CN103957933A - 疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于在皮肤免疫中使用的免疫原性组合物，其包含一种或多种抗原和佐剂，其中所述佐剂是免疫学活性皂苷。

Description

疫苗
技术领域
本发明提供了用于在皮肤免疫中使用的免疫原性组合物，其包含抗原和佐剂，其中佐剂是免疫学活性皂苷和/或TLR-4激动剂。
发明背景
无论是接触抗原免疫还是加强免疫，一般均存在增加患者对疫苗接种的依从性，以及提高疫苗生产和运输的易用性的需要。皮肤免疫可解决这些需求的一些，并且可以用于与佐剂组合施用抗原，以诱导抗原特异性免疫应答。
发明概述
本发明的目标是在对象中刺激针对疫苗的免疫应答。所述疫苗包含免疫原性组合物并且皮肤施用，所述免疫原性组合物包含抗原和佐剂。
免疫原性组合物中的佐剂是免疫学活性皂苷和/或TLR-4激动剂。
附图简述
图1：小鼠抗原特异性IgG
图2A：IFN-γ、TNF-α、IL-2三者阳性的CD4 T细胞(小鼠数据)
图2 B：IFN-γ、TNF-α、IL-2三者阳性的CD8 T细胞(小鼠数据)
图3：小鼠抗原特异性IgG
图4 A：IFN-γ、TNF-α、IL-2三者阳性的CD4 T细胞(小鼠数据)
图4 B：IFN-γ、TNF-α、IL-2三者阳性的CD8 T细胞(小鼠数据)
图5：尤卡坦微型猪的免疫原性数据
图6：家猪（在接触抗原和加强方案中的免疫原性）。
发明详述
本发明提供了用于在皮肤免疫中使用的免疫原性组合物，其包含一种或多种抗原和佐剂，其中所述佐剂是免疫学活性皂苷和/或TLR-4激动剂。
在另一个实施方案中提供了包含一种或多种抗原和佐剂的免疫原性组合物在制备用于皮肤免疫的药物中的用途，其中所述佐剂是免疫学活性皂苷和/或TLR-4激动剂。
在另一个实施方案中提供了皮肤免疫的方法，其包括给对象皮肤应用包含一种或多种抗原和佐剂的免疫原性组合物的步骤，其中所述佐剂是免疫活性皂苷和/或TLR-4激动剂。
本文所用的术语皮肤地意指应用抗原进入到人类皮肤的真皮和/或表皮。本发明尤其利用用于皮肤免疫的递送系统，其诱导动物或人中的免疫应答，尽管也涵盖了常规的施用方法。
包含至少一种抗原和佐剂（其中所述佐剂是免疫学活性皂苷和/或TLR-4激动剂）的免疫原性组合物的皮肤应用可以通过使用本领域技术人员已知的任何皮肤方法进行，其包括但不限于使用短针装置（包括约1至约2mm长度的针的装置）递送或使用皮肤贴剂递送。
用于与本文所描述的皮肤疫苗使用的合适的装置包括短针装置，例如在US 4,886,499、US5,190,521、US 5,328,483、US 5,527,288、US 4,270,537、US 5,015,235、US 5,141,496、US 5,417,662和EP1092444中描述的那些。皮肤疫苗也可通过限制针进入皮肤的有效穿透长度的设备施用，所述装置诸如在WO99/34850（其通过引用并入本文）中描述的那些，以及它们的功能等同物。还合适的是，通过液体喷射注射器或通过刺穿角质层并产生到达真皮的喷射的针递送液体疫苗到真皮的喷射注射装置。喷射注射装置描述于，例如US 5,480,381、US 5,599,302、US 5,334,144、US 5,993,412、US 5,649,912、US 5,569,189、US 5,704,911、US 5,383,851、US 5,893,397、US 5,466,220、US 5,339,163、US 5,312,335、US 5,503,627、US 5,064,413、US 5,520,639、US 4,596,556、US 4,790,824、US 4,941,880、US 4,940,460、WO 97/37705和WO 97/13537。同样合适的是使用压缩气体以加速粉末形式的疫苗通过皮肤的外层到真皮的弹道粉末/颗粒递送装置。此外，常规注射器可以在皮肤施用的经典曼托法（mantoux method）中使用。然而，使用常规注射器需要高度熟练的操作人员，并且因此能够在没有高度熟练的使用者的情况下准确地递送的装置是优选的。因此，在一个实施方案中，提供了本发明的用于在皮肤免疫中使用的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物不通过使用常规的注射器的曼托法施用。
在本发明的具体实施方案中，提供了包含如本文所描述的本发明的免疫原性组合物的贴剂。该贴剂将一般包括背板，其包括固体基质（如闭塞性或非闭塞外科敷料）。本发明的贴剂递送本发明的抗原和佐剂到真皮或表皮。因此，本发明的贴剂包含一个或多个适合于递送本发明的免疫原性组合物到表皮或真皮的微突出（microprojection）。在本发明的一个实施方案中，所述一个或多个微突出在10µm和2mm之间，例如20µm至500µm、30µm至1mm、100至200、200至300、300至400、400至500、500至600、600至700、700、800、800至900、100µm至400µm，尤其在约200µm和300µm之间或在约150µm和250µm之间。
在具体实施方案中，本发明的贴剂包含多个微突出。在具体实施方案中，本发明的贴剂包含在2和5000个之间的微针，例如在1000和2000个之间的微突出。
在具体实施方案中，所述微突出分开约50µm和1000µm之间的距离。
所述微突出可以是适合于刺穿角质层、表皮和/或真皮，和递送抗原和佐剂到表皮或真皮的任何形状。微突出可以做成如在例如WO2000/074765和WO2000/074766中所公开的形状。所述微突出可以具有至少3：1（高度对基底处的直径），至少约2：1或至少约1：1的高宽比。对于微突出的具体优选的形状是具有多边形的底部，例如六边形或菱形的椎体。其它可能的微突出形状显示于，例如美国公开的专利申请2004/0087992。在具体实施方案中，本发明的微突出具有朝向基底变厚的形状。
阵列中微突出的数目优选至少约100、至少约500、至少约1000、至少约1400、至少约1600或至少约 2000。鉴于它们小的尺寸，微突出的面积密度不可以特别高，但是例如每平方厘米的微突出的数目可以是至少约50、至少约250、至少约500、至少约750、至少约1000或至少约1500。
在本发明的一个实施方案中，本发明的抗原和佐剂在将贴剂置于宿主的皮肤上的5小时内，例如4小时、3小时、2小时、2小时或30分钟内递送到宿主。在本发明的具体实施方案中，本发明的抗原和佐剂在放置皮肤贴剂20分钟内，例如30秒，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19分钟内递送。
所述微突出可以由本领域技术人员已知的任何合适的材料制成。在具体实施方案中，至少部分微突出是生物可降解的，尤其是在微突出的最外层的微突出的顶端。在具体实施方案中，基本上所有的微突出是生物可降解的。如本文所用术语“生物可降解的”指在体内使用（例如插入皮肤）的预期条件下可降解，而无论生物降解机制如何。生物降解的示例性的机制包括崩解、分散、溶解、腐蚀、水解和酶促降解。通过基本上所有，其指至少70%的微突出是生物可降解的，例如至少75%、80%、85%、90%或至少95%是生物可降解的。
在具体实施方案中，生物可降解的微突出包含生物可降解的聚合物。例如，合适的生物相容的，生物可降解的或生物可腐蚀的聚合物包括聚（乳酸）（PLA），聚（乙醇酸） （PGA），聚（乳酸-共-乙醇酸）类（ PLGAs），聚酐类，聚原酸酯类，聚醚酯类，聚己内酯（PCL）类，聚酯酰胺类，聚（丁酸），聚（戊酸），聚乙烯吡咯烷酮（PVP），聚乙烯醇（PVA ），聚乙二醇（PEG），PEG-PLA、PEG-PLA-PEG、PLA-PEG-PLA、PEG-PLGA、PEG-PLGA-PEG、PLGA-PEG-PLGA、PEG-PCL、PEG-PCL-PEG、PCL-PEG-PCL的嵌段共聚物，乙二醇-丙二醇-乙二醇的共聚物（PEG-PPG-PEG，商品名Pluronic®或泊洛沙姆®），葡聚糖，羟乙基淀粉（hetastarch），四聚淀粉（tetrastarch），五聚淀粉（pentastarch），羟乙基淀粉类（hydroxyethyl starches），纤维素，羟丙基纤维素（HPC），羧甲基纤维素钠（Na CMC），热敏HPMC（羟丙基甲基纤维素），聚磷腈，羟乙基纤维素（HEC），其它多糖类，多元醇类，明胶，藻酸盐，脱乙酰壳多糖，透明质酸及其衍生物，胶原蛋白及其衍生物，聚氨酯类，和这些聚合物的共聚物和共混物。优选的羟乙基淀粉可以具有0-0.9范围中的替换度。
在具体实施方案中，微突出的生物可降解部分包含抗原和/或佐剂。所述抗原和/或佐剂可以见于不同的微突出，例如分别约90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%的微突出可以包含抗原和10%、20%、30%、40%、50%、60%或70%的微突出可以包含佐剂。在具体实施方案中，提供了包含一个或多个，尤其是多个生物可降解的包含如本文所述免疫原性组合物的微突出的贴剂。包含活性物诸如抗原的微突出的实例公开于WO2008/130587和WO2009/048607。可代谢的微针的制造方法公开于WO2008/130587和WO2010/124255。
在进一步的实施方案中，所述佐剂和抗原包被在一个或多个微突出上。包被可以通过任何本领域技术人员已知的方法进行，例如通过公开于WO06/055844，WO06/055799的方法。
所述抗原和/或佐剂可以包被在不同的微突出上，分别约90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%的微突出可以包被有抗原并且10%、20%、30%、40%、50%、60%或70%的微突出可以包被有佐剂。
本发明的贴剂可以通过任何手段应用于佩带者的皮肤，例如通过用手将贴剂置于皮肤上。在具体实施方案中，本发明的贴剂使用敷料器应用于皮肤，例如WO2008/091602中所述辅料器。具体而言，所述应用包括用于保证所述贴剂已经以足够的压力施加到皮肤以保证一个或多个微突出刺穿角质层、表皮和/或真皮的手段，例如当已施加了足够的压力时发出可听到的声音的装置。
本发明的贴剂还可以包含胶粘剂以帮助贴剂在释放/递送抗原和佐剂进入真皮和/或表皮期间保留在皮肤上。
本发明的免疫原性组合物包含抗原和佐剂两者。佐剂是免疫原性组合物的组分，其帮助诱导对抗原的免疫应答。在本发明中，所述用于在皮肤免疫中使用的免疫原性组合物，包含佐剂，其是免疫学活性皂苷和/或TLR-4激动剂。
用于在本发明中使用的免疫学地特别合适的皂苷是Quil A及其衍生物。Quil A是从南美树木石碱木（Quillaja Saponaria Molina）分离的皂苷制备物，并且首先由Dalsgaard等人在1974年（“Saponin adjuvants”, Archiv. für die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, Berlin, p243-254）描述为具有佐剂活性。Quil A的纯化的片段已通过HPLC分离，其保留佐剂活性而无Quil A相关的毒性（EP 0 362 278），例如QS7和QS21（也称为QA7和QA21）。QS-21是衍生自石碱木的树皮的天然皂苷，其诱导CD8+细胞毒性T细胞（CTLs）、Th1细胞和主要的IgG2a抗体应答并且在本发明的背景下是优选的皂苷。在本发明的具体实施方案中，免疫学活性的皂苷是QS21。具体而言，基本上纯的形式的QS21，也就是说，QS21是至少90%纯，优选至少95%纯和最优选至少98%纯。在本发明的具体实施方案中，QS21用甾醇配制。优选的甾醇包括β-谷甾醇、豆甾醇、麦角甾醇、麦角钙化甾醇与胆固醇。这些甾醇是本领域熟知的，例如胆固醇公开于默克索引，第11版，第341页，作为在动物脂肪中发现的天然存在的甾醇。在本发明的具体实施方案中，所述甾醇是胆固醇。在本发明的具体实施方案中，QS21与胆固醇的比例是在1：100和1：1之间，具体在1：2和1：10之间，例如1：5。
TLR-4激动剂是Toll样受体4的激动剂，后者是Toll样受体家族的成员。这是熟知的受体家族，其所有均在某种程度上参与免疫应答。在一个实施方案中，所述TLR-4激动剂是脂多糖，合适地脂质A的非毒性衍生物，具体是单磷酰脂质A或更具体是3-脱酰基单磷酰脂质A（3D-MPL）。
3D-MPL以名称MPL由GlaxoSmithKline Biologicals N.A.销售，并且在整个文献中称为MPL或3D-MPL。参见，例如美国专利号4,436,727、4,877,611、4,866,034和4,912,094。3D-MPL主要促进具有IFN-g（Th1）表型的CD4+ T细胞应答。3D-MPL可以根据GB 2 220 211 A中公开的方法生产。化学上，其是具有3、4、5或6条酰化链的3-脱酰基单磷酰脂质A的混合物。
可用于本发明中的其它TLR-4激动剂是氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯（AGPs），其是可从GlaxoSmithKline Biologicals S. A.获得的合成的TLR-4激动剂。合适的实例是在WO98/50399或美国专利号6303347中公开的那些（用于制备AGP的方法也被公开），合适地如在美国专利号6764840中公开的RC527或RC529或AGPs的药学可接受的盐。
在一个实施方案中，所述免疫原性组合物包含如本文所定义的免疫学活性皂苷和/或TLR-4激动剂并且无其它佐剂。在另一个实施方案中，所述免疫原性组合物包含TLR-5激动剂和一种或多种其它佐剂。在此实施方案的一个方面，所述一种或多种其它佐剂选自如本文所述的TLR-4激动剂，TLR-5激动剂、TLR7/8激动剂和如本文所述的免疫学活性的皂苷级分。
所述TLR-5激动剂可以是鞭毛蛋白或保留TLR-5激动剂活性的鞭毛蛋白的片段。所述鞭毛蛋白可以包括选自下列的多肽：幽门螺旋杆菌（H. pylori），鼠伤寒沙门菌（S. typhimurium）、霍乱弧菌（V. cholera）、粘质沙雷氏菌（S. marcesens)、福氏痢疾杆菌（S. flexneri)、梅毒螺旋体（T. pallidum）、肺炎军团菌（L. pneumophilia）、伯氏疏螺旋体(B. burgdorferei)、艰难梭状芽孢杆菌(C. difficile)、苜蓿根瘤菌(R.meliloti)、羽扇豆根瘤菌(R. Iupini)、卡氏巴尔通体(B. clarridgeiae)、奇异变形杆菌(P. Mirabilis)、枯草芽胞杆菌(B. subtilus)、单核细胞增生李斯特菌(L. monocytogenes)、铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)和大肠杆菌（E. coli)。
在具体实施方案中，所述鞭毛蛋白选自鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白B（Genbank登录号AF045151）、鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白B的片段、大肠杆菌FliC（Genbank登录号AB028476）、大肠杆菌FliC的片段、鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白FliC（ATCC14028）和鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白FliC的片段。
在具体实施方案中，所述TLR-5激动剂是如在WO2009/156405中所述的截短的鞭毛蛋白，即其中高变结构域已被缺失的鞭毛蛋白。在此实施方案的一个方面，所述TLR-5激动剂选自FliCΔ 174-400、FliCΔ 161-405和FliCΔ 138-405。
在进一步的实施方案中，所述TLR-5激动剂是如WO2009/128950中所述的鞭毛蛋白。
如果TLR-5激动剂是鞭毛蛋白的片段，可以理解所述片段将保留TLR5激动剂活性并且必须因此保留对TLR-5激活负责的其序列部分。本领域技术人员知道鞭毛蛋白的NH2和COOH末端结构域对于TLR-5相互作用和激活是重要的，尤其例如沙门氏菌中氨基酸86-92。
TLR7和8是toll样受体家族的进一步的成员。作为TLR7受体或TLR8受体或两者的激动剂的小分子是已知的。TLR7/8激动剂指可以激动（agonise）（即，增加）TLR7受体或TLR8受体或两者受体的信号传导的分子。因此在一方面，TLR7/7配体是作为TLR7激动剂而非TLR8激动剂的分子。在另一方面，TLR7/8配体是TLR8激动剂而非TLR7激动剂。在进一步的方面，TLR7/8配体作为TLR7和TLR8受体两者的激动剂发挥作用。合适的TLR7/8配体可以见于，例如WO2010/018133、WO2010048520、WO2010/018134、WO 2008004948、WO 2007034882和WO 2005092893。
在本发明进一步的方面，提供了包含一种或多种抗原和佐剂的免疫原性组合物，其用于皮肤免疫，其中所述佐剂是一种或多种TLR激动剂。在具体实施方案中，所述TLR激动剂是TLR-2激动剂或TLR7和/或TLR8激动剂。
在本发明的具体实施方案中，所述TLR激动剂是TLR2激动剂（Sabroe 等, JI 2003 p1630-5）。合适地，能够导致通过TLR-2的信号传导应答的TLR激动剂是来自结核分枝杆菌（M. tuberculosis）、伯氏疏螺旋体、梅毒螺旋体的脂蛋白、肽聚糖、细菌脂肽；来自包括金黄色葡萄球菌的物种的肽聚糖；脂磷壁酸、甘露糖醛酸、奈瑟氏菌孔蛋白、细菌菌毛、耶尔森氏菌毒力因子、CMV病毒颗粒、麻疹血凝素和来自酵母的酵母聚糖中的一种或多种。在本发明的具体实施方案中，所述TLR2激动剂是合成的脂肽Pam3Cys-Lip（参见，例如Fisette 等, Journal of Biological Chemistry 278(47) 46252）。
在可选的实施方案中，使用能够导致通过TLR-7的信号传导应答的TLR激动剂（Sabroe 等, JI 2003 p1630-5）。合适地，所述能够导致通过TLR-7的信号传导应答的TLR激动剂是单链RNA（ssRNA）、洛索立宾、在位置N7和C8的鸟苷类似物或咪唑喹啉化合物，或其衍生物。在一个实施方案中，所述TLR激动剂是咪喹莫特。进一步的TLR7激动剂描述于WO02085905。
在可选的实施方案中，使用能够导致通过TLR-8的信号传导应答的TLR激动剂（Sabroe 等, JI 2003 p1630-5）。合适地，能够导致通过TLR-8的信号传导应答的TLR激动剂是单链RNA（ssRNA），具有抗病毒活性的咪唑喹啉分子，例如瑞喹莫德（R848）；雷西莫特也能够被TLR-7识别。可以使用的其它TLR-8激动剂包括在WO2004071459中描述的那些。
在一个实施方案中，提供了本发明的免疫原性组合物，其中TLR7/8激动剂，咪唑喹啉分子，尤其是共价连接到磷脂或膦脂（phosphonolipid）基团的咪唑喹啉。在具体实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含CRX642（参见WO2010/048520）。
如本文进一步讨论的，对于本领域技术人员显而易见的是，在抗原制剂中可以存在一些天然佐剂，如果这些制剂是包含天然病原体相关分子模式的活的减毒病毒或杀死的全病毒。 在此背景下，术语“无其它佐剂”不意在排除在一些抗原性制剂中发现的那些天然佐剂，但是意在指无进一步的佐剂特别添加到免疫原性组合物。
在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物用于皮肤初次免疫。在另一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物用于在对象中皮肤加强免疫，所述对象已经通过非经皮途径（如舌下、鼻内或肌内）接受初次免疫。在又一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物可以提供皮肤初次免疫和皮肤加强免疫。
术语初次免疫意在指对象接受针对具体病原体的首次疫苗接种过程。 例如，在UK疫苗接种计划中，婴儿在13个月龄时针对麻疹、腮腺炎和风疹免疫（初次免疫）。他们在3岁零4个月年龄时针对相同的病原体再次接种疫苗（加强免疫）。在乙型肝炎领域可以见到另一个实例。需要接种疫苗的人（成人或婴儿）在0、1和6个月给予三次疫苗剂量的初始计划（primary schedule）（初次免疫）。如果有必要，（例如，按照加速的初始计划，或抗体滴度已下降）在初始疫苗接种之后在1岁或5岁可以给予另一次疫苗接种（加强免疫）。进一步的实例可以见于所谓的“DTP”疫苗——白喉、破伤风、百日咳疫苗。通常，初次破伤风和白喉免疫在生命的第一年期间以两个剂量进行。根据国家，在第二年期间和/或在4岁和10岁年龄之间施用加强剂量。
本领域充分理解术语抗原是指产生免疫应答的试剂。所述抗原可以是能够引起人或动物中免疫应答的一种或多种蛋白、多糖、肽、核酸、蛋白-多糖缀合物、分子或半抗原。可选地，所述抗原可以是全病原体，例如减毒的或灭活的病原体。全的灭活的病原体可以进一步拆分，例如拆分的流感病毒。在本发明的一个实施方案中，抗原衍生自甲型肝炎病毒和/或乙型肝炎病毒（例如，乙型肝炎病毒表面抗原）。在本发明的另一个实施方案中，抗原衍生自人乳头瘤病毒。在本发明的另一个实施方案中，抗原是烟碱，或其衍生自烟碱。在本发明的另一个实施方案中，抗原衍生自登革热病毒。在本发明的另一个实施方案中，抗原衍生自呼吸道合胞病毒（RSV）。在另一个实施方案中，所述抗原与阿尔茨海默氏病有关。在另一个实施方案中，所述抗原衍生自导致麻疹、腮腺炎、风疹或其组合的病毒。在另一个实施方案中，所述抗原衍生自水痘-带状疱疹病毒（VZV）。在另一个实施方案中，所述抗原衍生自肿瘤相关的抗原（例如，MAGE和/或PRAME）。在另一个实施方案中，所述抗原衍生自引起人类疟疾的寄生虫，尤其是恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）和/或间日疟原虫（Plasmodium vivax）。在另一个实施方案中，所述抗原衍生自巨细胞病毒（CMV）。
如果本发明的免疫原性组合物用作加强免疫，则初次免疫可以是佐剂化的或未佐剂化的。显而易见的是，一些疫苗天然包含佐剂，例如活的减毒的或杀死的病毒疫苗将保留在原始病原体中发现的一些病原体相关的分子模式（PAMPS）。当初次免疫是“未佐剂化的”时，此术语意在指所述初次免疫在除了可以在抗原制剂中存在的那些之外不包含任何佐剂。
在本发明的一个具体实施方案中，所述初次免疫是佐剂化的（即，已经掺入抗原制剂中可以是天然存在的那些之外的佐剂）。佐剂是本领域理解的术语，指帮助诱导对抗原的免疫应答的组分。可用于初次接种的佐剂是，例如金属盐、TLR调节剂、水包油乳液、脂质体免疫原性组合物、皂苷佐剂或这些的任何组合。
在一个实施方案中，在初次免疫中使用的佐剂包括TLR调节剂，例如TLR-4调节剂，例如脂多糖或它们的衍生物，例如单磷酰脂质A或3-脱酰基单磷酰脂质A（称为3D-MPL并可以从GlaxoSmithKline Biologicals North America获得，参见例如美国专利号4,436,727、4,877,611、4,866,034和4,912,094）。
在另一个实施方案中，在初次免疫中使用的佐剂包含皂苷佐剂，例如Quil A和其衍生物。Quil A是从南美树木石碱木（Quillaja Saponaria Molina）分离的皂苷制备物，并且首先由Dalsgaard等人在1974年（“Saponin adjuvants”, Archiv. für die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, Berlin, p243-254）描述为具有佐剂活性。Quil A的纯化的片段已通过HPLC分离，其保留佐剂活性而无Quil A相关的毒性（EP 0 362 278），例如QS7和QS21（也称为QA7和QA21）。
在一个实施方案中，在初次免疫中使用的佐剂包括皂苷佐剂和TLR-4调节剂两者，例如称为AS01B的佐剂（在脂质体免疫原性组合物中的3D-MPL和QS21，50µg 3D-MPL和50 µg QS21）或称为AS01E的佐剂（在脂质体免疫原性组合物中的3D-MPL和QS21，25µg 3D-MPL和25 µg QS21）。
在一个实施方案中，在初次免疫中使用的佐剂包括金属盐，例如氢氧化铝或磷酸铝和3-脱酰基单磷酰脂质A。在此实施方案的具体实例中，在初次免疫中使用的佐剂是称作AS04的佐剂（50µg 3D-MPL吸附到500 µg铝盐上）。
在进一步的实施方案中，在初次免疫中使用的佐剂包含水包油乳液，其本身包含可代谢的油，例如角鲨烯和表面活性剂例如吐温80和/或司盘85。在此实施方案的具体实例中，所述水包油乳液是MF59。在此实施方案的一个实例中，水包油乳液可以包含可代谢的油的组合，例如角鲨烯和α-生育酚。在此实施方案的具体实例中，所述水包油乳液佐剂是AS03A、AS03B、AS03C或AS03D，其所有都是来自GlaxoSmithKline Biologicals S.A.的基于α-生育酚的水包油乳液。
实施例
实施例 1
为了评价通过皮内途径注射的多种化合物的佐剂效力，C57BL/6小鼠的组在第0天和第14天皮内注射2 μg或20 μg单独的乙型肝炎表面抗原（HBsAg）或与1 μg或10 μg下列化合物组合的HBsAg：MPL、DQ、CRX-642、Pam3Cys Lip或CT。小鼠的基准比较组也分别肌内注射吸附到50 μg或500 μg明矾上的2 μg或20 μg HBsAg。最后一次免疫后14天，处死小鼠并通过心脏穿刺收集血液样品。在每次免疫之前也收集血液样品。将血液样品进行处理并且血清样品冷冻在-80℃，用于通过ELISA的抗原特异性抗体测定。简而言之，微孔板的孔用最佳浓度的HBsAg或用于标准曲线的抗小鼠IgG在室温包被4小时。清洗和封闭微孔后，血清样品系列稀释到板中，并且板在4℃孵育过夜。在充分清洗步骤后，使用缀合HRP的第二抗体检测小鼠IgG（在37℃30分钟），随后与TMB底物溶液一起孵育。反应在30分钟后用1M硫酸终止。板在450nm读数。测试样品的抗体浓度从标准曲线计算，所述标准曲线在每个板上，由纯化的小鼠免疫球蛋白制成，使用SoftMaxPro通过应用4参数公式进行。值表示为每毫升血清特异性抗体的纳克数，并且将测试组的抗体浓度的平均值与已皮内接受未佐剂化的HBsAg（图上的空心圆圈）对照组比较，或与已接受相同剂量的明矾吸附的HBsAg相应的基准组比较，所述比较通过单因素方差分析随后是Dunnett氏多重比较测试。
来自在第28天收集的样品的抗原特异性血清IgG浓度的统计学分析揭示，当MPL和DQ与HBsAg混合用于皮内注射时，与无佐剂给予的等效剂量的HBsAg相比记录了强的佐剂效应（图1）。对于所有测试的涉及MPL或DQ的免疫方案，显示引发的抗原特异性抗体应答与由肌内给予的吸附到明矾的基准疫苗引发的那些相匹配。当抗原特异性抗体浓度与由等效的未佐剂化的疫苗引发的应答比较时，所评价的4个基于CRX-642的制剂的3个显示显著的但更低（相对MPL和DQ）的佐剂效应。当与HBsAg通过皮内途径共施用时，Pam3CysLip也展示强的佐剂效应。4个测试的制剂中的3个可以引发与由基准明矾吸附的疫苗引发的等效的抗原特异性抗体应答。当皮内注射20 μg HBsAg时，CT也显示与通过明矾吸附的基准疫苗引发的应答相匹配的强的佐剂效应。
还评价了通过多种疫苗制剂引发的细胞介导的免疫（CMI）应答。作为CMI的替代，通过细胞内细胞因子染色在CD4和CD8 T细胞子集中评价了细胞因子产生。简而言之，从处死后的小鼠收集脾并使用尼龙细胞滤器和注射器栓塞处理成单细胞悬浮液。脾细胞在完全RPMI中培养。在存在抗CD28、抗CD49d和多种刺激剂例如HBsAg、涵盖HBsAg的合成的15聚体肽和来自HIV的对照肽的情况下刺激脾细胞。作为阴性对照，脾细胞仅与完全RPMI培养基孵育。在2小时的刺激后，添加布雷菲德菌素A持续额外的16至18小时。使用Cytofix/Cytoperm试剂盒清洗、固定和透化细胞，并用下列mAb染色：APC-H7-缀合的大鼠抗-小鼠 CD4 (L3T4)、PerCP-Cy5.5-缀合的大鼠抗-小鼠 CD8a(Ly-2)、FITC-缀合的大鼠抗-小鼠 IL-2、PE-缀合的大鼠抗-小鼠 IL-5、APC-缀合的大鼠抗-小鼠 IFN- γ和PE-Cy7-缀合的大鼠抗-小鼠 TNF-α。在BD FACS Canto ™ II上获得细胞并使用BD FACS Diva™ 软件分析。结果表示为同时产生细胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-2的CD4或CD8细胞频率（%）。
如图2（A，B）中所示，结果表明对于产生细胞因子的CD4和CD8 T细胞的引发最佳的佐剂是DQ并且在较低程度上是MPL，极佳的制剂是10 μg DQ与20 μg HBsAg一起皮内给予。测试的其它制剂显示在用HBsAg或合成的15聚体肽（HBsAg）重刺激（从每组5只小鼠的2个合并物中制成的脾细胞悬浮液）后诱导非常低或无可检测的三细胞因子阳性CD4和CD8 T细胞。
实施例 2MPL 和 DQ 的协同效应或组合效应
进行小鼠免疫原性研究以评估MPL和DQ协同作用以引发针对HBsAg的抗原特异性抗体应答和T细胞应答的潜能。C57BL/6小鼠组在第0天和第14天皮内注射2 μg HBsAg，所述HBsAg与或不与1 μg DQ，或1 μg MPL或1 μg MPL与1 μg DQ的组合一起配制。吸附到明矾的相同剂量的HBsAg也肌内给予作为基准对照。小鼠在第28天处死。收集脾并进行心脏穿刺放血。在每次免疫之前也收集血液样品。将血液样品进行处理并且血清样品冷冻在-80℃，用于通过ELISA的抗原特异性抗体测定。如先前所述测定抗原特异性抗体水平。还如先前所述重刺激脾细胞。
抗原特异性血清IgG水平的比较表明，MPL和DQ（基于重量调整）当与HBsAg皮内共施用时，引发非常类似水平的抗原特异性IgG水平，分别具有29 489 ng/mL和31 924 ng/mL的几何平均浓度。在两种情况下，抗原特异性IgG水平显著高于单独接受HBsAg的小鼠所产生的那些。有意思的是，当一起配制时，MPL和DQ的佐剂效应对于抗原特异性IgG的引发不仅仅是加和性的，具有205 130 ng/mL的几何平均浓度，其构成协同效应的优良实例（图3）。当MPL与DQ一起配制时，引发产生细胞因子的细胞的效力也显示最高。用HBsAg肽或抗原重刺激之后，三阳性（TNF-α+、IFN-γ+和IL-2+）CD4和CD8 T细胞的频率优于任何其它组（图4）。
实施例 3 ：尤卡坦微型猪中的免疫原性 / 反应原性
设计第一个尤卡坦猪反应原性和免疫原性研究以：1）再现透皮贴剂应用后由大肠杆菌不耐热毒素（LT）产生的过度色素沉着反应，2）确保DQ-佐剂化疫苗皮内施用后不生成过度色素沉着反应，以及3）验证经过2次免疫后在尤卡坦猪品系中生成针对皮内HBsAg的特异性免疫反应的可能性。简而言之，总共9只尤卡坦猪（雌性，3-4个月）分成3组，每组3只动物。第一组将在第0天在侧面区域以100微升的体积皮内接受5个不同剂量（50 µg、25 µg、12.5 µg、5 µg和1 µg）的LT。第二组将在第0和28天在后肢肌内（1ml/剂量）接受Engerix。第三组将在第0和28天在侧面区域以100µl 的体积皮内接受混合有50µg的DQ的20µg 乙型肝炎表面抗原。将通过Draize评分观察和评估用于皮内注射的注射部位，在每次免疫前和在第56天处死时将收集血清（组2和3）并通过ELISA测定抗原特异性IgG水平。注射后，动物每天监测作为反应原性指标的红斑、水肿、硬结、坏死和过度色素沉着进行至多21天。
如下进行抗原特异性血清抗体测定。简而言之，微孔NUNC板的孔用最佳浓度的HBsAg或用山羊抗猪IgG在室温包被1小时。用DPBS-T 0.05%-BSA 1%在室温清洗和封闭微孔板30分钟后，血清样品系列稀释到板中并且板在室温孵育1小时。充分清洗步骤后，使用HRP缀合的山羊抗猪第二抗体（在室温1小时），随后与TMB底物溶液在室温孵育30分钟而检测猪IgG。反应在30分钟后用1M硫酸终止。板在450nm读数。测试样品中的抗体浓度从标准曲线计算，所述标准曲线使用猪参照血清在每个板上运行。通过使用4参数公式通过SoftMaxPro从标准品计算特异性血清IgG浓度。值表示为每毫升血清特异性抗体的纳克数。
抗原特异性血清IgG测定表明与由IM给予的人剂量的Engerix构成的基准疫苗相比，皮内接受2个剂量的HBsAg（20µg）与DQ（50µg）的动物能够生成至少等效于在相同数目的剂量后由基准疫苗引发的那些的抗体水平。当LT皮内注射到尤卡坦微型猪的侧面皮肤中时，在注射部位观察到严重的持续时间长的炎症反应。对于注射的LT的所有剂量和对于组中的所有3只猪都注意到过度色素沉着。这些强反应在用20 µg HBs+50 µg DQ免疫的动物中不存在。在用20 µg HBs+50 µg DQ ID注射的动物中可以观察到在注射部位存在干皮肤（非常温和）。此外，特异性染色显示，与正常皮肤相比，在DQ免疫的皮肤部分黑色素含量略微增加（几乎不能被察觉）。然而，当与已通过相同途径接受50 µg LT的组相比时，在用20 µg HBs+50 µg DQ ID注射后，黑色素色素沉着非常弱，几乎是不可检测的。
实施例 3 ：家猪中的免疫原性 / 反应原性
在家猪（Yorkshire/Landrace X Duroc）中进行免疫原性研究以评价用HBsAg w/wo 佐剂皮内注射加强先前通过Engerix经由肌内注射引发的应答的能力。简而言之，总共25只猪（雄性和雌性，3-4月龄）分入6组，并按照2次免疫的计划进行免疫，在每次免疫之间具有28天的间隔。在第二次免疫后28天处死动物。前4组每组由5只动物组成，第5组（探索组）由3只动物组成，并且第6组由2只猪组成。组1（基准）肌内接受Engerix (Engerix HD)的人剂量。组2和3对于第一次免疫肌内接受Engerix HD并且对于第二次免疫使用100微升的体积皮内接受单独HBsAg (20µg)或与DQ（50µg）一起的HBsAg (20µg)。组4接受混合50µg DQ的20µg HBsAg的两次皮内注射，并且组5是探索组，用混合有5µg DQ的20µg HBsAg皮内免疫两次。在每次免疫前和在第56天的处死时收集血液样品，并且血清将用于通过ELISA的抗原特异性IgG测定。来自组6的2只动物将用于使用伊文思蓝染色鉴定相关引流淋巴结。已接受伊文思蓝的动物在注射后30分钟处死用于观察引流淋巴结。
与肌内给予的基准（Engerix HD）相比，接受用Engerix HD IM初次免疫随后是用混合50 µg DQ的20 µg HBsAg加强的组生成与由基准IM疫苗诱导的等效的抗体应答（图6）。对于按照相同的计划已接受混合50 µg DQ的20µgHBsAg的2次免疫的动物，相同的观察是有效的。但是，在没有佐剂的情况下，接触抗原和加强方案之后，ID接受单独的HBsAg（20µg）作为加强剂的组不能匹配由基准组生成的抗体应答。
对于皮内给药的组在免疫后使用Draize评分表进行注射部位的评分。如表1所总结，在所有已接受HBsAg (20 µg) + DQ (50 µg)的动物上第一次免疫后1天观察到轻微的皮肤红色（明确界定的），具有20毫米的平均直径。在免疫后2天，仅对于免疫的相同组在5只动物的2只上观察到几乎难以察觉的皮肤红色。在第3天，检测不到皮肤反应。对于已接受混合有DQ（5µg）的HBsAg（20µg）的组，在免疫后1天对于3只动物中的2只观察到几乎难以察觉的皮肤红色，并且对于此组在第2天观察到无皮肤反应。在第2次免疫后，在用Engerix肌内初次接触抗原并用混合有DQ（50μg）的HBsAg（20 μg）皮内加强的组中和在皮内接受两个剂量的混合有DQ（50 μg）的HBsAg（20 μg）的组中观察到几乎难以察觉的红斑反应，持续2天。对于皮内接受两个剂量的混合有DQ（5 μg）的HBsAg（20 μg）的组，仅在免疫后1天观察到几乎难以察觉的红斑反应。
表 1 反应原性表（家猪）

Claims (17)

1.用于在皮肤免疫中使用的免疫原性组合物，其包含一种或多种抗原和佐剂，其中所述佐剂是免疫学活性皂苷。
2.根据任意前述权利要求的免疫原性组合物，其中所述免疫学活性皂苷衍生自QuilA。
3.根据权利要求2的免疫原性组合物，其中所述QuilA衍生物是QS21。
4.根据任意前述权利要求的免疫原性组合物，其中所述免疫学活性皂苷用甾醇，尤其是胆固醇配制。
5.根据权利要求4的免疫原性组合物，其中免疫学活性皂苷对甾醇的比例是在1：1和1：100之间，尤其在1：2和1：10之间，尤其约1：5。
6.用于在皮肤免疫中使用的免疫原性组合物，其包含一种或多种抗原和佐剂，其中所述佐剂是TLR-4激动剂。
7.根据权利要求6的免疫原性组合物，其中所述TLR-4激动剂是脱毒的脂质A，尤其是3D-MPL。
8.根据任意前述权利要求的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物进一步包含一种或多种选自下组的额外佐剂：TLR-4激动剂、TLR7/8激动剂或鞭毛蛋白或其片段，或免疫学活性皂苷。
9.根据任意前述权利要求的免疫原性组合物，其包含免疫学活性的皂苷，尤其是QS21（尤其用甾醇，例如胆固醇配制）和TLR-4激动剂，尤其是3D-MPL。
10.根据任意前述权利要求的免疫原性组合物，其以贴剂的形式施用。
11.根据任意前述权利要求的免疫原性组合物，其使用短针装置施用。
12.根据任意前述权利要求的免疫原性组合物，其中所述TLR-5激动剂是鞭毛蛋白或其具有TLR-5活性的片段。
13.根据任意前述权利要求的免疫原性组合物，其中所述TLR-5激动剂是其中高变结构域已经缺失的TLR-5激动剂。
14.根据权利要求5的免疫原性组合物，其中所述TLR-5激动剂选自：FliCΔ174-400、FliCΔ161-405和FliCΔ138-405。
15.根据任意前述权利要求的免疫原性组合物，其中所述抗原衍生自乙型肝炎病毒，尤其其中所述抗原是乙型肝炎表面抗原（HBsAg）。
16.用于在皮肤免疫中使用的免疫原性组合物，其包含一种或多种抗原和佐剂，其中所述佐剂是免疫学活性皂苷。
17.用于在皮肤免疫中使用的免疫原性组合物，其包含一种或多种抗原和佐剂，其中所述佐剂是一种或多种TLR激动剂，尤其其中所述TLR激动剂是TLR-2（例如Pam3Cys-lip）激动剂或TLR7和/或8激动剂（例如CRX642）。
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