CN102597216B - 新型植物乳杆菌及其组合物 - Google Patents

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Abstract

植物乳杆菌CJLP243(KCTC11045P)，一种包含植物乳杆菌CJLP243的治疗肠道疾病的组合物，和一种包含植物乳杆菌CJLP243的增强免疫应答的组合物。

Description

新型植物乳杆菌及其组合物
技术领域
本发明涉及新型植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)及其组合物，更具体地，涉及预防或治疗肠道疾病和免疫性疾病的新型植物乳杆菌及其组合物。
背景技术
在韩国传统的发酵食品，例如泡菜中发现的乳酸菌栖息于人体的消化系统中，分解纤维材料并将蛋白质合成重要营养素。有活力的微生物如乳酸菌对宿主的消化道有益，因为这些微生物改善宿主的肠道微生物环境，该宿主如动物，包括人类，这些微生物被称为益生菌。因为益生菌需要口服施用，直达小肠并附着在小肠表面以发挥益生菌的作用，所以益生菌需要具有优良的耐酸性和胆汁耐受性，以及对肠上皮细胞的强附着力。
在韩国传统的发酵食品，例如泡菜中普遍发现的乳酸杆菌乳酸菌是益生菌。乳酸杆菌微生物在同型发酵或异型发酵下产生乳酸，而且普遍在包括人类的动物肠道中和乳制品及蔬菜发酵中发现。乳酸杆菌微生物保持酸性pH值平衡以抑制有害细菌，如大肠杆菌或梭菌的增殖，并缓解腹泻和便秘。乳酸杆菌微生物还合成维生素，具有抗癌活性并降低血清胆固醇。已知由乳杆菌产生的乳酸菌素用于抑制志贺氏菌、沙门氏菌、葡萄球菌、大肠杆菌等的生长。乳酸菌素还抑制导致腹泻的微生物的增殖，并使肠道菌群正常化以预防腹泻(Michael和Philippe，Probiotics and prebiotics：Effects on diarrhea，Thejournal of nutrition，Volume 137，March 2007，pages 803S-811S；Roberfroid，Prebiotics and probiotics：Are they functional foods？，American journal ofclinical nutrition，Volume 71，June 2000，pages 1682S-1687S)。
根据上述乳酸杆菌微生物的功能，对作为益生菌和牲畜饲料的乳酸杆菌微生物进行了积极研究。牲畜体内出现的细菌性腹泻导致死亡并降低增重率。因此，普遍使用向牲畜饲料加入抗生素的方法来预防细菌性腹泻并增加牲畜的生产力。然而，由于牲畜体内出现的抗生素耐药菌和残留抗生素，抗生素的使用受限，而提出了饲养牲畜的有机方法(韩国专利公开号1998-78358)(McEwen和Fedorka-Cray，Antimicrobial use and resistance inanimals，Clinical infectious Diseases，Volume 34，June 2002，pages S93-S106)。
此外，已知乳酸菌如乳酸杆菌微生物具有增强免疫应答作用。因此，对乳酸菌在增强免疫应答方面的作用机制进行了研究。尽管没有揭示特殊机制，获知乳酸菌口服施用，并且存在于肠道中以影响肠道免疫系统。例如，已知通过酸奶吸收乳酸菌以增强淋巴集结的淋巴细胞的抗菌活性。根据对动物和人类的研究，已知乳酸菌增强IgA应答。此外，在体内对外部微生物病原体表现出对抗性的免疫系统分为先天免疫和适应性免疫，两者都受乳酸菌影响。根据肠道免疫系统的先天免疫，已知乳酸菌预防并杀死病原体，从而具有使机体保持健康不受感染的功能。先天免疫反应在感染的早期阶段抑制外部病原体数量增长方面起重要作用。另外，先天免疫反应递送抗原和共刺激分子，从而诱发先天免疫系统之后的适应性免疫的活化。涉及先天免疫反应的代表性免疫细胞包括NK细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞(Fearon DT，Locksley RM，Science 1996，272：50-53，The instructive role ofinnate immunity in the acquired immune response)。当受试者感染时，适应性免疫实质地诱发了外部病原体的去除，而且对应于适应性免疫的免疫细胞包括T淋巴细胞和B淋巴细胞。因此，对外部病原体的物理抗性可能取决于适应性免疫活性的增强(Gowans JL.，Immunology Today.1996Jun；17(6)：288-91，The lymphocyte-a disgraceful gap in medical knowledge)。
根据适应性免疫，将分解抗原以使其接触T淋巴细胞的巨噬细胞活化以增加多种细胞因子，特别是白细胞介素、IL-12和IL-18的产生。在这方面，乳酸菌细胞壁的某些成分激活NF-κB和STAT信号在巨噬细胞中转换以增加细胞因子的产生。此外，已知乳酸菌在抗原呈递细胞诸如树突状细胞中增加IL-12、IL-18和TNF-α的产生，该树突状细胞通常在消化系统的淋巴节和粘膜中发现。而且，已知乳酸菌增加了树突状细胞中表面分子的表达，该树突状细胞活化了T淋巴细胞，如MHC II类和B7-2(Cross等，Anti-allergyproperties of fermented foods：an important immunoregulatory mechanism oflactic acid bacteria？，International Immunopharmacology，Volume 1，May 2001，pages 891-901)。
在乳酸杆菌微生物和免疫反应之间的相互关系方面已经进行了很多研究。具体地，已知某些乳酸杆菌(例如发酵乳杆菌)增强抗原特异性免疫反应，因此尝试着将其作为细菌(例如白喉、破伤风)或病毒(例如流感病毒、脊髓灰质炎病毒)疫苗的佐剂使用(de Vrese等，2005；Olivares等，2007；West等，2008)。认为乳酸杆菌微生物的免疫增强作用是源自通过特异性乳酸杆菌微生物而增强的Th1型产生细胞因子的T淋巴细胞的活性，其有效地诱发了在适应性免疫中的一般免疫细胞的生长和T细胞或B细胞的活性(Mohamadzadeh等，Lactobacilli activate human dendritic cells that skew Tcells toward T helper 1 polarization.，Proc Natl Acad Sci USA.2005 22；102(8)：2880-2885)。为了测量T淋巴细胞的增强活性，近年来积极对测量产生的IFN-γ的数量进行研究(Shida等，2006；Foligne等，2007)。已知诱发一般免疫细胞生长可以预防或治疗消化道(肠道)感染(Jain S，Yadav H，Sinha PR.Probiotic dahi containing Lactobacillus casei protects against Salmonellaenteritidis infection and modulates immune response in mice.J Med Food.2009Jun；12(3)：576-83.)、泌尿生殖道感染(Zarate G，Santos V，Nader-Macias ME.Protective effect of vaginal Lactobacillus paracasei CRL 1289 against urogenitalinfection produced by Staphylococcus aureus in a mouse animal model.InfectDis Obstet Gynecol.2009；2009：48358.Epub 2007 Mar 29.)、呼吸道感染(Yasuda Y，Matsumura Y，Kasahara K，Ouji N，Sugiura S，Mikasa K，Kita E.Microbial exposure early in life regulates airway inflammation in mice afterinfection with Streptococcus pneumoniae with enhancement of local resistance.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol.2009 Sep 25[Epub ahead of print])、螺杆菌感染(Boyanova L，Stephanova-Kondratenko M，Mitov I.Anti-Helicobacterpylori activity of Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus strains：preliminary report.Lett Appl Microbiol.2009 May；48(5)：579-84.Epub 2009Mar 9.)和过敏反应(Ouwehand AC，Nermes M，Collado MC，Rautonen N，Salminen S，Isolauri E.Specific probiotics alleviate allergic rhinitis during thebirch pollen season.World J Gastroenterol.2009 Jul 14；15(26)：3261-8)。
T淋巴细胞控制适应性免疫，其可以分为作为细胞免疫的Th1应答和作为体液免疫的Th2应答。Th1和Th2应答在抗原呈递细胞中产生不同的细胞因子。在Th1应答中，主要产生IL-2、IL-12、IL-18和干扰素-γ(IFN-γ)。在Th2应答中，主要产生PGE2、IL-4和IL-10。需要平衡Th1和Th2应答。如果Th1和Th2应答不平衡，会产生多种免疫性疾病。Th1细胞主要对抗病原体，但Th2细胞主要涉及过敏症和炎症应答。当Th1和Th2应答在正常状态时，Th2细胞保护人体不受灰尘和其它不期望的物质的侵害。然而，如果Th2细胞过度应答，增加IgE抗体的产生，从而导致对人体无害的蛋白质的过敏反应，该蛋白质如花粉和食物。因此，应该平衡Th1和Th2应答的比例。这两者中任何一个的过度或不充分应答都会导致疾病。此外，由于持续性压力导致皮质醇的持续性分泌减少Th1应答并增加Th2应答，从而引发癌症、特应性疾病、过敏症和自身免疫性疾病(Elenkov和Chrousos，Stresshormones，Th1/Th2 patterns，pro/anti-inflammatory cytokines and susceptibilityto disease，Trends in Endocrinology and Metabolism，Volume 10，November1999，pages 359-368)。
根据体内实验，乳酸菌增加了IL-2和IFN-γ的产生，它们是T淋巴细胞中的Th1细胞因子，并且乳酸菌抑制了IL-4和IL-5的产生，它们是Th2细胞因子(Matsuzaki等，The effect of oral feeding of Lactobacillus casei strainShirota on immunoglobulin E production in mice，Journal of Dairy Science，Volume 81，January 1998，pages 48-53)。同时，IL-12和IL-18是在巨噬细胞或树突状细胞中产生的重要的细胞因子，其将Th0淋巴细胞分化为Th1淋巴细胞。已知当在培养过程中用乳酸菌处理脾细胞或巨噬细胞时，增加IL-12、IL-18和IFN-α的产生取决于乳酸菌的浓度。因此，乳酸菌增加了巨噬细胞中IL-12、IL-18和IFN-α的产生，从而促进Th0向Th1的分化并诱导形成IFN-γ，因此乳酸菌在Th2应答萌芽阶段对平衡Th1/Th2起重要作用(Cross等，Anti-allergy properties of fermented foods：an importantimmunoregulatory mechanism of lactic acid bacteria？，InternationalImmunopharmacology，Volume 1，May 2001，pages 891-901)。因此，已知乳酸菌预防和治疗由Th2的过度应答导致Th1/Th2失衡而诱发的癌症、特应性疾病、过敏症和自身免疫性疾病。
发明内容
技术问题
当寻找比常规乳酸菌具有更好免疫增强活性的新型乳酸菌时，本发明的发明人分离并确定了从韩国传统发酵食品中分离出的乳酸杆菌细菌。
因此，本发明提供了乳酸杆菌菌株，其具有良好的增强免疫应答作用，特别地，具有促进IFN-γ，Th1型细胞因子产生、诱发一般免疫细胞的增殖和对抗由Th2过度应答导致的Th1/Th2失衡的良好活性，并且具有良好的构成益生菌的基本性质的耐酸性、胆汁耐受性和对肠上皮细胞的强附着力。
本发明还提供了包含乳酸杆菌菌株的组合物以预防或治疗肠道紊乱病。
本发明还提供了包含乳酸杆菌菌株的组合物以增强免疫应答。
技术方案
根据本发明的一个方面，提供了植物乳杆菌CJLP243(保藏在韩国微生物保藏中心(KCCM)，保藏日期：2009年10月14日，保藏号：KCCM11045P)。
根据本发明的一个方面，提供了包含植物乳杆菌CJLP243的组合物以预防或治疗肠道疾病。
根据本发明的一个方面，提供了包含植物乳杆菌CJLP243的组合物以增强免疫应答。
在下文中，将参考以下附图对本发明进行更全面地描述，其中示出了本发明的示范实施方案。
根据本发明的一个方面，植物乳杆菌CJLP243是从韩国传统发酵食品中分离并确定的新型植物乳杆菌菌株。韩国传统发酵食品可以是泡菜、发酵蔬菜、豆酱、酱油、清国酱(chungkookjang)、发酵鱼等等，但不限于此。
确定并分类植物乳杆菌的16S rRNA碱基序列测试结果显示，植物乳杆菌CJLP243与植物乳杆菌标准菌株(植物乳杆菌NBRC15891T，GenBank登录号AB326351)具有最高同源性(99.9％)，并显示其与植物乳杆菌有最近分子系统学亲缘关系。因此，所述微生物确定为植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌CJLP243，并且于2009年10月14日保藏于韩国微生物保藏中心(KCCM)(保藏号：KCCM11045P)。植物乳杆菌CJLP243的16S rRNA基因的碱基序列在以下所附序列表中的SEQ ID NO：1上示出。
植物乳杆菌CJLP243是革兰氏阳性细菌和兼性厌氧菌，其可以在有氧和厌氧条件下生长，不产生孢子，不具有游动性，而且具有杆状形状。根据本领域已知的常规方法，已经分析了植物乳杆菌CJLP243的具体形态学和生理学性质，在下表1中示出。
表1
[表1]
  形态学、生理学和生物化学性质   结果
  形态学   杆
  游动   -
  孢子   -
  过氧化氢酶   -
  同型-异型发酵   兼性异型发酵
  在10℃下增殖   +
  在42℃下增殖   +
  在7％NaCl下增殖   +
  在10％NaCl下增殖   -
  在pH 3.8下增殖   +
  在厌氧条件下增殖   +
  使用葡萄糖产生CO2   -
  糖发酵
  甘油   -
  赤藓醇   -
  D-阿拉伯糖   -
  L-阿拉伯糖   +
  核糖   +
  D-木糖   -
  L-木糖   -
  阿东醇   -
  木糖苷   -
  半乳糖   +
  D-葡萄糖   +
  D-果糖   +
  D-甘露糖   +
  L-山梨糖   -
  鼠李糖   +
  卫矛醇   -
  肌醇   -
  甘露糖醇   +
  山梨糖醇   +
  D-甘露糖苷   +
  D-葡糖苷   +
  葡糖胺   +
  苦杏仁苷   +
  熊果苷   +
  七叶苷   +
  水杨苷   +
  纤维二糖   +
  麦芽糖   +
  乳糖   +
  蜜二糖   +
  蔗糖   +
  海藻糖   +
  菊粉   +
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+：阳性
-：阴性
为了长时间稳定地保存植物乳杆菌CJLP243，可以通过将菌株分散在混合水和甘油的保存溶液中，并在-70℃下储存分散体，或通过将菌株悬浮在无菌的10％脱脂乳中并冷冻干燥悬浮液以保存菌株。
此外，植物乳杆菌CJLP243是有缓解肠道紊乱并增强免疫应答效果的益生菌，其效果为乳酸菌的一般效果。
在这点上，益生菌是通过改善肠道环境而对宿主的胃肠道有益的有活力的微生物，该宿主如动物，包括人类。益生菌，在单个或复合菌株中具有益生菌活性的活体微生物，当其以干燥或发酵形式向人类或动物施用时，益生菌对肠道菌群有益。益生菌微生物应当不受胃液和胆汁影响，而且需要在经过胃之后在肠道中保持活力，栖息于肠道中，并对宿主的肠道菌群有益。因此，益生菌微生物需要具有良好的耐酸性和胆汁耐受性，以及对肠上皮细胞强的附着力。此外，益生菌微生物需要具有稳定性。在这点上，进行明胶液化试验、苯丙氨酸脱氨酶试验、氨形成试验、溶血试验等等。根据本发明的实施方案，植物乳杆菌CJLP243在明胶液化试验、苯丙氨酸脱氨酶试验和氨形成试验中为阴性，并显示出标示植物乳杆菌CJLP243不是病原体(参见实施例4)的α溶血，具有良好的耐酸性和胆汁耐受性，并显示出对肠上皮细胞的强附着力(参见实施例2和3)。
植物乳杆菌CJLP243由于良好的耐酸性和胆汁耐受性可能对缓解肠道紊乱非常有效，并显示出对肠上皮细胞的强附着力。
因此，本发明的另一个方面提供了包含植物乳杆菌CJLP243的组合物以预防或治疗肠道疾病。
包含植物乳杆菌CJLP243的用于治疗肠道疾病的组合物可以应用于预防或治疗哺乳动物的肠道疾病，该哺乳动物包括人类，例如牲畜，包括牛、马和猪。这种肠道疾病包括但不限于对肠道环境有害的细菌引起的肠道感染和炎症性肠病，例如由病源微生物(大肠杆菌、沙门氏菌和梭状芽胞杆菌)引发的感染性腹泻、胃肠炎、炎症性肠病、神经性肠炎综合征(psychogenicenteritis syndrome)、小肠中微生物生长过度、腹泻等等。组合物中含有的治疗肠道疾病的植物乳杆菌CJLP243可以是活或死细菌，优选的是活细菌。一般地，活细菌治疗或缓解由肠道菌群中异常发酵引发的一般症状，这些活细菌栖息于肠道中以防止人体和动物体内的有害细菌附着于肠道上，并产生乳酸以降低肠道pH，从而抑制有害细菌的增殖。此外，施用的活细菌产生具有细菌素的过氧化物以抑制有害细菌的增殖，并促进肠绒毛活性以吸收营养素。此外，活细菌可以产生辅助吸收和应用营养素的物质，改善牲畜饲料的需求，并产生中和由病原体产生的有毒物质的物质。
预防或治疗肠道疾病的组合物可以口服，但施用该组合物的方法并不限于此。施用的剂量可以根据患者肠道疾病的类型、严重程度、年龄、性别和种族类型，以及治疗或预防的目的而改变。一般地，可以向成年人施用一千万到一千亿个细菌。
此外，与常规乳酸菌相比，植物乳杆菌CJLP243具有增强免疫应答以及缓解肠道紊乱的良好效果。发现植物乳杆菌CJLP243促进IFN-γ、Th-1型细胞因子的产生，从而诱发Th-1型免疫的增强。现在将更详细的描述植物乳杆菌CJLP243的增强免疫应答作用。
当使用植物乳杆菌CJLP243处理从小鼠脾脏中分离的免疫细胞时，它们活化了诱发Th2应答的一般免疫细胞的生长(实施例5)，并增加了IFN-γ、Th1型细胞因子的产生(实施例6)。发现免疫细胞生长的活性和Th1型免疫反应的增强作用明显优于其他常规乳酸菌，如鼠李糖乳杆菌GG(KCTC5033)。此外，当向小鼠口服施用植物乳杆菌CJLP2438周时，显示出IFN-γ和IL-2，Th-1型细胞因子的产生增加，而且T细胞、CD4T细胞和CD8T细胞的生长全部增加。因此，可以说植物乳杆菌CJLP243产生相当大量的IFN-γ以促进Th1型应答，从而不仅增强了一般免疫，还调节了Th1/Th2的免疫失衡。
已知一般免疫细胞，特别是T细胞包括CD4T细胞和CD-8T细胞的增加增强了免疫，从而对预防或治疗消化道(肠道)感染、泌尿生殖道感染、呼吸道感染、螺杆菌感染或过敏反应有效(消化道(肠道)感染；Jain S、Yadav H、Sinha PR.Probiotic dahi containing Lactobacillus casei protectsagainst Salmonella enteritidis infection and modulates immune response in mice.J Med Food.2009 Jun；12(3)：576-83.，泌尿生殖道感染；Zarate G，Santos V，Nader-Macias ME.Protective effect of vaginal Lactobacillus paracasei CRL1289 against urogenital infection produced by Staphylococcus aureus in a mouseanimal model.Infect Dis Obstet Gynecol.2009；2009：48358.Epub 2007 Mar 29.，呼吸道感染；Yasuda Y，Matsumura Y，Kasahara K，Ouji N，Sugiura S，MikasaK，Kita E.Microbial exposure early in life regulates airway inflammation in miceafter infection with Streptococcus pneumoniae with enhancement of localresistance.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol.2009 Sep 25.[Epub ahead ofprint]；或螺杆菌感染(Boyanova L，Stephanova-Kondratenko M，Mitov I.Anti-Helicobacter pylori activity of Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricusstrains：preliminary report.Lett Appl Microbiol.2009 May；48(5)：579-84.Epub2009 Mar 9.)和过敏反应(Ouwehand AC，Nermes M，Collado MC，RautonenN，Salminen S，Isolauri E.Specific probiotics alleviate allergic rhinitis during thebirch pollen season.World J Gastroenterol.2009 Jul 14；15(26)：3261-8)。因此，实验结果显示，由于由T细胞生长的活化增强了一般免疫，植物乳杆菌CJLP243对预防或治疗消化道(肠道)感染，泌尿生殖道感染、呼吸道感染、螺杆菌感染或过敏反应有效。
近来，已经报道了在罹患特应性皮炎的患者体内，Th2细胞在外周血和皮肤病灶中相对增加(Miraglia等，Immune dysregulation in atopic dermatitis，Allergy and Asthma Proceedings，Volume 27，November-December 2006，pages451-455)。因此，由Th2的过度应答引发的Th1/Th2失衡诱发如特应性皮炎之类的疾病。此外，如上所述，Th1或Th2的过度应答或不充分应答导致疾病爆发。如果Th1应答减少而Th2应答增加，已知会引发癌症、特应性疾病、过敏症和自身免疫性疾病(Elenkov和Chrousos，Stress hormones，Th1/Th2 patterns，pro/anti-inflammatory cytokines and susceptibility to disease，Trends in Endocrinology and Metabolism，Volume 10，November 1999，pages359-368)。因此，因为植物乳杆菌CJLP243通过促进Th1型反应控制Th1/Th2失衡，预计植物乳杆菌CJLP243不仅可以应用于特应性疾病和过敏症，还可以应用于癌症和自身免疫性疾病。
本发明的另一个方面提供了一种用于增强免疫应答的包含植物乳杆菌CJLP243的组合物。因为植物乳杆菌CJLP243是如上所述对加强免疫应答有效的乳酸菌，增强免疫应答的组合物对加强免疫应答有效。特别地，如下述实施例中所证明的，植物乳杆菌CJLP243对活化一般免疫细胞的生长有效，因此增强免疫应答的组合物对预防或治疗消化道(肠道)感染、泌尿生殖道感染、呼吸道感染、螺杆菌感染和过敏反应有效。另外，因为CJLP243对促进Th1应答有效，增强免疫应答的组合物对预防或治疗由Th1/Th2失衡引发的疾病有效。因此，增强免疫应答的组合物可以有效地用于预防或治疗特应性疾病、过敏症、癌症和自身免疫疾病。自身免疫性疾病包括哮喘、花粉热，诸如此类。
增强免疫应答的组合物可以口服，但施用组合物的方法并不限于此。剂量可能根据患者的疾病类型、需要增强的免疫、严重程度、年龄、性别和种族而改变，并且其目的为治疗或预防。一般地，可以向成年人施用一千万到一千亿个细菌。
包含植物乳杆菌CJLP243以预防或治疗肠道疾病的组合物和包含植物乳杆菌CJLP243以增强免疫应答的组合物使用已经证明安全的乳酸菌，因此可以将这些组合物应用于药物、功能性食物、化妆品、牲畜饲料或牲畜饲料添加剂，而不必担心副作用。
如果将组合物作为药物使用，组合物可以配制成药物剂型，此方法在本领域中普遍使用。药物可以是用于口服的剂型，如液体、悬浊液、粉末、颗粒、片剂、胶囊、丸剂或提取物。
当配制组合物时，可以将药学上可接受的兼容赋形剂或添加剂加入到剂型中。口服剂型可以包括至少一个赋形剂，该赋形剂选自由稀释剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂、甜味剂、稳定剂和防腐剂组成的组中，并且至少一个添加剂，该添加剂选自由增香剂、维生素和抗氧化剂组成的组中。
赋形剂和添加剂可以是药学上可接受的材料。特别地，稀释剂可以是乳酸、玉米淀粉、豆油、微晶纤维素或甘露糖醇，润滑剂可以是硬脂酸镁或滑石，而且粘合剂可以是聚乙烯基吡咯烷酮或羟丙基纤维素。此外，崩解剂可以是羧甲基纤维素钙、羧甲基淀粉钠、聚克利林钾或交联聚维酮，甜味剂可以是白糖、果糖、山梨糖醇或阿斯巴甜，稳定剂可以是羧甲基纤维素钠、β-环糊精、白蜡或黄原胶，而且防腐剂可以是对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸钾。
除了以上物质之外，可以将天然香料如梅子香精、柠檬香精、凤梨香精或香草香精、天然果汁、天然色素如叶绿酸或黄酮，甜味剂如果糖、蜂蜜、糖醇或糖，或酸化剂如柠檬酸或柠檬酸钠，或其组合物添加到制剂中以改善口味。
这种制剂方法和用于制剂的赋形剂和添加剂在雷氏药学大全中详述(第19版，1995)。
组合物可以用作食品。这种食品可以包括但不只是功能性食品，还包括日常食品。用作功能性食品的组合物可以用食品学上可接受的赋形剂或添加剂配制成在本领域普遍使用的多种制剂。功能性食品可以是粉末、颗粒、片剂、胶囊、悬浊液、乳浊液、糖浆、液体、提取物、茶、凝胶、饮料或诸如此类。可以使用本领域普遍使用的任何食品学上可接受的赋形剂或添加剂。
由于组合物具有预防或治疗特应性疾病的作用，其可以用于化妆品中。用于化妆品中的组合物可以配制成在本领域中普遍使用的多种制剂。在制剂的制备过程中，可以向其中添加化妆品上可接受的赋形剂或添加剂。
组合物可以用作牲畜饲料或牲畜饲料添加剂。
如果组合物用作牲畜饲料添加剂，该组合物可以是20％至90％高浓度液体，或可以制备成粉末或颗粒。牲畜饲料添加剂可以包括至少一个选自由有机酸如柠檬酸、富马酸、己二酸、乳酸或苹果酸；磷酸盐如磷酸钠、磷酸钾、酸性焦磷酸盐或聚磷酸盐(聚合磷酸盐)；和天然抗氧化剂如多酚、儿茶素、α-生育酚、迷迭香提取物、维生素C、绿茶提取物、甘草提取物、壳聚糖、单宁酸或植酸组成的组中。用作牲畜饲料的该组合物可以用牲畜饲料中普遍使用的成分配制成在本领域中普遍使用的多种制剂。
牲畜饲料添加剂和牲畜饲料可以包括谷类，如粉末状或磨成粉末的小麦、燕麦、大麦、玉米或大米；植物蛋白牲畜饲料，其含有油菜、豆子或向日葵作为主要成分；动物蛋白牲畜饲料如血粉、肉粉、骨粉或鱼粉；糖；和乳制品如奶粉和乳清粉。牲畜饲料添加剂和牲畜饲料还可以包括营养补充剂、消化和吸收辅助剂、生长促进物质，或诸如此类。
牲畜饲料添加剂可以单独向动物施用，或可以与另一种牲畜饲料添加剂组合成可食用的赋形剂来施用。此外，牲畜饲料添加剂可以作为对牲畜饲料的追肥或与牲畜饲料相混合的混合物来施用。可替代地，牲畜饲料添加剂可以从牲畜饲料中分离作为单独剂型口服施用。如果牲畜饲料添加剂从牲畜饲料中分离而单独施用，其与药学上可接受的可食用赋形剂合并以制备即释或持续释放的剂型。可食用的负载体可以是固体或液体，如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、豆片、花生油、橄榄油、芝麻油或丙二醇。如果使用固体赋形剂，牲畜饲料添加剂可以是片剂、胶囊、粉末、含片或锭剂，或不分散的追肥的形式。如果使用液体赋形剂，牲畜饲料添加剂可以是明胶软胶囊、糖浆悬浊液、乳浊液或溶液的形式。
牲畜饲料可以包括有机谷物粉，其含有普遍使用以满足动物饮食需求的蛋白质。含有蛋白质的谷物粉可以包括玉米、豆粉或玉米/豆粉混合物。
此外，牲畜饲料添加剂和牲畜饲料可以包括添加剂，如防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂和增溶剂。牲畜饲料添加剂可以通过渗透、喷洒和混合加入牲畜饲料中。
牲畜饲料或牲畜饲料添加剂可以应用于多种动物，如哺乳动物、家禽和鱼类的牲畜饲料。所述哺乳动物包括猪、牛、绵羊、山羊、实验用啮齿动物和宠物(例如狗和猫)。所述家禽包括鸡、火鸡、鸭、鹅、雉鸡和鹌鹑，所述鱼类包括鳟鱼。然而，牲畜并不限于此。
技术效果
如上所述，根据本发明的植物乳杆菌CJLP243是具有良好耐酸性、胆汁耐受性和对肠上皮细胞强附着力的益生菌，因此对缓解肠道紊乱有效。另外，由于其促进包括T细胞的一般免疫细胞的生长所产生的免疫增强作用，植物乳杆菌CJLP243对预防或治疗多种疾病有效。特别地，植物乳杆菌CJLP243促进Th1应答，因此其对治疗由于Th2的过度应答引发的Th1/Th2失衡而导致的疾病有效。因此，根据本发明的植物乳杆菌CJLP243可以应用于治疗肠道疾病的组合物，也可以应用于增强免疫应答的组合物。
附图说明
本发明的以上和其它特征和优势将通过参考以下附图详细描述其示范实施方案而愈加明显：
图1是阐明植物乳杆菌CJLP243的耐酸性的图表；
图2是阐明植物乳杆菌CJLP243的胆汁耐受性的图表；
图3是阐明植物乳杆菌CJLP243对肠上皮细胞的附着能力的图表。
图4是阐明MTT试验结果的图表，该试验在来自脾脏的免疫细胞中进行，所述脾脏从小鼠中分离，并在体外培养，然后用植物乳杆菌CJLP243处理，与主要促细胞分裂剂处理组、β-葡聚糖处理组和鼠李糖乳杆菌GG处理组比较。
图5是阐明IFN-γ试验结果的图表，该试验在来自脾脏的免疫细胞上进行，所述脾脏从小鼠中分离，并在体外培养，然后用植物乳杆菌CJLP243处理，与主要促细胞分裂剂处理组、β-葡聚糖处理组和鼠李糖乳杆菌GG处理组比较。
图6是阐明在处死口服施用植物乳杆菌CJLP243的小鼠之前测量的体重的图表，与阴性对照组和鼠李糖乳杆菌GG施用组比较。
图7是阐明通过测量T细胞群体变化以确定植物乳杆菌CJLP243菌株对脾脏中的免疫细胞的作用而获得的结果的图表，该脾细胞从处死的口服施用植物乳杆菌CJLP243菌株的小鼠的脾脏中获得，与阴性对照组和鼠李糖乳杆菌GG施用组比较。
图8是阐明通过测量CD4T细胞群体变化以确定植物乳杆菌CJLP243菌株对脾脏中的免疫细胞的作用而获得的结果的图表，该脾细胞从处死的口服施用植物乳杆菌CJLP243菌株的小鼠的脾脏中获得，与阴性对照组和鼠李糖乳杆菌GG施用组比较。
图9是阐明通过测量CD8T细胞群体变化以确定植物乳杆菌CJLP243菌株对脾脏中的免疫细胞的作用而获得的结果的图表，该脾细胞从处死的口服施用植物乳杆菌CJLP243菌株的小鼠的脾脏中获得，与阴性对照组和鼠李糖乳杆菌GG施用组比较。
图10是阐明通过使用酶联免疫吸附法(ELISA)测量由取自脾细胞的T细胞产生的IL-2的数量而获得的结果的图表，该脾细胞从处死的口服施用植物乳杆菌CJLP243菌株的小鼠的脾脏中获得，然后在体外受伴刀豆球蛋白A刺激以确定植物乳杆菌CJLP243在T细胞活化中的作用，与阴性对照组和鼠李糖乳杆菌GG施用组比较。
图11是阐明通过使用酶联免疫吸附法测量由取自脾细胞的T细胞产生的IFN-γ的数量而获得的结果的图表，该脾细胞从处死的口服施用植物乳杆菌CJLP243菌株的小鼠的脾脏中获得，然后在体外受伴刀豆球蛋白A刺激以确定植物乳杆菌CJLP243在T细胞活化中的作用，与阴性对照组和鼠李糖乳杆菌GG施用组比较。
具体实施方式
在下文中，将参考以下实施例对本发明进行详细描述。然而，这些实施例并不只在限制本发明的目的和范围。
实施例1：植物乳杆菌CJLP243菌株的分离和鉴定
从泡菜中分离的植物乳杆菌CJLP243菌株涂到含有1.5％琼脂的固体MRS培养基上(Difco，美国)，并在37℃下培养24小时。使用环状圈(loop)收集已证明纯的菌落，37℃下在液体MRS培养基(Difco，美国)中培养18至24小时。
然后，使用Kim等报道的方法(Kim等，Leuconostoc inhae sp.nov.，a lacticacid bacterium isolated from kimchi，International Journal of Systematic andEvolutional Microbiology，Volume53，July 2003，pages 1123-1126)并使用API50CH和API50CHL试剂盒鉴定植物乳杆菌CJLP243菌株的形态学和生理性质。鉴定的植物乳杆菌CJLP243的形态学和生理性质在上表1中列出。
此外，分析16S rRNA基因的碱基序列以鉴定并给乳酸菌分类。使用Kim等报道的方法(Kim等，Leuconostoc kimchii sp.nov.，a new species fromkimchi.International Journal of Systematic and Evolutional Microbiology，Volume 50，September 2000，pages 1915-1919)进行16S rRNA基因的碱基序列的测定和试验。结果，16S rRNA基因的碱基序列在所附序列表中的SEQ IDNO：1中显示。
由16S rRNA碱基序列试验的结果确定，植物乳杆菌CJLP243菌株相对于植物乳杆菌标准菌株(植物乳杆菌NBRC15891T，GenBank登录号AB326351)具有最高同源性(99.9％)，其被鉴定并命名为植物乳杆菌CJLP243，并于2009年10月14日保藏在韩国微生物保藏中心(KCCM)(保藏号：KCCM11045P)。
实施例2：植物乳杆菌CJLP243菌株在人工胃液中的耐酸性测试和人 工胆汁中的胆汁耐受性测试
使用Kobayashi等报道的改良法(Kobayashi等，Studies on biologicalcharacteristics of Lactobacillus：II.Tolerance of the multiple antibiotic resistancestrain，L.casei PSR3002，to artificial digestive fluids.Japan Journal ofMicrobiology.Volume 29，July 1974，pages 691-697)制备的人工胃液进行人工胃液中的耐酸性测试。特别地，通过使用1N HCl将液体MRS培养基中的pH值调整到2.5，加入1000单位/mL浓度的胃蛋白酶并对培养基灭菌处理来制备人工胃液。
将在实施例1中分离和鉴定并在37℃下在液体MRS培养基中培养18小时的植物乳杆菌CJLP243菌株离心以沉淀菌株，并用无菌生理盐水(0.85％NaCl)清洗两次。然后，将该菌株的悬浮液接种到对照培养基上，使人工胃液达到大约107cfu/mL的浓度。在37℃下培养，在接种开始时和接种3小时后测量存活的菌株数量，其中通过用含有KH2PO4、Na2HPO、L-半胱氨酸、HCl、吐温80等的磷酸缓冲液(pH 6.8)将菌株稀释10倍以测量菌株的总数量。
根据Casey等报道的方法(Casey等，Isolation and characterization ofanti-Salmonella lactic acid bacteria from the porcine gastrointestinal tract，Lettersin Applied Microbiology.Volume 39，2004，pages 431-438)进行人工胆汁的胆汁耐受性测试。在培养基中接种植物乳杆菌CJLP243，该培养基通过向上述耐酸性测试使用的液体MRS培养基中加入0.3％公牛胆汁来制备。以上述耐酸性测试相同的方式接种菌株，并在接种开始时和接种后12小时以及24小时测量存活菌株的数量。
以植物乳杆菌CJLP243测试相同的方式进行鼠李糖乳杆菌GG(KCTC5033)的耐酸性测试和胆汁耐受性测试以作比较。
结果在图1和图2中示出。图1是阐明植物乳杆菌CJLP243的耐酸性的图表。图2是阐明植物乳杆菌CJLP243的胆汁耐受性的图表。
根据图1和图2，与其他乳酸菌相比，植物乳杆菌CJLP243具有相等或更高的耐酸性和胆汁耐受性。这表明了根据本发明的植物乳杆菌CJLP243可以不受胃液影响达到肠道，并不受胆汁影响栖息于肠道。
实施例3：植物乳杆菌CJLP243菌株对肠上皮细胞的附着力
从韩国细胞系库(KCLB)中获得HT-29作为动物细胞以测试肠上皮细胞的附着力，使用Kim等(Kim等，Probiotic properties of Lactobacillus andBifidobacterium strains isolated from porcine gastrointestinal tract，AppliedMicrobiology and Biotechnology，Volume 74，April 2007，pages 1103-1111)和Hirano等(Hirano等，The effect of Lactobacillus rhamnosus onenterohemorrhagic Escherichia coli infection of human intestinal cells in vitro，Microbiology and Immunology，Volume 47，2003，pages 405-109)报道的方法进行该测试。
在RPMI 1640(Gibco，美国)培养基中培养HT-29细胞，该培养基在37℃下在存在5％CO2下含有热灭活10％胎牛血清(FBS)、1％L-谷酰胺、青霉素G(100IU/mL)和链霉素(100mg/mL)。为了测量附着力和附着抑制力，将HT-29细胞分散到24孔平板中，使得每孔的HT-29细胞数量为1.0x105细胞/mL。培养HT-29细胞，同时每隔一天更换培养基直到完全形成单层。在25℃下用PBS缓冲液将完全形成的HT-29细胞单层清洗5次，并将没有抗生素的0.5mL的RPMI 1640培养基加入其中。
在RPMI培养基中悬浮植物乳杆菌CJLP243达到大约1.0x109cfu/mL的浓度，将该悬浮液接种到上述制备的24孔平板中并在37℃下在5％CO2存在下培养2小时。当培养完成时，用PBS缓冲液将24孔平板清洗3次，同时以200rpm搅拌3分钟以去除未附着在孔板上的菌株，并确定经过清洗仍能附着细胞的菌株。清洗后，将0.2％胰蛋白酶-EDTA加入到孔中以分离附着细胞。通过连续稀释法的方式在蛋白胨水中稀释分离的细胞，并涂在MRS-琼脂板上，然后在37℃下培养24小时。培养后，统计菌株的数量。
单独地，为了确定部分附着力，将盖玻片浸入到70％的酒精中一天直到完全无菌后，将其贴在培养皿底部并培养HT-29细胞，将上述使用的相同数量的乳酸菌加入其中，然后以上述相同的方式进行培养和清洗。干燥没有清洗掉并附着在HT-29细胞上的乳酸菌并使用革兰氏染色进行染色。使用光学显微镜观察染色的细菌，并测量菌株的数量。使用鼠李糖乳杆菌GG(KCTC5033)进行相同的实验。
结果在图3中示出。图3是阐明植物乳杆菌CJLP243对肠上皮细胞的附着力的图表。
参考图3，与商用上众所周知的作为益生菌的鼠李糖乳杆菌GG(KCTC5033)相比，24小时后，植物乳杆菌CJLP243具有对肠上皮细胞更强的附着力。根据这些结果，可以看出根据本发明的一个方面，植物乳杆菌CJLP243能够附着于肠上皮细胞，从而改善肠道环境。
实施例4：植物乳杆菌CJLP243菌株的安全性测试
为了评估实施例1中分离的菌株的安全性，根据韩国生物风险投资协会(KBVA)团体标准所提出的安全测试方法进行溶血试验、明胶液化试验、有害的代谢产物(氨)形成试验和苯丙氨酸脱氨酶试验。
结果在下表2中示出。
表2
[表2]
植物乳杆菌CJLP243的安全性
根据结果，植物乳杆菌CJLP243在明胶液化试验、有害的代谢产物(氨)形成试验以及苯丙氨酸脱氨酶试验中是阴性的，并显示出α-溶血，估计其与病原体不相关。因此，证明植物乳杆菌CJLP243可以安全地对人体施用。
实施例5：通过体外实验的小鼠免疫细胞的生长
为了确定植物乳杆菌CJLP243的免疫增强能力，通过MTT试验确定小鼠免疫细胞的生长。根据MTT试验试剂盒(promega，分类号G5430)的制造商指南进行以下MTT试验。首先，在含有10％胎牛血清的RPMI 1640培养基上稀释通过从B6小鼠的脾细胞中除去血细胞而获得免疫细胞。之后，以1x106细胞/每孔的数量将免疫细胞播种到96孔平板中(总容量200μl)。完成免疫细胞播种后，将活植物乳杆菌CJLP 243(5x106细胞)加入到每个孔中并在37℃下在5％CO2培养箱中培养3天。3天后，在MTT试验前1小时去除100μl的培养基以准备进行MTT试验。然后，将20μl的MTT溶液(2mg/mL)分散到每个孔中，然后在37℃下培养1小时。之后，使用酶标仪(分子器件，美国)在490nm处测量吸光度。重复此流程至少3次。在这一流程中，阳性对照组使用作为主要促细胞分裂剂的伴刀豆球蛋白A(伴刀豆球蛋白A；西格玛分类号L6397)、植物血凝素(PHA；西格玛分类号L8902)或脂多糖(LPS；西格玛分类号L4516)，每个浓度为10μg/mL。另外，从西格玛化工(分类号G5011，美国)购买99％的纯β-葡聚糖并以最终浓度1.25μg/mL使用以对比免疫增强能力。结果在图4中示出。
图4是阐明MTT试验的结果的图表，该试验在来自脾脏的免疫细胞上进行，该脾脏从小鼠中分离，并在体外培养，然后用植物乳杆菌CJLP243处理。
参考图4，可以说与主要促细胞分裂剂、β-葡聚糖和鼠李糖乳杆菌(KCTC5033)相比，植物乳杆菌CJLP243具有优越的活化脾细胞生长的能力，并因此确认能够诱发增强的免疫。
实施例6：使用细胞因子试验产生IFN-γ的能力
为了确定植物乳杆菌CJLP243对外来抗原的免疫增强能力，使用酶联免疫吸附法测量IFN-γ，Th1型细胞因子的产生能力。首先，将通过除去B6小鼠脾细胞中血细胞而获得的免疫细胞在含有10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中稀释。之后，以1x106细胞/每孔的数量将免疫细胞播种到96孔平板中(总容量200μl)。在完成免疫细胞播种后，将活植物乳杆菌CJLP 243(5x105细胞)加入到每个孔中并在37℃下在5％CO2培养箱中培养3天。3天后，去除50μl的培养基，并使用酶联免疫吸附法测量其中含有的IFN-γ的量。为了进行酶联免疫吸附法，在室温下用IFN-γ抗体涂覆ELISA平板4小时，然后向其中加入50μl培养基并在室温下培养。之后，从ELISA平板中除去培养基，然后在室温下用生物素化的IFN-γ抗体(BD生物科学，分类号554410)，即第二抗体，将其涂覆2小时。通过链霉亲和素共轭的辣根过氧化酶(vectore，分类号SA-5004)及其基质TMB(3，3′，5，5′-四甲基联苯胺，KPL，分类号50-76-03)诱发显色反应。在进行显色反应后，将100μg/mL的停止液(3M HCl)加入到平板中以停止显色反应。在这时，显色反应显示从蓝色到黄色的颜色变化，并在显色反应停止后使用酶标仪(分子器件，美国)在450nm处测量吸光度。重复此流程至少3次。在这些流程中，阳性对照组使用作为主要促细胞分裂剂的伴刀豆球蛋白A(伴刀豆球蛋白A；西格玛分类号L6397)、植物血凝素(PHA；西格玛分类号L8902)或脂多糖(LPS，西格玛分类号L4516)，每个浓度为10μg/mL。此外，从西格玛化工(分类号G5011，美国)购买99％的纯β-葡聚糖并以最终1.25mg量中使用以对比免疫增强能力。结果在图5中示出。
图5是阐明IFN-γ试验结果的图表，该试验在来自脾脏的免疫细胞上进行，该脾脏从小鼠中分离，并在体外培养，然后用植物乳杆菌CJLP243处理。
参见图5，可以说在产生IFN-γ这方面，植物乳杆菌CJLP243比作为阳性对照组的主要促细胞分裂剂能力较弱，但比鼠李糖乳杆菌GG(KCTC5033)能力明显优越，因此其确认能够诱发增强的Th1型免疫。
实施例7：当口服施用时植物乳杆菌CJLP243菌株的增强免疫
如下进行了当口服施用时确定植物乳杆菌CJLP243菌株的增强免疫的测试。
购买4周大的雌性Balb/c小鼠并在动物培育室中保持稳定状态1周，该培育室在SPF条件下，保持温度为24±2℃，湿度为55±15％。用加入某些抗生素的一般粉末状牲畜饲料喂食小鼠并任其自由喝水。将每种鼠李糖乳杆菌GG和植物乳杆菌CJLP 243加工成冻干粉末的形式，使其冷冻。统一将乳酸菌与粉末状牲畜饲料混合，并以2.5x1010CFU/每天/每只小鼠的剂量向小鼠口服施用。在施用过程中持续8周测量每只小鼠的重量，然后在以下的实验中处死所有小鼠。
从每只处死的小鼠中去除脾脏，并测量其长度和重量。施用注射剂的活塞压碎脾脏并用筛网过滤以分离细胞，在ACK缓冲液中进行这些程序。使用显微镜对分离的细胞计数。
为了确定在分离的脾细胞中免疫细胞的成分变化，用抗Thy1.2-FITC抗体对分离的细胞中的T细胞染色，并用抗CD19-FITC抗体对B细胞染色。用抗Thy1.2-FITC抗体和抗CD4-PE抗体对CD T细胞染色，并用抗Thy1.2-FITC抗体和抗CD8-PE抗体对CD8细胞染色。使用流式细胞仪(FACScan)(BD生物科学，美国)分析每个组织中染色的细胞的成分比例。
用浓度为5μg/mL的伴刀豆球蛋白A处理分离的脾细胞以刺激T淋巴细胞。24小时后，去除上清液并使用ELISA测量IFN-γ和IL-2，T淋巴细胞细胞因子的浓度。在4℃下用IFN-γ和IL-2捕捉抗体涂覆微板过夜，然后用含有0.05％吐温20的PBS(PBST)清洗并用含有3％胎牛血清的PBS封闭。1小时后，清洗微板并将上清液和标准溶液(由BD生命科学提供的标准溶液)加入到每个孔中并在4℃下反应过夜。然后，清洗微板并将生物素化的抗体加入到每个孔中，并在室温下进行反应45分钟。之后，清洗微板并将链霉亲和素-碱性磷酸酶加入到每个孔中，在室温下培养30分钟。清洗微板后，通过将对硝基苯磷酸盐(西格玛，美国)加入到每个孔中以进行显色反应。使用微孔板测定仪在405nm处测量吸光度，并使用标准曲线测量细胞因子的浓度。
结果在图6至11中显示。
图6是阐明在处死口服施用植物乳杆菌CJLP243菌株的小鼠之前测量的体重的图表，与阴性对照组和鼠李糖乳杆菌GG施用组比较。
参考图6，观察到植物乳杆菌CJLP243菌株施用组由于过度增强的免疫保持正常体重且没有任何异常，而且观察到脾脏的重量和细胞数量(数据未示出)没有异常。
图7是阐明通过测量T细胞群体变化以确定植物乳杆菌CJLP243菌株对脾脏中的免疫细胞的作用而获得的结果的图表，该脾脏从处死的口服施用植物乳杆菌CJLP243菌株的小鼠中分离，与阴性对照组和鼠李糖乳杆菌GG施用组比较。
图8是阐明通过测量CD4T细胞群体变化以确定植物乳杆菌CJLP243菌株对脾脏中的免疫细胞的作用而获得的结果的图表，该脾脏从处死的口服施用植物乳杆菌CJLP243菌株的小鼠中分离，与阴性对照组和鼠李糖乳杆菌GG施用组比较。
图9是阐明通过测量CD8T细胞群体变化以确定植物乳杆菌CJLP243菌株对脾脏中的免疫细胞的作用而获得的结果的图表，该脾脏从处死的口服施用植物乳杆菌CJLP243菌株的小鼠中分离，与阴性对照组和鼠李糖乳杆菌GG施用组比较。
参考图7、8和9，确定植物乳杆菌CJLP243菌株增加T细胞、CD4T细胞和CD8T细胞的数量，从而可以说植物乳杆菌CJLP243通过影响T细胞生长的活化来增强免疫。
另外，为了确定植物乳杆菌CJLP243在T细胞活化方面的作用，使用ELISA法测量由取自脾细胞的T细胞产生的IL-2和IFN-γ的数量，该脾细胞从处死的口服施用植物乳杆菌CJLP243菌株的小鼠的脾脏中分离，然后在体外用伴刀豆球蛋白A刺激。获得的结果在图10和11中示出。
图10是阐明通过使用ELISA法测量由取自脾细胞的T细胞产生的IL-2的数量而获得的结果的图表，该脾细胞从处死的口服施用植物乳杆菌CJLP243菌株的小鼠的脾脏中获得，然后在体外用伴刀豆球蛋白A刺激以确定植物乳杆菌CJLP243在T细胞活化的作用，与阴性对照组和鼠李糖乳杆菌GG施用组比较。
图11是阐明通过使用ELISA法测量由取自脾细胞的T细胞产生的IFN-γ的数量而获得的结果的图表，该脾细胞从处死的口服施用植物乳杆菌CJLP243菌株的小鼠的脾脏中获得，然后在体外用伴刀豆球蛋白A刺激以确定植物乳杆菌CJLP243在T细胞活化的作用，与阴性对照组和鼠李糖乳杆菌GG施用组比较。
参考图10和11，可以说与阴性对照组相比，确定植物乳杆菌CJLP243菌株增加了T细胞细胞因子的产生，由此植物乳杆菌CJLP243可以诱发T细胞的活化并增强一般免疫。
实施例8：包含植物乳杆菌CJLP243的益生菌粉末的制备
大量生产实施例1中确定的植物乳杆菌CJLP243并冻干以使得益生菌应用于药物、食品、牲畜饲料、牲畜饲料添加剂或化妆品的原料。
37℃下在液体MRS培养基(Difco)中培养细菌18小时，同时使用25％NaOH溶液将其pH值调整到6.0，并离心以获得菌株。-40℃下使用5％的糊精和10％脱脂乳作为冻干保护剂冻干收集的菌株，并在37℃下使用搅拌器将干燥的菌株磨碎以制备成粉末。粉末状的活细菌与赋形剂如葡萄糖、乳酸以及脱脂乳混合以将细菌的数量调节到理想水平并储存活细菌，而且将其在封闭的铝袋中包装。
根据这种方法制备的益生菌可以通过与谷物粉末混合用作牲畜饲料的原料，通过与赋形剂或添加剂混合以形成药物，如片剂和胶囊，或食品，以及通过与原料混合以形成化妆品，从而应用于药物、食品、牲畜饲料、化妆品或诸如此类。
当本发明已经参考其示范实施方案进行了特别地显示和描述，本领域技术人员将会理解的是，可能产生的对本发明形式和细节上的多种变化不会超出本发明的如以下权利要求所限定的宗旨和范围。
国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约
国际表
致：CJ第一制糖株式会社                        原保藏证明根据7.1规定发行
韩国首尔市中区南大门路5-街500                 国际保藏机构按本页如下证明
1适用于规定6.4(d)，此日期为获得国际保藏机构的资格之日；在获得国际保藏机构的资格之后超出布达佩斯条约的保藏将转移为布达佩斯条约下的保藏，此日期为该微生物被国际保藏机构受理之日。
表BP/4                                            单页
<110>    CJ 第一制糖株式会社
 
<120>    新型植物乳杆菌及其组合物
 
<130>    pn085815
 
<160>    1
 
<170>    KopatentIn 1.71
 
<210>    1
<211>    1461
<212>    DNA
<213>    植物乳杆菌
 
<400>    1
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gacagatgat tagggtgaag t                                                 1461

Claims (9)

1. 一种植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）CJLP243，其保藏号为KCCM 11045P。
2. 一种预防或治疗肠道疾病的组合物，所述组合物包含植物乳杆菌 CJLP243，其保藏号为KCCM 11045P。
3. 一种增强免疫应答的组合物，所述组合物包含植物乳杆菌CJLP243，其保藏号为KCCM 11045P。
4. 如权利要求3所述的组合物，其中所述组合物用于预防或治疗免疫疾病，所述免疫疾病选自由消化道感染、呼吸道感染、螺杆菌感染和过敏反应组成的组中。
5. 如权利要求3所述的组合物，其中所述组合物用于预防或治疗由Th2的过度应答引发的Th1/Th2失衡而导致的免疫疾病。
6. 如权利要求5所述的组合物，其中所述免疫疾病选自由过敏性疾病和自身免疫性疾病组成的组中。
7. 如权利要求2至6中任一项所述的组合物，其中所述组合物是药物。
8. 如权利要求2至6中任一项所述的组合物，其中所述组合物是功能性食品。
9. 如权利要求2至6中任一项所述的组合物，其中所述组合物是牲畜饲料或牲畜饲料添加剂。
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