CN107669982B - 一种藏药组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种藏药组合物，是由按照重量份计的以下原料制备得到的：白莨菪20～40份，轮叶棘豆10～20份，水菖蒲10～20份，硼砂1～2份，秦艽5～10份，翼首草5～10份，信筒子5～10份，姜黄5～10份，可瓜子25～50份；并提供了其制备方法和应用。本发明的有益效果为：本发明公开了一种藏药组合物及其制备方法，以及其在防治多杀性巴氏杆菌引起的出血性败血症中的用途，是根据藏药理论及应用法则和传统用药经验，结合现代免疫药理和临床兽医学等技术方法，对藏药进行组方筛选，其组方合理，安全有效，原料易得，制备工艺简单，易于操作，经体外、体内药效试验研究，效果显著，在临床上具有广阔的推广应用价值。

Description

一种藏药组合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及藏药组合物技术领域，具体涉及一种藏药组合物及其制备方法和应用。
背景技术
牛多杀性巴氏杆菌病，又称出血性败血症，简称“牛出败”，是由多杀性多杀性巴氏杆菌引起的一类多种动物共患的一种急性热性败血性的传染病，在牧区内，常零星散发或地方流行，该病原是条件致病菌，一般常存在于健康牛的上呼吸道和消化道粘膜上，正常情况下不引起发病，当机体抵抗力降低时，如在天气骤变、长途运输、营养缺乏等不良应激因素作用下，病菌即可侵入体内大量繁殖，除内源性感染而发病外，也可经呼吸道、消化道以及损伤的皮肤和粘膜感染。西藏是全国五大牧区之一，其主导产业是牦牛，牦牛不仅是生产和生活资料提供者，还是牧区直接劳动力，对本地人民是很重要，而发病牦牛大多表现急性经过,未经确诊治疗便已死亡,死亡率较高，不仅带来巨大的经济损失，还对草场和水源造成二次污染。
近年来，由于抗生素的滥用，临床分离到的牛源多杀性巴氏杆菌耐药菌株不断增多，临床抗感染治疗效果也越来越差，有研究表明中药或天然植物提取物可发挥对病原菌的直接杀灭作用而不产生耐药性或提高其对抗生素的敏感性，故通过天然植物提取物用于临床已逐渐成为研究热点，而藏药生长环境得天独厚，药用成分积累高，药性纯正且副作用低，近年来研究很多。通过体外抑菌试验可以初步判断藏药组合物抑菌作用的大小，进一步通过体外抑菌试验可以筛选获得有效的中药组方，为畜牧养殖业的健康发展起到积极的保障作用。
发明内容
本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种藏药组合物及其制备方法。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一种藏药组合物，是由按照重量份计的以下原料制备得到的：白莨菪20～40份，轮叶棘豆10～20份，水菖蒲10～20份，硼砂1～2份，秦艽5～10份，翼首草5～10份，信筒子5～10份，姜黄5～10份，可瓜子25～50份。
进一步的，上述的一种藏药组合物，是由按照重量份计的以下原料制备得到的：白莨菪30份，轮叶棘豆15份，水菖蒲15份，硼砂1.5份，秦艽7.5份，翼首草7.5份，信筒子7.5份，姜黄7.5份，可瓜子37.5份。
本发明的第二个目的是提供了上述一种藏药组合物的制备方法，包括以下步骤：
1)按照重量份配比，分别准确称取白莨菪、轮叶棘豆、水菖蒲、硼砂、秦艽、翼首草、信筒子、姜黄和可瓜子，按每kg药材加水10-12L纯净水，置于圆筒锅中浸泡3.5-4h；
2)将加入原料药的圆筒锅放置于加热器上，2200W条件下加热30～40分钟至沸腾，然后降低加热器功率到800W，使其慢慢煮沸120min，用4层纱布进行过滤，得到第一次煎煮过滤的滤液，保存备用；
3)将第一次煎煮过滤的滤渣，再按每kg药材加水10-12L纯净水，2200W条件下加热30～40分钟至沸腾，然后降低加热器功率到800W，使其慢慢煮沸120min，将配比量的轮叶棘豆放进去，继续煮沸0.5h，用纱布进行过滤，得到第二次煎煮过滤的滤液，保存备用；
4)合并第一次煎煮过滤的滤液和第二次煎煮过滤的滤液，2200W条件下加热25～30分钟至沸腾，然后降低加热器功率到1200-1600W，煮沸210-240min，挥发多余水分后得到药物组合物浓缩液至800～1600ml，冷却后密封保存于4℃冰箱备用；
5)将药物组合物浓缩液50mL置于离心管中，4000r/min离心30min，吸取上清液于100mL三角瓶中，瓶口用纸紧密包两层，于100℃流通蒸汽灭菌30min，将灭菌后的药液放入4℃冰箱备用。
本发明的第三个目的是提供了上述一种藏药组合物在制备用于防治多杀性巴氏杆菌引起的出血性败血症的药物中的应用。
本发明的有益效果为：本发明公开了一种藏药组合物及其制备方法，以及其在防治多杀性巴氏杆菌引起的出血性败血症中的用途，是根据藏药理论及应用法则和传统用药经验，结合现代免疫药理和临床兽医学等技术方法，对藏药进行组方筛选，其组方合理，安全有效，原料易得，制备工艺简单，易于操作，经体外、体内药效试验研究，效果显著，在临床上具有广阔的推广应用价值。
具体实施方式
实施例1：
一种藏药组合物的制备方法
1材料与方法：
1.1材料：
药材：
白莨菪，轮叶棘豆，水菖蒲，硼砂，秦艽，翼首草，信筒子，姜黄，可瓜子。
仪器：
ZDX-35BI型座式自动电热压力蒸汽灭菌器、电子天平(AL204，梅特勒-托利多仪器上海有限公司)、数显恒温水浴锅(HH-2，国画电器有限公司)、电磁炉、GOODLOOK-1000型薄层色谱成像系统(上海科哲生化科技有限公司)、电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9070，上海鸿都电子科技有限公司)、数控超声波清洗器(KH7200DB,昆山禾创超声仪器有限公司)、实验室专用超纯水机、TDZ4-WS台式低速离心机、锥形瓶、漏斗、量筒、烧杯等。
2.方法：
2.1粉碎药材：
取白莨菪，轮叶棘豆，水菖蒲，硼砂，秦艽，翼首草，信筒子，姜黄，可瓜子9味药材各200g-300g左右，粉碎成粉末，分开装袋，保存。
2.2药材煎煮：
(1)藏药组合物的制备方法：
分别准确称取白莨菪20～40g，轮叶棘豆10～20g，水菖蒲10～20g，硼砂1～2g，秦艽5～10g，翼首草5～10g，信筒子5～10g，姜黄5～10g，可瓜子25～50g，放置于20L-30L的圆筒锅中，加水10-12L，浸泡3.5-4h；
(2)将加入原料药的圆筒锅放置于加热器上，2200W条件下加热30～40分钟至沸腾，然后降低加热器功率到800W,使其慢慢煮沸120min，用4层纱布进行过滤，得到第一次煎煮过滤的滤液，保存备用；
(3)将第一次煎煮过滤的滤渣，再加入10-12L纯净水，2200W条件下加热30～40分钟至沸腾，然后降低加热器功率到800W,使其慢慢煮沸120min，将准确称量的轮叶棘豆放进去，继续煮沸0.5h用纱布进行过滤，得到第二次煎煮过滤的滤液，保存备用；
(4)合并第一次煎煮过滤的滤液和第二次煎煮过滤的滤液，2200W条件下加热25～30分钟至沸腾，然后降低加热器功率到1200-1600W，煮沸210-240min，挥发多余水分后得到药物组合物浓缩液至800～1600ml，冷却后密封保存于4℃冰箱备用。
(5)将浓缩药液倒出50mL于离心管中，4000r/min离心30min，吸取上清液于100mL三角瓶中，瓶口用纸紧密包两层，于100℃流通蒸汽灭菌30min，将灭菌后的药液放入4℃冰箱备用。
药物组合物配比分组如表1所示。
表1
药物名称 组1配比量 组2配比量 组3配比量
白莨菪 20g 40g 30g
轮叶棘豆 10g 20g 15g
水菖蒲 10g 20g 15g
硼砂 1g 2g 1.5g
秦艽 5g 10g 7.5g
翼首草 5g 10g 7.5g
信筒子 5g 10g 7.5g
姜黄 5g 10g 7.5g
可瓜子 2g 50g 37.5g
实施例2：
藏药组合物对体外抑菌试验
1材料与方法
1.1藏药组合物与菌种
藏药组合物由白莨菪，轮叶棘豆，水菖蒲，硼砂，秦艽，翼首草，信筒子，姜黄，可瓜子组成，以上药材均购买于西藏亚郎藏药材销售有限公司。
菌种：多杀性巴氏杆菌(编号CVCC 1659)，购自于中国兽医微生物菌种保藏管理中心；
培养基：MH琼脂培养基(Mueller-Hinton Agar，MHA)，MH肉汤培养基(Mueller-Hinton borth，MHB)，均购自北京奥博星生物技术有限责任公司；LS4509增菌培养基，批号ZBAP-170716D，购自于广州市迪景微生物科技有限公司。
1.2实验动物
昆明小鼠，雌雄各半，体重(20±2)g，购自于中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物中心，连续饲喂7d，自由采食饮水，注意观察。
1.3仪器和试剂
HFsafe-1500生物安全柜，购自于上海力申科学仪器有限公司；高压灭菌锅(LDZS-50KBS)，购自于上海申安医疗器械厂；TDZ4-WS低速离心机，购自于湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；；HNYC-202T恒温培养振荡器，购自于天津欧诺仪器股份有限公司；VITEK 2COMPACT仪器，购自于生物梅里埃公司；电热恒温鼓风干燥箱，购自于上海鸿都电子科技有限公司沃特浦制水机，购自于四川沃特尔水处理有限公司；KQ-500DB型数控超声波清洗器，购自于昆山市超声仪器有限公司；CO2培养箱，购自于TABAI ESPEC CORD，Japan；革兰氏阴性细菌鉴定卡，产品批号2410112103，购自于梅里埃诊断产品(上海)有限公司；注射用硫酸链霉素，产品批号170103，购自于合肥强力动物药品有限责任公司；注射用青霉素钠，产品批号16050905-1，购自于哈药集团。
1.4细菌鉴定
将细菌复壮以后，接种于血平皿中划出单菌落，按照VITEK 2 COMPACT仪器，将细菌配制为0.50-0.63麦氏浓度的菌悬液，按照革兰氏阴性细菌鉴定卡的操作说明利用全自动微生物鉴定及药敏系统(VITEK 2 COMPACT)对该细菌进行鉴定。
1.5藏药组合物梯度浓度的配制
将配制的药液倒出50mL于离心管中，4000r/min离心30min，吸取上清液于100mL三角瓶中，瓶口用纸紧密包两层，于100℃流通蒸汽灭菌30min，将灭菌后的药液放入4℃冰箱备用。取8支10mL灭菌过的离心管，分别标号1-1、1-2～1-8，在超净台中每支管中分别加入3mL的无菌超纯水，在1-1管中加入3mL无菌的方剂1，混匀后吸出3mL于1-2管中，这是2倍稀释，再从1-2中吸出3mL于1-3管中，依次至1-8，则2-1～2-8倍的药浓度分别为500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.8、3.91g/L，做好标记，封口膜封上，于4℃冰箱备用。
1.6菌悬液的计数和制备
取8支灭菌离心管，每支准确加入2.7mL灭菌过的PBS缓冲溶液，将离心管依次标记为10-1～10-8，精密吸取0.3mL的菌悬液至10-1离心管中，此为10倍稀释，反复吹打使菌液混匀，从离心管中吸取0.3ml至10-2管中，混匀，依次稀释到10-8离心管，将每个离心管的菌液吸取100μL于MHA平皿上，涂布棒涂匀，每个浓度涂布2个板子，37℃恒温培养箱中培养18h，对菌落数在10～100之间的平皿进行计数，求平均值，单位为CFU/mL。菌落均匀平铺一层的可用于做牛津杯试验，用麦氏比浊法测定菌液浓度为106CFU/mL。
1.7牛津杯法测定藏药组合物的对细菌的体外作用
取2个MHA培养平皿，分别吸取100μL配制的巴氏杆菌菌悬液于MHA平皿上，涂布棒涂匀，每个上面放置4个牛津杯，每个牛津杯里加入200μL方剂的2-1～2-8倍的稀释药液，每个剂量组再做2组平行，并将平皿置于37℃培养箱中培养18h，观察细菌培养生长情况。
1.8藏药组合物对细菌的MIC值的测定
牛津杯试验有抑菌圈的可以做MIC值的测定实验。根据美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute)制定的微生物临床检验标准，采用宏量肉汤稀释法来测定MIC值。方剂对巴氏杆菌的MIC值测定：取10根试管，试管标号1-1、1-2～1-9、1-10，在每支试管里加1mL的MHB培养基，在1-1试管加入1mL无菌的方剂1原液，原液浓度为1g/mL，混匀，吸取1mL至1-2试管中，混匀，再从1-2试管中吸取1mL至1-3试管中，此为2倍稀释，依次稀释至1-8试管，混匀后从1-8试管吸出1mL扔掉。最后于试管1-1、1-2～1-9中分别加入配好的菌液(浓度为1×106CFU/mL)1mL，即每支试管里最终菌液浓度为5×105CFU/mL，前8管药液浓度依次为250、125、62.5、31.25、15.63、7.8、3.91、1.95g/L。试管1-9为菌液的阴性对照，试管1-10为空白对照。再做2组重复试验，将其放于37℃摇床中培养18h。
2.结果
2.1细菌鉴定结果
利用全自动微生物鉴定及药敏系统对试验中应用的细菌进行菌种鉴定，鉴定结果如表2所示。
表2
鉴定编号 鉴定结果 可靠性(％) 鉴定水平 鉴定次数
1 多杀性巴氏杆菌 97％ E 1
注：E：Excellent；VG：Very good；G：Good；A：Acceptable.
2.2牛津杯法测定结果
藏药组方的药物浓度大于等于62.5g/L时对多杀性巴氏杆菌具有一定的抑菌作用，当藏药组方浓度为500g/L时，它对多杀性巴氏杆菌的抑菌圈直径平均值为12.5mm。
2.3MIC值实验结果
藏药组方对多杀性巴氏杆菌的MIC值为15.63g/L。
实施例3：
藏药组合物对巴氏杆菌的体内抑菌试验：
1材料与方法
1.1藏药组合物与菌种
藏药组合物由白莨菪，轮叶棘豆，水菖蒲，硼砂，秦艽，翼首草，信筒子，姜黄，可瓜子组成，以上药材均购买于西藏亚郎藏药材销售有限公司。
菌种：多杀性巴氏杆菌(编号CVCC 1659)，购自于中国兽医微生物菌种保藏管理中心；
培养基：MH琼脂培养基(Mueller-Hinton Agar，MHA)，MH肉汤培养基(Mueller-Hinton borth，MHB)，均购自北京奥博星生物技术有限责任公司；
1.2实验动物
昆明小鼠，雌雄各半，体重(20±2)g，购自于中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物中心，连续饲喂7d，自由采食饮水，注意观察。
1.3仪器和试剂
HFsafe-1500生物安全柜，购自于上海力申科学仪器有限公司；高压灭菌锅(LDZS-50KBS)，购自于上海申安医疗器械厂；TDZ4-WS低速离心机，购自于湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；；HNYC-202T恒温培养振荡器，购自于天津欧诺仪器股份有限公司；VITEK 2COMPACT仪器，购自于生物梅里埃公司；电热恒温鼓风干燥箱，购自于上海鸿都电子科技有限公司沃特浦制水机，购自于四川沃特尔水处理有限公司；KQ-500DB型数控超声波清洗器，购自于昆山市超声仪器有限公司；CO2培养箱，购自于TABAI ESPEC CORD，Japan；革兰氏阴性细菌鉴定卡，产品批号2410112103，购自于梅里埃诊断产品(上海)有限公司；注射用硫酸链霉素，产品批号170103，购自于合肥强力动物药品有限责任公司；注射用青霉素钠，产品批号16050905-1，购自于哈药集团。
1.4细菌鉴定
在小鼠感染细菌后，取感染后小鼠脏器，涂板培养后，挑取单个菌落再次利用全自动微生物鉴定及药敏系统(VITEK 2 COMPACT)对感染模型是否成功进行鉴定。
1.5藏药组合物不同梯度浓度溶液的配制
将配制的药液倒出50mL于离心管中，4000r/min离心30min，吸取上清液于100mL三角瓶中，瓶口用纸紧密包两层，于100℃流通蒸汽灭菌30min，将灭菌后的药液放入4℃冰箱备用。取8支10mL灭菌过的离心管，分别标号1-1、1-2～1-8，在超净台中每支管中分别加入3mL的无菌超纯水，在1-1管中加入3mL无菌的方剂1，混匀后吸出3mL于1-2管中，这是2倍稀释，再从1-2中吸出3mL于1-3管中，依次至1-8，则2-1～2-8倍的药浓度分别为500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.8、3.91g/L，做好标记，封口后于4℃冰箱保存备用。
1.6菌悬液的计数和制备
取8支灭菌离心管，每支里面准确加入2.7mL灭菌过的PBS缓冲溶液，将离心管依次标记为10-1～10-8，精密吸取0.3mL的菌悬液至10-1离心管中，此为10倍稀释，反复吹打使菌液混匀，从离心管中吸取0.3ml至10-2管中，混匀，依次稀释到10-8离心管，将每个离心管的菌液吸取100μL于MHA平皿上，涂布棒涂匀，每个浓度设置2个平行，37℃恒温培养箱中培养18h，对菌落数在10～100之间的平皿进行计数，求平均值，单位为CFU/mL。菌落均匀平铺一层的可用于做牛津杯试验，此菌液浓度为106CFU/mL，将菌液配成这个浓度备用。
1.7小鼠体内感染巴氏杆菌防治作用
经预实验测定使小鼠致死率达到80％以上的巴氏杆菌的最小细菌浓度是1×10CFU/mL。其培养方式是：挑取血平皿上的一个巴氏杆菌单菌落接种于6mL MHB中，37℃180r/min培养7h，再吸取100μL接种于新的6mL MHB中，37℃140r/min培养12h，过夜放一天，稀释至10-7倍，尽量30min内用。
将小鼠随机分为预防组、治疗组和对照组，每组12只，雌雄各半。其中，预防组3组，每天分别灌胃该藏药组方药液，所用药液浓度为125g/L，分别灌胃0.5mL、0.3mL和0.1mL，连续灌胃5d，在第5d给药后1h，每只小鼠腹腔注射50μL的巴氏杆菌液(浓度是1×10CFU/ml)，观察小鼠精神状况及死亡情况。
治疗组3组，每只小鼠腹腔注射50μL的巴氏杆菌液(浓度是1×10CFU/ml)，感染1h后再治疗，分别灌胃0.5mL、0.3mL和0.1mL，所用药液浓度为125g/L。
对照组设有阴性对照组、阳性对照组和空白对照组，阴性对照组为感染巴氏杆菌后不治疗，阳性对照组为感染巴氏杆菌1h后使用青链霉素治疗，空白对照组既不感染细菌，也不给药，每日正常饲喂饮水，观察小鼠死亡情况，并记录。
2实验结果
2.1细菌鉴定结果
利用全自动微生物鉴定及药敏系统对试验中应用的细菌进行菌种鉴定，鉴定结果如表3所示。
表3
鉴定编号 鉴定结果 可靠性(％) 鉴定水平 鉴定次数
1 多杀性巴氏杆菌 97％ E 1
注：E：Excellent；VG：Very good；G：Good；A：Acceptable.
2.2小鼠体内防治实验结果
空白组小鼠正常存活，阳性对照组小鼠死亡率为0。实验组结果如下表所示：
预防组：方剂中0.3mL和0.1mL给药组预防效果较好，较之阴性对照死亡率100％分别降低了33.3％和18.2％。
治疗组：方剂中0.3mL给药组死亡率明显比阴性对照死亡率100％降低了16.7％，整体看来，该方剂的预防作用效果强于治疗作用。
小鼠体内防治实验结果如表4所示。
表4
Figure BDA0001452140830000091
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种具有防治多杀性巴氏杆菌作用的藏药组合物，其特征在于，是由按照重量份计的以下原料制备得到的：白莨菪20～40份，轮叶棘豆10～20份，水菖蒲10～20份，硼砂1～2份，秦艽5～10份，翼首草5～10份，信筒子5～10份，姜黄5～10份，可瓜子25～50份。
2.根据权利要求1所述的一种具有防治多杀性巴氏杆菌作用的藏药组合物，其特征在于，是由按照重量份计的以下原料制备得到的：白莨菪30份，轮叶棘豆15份，水菖蒲15份，硼砂1 .5份，秦艽7 .5份，翼首草7 .5份，信筒子7 .5份，姜黄7 .5份，可瓜子37 .5份。
3.根据权利要求1或2所述的一种藏药组合物在制备用于防治多杀性巴氏杆菌引起的出血性败血症的药物中的应用。
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CN105560444A (zh) * 2016-01-26 2016-05-11 中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所 一种用于治疗牦牛胃肠炎的藏药组合物及其制备方法和应用

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