CN102835657A - 用以抑制发炎反应及抗阴道炎的含乳酸菌食品组合物及医药组合物 - Google Patents
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Abstract
一种用以抑制发炎反应及抗阴道炎的食品组合物及/或医药组合物，包含：至少一乳酸菌菌株，其选自以下任一或多种组合的生物性培养物：唾液乳酸杆菌(Lactobacillus salivarius)AP-32菌株，保藏编号CCTCC NO：M 2011127、罗伊氏乳酸杆菌(Lactobacillus reuteri)TE-33菌株，保藏编号CCTCC NO：M 2011126、嗜酸乳酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)F-1菌株，保藏编号CCTCC NO：M 2011124、鼠李糖乳酸杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CT-53菌株，保藏编号CCTCC NO：M 2011129或其组合。本发明可抑制树突状细胞的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的产生及/或促进白细胞介素-10(IL-10)的产生，并进而抑制发炎反应及阴道黏膜细胞发炎的症状。本发明可以口服益生菌及直接接触于患处的益生菌制剂形式存在。
Description
技术领域
本发明涉及一种食品组合物以及医药组合物，特别是一种包含乳酸菌菌株的食品组合物以及医药组合物，其用以抑制发炎反应。
背景技术
由国际发表文献中论述，益生菌定义为可促进宿主健康的活性微生物。益生菌拥有促进人体健康的能力，在上个世纪末已被发觉，且逐步进行许多科学验证的研究。首先被发现益生菌对于肠胃不适的症状有舒缓的能力，直至今日，调整肠胃道功能仍是益生菌在产品应用上重要的一环。
然而，除了肠胃道功能外，近年来益生菌在免疫调节方面的功能，也开始崭露头角，许多关于益生菌与免疫相关的文献陆续发表，研究结果如雨后春笋般出现，益生菌在免疫调节上的能力，可以见得。目前在益生菌对于免疫功能上，有提升免疫力、调整过敏体质、辅助缓解自体免疫疾病及抗发炎等等，皆在研究范畴中。一般食用含乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB)的产品仅具有调整肠道的健康效果，虽然有数以万计的乳酸菌菌株存在于自然界，但仅有少数乳酸菌菌株具有调节免疫，甚至抗发炎反应的特质。
时至今日，仅有少数几株经证明其具有调节免疫的健康效果的乳酸菌菌株被确认出来，而乳酸菌对身体健康的功能在于菌株(strain)的特异性而非菌种(species)，此种对于人的身体健康有特殊功效的菌株称为功能性益生菌(Guidelines for the evaluation of probiotics in food；Report of joint FAO/WHOworking group on drafting guidelines for the evaluation of probiotics in food；London Ontario，Canada April 30 and May 1，2002：1-7)。
抗发炎的益生菌株对于阴道发炎的症状，有舒缓症状的效果，尤其经由口服的途径，更能加速缓解阴道发炎的症状。国内外有许多益生菌与抗阴道炎方面有关的文献报导。在体外试验方面，Lactobacillus crispatus及Lactobacillusjensenii被发现具有产生H2O2及类抑菌物质化合物成分，可以有效抑制并杀死阴道内致病菌株(Jasadee et al.，2006)。Lactobacillus acidophilus、Lactobacillusrhamnosus、Lactobacillus plantarum及Lactobacillus fermentum菌株与阴道念珠菌共同培养后，发现可以有效抑制阴道念珠菌的生长(Magdalena et al.，2005)。将阴道炎致病菌株Gardnerella vaginalis及Prevotella bivia与HeLa细胞(模拟阴道黏膜内皮细胞)共同培养，使致病菌株吸附在细胞上，再加入Lactobacillus gasseri共同培养，发现Lactobacillus gasseri可以破坏Gardnerella vaginalis及Prevotellabivia对于HeLa细胞的吸附性外，pH值在4.5～5.5之间的破坏效果最好，显示益生菌的确可以抑制并杀死阴道炎致病菌株，且维持阴道黏膜的弱酸性，对于抑制致病菌株的活性及增加益生菌的活性，皆有极大的帮助(Fabrice et al.，2006)。这些文献证实在阴道炎菌丛的体外模拟试验上，益生菌确实能够对抗阴道炎的致病菌丛，藉此改善阴道炎的症状。
乳酸菌在临床实验上，将嗜酸乳酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)发酵酸奶，菌数大于108以上，让阴道炎病患服用2个月，病人改善情形为60％，远大于安慰剂组的25％(Shalve et al.，1996)。而将卫生棉条浸润Lactobacillusacidophilus发酵酸奶及5％醋酸，用于阴道发炎病患4周～8周，发现阴道炎缓解的程度为88％，比醋酸组的38％高出许多(Neri et al.，1993)。口服含Lactobacillusrhamnosus及Lactobacillus fermentum菌株109以上菌数的胶囊，一天一次，服用60天，对于阴道炎的改善效果高达87.5％(Reid et al.，2004)。
然而，仅少数乳酸菌菌株具有的耐酸与耐胆盐能力、吸附黏膜表皮细胞的能力以及在通过肠胃道后仍可存活的能力等特性，因此需筛选可促进健康效果及可成为功能性益生菌的菌株。
综合上述，寻找适合的乳酸杆菌，用作抗发炎，特别是抗阴道炎的作用，以作为功能性益生菌菌株，是目前需要努力的目标。
发明内容
本发明的目的为提供一种食品组合物及医药组合物，其可藉由抑制肿瘤坏死因子-α的产生及/或促进白细胞介素-10(IL-10)的产生，进而抑制发炎反应。
本发明的另一目的为提供一种食品组合物及医药组合物，其具有酸性及胆盐的耐受性，以作为口服益生菌。
本发明的另一目的为提供一种食品组合物及医药组合物，其具有阴道炎栓剂的耐受性，以作为治疗阴道炎的用途。
在一实施例之中，本发明的一种食品组合物，用以抑制发炎反应，包含至少一乳酸菌菌株，其选自以下任一或多种组合的生物性培养物：唾液乳酸杆菌(Lactobacillus salivarius)AP-32菌株，保藏编号CCTCC NO：M 2011127、罗伊氏乳酸杆菌(Lactobacillus reuteri)TE-33菌株，保藏编号CCTCC NO：M 2011126、嗜酸乳酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)F-1菌株，保藏编号CCTCC NO：M2011124、鼠李糖乳酸杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CT-53菌株，保藏编号CCTCC NO：M 2011129或其组合。
在另一实施例之中，本发明的一种医药组合物，用以抑制发炎反应，包含至少一乳酸菌菌株以及生理上可接受的赋形剂或稀释剂。乳酸菌菌株为选自以下任一或多种组合的生物性培养物：唾液乳酸杆菌(Lactobacillus salivarius)AP-32菌株，保藏编号CCTCC NO：M 2011127、罗伊氏乳酸杆菌(Lactobacillusreuteri)TE-33菌株，保藏编号CCTCC NO：M 2011126、嗜酸乳酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)F-1菌株，保藏编号CCTCC NO：M 2011124、鼠李糖乳酸杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CT-53菌株，保藏编号CCTCC NO：M2011129或其组合。
本发明亦可广义的包括本发明说明书中分开或总合说明的部分、构成要件与特征，及任何包含所述部分、构成要件与特征中任何一种或更多种的任何或全部组合，且若本文所述及的明确完整事物已于与本发明有关的相关技术中出现已知的同等物时，所述已知的同等物将如同独立事项并入本文中。
附图说明
图1显示，唾液乳酸杆菌AP-32菌株、罗伊氏乳酸杆菌TE-33菌株、嗜酸乳酸杆菌F-1菌株以及鼠李糖乳酸杆菌CT-53菌株菌数并不受胃酸的影响，胆盐的部份则除了鼠李糖乳酸杆菌CT-53菌株较为敏感外，唾液乳酸杆菌AP-32菌、罗伊氏乳酸杆菌TE-33菌株、嗜酸乳酸杆菌F-1菌株皆不受胆盐影响而使菌数急剧下降，证明本发明的抗阴道炎乳酸菌可以通过人体消化系统严格环境的考验。
图2显示，唾液乳酸杆菌AP-32菌株、罗伊氏乳酸杆菌TE-33菌株、嗜酸乳酸杆菌F-1菌株以及鼠李糖乳酸杆菌CT-53菌株其抑菌环直径皆小于等于4mm，因此皆判定为耐受性良好的菌株。
具体实施方式
本发明一方面广义的包括由下列任一种生物性培养物：唾液乳酸杆菌(Lactobacillus salivarius)AP-32菌株，保藏编号CCTCC NO：M 2011127、罗伊氏乳酸杆菌(Lactobacillus reuteri)TE-33菌株，保藏编号CCTCC NO：M 2011126，嗜酸乳酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)F-1菌株，保藏编号CCTCC NO：M2011124，鼠李糖乳酸杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CT-53菌株，保藏编号CCTCC NO：M 2011129或其组合，以及生理上可接受的赋形剂或稀释剂所组成的食品组合物或医药组合物。其中乳酸菌菌株可为具有活性或去活性(inactivated)的菌株。
其中，食品组合物可包含但不限于发酵乳、酸奶、奶酪、乳制饮品乳粉、茶、咖啡或以上的组合。
医药组合物可包含口服剂型或外用剂型；口服剂型例如为锭剂、胶囊、溶液剂及粉剂等。外用剂型例如为乳膏、喷雾剂、凝胶、散剂或霜剂等。
此外，本发明可用于抗阴道炎，因此可用于妇女用品，包含但不限于喷雾、软膏或卫生棉等。
本发明的乳酸菌的形态学及一般性质
本发明所述的菌株的冷冻干燥培养物已保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址为中国武汉。保藏的详细资料如表1所示：
表1：乳酸菌名称及保藏数据
根据16S rDNA序列分析及API细菌鉴定系统分析结果来确认菌株在分类学上的特征。发现，菌株编号AP-32为唾液乳酸杆菌；菌株编号TE-33为罗伊氏乳酸杆菌；菌株编号F-1为嗜酸乳酸杆菌；菌株编号CT-53为鼠李糖乳酸杆菌。此菌株在形态学及一般性质上的特征详细列于表2：
表2：乳酸菌形态学及一般性质的特征
抑制发炎反应
目前已知在Th17发炎反应之中，Th17型辅助型T细胞在发炎激素肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)刺激下，其会分泌出许多细胞激素(例如IL-6、IL-17)及介质来吸引发炎细胞的聚集以共同造成感染的发炎反应。白介素-10(IL-10)被发现其具有抗发炎的作用，可抑制IL-6和TNF-α等发炎细胞激素产生。因此可藉由调控增加细胞IL-10及/或减少TNF-α，进而抑制Th17的发炎反应，改善Th17型免疫反应过剩的发炎现象。
一、抑制TNF-α的分泌(以树突状细胞为体外功效验证平台)
测定Th17型免疫能力的抑制效果，其作用方式为利用前述乳酸菌共同培养后测定TNF-α的分泌量。使用如下的实验步骤：
1.抽取适当人类血液量每次约200mL。
2.取等比例的血球分离液(Ficoll-paque)与血液在18-20℃以400g离心30-40分钟。
3.取人外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC)层，缓冲溶液清洗细胞2至3次后，以适当的培养基(例如RPMI-1640)悬浮细胞。
4.以带有CD14+的微珠体(microbeads)(MiniMACS system)将细胞的CD14+单个核细胞自利用PBMC细胞纯化。
5.以细胞激素IL-4及生长激素GM-CSF刺激细胞分化成树突状细胞，6-7天的培养时间，将已分化的树突状细胞收集。
6.将乳酸菌菌株在共同培养之前3天活化，之后以100℃热致死乳酸菌菌株30分钟。
7.将树突状细胞与已热致死的乳酸菌菌株以1∶10比例共同培养48小时。
8.收取细胞培养的上清液。利用酶联免疫分析法(enzyme-linked-immunosorbent serologic assay，ELISA)检测TNF-α在上清液中的含量。
数据的统计分析如表3所示，以平均值±标准差(Mean±SD)表示。当分别以106至108个CFU菌株的混菌培养物与105至107个人类树突状细胞分别共同培养48小时，收取细胞上清液，以酶联免疫分析法检测TNF-α在上清液中的含量。其中以市售抗阴道炎功能产品的混菌培养物(Biocan Vagi-guard
，其有效成份为乳酸菌)为对照组，脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)为正控制组，仅含细胞(Cell only)的实验背景值为负控制组，检测TNF-α受刺激浓度。结果显示本发明的试验组可以显著的抑制人类树突状细胞分泌TNF-α与正控制组(LPS)有显著性差异并比正控制组(LPS)及对照组(Biocan Vagi-guard
)的刺激量分别低于84倍与135倍。
表3为本发明所述的乳酸菌菌株混菌配方及控制组、对照组分别与人类树突状细胞培养，刺激TNF-α的分泌量：
二、促进IL-10分泌(以树突状细胞为体外功效验证平台)。
为测量IL-10分泌的增加，将人类树突状细胞与前述乳酸菌共同培养后测定IL-10的分泌量，以测定对抗发炎细胞激素免疫能力的增进效果。使用如下的实验步骤：
1.抽取适当人类血液量每次约200mL。
2.取等比例的血球分离液(Ficoll-paque)与血液在18-20℃以400g离心30-40分钟。
3.取人外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC)层，缓冲溶液清洗细胞2至3次后，以适当的培养基(例如RPMI-1640)悬浮细胞。
4.以带有CD14+的微珠体(microbeads)(MiniMACS system)将细胞的CD14+单个核细胞自利用PBMC细胞纯化。
5.以细胞激素IL-4及生长激素GM-CSF刺激细胞分化成树突状细胞，6-7天的培养时间，将已分化的树突状细胞收集。
6.将乳酸菌菌株在共同培养之前3天活化，之后以100℃热致死乳酸菌菌株30分钟。
7.将树突状细胞与已热致死的乳酸菌菌株以1∶10比例共同培养48小时。
8.收取细胞培养的上清液。利用ELISA检测IL-10在上清液中的含量。
数据的统计分析如表4所示，以Mean±SD表示。当分别以热致死106至108个CFU的混菌培养物与105至107个人类树突状细胞共同培养48小时，收取细胞上清液，以酶联免疫分析法检测IL-10在上清液中的含量。其中以仅含细胞(Cellonly)的实验背景值为负控制组，以抗阴道炎功能产品的混菌培养物(BiocanVagi-guard
)为对照组，植物凝集素(Phytohemagglutinin，PHA)为正控制组，检测IL-10受刺激浓度。结果显示本发明的试验组可以显著的刺激人类树突状细胞分泌IL-10，与负控制组(Cell only)有显著性差异，并比对照组(BiocanVagi-guard
)的刺激量高出5倍。表4所示为以热致死乳酸菌菌株混菌配方及控制组、对照组分别与树突状细胞培养，刺激IL-10的分泌量。
表4：为本发明所述的乳酸菌菌株混菌配方及控制组、对照组分别与人类树突状细胞培养，刺激IL-10的分泌量
本发明的乳酸菌的耐胃酸胆盐试验
本发明的目的为提供大众在阴道炎治疗上除药物以外的新选择，本发明找出对人体无副作用且有益健康的乳酸菌以作为阴道炎治疗的新选择。
由于口服益生菌要发挥抗阴道炎的效果除了要找出具有特定功能的菌株外，更要确认菌株能通过人体胃酸胆盐的环境外，还要能对阴道炎常用药物具有耐受能力的乳酸菌菌株，因此需要具备上述特性，本发明的乳酸菌才可以提供治疗或舒缓阴道炎症状的医疗用途，并降低阴道炎的复发率。
为检测本发明的乳酸菌菌株是否具有通过胃酸胆盐考验的能力顺利在肠道发挥其抗发炎的功能，试验流程如下：
1.将本发明的乳酸菌活化3天。
2.取1mL菌液计算原始菌数，剩余的乳酸菌以500g离心10分钟，加入去离子水清洗乳酸菌2至3次。
3.加入以盐酸调配成pH 2.5的培养基中，本发明的乳酸菌与pH 2.5的培养基充分混合后，置于37℃培养箱。
4.每小时取出1mL的菌液以去离子水清洗2至3次后，计算存活细胞数，至3小时培养时间为止。
5.剩余菌液离心后沉淀物再以含1.5％(w/V)牛胆汁(ox gall，Sigma)的培养基中回溶，充分混合后，于37℃培养。
6.每小时取出1mL的菌液以去离子水清洗2至3次后，计算存活细胞数，至4小时培养时间为止。
7.记录乳酸菌生长速率，计算乳酸菌对胃酸与胆盐的耐受力，以比较样品中本发明的乳酸菌在胃酸及胆盐存在下，菌株生长是否受到抑制。
耐胃酸的能力结果与分析整理于表5及图1所示。结果显示，本发明的乳酸菌在培养基活化后，将菌株处理酸性缓冲溶液及胆盐，AP-32、TE-33、F-1及CT-53菌数并不受胃酸的影响。耐胆盐的能力结果与分析整理于表6及图1所示，在胆盐的部份则除了CT-53较为敏感而使菌数下降之外，AP-32、TE-33及F-1菌株皆不受胆盐影响。以上证明本发明的乳酸菌可以通过人体消化系统环境的考验。
表5：以pH值2.5的盐酸与本发明的乳酸菌混合
表6为以1.5％的胆汁与本发明的乳酸菌混合：
本发明的乳酸菌对治疗阴道炎常用栓剂抑霉剂克霉唑(Clotrimazole)的耐受能力试验
在平板培养基上涂布高密度菌数，使菌株长满盘。将抑霉剂克霉唑(Clotrimazole)点置在平板正中央，以37℃培养48小时后，观察抑菌环直径的大小判定菌株的耐受能力。在耐受性判断部分，抑菌环直径小于等于4mm为耐受性良好，大于4mm且小于等于5mm为耐受性中等，大于5mm以上为无耐受性。耐受性结果整理于表7及图2，其显示AP-32、TE-33、F-1以及CT-53菌株皆判定为耐受性良好的菌株。
表7为本发明的乳酸菌对抑霉剂克霉唑的耐受能力试验。
| 菌株名称 | 抑菌环直径(mm) |
| AP-32 | 4 |
| TE-33 | 0 |
| F-1 | 1 |
| CT-53 | 0.2 |
本发明的乳酸菌组合具有抑制发炎反应，并具有胆盐、酸性及抑霉剂的耐受性，并因此用于口服益生菌，并具有抗阴道炎的能力，包括抑制阴道致病菌丛及发炎症状，例如红肿、搔痒、疼痛等的功能，并可用于喷雾或是卫生棉，以促进妇女健康。
以上所述的实施例仅是为说明本发明的技术思想及特点，其目的在于使本领域技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，不能以之限定本发明的权利要求，即大凡依本发明所揭示的精神所作的均等变化或修饰，仍应涵盖在本发明的权利要求内。
Claims (9)
1.一种食品组合物，用以抑制发炎反应，包含：
至少一乳酸菌菌株，其选自以下任一或多种组合的生物性培养物：唾液乳酸杆菌(Lactobacillus salivarius)AP-32菌株，保藏编号CCTCC NO：M 2011127、罗伊氏乳酸杆菌(Lactobacillus reuteri)TE-33菌株，保藏编号CCTCC NO：M2011126、嗜酸乳酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)F-1菌株，保藏编号CCTCCNO：M 2011124、鼠李糖乳酸杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CT-53菌株，保藏编号CCTCC NO：M 2011129或其组合；以及
生理上可接受的赋形剂或稀释剂。
2.如权利要求1所述的食品组合物，其特征在于，该乳酸菌菌株包含唾液乳酸杆菌AP-32菌株、罗伊氏乳酸杆菌TE-33菌株、嗜酸乳酸杆菌F-1菌株及鼠李糖乳酸杆菌CT-53菌株。
3.如权利要求1所述的食品组合物，其特征在于，该赋形剂或该稀释剂为发酵乳、酸奶、奶酪、乳制饮品、乳粉、茶、咖啡或以上的组合。
4.如权利要求1所述的食品组合物，其特征在于，该乳酸菌菌株为具有活性或去活性的菌株。
5.如权利要求1所述的食品组合物，其特征在于，用以抗阴道炎。
6.一种医药组合物，用以抑制发炎反应，包含：
至少一乳酸菌菌株，其选自以下任一或多种组合的生物性培养物：唾液乳酸杆菌(Lactobacillus salivarius)AP-32菌株，保藏编号CCTCC NO：M2011127、罗伊氏乳酸杆菌(Lactobacillus reuteri)TE-33菌株，保藏编号CCTCCNO：M 2011126、嗜酸乳酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)F-1菌株，保藏编号CCTCC NO：M 2011124、鼠李糖乳酸杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CT-53菌株，保藏编号CCTCC NO：M 2011129或其组合；以及
医药上可接受的赋形剂或稀释剂。
7.如权利要求6所述的医药组合物，其特征在于，该乳酸菌菌株包含唾液乳酸杆菌AP-32菌株、罗伊氏乳酸杆菌TE-33菌株、嗜酸乳酸杆菌F-1菌株及鼠李糖乳酸杆菌CT-53菌株。
8.如权利要求6所述的医药组合物，其特征在于，该乳酸菌菌株为具有活性或去活性的菌株。
9.如权利要求6所述的医药组合物，其特征在于，用以抗阴道炎。
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