CN105132330A - 一种可预防胃溃疡的发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum strain Lee及其用途 - Google Patents
一种可预防胃溃疡的发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum strain Lee及其用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种可预防胃溃疡的发酵乳杆菌LactobacillusfermentumstrainLee及其用途，保藏编号为CCTCCNO:M2013512的该菌株的耐酸性较强，在pH3.0的人工胃液下3h后存活率达到了40.48±1.84％，在0.3％浓度胆盐下存活率达到60％；LactobacillusfermentumstrainLee细胞的疏水性也达到了15.17±6.20％，在人的肠道内正常生长。LactobacillusfermentumstrainLee能够减小胃溃疡面积，降低胃溃疡程度，减少胃酸的分泌，不同程度的增加生长抑制素(SS)和血管活性肠肽(VIP)因子的水平，降低胃动素(MOL)和P物质(SP)因子水平，下调白细胞介素-6(IL-6),白细胞介素-12(IL-12),肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和干扰素-γ(IFN-γ)的水平。与胃溃疡药物奥美拉挫起到相似的作用，表现出一定的胃溃疡预防效果。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种可预防胃溃疡的发酵乳杆菌LactobacillusfermentumstrainLee及其用途。
背景技术
乳杆菌与人类生活关系密切，是广泛应用于食品发酵、工业乳酸发酵及医疗保健领域中的有益微生物之一。现已认识的乳杆菌属和双歧杆菌属中的许多种都具有特定的优良性质和遗传性状，表现出极强的益生菌特性。乳杆菌不仅能够提高食品营养价值，改善并赋予食品风味，减少香精香料等在食品中的添加，延长保存时间，还可以改善食品的功能性质。它能够通过分解食物中的蛋白质、糖类、合成维生素，提高食物的消化率和生物价，促进消化吸收，防治便秘，防治细胞老化。还能够减少人体胆固醇含量，改善血脂，增强免疫功能、抗变异原性、抗肿瘤、抗高血压等。近年来，乳杆菌以其特殊的生理活性和营养功能而成为益生菌的主要来源，正日益引起人们的重视。
胃溃疡是消化性溃疡中最常见的一种，在我国发病率较高，可发生于任何年龄，尤以青壮年居多。胃溃疡表现为胃粘膜组织损伤，也会引发组织出现炎症。胃溃疡的临床表现为上腹疼痛呈反复周期性发作，多表现为钝痛、灼痛或饥饿样痛，绝大部分人可出现各种消化不良的症状，但是有的也无任何症状，直至出现并发症。严重的并发症主要有出血、穿孔、癌变等，若不及时处理，可导致2.5％～8.0％的病死率。出现胃溃疡的症状下由于胃部不适，患者进食困难，慢性胃溃疡患者长期进食困难，还会引起营养不良、免疫力下降等问题。部分患者可出现溃疡恶化，严重影响患者身体健康和生活质量。一般来说胃溃疡本身不会引起患者死亡，一般经药物治疗后，症状缓解或消失，但溃疡愈合质量差，停药后极易复发，给患者的身心健康带来极大的危害。因此，寻找一种能够代替药物来预防胃溃疡的生物制品有很大的现实意义，微生态疗法恰是以一个崭新的手段解决了传统疗法存在的多种问题。
国内外对乳酸菌的生理功能有大量的研究报道，但对乳酸菌预防胃溃疡的功能性研究报道很少。关于乳酸菌预防胃溃疡的研究对食品科学、预防医学和微生态学等许多学科都有很大价值。发酵乳制品是人们摄入乳酸菌的一条重要渠道，筛选优良的具有预防胃溃疡和安全的乳酸菌菌株，对于开发功能性乳制品、丰富现有乳制品种类、提高乳品的附加值将具有重要意义。因此，具有预防胃溃疡的乳酸菌具很大的研究和应用价值。
在目前已经公开的文献与专利或专利申请中，例如CN104489687A公开了一株副干酪乳杆菌与中药材提取物复配，可用于预防和治疗非酒精性脂肪肝。CN104450586A公开了一种干酪乳杆菌及其组合物，所提供的干酪乳杆菌对糖肽类、单环β-内酰胺类和碳青霉烯类抗生素及磺胺具有耐受性，适用于食品、药品和/或保健品中。CN103333847A公开一株发酵乳杆菌，能够促进体内胆固醇的转化和分解，能有效降血脂。CN103756926A公开了一株具有耐酸性，在体内外对铜离子有较好的耐受能力的植物乳杆菌，可用于制备缓解铜毒性的药物组合物和发酵食品中。CN1796540A公开了具有抗肠道致病菌和抗氧化特性的双歧杆菌及其用途，用于制备食品组合物或药物组合物，杀死或抑制幽门螺旋杆菌或大肠杆菌，治疗由其引起的各种疾病。CN104430847A和CN104381440A采用相同发酵乳预防便秘保健用途。但是，这些专利或专利申请没有完全涉及具有预防胃溃疡性能的微生物或其功能。因此，目前还需要有一种具有预防胃溃疡的微生物及其含有它们的食品。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种可预防胃溃疡的发酵乳杆菌及其用途，主要提供一种可预防胃溃疡的发酵乳杆菌菌株和提供一种所述发酵乳杆菌在发酵食品中的用途。
本发明提供的一种可预防胃溃疡的发酵乳杆菌(LactobacillusfermentumstrainLee)于2013年10月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC中国武汉武汉大学)，保藏编号为CCTCCNO:M2013512。
从自然发酵牦牛酸乳中筛选出一株发酵乳杆菌(LactobacillusfermentumstrainLee)，利用形态特征、培养性状和生理生化特征等微生物学特性对该乳酸杆菌(LactobacillusfermentumstrainLee)鉴定为发酵乳杆菌，该菌株已于2013年10月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC中国武汉武汉大学)，保藏编号CCTCCNO:M2013512。
所述发酵乳杆菌的形态学特征具体为：
菌体特征：呈革兰氏染色阳性，细胞杆状，菌体约0.5-1.0μm宽，1.5-4μm长，成单、成对或者成链，不形成芽孢，两端圆形。
菌落特征：在MRS培养基上形成明显的菌落，直径在0.5-2.0mm之间，圆形，边缘整齐，乳白色，透明，表面湿润光滑，不产生色素。
所述发酵乳杆菌体内耐受特征为：发酵乳杆菌的菌株耐酸性较强，在pH3.0的人工胃液下3h后存活率为40.48±1.84％；在0.3％浓度胆盐下存活率达到60％；发酵乳杆菌细胞的疏水性为15.17±6.20％。
本发明的目的还在于提供可预防胃溃疡LactobacillusfermentumstrainLee发酵乳杆菌的用途：所述发酵乳杆菌制得的发酵乳杆菌工作发酵剂添加到乳制发酵食品中,所述发酵乳杆菌工作发酵剂的制备步骤包括:将所述发酵乳杆菌的原始菌种接种于12％重量的脱脂乳中，110℃灭菌10min，在37℃条件下培养14-16h至凝乳，连续培养活化两代，用作母发酵剂；将所述母发酵剂按3-5％体积接种于灭菌乳中，培养14-16h至凝乳，至该凝乳中的活菌数约109cfu/mL，得到目标发酵乳杆菌工作发酵剂。
所述乳制发酵食品包含乳酸菌奶饮料、乳粉、胶囊制品和发酵乳。
所述含有发酵乳杆菌的乳酸菌奶饮料是按照下述步骤制备得到的：
所述发酵乳杆菌的原始菌种在温度-75℃下以30％(重量)甘油悬液形式保存，或者在温度4℃下以冷冻干燥菌粉的形式保存备用；
原料乳在95℃下加热杀菌20min或在140℃下高温热杀菌2s，冷却到4℃，加入所述发酵乳杆菌工作发酵剂，使其浓度达到106cfu/mL以上，在4℃冷藏保存。
所述含有发酵乳杆菌的乳粉是按照下述步骤制备得到的：
所述发酵乳杆菌的原始菌种在温度-75℃下以30％(重量)甘油悬液形式保存，或者在温度4℃下以冷冻干燥菌粉的形式保存备用；
原料乳在95℃下加热杀菌20min或在140℃下高温热杀菌2s，然后冷却到37℃，再以原料乳体积的4％接菌量接种所述的发酵乳杆菌工作发酵剂，37℃下发酵16h，得到发酵乳杆菌发酵乳；所述发酵乳杆菌发酵乳和灭菌后的原料乳按照1:3(V:V)配比加入，进行均质，真空浓缩、喷雾干燥得到含发酵乳杆菌的乳粉。
所述含有发酵乳杆菌的胶囊制品是按照下述步骤制备得到的：
所述发酵乳杆菌的原始菌种在温度-75℃下以30％(重量)甘油悬液形式保存，或者在温度4℃下以冷冻干燥菌粉的形式保存备用；
将原料乳在140℃高温热杀菌2s，然后冷却至37℃，以原料乳体积的4％接菌量接种所述发酵乳杆菌工作发酵剂，在37℃下发酵16h，得到发酵乳杆菌发酵乳；将所述发酵乳杆菌发酵乳和灭菌后的原料乳按照以1:3(V:V))配比加入，均质，真空浓缩、喷雾干燥处理后得到乳粉，将得到含有发酵乳杆菌的胶囊制品。
所述含有发酵乳杆菌的发酵乳是按照下述步骤制备得到的：
所述发酵乳杆菌的原始菌种在温度-75℃下以30％(重量)甘油悬液形式保存，或者在温度4℃下以冷冻干燥菌粉的形式保存备用；
原料乳在95℃下加热杀菌20min或在140℃下高温热杀菌2s，然后冷却到37℃，再按照3-5％(体积)加入发酵乳杆菌工作发酵剂，再加入3-5％(体积)可共生的用于制备发酵乳制品的发酵剂，混匀后在37℃下混菌发酵至滴定酸度以乳酸计0.6-0.7％，然后冷却至4℃，再进行冷藏保存得到含有发酵乳杆菌的发酵乳。
所述发酵乳杆菌工作发酵剂的制备方法包括：
将所述发酵乳杆菌的原始菌种接种于12％(重量)的脱脂乳中，110℃灭菌10min，在37℃条件下培养14-16h至凝乳，连续培养活化两代，用作母发酵剂；将所述母发酵剂按3-5％(体积)接种于灭菌乳中，培养14-16h至凝乳，此时该凝乳中的活菌数约109cfu/mL，得到工作发酵剂，可以直接将这种工作发酵剂添加到食品中，或者与可共生的制备发酵乳的商业发酵剂如保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌一起使用制备发酵乳；或
将所述发酵乳杆菌的原始菌种接种于MRS液体培养基中，在37℃条件下培养12-16h进行活化，连续活化两代，然后将活化培养物按2-4％(体积)接种于MRS培养基中，培养16-18h，在4℃条件下4000r/min离心15min，去除上清夜，得到细胞沉淀，将沉淀用无菌脱脂乳制成悬浮液，得到工作发酵剂。
所述的加热杀菌是例如使用上海沃迪自动化装备股份有限公司销售的TW10D1000型管式杀菌机进行的。
所述的高温热杀菌是例如使用北京勇创嘉业机械设备有限公司销售的YC-104型板式超高温杀菌机进行的。
所述的均质是例如使用常州市均质机械有限公司销售的GJB500-40小型均质机进行的。
所述的浓缩是例如使用上海伟宙轻工机械有限公司销售的真空浓缩锅进行的。
所述的喷雾干燥是例如使用上海沃迪科技有限公司销售的实验型喷雾干燥机进行的。
所述的商品发酵剂优选的是保加利亚乳杆菌或嗜热链球菌。
在本发明的意义上，所述的原料乳是一种或多种选自脱脂奶、鲜奶、复原奶的原料乳。
本发明实施例的技术方案带来的有益效果如下：
本发明为一种分离自四川省若尔盖县牧民家自然发酵牦牛酸乳中的可预防胃溃疡的发酵乳杆菌和以该菌株为发酵剂或添加的发酵乳、健康食品以及动物保健制品中的应用，发酵乳杆菌(LactobacillusfermentumstrainLee)菌株的耐酸性较强，在pH3.0的人工胃液下3h后存活率达到了40.48±1.84％，在0.3％浓度胆盐下存活率达到60％，LactobacillusfermentumstrainLee细胞的疏水性也达到了15.17±6.20％。这表明发酵乳杆菌(LactobacillusfermentumstrainLee)能在人的肠道内正常生长。小鼠体内试验还表明，发酵乳杆菌(LactobacillusfermentumstrainLee)能够减小胃溃疡面积，降低胃溃疡程度，减少胃酸的分泌，不同程度的增加生长抑制素(SS)和血管活性肠肽(VIP)因子的水平，降低胃动素(MOL)和P物质(SP)因子水平，下调白细胞介素-6(IL-6),白细胞介素-12(IL-12),肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和干扰素-γ(IFN-γ)的水平。与胃溃疡药物奥美拉挫起到相似的作用，表现出一定的胃溃疡预防效果。
由于发酵乳杆菌来源于传统发酵食品，属公认安全(GenerallyRecognizedAsSafe,GRAS)菌种，可用于发酵食品中。
附图说明
为了更清楚的说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见的，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1发酵乳杆菌(LactobacillusfermentumstrainLee)菌落形态；
图2发酵乳杆菌(LactobacillusfermentumstrainLee)的菌体形态(l000x)；
图3各组小鼠胃溃疡程度(溃疡面积大小)；
图4各组小鼠胃溃疡程度(溃疡形态)；
图5小鼠胃液量；
图6小鼠胃液pH值；
图7实验期内各小组小鼠血清中各因子水平；
图8实验期内各小组小鼠血清中各细胞因子水平。
本发明的发酵乳杆菌(LactobacillusfermentumstrainLee)于2013年10月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，编号为CCTCCNO:M2013512。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：发酵乳杆菌(LactobacillusfermentumstrainLee)的分离、纯化及初步定。
该实施例按照下述步骤进行：
(1)LactobacillusfermentumstrainLee的分离、纯化。
以无菌操作吸取传统发酵牦牛酸奶样品500μL加入至5mL灭菌生理盐水混合作成1：10的均匀稀释液，并继续作一定比例的稀释。选择合适梯度的稀释液，用无菌枪头各吸取100μL分别涂布到MRS固体平板培养基中，30℃培养48-72h，观察记录菌落形态如图1所示。
用接种环(或灭菌牙签)从平板表面及内部挑取不同菌落接种于MRS液体培养基中，置30℃，300r/min摇床培养24-48h；重复以上步骤连续活化2代后进行涂片革兰氏染色镜检如图2所示。
确定为G+菌的继续活化，直至得到纯菌落(镜检无杂菌)，并进行过氧化氢酶实验。将G+和过氧化氢酶阴性的无芽孢杆菌、球菌及链球菌均暂定为乳酸菌，并保存，具体操作参照《微生物学实验技术》。
实验结果显示，从若盖尔县的十个样品中共分离出乳酸菌56株，样本乳酸菌活菌数平均在108cfu/mL数量级。
(2)LactobacillusfermentumstrainLee的初步鉴定。
革兰氏染色：取典型菌落涂片，进行革兰氏染色，在微生物显微镜油镜下观察菌体形态及其排列方式。挑取视野清晰、形态典型的菌株，进行拍照。过氧化氢酶实验：挑取固体培养基上菌落一接种环，置于洁净试管内，滴加3％过氧化氢溶液2mL，观察结果(于半分钟内发生气泡者为阳性，不发生气泡者为阴性)。
结果表明，从样品中共分离纯化出56株乳酸菌，这些菌株均能在含5‰CaCO3的MRS平板培养基上生长，并在菌落周围形成溶钙圈，革兰氏染色阳性，过氧化氢酶试验阴性。
实施例2：发酵乳杆菌(LactobacillusfermentumstrainLee)的体外筛选。
(1)益生菌耐受pH3.0人工胃液的筛选。
人工胃液的配制：NaCl0.2％、胃蛋白酶0.35％、用1M的HCl调整pH值为3.0后，在无菌操作台中用真空泵抽滤除菌后备用。
益生菌对人工胃液耐受性的测定：取5mL已经活化好的菌株培养液，在无菌操作台中倒入已灭菌10mL离心管中，经3000r/min离心10min收集菌体，加入5mL灭菌生理盐水混匀制成菌悬液，取1mL菌悬液与9mLpH3.0的人工胃液混合，摇匀，置于恒温振荡器中培养(37℃，300r/min)，并分别在0h和3h取样，用MRS琼脂培养基倾注37℃培养48h。用平板计数法测定活菌数，计算其存活率(％)：存活率(％)＝3h的活菌数/0h的活菌数×100％。
(2)益生菌耐受不同浓度胆盐的测定。
选择在pH3.0人工胃液中存活率在10％以上的菌种做不同胆盐浓度下的生长测试。将活化好的菌种5mL按2％的接种量(100μL)用移液枪分别接种于含0.0％牛胆盐(即空白)、0.3％牛胆盐、0.5％牛胆盐、l.0％牛胆盐(W/V)的MRS-THIO培养基(MRS培养基中加0.2％的巯基乙酸钠)。在恒温振荡器中37℃培养24h后，以空白培养基为对照(未接种的MRS-THIO培养基)，分别测定上述不同浓度培养基的OD值，计算菌株对胆盐的耐受力。胆盐耐受力＝含胆盐的培养基的OD值/空白培养基的OD值×100％。
(3)菌液浓度调整。
选择在pH3.0人工胃液中存活率在10％以上、耐胆盐较强的的菌种，经镜检观察菌体生长形态良好后进行试验，将活化好的细菌培养物5mL，在无菌操作台中倒入已灭菌10mL离心管中，以3000r/min离心10min收集菌体。以5mLPBS(50mM，pH6.5)缓冲液洗涤菌体，3000r/min离心10min，重复洗涤两次。以PBS缓冲液为空白对照，用缓冲液调整受试菌株菌体浓度，使其在560nm波长下A0值约为1.00。
取4mL调整好浊度的菌液于已灭菌10mL离心管中，加入0.8mL二甲苯，对照组不加二甲苯，振荡30s，停顿10s，后再振荡30s，于试管架上静置5～10min分层，取下层水相，以PBS缓冲液为空白对照，在560nm下测量A值并进行记录。疏水率H％＝[(A0-A)/A0]×100其中A0和A分别是与二甲苯混匀前、后菌液在560nm下测量得到的A值。
乳酸菌是正常肠道菌的一部分，作为益生菌的首要条件之一，是能在胃和小肠前段存活，被筛选的菌株应具有足够的耐酸性和酸性环境下生长发育的特性。
LactobacillusfermentumstrainLee的筛选结果如下表1所示：
表1
筛选结果表明，LactobacillusfermentumstrainLee菌株能耐受pH3.0的环境，且存活率都在50％以上，在pH3.0胃液下存活率达到了40.48±1.84％。
通过胃后存活的菌体将与小肠中的胆盐接触，本实验把乳酸菌对胆盐的抵抗能力用于作为潜在益生菌的一个选择标准。耐酸性较好的LactobacillusfermentumstrainLee菌株耐受不同浓度胆盐的的结果是对0.3％的胆盐有一定的耐受力，当胆盐浓度升高至0.5％及1.0％时，LactobacillusfermentumstrainLee体现出了很好的胆盐耐受力。
除对小肠中胆盐有一定抵抗能力的同时，乳酸菌还需在小肠粘膜上有很好的粘附性，因此将乳酸菌的疏水能力作为另一选择标准，从表中可以看出，LactobacillusfermentumstrainLee的疏水性达到了15.17±6.20％。
通过以上实验我们筛选出了耐酸性、耐胆盐及疏水性较好的LactobacillusfermentumstrainLee乳杆菌，该菌株已于2013年10月30日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏编号CCTCCNO:M2013512。
实施例3：利血平诱导胃溃疡实验。
饲喂健康SPF级昆明小鼠，体重23±2g，雄性，50只。喂食基础饲料适应7d后，将小鼠根据体重随机分成5组，分别为：正常组、胃溃疡对照组、奥美拉挫组、Lactobacillusbulgaricus组和LactobacillusfermentumstrainLee组，每组10只。饲养在不锈钢笼中，室温保持24±2℃，相对湿度50±10％，12h明暗轮换(8:00～20:00照明)。在整个实验周期，正常组和胃溃疡对照组每日灌胃0.2mL生理盐水，Lactobacillusbulgaricus组和LactobacillusfermentumstrainLee组的实验小鼠分别每天按1.0×109CFU/kg灌胃0.2mL相应的菌液。奥美拉挫组每日按30mg/kg灌胃0.2mL奥美拉挫稀释液，在实验过程中，未出现小鼠对灌胃物质不适出现死亡的情况。实验期间各组小鼠自由摄食和饮水，实验期四周。四周后，除正常组小鼠外，其余四组小鼠均实施腹腔皮下注射0.2mL利血平悬浮液(10mg/kg)。注射24小时后，将5组小鼠全部处死解剖，摘取小鼠全胃，浸泡入福尔马林中，10min后用数码相机拍照，并用ImageJ软件分析胃溃疡面积，计算胃溃疡指数。
实验期内各小组小鼠胃溃疡程度如图3和图4所示。
利血平(10mg/kg)诱导胃溃疡各组小鼠胃溃疡程度如下表2：
a～e不同字母表示具有统计学差异(p<0.05)，下同.
表2
对小鼠用利血平诱导胃溃疡后观察小鼠胃部溃疡面积，由表2可知，各组小鼠的胃溃疡面积存在显著性差异(P﹤0.05)。对照组的溃疡最为严重，溃疡面积达到(7.08±1.52)mm2，灌食Lactobacillusbulgaricus菌液和LactobacillusfermentumstrainLee菌液的小鼠胃溃疡面积分别下降到(5.22±0.32)和(2.31±0.41)mm2。由表2实验数据可以看到奥美拉挫是一种具有良好药效的治疗胃溃疡药物。LactobacillusfermentumstrainLee可以减小胃溃疡面积，降低胃溃疡程度，效果大于普通的保加利亚乳杆菌。
实施例4：利血平(10mg/kg)诱导胃溃疡各组小鼠的胃液量和胃液pH的测定。
将小鼠脱颈椎处死，收集解剖后的小鼠胃液，测定小鼠胃液分泌量，用pH计测定胃液的pH值。实验期内各小组小鼠胃液量和胃液pH值如图5和图6所示。
利血平(10mg/kg)诱导胃溃疡各组小鼠的胃液量和胃液pH如下表3：
表3
胃溃疡发生后胃部大量分泌胃酸，胃酸进一步刺激胃溃疡加重，两者具有正相关性。而pH值由于胃酸增多而降低，与胃溃疡程度是负相关。LactobacillusfermentumstrainLee缓解了胃溃疡程度，使胃液量较对照组下降，pH值增加，效果比Lactobacillusbulgaricus更为显著。
实施例5：小鼠血清中各因子水平的测定。
脱颈椎处死小鼠，取小鼠动脉血浆0.2mL，在4℃、3000r/min离心10min，取上层血清。按测试剂盒说明书的方法测定胃动素(MOL)、生长抑制素(SS)、P物质(SP)和血管活性肠肽(VIP)因子在血清中的水平。实验期内各小组小鼠血清中各因子水平如图7所示。
利血平(10mg/kg)诱导胃溃疡各组小鼠的胃动素(MOL)，P物质(SP)，生长抑素(SS)和血管活性肠肽(VIP)水平如下表4：
表4
相对于胃溃疡对照组，LactobacillusfermentumstrainLee能不同程度的降低血清的MOL、SP、因子水平，增加SS和VIP因子水平。所以LactobacillusfermentumSuo对胃溃疡有预防作用。
实施例6：小鼠血清中细胞因子水平的测定。
脱颈椎处死小鼠，取小鼠动脉血浆0.2mL，在4℃、3000r/min离心10min，取上层血清。采用定量酶联检测试剂盒，按酶联免疫法用紫外分光光度计，在450nm波长处检测血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，白细胞介素-6(IL-6)，白细胞介素-12(IL-12)和干扰素-γ(IFN-γ)水平。实验期内各小组小鼠血清中各细胞因子水平如图8所示。
利血平(10mg/kg)诱导胃溃疡各组小鼠的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，白细胞介素-6(IL-6)，白细胞介素-12(IL-12)和干扰素-γ(IFN-γ)水平如下表5：
表5
IL-6是由T.B细胞和单核巨噬细胞分泌的细胞因子，在多种自身免疫性疾病中有异常，并与这些疾病的病理过程及病情严重程度有关.溃疡患者体内多种异常抗体，免疫复合物及合并病原微生物感染可通过不同途径刺激单核一巨噬细胞产生并释放TNF-α至血循环中，导致血中TNF-α增高.增高的TNF-α与炎症细胞相互作用，加重炎症反应，同时可刺激血中和炎症细胞分泌其他细胞因子，促进损伤.同时高活性的IL-6与体内产生异常抗体有关，通过抗原一抗体反应，激活补体，使组织损伤进一步加重.由此证实溃疡患者存在免疫功能紊乱，TNF-α和IL-6在溃疡的发生和病情发展中起着重要作用.IL-12和IFN-γ是促炎症细胞因子，IL-12能促进T细胞和NK细胞的发育与增殖,并刺激这些细胞产生IFN-γ,IFN-γ也会增加IL-12的分泌。已有研究显示,IFN-γ和IL-12可通过相互作用的参与溃疡的的发病与治疗。在临床研究中，下调IL-6,IL-12,TNF-α和IFN-γ的水平可以减轻胃溃疡的程度。LactobacillusfermentumstrainLee表现出下调IL-6,IL-12,TNF-α和IFN-γ的水平的能力，效果明显好于Lactobacillusbulgaricus，可认为LactobacillusfermentumstrainLee具有良好的抑制胃溃疡作用，且达到接近药物奥美拉挫的效果。
应用实施例1：利用发酵乳杆菌(LactobacillusfermentumstrainLee)制造乳酸菌奶饮料。
首先，所述发酵乳杆菌(LactobacillusfermentumstrainLee)原始菌种在温度-75℃下以30重量％甘油悬液形式保存，或者在温度4℃下以冷冻干燥菌粉的形式保存备用。
然后，可以采用两种方法制备本发明的发酵乳杆菌(LactobacillusfermentumstrainLee)工作发酵剂：
第一种方法是将上述发酵乳杆菌(LactobacillusfermentumstrainLee)原始菌种接种于12重量％在110℃灭菌10min的脱脂乳中，在37℃条件下培养14-16h至凝乳，连续培养活化两代，用作母发酵剂；将所述母发酵剂按3-5％(体积)接种于灭菌乳中，培养14-16h至凝乳，此时该凝乳中的活菌数约109cfu/mL，得到所述的工作发酵剂，可以直接将这种工作发酵剂添加到食品中，或者与可共生的制备发酵乳的商业发酵剂如保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌一起使用制备发酵乳。
第二种方法是将上述发酵乳杆菌(LactobacillusfermentumstrainLee)原始菌种接种于MRS液体培养基中，在37℃条件下培养12-16h进行活化，连续活化两代，然后将活化培养物按2-4％(体积)接种于MRS培养基中，培养16-18h，在4℃条件下4000r/min离心15min，去除上清夜，得到细胞沉淀，将沉淀用一定量的无菌脱脂乳制成悬浮液，得到工作发酵剂备用。
然后，原料乳在95℃下加热杀菌20min或在140℃下高温热杀菌2s，然后冷却到4℃，再加入前面所述的发酵乳杆菌(LactobacillusfermentumstrainLee)工作发酵剂，使其浓度达到106cfu/ml以上，在4℃冷藏保存即得到含发酵乳杆菌LactobacillusfermentumstrainLee活菌的乳酸菌奶饮料。
在本发明中，所述的MRS液体培养基是本技术领域的技术人员熟知的，是索莱宝公司销售的用于乳杆菌培养的培养基。
所述的加热杀菌是例如使用上海沃迪自动化装备股份有限公司销售的TW10D1000型管式杀菌机进行的。
所述的高温热杀菌是例如使用北京勇创嘉业机械设备有限公司销售的YC-104型板式超高温杀菌机进行的。
应用实施例2：利用发酵乳杆菌(LactobacillusfermentumstrainLee)制造乳粉。
按照上述乳酸菌奶饮料的制备方法制备，只是原料乳在95℃下加热杀菌20min或在140℃下高温热杀菌2s，然后冷却到37℃，再以原料乳体积的4％接菌量接种前面所述的发酵乳杆菌(LactobacillusfermentumstrainLee)工作发酵剂，再在37℃下发酵16h，得到发酵乳杆菌(LactobacillusfermentumstrainLee)发酵乳；然后所述的发酵乳杆菌(LactobacillusfermentumstrainLee)发酵乳按照1:3(V:V)加到上述灭菌原料乳中，进行均质，真空浓缩、喷雾干燥得到含发酵乳杆菌(LactobacillusfermentumstrainLee)的乳粉。
所述的均质是例如使用常州市均质机械有限公司销售的GJB500-40小型均质机进行的。
所述的浓缩是例如使用上海伟宙轻工机械有限公司销售的真空浓缩锅进行的。
所述的喷雾干燥是例如使用上海沃迪科技有限公司销售的实验型喷雾干燥机进行的。
应用实施例3:利用发酵乳杆菌(LactobacillusfermentumstrainLee)制造胶囊制品。
将原料乳在140℃高温热杀菌2s，然后冷却至37℃，以原料乳体积的4％接菌量接种本发明的发酵乳杆菌(LactobacillusfermentumstrainLee)工作发酵剂，在37℃下发酵16h，得到发酵乳杆菌(LactobacillusfermentumstrainLee)发酵乳。将发酵乳杆菌(LactobacillusfermentumstrainLee)发酵乳以1:3(V:V)加入灭菌后的原料乳中均质，经真空浓缩、喷雾干燥处理后得到乳粉，将得到的乳粉装到胶囊中制成胶囊制品。
应用实施例4：利用发酵乳杆菌(LactobacillusfermentumstrainLee)制备发酵乳。
按照上述乳酸菌奶饮料的制备方法制备，只是原料乳在95℃下加热杀菌20min或在140℃下高温热杀菌2s，然后冷却到37℃，再按照3-5％(体积)加入前面所述的发酵乳杆菌(LactobacillusfermentumstrainLee)工作发酵剂，再加入3-5％(体积)可共生的制备发酵乳商品发酵剂，混匀后在37℃下混菌发酵至滴定酸度以乳酸计0.6-0.7％，然后冷却至4℃，再进行冷藏保存得到所述的发酵乳。
所述的商品发酵剂优选的是保加利亚乳杆菌或嗜热链球菌。
在本发明的意义上，所述的原料乳是一种或多种选自脱脂奶、鲜奶、复原奶的原料乳。
以上所述，仅为本发明的具体实施例，但本发明的特征并不局限于此，任何熟悉该项技术的人在本发明领域内，可轻易想到的变化或修饰，都应涵盖在以下本发明的申请专利范围中。
Claims (9)
1.一种可预防胃溃疡的发酵乳杆菌LactobacillusfermentumstrainLee，于2013年10月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC中国武汉武汉大学)，保藏编号为CCTCCNO:M2013512。
2.如权利要求1所述的发酵乳杆菌，其特征在于，所述发酵乳杆菌的形态学特征具体为：
菌体特征：呈革兰氏染色阳性，细胞杆状，菌体约0.5-1.0μm宽，1.5-4μm长，成单、成对或者成链，不形成芽孢，两端圆形；
菌落特征：在MRS培养基上形成明显的菌落，直径在0.5-2.0mm之间，圆形，边缘整齐，乳白色，透明，表面湿润光滑，不产生色素。
3.如权利要求1所述的发酵乳杆菌，其特征在于，所述发酵乳杆菌体内耐受特征为：
发酵乳杆菌的菌株耐酸性较强，在pH3.0的人工胃液下3h后存活率为40.48±1.84％；在0.3％浓度胆盐下存活率达到60％；发酵乳杆菌细胞的疏水性为15.17±6.20％。
4.权利要求1或2或3所述可预防胃溃疡LactobacillusfermentumstrainLee发酵乳杆菌的用途，其特征在于，所述发酵乳杆菌制得的发酵乳杆菌工作发酵剂添加到乳制发酵食品中,所述发酵乳杆菌工作发酵剂的制备步骤包括:将所述发酵乳杆菌的原始菌种接种于12％重量的脱脂乳中，110℃灭菌10min，在37℃条件下培养14-16h至凝乳，连续培养活化两代，用作母发酵剂；将所述母发酵剂按3-5％体积接种于灭菌乳中，培养14-16h至凝乳，至该凝乳中的活菌数约109cfu/mL，得到目标发酵乳杆菌工作发酵剂。
5.如权利要求4所述的发酵乳杆菌的用途，其特征在于，所述乳制发酵食品包括乳酸菌奶饮料、乳粉、胶囊制品、发酵乳。
6.如权利要求5所述的发酵乳杆菌的用途，其特征在于，所述含有发酵乳杆菌的乳酸菌奶饮料是按照下述步骤制备得到的：
所述发酵乳杆菌的原始菌种在温度-75℃下以30％重量甘油悬液形式保存，或者在温度4℃下以冷冻干燥菌粉的形式保存备用；
原料乳在95℃下加热杀菌20min或在140℃下高温热杀菌2s，冷却到4℃，加入所述发酵乳杆菌工作发酵剂，使其浓度达到106cfu/mL以上，在4℃冷藏保存；
所述的原料乳是一种或多种选自脱脂奶、鲜奶、复原奶的原料乳。
7.如权利要求5所述的发酵乳杆菌的用途，其特征在于，所述含有发酵乳杆菌的乳粉是按照下述步骤制备得到的：
所述发酵乳杆菌的原始菌种在温度-75℃下以30％重量甘油悬液形式保存，或者在温度4℃下以冷冻干燥菌粉的形式保存备用；
原料乳在95℃下加热杀菌20min或在140℃下高温热杀菌2s，然后冷却到37℃，再以原料乳体积的4％接菌量接种所述的发酵乳杆菌工作发酵剂，37℃下发酵16h，得到发酵乳杆菌发酵乳；所述发酵乳杆菌发酵乳和灭菌后的原料乳按照1:3(V:V)配比加入，进行均质，真空浓缩、喷雾干燥得到含发酵乳杆菌的乳粉。
8.如权利要求5所述的发酵乳杆菌的用途，其特征在于，所述含有发酵乳杆菌的胶囊制品是按照下述步骤制备得到的：
所述发酵乳杆菌的原始菌种在温度-75℃下以30％重量甘油悬液形式保存，或者在温度4℃下以冷冻干燥菌粉的形式保存备用；
将原料乳在140℃高温热杀菌2s，然后冷却至37℃，以原料乳体积的4％接菌量接种所述发酵乳杆菌工作发酵剂，在37℃下发酵16h，得到发酵乳杆菌发酵乳；将所述发酵乳杆菌发酵乳和灭菌后的原料乳按照以1:3(V:V))配比加入，均质，真空浓缩、喷雾干燥处理后得到乳粉，将得到含有发酵乳杆菌的胶囊制品。
9.如权利要求5所述的发酵乳杆菌的用途，其特征在于，所述含有发酵乳杆菌的发酵乳是按照下述步骤制备得到的：
所述发酵乳杆菌的原始菌种在温度-75℃下以30％重量甘油悬液形式保存，或者在温度4℃下以冷冻干燥菌粉的形式保存备用；
原料乳在95℃下加热杀菌20min或在140℃下高温热杀菌2s，然后冷却到37℃，再按照3-5％(体积)加入发酵乳杆菌工作发酵剂，再加入3-5％体积可共生的用于制备发酵乳制品的发酵剂，混匀后在37℃下混菌发酵至滴定酸度以乳酸计0.6-0.7％，然后冷却至4℃，再进行冷藏保存得到含有发酵乳杆菌的发酵乳。
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