CN108076643A - 用于治疗例如细菌性阴道病的鼠李糖乳杆菌细菌 - Google Patents

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Abstract

公开了一种适合于治疗例如细菌性阴道病的新颖乳酸鼠李糖乳杆菌细菌。

Description

用于治疗例如细菌性阴道病的鼠李糖乳杆菌细菌
技术领域
本发明涉及一种适合于治疗例如细菌性阴道病的新颖乳酸鼠李糖乳杆菌细菌。
背景技术
细菌性阴道病(BV)是生育年龄的女性的最常见病症之一。根据美国疾病控制与预防中心(CDC)，BV的风险因素包含灌洗和具有新的或多个性伴侣。BV由天然产生的细菌性微生物群的失衡引起且在微生物学上的特征可能在于以潜在病原阴道细菌替代乳杆菌主导阴道微生物群。能够相对快速地产生从健康的H2O2和乳酸产生的乳杆菌主导微生物群到复杂的多种微生物群的变化，并且所述变化导致BV。
如例如EP0257007(1987提交)所讨论，很久以前已知细菌性阴道病(BV)伴随着pH的上升(从正常/健康的pH上升大约4到4.5以上的pH)和微生物生态失调，其中通常占主导的乳杆菌阴道微生物群受到显著厌氧生物的过度生长的压制。
EP2509610B1(《HSO健康护理(HSO Health Care)》，维也纳，2011年9月13日提交且于2013年公开/授予)提供了对与本文相关的先前背景技术的概述。
如EP2509610B1中所讨论，各种乳杆菌物种在健康的人类阴道中占主导，所述物种在保护女性免受泌尿生殖器感染中起到必不可少的作用。乳杆菌能够黏附于阴道上皮，以抑制病原体的黏附与生长、耗乏否则可供病原体使用的养分且调节宿主免疫应答和微环境。最重要的是，乳杆菌使阴道穹窿的细胞中所含有的肝糖代谢，形成最终产物乳酸。因此，在健康的阴道中，达到4.0左右的pH值，许多病原体在所述pH值水平下无法繁茂。
当以医药组合物(例如用于经阴道给药的经阴道胶囊)的形式给予女性时，通过乳杆菌的代谢活动产生乳杆菌在阴道中抵抗潜在病原体的保护作用。细菌消耗肝糖和葡萄糖的其它来源并产生乳酸。以这种方式产生的低pH对较少所要细菌和真菌有害并因此保护阴道黏膜免受感染。
因为阴道感染是造成早产的疾病的重要机理，因此在妊娠期间维持阴道中乳杆菌微生物群的天然健康的均衡尤为重要。乳杆菌缺乏可能打乱阴道中的微生物均衡，这时常导致细菌性阴道病综合征，这可能与正常产生的乳杆菌到由厌氧细菌主导的混合微生物群的数量与质量变化相关联。根据本领域，细菌性阴道病的特征可能在于乳杆菌的完全丧失及革兰氏染色不定和革兰氏阴性杆菌的伴随增加，所述革兰氏染色不定和革兰氏阴性杆菌主要为阴道加德纳菌以及拟杆菌属、普氏菌属及动弯杆菌属物种。然而，阴道乳杆菌的丧失还使得非怀孕女性对感染敏感，这可能导致子宫内膜炎或甚至盆腔炎疾病。
在更年期期间，发生女性生殖道的退化，从而可能反映与垂体神经部内分泌轴相关的内部生物预期寿命。主要的普遍变化为阴道萎缩。常见的不适为阴道干燥、烧灼、瘙痒和性交不适以及排尿困难、尿频和复发性感染。绝经后的泌尿生殖器萎缩与雌激素分泌减少相关联，所述雌激素分泌减少伴随着与细菌性阴道病和尿路感染相关联的乳杆菌耗乏及病原性微生物定殖增加。在绝经后女性中，阴道雌三醇疗法降低大肠杆菌定殖且增大乳杆菌的数量，因此复发性泌尿和生殖道感染的发病率明显降低。
已描述用以不同程度地占据阴道的若干乳杆菌物种。一段时间以来，认为生育年龄的健康女性的微生物群是由嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)和发酵乳杆菌(L.fermentum)占主导，之后为短乳杆菌(L.brevis)、詹氏乳杆菌(L.jensenii)及干酪乳杆菌(L.casei)。在对阴道乳杆菌微生物群的另一研究中，发明者发现大部分参与者的阴道微生物群是由单个乳杆菌物种占主导，同时存在展示广泛个体变异性的其它物种。最常产生的物种是卷曲乳杆菌(L.crispatus)、加氏乳杆菌(L.gasseri)、惰性乳杆菌(L.iners)及詹氏乳杆菌(L.jensenii)。在另一研究中，最常分离的乳杆菌菌株是詹氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌及加氏乳杆菌。在奥地利最近的研究中，通过物种特异性PCR鉴定的主导性乳杆菌物种(即卷曲乳杆菌、加氏乳杆菌、詹氏乳杆菌及鼠李糖乳杆菌)用于产生DNA指纹。卷曲乳杆菌、加氏乳杆菌、詹氏乳杆菌及鼠李糖乳杆菌可以被看作是阴道中的主导性物种。
为了弥补乳杆菌微生物群的不足(及因此弥补阴道微生物群的保护能力的不足)，含有乳杆菌的阴道栓剂的给药是乳杆菌替补的最常见方式。一些发明者认为乳杆菌的局部使用是预防阴道病和复发性尿路感染的安全且有前景的治疗。
虽然经阴道补充为对乳杆菌替补的长期持续的广泛可接受的实践，但乳杆菌制剂的经口给药表示恢复正常阴道微生物群的新概念。相对近期的结果指示益生菌菌株鼠李糖乳杆菌GR-1(ATCC 55826)及罗伊氏乳杆菌RC-14(ATCC 55845)能够持续两个月每日经口服用而无任何副作用。所述摄取接着使得阴道微生物群在增加乳杆菌存在及减少酵母菌和大肠杆菌群方面显著改善。虽然一群发明者讨论了在改变黏膜免疫方面或从经直肠区域上升到阴道的益生菌方面的有益影响，但另一群组最近通过物种特异性PCR扩增表明鼠李糖乳杆菌GR-1及罗伊氏乳杆菌RC-14能够在经口给药时被递送到阴道环境。
考虑到以上讨论的先前技术，EP2509610B1中所描述的本发明涉及卷曲乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、詹氏乳杆菌和/或加氏乳杆菌的特定保存菌株的组合用于治疗细菌性阴道病(BV)的用途。在第15页上的表11中展示例如保存的鼠李糖乳杆菌(DSM22560)具有使pH下降的相对良好的能力。
发明内容
本发明解决的问题在于提供一种新颖鼠李糖乳杆菌菌株，其具有特别是关于治疗由乳杆菌缺乏引起的阴道及女性生殖器与泌尿生殖器感染和/或尿路感染(例如细菌性阴道病)的良好特性。
如在下文工作实例中可见，具有登记号CECT 8800(本文中又称为BPL005)的本文中描述的新颖鼠李糖乳杆菌菌株具有许多特别是关于治疗例如细菌性阴道病的良好/改进特性。
本文中的工作实例1的结果表明分离CECT 8800(＝BPL005)鼠李糖乳杆菌菌株的以下相关正面特征：
1:其是从来自健康女性的阴道的分离株重新分离的，即初步认为不存在认为其并非如所指的新颖菌株的原因；
2:随机扩增多态DNA(RAPD)图谱表明所述菌株不同于其它菌株，且16S rRNA测序展示BPL005为特有的鼠李糖乳杆菌菌株；
3:BPL005具有阴道分离菌株降低pH水平的最高能力；
4:在无pH控制的测定中，BPL005具有迅速pH降低效果。就BPL005菌株而言，乳酸的迅速产生与其在较短时间内减小pH的高能力一致。关于其余酸的产生，菌株BPL005是所测试菌株的最好产生者；
5:关于对妇科商业产品的抗性，菌株BPL005对测试的最高浓度具有抗性且未观察到抑制；
6:菌株BPL005的全基因组的基因组测序展示其具有3.023Mb的特有重叠群，即基因组序列不是先前技术描述的序列。
如上文所讨论，很久以前已知细菌性阴道病(BV)伴随着pH的上升(从正常/健康的pH上升大约4到4.5以上的pH)和微生物生态失调，其中通常占主导的乳杆菌阴道微生物群受到显著厌氧生物的过度生长的压制。
因此，本文中描述的新颖CECT 8800(＝BPL005)鼠李糖乳杆菌菌株具有降低pH水平的极良好能力的事实对于菌株治疗例如细菌性阴道病的用途十分重要。
简单地说且不受限于理论，基于本文中描述的新颖CECT 8800(＝BPL005)鼠李糖乳杆菌菌株的本文中描述的良好特性，不存在认为其会不适用于治疗由乳杆菌缺乏引起的阴道及女性生殖器和泌尿生殖器感染和/或尿路感染(例如细菌性阴道病)的原因。
本文中的工作实例2的结果展示菌株BPL005具有与本文中的相关商业妇科益生菌产品的所测试最好益生菌类似的pH降低水平。
本文中的工作实例3的结果展示菌株BPL005在实验室规模(体积为1L)下的生产过程中的良好效率，且制得的冻干粉末的数据展示BPL005菌株在15个月的周期中获得良好稳定性。
本文中的工作实例4的结果展示菌株BPL005在工业规模(体积为1500L)下的生产过程中的良好效率，且制得的冻干粉末的数据展示BPL005菌株获得极良好稳定性。
为了能够制得本文中相关商业产品，显然优势在于乳杆菌菌株能够在工业规模下适当地产生，因此，本文中的工作实例4进一步表明本文中描述的新颖CECT 8800(＝BPL005)鼠李糖乳杆菌菌株的有利特性。
因此，本发明的第一方面涉及一种具有登记号CECT 8800(本文中又称为BPL005)的乳酸鼠李糖乳杆菌细菌或其突变体，其中所述突变株通过使用保存菌株作为起始材料获得，且其中所述突变体保持或进一步提供CECT 8800降低pH水平的能力。
本发明的第二方面涉及一种饮食或医药组合物，包括第一方面和/或其任何本文中描述的实施例的细菌。
术语“饮食”根据本领域是指膳食或食物或饲料摄取的调节。因此，饮食组合物为适合于添加到用于人类的食品或用于动物的饲料产品的一种组合物。
本发明的第三方面涉及一种用于治疗女性病症的根据第二方面和/或其任何本文中描述的实施例的饮食或医药组合物，其中所述病症为天然产生阴道细菌性微生物群的失衡、阴道感染、女性生殖器感染、泌尿生殖器感染或尿路感染。
本发明的第四方面涉及一种用于人类营养的乳制品、饮品、食品和/或用于动物营养的饲料产品，特征在于所述产品含有根据第二方面和/或其任何本文中描述的实施例的饮食组合物。
下文仅借助于实例描述本发明的实施例。
具体实施方式
新颖鼠李糖乳杆菌菌株
新颖鼠李糖乳杆菌菌株BPL005的样本已以寄存编号CECT 8800保存在CECT(Coleccion Espanola de Cultivos Tipo)处，保存日期为2014年12月15日。保存是在国际承认用于专利程序的微生物保存的布达佩斯条约(Budapest Treaty)的条件下进行。
本发明的第一方面涉及本文中描述的新颖菌株或“其突变体”。
技术人员应清楚，通过使用保存的菌株作为起始材料，有经验的阅读者能够通过常规突变诱发或再分离技术通常地进一步获得保留本文中描述的相关特征及优点的其突变体或衍生物。因此，第一方面的术语“其突变体”是指通过使用保存的菌株作为起始材料获得的突变株。
换句话说，本发明涉及一种用于获得具有登记号CECT 8800的乳酸鼠李糖乳杆菌细菌的突变株的方法，包括以下步骤：
(i)：制得具有登记号CECT 8800的乳酸鼠李糖乳杆菌细菌的突变体；
(ii)：分析在步骤(i)中制得的突变体及鉴定保持或进一步提高CECT 8800降低pH水平的能力的突变株；以及
(iii)分离在步骤(ii)中鉴定的所述突变株，由此获得具有登记号CECT 8800的乳酸鼠李糖乳杆菌细菌的突变株，其中所述突变株保持或进一步提高CECT 8800降低pH水平的能力。
优选地，第一方面涉及一种具有登记号CECT 8800(本文中又称为BPL005)的乳酸鼠李糖乳杆菌细菌。
2016年4月(即在本申请的EP15174222.8优先权日2015年6月29日之后)公开了论文(Chenoll E、Codoner FM、Martinez-Blanch JF、RamonD、Genoves S、Menabrito M，2016年，《用于治疗细菌性阴道病的益生菌鼠李糖乳杆菌菌株BPL5(CECT 8800)的全基因组序列(Complete genome sequence of Lactobacillus rhamnosus strain BPL5(CECT 8800),aprobiotic for treatment of bacterial vaginosis)》，《基因组公告(Genome Announc)》4(2):e00292-16.doi:10.1128/genomeA.00292-16，2016Chenoll等人)。
所述论文公开了本发明的具有登记号CECT 8800的乳酸鼠李糖乳杆菌细菌的全基因组序列。
显然，对于技术人员而言，即使不了解基因组序列，获得CECT 8800的突变株也只是常规工作，在了解所述序列的情况下，所述工作会更容易。
饮食或医药组合物-本发明的第二方面
如上文所讨论，本发明的第二方面涉及一种饮食或医药组合物，包括第一方面和/或其任何本文中描述的实施例的细菌。
所述饮食组合物一般包括饮食或营养上可接受的佐剂和/或赋形剂。
所述医药组合物一般包括医药学上可接受的佐剂和/或赋形剂。
通常，这类组合物包括通常具有一定浓度的活细胞的呈浓缩(包含冷冻、干燥或冷冻干燥的浓缩物)形式的细菌，所述浓度的范围为每克组合物104到1014cfu(集落形成单位)。可能优选的是，所述范围在每克组合物106到1014cfu(集落形成单位)的范围内或在每克组合物108到1014cfu(集落形成单位)的范围内。相关范围还可以在每克组合物106到1013cfu(集落形成单位)的范围内。
可能优选的是，所述组合物包括冷冻干燥(换句话说冻干)的细菌。
所述组合物可含有冷冻保护剂(例如麦芽糊精)和/或包含例如酵母菌提取物、糖和维生素的营养素的常规添加剂作为其它组份。
如果组合物包括冷冻干燥细菌，那么优选地包括合适的冷冻保护剂(例如麦芽糊精)。
如技术人员在本上下文中所理解，如本文中所描述的饮食或医药组合物在某些实施例中将包括属于同一物种或属于不同物种的多种菌株。如本文中所描述的组合物中的乳杆菌的这种适用组合的典型实例为明串珠菌属物种与一或多个乳球菌属亚种的混合物，所述一或多个乳球菌属亚种例如乳酸乳杆菌乳酸亚种(Lc.lactis subsp.lactis)、乳酸乳杆菌乳脂亚种(Lc.lactis subsp.cremoris)或双醋酸乳酸乳杆菌乳酸亚种生物变种(Lc.slactis subsp.lactis biovar.diacetylactis)。
其还可能是例如卷曲乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、詹氏乳杆菌和/或加氏乳杆菌。
可以优选适合于口服或局部经阴道给药的根据本发明的组合物的施用形式。作为一实例，供女性使用的益生菌可以以胶囊形式或(填充在药囊中)悬浮在饮料中或以发酵乳(酸奶)形式经口给药。在经口给药时，预期其安全通过胃和十二指肠(对于酸和胆液呈现某一稳定性)并暂时定殖于肠道。自此，较小数量的细菌将上升到阴道并(再次暂时)定殖于阴道黏膜。益生菌还能够作为阴道胶囊或栓剂常规地使用及直接施用到阴道。在阴道中抵抗潜在病原体的乳杆菌的保护作用是通过乳杆菌的代谢活动来产生的。细菌消耗肝糖和葡萄糖的其它来源并产生乳酸。以这种方式产生的低pH对较少所要细菌和真菌有害并因此保护阴道黏膜免受感染。因此，根据本发明的组合物可以以栓剂、用于经阴道给药的经阴道胶囊形式或呈包衣胶囊、片剂、药囊、丸剂、珠剂、用于口服的小瓶以及酸奶、酸奶饮料、发酵乳、果汁及其它发酵饮料和食品的形式给药。
治疗女性病症的用途-本发明的第三方面
如上文所讨论，本发明的第三方面涉及一种用于治疗女性病症的根据第二方面和/或其任何本文中描述的实施例的饮食或医药组合物，其中所述病症为天然产生阴道细菌性微生物群的失衡、阴道感染、女性生殖器感染、泌尿生殖器感染或尿路感染。
如技术人员在本上下文中所理解，关于女性病症，例如，将按次序多次使用如本文中所描述的饮食或医药组合物和/或所述饮食或医药组合物维持健康的阴道细菌性微生物群。
第三方面可以替代地关于用于治疗女性病症的方法调配，其中所述病症为人类女性的天然产生的阴道细菌性微生物群的失衡、阴道感染、女性生殖器感染、泌尿生殖器感染或尿路感染，所述方法包括给予人类女性相关量的根据第二方面和/或其任何本文中描述的实施例的饮食或医药组合物。
本文中相关病症的实例为阴道病、阴道炎、慢性细菌性阴道病、慢性酵母菌感染、更年期慢性尿路感染、萎缩性阴道炎、阴道病或细菌性阴道病。
在优选实施例中，所述女性病症为细菌性阴道病(BV)。
另外，根据本发明的组合物尤其适合用于治疗或预防妊娠中的无症状和复发性细菌性阴道病或由细菌性阴道病引起的早产。
乳制品、饮品、食品等-本发明的第四方面
如上文所讨论，本发明的第四方面涉及一种用于人类营养的乳制品、饮品、食品和/或用于动物营养的饲料产品，特征在于所述产品含有根据第二方面和/或其任何本文中描述实施例的饮食组合物。
本发明的乳制品可以由含有益生菌的奶、酸奶、奶酪、均质化产品(基于奶、奶酪、水果)、发酵或非发酵乳(包含奶粉、不含乳糖的奶、奶昔)构成。治疗性奶酪可以通过在奶酪的某一处理阶段中以浓缩干燥形式添加合适的益生菌微生物来获得以便保证生物必需的微生物剂的供应。饮料可以是含有根据本发明的组合物的即时饮料或水。
所述合成物(integrator)乳制品和食品适合用于治疗如上文所讨论的所述女性病症，即用于治疗女性病症，其中所述病症为天然产生阴道细菌性微生物群的失衡、阴道感染、女性生殖器感染、泌尿生殖器感染或尿路感染。
本发明的一实施例涉及一种制造发酵食物或发酵饲料产品的方法，包括将第一方面的乳酸鼠李糖乳杆菌细菌添加到食物或饲料产品起始材料及将因此接种的起始材料保持在乳杆菌代谢活跃的条件下。
适用的食品起始材料包含对其常规地进行乳酸细菌性发酵步骤的任何材料，例如奶、蔬菜材料、肉制品、果汁、葡萄汁、生面团、大豆及面糊。
通过所述方法获得的发酵产品包含作为典型实例乳制品的例如发酵乳、酸奶、奶酪(包含新鲜奶酪产品或马苏里拉奶酪)及脱脂奶。
在其它实施例中，底物材料为用于动物饲料的起始材料，例如青贮饲料，例如草、谷类材料、豆类、苜蓿或甜菜叶，其中细菌性培养物被接种在待制成青贮饲料的饲料作物中以便在此处保藏，或接种在富含蛋白质的动物废产物(例如屠宰杂肉和鱼杂肉)中以同样为了保藏用于动物饲养目的的所述杂肉的目的。
实例
实例1：本发明的鼠李糖乳杆菌BPL005的分离和表征
材料和方法
1.菌株的分离和选择
为了从健康女性的阴道获得分离株，从年龄在18与45之间的十四位健康绝经前女性的阴道的中间区域获取样本。排除准则是确定怀孕或哺乳期的女性、在取样时处于经期或针对先前的阴道炎进行了抗微生物疗法。
将拭子铺展在MRS琼脂板中并在37℃下厌氧培育。选择革兰氏阳性非孢子化杆菌作为假定乳杆菌。纯培养物长期存储(-20℃)在甘油中以供进一步分析。
2.分子鉴定
为了确保分离株是特有的，产生琼脂糖随机扩增多态DNA(RAPD)图谱，且丢弃重复分离株。
与Chenoll等人(《有效抵抗病原性细菌幽门螺旋杆菌的新颖益生菌双岐双叉杆菌CECT 7366菌株(Novel Probiotic Bifidobacterium bifidum CECT 7366strain activeagainst the pathogenic bacterium Helicobacter pylori)》，2011，《应用和环境微生物学(Applied and Environmental Microbiology)》77(4):1335-1343)一样通过16S rRNA基因测序实行分子鉴定。简单来说，从纯培养物提取DNA并进行纯化，且通过PCR技术扩增16SrDNA。将扩增产物纯化并进行测序。通过将获得的序列与BLAST数据库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行比较来实现鉴定。
3.最好的pH降低菌株的选择
为了研究乳杆菌菌株降低pH水平的能力，在37℃下于17h内在de Man,Rogosa andSharpe(MRS)培养基中生长菌株的规范化培养物。在pH仪表的辅助下测量最终pH。重复三次执行测定。分开地执行实验后，测试降低pH水平的大部分降低菌株的组合。为了执行这种测定，在37℃下于17h内在MRS培养基中共同培养两种菌株，且在pH仪表的辅助下测量最终pH。
4.有机酸图谱的鉴定
为了获得所选菌株的有机酸图谱，在37℃下在1L发酵器(Biobundle；Applikon)中于Biopolis中优化的用于乳杆菌的工业培养基中厌氧地培养每个菌株。对于每个菌株，在两个条件下进行测定：具有pH控制和不具有pH控制。在两种情况下，在测定期间监测pH的水平。在整个测定中收集样本。对于有机酸定量，通过使含有5％偏磷酸、硫酸铜(1.56mg/ml)及作为内标物的50mM 4-甲基戊酸的0.2mL的混合物涡流来混合0.8mL无细胞上清液。接着通过0.45pm孔径过滤样本，且稀释成1/2和1/10。
有机酸的评估通过HPLC色谱法执行。在由制造厂定义的条件下将10μL处理后样本的等分试样注入到装备有Rezex管柱的HPLC Alliance 2695(Waters)上(ROA有机酸(H+)8％300×7，8mm，8μm[高级])。通过折射率检测器(2414Waters)实现检测。洗脱液为等度流动速率为0.6mL/min的脱气H2SO4(2.5mM)。在所有情况下，通过添加先前定义的混合物建构定量曲线。
5.对商业产品的抗性
为了测试菌株BPL005对不同妇科产品的抗性，将每个产品的直接储备物的等分试样溶解于液体培养基中达到5120pg/ml，且进行0.22pm过滤。储备溶液存储在-80℃下。从第一次稀释开始，在512pg/ml到0.125pg/ml的范围内执行1/2系列稀释。从24h集落直接获得接种物，使其再悬浮在盐水中以达到0.5MacFarland，且在盐水中稀释成1/20。在多孔板中执行测定，且在37℃下于24h内厌氧地进行培育。将最小抑菌浓度(MIC)确定为抗生素发挥明显抑制作用(不生长)的最小浓度。就具有高浊度的产品而言，测定包含第二步骤，其中第一培养基中的BPL005的5pL24h培养液在系列稀释的商业产品的存在下滴入琼脂板中以确认益生菌的生长。
6.基因组序列
为了获得菌株BPL005的全基因组的全基因组序列和分析，执行基因组测序和生物信息学分析。
i)测序：
为了获得所选菌株的全基因组，从主细胞库获得高度浓缩菌块，且遵循Pitcher等人(《使用硫氰酸胍迅速提取细菌基因组DNA(Rapid extraction of bacterial genomicDNA with guanidium thiocyanate)》，1989，《应用微生物学快报(Letters in AppliedMicrobiology)》，8(4):151-156)手动提取高纯DNA。已在Pacific Biosciences平台(PacBio)的辅助下执行测序。
ii)生物信息学分析：
已装配从全基因组测序获得的原始序列，从而建构待用于基因组注释的支架(scaffolding)。将预测tRNA、rRNA和开读框(open Reading Frame；ORF)。通过将每个ORF于含有来自细菌界的所有序列的数据库进行比较来注释ORF功能性。一旦将基因功能性关联到每个ORF，将检索和列出毒性和抗生素抗性基因。
结果
1.菌株的分离和选择
获得总计十四个样本，且将所述样本铺展在MRS琼脂板中以便获得分离株。从重新获得的100个分离株中获得十四个菌株。从阴道样本获得所有所述菌株。一旦重新获得，即将菌株长期存储(-20℃)在甘油中以供进一步分析。基于革兰氏染色和细胞形态对获得的分离株进行分类。将十四个革兰氏阳性非孢子化杆菌分类为假定乳杆菌，且因此选择其用于进一步鉴定。
2.分子鉴定
一旦重新获得分离株，即执行琼脂糖RAPD图谱以便丢弃重复分离株。基于RAPD图谱，将十四分离株分组为六种不同的菌株。通过16S rRNA测序鉴定菌株(表1)，且选择乳杆菌菌株用于进一步研究(表2)。另外，将收集菌株卷曲乳杆菌CECT 4840和惰性乳杆菌DSM13335包含在所述研究中。
表1.通过RAPD图谱和16S rRNA测序获得的群组。
表2.获得乳杆菌菌株。
3.最好的pH降低菌株的选择
研究菌株降低pH水平的能力。表3概述所获得的结果。在用仅一个菌株执行的测定中，pH水平在所有情况下都降低了。在菌株鼠李糖乳杆菌BPL005的情况下获得了最高pH降低，最终pH为3.82。
表3.在乳杆菌菌株的生长培养物中获得的pH水平(使用纯培养物的测定)。
基于pH降低结果，选择菌株鼠李糖乳杆菌BPL005和干酪乳杆菌BPL013用于进一步研究。
4.有机酸图谱的鉴定
已将有机酸描述为抑制代谢物，且也将其描述为具有益生元效果的化合物。在这种意义上讲，基于菌株BPL005和BPL013在1L发酵中的有机酸的产量而分析所述菌株。关于在无pH控制的测定中的pH降低，就菌株BPL005而言，pH极快速地开始降低。在发酵5小时后，pH水平为3.7，且在发酵10小时后，pH达到其最小值(pH 3.0)。就BPL013菌株而言，pH逐渐降低，最低pH是在发酵30小时后。
表4到表5展示有机酸的产量。就具有pH控制的发酵而言，在发酵结束时重新获得样本。在所有情况下，对于乳酸而言，在控制pH的发酵中获得最高水平，就BPL013而言最高浓度为22.53g/L，就BPL005菌株而言最高浓度为19.90g/L。就BPL005菌株而言，乳酸的迅速产生与其在较短时间内减小pH的高能力一致。乳酸的产生之后跟随pH在两种菌株中的降低，就菌株BPL005而言降低更显著。
关于其余酸的产生，在所有情况下，菌株BPL005是最好的产生者。已报告这些有机酸可抑制病原体细菌和酵母(Juarez等人，《泌尿生殖器病原体抑制和被视为益生菌候选的阴道乳杆菌菌株之间的相容性(Urogenital pathogen inhibition and compatibilitybetween vaginal Lactobacillus strains to be considered as probioticcandidates)》，2011，《欧洲妇产科和生殖生物学杂志(European Journal of Obstetrics&Gynecology and Reproductive Biology)》，159:399-406)。就乳酸而言，获得的水平高于先前在以上引用的Juarez等人的参考中所描述的其它酸。
表4.在BPL005发酵中获得的有机酸的含量(g/L)。
表5.在BPL013发酵中获得的有机酸的含量(g/L)。
ND：未检测到。
5.对商业产品的抗性测定。
使用妇科商业产品获得的结果概述于表6中。在所有情况下，菌株BPL005对所测试的最高浓度具有抗性，且未观察到抑制，即时在凝胶和乳膏基质中的产品以最高浓度进行测试也是如此。
表6.针对孕酮类产品获得的MIC值。
*由于其初始浓度，不可能测试更高的浓度。
6.基因组序列
已对菌株BPL005的全基因组进行测序。已执行全基因组提取；证实菌株的鉴定且已应用测序。所述装配提供3.023Mb的特有重叠群。无序列被预测为质粒。
结论
本实例之结果表明分离BPL005鼠李糖乳杆菌菌株的以下本文中的相关阳性特征：
1：其是从来自健康女性的阴道的分离株重新分离的，即初步认为不存在认为其并非如所指的新颖菌株的原因；
2：随机扩增多态DNA(RAPD)特性图谱表明所述菌株不同于其它菌株，且16S rRNA测序展示BPL005为特有鼠李糖乳杆菌菌株；
3：BPL005具有最高容量的阴道分离菌株以降低pH水平；
4：在无pH控制的测定中，BPL005具有迅速pH降低效果。就BPL005菌株而言，乳酸的迅速产生与其在较短时间内减少pH的高能力一致。关于其余酸的产生，菌株BPL005是所测试菌株的最好产生者；
5：关于对妇科商业产品的抗性，菌株BPL005对测试的最高浓度具有抗性且未观察到抑制；
6：菌株BPL005的全基因组的基因组测序展示其具有3.023Mb的特有重叠群，即基因组序列不是先前技术描述的序列。
实例2：BPL005与商业妇科益生菌的比较
材料和方法
产品中的活细胞。
为了深入研究现在市场中可获得的不同商业益生菌产品，分析基于18种益生菌产品的集合。所测试产品概述于表7中。对于每一种产品，通过在MRS板中进行计数来获得浓度，且测试菌株的功能。为了研究功能，对益生菌菌株进行分离，通过16S rDNA测序和其降低所测试pH的能力进行鉴定。
表7.所分析的商业产品。
降低pH水平的能力
从商业产品分离益生菌菌株且存储在-80℃下。通过16S rDNA测序来确认物种水平下的鉴定。对于每一种菌株，如上文所阐述进行pH降低测定。包括BPL005菌株作为对照。
结果
产品中的活细胞
为了深入研究现在市场中可获得的不同商业益生菌产品，分析基于18种益生菌产品的集合。所测试产品概述于表8中。对于每一种产品，通过在MRS板中进行计数来获得浓度，且测试菌株的功能。为了研究功能，对益生菌菌株进行分离，通过16S rDNA测序和其降低所测试pH的能力进行鉴定。
表8.商业产品的比较分析。
1剂量是以mg而不是CFU来给定；2在包封的时间内是活的；3组合物中无益生菌；4裂解的益生菌
如表8中所展示，结果变化很大。其中一些展示低于规格的活细胞。
降低pH水平的能力
对来自商业产品的益生菌菌株进行分离且测试其降低pH水平的能力。表9展示其中所获得的比较。
表9.商业益生菌所获得的pH水平的降低。
所获得结果展示菌株BPL005具有与所测试最好益生菌类似的pH降低水平。
结论
本实例的结果展示菌株BPL005具有与本文中的相关商业妇科益生菌产品的所测试最好益生菌类似的pH降低水平。
实例3：乳酸菌菌株BPL005在实验室规模生产(体积为1L)中的产率的评价
材料和方法
对于产率的评价，构建在-80℃下的主细胞库和工作细胞库。
在1L发酵器(Biobundle；Applikon)中、在乳杆菌优化工业介质中进行实验室规模生产。在标准条件(表10)下获得培养物，且通过离心来收集细胞。在收集之后，将离心块再悬浮于麦芽糊精基载液中，且在-80℃下冷冻并冻干。
表10.发酵条件
为了评价菌株对于冷冻和冻干过程的抗性，在收集之前和在冻干之后，在MRS琼脂板上检验细胞存活率。
冻干产品的稳定性的研究
对冻干粉末进行真空包装且存储在5℃(±3℃)下。通过在15个月期间在MRS中进行计数来检验产品的稳定性。
结果
为了获得菌株BPL005效率的评价，进行实验室规模生产。所获得结果概述于表11中。所获得结果展示菌株BPL005在实验室规模下的生产过程中的良好效率。
表11.在1L发酵之后所获得的结果。
对冻干粉末进行真空包装且存储在5℃下。通过在MRS中计数来检验产品的稳定性。BPL005菌株在15个月的时间段中获得良好稳定性。
结论
本实例的结果展示菌株BPL005在实验室规模(体积为1L)的生产过程中的良好效率，且制得的冻干粉末的数据展示BPL005菌株在15个月的时间段中获得良好稳定性。
实例4：乳杆菌BPL005菌株的工业生产(体积为1500L)
材料和方法
工业规模放大生产
在1500L发酵器中进行工业生产。在乳杆菌优化工业介质中进行生长。在标准条件(厌氧地，控制pH和温度)下获得培养物，且通过在工业离心机中进行离心来收集细胞。
冻干优化
一旦获得，则将离心块再悬浮于载剂(麦芽糊精基)中且在工业冻干器中进行冻干。为了获得菌株对于抵抗冻干过程的能力，在刚好在发酵过程之后和在工业冻干过程之后，在MRS琼脂板上检验存活率。通过随机选择菌落的电泳RAPD(多态DNA的随机扩增)图谱来检验培养物和冻干产品的纯度。
散装粉末的保存期评价。
散装粉末的保存期正处于研究中。将散装粉末的等分试样存储在5℃和25℃下。应通过在MRS琼脂上计数来定期进行评价。
结果
工业规模放大生产
在1500L发酵器中按照标准条件进行工业生产。鼠李糖乳杆菌BPL005培养物呈现6.55×109CFU/mL。这个结果与在1L规模中所获得的结果一致，且就过程的效率而言是可接受的。
冻干优化
所获得计数概述于表12中。所获得结果展示菌株BPL005对于1500L规模下的生产过程的良好效率。
表12.在1500L发酵之后所获得的结果。
采集时间 17h
发酵器中的最终CFU/ml 6.55×109CFU/ml
冻干物中的最终CFU/g 5.53×1011CFU/g
散装粉末的保存期评价。
真空包装冻干菌株BPL005的在5℃和25℃下的1500L生产中所获得的稳定性展示产品在5℃的温度下是极其稳定的。在25℃下所获得的结果展示可接受的较低数量降低。
结论
本实例的结果展示菌株BPL005在工业规模(体积为1500L)下的生产过程中的良好效率，且制得的冻干粉末的数据展示BPL005菌株获得极良好稳定性。
参考文献
1：EP0257007(1987年提交)
2：EP2509610B1(《HSO健康护理(HSO Health Care)》，维也纳，2011年9月13日提交且在2013年公开/授予)
3：Chenoll E、Codoner FM、Martinez-Blanch JF、RamonD、Genoves S、MenabritoM，2016年，《用于治疗细菌性阴道病的益生菌鼠李糖乳杆菌菌株BPL5(CECT 8800)的全基因组序列(Complete genome sequence of Lactobacillus rhamnosus strain BPL5(CECT8800),a probiotic for treatment of bacterial vaginosis)》，《基因组公告(GenomeAnnounc)》4(2):e00292-16.doi:10.1128/genomeA.00292-16，2016Chenoll等人，2016年4月公开。

Claims (14)

1.一种乳酸鼠李糖乳杆菌细菌，具有登记号CECT8800。
2.一种饮食或医药组合物，包括根据权利要求1中的任一个的所述细菌。
3.根据权利要求2所述的饮食或医药组合物，其中所述组合物具有一定浓度的活细胞，所述浓度在104到1014cfu(集落形成单位)每克所述组合物的范围内，优选地其中活细胞的所述浓度在106到1013cfu(集落形成单位)每克所述组合物的范围内。
4.根据前述权利要求中任一项所述的饮食或医药组合物，其中所述组合物包括呈冷冻形式、干燥形式或冷冻干燥形式的所述细菌。
5.根据权利要求4所述的饮食或医药组合物，其中所述组合物包括呈冷冻干燥形式的所述细菌，且所述组合物还包括合适的冷冻保护剂(例如麦芽糊精)。
6.根据前述权利要求中任一项所述的饮食或医药组合物，其中所述组合物适合于口服或经阴道给药。
7.根据权利要求6所述的饮食或医药组合物，其中所述组合物呈用于经阴道给药的栓剂、经阴道胶囊形式或呈用于口服的包衣胶囊、片剂、药囊、丸剂、珠剂、小瓶、酸奶、酸奶饮料、发酵乳、果汁及其它发酵饮料和食品的形式。
8.根据前述权利要求中任一项所述的饮食或医药组合物，其中所述组合物为还包括医药学上可接受的佐剂和/或赋形剂的医药组合物。
9.一种用于治疗女性病症的根据权利要求2到8中任一项所述的饮食或医药组合物，其中所述病症为天然产生的阴道细菌微生物群的失衡、阴道感染、女性生殖器感染、泌尿生殖器感染或尿路感染。
10.根据权利要求9所述的饮食或医药组合物，其中所述病症为阴道病、阴道炎、慢性细菌性阴道病、慢性酵母菌感染、更年期慢性尿路感染、萎缩性阴道炎、阴道病或细菌性阴道病。
11.根据权利要求10所述的饮食或医药组合物，其中所述感染为细菌性阴道病。
12.一种用于人类营养的乳制品、饮品、食品和/或用于动物营养的饲料产品，特征在于所述产品含有根据权利要求2到8中任一项所述的饮食组合物。
13.一种制造发酵食物或发酵饲料产品的方法，包括将根据权利要求1中任一权利要求所述的乳酸鼠李糖乳杆菌细菌添加到食物或饲料产品起始材料，及将所述因此接种的起始材料保持在所述乳杆菌代谢活跃的条件下。
14.一种获得具有登记号CECT8800的乳酸鼠李糖乳杆菌细菌的突变株的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)：制得具有所述登记号CECT8800的所述乳酸鼠李糖乳杆菌细菌的突变体；
(ii)：分析在步骤(i)中制得的突变体及鉴定保持或进一步提高CECT8800降低pH水平的能力的突变株；以及
(iii)分离在步骤(ii)中鉴定的所述突变株，由此获得具有所述登记号CECT8800的乳酸鼠李糖乳杆菌细菌的所述突变株，其中所述突变株保持或进一步提高CECT8800降低pH水平的所述能力。
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