CN116694492A - 幽门螺杆菌增菌培养基及其制备方法和幽门螺杆菌的增菌方法 - Google Patents

幽门螺杆菌增菌培养基及其制备方法和幽门螺杆菌的增菌方法 Download PDF

Info

Publication number
CN116694492A
CN116694492A CN202210178030.6A CN202210178030A CN116694492A CN 116694492 A CN116694492 A CN 116694492A CN 202210178030 A CN202210178030 A CN 202210178030A CN 116694492 A CN116694492 A CN 116694492A
Authority
CN
China
Prior art keywords
helicobacter pylori
dosage
increasing
culture medium
broth
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210178030.6A
Other languages
English (en)
Inventor
卢先雷
刘宏
卢恒屹
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhuhai Xihe Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Zhuhai Xihe Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhuhai Xihe Biotechnology Co ltd filed Critical Zhuhai Xihe Biotechnology Co ltd
Priority to CN202210178030.6A priority Critical patent/CN116694492A/zh
Publication of CN116694492A publication Critical patent/CN116694492A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/38—Chemical stimulation of growth or activity by addition of chemical compounds which are not essential growth factors; Stimulation of growth by removal of a chemical compound
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/045—Culture media therefor
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了一种幽门螺杆菌增菌培养基及其制备方法和幽门螺杆菌的增菌方法，涉及微生物培养技术领域，本发明提供的幽门螺杆菌增菌培养基，含有幽门螺杆菌生长所必需的营养元素以及特定的氧化还原电势，优越的生长环境可大幅度提升幽门螺杆菌的检出率；游离氧淬灭体系可以消除培养基中有毒的氧自由基，维持幽门螺杆菌最佳的繁殖环境，可大幅度提升阳性率。用对幽门螺杆菌无效的复合抗生素与抗真菌药抑制标本中的阳性球菌、阴性杆菌、阳性杆菌、念珠菌等杂菌，便于纯化幽门螺旋杆菌。

Description

幽门螺杆菌增菌培养基及其制备方法和幽门螺杆菌的增菌 方法
技术领域
本发明涉及微生物培养技术领域，尤其是涉及一种幽门螺杆菌增菌培养基及其制备方法和幽门螺杆菌的增菌方法。
背景技术
幽门螺杆菌或幽门螺旋菌，英文名Helicobacter pylori，简称Hp。是革兰氏阴性、微需氧的细菌，生存于胃部及十二指肠的各区域内，形态是一种单极多鞭毛、末端钝圆、螺旋形弯曲的细菌，长2.5～4.0μm，宽0.5～1.0μm。它会引起胃黏膜轻微的慢性感染，进一步导致胃及十二指肠溃疡与胃癌，1982由澳大利亚科学家巴里·马歇尔(BarryJ.Marshall)和罗宾·沃伦(J.RobinWarren)二人从慢性活动性胃炎患者的胃黏膜活检组织中首次分离成功该菌，是目前所知能够在胃酸中繁殖的惟一微生物种类。幽门螺杆菌会产生空泡毒素，导致胃粘膜的坏死和溃疡，甚至诱发癌变。幽门螺杆菌感染了全中国50％以上的人群，感染者中很大部分会发生慢性活动性胃炎，在此基础上部分患者可发生消化不良、消化性溃疡，极少部分患者可发生胃恶性肿瘤(胃癌、胃MALL淋巴瘤)。幽门螺杆菌胃炎已被定义为临床最常见的感染性疾病之一。根据临床数据，我国人群中感染胃幽门螺杆菌，使用三联疗法敏感菌株和耐药菌株在疗程为14天的根除率分别为 95％和＜50％。三联疗法中常用的抗生素——克拉霉素、甲硝唑、左氧氟沙星三种抗生素在国外的监测数据中单药耐药率居高不下，其中：克拉霉素耐药率约为20-45％、甲硝唑耐药率约为40-70％、左氧氟沙星耐药率约为 20-45％，目前依然缺乏权威机构系统的体外诊断监测数据，只能从治疗失败的案例统计中得出胃幽门螺杆菌的临床耐药率，该数字很高且各地区存在差异。
造成上述现状的主要原因是幽门螺杆菌需要的样本胃粘膜组织采集需要特殊侵入性技术以及包含弯曲菌在内的微需氧菌的特殊培养技术导致的。首先幽门螺杆菌存在部位特殊导致采样困难，其次由于胃幽门螺杆菌与弯曲菌一样需要特殊营养结构和特殊气体构成，需求比较苛刻，传统培养方法很难让幽门螺杆菌在离开人体之后还能生长出来，如果培养不到幽门螺杆菌，药敏试验就无从谈起。没有药敏实验也就无法预测抗生素的临床有效性。也就无法指导临床的合理用药，经验用药由于全球耐药泛滥的现状，尤其是耐药背景的地区差异已经造成了很大的治疗失败和资源浪费，因此幽门螺杆菌药敏试验就显得非常迫切了！
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种幽门螺杆菌增菌培养基，以至少解决现有技术中存在的技术问题之一。
本发明的目的之二在于提供上述幽门螺杆菌增菌培养基的制备方法。
本发明的目的之三在于提供一种幽门螺杆菌的增菌方法。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明提供了一种幽门螺杆菌增菌培养基，包括：哥伦比亚肉汤培养基、基础营养物质、加强营养物质、氧自由基淬灭剂、维生素、吸附剂和抗生素，溶剂包括水。
进一步的，所述哥伦比亚肉汤培养基的用量为30～40g/L。
进一步的，所述基础营养物质包括酵母粉、羊血消化液或中性肝消化粉中的一种或多种；
优选地，所述酵母粉的用量为1～5g/L；
优选地，所述羊血消化液的用量为40～60mL/L；
优选地，所述中性肝消化粉的用量为1～10g/L；
优选地，所述加强营养物质包括马血或马血清；
优选地，所述加强营养物质的用量为20～30mL/L。
进一步的，所述氧自由基淬灭剂包括氯化血红素、丙酮酸钠和α环糊精中的一种或多种；
优选地，所述氯化血红素的用量为5～20mg/L；
优选地，所述丙酮酸钠的用量为0.1～2g/L；
优选地，所述α环糊精的用量为1～10g/L。
进一步的，所述维生素包括淋球菌生长促进剂或者ISO-vitalex；
优选地，所述促淋剂的用量为10～30mL/L。
进一步的，所述吸附剂包括活性炭；
优选地，所述活性炭的用量为1～10g/L。
进一步的，所述抗生素包括两性霉素、万古霉素、甲氧苄啶和头孢磺啶中的一种或多种；
优选地，所述两性霉素的用量为0.1～4mg/L；
优选地，所述万古霉素的用量为5～15mg/L；
优选地，所述甲氧苄啶的用量为5～20mg/L；
优选地，所述头孢磺啶的用量为5～30mg/L。
本发明还提供了上述的幽门螺杆菌增菌培养基的制备方法，将配方量的哥伦比亚肉汤培养基、基础营养物质和氧自由基淬灭剂溶解并混合，调节pH 6.8～7.2后加入吸附剂并灭菌，室温下加入余下组分，得到所述幽门螺杆菌增菌培养基。
此外，本发明还提供了一种幽门螺杆菌的增菌方法，将菌种悬液接种至上述的幽门螺杆菌增菌培养基内，然后在微需氧环境中进行培养；
所述微需氧环境包括3％-5％O2、10％CO2、2％H2和83％-85％N2的气体环境。
进一步的，将所述幽门螺杆菌增菌培养基置于细胞培养瓶中进行增菌培养；
优选地，所述细胞培养瓶的瓶盖包括透气膜。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的幽门螺杆菌增菌培养基，含有幽门螺杆菌生长所必需的营养元素以及特定的氧化还原电势，优越的生长环境可大幅度提升幽门螺杆菌的检出率；游离氧淬灭体系可以消除培养基中有毒的氧自由基，维持幽门螺杆菌最佳的繁殖环境，可大幅度提升阳性率。用对幽门螺杆菌无效的复合抗生素与抗真菌药抑制标本中的阳性球菌、阴性杆菌、阳性杆菌、念珠菌等杂菌，便于纯化幽门螺旋杆菌。
本发明提供的幽门螺杆菌的增菌方法，应用本发明提供的幽门螺杆菌增菌培养基，通过严格控制气体组成构建微需氧环境，更有利于幽门螺杆菌的生长。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例提供的幽门螺杆菌在增菌液表面的漂浮生长现象，密集的白色点状物就是该菌形成的微菌落团块，该图生长为2+。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
根据本发明发明人的研究发现，以往对于微需氧菌的某些观点应用到幽门螺杆菌时存在一些不适用不严格的地方。主要表现在微需氧气体环境的定义，以及对于营养结构中必须元素的使用上。其中，幽门螺杆菌对氧气的最适范围是3-5％左右，而非之前认为的5-10％；CO2是10-15％，也不是之前认为的5-10％。再有就是培养基中必须含有能淬灭自由氧O2 -的成分以及生物还原剂以降低培养基氧化还原电位，这导致采用商品化微需氧产气袋无法很好的培养到幽门螺杆菌，只能用更为严格的产气罐，通过调整 O2与CO2比例来改善培养能力。其次，传统观念认为血红蛋白和血红素是幽门螺杆菌必须的，但本发明发明人的研究发现，单独添加血红蛋白和血红素反而会导致培养基中产生过多的H2O2以及自由氧O2 -,这些产物有毒，会抑制幽门螺杆菌的生长。而通过添加如活性炭、亚铁离子与丙酮酸钠等物质构成光触媒反应体系以消除H2O2以及O2 -而解毒，或者去掉血红蛋白和血红素，更换为马血清和α环糊精等后幽门螺杆菌的生长将得到改善。本发明正是基于这些思想而设计。通过对几组实施案例的研究分析最终确定了本发明的技术路线并提出如下技术方案：
一种幽门螺杆菌增菌培养基，包括：哥伦比亚肉汤培养基、基础营养物质、加强营养物质、氧自由基淬灭剂、维生素、吸附剂和抗生素，溶剂包括水。
哥伦比亚肉汤培养基
哥伦比亚肉汤培养基作为市售培养基，使用方便，来源稳定，且其中含有的蛋白胨、酵母浸粉、葡萄糖等组分能够为幽门螺杆菌的生长提供基本的营养；L-半胱氨酸盐酸盐作为还原剂能够为幽门螺杆菌固体培养基提供良好的电解质环境、酸碱度环境及氧化还原电势环境，更有利于幽门螺杆菌的增殖；此外，氯化钠、硫酸镁、硫酸亚铁和碳酸钠等无机盐，能够保证细菌所处环境电解质处于最适宜条件，同时调节菌体内外的渗透压。本发明从种类繁多的现有肉汤培养基中创造性地选择哥伦比亚肉汤培养基作为市售培养基，更适用于幽门螺杆菌的增殖。其用量例如可以为，但不限于30g/L、32g/L、38g/L或40g/L，优选36g/L。
基础营养物质
基础营养物质能够为幽门螺杆菌提供必需的氮源、碳源等物质。
作为优选，所述基础营养物质包括酵母粉、羊血消化液或中性肝消化粉中的一种或多种，例如可以单独为酵母粉、单独为羊血消化液或单独为中性肝消化粉，或者为上述中任意二者的组合，或者同时使用酵母粉、羊血消化液和中性肝消化粉。
其中，所述酵母粉的用量为1～5g/L，例如可以为，但不限于1g/L、2g/L、 3g/L、4g/L或5g/L，优选3g/L；所述羊血消化液的用量为40～60mL/L，例如可以为，但不限于40mL/L、45mL/L、50mL/L、55mL/L或60mL/L，优选50mL/L；所述中性肝消化粉的用量为1～10g/L，例如可以为，但不限于1g/L、3g/L、5g/L、8g/L或10g/L，优选5g/L。
加强营养物质
加强营养物质能够在保证幽门螺杆菌存活的基础上进一步改善幽门螺杆菌的生长状态。其用量为20～30mL/L，例如可以为，但不限于20mL/L、 22mL/L、25mL/L、28mL/L或30mL/L，优选25mL/L。
作为优选，可以选择马血或马血清作为幽门螺杆菌固体培养基的加强营养物质，从而在提供强化营养的同时避免产生抑制幽门螺杆菌生长的有毒物质。
氧自由基淬灭剂
氧自由基淬灭剂能够有效淬灭自由氧，减少氧自由基对细胞的毒性作用，创建适于幽门螺杆菌生长和增殖的环境。
作为优选，所述氧自由基淬灭剂包括氯化血红素、丙酮酸钠和α环糊精中的一种或多种，例如可以为单独的氯化血红素、单独的丙酮酸钠、单独的α环糊精，或氯化血红素和丙酮酸钠、丙酮酸钠和α环糊精的组合，或氯化血红素、丙酮酸钠和α环糊精三者的组合。其中，所述氯化血红素的用量为5～20mg/L，例如可以为，但不限于5mg/L、10mg/L、15mg/L 或20mg/L；所述丙酮酸钠的用量为0.1～2g/L，例如可以为，但不限于0.1 g/L、0.5g/L、1g/L、1.5g/L或2g/L；所述α环糊精的用量为1～10g/L，例如可以为，但不限于1g/L、3g/L、5g/L、8g/L或10g/L。
维生素
维生素的加入能够进一步强化本发明提供的幽门螺杆菌固体培养基的营养成分，利于幽门螺杆菌的增殖和生长。
作为优选，可以选择淋球菌生长促进剂(促淋剂)或者ISO-vitalex等作为复合维生素，其用量为10～30mL/L，例如可以为，但不限于10mL/L、 15mL/L、20mL/L、25mL/L或30mL/L。
抗生素
本发明中的抗生素可以是单一抗生素，也可以是复合抗生素。所使用的抗生素可以为两性霉素、万古霉素、甲氧苄啶和头孢磺啶中的一种或多种。为了提升幽门螺杆菌固体培养基的增菌效果，抑制标本中的阳性球菌、阴性杆菌、阳性杆菌、念珠菌等杂菌，便于纯化幽门螺旋杆菌，优先选择使用复合抗生素。
抗生素的用量例如可以为，但不限于15mg/L、20mg/L、30mg/L、40 mg/L、50mg/L、60mg/L或70mg/L。其中，两性霉素的用量为0.1～4mg/L，例如可以为，但不限于0.1mg/L、1mg/L、2mg/L、3mg/L或4mg/L；万古霉素的用量为5～15mg/L，例如可以为，但不限于5mg/L、10mg/L或15 mg/L；甲氧苄啶的用量为5～20mg/L，例如可以为，但不限于5mg/L、10 mg/L、15mg/L或20mg/L；头孢磺啶的用量为5～30mg/L，例如可以为，但不限于5mg/L、10mg/L、20mg/L或30mg/L。
此外，本发明提供的运送培养基中还包括吸附剂，考虑到原料的成本及普适性，所述吸附剂优选为活性炭。其用量为1～10g/L，例如可以为，但不限于1g/L、3g/L、5g/L、8g/L或10g/L。
值得注意的是，本发明提供的幽门螺杆菌增菌培养基中，通过特意选择的哥伦比亚肉汤培养基中含有的亚铁离子、配方中的氧自由基淬灭剂和吸附剂的创造性组合，构成光触媒反应体系，从而更加有效地消除培养基中的氧自由基，达到去除毒素的目的，使环境更有利于幽门螺杆菌的生长。
本发明提供的幽门螺杆菌增菌培养基，含有幽门螺杆菌生长所必需的营养元素以及特定的氧化还原电势，优越的生长环境可大幅度提升幽门螺杆菌的检出率；游离氧淬灭体系可以消除培养基中有毒的氧自由基，维持幽门螺杆菌最佳的繁殖环境，可大幅度提升阳性率。用对幽门螺杆菌无效的复合抗生素与抗真菌药抑制标本中的阳性球菌、阴性杆菌、阳性杆菌、念珠菌等杂菌，便于纯化幽门螺旋杆菌。
本发明还提供了上述幽门螺杆菌增菌培养基的制备方法：将配方量的哥伦比亚肉汤培养基、基础营养物质和氧自由基淬灭剂溶解并混合，调节 pH 6.8～7.2后加入吸附剂并灭菌，室温下加入余下组分，得到所述幽门螺杆菌增菌培养基。
该方法工艺简单，操作方便，对设备及人员没有过高要求，适于推广应用。
可选地，通过煮沸的方式进行溶解。
可选地，通过高温的方式进行灭菌，优选121℃高温。
在一些优选的实施方式中，加入抗生素后还包括除菌的步骤，通过除菌操作能够进一步避免杂菌的干扰。
考虑到操作的简便性，优选通过过滤进行除菌。
在制备过程中，优选对抗生素进行预处理：
具体可以为，将孢磺啶钠用水溶解；将甲氧苄啶用乳酸溶液溶解；将两性霉素B用有机溶剂助溶等。
此外，依据本发明提供的幽门螺杆菌增菌培养基，本发明还提供了一种幽门螺杆菌的增菌方法：将菌种悬液接种至上述的幽门螺杆菌增菌培养基内，然后在微需氧环境中进行培养；
所述微需氧环境包括3％-5％O2、10％CO2、2％H2和83％-85％N2的气体环境。
本发明提供的幽门螺杆菌的增菌方法，应用本发明提供的幽门螺杆菌增菌培养基，通过严格控制气体组成构建微需氧环境，更有利于幽门螺杆菌的生长。
当标本中幽门螺杆菌含量较少时(譬如轻微感染)，或者已经经过抗生素治疗后而采集的胃粘膜标本中可能仅含有极少的幽门螺杆菌时，采用液体增菌液先行增菌，待幽门螺杆菌数量达到一定水平后再行传代固体培养基，此时阳性率就会大幅度提升。而且固体培养基上目标菌落数量足够多时，人为漏诊会降低，并且检验流程也可简化，检验周期也会缩短。
值得注意的是，本发明的发明人还通过实验验证发现，应用本发明提供的幽门螺杆菌增菌培养基对幽门螺杆菌进行增菌培养时，幽门螺杆菌增菌培养基与微需氧环境的接触面积越大，幽门螺杆菌的增菌效果越好。
基于此，本发明优选将所述幽门螺杆菌增菌培养基置于细胞培养瓶中进行增菌培养。细胞瓶瓶身扁平，保证液体面积更大，气体与液体的接触面更大，有利于幽门螺杆菌在液面气体交换充分的界面上快速生长。进一步优选地，将所述细胞培养瓶的瓶盖设置透气膜，便于气体的交换。其中透气膜可以选择有机硅薄膜、尼龙塑料(如聚四氟乙烯PTFE微孔膜、聚氨酯PU微孔膜、超密织物、聚乙烯PE多孔膜)、疏水处理纤维纸等。
下面通过实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，实施例中的材料为根据现有方法制备而得，或直接从市场上购得。
实施例1
本实施例提供了一种幽门螺杆菌增菌培养基，包括哥伦比亚肉汤培养基36g/L、酵母粉3g/L、羊血消化液50mL、中性肝消化粉5g/L、氯化血红素15mg/L、丙酮酸钠1g/L、α环糊精5g/L、活性炭4g/L、促淋剂20ml、马血清25ml、抗生素25ml和纯化水950ml。
所述幽门螺杆菌增菌培养基通过如下方法制备得到：
除马血清、活性炭、抗生素、促淋剂(为商品市售成品，按使用说明溶解后使用)外的所有成份煮沸溶解于950ml去离子水中，调pH 6.8-7.2，加入活性炭混匀后121℃灭菌，冷至室温，加入灭菌马血清、过滤除菌的抗生素及促淋剂。分装赛默飞T25细胞培养瓶，10-20ml/瓶，加盖密封，铝塑复合膜独立包装。无菌试验3天合格后，常温避光保存备用。
抗生素选择剂制备方法：头孢磺啶钠5mg/L，用5ml无菌蒸馏水溶解， 0.22μm孔径微孔滤膜过滤除菌；甲氧苄啶5mg/L，5ml乳酸溶液溶解(取 AR乳酸2滴滴入100ml灭菌蒸馏水中，加入甲氧苄啶100mg，溶解后煮沸杀菌；取该液体5ml)；再加入万古霉10mg/L，0.22μm孔径微孔滤膜过滤除菌；最后加入两性霉素2mg/L(数滴二甲亚砜助溶)；溶于5ml无菌蒸馏水中，0.22μm孔径微孔滤膜过滤除菌。
羊血消化液制备方法(以1L计算)：将1L水和0.4L羊血加入316不锈钢或陶瓷桶中，按10ml/L的量，取浓盐酸14ml缓慢加入，搅拌均匀，调节pH为2-3。称取胃蛋白酶，按6g/L加入。将血水液体加热至45-50℃，置50℃恒温培养箱中消化24小时。先加入1mol/L碳酸钠溶液5ml。加热煮沸保持沸腾10min冷后置冷藏过夜。3500转15min离心弃渣，留上清液。上清液倒入316不锈钢桶或陶瓷桶中加入磷酸氢二钠1g，加热至80℃，缓慢加入碳酸钠溶液45ml，边加边搅拌，防止泡沫溢出。待泡沫消除后加氢氧化钠调PH至7.4-7.8。10-20g/L硅藻土助滤，将硅藻土与消化液上清液混合后注入过滤器中静置15min，形成稳定过滤层后开始自然过滤的澄清滤液。
实施例2
本实施例提供了一种幽门螺杆菌增菌培养基，与实施例1的区别之处在于，不含有羊血消化液及α环糊精，同时将马血清替换为冻融马血。
实施例3
本实施例提供了一种幽门螺杆菌增菌培养基，与实施例1的区别之处在于，包括哥伦比亚肉汤培养基40g/L、酵母粉1g/L、羊血消化液60mL、中性肝消化粉1g/L、氯化血红素20mg/L、丙酮酸钠0.1g/L、α环糊精10 g/L、活性炭1g/L、促淋剂30ml、马血清20ml、抗生素25ml和纯化水950ml。
实施例4
本实施例提供了一种幽门螺杆菌增菌培养基，与实施例1的区别之处在于，包括哥伦比亚肉汤培养基30g/L、酵母粉5g/L、羊血消化液40mL、中性肝消化粉10g/L、氯化血红素5mg/L、丙酮酸钠2g/L、α环糊精1g/L、活性炭10g/L、促淋剂10ml、马血清30ml、抗生素25ml和纯化水950ml。
实施例5
本实施例提供了一种幽门螺杆菌增菌培养基，与实施例1的区别之处在于，不含有氯化血红素。
实施例6
本实施例提供了一种幽门螺杆菌增菌培养基，与实施例1的区别之处在于，包括哥伦比亚肉汤培养基36g/L、酵母粉8g/L、羊血消化液35mL、中性肝消化粉12g/L、氯化血红素3mg/L、丙酮酸钠3g/L、α环糊精12g/L、活性炭5g/L、促淋剂5ml、马血清25ml、抗生素25ml和纯化水950ml。
对比例1
本对比例提供了一种幽门螺杆菌增菌培养基，与实施例1的区别之处在于，将哥伦比亚肉汤培养基替换为胰大豆肉汤，同时添加3#蛋白胨5 g/L、脑心浸液粉3g/L、L-半胱氨酸盐酸盐1g/L、葡萄糖2.5g/L、硫酸镁 0.2g/L、硫酸亚铁0.02g/L、碳酸钠0.6g/L、三羟甲基氨基甲烷0.83g/L、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐2.86g/L。
对比例2
本对比例提供了一种幽门螺杆菌增菌培养基，与实施例1的区别之处在于，不含有氧自由基淬灭剂。
对比例3
本对比例提供了一种幽门螺杆菌增菌培养基，与实施例1的区别之处在于，不含有活性炭。
实验例1
购买市售新鲜猪肚，洗净，切碎成黄豆大小的肉渣，煮沸杀菌后捞出凉冷备用。幽门螺杆菌ATCC43526传代哥伦比亚马血培养基复苏，微需氧产气罐(3％O2、10％CO2、2％H2其余氮气。具体方法为，在一个体积5L 的玻璃干燥器底部加入少量无菌水，放置一根白色普通蜡烛，蜡烛长度位于隔板上方2cm位置。点燃蜡烛后，放入2包2.5L的微需氧产气包，再放入接种了临床标本或者幽门螺杆菌菌株的培养基。盖上盖子。待蜡烛熄灭后，将烛缸放入35℃培养箱内)。培养3天后，棉签洗脱平板上菌落到灭菌生理盐水中制备2McF菌悬液(约2×108CFU/ml)总体积2ml，稀释1000倍(约 2×105CFU/ml)后50ml容积无菌杯中备用。无菌镊子取几块煮沸杀菌的猪肚组织(约20g)，投入到上述稀释的菌悬液中浸泡5min后取出，制备模拟胃组织活检物，将模拟活检物用9个无菌匀浆器取9块模拟组织加入0.2ml 左右的胃组织保存液培养基或者脑心浸液培养基磨碎成匀浆后，分别用 10ml一次性注射配0.9-1.2mm规格针头抽吸匀浆器中全量匀浆注入本发明实施例1-6及对比例1-3提供的增菌培养基中(增菌培养基装于PC塑料血培养瓶内)，每瓶接种一支匀浆器内所有匀浆，将瓶子置微需氧产气罐 (3％-5％O2、10％CO2、2％H2和83％-85％N2)培养72小时。勿振摇取出瓶子观察液面生长情况。培养瓶表面白色雪花状微菌落轻微生长为+，表面密集生长及液层中分散絮状2+，如图1，表面密集生长及液层下轻微浑浊为3+，表面密集生长及液体均匀浑浊为4+。表面无生长，液体清澈为阴性(无生长)。
上述不同幽门螺杆菌增菌培养基生长情况为：
组别 生长情况
实施例1 2+
实施例2 +
实施例3 +
实施例4 +
实施例5 +
实施例6 ±(弱生长)
对比例1 -
对比例2 -
对比例3 ±(弱生长)
阴性对照(生理盐水) -
实验例2
本实验例与实验例1的不同之处在于，将本发明实施例1提供的幽门螺杆菌增菌培养基装于细胞瓶内，且在细胞培养瓶的瓶盖中心设置透气膜。
生长情况为：
组别 生长情况
实施例1 4+
由上述结果可知，应用本发明实施例1-5提供的幽门螺杆菌增菌培养基均适宜幽门螺杆菌的生长，能显著促进幽门螺杆菌的生长和增殖。实施例6 中各组分的用量不在本发明优选范围内，增菌效果稍差。
并且，通过对比例1的结果可以看出，选择哥伦比亚肉汤培养基作为本发明的培养基基础是通过实验验证得到的，当将哥伦比亚肉汤培养基替换为其他市售肉汤培养基时，即使在培养体系中加入哥伦比亚肉汤培养基的主要成分，也不能实现对幽门螺杆菌的增菌培养。
通过对比例2和3的结果可以看出，本发明创造性的利用氧自由基淬灭剂、吸附剂和哥伦比亚肉汤培养基中的亚铁离子，构成光触媒反应体系，极大地促进了幽门螺杆菌的生长。
此外，通过实验例1和2的结果也可以看出，实验例1采用的容器为圆柱形PC塑料血培养瓶，气体与液体接触的表面积较小，而实验例2采用的细胞培养瓶为扁平方形，气体接触表面积大幅度增加，对幽门螺杆菌的增菌效果有显著提升。
虽然同样应用实施例1提供的增菌培养基对幽门螺杆菌进行培养，当采用细胞培养瓶分装培养基时，气体接触表面积大幅度增加
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种幽门螺杆菌增菌培养基，其特征在于，包括：肉汤培养基、基础营养物质、加强营养物质、氧自由基淬灭剂、维生素、吸附剂和抗生素，溶剂包括水。
2.据权利要求1所述的幽门螺杆菌增菌培养基，其特征在于，所述肉汤培养基包括哥伦比亚肉汤培养基、脑心浸液、胰大豆肉汤或布氏肉汤中的一种或多种；
优选地，所述哥伦比亚肉汤培养基的用量为30～40g/L；所述脑心浸液的用量为30-40g/L；所述胰大豆肉汤的用量为30-40g/L；所述布氏肉汤的用量为30-40g/L。
3.根据权利要求1所述的幽门螺杆菌增菌培养基，其特征在于，所述基础营养物质包括酵母粉、羊血消化液或中性肝消化粉中的一种或多种；
优选地，所述酵母粉的用量为1～5g/L；
优选地，所述羊血消化液的用量为40～60mL/L；
优选地，所述中性肝消化粉的用量为1～10g/L；
优选地，所述加强营养物质包括马血或马血清；
优选地，所述加强营养物质的用量为20～30mL/L。
4.根据权利要求1所述的幽门螺杆菌增菌培养基，其特征在于，所述氧自由基淬灭剂包括氯化血红素、丙酮酸钠和α环糊精中的一种或多种；
优选地，所述氯化血红素的用量为5～20mg/L；
优选地，所述丙酮酸钠的用量为0.1～2g/L；
优选地，所述α环糊精的用量为1～10g/L。
5.根据权利要求1所述的幽门螺杆菌增菌培养基，其特征在于，所述维生素包括淋病奈瑟菌生长促进剂或ISO-vitalex；
优选地，所述促淋剂的用量为10～30mL/L。
6.根据权利要求1所述的幽门螺杆菌增菌培养基，其特征在于，所述吸附剂包括活性炭；
优选地，所述活性炭的用量为1～10g/L。
7.根据权利要求1所述的幽门螺杆菌增菌培养基，其特征在于，所述抗生素包括两性霉素、万古霉素、甲氧苄啶和头孢磺啶中的一种或多种；
优选地，所述两性霉素的用量为0.1～4mg/L；
优选地，所述万古霉素的用量为5～15mg/L；
优选地，所述甲氧苄啶的用量为5～20mg/L；
优选地，所述头孢磺啶的用量为5～30mg/L。
8.权利要求1-7任一项所述的幽门螺杆菌增菌培养基的制备方法，其特征在于，将配方量的哥伦比亚肉汤培养基、基础营养物质和氧自由基淬灭剂溶解并混合，调节pH 6.8～7.2后加入吸附剂并灭菌，室温下加入余下组分，得到所述幽门螺杆菌增菌培养基。
9.一种幽门螺杆菌的增菌方法，其特征在于，将菌种悬液接种至权利要求1-7任一项所述的幽门螺杆菌增菌培养基内，然后在微需氧环境中进行培养；
所述微需氧环境包括3％-5％O2、10％CO2、2％H2和83％-85％N2的气体环境。
10.根据权利要求9所述的增菌方法，其特征在于，将所述幽门螺杆菌增菌培养基置于细胞培养瓶中进行增菌培养；
优选地，所述细胞培养瓶的瓶盖包括透气膜。
CN202210178030.6A 2022-02-24 2022-02-24 幽门螺杆菌增菌培养基及其制备方法和幽门螺杆菌的增菌方法 Pending CN116694492A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210178030.6A CN116694492A (zh) 2022-02-24 2022-02-24 幽门螺杆菌增菌培养基及其制备方法和幽门螺杆菌的增菌方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210178030.6A CN116694492A (zh) 2022-02-24 2022-02-24 幽门螺杆菌增菌培养基及其制备方法和幽门螺杆菌的增菌方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116694492A true CN116694492A (zh) 2023-09-05

Family

ID=87822619

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210178030.6A Pending CN116694492A (zh) 2022-02-24 2022-02-24 幽门螺杆菌增菌培养基及其制备方法和幽门螺杆菌的增菌方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116694492A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106858066B (zh) 协同促进肠道益生菌增殖与定植的添加剂及使用方法
KR20210088408A (ko) 락토바실러스 플란타럼 및 그의 용도
CN115287203B (zh) 一种高效降解氨基甲酸乙酯的红酵母及其应用
CN110892939A (zh) 枯草芽孢杆菌发酵产黄芩素的方法以及发酵制备的饲料添加剂和制备方法
CN113755409A (zh) 一种缓解胰岛素抵抗的长双歧杆菌及其应用
CN105110486A (zh) 一种用微生物絮凝剂去除水中四环素的方法
CN117645941A (zh) 一种通过同时降解尿酸和嘌呤核苷缓解高尿酸血症的发酵粘液乳杆菌及其应用
CN116694492A (zh) 幽门螺杆菌增菌培养基及其制备方法和幽门螺杆菌的增菌方法
CN115590893A (zh) 一种可抑制幽门螺杆菌的复合益生菌组合物及其应用
CN116694493A (zh) 幽门螺杆菌固体培养基及其制备方法和应用
CN109943494B (zh) 培养基及其制备方法
CN116694491A (zh) 幽门螺杆菌运送培养基及其制备方法和应用
CN114085791A (zh) 一种戊糖片球菌He10-a-1及其用途
CN105130010A (zh) 一株克雷伯氏菌的新用途
CN105483056A (zh) 一种微生物培养基及其应用
CN116590192B (zh) 一种幽门螺杆菌固体分离培养基及其制备方法和应用
EP1881838B1 (en) Antitumor agent on the base of bcg vaccine, method for its preparation and its use
CN101139569A (zh) 一株α-淀粉酶抑制剂生产菌及α-淀粉酶抑制剂的制备方法与应用
CN109593674B (zh) 一种抑制产气荚膜梭菌的菌剂及其应用
CN104087532B (zh) 一种来源于鸡肠道的雌马酚产生梭菌c1-6及应用
CN110904006B (zh) 鸡源乳酸肠球菌ar及其筛选方法、应用
CN114958649B (zh) 一种乳酸片球菌及其在降解赭曲霉毒素a中的应用
CN115386523B (zh) 一株乳酸乳球菌及其在抗幽门螺杆菌感染的应用
CN115595284B (zh) 一株植物乳杆菌y1和巴氏毕赤酵母y2及其益生菌制剂和应用
CN116396883B (zh) 一株耐高温高效降解玉米赤霉烯酮和呕吐毒素的枯草芽孢杆菌及其菌剂

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination