CN104651233B - 一种新的重组禽流感病毒h5n1抗原制备的病毒维持液 - Google Patents

一种新的重组禽流感病毒h5n1抗原制备的病毒维持液 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物工程技术领域，特别是涉及一种新的重组禽流感病毒H5N1抗原制备的病毒维持液，所述的病毒维持液包括下述组分：6.5gDMEM高糖干粉培养基、5.0gDMEM低糖干粉培养基、1000ml注射用水、476.6mgHepes及1mLTPCK浓度为200mg/L的TPCK配置液；所述的TPCK配置液由10gTPCK干粉，加入50mlpH值为7.2的PBS溶液配制成规格为200mg/ml的TPCK配置液；所述的PBS溶液由氯化钠8.0g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠1.25g、磷酸二氢钾0.2g、用注射用水1000ml配制而成。本发明主要用于重组禽流感病毒H5N1抗原制备过程中。

Description

一种新的重组禽流感病毒H5N1抗原制备的病毒维持液
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，特别是涉及一种新的重组禽流感病毒H5N1抗原制备的病毒维持液。
背景技术
现行的禽流感H5N1灭活疫苗主要是在鸡胚上进行培养，收获尿囊液，灭活后制备成成品疫苗。这种方法存在一些弊端：鸡胚分离流感病毒或传代易引起病毒变异；鸡胚残留物可引起过敏性反应；鸡胚作为疫苗生产基质，在大规模生产时，存在潜在的外源病毒污染问题。但是，传统的细胞源疫苗所用病毒维持液一般与原细胞培养液成分一致，只是降低了血清的浓度；而目前研究的重组禽流感H5N1灭活疫苗是在原有细胞培养基上接毒，获得的重组禽流感H5N1病毒，其效价一般不高，达不到现行鸡胚疫苗规程的效价(Re-6株和Re-4株病毒液HA效价不低于1:256者方可用于制苗)。
文献检索披露：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所刘明等人，进行了重组H5N3禽流感疫苗株在MDCK细胞中大规模增殖条件研究，文章未涉及对禽流感鸡胚毒在MDCK细胞上的驯化及病毒维持液。另外华东理工大学黄锭等人“用于流感疫苗生产的MDCK细胞无血清单细胞悬浮培养体系的开发”及东北林业大学博士后流动站的李春艳微载体规模化培养MDCK细胞增殖H9N2亚型禽流感病毒的研究等大量文章，也均未涉及对禽流感鸡胚毒在MDCK细胞上的驯化和接毒前对原细胞营养液的置换，病毒维持液也完全不同。
发明内容
本发明的目的在于：采用一种新的重组禽流感H5N1的病毒维持液，可以稳定高效价地增殖重组禽流感H5N1病毒。整个病毒培养过程所获得的抗原，可以达到现行禽流感疫苗规程所规定的较高效价，该病毒维持液也用于禽流感鸡胚毒在贴壁MDCK细胞上的细胞种毒的驯化，同时在反应器上大规模增殖禽流感病毒也具有重要的应用价值。
本发明的目的是这样实现的：一种新的重组禽流感病毒H5N1抗原制备的病毒维持液，所述的病毒维持液包括下述组分：6.5gDMEM高糖干粉培养基、5.0gDMEM低糖干粉培养基、1000ml注射用水、476.6mgHepes及1mLTPCK浓度为2ug/L的TPCK配置液；所述的TPCK配置液由100mgTPCK干粉，加入50mlpH值为7.2的PBS溶液配制成规格为200mg/ml的TPCK配置液；所述的PBS溶液由氯化钠8.0g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠1.25g、磷酸二氢钾0.2g、用注射用水1000ml配制而成。
本发明的有益效果：本发明采用的一种新的重组禽流感H5N1的病毒维持液，用于生长良好的贴壁MDCK细胞的接毒培养，可以稳定高效价地增殖重组禽流感H5N1病毒。整个病毒培养过程所获得的抗原，可以达到现行禽流感疫苗规程所规定的较高效价，该病毒维持液对禽流感鸡胚毒在贴壁MDCK细胞上的细胞种毒的驯化也具有关键作用，同时在反应器上大规模增殖禽流感病毒也具有重要的应用价值。同时，通过大量试验证明本发明研制的重组禽流感H5N1细胞源灭活疫苗抗原制备的病毒维持液，对禽流感病毒的增殖达到现行鸡胚疫苗规程的效价起到至关重要的作用。解决了文献中常规接毒无法获得高效价病毒抗原的缺点。
具体实施方式
实施例1、一种新的重组禽流感病毒H5N1抗原制备的病毒维持液，所述的病毒维持液包括下述组分：6.5gDMEM高糖干粉培养基、5.0gDMEM低糖干粉培养基、1000ml注射用水、476.6mgHepes及1mLTPCK浓度为2ug/L的TPCK配置液；所述的TPCK配置液由100mgTPCK干粉，加入50mlpH值为7.2的PBS溶液配制成规格为200mg/ml的TPCK配置液；所述的PBS溶液由氯化钠8.0g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠1.25g、磷酸二氢钾0.2g、用注射用水1000ml配制而成。
具体实验验证：其1贴壁MDCK细胞的制备：取细胞密度为2.0×106个/ml的MDCK冻存管(1.0ml)，置于37℃水浴中，晃动溶解2-3分钟，在1000r/min条件下，离心5分钟，弃去上清，加入10-15ml细胞培养液，转入75cm2培养瓶中，置于37℃、5％的CO2培养箱中，培养72小时，形成致密单层备用。也可用浓度0.25％的EDTA-胰酶消化细胞，进行适当传代，直至达到所需的数量。
其2病毒液的制备：取其1中制备的致密单层细胞，用pH7.2的无菌PBS溶液清洗两遍，加入3ml病毒维持液，然后按MOI(病毒感染复数)10-4～10-5接种驯化好的重组禽流感H5N1Re-6株或Re-4株细胞种毒，旋紧瓶盖，置于37℃、5％的CO2培养箱中，吸附1小时，然后用病毒维持液补至10ml，置于37℃、5％的CO2培养箱中，培养72～96小时，当细胞病变达到75％以上时收毒。无菌取样，红细胞血凝抑制法测定HA效价。
上述细胞营养液由13.0gDMEM(高糖)干粉培养基，用注射水配制成1000ml，过滤除菌后加入新生牛血清100ml配制而成。
上述病毒维持液由6.5gDMEM(高糖)+5.0gDMEM(低糖)干粉培养基，用注射用水配制成1000ml，调整pH7.2～7.4，临用前分别加入20ml的1M Hepes(磷酸缓冲液)(终浓度20mMHepes)和1ml的2ug/ml的TPCK(终浓度2ug/mlTPCK)。
上述2ug/mlTPCK的配制由100mgTPCK干粉，加入50mlpH7.2的PBS溶液，完全溶解后过滤除菌，分装成1ml/支的小包装，-20℃冻存。
上述pH7.2的PBS溶液由氯化钠：8.0g氯化钾：0.2g磷酸氢二钠：1.25g磷酸二氢钾：0.2g用注射用水配制成1000ml配制而成。
上述1％红细胞悬液制备：采取2-4只2-6月龄SPF鸡血液，与等量阿氏液混合，1500r/min，离心10分钟。用0.85％生理盐水离心洗涤3-4次，每次1500r/min，离心10分钟，将沉积的红细胞用0.85％生理盐水制成1％悬液。
上述阿氏液配制：柠檬酸钠8g、柠檬酸0.325g、葡萄糖20.5g、氯化钠4.2g、蒸馏水1000ml。将上述成分溶化、过滤、分装。
上述MOI感染复数计算方法：病毒数量与细胞数量的比值，算式如下：
种毒所需体积(ml)＝(细胞数×MOI)/种毒的TCID50
上述选用的MDCK细胞购自美国ATCC；DMEM(高糖)干粉培养基为Hyclone公司生产，货号：AXM51149EC；DMEM(低糖)干粉培养基为Hyclone公司生产，货号：AWK25188RC；新生牛血清为兰州百灵公司生产，货号：20130410；EDTA-胰酶消化液为GIBCO生产，货号400660；TPCK为Sigma公司生产，货号：T8802。其他常用试剂均为国产分析纯试剂；Hepes磷酸缓冲液为Hyclone公司生产，货号：AZD189225。
本发明方法验证：禽流感病毒液在不同条件下接种MDCK细胞后病毒HA效价对比见表1。
表1最初3批次禽流感病毒液接种贴壁MDCK细胞后病毒HA效价
依据表1中试验数据分析用原来的细胞营养液接毒效果极差，考虑原因(1)不换新鲜营养液有可能病毒增殖所需养分不足，导致病毒增殖少。(2)有查资料说血清抑制禽流感的增殖。(3)收毒时pH值较低，禽流感病毒一般最适pH值为6.4-7.4左右，所以后续试验考虑降低糖浓度，以便减少产酸。
表2重复6批次禽流感病毒液接种贴壁MDCK细胞后病毒HA效价
依据表2数据可以得出病毒维持液DMED(高糖)+DMED(低糖)+20mMHepes+2ug/mlTPCK可以获得高效价的重组禽流感H5N1病毒抗原，可以达到或超过现行鸡胚疫苗规程的效价。
由上表1-表2数据所述：采用本发明新的重组禽流感H5N1的病毒维持液(DMED(高糖)+DMED(低糖)+20mMHepes+2ug/mlTPCK)，用于生长良好的贴壁MDCK细胞的接毒培养，可以稳定高效价地增殖重组禽流感H5N1病毒。整个病毒培养过程所获得的抗原，可以达到现行禽流感疫苗规程所规定的较高效价，该病毒维持液对禽流感鸡胚毒在贴壁MDCK细胞上的细胞种毒的驯化也具有关键作用，同时在反应器上大规模增殖禽流感病毒也具有重要的应用价值。

Claims (1)

1.一种新的重组禽流感病毒H5N1抗原制备的病毒维持液，其特征在于：所述的病毒维持液包括下述组分：6.5gDMEM高糖干粉培养基、5.0gDMEM低糖干粉培养基、1000ml注射用水、476.6mgHepes及1mLTPCK浓度为2ug/L的TPCK配置液；所述的TPCK配置液由100mgTPCK干粉，加入50mlpH值为7.2的PBS溶液配制成规格为200mg/ml的TPCK配置液；所述的PBS溶液由氯化钠8.0g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠1.25g、磷酸二氢钾0.2g 、用注射用水1000ml配制而成。
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