ES2582828T3 - Lactobacillus plantarum novedoso y composición que lo comprende - Google Patents
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Abstract
El Lactobacillus plantarum CJLP243 depositado bajo el número KCCM 11045P.
Description
que se muestran realizaciones ilustrativas de la invención.
El Lactobacillus plaratarum CJLP243 de acuerdo con un aspecto de la presente invención es una cepa novedosa de Lactobacillus plantarum aislada e identificada a partir de alimentos fermentados tradicionales de Corea. La comida 5 fermentada tradicional coreana puede ser kimchi, hortalizas fermentadas, pasta de soja, salsa de soja, chungkookjang, pescado fermentado, o similares, pero no está limitada a los mismos.
Un resultado de un análisis de la secuencia de bases del ARNr 16S para identificar y clasificar Lactobacillus plantarum mostró que Lactobacillus plantarum CJLP243 tenía la homología más alta (99,9%) con una cepa estándar 10 de Lactobacillus plantarum (Lactobacillus plantarum NBRC15891T, Número de acceso GenBank AB326351) y mostró la relación filogenética molecular más estrecha con Lactobacillus plantarum. Por lo tanto, el susodicho microorganismo fue identificado como Lactobacillus plantarum, denominado Lactobacillus plantarum CJLP243, y depositado en el Centro Coreano de Cultivo de Microorganismos (KCCM) el (Núm. de Depósito: KCCM11045P) de 14 de Octubre de 2009. La secuencia de bases de un gene de ARNr 16S de Lactobacillus plantarum CJLP243 se
15 muestra en el SEC ID NO: 1 en la lista de secuencias adjunta.
El Lactobacillus plantarum CJLP243 es una bacteria gram-positiva y un anaerobio facultativo que puede crecer en condiciones aerobias y anaerobias, no produce esporas, no tiene motilidad, y tiene forma de varilla. Las propiedades morfológicas y fisiológicas específicas de Lactobacillus plantarum CJLP243 han sido analizadas de acuerdo con
20 métodos convencionales conocidos en la técnica y se muestra en la Tabla 1 a continuación.
Tabla 1 [Tabla 1]
- Propiedades morfológicas, fisiológicas y bioquímicas
- Resultados
- Morfología
- Varilla
- Motilidad
- -
- Espora
- -
- Catalasa
- -
- Homo-hetero fermentación
- heterofermentación facultativa
- Proliferación a 10°C
- +
- Proliferación a 42°C
- +
- Proliferación en NaCl al 7%
- +
- Proliferación en NaCl al 10%
- -
- Proliferación a pH 3,8
- +
- Proliferación en condiciones anaerobias
- +
- Producción de CO2 utilizando glucosa
- -
- Fermentación de azúcar
- Glicerol
- -
- Eritritol
- -
- D-arabinosa
- -
- L-arabinosa
- +
- Ribosa
- +
- D-xilosa
- -
- L-xilosa
- -
- Adonitol
- -
- Xilósido
- -
- Galactosa
- +
- D-glucosa
- +
- D-fructosa
- +
5
- Propiedades morfológicas, fisiológicas y bioquímicas
- Resultados
- D-manosa
- +
- L-sorbosa
- -
- Ramnosa
- +
- Dulcitol
- -
- Inositol
- -
- Manitol
- +
- Sorbitol
- +
- D-manósido
- +
- D-glucósido
- +
- Glucosamina
- +
- Amigdalina
- +
- Alutina
- +
- Esculina
- +
- Salicina
- +
- Celobiosa
- +
- Maltosa
- +
- Lactosa
- +
- Melibiosa
- +
- Sacarosa
- +
- Trehalosa
- +
- Inulina
- +
- Melicitosa
- +
- D-rafinosa
- +
- Almidón
- -
- Glucógeno
- -
- Xilitol
- -
- Gentiobiosa
- -
- D-turanosa
- -
- D-lixosa
- -
- D-tagatosa
- -
- D-fucosa
- -
- L-fucosa
- -
- D-arabitol
- -
- L-arabitol
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- Gluconato
- -
- 2-gluconato
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- 5-gluconato
- -
- +: Positivo -: Negativo
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productos farmacéuticos, alimentos funcionales, cosméticos, alimentos para ganado, o aditivos para la alimentación del ganado, sin ninguna preocupación sobre los efectos secundarios.
Si la composición se utiliza como productos farmacéuticos, la composición puede formularse en formulaciones farmacéuticas que se utilizan comúnmente en la técnica. Los productos farmacéuticos pueden ser formulaciones para administración oral tales como líquidos, suspensiones, polvos, gránulos, comprimidos, cápsulas, píldoras, o extractos.
Mientras se formula la composición, se pueden añadir a las formulaciones excipientes o aditivos compatibles farmacéuticamente aceptables. La formulación para administración oral puede incluir al menos uno seleccionado del grupo que consiste de un diluyente, un lubricante, un aglutinante, un disgregante, un edulcorante, un estabilizador, y un conservante, como excipiente, y al menos uno seleccionado del grupo que consiste en un agente aromatizante, una vitamina, y un antioxidante, como aditivo.
El excipiente y el aditivo pueden ser cualquier material farmacéuticamente aceptable. En particular, el diluyente puede ser ácido láctico, almidón de maíz, aceite de soja, celulosa microcristalina, o manitol, el lubricante puede ser estearato de magnesio o talco, y el aglutinante puede ser polivinilpirrolidona o hidroxipropilcelulosa. Además, los disgregantes pueden ser carboximetilcelulosa de calcio, glicolato de almidón sódico, polacrilina de potasio, o crospovidona, el edulcorante puede ser azúcar blanco, fructosa, sorbitol, o aspartamo, el estabilizador puede ser carboximetilcelulosa sódica, β-ciclodextrina, cera blanca, o goma de xantano, y el conservante pueden ser paraoxibenzoato de metilo, paraoxibenzoato de propilo, o sorbato de potasio.
Además de las sustancias anteriores, se pueden añadir a la formulación un aroma natural tal como aroma de ciruela, aroma de limón, aroma de piña, o aroma de hierbas, un zumo de fruta natural, un colorante natural tal como clorofilina o flavonoide, un agente edulcorante tal como fructosa, miel, alcohol de azúcar, o azúcar, o un acidulante, tal como ácido cítrico o citrato de sodio, o combinaciones de los mismos con el fin de mejorar el sabor.
Este método de formulación, y los excipientes y aditivos para la formulación se describen en detalle en Remington's Pharmaceutical Sciences (19a ed., 1995).
La composición se puede utilizar como alimento. El alimento puede incluir no sólo alimentos funcionales, sino también alimentos cotidianos. La composición utilizada como alimento funcional se puede formular en una variedad de formulaciones que se utilizan comúnmente en la técnica con excipientes o aditivos fisiológicamente aceptables. El alimento funcional puede ser polvo, gránulos, comprimidos, cápsulas, suspensiones, emulsiones, jarabes, líquidos, extractos, té, jalea, bebidas, o similares. Se pueden utilizar excipientes o aditivos fisiológicamente aceptables cualesquiera que se utilizan comúnmente en la técnica.
Debido a su eficacia para prevenir o tratar enfermedades atópicas, la composición puede ser utilizado en cosméticos. La composición utilizada en cosméticos se puede formular en una variedad de formulaciones que se utilizan comúnmente en la técnica. Durante la preparación de las formulaciones, pueden añadirse a las mismas excipientes o aditivos que sean aceptables para los cosméticos.
La composición puede ser utilizada como alimento para animales o aditivos de alimento para animales.
Si la composición se utiliza como un aditivo de alimento para animales, la composición puede ser un líquido con alta concentración que oscila de 20 a 90% o se pueden preparar en forma de polvo o gránulos. El aditivo de alimento para animales puede incluir al menos uno seleccionado del grupo que consiste en un ácido orgánico tal como ácido cítrico, ácido fumárico, ácido adípico, ácido láctico o ácido málico, una sal fosfato tal como fosfato de sodio, fosfato de potasio, pirofosfato ácido, o polifosfato (fosfato polimerizado), y un antioxidante natural tal como polifenol, catequina, α-tocoferol, extracto de romero, vitamina C, extracto de té verde, extracto de regaliz, quitosano, ácido tánico o ácido fítico. La composición utilizada como alimento para el ganado se puede formular en una variedad de formulaciones que se utilizan comúnmente en la técnica con ingredientes comúnmente utilizados en la alimentación del ganado.
El aditivo de alimento para animales y el alimento para animales pueden incluir cereales tales como trigo en polvo o pulverizado, avena, cebada, maíz o arroz; alimento para animales con proteína vegetal que contiene colza, habas, o girasol como ingrediente principal; alimento para animales con proteínas animales tales como sangre en polvo, carne en polvo, hueso en polvo, o pescado en polvo; azúcar; y productos lácteos tales como leche en polvo y suero de leche en polvo. El aditivo de alimento para animales y el alimento para animales pueden incluir adicionalmente suplementos de nutrientes, agentes para ayudar a la digestión y la absorción, sustancias promotoras del crecimiento, o similares.
El aditivo de alimento para animales solo se puede administrar a animales o se puede combinar con otro aditivo de alimento para animales en excipientes comestibles que van a ser administrados. Además, el aditivo de alimento para
9
Los resultados se muestran en la FIG. 3. La FIG. 3 es un gráfico que ilustra una capacidad de adherencia de Lactobacillus plantarum CJLP243 a células epiteliales del intestino.
Haciendo referencia a la FIG. 3, Lactobacillus plantarum CJLP243 tenía una mayor capacidad de adherencia a las
5 células epiteliales intestinales después de 24 horas en comparación con Lactobacillus rhamnosus GG (KCTC 5033) comercialmente bien conocida como probiótico. De acuerdo con estos resultados, puede observarse que Lactobacillus plantarum CJLP243 de acuerdo con un aspecto de la presente invención es capaz de adherirse a las células epiteliales intestinales, mejorando así los entornos intestinales.
10 Ejemplo 4: Ensayo de seguridad de las cepas CJLP243 de Lactobacillus plantarum
Con el fin de evaluar la seguridad de las cepas aisladas en el Ejemplo 1, se llevaron a cabo una prueba de hemólisis, una prueba de licuefacción de la gelatina, una prueba de formación de metabolitos peligrosos (amoníaco), y una prueba de fenilalanina desaminasa de acuerdo con los métodos de prueba de seguridad sugeridas por una
15 norma colectiva de la Korean Bio Venture Association.
Los resultados se muestran en la Tabla 2 a continuación.
Tabla 2 20 [Tabla 2]
- Seguridad de Lactobacillus plantarum CJLP243
- Cepas
- Prueba
- prueba de licuefacción de la gelatina
- prueba de fenilalanina desaminasa prueba de hemólisis prueba de formación de amoniaco
- CJLP243
- negativo negativo α-hemólisis, seguro negativo
De acuerdo con los resultados, Lactobacillus plantarum CJLP243 fue negativo para la prueba de licuefacción de la gelatina, la prueba de formación de metabolitos peligrosos (amoníaco), y la prueba de fenilalanina desaminasa, y mostró α-hemólisis que se estima no estaba relacionada con un patógeno. De este modo, se comprobó que
25 Lactobacillus plantarum CJLP243 se puede administrar de forma segura para el cuerpo humano.
Ejemplo 5: Crecimiento de las células inmunitarias de ratón a modo de experimento ex vivo
Con el fin de identificar la capacidad potenciadora inmunológica de Lactobacillus plantarum CJLP 243, se identificó
30 el crecimiento de las células inmunitarias de ratón mediante un ensayo MTT. El ensayo MTT se realizó como sigue de acuerdo con las instrucciones del fabricante de un kit de ensayo MTT (Promega, número de cat. G5430). En primer lugar, se diluyeron las células inmunitarias obtenidas mediante la eliminación de células de la sangre de esplenocitos de un ratón B6 en un medio RPMI 1640 que contenía suero bovino fetal al 10%. Después, las células inmunitarias se sembraron en la placa de 96 pocillos en la cantidad de 1 x 106 células/pocillo (volumen total de 200
35 μℓ). Después de que se completó la siembra de las células inmunitarias, se añadieron a cada pocillo Lactobacillus plantarum CJLP 243 vivos (5 x 106 células) y se cultivaron a 37°C en una incubadora con CO2 al 5% durante 3 días. Después de 3 días, se retiraron 100 μℓ de medio 1 hora antes del ensayo MTT con el fin de prepararse para el ensayo MTT. A continuación, se dispensaron a cada pocillo 20 μℓ de solución de MTT (2 mg/mL), y después se cultivó a 37°C durante 1 hora. Después, se midió la absorbancia a 490 nm usando un lector de ELISA (Molecular
40 Device, EE.UU.). Este procedimiento se repitió al menos 3 veces. En este procedimiento, en los grupos de control positivo, cada uno a una concentración de 10 mg/mL, se utilizaron concanavalina A (Con A; Número de cat. Sigma L6397), fitohemaglutamina (PHA; número de cat Sigma L8902), o lipopolisacárido (LPS; Número de cat. Sigma L4516), que son los principales mitógenos. Por otra parte, se adquirió β-glucano puro al 99% de Sigma Chemical (número de cat G5011, EE.UU.) y se utilizó a la concentración final de 1,25 g/mL para comparar la capacidad de
45 potenciación inmunológica. Los resultados se muestran en la figura. 4.
La FIG. 4 es un gráfico que ilustra los resultados del ensayo MTT que se realizó sobre las células inmunitarias de bazo, que se aislaron de un ratón y se cultivaron ex vivo, y después se trató con Lactobacillus plantarum CJLP243.
50 Haciendo referencia a la FIG. 4, se puede decir que Lactobacillus plantarum CJLP243 tiene capacidad superior para activar el crecimiento de los esplenocitos en comparación con los principales mitógenos, ß-glucano, y Lactobacillus rhamnosus GG (KCTC 5033), y por lo tanto se confirma que es capaz de inducir la potenciación de la inmunidad.
Ejemplo 6: Capacidad de producir IFN-γ utilizando el análisis de citoquinas
55 Con el fin de identificar una capacidad de potenciar el sistema inmunitario de Lactobacillus plantarum CJLP243 en
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un antígeno foráneo, se midió la capacidad de producción de IFN-γ, una citoquina de tipo Th1, utilizando un ensayo ELISA. En primer lugar, se diluyeron las células inmunitarias obtenidas mediante la eliminación de células de la sangre a partir de esplenocitos de un ratón B6 en un medio RPMI 1640 que contenía suero bovino fetal al 10%. Después, las células inmunitarias se sembraron en la placa de 96 pocillos en la cantidad de 1 x 106 células/pocillo (volumen total de 200 µℓ). Después de que se completó la siembra de las células inmunitarias, se añadieron a cada pocillo Lactobacillus plantarum CJLP 243 vivas (5 x 105 células) y se cultivaron a 37°C en una incubadora con CO2 al 5% durante 3 días. Después de 3 días, se retiraron 50 µℓ del medio de cultivo y se midió la cantidad de IFN-γ contenida en el mismo utilizando el ensayo ELISA. Para llevar a cabo el ensayo ELISA, una placa de ELISA se revistió con un anticuerpo IFN-γ a temperatura ambiente durante 4 horas, y a continuación se añadieron a la misma 50 µℓ del medio de cultivo y se cultivaron a temperatura ambiente. Después, el medio de cultivo se eliminó de la placa de ELISA, que después se recubrió con un anticuerpo para IFN-γ biotinilado (BD Bioscience, número de cat. 554410), que es un segundo anticuerpo, a temperatura ambiente durante aproximadamente 2 horas. La reacción de color se indujo mediante estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante (Vectore, número de cat. SA5004) y su sustrato, TMB (3,3',5,5'-tetrametilbencidina, KPL, número de cat. 50-76-03). Después de llevar a cabo la reacción de color, se añadieron 100 µg/mL de solución de parada (HCl3M) a la placa con el fin de detener la reacción de color. En este momento, la reacción de color mostró el cambio de color de azul a amarillo, y la absorbancia se midió a 450 nm utilizando un lector de ELISA (Molecular Device, EE.UU.) después de que se detuvo la reacción de color. Este procedimiento se repitió al menos 3 veces. En estos procedimientos, en los grupos positivos de control se utilizaron concanavalina A (Con A; número de cat. Sigma L6397), fitohemaglutamina (PHA; número de cat. Sigma L8902), o lipopolisacárido (LPS; número de cat. Sigma L4516), que son los principales mitógenos, cada uno a la concentración de 10 µg/mL. Adicionalmente, se adquirió β-glucano al 99% puro de Sigma Chemical (número de cat. G5011, EE.UU.) y se utilizó en una cantidad de 1,25 mg al final para comparar la capacidad de potenciación inmunológica. Los resultados se muestran en la FIG. 5.
La FIG. 5 es un gráfico que ilustra los resultados del ensayo de IFN-γ que se realizó sobre las células inmunitarias del bazo que se aislaron de ratón y se cultivaron ex vivo, y después se trataron con Lactobacillus plantarum CJLP243.
Haciendo referencia a la figura. 5, se puede decir que Lactobacillus plantarum CJLP243 tiene capacidad inferior a los principales mitógenos que son grupos de control positivo, pero capacidad significativamente superior a Lactobacillus rhamnosus GG (KCTC 5033) con respecto a la producción de IFN-γ, y por lo tanto se confirma que es capaz de inducir la inmunidad de tipo Th1 potenciada.
Ejemplo 7: Inmunidad potenciada de la cepa CJLP243 de Lactobacillus plantarum cuando se administra por vía oral
Se llevó a cabo como un ensayo para la identificación de la potenciación de la inmunidad de una cepa CJLP243 de Lactobacillus plantarum cuando se administra por vía oral de la siguiente manera.
Se adquirieron ratones Balb/c hembras de 4 semanas de edad, y se mantuvieron para la estabilización durante 1 semana en una sala de cría de animales, que estaba en la condición SPF mantenida a una temperatura de 24 ± 2°C y una humedad de 55 ± 15%. A los ratones se les proporcionó alimento general en polvo para animales a lo que se añadieron algunos antibióticos, y se les proporcionó agua ad libitum. Cada Lactobacillus rhamnosus GG y Lactobacillus plantarum CJLP 243 se procesó en forma de polvo liofilizado, que se mantuvo refrigerado. Las bacterias ácido lácticas se mezclaron uniformemente con el alimento en polvo para animales y se administraron oralmente a los ratones a una dosis de 2,5 x 1010 UFC/día/ratón. El peso de cada ratón se midió durante 8 semanas durante la administración, y a continuación todos los ratones fueron sacrificados para los siguientes experimentos.
Se retiró el bazo de cada ratón sacrificado, y se midieron su longitud y su peso. El bazo fue aplastado utilizando un émbolo de una jeringa y se filtró a través de una malla con el fin de separar las células, y estos procedimientos se llevaron a cabo en un tampón ACK. Las células separadas se contaron utilizando un microscopio.
Con el fin de identificar el cambio en la composición de células inmunitarias en los esplenocitos separados, las células T en las células separadas se tiñeron con anticuerpos anti-Thy1.2-FITC, y las células B se tiñeron con anticuerpos anti-CD 19-FITC. Las células T CD se tiñeron con anticuerpos anti-Thy1.2-FITC y anticuerpos anti-CD4-PE, y las células CD8 se tiñeron con anticuerpos anti-Thy1.2-FITC y anticuerpos anti-CD8-PE. Se analizaron las células teñidas en cada tejido para determinar su proporción de composición utilizando un FACScan (BD Biosciences, EE.UU.).
Los esplenocitos separados se trataron con ConA a una concentración de 5 µg/mL para estimular los linfocitos T. Después de 24 horas, se retiró el sobrenadante y se midieron las concentraciones de IFN-γ e IL-2, citoquinas de los linfocitos T, utilizando un ELISA. Una microplaca se recubrió con IFN-γ y anticuerpos de captura para IL-2 a 4°C durante la noche, y después se lavó con PBS (PBST) que contenía Tween 20 al 0,05% y se bloqueó con PBS que contenía suero bovino fetal al 3%. Después de 1 hora, la microplaca se lavó y se añadieron a cada pocillo el sobrenadante y una solución convencional (una solución convencional proporcionada por BD Bioscience) y se
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imagen1
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