전형적으로 150nm 미만이고 Z 평균 및/또는 D(v,0.9)가 350nm 미만이고 보다 전형적으로는 200nm 미만인 크기 분포를 갖는다.
입자 크기는 당업계에 유용한 방법을 사용하여 결정될 수 있다(측정될 수 있다). 예를 들어, 입자 크기는 광자 대비 분광측정기, 동력학적 광 산란 또는 준-탄성 광산란을 사용하여 결정될 수 있다. 이들 방법은 브라운 운동 측정으로부터 수득된 입자의 확산 성질과 크기 분포의 대비를 기초로 한다. 브라운 운동은 입자를 둘러싸는 용매 분자에 의한 폭발로 인한 입자의 무작위 운동이다. 입자가 클수록 브라운 운동은 보다 느려진다. 속도는 변환 확산 계수(D)에 의해 정의된다. 측정된 상기 수치는 입자가 액체내(유체역학적 직경)에서 어떻게 움직이는 가를 언급한다. 수득된 직경은 입자와 동일한 변환 확산 계수를 갖는 입자의 직경이다. 입자 크기는 또한 단일 시점에서 용액내에서 산란되는 광의 강도를 측정하는 정적 광 산란을 사용하여 결정할 수 있다. 정적 광 산란은 산란각 및 용질 농도의 함수로서 광 강도를 측정한다. 광원, 예를 들어, 레이져 빔을 통과하는 입자는 이들의 크기에 역비례하는 각도로 광을 산란시킨다. 대형 입자는 고강도로 낮은 산란 각에서 회절 패턴을 생성하는 반면, 작은 입자는 넓은 각의 낮은 강도 시그날을 생성시킨다. 입자 크기 분포는 샘플로부터 산란된 광 강도가 각의 함수로서 측정되는 경우 계산될 수 있다. 각도 정보는 산란 모델(예를 들어, Mie 이론)과 비교하여 크기 분포를 계산한다.
일반적으로, 입자 크기는 실온에서 결정하고 미지의 샘플의 다중 분석(예를 들어, 동일한 샘플에 대해 3회 이상의 반복 측정)으로 입자 직경에 대한 평균치를 수득함을 포함한다.
광 대비 분광측정을 위해, Z 평균(또한 누적 평균 또는 수역학적 직경으로도 불리움)은 전형적으로 누적(단극(monomodal)) 분석으로부터 계산된다. 정적 광 산란 측정을 위해(및 또한 몇몇 양태에서 광 대비 분광측정을 위해), 용적 기반 크기 계수를 측정할 수 있다.
예를 들어, D(v,0.5) (v는 용적을 의미한다)는 크기 계수이고 이의 값은 측정된 바와 같은 조성물내 입자의 50%(용적 기반)가 D(v,0.5) 미만의 크기를 갖고 조성물내 입자의 50%가 D(v,0.5) 값 초과인 크기를 갖는 포인트로서 정의된다. 유사하게, D(v,0.9)는 크기 계수이고 이의 값은 조성물내 입자의 90%(용적 기반)가 D(v,0.9) 값 미만인 크기를 갖고 조성물내 입자의 10%가 D(v,0.9) 값 초과인 크기를 갖는 포인트로서 정의된다.
올리고뉴클레오타이드
본 발명의 추가의 양태에서, 중간 링커가 한상 이상의 상보적 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 중간 링커를 사용하여 연결된, 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 항원 전달 입자를 포함하는 조성물이 제공된다.
용어 올리고뉴클레오타이드는 당업계에 널리 공지되어 있다. 용어 "올리고뉴클레오타이드"는 임의의 단일 가닥의 올리고뉴클레오타이드 서열을 의미하는 것으로 본원에 사용된다. 올리고뉴클레오타이드는 RNA 또는 DNA 올리고뉴클레오타이드일 수 있거나 올리고뉴클레오타이드는 펩타이드 핵산일 수 있거나 또 다른 양태에서 3중 DNA 나선을 형성할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 '올리고뉴클레오타이드'는 상보적인 핵산과 하이브리드화할 수 있는 단일 가닥의 올리고뉴클레오타이드 서열을 언급한다. 올리고뉴클레오타이드의 디자인(길이 및 특이적 서열)은 올리고뉴클레오타이드가 사용되는 조건(예를 들어, 온도 및 이온 강도) 뿐만 아니라 항원 전달 입자 및/또는 항원의 성질에 의존한다. 올리고뉴클레오타이드의 디자인은 연결될 항원 전달 입자 또는 항원의 유형의 의존할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드의 길이는 연결의 특이성 및 강도를 결정할 수 있고 항원과 리포좀 표면간에 목적하는 거리에 따라 다양할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드의 서열은 올리고뉴클레오타이드의 목적하는 면역자극 효과에 따라 다양할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 임의의 길이일 수 있고 하이브리드화하는 이의 능력 및/또는 이것이 합성될 수 있는 용이성에 의해서만 제한된다. 하나의 양태에서, 올리고뉴클레오타이드는 8개 내지 250개 염기(예를 들어, 10 내지 200개, 12 내지 75개, 13 내지 50개, 10 내지 45개, 14 내지 40개)이고 특이적으로 상기 올리고뉴클레오타이드는 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35 또는 40개 염기 길이일 수 있다.
상보적인 올리고뉴클레오타이드의 쌍은 임의의 서열일 수 있고 단, 이들은 서로 결합하는데 적합하고 리포좀 및/또는 항원에 부착할 수 있어야 한다. 하나의 양태에서, 제1 올리고뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1 내지 6 중 어느 하나의 서열이거나 서열번호 1 내지 6의 서열을 포함하거나 이의 서열내에 떨어지는 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75 또는 100개 이상의 염기일 수 있다. 제2 올리고뉴클레오타이드 쌍은 제1 올리고뉴클레오타이드에 상보적이다. 경우에 따라, 상기 올리고뉴클레오타이드의 길이 및/또는 서열을 약간 변형시켜 임의의 소정의 환경하에 요구되는 특이성 및 민감성을 유지시킬 수 있다. 본원에 열거된 올리고뉴클레오타이드는 예를 들어, 양 방향으로, 1 내지 40개 뉴클레오타이드까지 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 뉴클레오타이드까지 연장될 수 있다.
본 발명의 하나의 양태에서, 올리고뉴클레오타이드는 면역자극 올리고뉴클레오타이드이다. 용어 "면역자극 올리고뉴클레오타이드"는 면역계의 성분을 활성화시킬 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 의미하기 위해 사용된다. 본 발명의 하나의 양태에서, 면역자극 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 비메틸화된 사이토신-구아노신(CpG) 모티프를 포함한다. 추가의 양태에서, 면역자극 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 비메틸화된 티미딘-구아노신(TG) 모티프를 포함하고 T-풍부일 수 있다. T-풍부란 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 조성이 50%, 60%, 70% 또는 80% 초과의 티미딘을 포함함을 의미한다. 본 발명의 하나의 양태에서, 올리고뉴클레오타이드는 면역자극 올리고뉴클레오타이드가 아니고 비메틸화된 CpG 모티프를 포함하지 않는다. 추가의 양태에서, 면역자극 올리고뉴클레오타이드는 T-풍부가 아니고/아니거나 비메틸화된 TG 모티프를 포함하지 않는다.
올리고뉴클레오타이드를 변형시켜 시험관내 및/또는 생체내 안정성을 개선시킬 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 하나의 양태에서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트 골격, 즉, 뉴클레오타이드 상호 연결을 포함하도록 변형시킨다. 올리고뉴클레오타이드에 대한 또 다른 뉴클레오타이드 상호 연결 뿐만 아니라 디포스포로티오에이트, 포스포로아미데이트 및 메틸포스포네이트 변형을 포함하는 다른 적합한 변형은 당업자에게 널리 공지되어 있고 본 발명에 의해 포함된다.
추가의 양태에서, 올리고뉴클레오타이드를 변형시켜 항원 전달 입자 및/또는 항원에 접합될 수 있도록 할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드를 변형시키는 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 하나의 양태에서, 유리된 설프하이드릴 그룹(SH)를 포함하도록 변형된 올리고뉴클레오타이드가 제공된다. 특정 양태에서, 3' 말단에 유리된 설프하이드릴 그룹을 포함하는 올리고뉴클레오타이드가 제공된다. '유리된 설프하이드릴 그룹'은 그룹이 화학적 접합에 유용함을 의미한다.
본 발명의 하나의 양태에서, 면역원성 조성물의 항원 전달 입자가 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드에 연결된 본 발명의 면역원성 조성물이 제공된다. 단일 항원 전달 입자상에 올리고뉴클레오타이드는 동일할 수 있거나 또한 하나 이상의 상이한 올리고뉴클레오타이드가 단일 항원 전달 입자에 연결될 수 있다. 면역원성 조성물내 올리고뉴클레오타이드는 모두 동일하거나 추가의 양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 하나 이상의 상이한 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
본 발명의 추가의 양태에서, 전달 입자 일부가 한 유형의 올리고뉴클레오타이드에 연결되고 하나의 일부가 하나 이상의 상이한 올리고뉴클레오타이드에 연결된 2개의 이상의 항원 전달 입자를 포함하는 면역원성 조성물이 제공된다.
본 발명의 추가의 양태에서, 하나 이상의 상이한 올리고뉴클레오타이드에 연결된 항원을 포함하는 면역원성 조성물이 제공되고, 즉 본 발명의 항원은 임의의 수의 상이한 올리고뉴클레오타이드에 연결된 항원(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 이상의 상이한 올리고뉴클레오타이드 서열에 연결될 수 있다)을 포함하는 면역원성 조성물이 제공된다. 본 발명의 추가의 양태에서, 하나의 항원이 하나의 유형의 올리고뉴클레오타이드에 연결되고 하나 이상의 상이한 항원이 하나 이상의 상이한 올리고뉴클레오타이드에 연결된 2개 이상의 상이한 항원을 포함하는 면역원성 조성물이 제공된다.
추가의 양태에서, 항원이 하나 이상의 상이한 올리고뉴클레오타이드 서열에 연결된 면역원성 조성물이 제공된다. 이것은 단일 항원 분자가 서열이 상이한 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있음을 의미하지만 본 발명의 또 다른 양태에서, 항원 집단내에서 서로 동일한 항원은 상이한 올리고뉴클레오타이드에 연결된다.
접합
본 발명의 하나의 양태는 항원 전달 입자가 중간 링커를 사용하여 항원에 연결된 면역원성 조성물에 관한 것이다. 특정 양태에서, 중간 링커를 한쌍 이상의 상보적 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 상기 올리고뉴클레오타이드는 당업자에게 공지된 방법에 의해 항원 및/또는 리포좀에 부착될 수 있다.
본 발명의 특정 양태에서, 올리고뉴클레오타이드가 화학적 접합에 의해 하나 이상의 항원 전달 입자에 연결되어 있고 하나 이상의 항원 전달 입자에 연결된 상기 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 올리고뉴클레오타이드가 화학적 접합에 의해 하나 이상의 항원에 연결된, 본원에 기재된 발명의 면역원성 조성물이 제공된다.
항원은 화학적 접합에 의해 연결된 하나 이상, 예를 들어, 1 내지 10개, 1 내지 15개, 1 내지 25개, 1 내지 50개, 1 내지 200개, 2 내지 100개, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 이상의 올리고뉴클레오타이드를 가질 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 당업자에게 널리 공지된 화학적 방법을 사용하여 항원에 접합될 수 있다.
하나의 양태에서, 항원은 이작용성 링커(예를 들어, S-GMBS[N-(γ-말레이미도부티릴옥시)설포 숙신이미드 에스테르])를 사용하여 올리고뉴클레오타이드에 접합되어 말레이미드 그룹이 단백질에 도입되도록 하고 상기 단백질에는 추가의 설프하이드릴 그룹을 갖는 올리고뉴클레오타이드가 후속적으로 접합된다. 말레이미드 그룹을 부가하기 위해 적합한 추가의 시약은 N-[α-말레이미도아세톡시]숙신이미드 에스테르 (AMAS), N-[β-말레이미도프로필옥시] 숙신이미드 에스테르 (BMPS), N-[ε-말레이미도카프로일옥시]숙신이미드 에스테르(EMCS), N-[γ- 말레이미도부티릴옥시]숙신이미드 에스테르(GMBS), m-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙신이미드 에스테르(MBS), 숙신이미딜-4-[N-말레이미도메틸]-사이클로헥산-1-카복시-[6-아미도카프로에이트] (LC-SMCC), 숙신이미딜-4-[N-말레이미도메틸]-사이클로헥산-1-카복실레이트, (SMCC), 말레이미도(폴리에틸렌 옥사이드)2, 4, 6, 8 또는 12 N-하이드록시숙신이미드 에스테르 (SM(PEG)2, 4,, 6, 8 또는 12), 숙신이미딜 4-[p-말레이미도페닐]부티레이트(SMPB), 숙신이미딜 6-[β-말레이도프로피온아미도) 헥사노에이트 (SMPH), N-- [ε-말레이미도카프로일옥시] 설포숙신이미드 에스테르 (설포-EMCS), m-말레이미도벤조일-N-하이드록시설포-숙신이미드 에스테르 (설포-MBS), 설포숙신이미딜-4-[N-말레이미도메틸]-사이클로헥산-1-카복실레이트 (설포-SMCC), N-[γ-말레이미도부티릴옥시]설포-숙신이미드 에스테르 (설포-GMBS) 및 설포숙신이미딜 4-[p-말레이미도페닐]부티레이트 (설포-SMPB) (문헌참조: Pierce; Bioconjugate techniques Greg T. Hermanson Academic Press 1996)로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
단백질이 하나 이상의 유리된 설프하이드릴 그룹을 포함하는 추가의 양태에서, 말레이미드 활성화 전에, 유리된 설프하이드릴 그룹은 예를 들어, N-에틸말레이미드로 차단된다.
다수의 추가의 화학물질이 당업자에게 유용하고 따라서 하나의 양태에서 유리된 설프하이드릴 그룹을 포함하는 항원은 예를 들어, N-숙신이미딜 3-[2-피리딜티오]프로피오네이트(SPDP)와 같은 시약을 사용한 DTT 처리 후 유리된 아미노 그룹이 설프하이드릴 그룹으로 변환되도록 변형시킬 수 있다. 다른 시약은 숙신이미딜 6-[3-(2-피리딜티오]프로피온아미도]헥사노에이트 LC-SPDP, 4-숙신이미딜옥시카보닐-메틸-α-[2-피리딜디티오]톨루엔 (SMPT), LC-SMPT, 설포숙신이미딜 3-[2-피리딜디티오]프로피오네이트(설포-SPDP), 설포우시니미딜옥시카보닐-메틸-α-[2- 피리딜티오]톨루엔 Sufo-SMPT, 설포숙신이미딜 6-메틸-α-[2-피리딜디티오]톨루아미도 헥사노에이트 설포-LC-SMPT, 설포숙신이미딜 6-[3'-2-피리딜티오]프로피온아미도]헥사노에이트(설포- LC-SDPD) 및 N-아세틸 호모시스테인 티올락톤으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다:
올리고뉴클레오타이드-SH + 항원-SH -> 올리고뉴클레오타이드-S-S-항원
또 다른 양태에서, 설프하이드릴 그룹을 포함하는 항원은 설프하이드릴(티올)변형된 올리고뉴클레오타이드에 대한 접합용으로 적합한 말레이미드 활성화된 항원을 생성시키는 비스-말레이미드 시약, 예를 들어, BM[PEO]2 또는 3 또는 DTME를 사용하여 변형시킬 수 있다:
Ag-SH + 비스말레이미드 시약 -> 말레이미드-활성화된 Ag+ 올리고뉴클레오타이드-SH
또 다른 양태에서, 할로아세틸 항원은 SBAP, NHS-BA, SIA, SIAB 및 설포-SIAB와 같은 시약과 반응시켜 수득할 수 있다. 수득한 할로아세틸 항원은 이어서 티올 변형된 올리고뉴클레오타이드에 접합시킬 수 있다:
올리고뉴클레오타이드-SH + 항원-Br -> 올리고뉴클레오타이드-S-항원 + HBr
리포좀은 리포좀 크기, 및 리포좀의 표면에서 올리고뉴클레오타이드의 입체적 장애와 같은 다른 제한요소에 따라 하나 이상, 예를 들어, 1 내지 100,000개의 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 당업자에게 널리 공지된 화학물질을 사용하여 리포좀에 접합시킬 수 있다. 리포좀 접합체 및 유도체의 제조는 널리 공지되어 있다[문헌참조: Bioconjugate techniques. G T. Hermanson: preparation of liposome conjugates and derivatives pages 528-569 (1996)]. 포스파티딜 에탄올아민 그룹을 포함하는 리포좀은 이종-이작용성 가교 결합제를 사용하여 활성화시켜 말레이미드, 요오도아세틸 또는 피리딜 디설파이드 그룹을 부가할 수 있다.
올리고뉴클레오타이드는 리포좀 성분중 임의의 하나, 예를 들어, 포스포리피드에 연결시킬 수 있다. 하나의 양태에서, 상기 리포좀은 말레이미드 변형된 포스포리피드를 포함한다. 하나의 양태에서, 상기 리포좀은 POPE-MAL (N-(3-말레이미도-1-옥소프로필)L-α-포스파티딜에탄올아민 또는 1-팔미토일-2-올레일 [제조원: NOF American corporation]을 포함하고 여기에, 예를 들어, 티올-변형된 올리고뉴클레오타이드가 접합될 수 있다.
리포좀은 변형된 포스포리피드를 0.5% 내지 50%(몰) 범위의 농도로 포함하도록 제조될 수 있다. 특히, 변형된 포스포리피드의 %는 1 내지 20%이고 보다 더 특히 1 내지 10%이다. 올리고뉴클레오타이드에 공유적으로 부착될 변형된 포스포리피드의 비율은 실험 조건 및 반응 수율에 의존한다.
올리고뉴클레오타이드는 ISCOM 성분중 임의의 하나, 예를 들어, 포스포리피드에 연결될 수 있다. 하나의 양태에서, ISCOM은 말레이미드 변형된 포스포리피드를 포함한다. 하나의 양태에서, ISCOM은 예를 들어, 티올-변형된 올리고뉴클레오타이드가 접합될 수 있는 POPE-MAL을 포함한다.
ISCOM은 변형된 포스포리피드를 포함하도록 제조될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드에 공유적으로 부착되는 변형된 포스포리피드의 비율은 실험 조건 및 반응 수율에 의존한다. 추가의 양태에서, 본 발명의 ISCOMS은 변형된 콜레스테롤을 포함한다.
올리고뉴클레오타이드는 수중유 에멀젼에서 오일 소적에 접합될 수 있다. 수본 발명의 수중유 에멀젼의 오일 소적은 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드에 접합할 수 있는 변형된 계면활성제를 포함할 수 있다. 하나의 양태에서, 본원에 정의된 바와 같은 변형된 포스포리피드인 변형된 계면활성제를 포함하는 본 발명의 오일 소적이 제공된다. 본 발명의 특정 양태에서, 변형된 포스포리피드는 총 계면활성제 용적의 약 0.1 내지 10%(v/v)이다.
올리고뉴클레오타이드는 마이크로 및/또는 나노입자에 접합될 수 있다. 본 발명의 마이크로/나노입자는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드에 접합할 수 있는 변형된 포스포리피드를 포함할 수 있다. 하나의 양태에서, 본원에 정의된 바와 같은 변형된 포스포리피드를 포함하는 본 발명의 마이크로/나노입자가 제공된다.
본 발명의 하나의 양태에서, 다음 단계를 포함하는 면역원성 조성물의 제조 방법이 제공된다::
a. 제1 올리고뉴클레오타이드를 항원에 접합시키는 단계;
b. 단계 a)에서의 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 제2 올리고뉴클레오타이드를 항원 전달 입자에 접합시키는 단계;
c. 올리고뉴클레오타이드의 하이브리드화를 허용하는 조건하에 항원과 항원 전달 입자를 혼합하는 단계.
추가의 양태에서, 다음 단계를 포함하는 면역원성 조성물의 제조 방법이 제공된다:
a. 적합한 시약을 사용하여 항원상의 임의의 유리된 설프하이드릴 그룹을 차단시키는 단계;
b. 말레이미드 그룹을 상기 항원으로 부가하는 단계;
c. 제1 티올-활성화된 올리고뉴클레오타이드를 상기 항원에 접합시키는 단계;
d. 단계 c)의 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 제2 티올 올리고뉴클레오타이드를 말레이미드 활성화된 포스포리피드를 포함하는 리포좀에 접합시키는 단계;
e. 올리고뉴클레오타이드의 하이브리드화를 허용하는 조건하에 항원과 리포좀을 혼합시키는 단계.
추가의 양태에서, 다음 단계를 포함하는 면역원성 조성물의 제조 방법이 제공된다:
a. 적합한 시약을 사용하여 항원상의 임의의 유리된 설프하이드릴 그룹을 차단시키는 단계;
b. 말레이미드 그룹을 상기 항원으로 부가하는 단계;
c. 제1 티올-활성화된 올리고뉴클레오타이드를 상기 항원에 접합시키는 단계;
d. 단계 c)의 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 제2 티올 올리고뉴클레오타이드를 말레이미드 활성화된 포스포리피드를 포함하는 ISCOM에 접합시키는 단계;
e. 올리고뉴클레오타이드의 하이브리드화를 허용하는 조건하에 항원과 ISCOM을 혼합하는 단계.
추가의 양태에서, 다음 단계를 포함하는 면역원성 조성물의 제조 방법이 제공된다:
a. 적합한 시약을 사용하여 항원상의 임의의 설프하이드릴 그룹을 차단시키는 단계;
b. 말레이미드 그룹을 상기 항원에 부가하는 단계;
c. 제1 티올-활성화된 올리고뉴클레오타이드를 상기 항원에 접합시키는 단계;
d. 단계 c)의 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 제2 티올 올리고뉴클레오타이드를 말레이미드-활성화된 포스포리피드를 포함하는 오일 소적에 접합시키는 단계;
e. 올리고뉴클레오타이드의 하이브리드화를 허용하는 조건하에 항원과 오일 소적을 혼합하는 단계.
추가의 양태에서, 다음 단계를 포함하는 면역원성 조성물의 제조 방법이 제공된다:
a. 적합한 시약을 사용하여 항원상의 임의의 유리된 설프하이드릴 그룹을 차단시키는 단계;
b. 말레이미드 그룹을 상기 항원에 부가하는 단계;
c. 제1 티올-활성화된 올리고뉴클레오타이드를 상기 항원에 접합시키는 단계;
d. 단계 c)의 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 제2 티올 올리고뉴클레오타이드를 말레이미드-활성화된 포스포리피드를 포함하는 마이크로입자 및/또는 나노입자에 접합시키는 단계;
e. 올리고뉴클레오타이드의 하이브리드화를 허용하는 조건하에 항원과 마이크로입자 및/또는 나노입자를 혼합하는 단계.
본 발명의 특정 양태에서, 단계 b)가, 몰비가 약 6인 이작용성 링커/항원을 사용하여 수행되는, 본원에 기재된 바와 같은 면역원성 조성물의 제조 방법이 제공된다.
항원
본 발명의 백신 또는 면역원성 조성물은 사람 또는 동물에서 발병하는 사람 또는 동물 병원체 및/또는 물질에 대해 면역 반응을 유발할 수 있는 항원을 포함한다. 본 발명의 추가의 양태에서, 본 발명의 백신 또는 면역원성 조성물은 사람 또는 동물에서 종양 및/또는 종양 항원 또는 신생물에 대해 면역 반응을 유발할 수 있는 항원을 포함한다.
용어 항원은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 항원은 사람 또는 동물에서 면역 반응을 유발할 수 있는 단백질, 폴리사카라이드, 펩타이드, 핵산, 단백질-폴리사카라이드 접합체, 분자 또는 합텐일 수 있다. 항원은 바이러스, 세균, 기생충, 원생동물 또는 진균류로부터 유래하거나 이의 유사 분자와 상동성이거나 합성될 수 있다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 항원은 종양 세포 또는 신생물로부터 유래하거나 이의 모사 분자와 상동성이거나 합성된다. 본 발명의 추가의 양태에서, 항원은 알레르기, 알츠하이머 질환, 죽상동맥경화증, 비만 및 니코틴-중독에 연루된 물질로부터 유래하거나 이의 유사 분자와 상동성이거나 합성된다.
본 발명의 하나의 양태에서, 중간 링커를 통해 1개 이상의 항원에 연결된 하나 이상의 항원 전달 입자를 포함하는 면역원성 조성물이 제공된다. 본 발명의 추가의 양태에서, 한쌍 이상의 상보적 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 링커를 통해 1개 이상의 항원에 연결된 하나 이상의 항원 전달 입자를 포함하는 면역원성 조성물이 제공된다. 본 발명의 항원 전달 입자는 임의의 수의 항원, 예를 들어, 1개 내지 200,000개의 항원 분자에 연결되고 이는 미립자 항원 전달 입자에 의존한다. 상기 항원은 모두 동일하거나 또 다른 양태에서 하나 이상의 상이한 항원일 수 있고 따라서 본 발명의 항원 전달 입자는 임의의 수의 상이한 항원, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 또는 60개 이상의 상이한 항원에 연결될 수 있다.
본 발명의 추가의 양태에서, 상기 항원은 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드, 예를 들어, 1 내지 200개, 2 내지 100개, 1 내지 50개, 1 내지 25개, 1 내지 15개, 1 내지 10개, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 이상의 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 상기 항원에 연결된 올리고뉴클레오타이드는 모두 동일하거나 또한 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드는 서로 상이할 수 있다.
본 발명의 면역원성 조성물은 링커 성분에 연결된 항원 전달 입자 및 상보적인 링커 성분에 연결된 항원을 포함한다. 적합하게, 적어도 30% 이상의 항원 분자는 조성물중에서 항원 전달 입자에 연결된다. 본 발명의 추가의 양태에서, 적어도 약 40% 이상의 항원 분자가 항원 전달 입자에 연결된다. 본 발명의 추가의 양태에서, 대다수의 항원은 항원 전달 입자에 연결되고, 즉 조성물중에 항원 분자의 50% 이상이 항원 전달 입자에 연결된다. 본 발명의 추가의 양태에서, 조성물중 실질적으로 모든 항원 분자가 조성물의 항원 전달 입자에 연결된다. 실질적으로 모든이란 적어도 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상의 항원 분자가 항원 전달 입자에 연결됨을 의미한다. 본 발명의 하나의 양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물에 존재하는 모든(약 100%) 항원이 조성물내 항원 전달 입자에 연결된다. 임의의 과량의 비결합된 항원 분자는 당업자에게 공지된 다양한 방법에 의해 조성물로부터 제거될 수 있고, 예를 들어, 면역원성 조성물은 항원 전달 입자에 연결된 항원이 펠렛화되고 리포좀에 연결되지 않은 항원이 상등액중에 잔류하도록 하는 원심분리에 적용될 수 있다.
키트
본 발명의 잇점은 올리고뉴클레오타이드 연결된 항원이 이어서 상보적인 올리고뉴클레오타이드에 연결된 항원 전달 입자에 용이하게 연결될 수 있다는 것이다. 본 발명의 범위내에서, 상보적인 링커 성분에 연결된 항원 전달 입자 및 항원을 포함하는 키트가 제공된다. 특정 양태에서, 상보적인 올리고뉴클레오타이드에 연결된 항원 전달 입자 및 항원을 포함하는 키트가 제공된다. 본 발명의 키트내 상보적 올리고뉴클레오타이드에 접합된 항원 전달 입자 및 항원은 서로 하이드리드화하거나 별개일 수 있고 따라서 숙주에게 투여하기 전에 하이브리드화를 필요로 한다.
본 발명의 특정 측면에서, i) 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드에 연결된 하나 이상의 항원 전달 입자를 포함하는 키트가 제공된다. 본 발명의 추가의 측면에서, i) 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드에 연결된 하나 이상의 항원을 포함하는 키트가 제공된다.
본 발명의 하나의 양태에서, i) 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드에 연결된 하나 이상의 항원 전달 입자 및 ii) i)의 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드에 연결된 하나 이상의 항원을 포함하는 키트가 제공된다. 본 발명의 추가의 양태에서, i) 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드에 연결된 하나 이상의 항원 전달 입자 및 ii) i)의 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드에 연결된 2개 이상의 항원을 포함하는 키트가 제공된다. 본 발명의 추가의 양태에서, i) 올리고뉴클레오타이드에 연결된 하나 이상의 항원 및 ii) i)의 올리고뉴클레오타이드 또는 상이한 올리고뉴클레오타이드에 연결된 하나 이상의 상이한 유형의 항원 전달 입자 및 iii) i) 및/또는 ii)의 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드에 연결된 하나 이상의 항원; 및 임의로 iv) i) 및/또는 ii)의 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 올리고뉴클레오타이드에 연결된 하나 이상의 상이한 항원을 포함하는 키트가 제공된다.
본 발명의 하나의 양태에서, 하나 이상의 항원 전달 입자가 상보적인 올리고뉴클레오타이드를 통한 하이브리드화에 의해 하나 이상의 항원에 연결되거나 하나 이상의 항원이 상보적인 올리고뉴클레오타이드를 통한 하이브리드화에 의해 하나 이상의 항원 전달 입자에 연결된 키트가 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 항원 전달 입자 및 항원이 상이한 바이엘에 있음에 따라 상보적인 올리고뉴클레오타이드를 통해 하이브리드화하지 않아 이들이 투여 전 적당한 시점에서 하이브리드화될 수 있도록하는 키트가 제공된다.
키트는 임의의 수의 상이한 유형의 항원 전달 입자, 예를 들어, 1 내지 100개 범위에 이르는 상이한 유형의 항원 전달 입자를 포함할 수 있다. 하나의 양태에서, 한 유형의 항원 전달 입자가 동일한 올리고뉴클레오타이드에 연결되고, 또 다른 양태에서, 각각 상이한 유형의 항원 전달 입자가 상이한 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 추가의 양태에서 본 발명의 키트는 임의의 수의 상이한 항원, 예를 들어, 예를 들어 1 내지 100개 범위의 상이한 항원을 포함할 수 있다. 키트내 항원은 키트내 하나 이상의 리포좀 세트에 연결된 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 올리고뉴클레오타이드에 적합하게 연결된다.
추가의 양태에서, i) 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드에 연결된 하나 이상의 항원 전달 입자 및 ii) 상기 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드에 연결된 하나 이상의 항원; 및 추가의 면역자극제를 포함하는 키트가 제공된다.
면역자극제
본 발명의 추가의 양태에서, 하나 이상의 면역자극제 또는 면역자극제의 배합물을 추가로 포함하는, 실질적으로 본원에 기재된 바와 같은 백신 또는 면역원성 조성물이 제공된다.
본 발명의 하나의 양태에서, 한쌍 이상의 상보적인 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 중간 링커를 사용하여 연결된 하나 이상의 항원 전달 입자 및 하나 이상의 항원을 포함하고 하나 이상의 면역자극제를 추가로 포함하는 면역원성 조성물이 제공된다. 면역자극제는 리포좀, ISCOM 또는 소적내에 존재할 수 있고(지질 이중층에 존재하거나 내부 수성상에 캅셀화되어 있다), 수용액중에서 항원 전달 입자와 혼합되거나, 추가의 양태에서, 조성물의 성분은 추가의 면역자극제로 흡수될 수 있다.
임의의 면역자극제는 하기 그룹으로부터 선택된다: 사포닌, 지질 A 또는 이의 유도체, 면역자극 올리고뉴클레오타이드, 알킬 글루코사미니드 포스페이트, 금속염, 톨(Toll)형 수용체 효능제 또는 이의 배합물. 특정 양태에서, 면역자극제/보조제는 톨형 수용체 효능제, 특히 톨형 수용체 2, 3, 4, 7, 8 또는 9의 효능제, 또는 사포닌이다. 특정 배합물은 사포닌(특히 QS21) 보조제 및/또는 톨형 수용체 수용체 4 효능제(예를 들어, 3D-MPL) 또는 톨형 수용체 9 효능제(예를 들어, CpG 함유 면역자극 올리고뉴클레오타이드)를 함유한다. 다른 배합물은 사포닌(특히 QS21) 및 톨형 수용체 4 효능제(예를 들어 사포닌(특히 QS21)) 및 톨형 수용체 4 리간드, 예를 들어, 3D-MPL 또는 알킬 글루코아미니드 포스페이트를 포함한다.
하나의 양태에서, 면역자극제는 톨형 수용체(TLR) 4 리간드, 특히 지질 A 유도체, 특히 모노포스포릴 지질 A 또는 보다 특히 3 탈아실화된 모노포스포릴 지질 A(3D-MPL)와 같은 효능제이다. 3D-MPL은 제조원[GlaxoSmithKline Biologicals N.A.-]에 의해 상품명 MPL하에 시판되고 있고 문헌 전반에 걸쳐 MPL 또는 3MPL로 언급된다[문헌참조: 예를 들어, 미국 특허 제,436,727호 제4,877,611호; 제4,866,034호 및 제4,912,094호]. 3D-MPL은 주로 IFN-g (Th1) 표현형과 함께 CD4+ T 세포 반응을 촉진시킨다. 3D-MPL은 문헌[참조: GB 2 220 211 A에 기재된 방법에 따라 제조될 수 있다. 화학적으로 이것은 3, 4, 5 또는 6 아실화된 쇄와 3-탈아실화된 모노포스포릴 지질 A의 혼합물이다. 특정 양태에서, 소형 입자 3D-MPL이 본 발명의 조성물에 사용된다. 소형 입자 3D-MPL은 이것이 0.22μm 여과기를 통해 멸균 여과될 수 있도록 하는 입자 크기를 갖는다. 상기 제제는 문헌[참조: WO 94/21292]에 기재되어 있다.
상기 면역원성 조성물은 리포폴리사카라이드, 적합하게는 지질 A의 비독성 유도체, 특히 모노포스포릴 지질 A 또는 보다 특히 3-탈아실화된 모노포스포릴 지질 A(3D-MPL)인 면역자극제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 하나의 양태에서, 면역원성 조성물은 3D-MPL을 포함한다.
지질 A의 합성 유도체는 공지되어 있고 TLR 4 효능제인 것으로 사료되고 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다:
OM174 (2-데옥시-6-o-[2-데옥시-2-[(R)-3-도데카보닐옥시테트라-데카노일아미노]-4-o-포스포노-β-D-글루코피라노실]-2-[(R)-3-하이드록시테트라데카노일아미노]-α-D-글루코피라노실디하이드로겐포스페이트), (WO 95/14026)
OM 294 DP (3S, 9R)-3-[(R)-도데카노일옥시테트라데카노일아미노]-4-옥소-5-아자-9(R)-[(R)-3-하이드록시테트라데카노일아미노]데칸-1,10-디올,1,10-비스(디하이드로게노포스페이트) (WO99 /64301 및 WO 00/0462)
OM 197 MP-Ac DP(3S-, 9R)-3-[(R)-도데카노일옥시테트라데카노일아미노]-4-옥소-5-아자-9-[(R)-3-하이드록시테트라데카노일아미노]데칸-1,10-디올,1-디하이드로게노포스페이트 10-(6-아미노헥사노에이트) (WO 01/46127)
사용될 수 있는 다른 TLR4 리간드는 문헌[참조: WO9850399 또는 US6303347 (AGP의 제조 방법이 또한 기재되어 있다)]에 기재된 것들과 같은 알킬 글루코사미니드 포스페이트(AGP), 또는 문헌[참조: US6764840]에 기재된 바와 같은 AGP의 약제학적으로 허용되는 염이다. 몇몇 AGP는 TLR4 효능제이고 몇몇은 TLR4 길항제이다. 이 둘다는 면역자극제로서 유용한 것으로 사료된다.
TLR-4을 통한 시그날 전달 반응을 유발할 수 있는 다른 적합한 TLR-4 리간드(문헌참조: Sabroe et al, Jl 2003 p1630-5)는 예를 들어, 그람-음성 세균 기원의 리포폴리사카라이드 및 이의 유도체 또는 단편, 특히, LPS의 비독성 유도체(예를 들어, 3D-MPL)이다. 다른 적합한 TLR 효능제는 다음과 같다: 열 쇼크 단백질 (HSP) 10, 60, 65, 70, 75 또는 90; 계면활성제 단백질 A, 하이알루로난 올리고사카라이드, 헤파란 설페이트 단편, 피브로넥틴 단편, 피브리노겐 입자 및 b-데펜신-2, 무라밀 디펩타이드 (MDP) 또는 호흡기 신시티알 바이러스(syncitial virus)의 F 단백질. 하나의 양태에서, TLR 효능제는 HSP 60, 70 또는 90이다.
톨형 수용체(TLR)는 I형 막관통 수용체이고 이는 곤충과 사람간에 진화적으로 보존되어 있다. 10개의 TLR이 지금까지 밝혀졌다(TLR 1 내지 10) (문헌참조: Sabroe et al, Jl 2003 p1630-5). TLR 계열의 구성원은 유사한 세포외 및 세포내 도메인을 갖고, 이들의 세포 도메인은 류신 풍부 반복 서열을 갖는 것으로 나타났고 이들의 세포내 도메인은 인터류킨-1 수용체(IL-1 R)의 세포내 영역과 유사하다. TLR 세포는 면역 세포 및 다른 세포(혈관 내피 세포, 지방세포, 심근세포 및 장 내피 세포를 포함하는) 중에서 차등적으로 발현된다. TLR의 세포내 도메인은, 어댑터 단백질 Myd88과 상호작용할 수 있고 상기 어뎁터 단백질은 또한 이의 세포질 영역에 IL-1 R 도메인을 가져 사이토킨의 NF-KB 활성화를 유도하고; 당해 Myd88 경로는 사이토킨 방출이 TLR 활성화에 의해 수행되는 한가지 통로이다. TLR은 주로 항원 제공 세포(예를 들어, 수지상 세포, 마크로파아지 등)와 같은 세포 유형에서 발현된다.
TLR을 통한 자극에 의해 수지상 세포가 활성화되어 수지상 세포가 성숙되고 IL-12와 같은 염증성 사이토킨이 생성된다. 지금까지 수행된 연구는 TLR이 상이한 유형의 효능제를 인지하는 것으로 밝히고 있지만 몇몇 효능제는 수개의 TLR에 공통으로 작용한다. TLR 효능제는 주로 세균 및 바이러스로부터 유래하고 플라겔린 또는 세균 리포폴리사카라이드(LPS)와 같은 분자를 포함한다.
"TLR 효능제"란 직접적인 리간드로서 또는 간접적으로 내인성 또는 외인성 리간드의 생성을 통해, TLR 시그날 전달 경로를 거치는 시그날 전달 반응을 유발할 수 있는 성분을 의미한다(문헌참조: Sabroe et al, Jl 2003 p1630-5).
또 다른 양태에서, TLR 분자의 다른 천연 또는 합성 효능제는 임의의 면역자극제로서 사용된다. 이들은 TLR2, TLR3, TLR7, TLR8 및 TLR9에 대한 효능제를 포함하지만 이에 제한되지 않을 수 있다.
본 발명의 하나의 양태에서, 사용되는 TLR 효능제는 TLR-1을 통해 시그날 전달 반응을 유발할 수 있다(문헌참조: Sabroe et al, Jl 2003 p1630-5). 적합하게, TLR-1을 통해 시그날 전달 반응을 유발할 수 있는 TLR 효능제는 다음으로부터 선택된다: 트리-아실화된 리포펩타이드(LP); 페놀-가용성모듈린; 마이코박테리움 튜버큘로시스(Mycobacterium tuberculosis) LP; S-(2,3-비스(팔미토일옥시)-(2-RS)- 프로필)-N-팔미토일-(R)-Cys-(S)-Ser-(S)-Lys(4)-OH, 세균 리포단백질 및 보렐리아 부르그도프레이 (Borrelia burgdorfei) OspA LP의 아세틸화된 아미노 말단과 유사한 트리하이드로클로라이드 (Pam3Cys) LP.
또 다른 양태에서, 사용되는 TLR 효능제는 TLR-2를 통해 시그날 반응을 유발할 수 있다(문헌참조: Sabroe et al, Jl 2003 p1630-5). 적합하게 TLR-2를 통해 시그날 전달 반응을 유발할 수 있는 TLR 효능제는 리포단백질, 펩티도글리칸, 엠. 튜버큘로시스(M. tuberculosis), 비. 부르그도르페리(B. burgdorferi), 티. 팔리둠(T. pallidum) 기원의 세균 리포펩타이드; 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)을 포함하는 종 기원의 펩티도글리칸; 리포테이코산, 마누론산, 나이세리아 포린스(Neisseria porins), 세균성 핌브리애(fimbriae), 여시니아(Yersinia) 독성 인자, CMV 비리온, 홍역 해마글루티닌, 및 효모 기원의 자이모산중 하나 이상이다.
또 다른 양태에서, 사용되는 TLR 효능제는 TLR-3을 통한 시그날 전달 반응을 유발할 수 있다(문헌참조: Sabroe et al, Jl 2003 p1630-5). 적합하게, TLR-3을 통해 시그날 전달 반응을 유발할 수 있는 TLR 효능제는 이중가닥 RNA (dsRNA), 또는 바이러스 감염과 관련된 분자 핵산 패턴인 폴리이노신산-폴리시티딜산(폴리 IC)이다.
또 다른 양태에서, 사용되는 TLR 효능제는 TLR-5를 통해 시그날 전달 반응을 유발할 수 있다(문헌참조: Sabroe et al, Jl 2003 p1630-5). 적합하게, TLR-5를 통해 시그날 전달 반응을 유발할 수 있는 TLR 효능제는 세균성 플라겔린이다.
또 다른 양태에서, 사용되는 TLR 효능제는 TLR-6를 통해 시그날 전달 반응을 유발할 수 있다(문헌참조: Sabroe et al, Jl 2003 p1630-5). 적합하게, TLR-6를 통한 시그날 전달 반응을 유발할 수 있는 TLR 효능제는 마이코세균성 리포단백질, 디-아실화된 LP 및 페놀 가용성 모듈린이다. 추가로 TLR6 효능제는 문헌[참조: WO2003043572]에 기재되어 있다.
또 다른 양태에서, 사용되는 TLR 효능제는 TLR-7을 통해 시그날 전달 반응을 유발할 수 있다(문헌참조: Sabroe et al, Jl 2003 p1630-5). 적합하게 TLR-7을 통해 시그날 전달 반응을 유발할 수 있는 TLR 효능제는 단일 가닥 RNA(ssRNA), 록소리빈, N7 및 C8에서 구아노신 유사체 또는 이미다조퀴놀린 화합물 또는 이의 유도체이다. 하나의 양태에서, TLR 효능제는 이미쿠이모드이다. 추가로, TLR7 효능제는 문헌[참조: WO02085905]에 기재되어 있다.
또 다른 양태에서, 사용되는 TLR 효능제는 TLR-8을 통해 시그날 전달 반응을 유발할 수 있다(문헌참조: Sabroe et al, Jl 2003 p1630-5). 적합하게 TLR-8을 통해 시그날 전달 반응을 유발할 수 있는 TLR 효능제는 단일 가닥 RNA(ssRNA), 항바이러스 활성을 갖는 이미다조퀴놀린 분자, 예를 들어, 레시쿠이모드 (R848)이고; 레시쿠이모드는 또한 TLR-7에 의해 인지될 수 있다. 사용될 수 있는 다른 TLR-8 효능제는 문헌[참조: WO2004071459]에 기재된 것들을 포함한다.
하이브리드화에 사용되는 것들 뿐만 아니라 면역자극 올리고뉴클레오타이드 또는 임의의 다른 톨형 수용체(TLR) 9 효능제가 또한 사용될 수 있다. 본 발명의 백신 또는 면역원성 조성물중에 사용하기 위한 특정 올리고뉴클레오타이드는 CpG 함유 올리고뉴클레오타이드, 특히 3개 이상, 보다 특히 6개 이상의 뉴클레오타이드에 의해 분리된 2개 이상의 디뉴클레오타이드 CpG 모티프를 함유하는 올리고뉴클레오타이드이다. CpG 모티프는 시토신에 이어서 구아닌 뉴클레오타이드가 존재한다. 본 발명의 CpG 올리고뉴클레오타이드는 전형적으로 데옥시뉴클레오타이드이다. 특정 양태에서, 올리고뉴클레오타이드중 뉴클레오타이드 상호연결은 포스포로디티오에이트 또는 포스포로티오에이트 결합이지만 포스포디에스테르 및 다른 뉴클레오타이드 상호 결합이 본 발명의 범위내에 있다. 뉴클레오타이드 상호연결이 혼합되어 있는 올리고뉴클레오타이드가 본 발명의 범위내에 포함된다. 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오타이드 또는 포스포로디티오에이트를 제조하는 방법이 문헌[참조: US5,666,153, US5,278,302 및 WO95/26204]에 기재되어 있다.
본 발명에 사용하기 위한 특정 올리고뉴클레오타이드의 예는 하기의 서열을 갖는다. 본 발명의 특정 양태에서, 당해 서열은 포스포로티오에이트 변형된 뉴클레오타이드 상호 연결을 함유한다.
(서열번호 1): TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826)
(서열번호 2): TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758)
(서열번호 3): ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG
(서열번호 4): TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006)
(서열번호 5): TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668)
(서열번호 6): TCG ACG TTT TCG GCG CGC GCC G (CpG 5456)
또 다른 CpG 올리고뉴클레오타이드는 비연속적 결실 또는 삽입을 갖는 상기 서열을 포함할 수 있다. 본 발명에 사용되는 CpG 올리고뉴클레오타이드는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 합성될 수 있다(예를 들어, EP 468520 참조). 편리하게, 당해 올리고뉴클레오타이드는 자동화 합성기를 사용하여 합성될 수 있다.
따라서, 또 다른 양태에서, 본 발명의 조성물은 추가로 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 면역자극제를 포함한다: TLR-1 효능제, TLR-2 효능제, TLR-3 효능제, TLR-4 효능제, TLR-5 효능제, TLR-6 효능제, TLR-7 효능제, TLR-8 효능제, TLR-9 효능제, 또는 이의 배합물.
본 발명의 하나의 양태에서, 면역원성 조성물은 추가로 사포닌을 포함한다. 본 발명에 사용하기에 특히 적합한 사포닌은 쿠일 A 및 이의 유도체이다. 쿠일 A 는 제조원[South American tree Quillaja Saponaria Molina]으로부터 분리된 사포닌 제제이고 최초로 문헌[참조: Dalsgaard et al. in 1974 ("Saponin adjuvants", Archiv. fur die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, Berlin, p243-254)]에서 보조제 활성을 갖는 것으로 기재되었다. 쿠일 A의 정제된 단편은 HPLC에 의해 분리되었고 이는 보조제 활성을 보유하고 쿠일 A(EP 0 362 278), 예를 들어, QS7 및 QS21(또한 QA7 및 QA21로서 공지됨)와 관련된 독성은 없었다. QS-21은 지역[Quillaja saponaria Molina]의 나무껍질로부터 유래된 천연 사포닌이고 이는 CD8+ 세포독성 T 세포(CTL), Th1 세포 및 주요 IgG2a 항체 반응을 유도하고 본 발명의 관점에서 특정된 사포닌이다.
특히 본 발명의 면역원성 조성물내 사포닌 보조제는 쿠일 A의 면역학적 활성 부분, 예를 들어, QS-7 또는 QS-21, 적합하게는 QS-21이다. 하나의 양태에서 본 발명의 조성물은 실질적으로 순수 형태의 면역학적 활성 사포닌 부분을 함유한다. 특히 본 발명의 조성물은 실질적으로 순수 형태의 QS21을 함유하고, 즉, QS21은 75%, 80%, 85% 또는 90% 이상 순수하고, 예를 들어 95% 이상 순수하거나 98% 이상 순수하다.
특정 양태에서, QS21은 이의 덜 반응성인 조성물로 제공되고 여기서, 이것은 외인성 스테롤, 예를 들어, 콜레스테롤로 켄칭되어 있다. 수개의 특정 형태의 덜 반응성인 조성물이 존재하고 여기서 QS21은 외인성 콜레스테롤로 켄칭되어 있다. 하나의 양태에서, 사포닌을 포함하는 본 발명의 리포좀은 적합하게 천연 지질, 예를 들어, 실온에서 적합하게 비-결정성인 포스파티딜콜린, 예를 들어, 난황 포스파티딜콜린, 디올레오일 포스파티딜콜린(DOPC) 또는 디라우릴 포스파티딜콜린을 함유한다. 상기 리포좀은 또한 포화 지질로 구성된 리포좀에 대해 리포좀-QS21 구조의 안정성을 증가시키는 하전된 지질을 함유할 수 있다. 이들 경우에, 하전된 지질의 양은 적합하게 1 내지 20% w/w, 특히 5 내지 10%이다. 스테롤 대 포스포리피드의 비는 1 대 50% (mol/mol), 적합하게는 20 대 25%이다.
QS21 및 스테롤, 특히 콜레스테롤을 포함하는 본 발명의 면역원성 조성물은 스테롤이 부재인 조성물과 비교하여 감소된 반응성을 보여주면서 보조제 효과는 유지된다. 반응성 연구는 문헌[참조: WO 96/33739]에 기재된 방법에 따라 평가할 수 있다. 본 발명에 따른 스테롤은 외인성 스테롤, 즉 항원 제제가 취해진 유기체에 내인성이 아니지만 제형화시에 후속적으로 항원 제제에 부가되는 스테롤을 의미한다.
활성 사포닌 부분이 QS21인 경우, QS21 : 스테롤의 비는 전형적으로 1:100 내지 1:1 (w/w) 정도이고, 적합하게는 1:10 내지 1:1 (w/w)이고, 바람직하게는 1:5 내지 1:1 (w/w)이다. 적합하게 과량의 스테롤이 존재하고 QS21 :스테롤의 비는 1:2 (w/w) 이상이다. 하나의 양태에서, QS21:스테롤의 비는 1:5 (w/w)이다. 상기 스테롤은 적합하게 콜레스테롤이다.
다른 유용한 사포닌은 식물 아에스쿨루스 히포카스타눔(Aesculus hippocastanum) 또는 지오필라 스트루티움(Gyophilla struthium)로부터 기원한다. 문헌에 기재된 다른 사포닌은 호스 체스넛(horse chestnut) 나무의 종자에 존재하는 혼합물, Lat: 아에스쿨루스 히포카스타눔으로서 문헌[참조: Merck index (12th ed: entry 3737)]에 기재된 에스신(Escin)을 포함한다. 이의 분리는 크로마토그래피 및 정제(문헌참조: Fiedler, Arzneimittel-Forsch. 4, 213 (1953)), 및 이온 교환 수지(문헌참조: Erbring et al., US 3,238,190)에 의해 수행한다. 에스신 부분은 정제되었고 생물학적으로 활성인 것으로 밝혀졌다(문헌참조: Yoshikawa M, et al. (Chem Pharm Bull (Tokyo) 1996 Aug;44(8):1454-1464)). 지프소필라 스트루티움(Gypsophilla struthium) (문헌참조: R. Vochten et al., 1968, J. Pharm. BeIg., 42, 213-226) 기원의 사포알빈은 또한 예를 들어, ISCOM 제조와 관련하여 기재되었다.
특히, 조성물은 상기 목록으로부터 2개 이상의 면역자극제를 포함할 수 있다. 하나의 양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 리포폴리사카라이드 및 면역학적 활성 사포닌 둘다를 포함한다. 본 발명의 추가의 양태에서, 리포폴리사카라이드는 본 발명의 리포좀으로 혼입된다. 본 발명의 특정 양태에서, 리포폴리사카라이드는 3D-MPL이고 면역학적 활성 사포닌은 본 발명의 리포좀으로 혼입되는 QS21이다.
백신 접종
본 발명의 면역원성 조성물을 함유하는 백신 제제를 사용하여 상기 백신을 전신 또는 점막 경로를 통해 투여함으로써 감염에 민감한 포유동물을 보호하거나 치료할 수 있다. 이들 투여는 근육내, 복강내, 피내 또는 피하 경로를 통한 주사 또는 경구/영양기, 호흡기, 뇨생식기로의 점막 투여를 포함할 수 있다. 본 발명의 백신은 단일 용량으로서 투여될 수 있지만 이의 성분들은 또한 동일한 시점에서 또는 상이한 시점에서 함께 동시 투여될 수 있다. 또한 본 발명의 백신은 프라이밍 용량에 대한 IM 및 부스터 용량에 대한 IN으로 투여될 수 있다.
백신내 단백질 항원의 함량은 전형적으로 1 내지 500μg, 바람직하게는 5 내지 350μg, 가장 전형적으로는 5 내지 300μg 범위이다. 초기 백신 접종 후, 피검체는 적당한 간격에서 하나 이상의 부스터 면역화를 받을 수 있다.
백신 제제는 일반적으로 문헌[참조: Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach" (eds Powell M. F. & Newman M.J.) (1995) Plenum Press New York)]에 기재되어 있다. 리포좀내 캅셀화는 문헌[참조: Fullerton, 미국 특허 제 4,235,877호]에 기재되어 있다.
각각 백신 용량에서 각각의 항원의 양은 전형적인 백신 접종 수용자에게서 상당한 부작용 없이 면역보호 반응을 유도하는 양으로서 선택된다. 사용되는 특이적 면역원 및 이것의 제공 방식에 따라 당해 양은 다양할 것이다.
추가의 양태에서, 실질적으로 본원에 기재된 바와 같은 조성물을 투여하여 질환에 민감하거나 이를 앓고 있는 개체를 치료하는 방법이 제공된다.
또한, 실질적으로 본원에 기재된 조성물을 개체에 투여함을 포함하는, 감염성 세균 및 바이러스 질환, 기생충 질환, 특히, 세포내 병원성 질환, 증식성 질환, 예를 들어, 전립선암, 유방암, 결장직장암, 폐암, 췌장암, 신장암, 난소암 또는 흑색종 암; 비암성 만성 장애, 알레르기를 포함하는 그룹으로부터 선택된 질환에 걸리지 않도록 개체를 예방하는 방법이 제공된다..
추가의 양태에서, 병태 또는 질환의 예방적 치료 또는 치료에 사용하기 위한 백신 조성물이 제공되고, 여기서, 백신 조성물은 복합체 형태로 하나 이상의 리포좀 및 하나 이상의 항원을 포함하고 여기서, 항원 및 리포좀은 중간 링커를 사용하여 연결된다.
추가의 양태에서, 병태 또는 질환의 예방적 치료 또는 치료에 사용하기 위한 약물의 제조에 있어서의 백신의 용도가 제공되고, 여기서, 백신은 실질적으로 본원에 기재된 바와 같은 조성물을 포함한다.
본 발명은 하기의 비제한적인 실시예를 참조로 추가로 기재될 것이다:
실시예
I- 중간 링커를 통해 항원에 연결된 리포좀의 제형.
I.1. p27 항원의 GpC - SH 단일 가닥 ODN ( 데옥시올리고뉴클레오타이드 )으로의 접합.
방법:
I.1.1. N- 에틸말레이미드(NEM)을 사용한 Ag 의 - SH 기능의 차단
p27 항원은 말레이미드와 반응할 수 있는 내인성 -SH를 함유한다. 상기 SH와 말레이미드의 미성숙한 반응을 회피하기 위해 이것은 화학적으로 차단된다.
Figure pct00001
따라서, P27 (SIV)을 1시간동안 교반하에 실온에서 25배 몰과량의 N-에틸말레이미드(Sigma, MW 125.12)과 항온처리하였다. 과량의 시약을 용출 완충액으로서 100mM 포스페이트 pH 6.8을 사용하는 PD10 칼럼(Amersham)상에서 제거하였다. 1ml의 분획을 수거하고 280nm에서의 흡광도로 모니터하였다. NEM 변형된 p27을 함유하는 분획은 모으고 로우리법으로 단백질 함량을 분석하였다. 반응의 효능은 엘만법으로 평가하였다.
정제된 항원을 함유하는 분획 2-4를 수거하고 모았다.
직접적인 엘만 분석은 모은 분획에 대해 수행하여 모든 SH 기능이 차단되었음을 입증하였다.
I.1.2. P27 의 활성화
약 1.1mg/ml에서 8.7 ml의 SH-차단된 p27 (NEM 변형된 p27)을 S-GMBS/p27 몰비 6에서 1시간동안 (RT, 자기 교반)(N-[γ-말레이미도부티릴옥시설포-숙신이미드 에스테르, Pierce) 항온처리하였다. 부산물 및 과량의 시약은 PD10 칼럼(Amersham) 및 용출 완충액으로서 100mM 포스페이트 pH 6.8을 사용하여 제거하였다. 1ml의 분획을 수거하고 280nm에서의 흡광도로 측정하였다. 말레이미드-활성화된 p27을 함유하는 분획을 모았다. 단백질 함량은 로우리법으로 평가하였다. p27에 대한 말레이미드 작용기의 수는 간접 엘만법으로 평가하였다(2.4 말레이미드 분획이 검출됨). S-GMBS N-(감마-말레이미도부티릴옥시- 숙신이미드 에스테르)는 한 측면상에 숙신이미드 작용기 및 다른 측면상에 말레이미드를 함유하는 이작용성 시약이다. 숙신이미드는 -NH 작용기(예를 들어, 단백질의 알칼린 아미노산의 작용기)와 반응하고 말레이미드는 설프하이드릴 그룹(-SH)와 반응한다.
로우리법을 사용한 풀에서 p27의 정량은 총 5.6ml에 대해 1.33mg/ml임을 밝혔다. 간접적인 엘만 분석을 적용하여 활성화 수율을 입증하였다. 상기 데이타는 6의 S-GMBS/p27 비가 단백질 당 평균 2개의 작용기를 활성화시킴을 보여주었다. 겔 전기영동은 상기 비율이 상대적으로 균일하게 p27 집단이 균일하게 활성화되도록 함을 보여주었다. 보다 높은 비율을 사용하면 (7.5 및 15) 특정 패턴의 고분자량의 밴드를 생성시키고 이는 여러 단백질의 가교 결합이 존재할 수 있음을 시사한다(데이타는 나타내지 않음). 따라서, 6몰 비가 추가의 실험을 위해 선택되었다.
I.1.3. p27 항원 및 GpC - SH ODN 의 접합
Figure pct00002
말레이미드-활성화된 p27은 pH 6.8의 포스페이트 완충액중에서 3.6배 몰 과량의 GpC-SH[제조원(Eurogentec)으로부터 시판됨, 말레이미드 작용기의 수와 비교하여 1.5배 몰 과량; 3' 말단에 티올 그룹을 갖는 서열번호 4에 나타낸 것에 상보적인 서열의 포스포디에스테르 올리고뉴클레오타이드]. 실온에서 1시간 후, 시스테인(Merck, 4 mg/ml)을 첨가하여 상기 반응을 켄칭시키고,즉, 이어서 비반응 말레이미드 작용기를 과량의 시스테인을 사용하여 중화시켰다. 과량의 GpC는 2mM 포스페이트 완충액 150mM NaCl pH 6.8에 대해 투석하여 제거하였다. 그러나, SDS-PAGE에 의한 분석은 유리된 단백질및 유리된 GpC가 여전히 접합체중에 존재함으로써, 이것이 겔 여과(Superdex 75)에 의해 정제됨을 보여준다. 용출은 2mM 포스페이트 150mM NaCl pH 6.8에서 수행하였다. 1ml의 분획을 수거하고 260 및 280nm에서의 흡광도로 모니터하였다. 접합체만을 함유하는 분획을 모았다.
도 1 (쿠마시 블루 염색)은 분획 21 내지 23이 p27-GpC 접합체를 함유하고, 분획 24, 25는 비접합된 p27 및 p27-GpC 접합체의 혼합물을 함유하고 다른 분획은 단지 비접합된 p27을 함유함을 보여준다. 도 2(에티디움 브로마이드 또는 BET 염색)는 유리된 GpC가 분획 24 내지 29에 나타남을 보여준다.
이어서 분획 24-26은 Superdex 75 칼럼을 사용한 제2 정제 단계에 적용하였다. 이어서 접합체만을 함유하는 분획을 모으고 분획 21 내지 23과 혼합하여다. 최종 풀은 SDS-PAGE 및 쿠마시 염색으로 분석하여다. 42 kDa 밴드가 겔상에서 관찰되고 이는 평균적으로 2개의 GpC 올리고가 각각 p27 단백질에 연결됨을 지적한다.
접합체는 사용때까지 -20℃에서 저장하였다.
I. 2. 상보적인 CpG - SH 올리고로의 리포좀의 접합
CpG-SH 올리고(3' 말단에 티올 그룹을 갖는 서열번호 4에 나타낸 바와 같은 서열의 포스포디에스테르 CpG)를 리포좀의 표면상으로 공유적으로 부착시키기 위해, POPE-MAL 지질 유도체(이의 극성 헤드 그룹에 말레이미드가 부착된 POPE)가 혼입된 변형된 리포좀을 제조하였다. 사용된 방법(지질 필름 수화)은 이하게서 기재한다.
DOPC (8.7 mg), 콜레스테롤(2.5 mg), 3D-MPL (0.5 mg) 및 POPE-MAL [N-(3-말레이미도-1-옥소프로필)L-α-포스파티딜에탄올아민, 1-팔미토일-2-올레일, 제조원: NOF American corporation] (DOPC 약 10% 몰을 나타내는 1.3 mg)을 2ml의 클로로포름중에서 가용화시켰다. 이어서 클로로포름을 질소 기류하에 증발시키고 3시간 동안 진공하에서 건조시켰다. 무수 지질 필름을 7.5mg의 CpG-SH(POPE-MAL에 비해 CpG-SH가 1.5배 몰 과량임을 나타냄)을 함유하는 1ml의 10mM PO4-150mM NaCl, pH 7.2과 함께 첨가하였다.
상기 형성된 지질 필름을 이어서 지질 필름이 완전히 재현탁될때까지 수화 매질중에서 와동시켰다. 수화 매질에서 CpG-SH의 존재는 차라리 불안정한 말레이미드 작용기의 분해 전에 SH와 말레이미드간에 반응이 일어나도록 하였다. 상기 용액을 프로브 초음파 처리기(50 W)를 사용하여 2분동안 초음파 처리함으로써 SUV(단일의 1층 라멜라 소포)를 수득하고 이어서 자기 교반하에 40℃에서 1시간동안 항온처리하였다.
항온처리말기에, CpG-혼입 리포좀을 초원심분리(4℃에서 200,000g, 1시간)에 의해 유리된 CpG-SH로부터 정제하였다. 상기 상등액(유리된 CpG를 함유)을 제거하고 펠렛(리포좀-CpG 함유)을 100㎕의 완충액중에 재현탁시켰다. 최종 단계로서, 리포좀의 표면에 비반응된 말레이미드 작용기를 30분동안 RT에서 시스테인(25몰 과량)을 사용하여 켄칭시켰다. 리포좀을 다시 펠렛화하여 과량의 시스테인을 제거하고 100㎕의 완충액중애 재현탁시켰다.
2회의 초원심분리로부터의 펠렛 및 상등액은 3% 아가로스 겔 전기영동 및 에티디움 브로마이드를 사용한 염색으로 분석하여 CpG의 존재를 검출하였다(데이타는 나타내지 않음).
I. 3. 리포좀 및 p27 의 하이브리드화
리포좀상으로 GpC 접합된 p27가 연합되도록 하기 위해, 하이브리드화 단계는 전형적으로 다음과 같이 수행하였다. 이를 위해, 1.5ml의 리포좀-CpG 접합체(15 mg/ml DOPC) 및 3 ml의 p27-GpC 접합체 (0.5 mg/ml p27)를 PBS 완충액(pH 7.4)중에서 혼합하고 37℃에서 30분동안 항온처리하였다. DNA 하이브리드화를 통한 리포좀-CpG상으로의 p27-GpC의 특이적 결합을 확신하기 위한 대조군으로서, p27-GpC는 표면에 CpG 올리고 결핍된 리포좀과 병행하여 항온처리하였다.
이어서 시험군 및 대조군 둘다는 초원심분리하여 p27-결합된 리포좀(펠렛)과 유리된 p27-GpC(상등액)이 분리되도록하였다. 이어서 펠렛 및 상등액은 SDS-PAGE 및 쿠마시 염색으로 분석하였다. 2개의 대표적인 실험에 대한 데이타는 도 3A 및 3B에 나타낸다. 대다수의 p27은 시험군의 경우에 펠렛에서 검출되었지만 대조군에서는 검출되지 않았는데 이는 리포좀의 표면에서 CpG 올리고의 존재가 p27이 리포좀에 효율적으로 연합되도록 함을 시사한다.
QS21을 하이브리드화 후 100㎍의 농도까지 면역원성 조성물에 첨가하였다. 상기 제형을 표 1 및 첨부된 박스에 설명된 바와 같이 "P27-GpCCpG-ASA*"로 지정하였다.
중요하게도, 면역화 실험을 위해, 하이브리드화로부터 비롯된 혼합물을 연합되지 않은 p27-GpC의 제거 없이 주사하였다.
올리고뉴클레오타이드 링커에 의해 항원에 연결된 리포좀의 생체내 시험
물질 및 방법
시약 및 배지
하기에 요약되고 기재된 제형을 사용하여 6 내지 8주령 C57BL/B6 (H2Kb), 암컷 마우스(10/그룹)에 백신 접종하였다. 마우스에 14일 간격으로 2회 주사하고 4, 5 및 6주 동안 채혈하였다(실제 채혈 일자에 대해 도 4를 참조한다). 마우스에 이전 방식 제형을 근육내 백신 접종하였다(50㎕의 최종 용적으로 좌측 비복근에 주사). SIV-p27 단백질을 암호화하는 재조합 아데노바이러스를 사용하여 이종성 프라임 부스트하고 보조제화된 p27을 대조군 그룹으로서 사용하며 상기 아데노바이러스를 5 x 108 VP의 용량으로 주사하였다. 상기 연구 디자인은 도 4에 나타낸다.
생체내 시험된 제형의 요약
하기의 표 (표 1)는 대조군 제형을 포함하는 모든 시험된 제형을 요약한다. 발명의 조성물을 중점으로 한다.
Figure pct00003
사용되는 보조제 항원 배합 전략 및 특히 대조군 그룹의 디자인을 명확하게 하기 위해, 하기에 기호 설명표를 제공하여 당업자가 각각의 제형의 함량을 용이하게 결정하고 본원의 내용과 도면을 연관지울 수 있게 한다. 하기의 기호 설명표는 표 1, 본원의 내용 및 하기의 도면에서 언급된 제형을 명확히한다.
Figure pct00004

II - 1.1 대조군 제형의 제조
II - 1.1.1 ASA -함유 제형.
지질(예를 들어, 난황 또는 합성 기원의 포스파티딜콜린) 및 콜레스테롤 및 유기 용매중의 3D-MPL을 진공하에(또는 불활성 가스 기류하에) 건조시켰다. 이어서 수용액(예를 들어, 포스페이트 완충 식염수)을 첨가하고 모든 지질이 현탁될때까지 용기를 진탕시켰다. 이어서 상기 현탁액을 리포좀 크기가 약 100nm로 감소할때까지 미세유동화시키고 이어서 0.2 μm 필터를 통해 멸균 여과시켰다. 전형적으로 콜레스테롤:포스파티딜콜린 비율은 1:4 (w/w)이고, 수용액을 첨가하여 최종 콜레스테롤 농도가 5 내지 50mg/ml이 되도록 하였다. 리포좀은 100nm의 한정된 크기를 갖고 SUV(소형 단일층 소포)로 언급된다. 수용액중 QS21은 SUV에 첨가하였다. PBS 조성은 Na2HPO4: 8.1 mM; KH2PO4: 1.47 mM; KCl: 2.7 mM; NaCl: 137 mM pH 7.4이었다. 상기 혼합물은 ASA로서 언급된다. 상기 ASA는 p27 항원의 존재하에 희석하여 p27, 3 D-MPL 및 QS21이 모두 최종 농도가 100 μg/ml이 되도록 하였다. 상기 제형을 "p27 + ASA"로 지정하였다.
II -1.1.2. DOTAP 함유 리포좀 또는 PEI (폴리에틸렌이민) 중합체로의 p27 의 연합.
DOTAP 함유 리포좀을 제조하기 위해, 몰비 1/1의 DOTAP(N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필)]-N,N니트리메틸암모늄 메틸설페이트) 및 DOPE (디올레오일포스파티딜에탄올아민)을 클로로포름중에 혼합하고 용매를 질소 기류하에 증발시켜 액체 필름을 수득하였다. 상기 필름은 50mM Hepes 및 6% 슈크로스 pH 7.4를 함유하는 완충액으로 수화시켜 DOTAP 최종 농도가 20mg/ml에 도달하게 하였다. 수득된 소포를 400nm에 이어서 100nm의 폴리카보네이트 막을 통해 압출시켰다.
p27/DOTAP-DOPE 복합체를 제조하기 위해, 200 μg/ml에서 2 ml의 p27를 4 mg/ml의 DOTAP 농도에서 2ml의 DOTAP/DOPE 리포좀과 혼합하고 혼합물이 30분동안 실온에서 항온처리되도록 방치하였다. 상기 혼합물의 완충액 조성은 Hepes: 5 mM; 슈크로스: 9%; pH 7.4이었다. 연합 효율을 평가하기 위해, 리포좀을 200,000g에서 초원심분리하여 펠렛화하고 p27는 변형된 로우리 과정을 사용하여 펠렛 및 상등액중에서 분석하였다. 상기 실험에서 연합 수율은 p27의 약 60 내지 70%가 리포좀에 결합되는 것으로 평가되었다. 상기 제형은 "p27-+DOTAP"로 지정한다.
PEI (MW = 750 KD)를 pH 6.8에서 50mM + 6% 슈크로스중에 가용화시켰다. p27/PEI 복합체를 제조하기 위해, 50mM Hepes, 6% 슈크로스, pH 6.8중의 200㎍/ml에서 2 ml의 p27를 50mM Hepes, 6% 슈크로스, pH 6.8중의 2ml의 PEI와 혼합하고 혼합물이 30분동안 RT에서 항온처리되도록 방치하였다. 상기 제형을 "p27-+PEI"로 지정한다.
ASA 보조제를 마우스로 투여하기 전에 이들 2개의 제형에 혼합하여 ASA 농도가 다른 그룹에에 대해 사용되는 것과 동일하도록 하였다.
II -1.2 기관 수거
II - 1.2.1 PBL 분리
안와정맥으로부터 채혈하고(마우스당 50 μl, 그룹 당 10마리의 마우스) RPMI + 헤파린(LEO) 배지에 직접 희석하였다. PBL을 림포프렙 농도(CEDERLANE)를 통해 분리하였다. 이어서 세포를 세척하고 계수하고 최종적으로 애드 혹(ad hoc) 희석으로 애드 혹 완충액중에 재현탁시킨다(하기 참조).
II - 1.2.2 비장 세포 분리
간략하게, 총 세포를 비장을 분쇄하여 추출하였고 이어서 세포를 대용량의 RPMI(35ml내 5개 비장)내에서 재현탁시킨다. 비장 세포를 림포프렙 농도구배(CEDERLANE)를 통해 분리한다. 이어서 림프구를 세척하고 계수하고 최종적으로 애드 혹 희석으로 애드 혹 완충액중에 재현탁시키고 CMC 분석에서 표적 세포로서 추가로 사용하였다.
II - 1.2.3 림프절 세포 분리
간략하게, 인출된 림프절을 분쇄하여 총 세포를 추출한다. 이들 세포를 주의깊게 2회 세척하고 계수하여 최종적으로 애드 혹 희석으로 애드 혹 완충액중에 재현탁시켜 CMC 분석에서 표적세포로서 추가로 사용하였다.
II - 1.3 면역학적 분석
II - 1.3.1 세포내 사이토킨 염색 ( ICS ).
ICS를 상기된 바와 같이 채혈된 샘플에 대해 수행하였다. 상기 분석은 2개의 단계를 포함한다: 생체외 자극 및 염색. 생체외 림프구 자극은 5% FCS(Harlan, Holland), 1 μg/ml의 각각 항 마우스 항체 CD49d 및 CD28 (BD, Biosciences), 2 mM L-글루타민, 1 mM 나트륨 피루베이트, 10 μg/ml의 스테렙토마이신 설페이트, 10 단위/ml의 페니실린 G 나트륨 (Gibco), 10 μg/ml의 스트렙토마이신 50 μM B-ME 머캅토에탄올 및 100X 희석된 비필수 아미노산이 보충된 RPMI 1640(Biowitaker)인 완전 배지에서 수행하고, 모든 이들 첨가제는 제조원[Gibco Life technologies]으로부터 기원한다. 펩타이드 자극은 항상 37℃, 5% CO2에서 수행한다.
단계 1 : 생체외 자극 (SIV-p27 모델)
생체외 자극을 위해, 5 내지 10 105 PBL은 각각에 대해 1 μg/ml의 농도로 존재하는 59 15-량체 SIV-p27 펩타이드 (각각 11개 아미노산이 중첩되고 Neosystem으로부터 구입한 상이한 MHC 부류 I-제한된 펩타이드 및 MHC 부류 II 제한된 펩타이드를 포함한다)의 풀이 보충된 완전 배지에 재현탁시켰다. 2시간 후, 1 μg/ml의 브레펠딘-A (BD, Biosciences)을 16시간 동안 첨가하고 총 18시간 후 세포를 수거하였다.
단계 2: 염색
자극 후 직접, PBL을 염색시킨다. 간략하게, 세포를 1회 세척함에 이어서 모두 제조원[BD, Biosciences]에서 구입한 항-마우스 항체를 사용하여 염색시키고 모든 추가의 단계는 빙상에서 수행하였다. 상기 세포를 먼저 10분동안 50μl의 CD16/32 용액(1/50 f.c, FACS 완충액)중에서 항온처리하였다. 50μl의 T 세포 표면 마커 혼합물을 첨가하고(1/100 CD8a perCp, 1/100 CD4 APC Cy7) 상기 세포를 세척하기 전에 20분동안 항온처리하였다.. 세포를 200μl의 침투/고정 용액(BD, Biosciences)중에서 고정하고 침투성이 되게하고, 침투/세척 완충액(제조원: BD, Biosciences)중에서 1회 세척한 후 2시간 또는 밤새 항 IFNg-APC, 항 TNFa-PE 및 항 IL2-FITC를 사용하여 4℃에서 염색시켰다. CELLQuest™ 소프트웨어와 함께 FACS Calibur™를 사용하여 데이타를 분석하고, 생존 CD8 게이트내 15000건의 반응을 시험당 획득한다.
II - 1.3.2 생체내에서 검출된 세포 매개 세포독성 활성( 생체내 CMC )
생체내 항원 특이적 세포독성을 평가하기 위해, 면역화된 마우스 및 대조군 마우스에 항원 특이적 및 비특이적 표적의 혼합물(비율 1/1)을 주사하였다. 동종 비장세포 및 림프절 세포에 전체 SIV-p27 단백질을 포함하는 59개 15량체 펩타이드 풀 1 μg/ml를 로딩하거나 하지 않고 이어서 이들을 각각 저용량 및 고용량의 CFSE로 표지시킨다. 차등 표지화를 위해, 카복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르(CFSE; 분자 프로브 - Palmoski ef a/.; 2002, J. Immunol. 168, 4391-4398)를 0.2μM 또는 2.5 μM의 농도로 사용하였다. 2개 유형의 표적을 1/1 비율로 모으고 ml당 108개 표적의 농도로 재현탁시켰다. 200μl의 표적 혼합물을 2번째 주사한 후 21일째에 마우스당 꼬리 정맥에 주사하였다. 세포독성은 표적 주사 24시간 후 희생된 동물로부터 채혈한 혈액(경정맥)에 대해 FACSR 분석으로 평가하였다. p27 특이적 표적 세포의 평균 % 용해는 하기의 식을 사용하여 항원-음성 대조군에 상대적으로 계산하였다:
용해 % = 100 - (보정된 표적(+)/대조군 표적(-) x 100)
보정된 표적 (+) = 표적 (+) x (예비주사-)/(예비주사 +)
예비 주사된 표적 세포 = 생체내 주사 전 FACS에 의해 획득된 펩타이드-펄스된 표적(예비주사 +) 및 비-펄스된(예비주사 -1) 표적의 혼합물.
보정된 표적 (+) = 예비주사된 혼합물에서 예비주사 + 세포의 수를 고려하기 위해 보정된, 생체내 주사 후 FACS에 의해 획득된 펩타이드-펄스된 표적의 수 (상기 참조).
II - 1.3.3 항원 특이적 항체 역가 : 특이적 IgG 의 ( 풀링된 ( pooled )) 혈청 분석( pooled )( ELISA ).
혈청학적 분석은 2번째 주사 후 2주째에 평가하였다. 마우스(그룹당 10마리의 마우스)에서 정맥내(retro-orbital) 천공하여 채혈하였다.
사용된 플레이트는 96웰 플레이트(제조원: NUNC, 면역흡착 플레이트)이고, 이들의 피복물은 동물 모델에 따라 상이하다.
SIV-p27 모델에 대해: 항-SIV-p27 총 IgG는 ELISA로 측정하였다. 96 웰 플레이트를 4℃에서 밤새 항원으로 피복시켰다(PBS중 SIV-p27 용액 5μg/ml의 웰 당 100㎕). 확인 단계는 다음과 같이 구성하였다: 플레이트를 이어서 세척 완충액(PBS/0.1% Tween 20(Merck))중에서 세척하고 37℃에서 1시간동안 200 μl의 포화 완충액(PBS/0.1% Tween 20/1% BSA)으로 포화시켰다. 포화 완충액을 제거하고 100 μl의 희석된 마우스 혈청을 첨가하고 37℃에서 또 다른 60분동안 항온처리하였다. 3회 세척 후, 플레이트는 포화 완충액중에서 1000배 희석된 100 μl의 비오티닐화된 항-마우스의 총 IgG과 함께 37℃에서 1시간동안 항온처리하였다. 항온처리 후 96웰 플레이트를 상기된 바와 같이 다시 세척하였다. 포화 완충액중에서 1000배 희석된 스트렙타비딘 퍼옥시다제(Amersham) 요액을 첨가하였다(웰당 100 μl). 마지막 세척은 세척 완충액중에서 5단계 세척이었다. 최종적으로, 웰당 100 μl의 OPDA (37.5 μl ml 시트레이트 de Na - 0.05% tween - pH4.5 + 15 mg OPDA + 37.5 μl H2O2 임시 첨가됨)을 첨가하고 플레이트를 실온에서 20분동안 암실에 방치하였다. 반응을 종료시키기 위해, 100 μl의 H2SO4 2N을 웰당 첨가하였다. 흡광도는 엘리자 플레이트 판독기(제조원: BIORAD)에 의해 490/630nm의 파장에서 판독하였다. 결과는 Softmax-pro 소프트웨어를 사용하여 계산하였다.
II - 2 결과
II - 2.1 생체외 검출된 사이토킨 생산 T-세포( ICS )
도 5는 2번째 주사한지 7일 후 상이한 그룹에 대해 검출된 사이토킨 생산 CD8+ T-세포 빈도를 설명한다.
1차 CD8 반응은 매우 낮았다(데이타는 나타내지 않음). 이어서 도 8에 보고된 2차 반응은 1차 반응의 명백한 부스트의 결과였다. 7일 후 2, CD8 빈도는 유리된 p27 및 ASA(P27+ASA)를 함유하는 제형을 투여받은 마우스에 대해서 매우 낮았다. p27이 DNA 하이브리드화 (P27--GpCCpG - ASA*)를 통해 리포좀의 표면으로 결합하는 경우, CD8 반응은 P27 + ASA에 비해 명백히 증가하였고, 이것은 리포좀상으로의 p27의 결합이 CD8+ T-세포 반응에 대해 명백히 증진된 효과를 가짐을 보여준다. 올리고 하이브리드화를 통한 항원/리포좀 연합이 가능하지 않은 대조군 제형은 다음과 같다: POPE-MAL-함유 리포좀을 포함하지만 CpG가 결합되지 않은 제형(p27 + ASA*), 또는 CpG와 연합된 리포좀을 함유하지만 p27이 변형되지 않은 제형(p27 + ASA*--CpG), 또는 Gpc가 p27에 접합되어 있지만 이들의 표면에 CpG가 결핍된 리포좀을 갖는 제형(p27--GpC + ASA*). 모든 이들 대조군 제형은 매우 낮은 CD8 반응을 유도하였다(< 0.5%). 이것은 CD8 반응 개선이 명백하게 하이브리드화를 통한 p27의 리포좀으로의 연합을 요구하는 것이지 항원 및/또는 리포좀의 화학적 변형으로 인한 것이거나 리포좀으로 결합된 변형된 CpG의 단독의 존재 때문이 아님을 시사한다. 결론적으로, 전체 데이타는 개선된 CD8 반응이 상보적인 올리고뉴클레오타이드를 통해 면역자극제 MPL 및 QS21 함유 리포좀으로 항원이 결합함에 의해 성취될 수 있음을 보여준다. 양이온성-지질(ASA와 함께 (p27-+DOTAP)) 또는 양이온성 중합체(ASA와 함께 (p27-+PEI))을 함유한 제형이 주사된 어떠한 마우스도 p27-특이적 CD8+ T-세포의 검출가능한 빈도를 유도하지 않았다. 이들 후자 데이타는 DOTAP 리포좀 또는 PEI 중합체와 같은 미립자 시스템으로 이온 상호작용을 통한 항원의 연합이 CD8을 유도하는데 충분하지 않음을 지적하고 따라서 항원이 올리고뉴클레오타이드 하이브리드화를 통해 ASA에 연합되는 경우 관찰된 개선된 CD8 반응은 단순히 항원의 미립자화 때문이 아님을 시사한다.
도 6은 제2 주사 후 7일째 상이한 그룹에 대해 검출된 사이토킨 생산 CD4+ T- 세포 빈도를 설명한다. CD8 반응에 대해 관찰된 바와 같이, 1차 CD4 반응은 매우 낮았다(데이타는 나타내지 않음). 이어서 도 9에 보고된 반응은 면역 반응의 명백한 부스트 결과이다. 상기 데이타에 대해 7일 후 2일에서, 하이브리드화를 통한 항원의 리포좀으로의 연합이 또한 CD4 반응에 대해 양성 효과(p27 + ASA 및 P27--GpCCpG-ASA*와 비교하여)를 가짐을 보여준다. CD8 반응과 관련하여, 대조군 제형은 CD4 반응의 증진이 단백질의 변형(p27-GpC + ASA*) 또는 리포좀의 단독의 변형(P27 + ASA*) 또는 리포좀에 결합된 CpG의 단독의 존재(P27 + ASA*-CpG)때문이 아니었음을 보여주었다. 양이온성 지질(ASA와 함께 (p27-+DOTAP)) 또는 양이온성 중합체(ASA와 함께 (p27-+PEI))를 함유하는 제형이 주사된 어떠한 마우스도 p27 특이적 CD4+ T-세포의 검출가능한 빈도를 유도하지 못하였다.
II - 2.2 생체내 검출된 세포독성 활성 ( CMC )
도 7은 2번째 주사 후 21일째에 생체내 검출된 세포독성 활성을 설명한다. PBL은 표적 세포를 주사한지 24시간 후에 분석하였다(상세한 내용은 물질 및 방법 참조). p27이 DNA 하이브리드화를 통해 리포좀의 표면으로 결합된 제형(P27~GpCCpG - ASA*)은 유리된 p27 및 ASA를 함유하는 제형 (p27 + ASA) 보다 높은 세포독성 활성을 유도하였다. 대조군 그룹(p27-GpC + ASA*, P27 + ASA*, P27 + ASA*-CpG)의 어떠한 것도 P27--GpCCpG - ASA* 제형에 의해 유도된 것 만큼 높은 세포독성 수준을 유도하지 못하였다. 양이온성 지질(ASA와 함께 (p27-+DOTAP)) 또는 양이온성 중합체(ASA와 함께 (p27-+PEI))와 연합된 항원을 함유하는 제형이 주사된 어떠한 마우스도 생체내 검출가능한 세포독성 활성을 유도하지 못하였다.
II - 2.3 항원 특이적 항체 역가 : 특이적 IgG 의 ( 풀링된 ( pooled )) 혈청 분석( ELISA ).
도 8은 2번째 주사한지 14일째에 수거된 개별 혈청에서 검출된 항-p27 IgG 역가를 설명한다. P27-특이적 항체 역가는 DNA 하이브리드화를 통한 항원의 리포좀으로의 연합시 증가된다. 여기서, 변형된 p27 및 ASA를 함유하는 제형(P27-GpC + ASA*)은 항체 반응을 개선시킬 수 있었다. 양이온성 지질(ASA와 함께 (p27-+DOTAP)) 또는 양이온성 중합체(ASA와 함께 (p27-+PEI))를 함유하는 제형이 주사된 어떠한 그룹도 p27+ ASA가 투여된 마우스에서 관찰된 것 보다 높은 항체 역가를 유도하지 못하였다.
CpG 모티프가 없는 올리고뉴클레오타이드(서열번호 7 GGTGTGTGCATTGCTTGGTGGTGG 및 이의 상보적 서열)를 포함하는 면역원성 조성물을 또한 시험하였다. 하이브리드화가 입증된 샘플에 대해 이것이 통계학적으로 유의적이진 않지만 비-하이브리드화된 대조군에 비해 면역 반응이 증진되는 경향이 있었다.
SEQUENCE LISTING <110> Elouahabi, Abdelatif Biemans, Ralph <120> Vaccine <130> VB62736 <160> 7 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 1 tccatgacgt tcctgacgtt 20 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 2 tctcccagcg tgcgccat 18 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 3 accgatgacg tcgccggtga cggcaccacg 30 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 4 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 5 tccatgacgt tcctgatgct 20 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 6 tcgacgtttt cggcgcgcgc cg 22 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 7 ggtgtgtgca ttgcttggtg gtgg 24

Claims (49)

  1. 하나 이상의 항원 전달 입자 및 하나 이상의 항원을 포함하는 면역원성 조성물로서, 상기 항원 및 항원 전달 입자가 중간 링커를 사용하여 연결된 면역원성 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 항원 전달 입자가 리포좀, ISCOM, 수중유 에멀젼내 오일 소적, 마이크로입자, 나노입자 또는 오일 소적으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 면역원성 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항원 전달 입자가 리포좀인 면역원성 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항원 전달 입자가 ISCOM인 면역원성 조성물.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항원 전달 입자가 수중유 에멀젼내 오일 소적인 면역원성 조성물.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항원 전달 입자가 마이크로입자인 면역원성 조성물.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항원 전달 입자가 나노입자인 면역원성 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 서로 상보적인 2개 이상의 성분을 포함하고 제1 링커 성분이 항원 전달 입자에 연결되고 제1 링커에 상보적인 제2 링커 성분이 항원에 연결된 면역원성 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 2개의 상보적인 링커 성분이 함께 연결되고/되거나 하이브리드화된 면역원성 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 중간 링커가 한쌍 이상의 상보적인 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 면역원성 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 제1 올리고뉴클레오타이드가 항원 전달 입자에 연결되고 제1 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 제2 올리고뉴클레오타이드가 항원에 연결된 면역원성 조성물.
  12. 제10항에 있어서, 하나 이상의 항원이 상보적인 올리고뉴클레오타이드의 하이브리드화를 통해 하나 이상의 항원 전달 입자에 연결된 면역원성 조성물.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드가 DNA, RNA 및 PNA의 그룹으로부터 선택되는 면역원성 조성물.
  14. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드가 DNA인 면역원성 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드가 포스포로티오에이트 골격을 포함하는 면역원성 조성물.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드가 하나 이상의 CpG 모티프를 포함하는 면역원성 조성물.
  17. 제14항 또는 제15항에 있어서, 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드가 하나 이상의 CpG 모티프를 포함하지 않는 면역원성 조성물.
  18. 제16항에 있어서, 하나 이상의 CpG 모티프를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열이 서열번호 4의 서열(ODN 2006)을 포함하는 면역원성 조성물.
  19. 제10항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드가 항원 전달 입자/및또는 항원으로 접합되는 것이 촉진되도록 상기 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드가 변형된 면역원성 조성물.
  20. 제10항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드가 티올(SH) 그룹이 부가되어 변형된 면역원성 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 티올 그룹이 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단에 접합된 면역원성 조성물.
  22. 제10항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 항원 전달 입자가 화학적 접합에 의해 제1 올리고뉴클레오타이드에 연결된 면역원성 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 하나 이상의 항원이 제1 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 제2 올리고뉴클레오타이드에 화학적 접합에 의해 연결된 면역원성 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 하나 이상의 항원이 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드에 말레이미드를 사용한 화학적 접합에 의해 연결된 면역원성 조성물.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 면역자극제를 포함하는 면역원성 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 항원 전달 입자가 리포좀이고 하나 이상의 리포좀이 하나 이상의 면역자극제를 포함하는 면역원성 조성물.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 면역자극제가 톨형(Toll-like) 수용체 4(TLR4) 리간드; 톨형 수용체 7 및/또는 8(TLR7/8) 리간드; 톨형 수용체 9(TLR9) 리간드 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 면역원성 조성물.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 리포좀이 사포닌 및/또는 TLR4 리간드를 포함하는 면역원성 조성물.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 사포닌이 쿠일(Quil) A의 유도체인 면역원성 조성물.
  30. 제29항에 있어서, 쿠일 A 유도체가 QS21인 면역원성 조성물.
  31. 제27항 또는 제28항에 있어서, TLR4 리간드가 모노포스포필 지질 A인 면역원성 조성물.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 전달 입자가 리포좀이고 하나 이상의 리포좀이 스테롤을 포함하는 면역원성 조성물.
  33. 제32항에 있어서, 스테롤이 콜레스테롤인 면역원성 조성물.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 상이한 항원을 포함하는 면역원성 조성물.
  35. a. 제1 올리고뉴클레오타이드를 항원에 접합시키는 단계;
    b. 단계 a)에서의 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 제2 올리고뉴클레오타이드를 항원 전달 입자에 접합시키는 단계;
    c. 올리고뉴클레오타이드의 하이브리드화를 허용하는 조건하에 항원과 항원 전달 입자를 혼합하는 단계
    를 포함하는, 면역원성 조성물을 제조하는 방법.
  36. a. 적합한 시약을 사용하여 항원상의 임의의 유리된 설프하이드릴 그룹을 차단시키는 단계;
    b. 말레이미드 그룹을 상기 항원으로 부가하는 단계;
    c. 제1 티올-활성화된 올리고뉴클레오타이드를 상기 항원에 접합시키는 단계;
    d. 단계 c)의 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 제2 티올 올리고뉴클레오타이드를 말레이미드 활성화된 포스포리피드를 포함하는 리포좀에 접합시키는 단계;
    e. 올리고뉴클레오타이드의 하이브리드화를 허용하는 조건하에 항원과 리포좀을 혼합시키는 단계
    를 포함하는, 면역원성 조성물을 제조하는 방법.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 약제에 사용하기 위한 면역원성 조성물.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 질환에 민감하거나 이를 앓고 있는 사람의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 면역원성 조성물.
  39. 질환에 민감하거나 이를 앓고 있는 사람의 예방 및/또는 치료용 약제를 제조하는데 있어서, 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물의 용도.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물을 투여함에 의해 질환에 민감하거나 이를 앓고 있는 개체를 치료하는 방법.
  41. i) 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드에 연결된 하나 이상의 항원 전달 입자를 포함하는 키트.
  42. i) 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드에 연결된 하나 이상의 항원을 포함하는 키트.
  43. i) 올리고뉴클레오타이드에 연결된 하나 이상의 항원 전달 입자 및 ii) i)의 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 올리고뉴클레오타이드에 연결된 하나 이상의 항원을 포함하는 키트.
  44. 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 상이한 유형의 항원 전달 입자를 포함하는 키트.
  45. 제41항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 상이한 항원을 포함하는 키트.
  46. 제41항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 상이한 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 키트.
  47. 제41항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 면역자극제를 추가로 포함하는 키트.
  48. 제43항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 항원 전달 입자가 상보적인 올리고뉴클레오타이드의 하이브리드화를 통해 하나 이상의 항원에 연결되거나 하나 이상의 항원이 상보적인 올리고뉴클레오타이드의 하이브리드화를 통해 하나 이상의 항원 전달 입자에 연결된 키트.
  49. 제41항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 전달 입자(들) 및 항원(들)이 상보적인 올리고뉴클레오타이드를 통해 하이브리드화되지 않는 키트.


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US10047116B2 (en) 2011-10-03 2018-08-14 Mx Adjuvac Ab Nanoparticles, process for preparation and use thereof as carrier for amphipatic and hydrophobic molecules in fields of medicine including cancer treatment and food related compounds
GB201120000D0 (en) * 2011-11-20 2012-01-04 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
CA2862306C (en) 2012-01-19 2019-08-27 Duke University Vaccines against antigens involved in therapy resistance and methods of using same
CA2919268C (en) 2013-07-25 2023-09-05 Exicure, Inc. Spherical nucleic acid-based constructs as immunostimulatory agents for prophylactic and therapeutic use
CA2932122C (en) 2013-12-03 2022-04-19 Northwestern University Liposomal particles, methods of making same and uses thereof
PL3164113T3 (pl) 2014-06-04 2019-09-30 Exicure, Inc. Wielowartościowe dostarczanie modulatorów immunologicznych w liposomowych kolistych kwasach nukleinowych do zastosowań profilaktycznych lub terapeutycznych
CA2954279C (en) 2014-07-07 2023-11-14 Duke University Vaccines against an oncogenic isoform of esr1 and methods of using the same
CA2954278A1 (en) 2014-07-07 2016-01-14 Duke University Vaccines against an oncogenic isoform of her2 (erbb2) and methods of using the same
JP2018507860A (ja) 2015-02-26 2018-03-22 ザヴァックス ジェネティクス ワクチン カンパニー リミテッドＴｈｅｖａｘ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｃｏ．， Ｌｔｄ． 抗原特異的ｔ細胞反応を誘発するための、免疫原性タンパク質及びアジュバントの組み合わせを含むワクチン組成物
AU2016332266B2 (en) * 2015-09-30 2020-05-07 Shionogi & Co., Ltd. Nucleic acid derivative having immunostimulatory activity
US10940201B2 (en) 2015-09-30 2021-03-09 Shionogi & Co., Ltd. Nucleic acid derivative having immunostimulatory activity
US11253580B2 (en) 2016-01-07 2022-02-22 Duke University Cancer vaccines and methods of delivery
US11266602B2 (en) * 2016-05-16 2022-03-08 Infectious Disease Research Institute PEGylated liposomes and methods of use
WO2018039629A2 (en) 2016-08-25 2018-03-01 Northwestern University Micellar spherical nucleic acids from thermoresponsive, traceless templates
CN109715651A (zh) 2016-09-19 2019-05-03 生控基因疫苗股份有限公司 乙型肝炎治疗型疫苗
US10487143B2 (en) 2016-10-05 2019-11-26 Duke University Vaccines against HER3 antigens and methods of using the same
US11224665B2 (en) 2016-10-05 2022-01-18 Duke University Mitochondrial antiviral signaling (MAVS) protein compositions and methods of using the same
SG11201908059YA (en) * 2017-03-29 2019-10-30 Shionogi & Co Nucleic acid derivative having immunostimulatory activity
KR20200028997A (ko) 2017-07-13 2020-03-17 노오쓰웨스턴 유니버시티 올리고뉴클레오타이드-작용화된 금속-유기 프레임워크 나노입자를 제조하는 일반적이고 직접적인 방법
CN111551729B (zh) * 2020-04-27 2021-02-09 浙江正熙生物技术股份有限公司 藻红蛋白免疫荧光探针制备方法

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1404873B1 (en) * 2001-06-21 2013-05-22 Dynavax Technologies Corporation Chimeric immunomodulatory compounds and methods of using the same
US7785610B2 (en) * 2001-06-21 2010-08-31 Dynavax Technologies Corporation Chimeric immunomodulatory compounds and methods of using the same—III
KR101052996B1 (ko) * 2003-03-13 2011-07-29 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 박테리아 세포용해소에 대한 정제 공정
CA2536139A1 (en) * 2003-09-25 2005-04-07 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid-lipophilic conjugates
EP2060269A3 (en) * 2003-12-08 2009-08-19 Hybridon, Inc. Modulation of immunostimulatory properties by small oligonucleotide-based compounds
CA2574090A1 (en) * 2004-07-18 2006-12-21 Coley Pharmaceutical Group, Ltd. Methods and compositions for inducing innate immune responses
GB0427131D0 (en) * 2004-12-10 2005-01-12 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel combination
CA2591582A1 (en) 2004-12-17 2006-06-22 Dynavax Technologies Corporation Methods and compositions for induction or promotion of immune tolerance
MX2007016237A (es) * 2005-06-27 2008-03-07 Glaxosmithkline Biolog Sa Composicion inmunogenica.

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