JP2014533674A - ワクチン - Google Patents

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メッヘレン，マルセル，ポーレット ヴァン
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Abstract

本発明は、皮膚免疫処置に使用するための、1種以上の抗原とアジュバントとを含む免疫原性組成物を提供し、ここにおいて、該アジュバントは免疫学的に活性なサポニンである。【選択図】 なし

Description

発明の分野
本発明は、抗原とアジュバントとを含む、皮膚免疫処置(cutaneous immunisation)に使用するための免疫原性組成物を提供し、該アジュバントは、免疫学的に活性なサポニンおよび/またはTLR-4アゴニストである。
発明の背景
一般的に、ワクチン接種が初回免疫(プライム)であろうと追加免疫(ブースト)であろうと、ワクチン接種における患者のコンプライアンスを高めること、並びにワクチンの製造および輸送の容易さを向上させることが必要である。皮膚免疫処置は、これらの必要性のいくつかに対処することができ、抗原特異的免疫応答を誘導するために、抗原をアジュバントと組み合わせて投与するために使用することができる。
本発明の目的は、被験者におけるワクチンに対する免疫応答を刺激することである。そのワクチンは、抗原とアジュバントの両方を含む免疫原性組成物を含んでなり、かつ皮膚に投与される。
免疫原性組成物中のアジュバントは、免疫学的に活性なサポニンおよび/またはTLR-4アゴニストである。
マウス抗原特異的IgG。 IFN-γ, TNF-α, IL-2三重陽性CD4 T細胞(マウスデータ)。 IFN-γ, TNF-α, IL-2三重陽性CD8 T細胞(マウスデータ)。 マウス抗原特異的IgG。 IFN-γ, TNF-α, IL-2三重陽性CD4 T細胞(マウスデータ)。 IFN-γ, TNF-α, IL-2三重陽性CD8 T細胞(マウスデータ)。 ユカタン(Yucatan)ミニブタの免疫原性データ。 飼育ブタ(初回および追加免疫アプローチにおける免疫原性)。
詳細な説明
本発明は、皮膚免疫処置に使用するための、1種以上の抗原とアジュバントとを含む免疫原性組成物を提供し、該アジュバントは、免疫学的に活性なサポニンおよび/またはTLR-4アゴニストである。
別の実施形態では、皮膚免疫処置のための薬剤の製造における、1種以上の抗原とアジュバントとを含む免疫原性組成物の使用を提供し、該アジュバントは、免疫学的に活性なサポニンおよび/またはTLR-4アゴニストである。
別の実施形態では、被験者の皮膚に、1種以上の抗原とアジュバントとを含む免疫原性組成物を適用する段階を含んでなる、皮膚免疫処置の方法を提供し、該アジュバントは、免疫学的に活性なサポニンおよび/またはTLR-4アゴニストである。
本明細書中で用いる「皮膚に」(cutaneously)という用語は、ヒト皮膚の真皮および/または表皮への抗原の適用を指すことを意図している。本発明は特に、動物またはヒトにおいて免疫応答を誘導する皮膚免疫処置のための送達システムを利用するが、従来の投与方法も包含される。
少なくとも1種の抗原およびアジュバントを含み、該アジュバントが免疫学的に活性なサポニンおよび/またはTLR-4アゴニストである、免疫原性組成物の皮膚適用は、当業者に知られている任意の皮膚適用方法を用いて行うことができ、そうした方法としては、限定するものではないが、短針デバイス(長さが約1〜約2mmの針を備えたデバイス)を使用する送達、または皮膚パッチを使用する送達が挙げられる。
本明細書に記載の皮膚ワクチンと共に使用するのに適したデバイスとしては、例えばUS 4,886,499、US 5,190,521、US 5,328,483、US 5,527,288、US 4,270,537、US 5,015,235、US 5,141,496、US 5,417,662およびEP 1092444に記載されるような短針デバイスが挙げられる。皮膚ワクチンはまた、例えば、参照により本明細書に組み入れられるWO 99/34850に記載されるような、皮膚への針の有効貫入長さを制限するデバイスおよびその機能的等価物によって投与することもできる。また、液体ジェットインジェクターを用いて、または角質層を穿刺しかつ真皮に到達するジェット噴流を生成する針を用いて、真皮に液体ワクチンを送達するジェット式注射器具も適している。ジェット式注射器具は、例えば、US 5,480,381、US 5,599,302、US 5,334,144、US 5,993,412、US 5,649,912、US 5,569,189、US 5,704,911、US 5,383,851、US 5,893,397、US 5,466,220、US 5,339,163、US 5,312,335、US 5,503,627、US 5,064,413、US 5,520,639、US 4,596,556、US 4,790,824、US 4,941,880、US 4,940,460、WO 97/37705およびWO 97/13537に記載されている。また、皮膚の外層から真皮へと粉末形態のワクチンを加速させるために圧縮ガスを用いるバリスティック(ballistic)粉末/粒子送達デバイスも適している。さらに、皮膚投与の古典的マントゥー(mantoux)法において従来の注射器を使用することも可能である。しかし、従来の注射器の使用は高度に熟練したオペレータを必要とし、そのため、高度に熟練したユーザなしで正確な送達が可能なデバイスが好適である。したがって、一実施形態では、皮膚免疫処置に使用するための本発明の免疫原性組成物が提供され、該免疫原性組成物は従来の注射器を使用するマントゥー法で投与されるものではない。
本発明の特定の実施形態では、本明細書に記載される本発明の免疫原性組成物を含むパッチが提供される。このパッチは一般的に、固体基板(例えば、閉鎖性または非閉鎖性包帯)などのバッキングプレート(受け板)を含む。本発明のパッチは、本発明の抗原およびアジュバントを真皮または表皮に送達するものである。したがって、本発明のパッチは、本発明の免疫原性組成物を表皮または真皮に送達するのに適した1つ以上の微小突起（microprojection）を含む。本発明の一実施形態では、1つ以上の微小突起は、10μm〜2mmの間、例えば20μm〜500μm、30μm〜1mm、100〜200、200〜300、300〜400、400〜500、500〜600、600〜700、700、800、800〜900、100μm〜400μm、特に約200μm〜300μmの間または約150μm〜250μmの間である。
特定の実施形態では、本発明のパッチは複数の微小突起を含む。特定の実施形態では、本発明のパッチは2〜5000の微小針、例えば1000〜2000の微小突起を含む。
特定の実施形態では、微小突起同士は約50μm〜1000μmの距離だけ離れている。
微小突起は、角質層、表皮および/または真皮を穿刺し、かつ抗原およびアジュバントを表皮または真皮に送達するのに適した任意の形状であり得る。例えば、WO 2000/074765およびWO 2000/074766に開示されるように微小突起を成形することができる。微小突起は、アスペクト比(高さ対基部での直径)を少なくとも3：1、少なくとも約2：1、または少なくとも約1：1とすることができる。微小突起の特に好ましい形状は、多角形(例えば、六角形またはひし形)の底面を有する錐形である。他の可能な微小突起の形状は、例えば、米国公開特許出願第2004/0087992号に示されている。特定の実施形態では、本発明の微小突起は基部に向かって厚くなる形状を有する。
アレイ中の微小突起の数は、好ましくは、少なくとも約100、少なくとも約500、少なくとも約1000、少なくとも約1400、少なくとも約1600、または少なくとも約2000である。微小突起の面積密度は、それらの小さいサイズを考慮すると、特に高くはないかもしれないが、例えば、cm2あたりの微小突起の数は、少なくとも約50、少なくとも約250、少なくとも約500、少なくとも約750、少なくとも約1000、または少なくとも約1500であり得る。
本発明の一実施形態では、本発明の抗原およびアジュバントは、宿主の皮膚上にパッチを置いてから5時間以内に、例えば、4時間、3時間、2時間、1時間または30分以内に、宿主に送達される。本発明の特定の実施形態では、本発明の抗原およびアジュバントは、皮膚にパッチを置いてから20分以内に、例えば、30秒、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18または19分以内に送達される。
微小突起は、当業者に知られている任意の適切な材料で作製することができる。特定の実施形態では、微小突起の少なくとも一部、特に微小突起の最外層の先端は、生分解性である。特定の実施形態では、微小突起の実質的に全部が生分解性である。本明細書中で用いる「生分解性」という用語は、生分解のメカニズムに関係なく、インビボ使用(例えば、皮膚への挿入)の予想された条件下で分解可能なことを意味する。代表的な生分解のメカニズムには、崩壊、分散、溶解、侵食、加水分解、および酵素的分解が含まれる。「実質的に全部」とは、微小突起の少なくとも70％が生分解性であり、例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、または少なくとも95％が生分解性であることを意味する。
特定の実施形態では、生分解性の微小突起は生分解性ポリマーから構成される。例えば、適切な、生体適合性の、生分解性の、または生体侵食性のポリマーとしては、以下が挙げられる：ポリ(乳酸)(PLA)、ポリ(グリコール酸)(PGA)、ポリ(乳酸-コ-グリコール酸)(PLGA)、ポリ酸無水物、ポリオルトエステル、ポリエーテルエステル、ポリカプロラクトン(PCL)、ポリエステルアミド、ポリ(酪酸)、ポリ(吉草酸)、ポリビニルピロリドン(PVP)、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリエチレングリコール(PEG)、ブロックコポリマーのPEG-PLA、PEG-PLA-PEG、PLA-PEG-PLA、PEG-PLGA、PEG-PLGA-PEG、PLGA-PEG-PLGA、PEG-PCL、PEG-PCL-PEG、PCL-PEG-PCL、エチレングリコール-プロピレングリコール-エチレングリコールのコポリマー(PEG-PPG-PEG、商品名Pluronic(登録商標)またはPoloxamer(登録商標))、デキストラン、ヘタスターチ、テトラスターチ、ペンタスターチ、ヒドロキシエチルデンプン、セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース(HPC)、カルボキシメチルセルロースナトリウム(Na CMC)、熱感受性HPMC(ヒドロキシプロピルメチルセルロース)、ポリホスファゼン、ヒドロキシエチルセルロース(HEC)、他の多糖類、ポリアルコール、ゼラチン、アルギン酸塩、キトサン、ヒアルロン酸およびその誘導体、コラーゲンおよびその誘導体、ポリウレタン、ならびにこれらのポリマーのコポリマーおよびブレンド。好ましいヒドロキシエチルデンプンは、0〜0.9の範囲内の置換度を有するものであり得る。
特定の実施形態では、微小突起の生分解性部分が抗原および/またはアジュバントを含む。抗原および/またはアジュバントは別個の微小突起中に存在することができ、例えば、微小突起の約90％、80％、70％、60％、50％、40％または30％が抗原を含み、そして微小突起の10％、20％、30％、40％、50％、60％または70％がアジュバントを含み得る。特定の実施形態では、本明細書に記載の免疫原性組成物を含む生分解性微小突起を1つ以上、特に複数、備えたパッチが提供される。抗原などの活性物質を含む微小突起の例は、WO 2008/130587およびWO 2009/048607に開示されている。代謝可能な微小針の製造方法は、WO 2008/130587およびWO 2010/124255に開示されている。
さらなる実施形態では、アジュバントおよび抗原は1つ以上の微小突起上にコーティングされている。コーティングは、当業者に公知の任意の方法、例えばWO 06/055844およびWO 06/055799に開示された方法により、行うことができる。
抗原および/またはアジュバントは別個の微小突起上にコーティングすることができ、微小突起の90％、80％、70％、60％、50％、40％または30％が抗原でコーティングされ、そして微小突起の10％、20％、30％、40％、50％、60％または70％がアジュバントでコーティングされ得る。
本発明のパッチは、任意の手段によって、例えば手で皮膚の上にパッチを置くことによって、使用者の皮膚に適用することができる。特定の実施形態では、本発明のパッチは、アプリケータ、例えばWO 2008/091602に記載のアプリケータを用いて、皮膚に適用される。特に、そのアプリケーションは、1つ以上の微小突起が角質層、表皮および/または真皮を確実に穿刺する（penetrate）のに十分な圧力でパッチが皮膚に適用されたことを保証する手段、例えば、十分な圧力が加えられたときに可聴音を出すデバイスを含む。
本発明のパッチはまた、真皮および/または表皮への抗原およびアジュバントの放出/送達の間、パッチを皮膚上に保持するのに役立つ接着剤を含むことができる。
本発明の免疫原性組成物は抗原とアジュバントの両方を含む。アジュバントは、抗原に対する免疫応答を誘導するのに役立つ免疫原性組成物の成分である。本発明では、皮膚免疫処置に使用するための免疫原性組成物は、免疫学的に活性なサポニンおよび/またはTLR-4アゴニストであるアジュバントを含む。
本発明で使用するのに特に適した免疫学的サポニンは、Quil Aおよびその誘導体である。Quil Aは、南米の樹木キラヤ・サポナリア・モリナ(Quillaja Saponaria Molina)から分離されたサポニン調製物であり、1974年にDalsgaardら(“Saponin adjuvants”, Archiv. fuer die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, Berlin, p243-254)によってアジュバント活性を有することが最初に記載された。Quil Aの精製された断片がHPLCにより単離されており、これらの断片は、Quil Aに付随する毒性なしにアジュバント活性を保持しており(EP 0 362 278)、例えばQS7およびQS21(QA7およびQA21の別名でも知られる)である。QS-21は、キラヤ・サポナリア・モリナの樹皮に由来する天然のサポニンであって、CD8+細胞傷害性T細胞(CTL)、Th1細胞および主にIgG2a抗体応答を誘導し、本発明との関連において好ましいサポニンである。本発明の特定の実施形態では、免疫学的に活性なサポニンはQS21である。特に、QS21は実質的に純粋な形態のものであり、すなわち、QS21は少なくとも90％の純度、好ましくは少なくとも95％の純度、最も好ましくは少なくとも98％の純度である。本発明の特定の実施形態では、QS21はステロールを用いて製剤化される。好ましいステロールとしては、β-シトステロール、スチグマステロール、エルゴステロール、エルゴカルシフェロール、およびコレステロールが挙げられる。これらのステロールは当技術分野でよく知られており、例えばコレステロールは、Merck Index, 第11版, 341ページに、動物性脂肪中に存在する天然のステロールとして開示されている。本発明の特定の実施形態では、ステロールはコレステロールである。本発明の特定の実施形態では、QS21のコレステロールに対する比は、1：100〜1：1の間、特に1：2〜1：10の間、例えば1：5である。
TLR-4アゴニストは、Toll様受容体ファミリーのメンバーであるToll様受容体4のアゴニストである。これは、よく知られた受容体のファミリーであり、そのすべてが免疫応答に何らかの形で関与している。一実施形態では、TLR-4アゴニストは、リポ多糖、適切には無毒性のリピドA誘導体、特にモノホスホリルリピドA、またはより具体的には3-脱アシル化モノホスホリルリピドA(3D-MPL)である。
3D-MPLは、GlaxoSmithKline Biologicals N.A.からMPLの名称で販売されており、本明細書全体を通してMPLまたは3D-MPLと呼ばれる。例えば、米国特許第4,436,727号; 第4,877,611号; 第4,866,034号および第4,912,094号を参照されたい。3D-MPLは、主にIFN-γ(Th1)表現型を有するCD4+ T細胞応答を促進する。3D-MPLは、GB 2 220 211 Aに開示された方法に従って製造することができる。化学的には、それは3-脱アシル化モノホスホリルリピドAと3-、4-、5-または6-アシル化鎖との混合物である。
本発明において有用であり得る他のTLR-4アゴニストは、GlaxoSmithKline Biologicals S.A.から入手可能な合成TLR-4アゴニストであるアミノアルキルグルコサミニド（glucasminide）ホスフェート(AGP)である。適切な例は、WO 98/50399または米国特許第6,303,347号(AGPの調製方法も開示される)に開示されるもの、好適にはRC527もしくはRC529、または米国特許第6,764,840号に開示されるようなAGPの薬学的に許容される塩である。
一実施形態では、免疫原性組成物は、免疫学的に活性なサポニンおよび/または本明細書で定義されるTLR-4アゴニストを含み、他のアジュバントを含まない。別の実施形態では、免疫原性組成物はTLR-5アゴニストおよび1種以上の他のアジュバントを含む。この実施形態の一態様では、前記1種以上の他のアジュバントは、本明細書に記載のTLR-4アゴニスト、TLR-5アゴニスト、TLR 7/8アゴニスト、および本明細書に記載される免疫学的に活性なサポニン画分からなる群より選択される。
TLR-5アゴニストは、フラジェリンであるか、またはTLR-5アゴニスト活性を保持するフラジェリンの断片であり得る。フラジェリンは、以下の菌類からなる群より選択されるポリペプチドを含むことができる：ピロリ菌(H. pylori)、ネズミチフス菌(S. typhimurium)、コレラ菌(V. cholera)、セラチア・マルセセンス(S. marcesens)、フレキシネル赤痢菌(S. flexneri)、梅毒トリポネーマ(T. pallidum)、レジオネラ・ニューモフィラ(L. pneumophilia)、ボレリア・ブルグドルフェリ(B. burgdorferei)；クロストリジウム・ディフィシル(C. difficile)、リゾビウム・メリロティ(R. meliloti)、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(A. tumefaciens)；R.ルピン(R. lupine)；バルトネラ・クラリゲイア(B. clarridgeiae)、プロテウス・ミラビリス(P. mirabilis)、枯草菌(B. subtilus)、リステリア・モノサイトゲネス(L. moncytogenes)、緑膿菌(P. aeruginoa)および大腸菌(E. coli)。
特定の実施形態では、フラジェリンは、ネズミチフス菌フラジェリンB (GenBankアクセッション番号AF045151)、ネズミチフス菌フラジェリンBの断片、大腸菌FliC (GenBankアクセッション番号AB028476)、大腸菌FliCの断片、ネズミチフス菌フラジェリンFliC (ATCC14028)およびネズミチフス菌フラジェリンFliCの断片からなる群より選択される。
特定の実施形態では、前記TLR-5アゴニストは、WO 2009/156405に記載されるようなトランケート型フラジェリン、すなわち、超可変ドメインが欠失されているものである。この実施形態の一態様では、前記TLR-5アゴニストは、FliCΔ174-400; FliCΔ161-405 およびFliCΔ138-405からなる群より選択される。
さらなる実施形態では、前記TLR-5アゴニストは、WO 2009/128950に記載されるようなフラジェリンである。
TLR-5アゴニストがフラジェリンの断片である場合、当然のことながら、前記断片はTLR5アゴニスト活性を保持するものであり、したがって、TLR-5活性化に関与するその配列の部分を保持しなければならない。フラジェリンのNH2およびCOOH末端ドメインはTLR-5相互作用および活性化に重要であることが当業者に知られており、具体的には、例えばサルモネラ(Salmonella)におけるアミノ酸86-92が重要である。
TLR7および8は、Toll様受容体ファミリーのさらなるメンバーである。TLR7受容体もしくはTLR8受容体のいずれかまたは両方のアゴニストである小分子が知られている。TLR7/8アゴニストとは、TLR7受容体もしくはTLR8受容体のいずれかまたは両方の受容体のシグナル伝達を作動する(すなわち、増加する)ことができる分子を意味する。一態様では、したがって、TLR7/7リガンドは、TLR7アゴニストであるがTLR8アゴニストではない分子である。別の態様では、TLR7/8リガンドは、TLR8アゴニストであるが、TLR7アゴニストではない。さらなる態様では、TLR7/8リガンドは、TLR7受容体とTLR8受容体の両方でアゴニストとして作用する。適切なTLR7/8リガンドは、例えば、WO 2010/018133、WO 2010048520、WO 2010/018134、WO 2008004948、WO 2007034882、およびWO 2005092893に見出すことができる。
本発明のさらなる態様では、1種以上の抗原とアジュバントとを含み、該アジュバントが1種以上のTLRアゴニストである、皮膚免疫処置に使用するための免疫原性組成物が提供される。特定の実施形態では、TLRアゴニストはTLR-2アゴニスト、またはTLR7および/もしくは8アゴニストである。
本発明の特定の実施形態では、TLRアゴニストはTLR2アゴニストである(Sabroe et al, JI 2003 p1630-5)。好適には、TLR-2を介してシグナル伝達応答を引き起こすことが可能なTLRアゴニストは、結核菌(M. tuberculosis)、ボレリア・ブルグドルフェリ、梅毒トレポネーマ由来のリポタンパク質、ペプチドグリカン、細菌性リポペプチド；黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)を含む種由来のペプチドグリカン；リポテイコ酸、マンヌロン酸、ナイセリア(Neisseria)ポーリン、細菌線毛、エルシニア(Yersinia)毒性因子、CMVビリオン、麻疹ヘマグルチニン、および酵母由来のザイモサンのうちの1種以上である。本発明の特定の実施形態では、TLR2アゴニストは合成リポペプチドPam3Cys-Lipである(例えば、Fisette et al., Journal of Biological Chemistry 278(47) 46252を参照されたい)。
別の実施形態では、TLR-7を介してシグナル伝達応答を引き起こすことが可能なTLRアゴニストが使用される(Sabroe et al, JI 2003 p1630-5)。好適には、TLR-7を介してシグナル伝達応答を引き起こすことが可能なTLRアゴニストは、一本鎖RNA(ssRNA)、ロキソリビン、位置N7およびC8でのグアノシン類似体、またはイミダゾキノリン化合物もしくはその誘導体である。一実施形態では、該TLRアゴニストはイミキモドである。さらなるTLR7アゴニストは、WO 02085905に記載されている。
別の実施形態では、TLR-8を介してシグナル伝達応答を引き起こすことが可能なTLRアゴニストが使用される(Sabroe et al, JI 2003 p1630-5)。好適には、TLR-8を介してシグナル伝達応答を引き起こすことが可能なTLRアゴニストは、一本鎖RNA(ssRNA)、抗ウイルス活性を有するイミダゾキノリン分子、例えばレシキモド(R848)である；レシキモドはまた、TLR-7によっても認識され得る。使用できる他のTLR-8アゴニストには、WO 2004071459に記載されるものが含まれる。
一実施形態では、TLR7/8アゴニストがイミダゾキノリン分子、特にホスホロ-またはホスホノリピド基に共有結合したイミダゾキノリンである、本発明の免疫原性組成物が提供される。特定の実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、CRX642を含む(WO 2010/048520参照)。
本明細書中でさらに説明するように、抗原調製物が弱毒化生ウイルスまたは天然の病原体関連分子パターン(pathogen associated molecular patterns)を含む死滅全ウイルスである場合には、いくつかの天然アジュバントが該抗原調製物中に存在し得ることは、当業者には明らかであろう。これに関連して、用語「他のアジュバントを含まない」は、いくつかの抗原調製物中に見出される天然のアジュバントを除くことを意味しておらず、さらなるアジュバントが免疫原性組成物に特に添加されないことを意味するものである。
一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、一次皮膚免疫処置のために使用される。別の実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、舌下、鼻腔内または筋肉内などの非経皮経路により一次免疫を受けている被験者における追加皮膚免疫処置のために使用される。さらに別の実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、一次皮膚免疫と追加皮膚免疫の両処置を提供することができる。
用語「一次免疫(処置)」(primary immunization)は、被験者が特定の病原体に対して受ける初回コースのワクチン接種を意味するものである。例えば、英国のワクチン接種スケジュールでは、乳児は生後13ヶ月で麻疹、おたふく風邪および風疹に対する予防接種を受ける(一次免疫)。彼らは、生後3年4ヶ月で同じ病原体に対して再びワクチン接種を受ける(追加免疫)。別の例は、B型肝炎の分野に見ることができる。ワクチン接種を必要とする人々(成人または乳幼児)は、0、1および6ヶ月目に3回のワクチン接種の一次スケジュールを受ける(一次免疫)。必要であれば、(例えば、加速した一次スケジュールに従ったか、または抗体価が減少している場合)、初回ワクチン接種の1年後または5年後にワクチン接種をもう1回受けることができる(追加免疫)。さらなる例は、いわゆる「DTP」ワクチン、すなわちジフテリア・破傷風・百日咳ワクチンに見ることができる。一般的に、破傷風とジフテリアの一次免疫は2回に分けて生後1年の間に実施される。国に応じて、ブースター量が2年目および/または4〜10歳の間に投与される。
用語「抗原」は、当技術分野でよく理解されており、免疫応答をもたらす物質を意味する。抗原は、ヒトまたは動物において免疫応答を惹起することが可能な、タンパク質、多糖類、ペプチド、核酸、タンパク質-多糖複合体、分子またはハプテンの1種以上であり得る。あるいは、抗原は、全病原体、例えば弱毒化または不活化した病原体であり得る。不活化した全病原体はさらに分割することができ、例えば、スプリットインフルエンザウイルスである。本発明の一実施形態では、抗原はA型肝炎ウイルスおよび/またはB型肝炎ウイルス(例えばB型肝炎ウイルス表面抗原)に由来する。本発明の別の実施形態では、抗原はヒトパピローマウイルスに由来する。本発明の別の実施形態では、抗原はニコチンであるか、またはニコチンから誘導される。本発明の別の実施形態では、抗原はデング熱ウイルスに由来する。本発明の別の実施形態では、抗原は呼吸器合胞体ウイルス(RSV)に由来する。別の実施形態では、抗原はアルツハイマー病と関連している。別の実施形態では、抗原は麻疹、おたふく風邪、風疹を引き起こすウイルス、またはそれらの組み合わせに由来する。別の実施形態では、抗原は水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)に由来する。別の実施形態では、抗原は腫瘍関連抗原(例えばMAGEおよび/またはPRAME)に由来する。別の実施形態では、抗原は、ヒトにおいてマラリアを引き起こす寄生虫、特に熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)および/または三日熱マラリア原虫(Plasmodium vivax)に由来する。別の実施形態では、抗原はサイトメガロウイルス(CMV)に由来する。
本発明の免疫原性組成物が追加免疫として使用される場合、一次免疫はアジュバント添加またはアジュバント無添加のいずれであってもよい。いくつかのワクチンはもともとアジュバントを含むことが明らかであり、例えば、弱毒化生ワクチンまたは死滅ウイルスワクチンは、もとの病原体中に存在していた病原体関連分子パターン(PAMP)の一部を保持している。一次免疫が「アジュバント無添加」である場合、この用語は、一次免疫が、抗原調製物中に存在し得るアジュバントに加えて、どのようなアジュバントも含まない、ことを意味するものである。
本発明の特定の実施形態では、一次免疫はアジュバントが添加されている(すなわち、抗原調製物中にもともと存在し得るアジュバントに追加のアジュバントが組み込まれている)。アジュバントは、抗原に対する免疫応答を誘導するのに役立つ成分を意味することが当技術分野で理解されている用語である。一次ワクチン接種に有用なアジュバントは、例えば、金属塩、TLRモジュレーター、水中油型エマルション、リポソーム免疫原性組成物、サポニンアジュバント、またはこれらの任意の組み合わせである。
一実施形態では、一次免疫に使用されるアジュバントは、TLRモジュレーター、例えばTLR-4モジュレーター、例えばリポ多糖類またはその誘導体、例えばモノホスホリルリピドAまたは3-脱アシル化モノホスホリルリピドA(3D-MPLとして知られており、GlaxoSmithKline Biologicals North Americaから入手可能；例えば、米国特許第4,436,727号; 第4,877,611号; 第4,866,034号および第4,912,094号を参照されたい)を含む。
別の実施形態では、一次免疫に使用されるアジュバントは、サポニンアジュバント、例えばQuil Aおよびその誘導体を含む。Quil Aは、南米の樹木キラヤ・サポナリア・モリナ(Quillaja Saponaria Molina)から分離されたサポニン調製物であり、1974年にDalsgaardら(“Saponin adjuvants”, Archiv. fuer die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, Berlin, p243-254)によってアジュバント活性を有することが最初に記載された。Quil Aの精製された断片がHPLCにより単離されており、これらの断片はQuil Aに付随する毒性なしにアジュバント活性を保持しており(EP 0 362 278)、例えばQS7およびQS21(QA7およびQA21の別名でも知られる)である。
一実施形態では、一次免疫に使用されるアジュバントはサポニンアジュバントとTLR-4モジュレーターの両方を含み、例えば、AS01Bとして知られるアジュバント(リポソーム免疫原性組成物中の3D-MPLおよびQS21、50μgの3D-MPLと50μgのQS21)またはAS01Eとして知られるアジュバント(リポソーム免疫原性組成物中の3D-MPLおよびQS21、25μgの3D-MPLと25μgのQS21)を含む。
一実施形態では、一次免疫に使用されるアジュバントは、水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムなどの金属塩と3-脱アシル化モノホスホリルリピドAを含む。この実施形態の具体的な例では、一次免疫に使用されるアジュバントは、AS04として知られるアジュバント(500μgのアルミニウム塩上に吸着させた50μgの3D-MPL)である。
さらなる実施形態では、一次免疫に使用されるアジュバントは水中油型エマルションを含み、該エマルションそれ自体がスクアレンなどの代謝可能な油と、Tween 80および/またはスパン（span）85などの界面活性剤を含む。この実施形態の具体的な例では、前記水中油型エマルションはMF59である。この実施形態の一例では、水中油型エマルションは、代謝可能な油の組み合わせ、例えばスクアレンとα-トコフェロールを含むことができる。この実施形態の具体例では、水中油型エマルションアジュバントは、AS03A、AS03B、AS03CまたはAS03Dであり、これらのすべては、GlaxoSmithKline Biologicals S.A.から得られるα-トコフェロールベースの水中油型エマルションである。
皮内経路によって注射される種々の化合物のアジュバント能力を評価するために、C57BL/6マウスの群に、2μgもしくは20μgのB型肝炎表面抗原(HBsAg)単独、または1μgもしくは10μgの以下の化合物と組み合わせたHBsAgのいずれかを、0日目と14日目に皮内注射した：MPL、DQ、CRX-642、Pam3Cys LipまたはCT。マウスのベンチマーク比較群にも2μgもしくは20μgのHBsAgをそれぞれ50μgもしくは500μgのミョウバンに吸着させたものを筋肉内注射した。最後の免疫処置の14日後にマウスを安楽死させ、血液サンプルを心臓穿刺によって採取した。それぞれの免疫処置の前にも血液サンプルを採取した。血液サンプルを処理し、血清サンプルをELISAによる抗原特異的抗体の測定のために-80℃で凍結させた。簡単に説明すると、マイクロウェルプレートのウェルに、最適濃度のHBsAgまたは標準曲線のための抗マウスIgGを室温で4時間コーティングした。マイクロウェルを洗浄してブロッキングした後、血清サンプルをプレートに連続希釈し、そのプレートを4℃で一晩インキュベートした。十分な洗浄工程の後に、マウスIgGを、HRP結合二次抗体を用いて検出し(37℃で30分間)、続いてTMB基質溶液とインキュベートした。この反応を1M硫酸で30分後に停止させた。プレートを450nmで読み取った。試験サンプルの抗体濃度は、SoftMaxProを用いて、4パラメータ方程式を適用することによって、精製したマウス免疫グロブリンから作成された各プレートの標準曲線ランから計算した。値を血清ミリリットルあたりの特異的抗体のナノグラムとして表して、試験群の抗体濃度の平均を、アジュバント無添加HBsAgを皮内投与した対照群(グラフ上の白丸)または同量のミョウバン吸着HBsAgを投与した対応するベンチマーク群と、一元配置ANOVAとその後のダネット(Dunnett)の多重比較検定により比較した。
28日目に採取したサンプルからの抗原特異的血清IgG濃度の統計分析から、MPLおよびDQを皮内注射のためにHBsAgと混合したとき、アジュバントなしでの同等の投与量のHBsAgと比較して、強力なアジュバント効果が記録された、ことが明らかになった(図1)。MPLまたはDQを含む、試験したすべての免疫処置レジメンでは、誘発された抗原特異的抗体応答は、筋肉内投与されたベンチマークのミョウバン吸着ワクチンにより誘発されたものと一致することが示された。評価した4つのCRX-642ベースの製剤のうち3つについては、抗原特異的抗体濃度を同等のアジュバント無添加ワクチンによって誘発された応答と比較したとき、有意であるが(MPLおよびDQに対して)低いアジュバント効果を示した。Pam3CysLipもまた、皮内経路によりHBsAgと共に同時投与したとき、強力なアジュバント効果を発揮する。試験した4つの製剤のうち3つは、ベンチマークのミョウバン吸着ワクチンにより誘発されたものと同等の抗原特異的抗体応答を惹起することができた。CTもまた、20μgのHBsAgと共に皮内注射した場合に、ベンチマークのミョウバン吸着ワクチンにより誘発された応答に一致する強力なアジュバント効果を示した。
種々のワクチン製剤により誘発される細胞性免疫(CMI)応答も評価した。CMIの代用として、細胞内サイトカイン染色により、CD4およびCD8 T細胞サブセットにおけるサイトカイン産生を評価した。簡単に述べると、安楽死後のマウスから脾臓を摘出し、ナイロン製セルストレーナーとシリンジプランジャーを用いて単細胞懸濁液に処理した。脾細胞を完全RPMI中で培養した。抗CD28、抗CD49d、ならびにさまざまな刺激剤(例えば、HBsAg、HBsAgにわたる合成15merペプチド、およびHIV由来の対照ペプチド)の存在下で脾細胞を刺激した。陰性対照として、脾細胞を完全RPMI培地のみとインキュベートした。2時間の刺激後、ブレフェルジンAをさらに16〜18時間加えた。細胞を洗浄し、Cytofix/Cytopermキットを用いて固定および透過処理し、次のmAbで染色した：APC-H7結合ラット抗マウスCD4(L3T4)、PerCP-Cy5.5結合ラット抗マウスCD8a(Ly-2)、FITC結合ラット抗マウスIL-2、PE結合ラット抗マウスIL-5、APC結合ラット抗マウスIFN-γ、およびPE-Cy7結合ラット抗マウスTNF-α。細胞をBD FACS Canto(商標)IIで捕捉し、BD FACS Diva(商標)ソフトウェアを用いて分析した。結果は、サイトカインTNF-α、IFN-γおよびIL-2を同時に産生するCD4またはCD8細胞の頻度(％)として表される。
図2(A、B)に示すように、結果は、サイトカイン産生CD4およびCD8 T細胞を誘導するための最高のアジュバントは、DQおよびより低い程度にMPLであり、最高の製剤は20μgのHBsAgと共に皮内投与された10μgのDQである、ことを示した。試験した他の製剤は、HBsAgまたは合成15merペプチド(HBsAg)のいずれかによる(1群5匹のマウスの2つのプールから作られた脾細胞懸濁液の)再刺激後に、非常に低い三重サイトカイン陽性CD4およびCD8 T細胞を誘導するか、または検出可能な該T細胞を誘導しない、ことが示された。
MPLとDQの相乗効果または複合効果
HBsAgに対する抗原特異的抗体応答およびT細胞応答を誘発させるためにMPLとDQの相乗的に作用する能力を評価するために、マウス免疫原性試験を行った。C57BL/6マウスの群に、1μgのDQもしくは1μgのMPLのいずれか、または1μgのMPLと1μgのDQの組み合わせを用いて、あるいは用いないで製剤化した2μgのHBsAgを、0日目と14日目に皮内注射した。同じ投与量のミョウバン吸着HBsAgもベンチマーク対照として筋肉内投与した。マウスを28日目に安楽死させた。脾臓を摘出し、放血のために心臓穿刺を実施した。それぞれの免疫処置の前にも血液サンプルを採取した。血液サンプルを処理し、血清サンプルをELISAによる抗原特異的抗体の測定のために-80℃で凍結させた。抗原特異的抗体のレベルは先に記載したように測定した。脾細胞も前述のように再刺激した。
抗原特異的血清IgGレベルの比較は、MPLおよびDQ(重量ベースで調整)が、HBsAgと共に皮内に同時投与したとき、それぞれ29 489ng/mLおよび31 924ng/mLの幾何平均濃度の非常に類似した抗原特異的IgGレベルを誘導することを示した。いずれの場合にも、抗原特異的IgGレベルは、HBsAgのみを投与されたマウスによって産生されたレベルよりも有意に高かった。興味深いことに、一緒に製剤化した場合には、MPLとDQのアジュバント効果は、205 130ng/mLの幾何平均濃度を有する抗原特異的IgGの誘発のために、単なる相加作用を超えており、相乗効果の良い例を構成する(図3)。サイトカイン産生細胞を引き出す効力もまた、MPLがDQと共に製剤化されたときに最も高いことが示された。HBsAgペプチドまたは抗原による再刺激後に、三重陽性(TNF-α+、IFN-γ+、およびIL-2+)CD4およびCD8 T細胞の頻度は他のどの群よりも優れていた(図4)。
ユカタンミニブタにおける免疫原性/反応原性
最初のユカタンブタでの反応原性および免疫原性の試験は、以下の1)〜3)を行うために設計された：1)経皮パッチ適用後に大腸菌易熱性毒素(heat labile toxin：LT)によりもたらされる高色素沈着反応を再現する、2)DQアジュバント添加ワクチンを皮内投与した後に高色素沈着反応が生じないことを確実にする、および3)2回の免疫処置後にユカタンブタ系統において皮内HBsAgに対する特異的免疫応答を生成する可能性を検証する。簡単に説明すると、全部で9匹のユカタンブタ(雌3〜4ヶ月)を1群3匹の3群に分けた。第1群には、0日目に、100μl容量中のLTの5つの異なる用量(50μg、25μg、12.5μg、5μgおよび1μg)を腹部に皮内投与する。第2群には、0日目と28日目に、Engerix(1回1ml)を後肢に筋肉内投与する。第3群には、0日目と28日目に、100μl容量中の50μgのDQと混合した20μgのB型肝炎表面抗原を腹部に皮内投与する。皮内注射の注射部位を観察して、ドレイズスコアによって評価し、血清をそれぞれの免疫処置の前および56日目の犠牲時に回収して(第2および第3群)、抗原特異的IgGレベルをELISAにより測定した。注射後、動物は、反応原性の指標として紅斑、浮腫、硬結、壊死および色素沈着過剰について最大21日間、毎日モニターした。
抗原特異的血清抗体の測定は、以下のように実施した。簡単に説明すると、マイクロウェルNUNCプレートのウェルに最適濃度のHBsAgまたはヤギ抗ブタIgGを室温で1時間コーティングした。DPBS-T 0.05％-BSA 1％を用いて室温で30分間マイクロウェルを洗浄してブロッキングした後、血清サンプルをプレートに連続希釈し、そのプレートを室温で1時間インキュベートした。十分な洗浄工程の後に、ブタIgGを、HRP結合ヤギ抗ブタ二次抗体を用いて検出し(室温で1時間)、続いてTMB基質溶液と室温で30分間インキュベートした。この反応を1M硫酸で30分後に停止させた。プレートを450nmで読み取った。試験サンプルの抗体濃度は、ブタ基準血清を用いた、各プレートの標準曲線ランから計算した。特異的血清IgG濃度は、4パラメータ方程式を用いてSoftMaxProにより標準から計算した。値は、血清ミリリットルあたりの特異的抗体のナノグラムとして表した。
抗原特異的血清IgGの測定からは、ヒト用量のEngerixを筋肉内投与することからなるベンチマークワクチンと比較して、DQ(50μg)と共にHBsAg(20μg)を2回皮内投与された動物は、同じ回数の投与後にベンチマークワクチンによって誘発されたものと少なくとも同等の抗体レベルを生成することができる、ことが示された。ユカタンミニブタの脇腹の皮膚にLTを皮内注射した場合に、重篤な長期の炎症反応が注射部位に観察された。注射したLTのすべての用量について、また、群内の3匹すべてのブタにおいて、高色素沈着が認められた。これらの強い反応は、20μg HBs＋50μg DQで免疫した動物には存在しなかった。注射部位での乾燥肌(非常に軽い)の存在が、20μg HBs＋50μg DQを皮内注射された動物において認められた。さらに、特異的染色は、正常な皮膚に比べて、DQ免疫された皮膚部分においてメラニン含量のわずかな増加(かろうじて認知できる)を示した。しかし、20μg HBs＋50μg DQを注射した後には、メラニン色素沈着は、同じ経路で50μgのLTを受け取った群と比較して、ほとんど検出できないくらいずっと弱かった。
飼育ブタにおける免疫原性/反応原性
免疫原性の試験は、以前に筋肉内注射を介してEngerixにより誘発された応答を増強(ブースト)するための、アジュバント含有/不含HBsAgの皮内注射の能力を評価するために、飼育ブタ(Yorkshire/Landrace X Duroc)で実施した。簡単に説明すると、全部で25匹のブタ(雄と雌、生後3〜4ヶ月)を6群に分けて、各免疫処置の間に28日の間隔をおく2回の免疫処置のスケジュールに従って免疫した。動物は2回目の免疫処置の28日後に犠牲にする。最初の4つの群は1群5匹の動物からなり、第5群は3匹の動物(探索的グループ)、そして第6群は2匹のブタを含んでいた。第1群(ベンチマーク)には、ヒト用量のEngerix (Engerix HD)を筋肉内投与した。第2および3群には、1回目の免疫としてEngerix HDを筋肉内投与し、2回目の免疫として100μlの容量を用いてHBsAg(20μg)を単独でまたはDQ(50μg)と共に皮内投与した。第4群には、50μgのDQと混合した20μgのHBsAgを2回皮内注射し、そして第5群は、5μgのDQと混合した20μgのHBsAgを皮内に2回免疫した探索的グループである。血液サンプルをそれぞれの免疫処置の前および56日目の犠牲時に回収し、血清をELISAによる抗原特異的IgGの測定のために使用する。第6群からの2匹の動物は、エバンスブルー染色を用いて、関連する流入領域リンパ節を識別するために使用される。エバンスブルーを投与した動物は、流入領域リンパ節の観察のために注射後30分で犠牲にした。
筋肉内投与されたベンチマーク(Engerix HD)と比較して、筋肉内(IM)Engerix HDによる一次免疫、続いて50μgのDQと混合した20μgのHBsAgによる追加免疫を受けた群は、ベンチマークIMワクチンにより誘発されたものと同等の抗体応答を生成した(図6)。同じ観察が、50μgのDQと混合した20μgのHBsAgによる2回の免疫を同じスケジュールに従って受けた動物にも当てはまる。しかし、アジュバントなしに、初回および追加免疫レジメンに従って、追加免疫としてHBsAg(20μg)のみを皮内(ID)投与された群は、ベンチマーク群により生成された抗体応答に匹敵することができなかった。
皮内投与群の注射部位のスコアリングは、免疫処置後にドレイズスコア表を用いて行った。表1にまとめたように、HBsAg(20μg)＋DQ(50μg)を受けたすべての動物で、1回目の免疫処置の1日後に、わずかな皮膚の発赤(境界のはっきりした発赤)が、20mmの平均直径で認められた。免疫の2日後に、同じ免疫群の5匹のうち2匹の動物にのみ、かろうじて認知できる皮膚の発赤が観察された。3日目には皮膚反応は検出されなかった。DQ(5μg)と混合したHBsAg(20μg)を受けた群では、免疫1日後に、3匹のうち2匹の動物でかろうじて認知できる皮膚の発赤が観察されたが、2日目にはこの群で皮膚反応がまったく観察されなかった。2回目の免疫処置後、Engerixによる筋肉内への初回免疫およびDQ(50μg)と混合したHBsAg(20μg)による皮内への追加免疫を受けた群、ならびにDQ(50μg)と混合したHBsAg(20μg)を皮内に2回投与された群では、かろうじて認知できる紅斑反応が2日間観察された。DQ(5μg)と混合したHBsAg(20μg)を皮内に2回投与された群については、かろうじて認知できる紅斑反応が免疫処置後1日目だけ観察された。
Figure 2014533674

Claims (17)

  1. 皮膚免疫処置（cutaneous immunisation）に使用するための、1種以上の抗原とアジュバントとを含む免疫原性組成物であって、該アジュバントが免疫学的に活性なサポニンである、免疫原性組成物。
  2. 免疫学的に活性なサポニンがQuil Aから誘導される、請求項1記載の免疫原性組成物。
  3. Quil A誘導体がQS21である、請求項2記載の免疫原性組成物。
  4. 免疫学的に活性なサポニンがステロール、特にコレステロールを用いて製剤化される、前記請求項のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
  5. 免疫学的に活性なサポニンのステロールに対する比が1：1〜1：100の間、特に1：2〜1：10の間、とりわけ約1：5である、請求項4記載の免疫原性組成物。
  6. 皮膚免疫処置に使用するための、1種以上の抗原とアジュバントとを含む免疫原性組成物であって、該アジュバントがTLR-4アゴニストである、免疫原性組成物。
  7. TLR-4アゴニストが無毒化リピドA、特に3D-MPLである、請求項6記載の免疫原性組成物。
  8. 前記免疫原性組成物が、TLR-4アゴニスト、TLR7/8アゴニスト、またはフラジェリンもしくはその断片、または免疫学的に活性なサポニンからなる群より選択される1種以上の追加のアジュバントをさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
  9. 免疫学的に活性なサポニン、特にQS21(特にステロール、例えばコレステロールを用いて製剤化されたもの)と、TLR-4アゴニスト、特に3D-MPLを含む、前記請求項のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
  10. パッチの形態で投与される、前記請求項のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
  11. 短針デバイスを用いて投与される、前記請求項のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
  12. 前記TLR-5アゴニストがフラジェリンまたはTLR-5活性を有するその断片である、前記請求項のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
  13. 前記TLR-5アゴニストが超可変ドメインを欠失しているものである、前記請求項のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
  14. 前記TLR-5アゴニストがFliCΔ174-400; FliCΔ161-405 およびFliCΔ138-405からなる群より選択される、請求項5記載の免疫原性組成物。
  15. 前記抗原がB型肝炎ウイルスに由来し、特に前記抗原がB型肝炎表面抗原(HBsAg)である、前記請求項のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
  16. 皮膚免疫処置に使用するための、1種以上の抗原とアジュバントとを含む免疫原性組成物であって、該アジュバントが免疫学的に活性なサポニンである、免疫原性組成物。
  17. 皮膚免疫処置に使用するための、1種以上の抗原とアジュバントとを含む免疫原性組成物であって、該アジュバントが1種以上のTLRアゴニストであり、特にTLRアゴニストがTLR-2(例えば、Pam3Cys-lip)アゴニストまたはTLR7および/もしくは8アゴニスト(例えば、CRX642)である、免疫原性組成物。
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