KR20160069733A

KR20160069733A - 신규한 균주로 알러지, 아토피성 피부염, 비염, 가려움증 등의 개선치료 및 면역력조절 기능을 갖는 Lactobacillus plantarum K-1 BR 균주

Info

Publication number: KR20160069733A
Application number: KR1020140175693A
Authority: KR
Inventors: 정용현; 정진웅
Original assignee: (주)바이오리듬
Priority date: 2014-12-09
Filing date: 2014-12-09
Publication date: 2016-06-17
Also published as: WO2016093450A1; CN107109351A

Abstract

본 발명은 항알러지 효과를 나타내며, 알레르기 질환, 아토피성 피부염, 비염, pruritus, 아낙필락시스 등의 질병을 개선 치료 할 수 있고 면역력 조절을 갖는 것으로 김치로 부터 분리 및 동정한 유산균 L. plantarum-K-1 BR (LP)에 관한 것이다.

Description

신규한 균주로 알러지, 아토피성 피부염, 비염, 가려움증 등의 개선치료 및 면역력조절 기능을 갖는 Lactobacillus plantarum K-1 BR 균주{Lactobacillus plantarum, K-1 BR on antiallergic properties, anti atopic dermatitis, anti rhinitis, anti pruritus. egulation of level of immunity, microbial agent}

본 발명은 서구화된 식생활, 문명의 획일화된 생활환경, 불규칙적인 생활습관 및 스트레스 등 복합적인 원인에 의해 장내 균총(Microbiota)의 변화를 초래하게 되고, 이로 인해 다양한 소화기성 염증 질환, 면역 과민 질환의 발생에 대항한 유산균의 일종인 아토피성 피부염, 비염 등의 개선치료 및 면역력조절 기능을 갖는 Lactobacillus plantarum K-1 BR 균주에 관한 것이다.

알러지는 이물질(항원, Allergen)에 대한 특이하고 변형된 반응을 나타내는 생화학적 현상이며, 이때 방출된 물질이 증상을 일으키게 되면 알러젠(Allergen)이라 하고 그 결과 생긴 질환을 알러지 질환이라고 한다.

유산균은 탄수화물을 대량 소비하여 젖산 등 유기산을 다량 생산하는 세균으로 단백질을 분해해서 부패시키는 능력은 없는 유익한 균이다.

이에 반해 부패균은 Bacteroides 속 균주와 같이 우리 몸에서 단백질을 분해하고 암모니아, 유화수소, 아민, 인돌, 페놀 등을 생산하여 악취를 내는 세균이다. 최근에는 유산균을 probiotics (for the life)라고 하고 있다.

현재 유산균은 분류되어 균주들은 모양에 따라 구균과 간균으로 구별하며, 구균에는 Streptococcus, Pediococcus, Leuconostoc 등이, 간균에는 Lactobacillus, Sporolactobacillus, Bifidobacterium 등이 있다.

유산균은 인류역사와 함께 시작하였으며, 히포크라테스의 저서에도 나올 만큼 오래된 유익균이다.

Hippocrates (460-377 B.C.)는 설사환자에 발효식품의 유효하다고 기록하고 있다.

유산균을 맨 처음 관찰한 연구자는 Antony van Leeuwenhoek로 추정되고 있으나 유산균 발견자가 되지는 못했으며, 최초의 유산균 발견 과학자는 루이 파스퇴르였고 부패균으로 생각하였으나, 이후 1899년에 Tisser가 분변으로부터 유산균인 Bifidus 를 처음으로 발견하고, 1900년에 소아과 의사인 Moro는 설사를 하는 어린이와 건강한 어린이의 분변중의 장내세균총의 차이점을 연구하다 유산균인 Lactobacillus acidophilus가 유익균임을 밝혔다

메치니코프는 소화관에 유익한 세균이 서식해야 장수할 수 있다고 주장하였다. 이 주장은 장내세균이 우리 몸에 유익한 유산균이 서식하는 것을 전제로 한 것으로 추정된다 우리 장 속에는 몸에 좋은 작용을 하는 균과 나쁜 작용을 하는 균이 존재한다. 스트레스나 피로 또는 노화 등의 다양한 영향에 의해 장속 환경의 균형은 무너진다. 유산균은 유산균의 유당 불내증 개선효과, 혈중 콜레스테롤 저하 효과, 유산균의 변비 개선 효과, 유산균의 유해균 억제효과, 유산균의 편두통 개선효과, 유산균의 간장보호효과, 유산균의 항돌연변이 효과, 유산균의 피부미용효과, 유산균의 염증성 장질환 (크론병과 대장염) 개선효과, 항암효과 및 면역증강작용, 항알러지 효과 등이 있다.

장속 세균의 균형이 무너지면 장의 상태가 나빠지거나 변비를 일으키고 피부가 거칠어지는 등의 악영향이 나타난다. 악영향은 거기에서만 그치는 것이 아니다. 문제가 되는 것은 장의 균형이 무너지면 각종 알레르기질환이나 다양한 생활습관병을 유발할 수 있다.

장은 인간 최대의 면역기관이다. 즉, 장은 신체의 면역력 및 몸전체의 상태와 밀접한 관계가 있다. 식물성유산균은 좋은 균을 늘리고 장의 균형을 유지시키므로 건강상태를 개선해준다.

호중구란 면역을 관리하는 백혈구의 중간체로서 체내에 침투한 세균 등의 이물질을 먹어 없애는 것인데, 이 수가 증가한다는 것은 결국 식물성유산균이 면역력을 부활시킨다는 것을 시사한다.

미국ABC방송은 "한국 과학자들이 AI에 감염된 13마리의 닭 가운데 11마리가 sauerkraut와 유사한 한국김치 추출물을 먹고 회복되기 시작했다고 보고한 이후 최근 이 발효식품이 큰 인기를 얻고 있다"고 보도했다.

마늘, 생강, 고춧가루, 파, 소금과 같은 천연 항생력을 가진 소재의 서식환경에서 극복하여 발육.증식하는 김치유산균은 그의 세포 연결구조가 달라지고 그의 생성물질도 차이가 있을 것이다. 그런 환경속에서 극복하여 생성된 유산균은 장속 환경을 정비함으로써 피부나 세포를 회춘시킬 뿐만 아니라 몸의 면역력을 높여 꽃가루알레르기나 아토피성 피부염 등의 알레르기성 질환 및 생활습관병의 예방 및 개선에 상당한 큰 도움이 된다.

알러지성 질환은 매년 증가하고 있으며, 2000년대에는 5%이상으로 급증했으며, 잠제적인 환자까지 포함하면 10%가 넘는 것으로 추정된다.

알러지의 발생원인 항원항체반응의 결과로 나타나는 생체의 병적과정이며, 가장 흔한 알러지 반응은 기관지 천식, 알러지성 비염, 화분증 및 아토피성피부염등을 일으키는 즉시형 과민반응은 제 1형 반응과 만성염증반응과 같은 제 4형이 있다

아낙필라시스과 같은 알러지 반응은 비만세포 등의 Fc 수용체에 대한 항원, anti-IgE, lectin 등의 결합, anaphylatoxin 등의 자극, calcium ionopore, compound K48/80, codeine 등 합성피질 자극 호르몬과 같은 약물에 의해 일어난다

또한 유산균은 우리 몸에서 면역 기전을 증가시켜 질병을 일으키는 병원성 세균의 감염을 억제한다. 이렇게 유산균이 면역계를 활성화시키면 바이러스가 우리 몸을 침범하더라도 방어능력이 커진다. 김치유산균이 조류독감 바이러스를 퇴치하는 것도 이와 같은 방법일 것이다. 그러므로 사람에게 유익을 주는 강력한 유산균을 분리.동정하여 찾아내는 것은 인류의 건강 유지를 통해 행복을 갖어다 줄 것이다.

국내공개특허공보 공개번호 제1020050076374 (2005.07.26)호에는 항알러지 및 항아토피에 효과가 있으며, 장내 세균 기인성 암모니아 생산성을 억제시킬 수 있도록 하기 위하여 알콜 또는 폴리에틸레그릴콜에 추출하고 건조하여 얻은 알러지 및 염증 치료용 두류 또는 두류 추출물에 두류락토바실러스 애시도필러스, 락토바실러스 불가리쿠스, 락토바실러스 컨푸수스, 락토바실러스 루테리, 락토바실러스 카제이, 비피도박테리움 브레이브, 비피도박테리움 인판티스, 비피도박테리움 비피덤, 비피도박테리움 써모필럼, 스트렙토코코스 페이스칼리스, 스트렙토코코스 써모필러스중 적어도 하나를 접종하여 얻어지는 아토피와 항알러지 및 장내유해세균의 암모니아 생산을 저해하는 활성을 갖는 두류 유산균 발효물을 포함하는 기능성 제품 및 그 제조방법에 공개되어 있고,

김치 추출 프로바이오틱스 섭취가 아토피 동물모델 NC/Nga mice에서 면역 지표에 미치는 영향, 한국식품과학회지 제40권 제1호 통권 제197호 (2008년 2월) pp.82-87 공개되어 있음을 알 수 있다.

1. 국내공개특허공보 공개번호 제1020050076374 (2005.07.26)호

1. 김치 추출 프로바이오틱스 섭취가 아토피 동물모델 NC/Nga mice에서 면역 지표에 미치는 영향, 한국식품과학회지 제40권 제1호 통권 제197호 (2008년 2월) pp.82-87

본 발명은 상기한 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 사람이 살아가는 환경에는 수 많은 미생물이 살아가고 있다. 사람의 피부에서부터 소장관에 이르기까지 다양한 곳에 서식하고 있으며, 이 세균들을 정상세균총이라고 하여, 이 장내세균총은 사람의 건강과 가장 밀접한 관계를 갖고 있는 소화관 균주는 유산균이다.

장내세균총은 숙주의 환경 즉 소화관내의 pH (위산), 장운동, 소화효소, 점액, 담즙 등에 의해 영향을 받는다. 예를 들면 사람이 스트레스를 받으면, 장운동이 멈추고, 위산과 장액의 분비가 많거나 적어지고, 그 결과 장내세균총은 균형을 상실하고, 심한 경우에는 균교대증이 나타날 수 있다.

그런 까닭에 현대인들의 불치성이라고 알려진 아토피성 피부염증이나 면역력 저하로 인한 각종 질병 등 다양한 소화기성 염증 질환, 면역 과민 질환으로 발생되는 상황에서 동물실험을 통해 각기 기능성을 확인하고 비교평가한 건강소재로서 김치로부터 강력하게 발현되는 유산균을 제공함에 그 목적이 있다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 AP-1 및 NF-B 활성화를 억제하는 유산균 L. plantarum-K-1 BR (LP)을 김치에서 분리한 아토피성 피부염, 비염 등의 개선치료 및 면역력조절 기능을 갖는 Lactobacillus plantarum K-1 BR균주(수탁번호; KCCM11209P)를 제공하는 것이 본 발명의 과제 해결수단인 것이다.

본 발명은 문명의 획일화된 생활환경, 서구화된 식생활, 불규칙적인 생활습관 및 스트레스 등 복합적인 원인에 의해 장내 균총(Microbiota)의 변화를 초래하게 되고, 이로 인해 다양한 소화기성 염증 질환 (설사, 궤양성 대장염, 과민성대장증후군), 면역 과민 질환 (아토피 피부염, 천식, 각종 알레르기질환, 당뇨병, 관절염등) 염증성질환 및 각종 대사성 질환)의 발생을 억제할 수 있으며 그 질병들을 긍정적으로 개선.치료할 수 있으며,

면역과민 질환이 손상된 장 면역계를 건강한 사람의 장내 균총으로 돌려 줌으로써 각종 질환을 제어할 수 있을 것으로 기대된다. 또한 유산균은 장관면역계를 조절함으로서 면역질환들 예를 들면 알러지질환들 아낙필락시스, 소양반응 등을 개선 및 치료할 수 있다.

도 1은 Lactobacillus plantarum K-1 BR의 PMA로 자극한 RBL-2H3 세포의 IL-4, TNF-alpha 발현 (1A) 및 전사인자 NF-kappaB, AP-1의 활성화 (1B) 억제효과를 나타낸 그라피
도2는 생쥐에 IgE로 유도한 수동형 피부아낙필락시스반응에 유산균 Lactobacillus plantarum K-1 BR의 억제효과를 나타낸 그라피
도3은 생쥐에 히스타민으로 유도한 소양행동에 유산균 Lactobacillus plantarum K-1 BR의 억제효과를 나타낸 그라피. 유산균과 azelastine의 항소양 효과 (3A) 유산균 및 azelastine의 혈관투과성 억제효과(3B).
도4는 생쥐에 히스타민으로 IL-4 (4A), TNF-alpha (4B), IL-1beta (4C) 및 IgE (4D)의 발현에 유산균 Lactobacillus plantarum K-1 BR의 억제효과를 나타낸 그라피
도5은 유산균 K-1 BR의 탈과립 억제효과를 나타낸 그라피
도6은 Cyclophosphamide로 유도한 골수 및 비장의 T(6B) 및 NK(6A) 세포수가 감소한 면역억제 생쥐에 유산균 K-1 BR의 효과를 나타낸 그라피.

본 발명은 김치로부터 phorbol 12'-myristate 13'-acetate (PMA)로 유도한 Rat basophilic leukemia (RBL)-2H3 세포의 NF-kB 및 AP-1의 활성화를 균주를 검색하여, 가장 강하게 NF-kB 및 AP-1 전사인자의 활성화를 억제하는 균주는 Lactobacillus plantarum K-1 BR에 관한 것이며, 2011년 9월 20일 국제기탁기관인 한국미생물보존센터에 기탁번호 KCCM11209P로 기탁하였다.

락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)는 락토바실러스(Lactobacillus)속 젖산균으로 막대기 모양의 간균이며 그람양성이다.

일반적으로 많은 발효 식품뿐만 아니라 혐기성 식품이나 식물 등의 물질속에서 발견되는 유산균종으로 자연계에 광범위하게 존재하고 있다.

크기는 0.7~1.0×3.0~8.0μ으로 생육 적정 온도는 29-33℃ 이며 약간의 호기성을 띤다. 락토바실러스 플란타룸은 아라비노오스(arabinose), 글루코오스(glucose), 과당(fructose), 갈락토오스(galactose), 엿당(maltose), 수크로오스(sucrose), 덱스트란(dextran), 라피노오스(raffinose)와 트레할로스(trehalose) 등을 발효하여 젖산을 생성한다. 주로 우유, 치즈, 버터, 케피어(kefir), 발효된 소시지, 발효된 감자, 곡물, 빵의 산성 반죽(dough), 피클이나 김치와 같은 침채류, 토마토 등에서 분리되며, 자연계에서 가장 분포가 넓은 젖산균 중의 하나이다. 특히 우리 나라 김치의 발효에 중요한 역할을 하는 젖산균으로 식염 내성은 약 5.5%이다.

우리나라 김치에는 약 30여종의 아주 다양한 젖산균 등이 보고 되어 있는데, 김치의 발효, 숙성, 온도에 따라 생육하는 균의 종류는 다르다. 김치의 발효 초기에는 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides)라는 균이 자라고, 발효 후기에는 내산성이 강한 막대기 모양의 유산 간균인 락토바실러스 플란타룸이 자란다. 락토바실러스 플란타룸은 김치가 발효가 많이 되어 신 맛이 날 때 주로 생장하는 균으로 내산성성과 내담즙성이 강하다. 유럽에서는 프로바이오틱스(probiotic)균주로서 락토바실러스 플란타룸을 요구르트에 첨가하고 있다.

본 발명의 Lactobacillus plantarum K-1 BR 균주는 그람 염색, Lactobacillus plantarum K-1 BR 균주의 일반적인 특성 및 API 당이용성을 분석하고, 이 균주의 유전자 분석을 QIAamp DNA Mini Kit을 이용하여 DNA를 추출한 후 16S rRNA 에 대해 PCR수행하고 서열 분석한 결과 얻은 16S rRNA 의 서열 비교하였다 (표 1 및 표 2 참조).

그람 양성 간균이였고, 당분석결과는 표 1과 같았으며, 서열분석 결과는 Lactobacillus plantarum과 아주 유사했으나, 동일하지는 않았다.

No.	당종류	Lactobacillus plantarum strain 1	Lactobacillus plantarum K-1 BR
1	Control	-	-
2	Glycerol	-	-
3	Erythritol	-	-
4	D-Arabinose	-	-
5	L-Arabinose	+	+
6	D-Ribose	+	+
7	D-Xylose	-	-
8	L-Xylose	-	-
9	Adonitol	-	-
10	Methyl-xyloside	-	-
11	D-Galactose	+	+
12	D-Glucose	+	+
13	D-Fructose	+	+
14	D-Mannose	+	+
15	L-Sorbose	-	-
16	Rhamnose	-	-
17	Dulcitol	-	-
18	Inositol	-	-
19	Mannitol	+	+
20	Sorbitol	+	+
21	Methyl-D-mannoside	+	+
22	Methyl-D-glucoside	-	-
23	N-Acetyl-glucosamine	+	+
24	Amydalin	+	+
25	Arbutine	+	+
26	Esculin	+	+
27	Salicin	+	+
28	Cellobiose	+	+
29	Maltose	+	+
30	Lactose	+	+
31	Melibiose	+	+
32	Sucrose	+	+
33	Trehalose	+	+
34	Inulin	-	-
35	Melesitose	+	+
36	Raffinose	+	+
37	Starch	-	-
38	Glycogen	-	-
39	Xylitol	-	-
40	Gentiobiose	+	+
41	D-Turanose	+	+
42	D-Lyxose	-	+
43	D-Tagatose	-	-
44	D-Fucose	-	-
45	L-Fucose	-	-
46	D-Arabitol	-	-
47	L-Arabitol	-	+
48	Gluconate	+	+
49	2-keto-gluconate	-	-
50	5-keto-glutonate	-	-

K-1 BR 균주과 Lactobacillus plantarum의 16S rRNA 유사성

구 분	K-1 BR 균주와의 homology (%)
구 분	Search	Align
Lactobacillus plantarum	99	99

도 1은 Lactobacillus plantarum K-1 BR의 PMA로 자극한 RBL-2H3 세포의 IL-4, TNF-alpha 발현 (1A) 및 전사인자 NF-kappaB, AP-1의 활성화 (1B) 억제효과를 나타냈다.

RBL-2H3 cells (2 ×10⁵)는 20 nM PMA (PM) 로 자극했으며, 유산균 L. plantarum K-1 BR (LPL, 0.2 ×10⁹CFU/well;LPH,110⁹CFU/well)은 처리했다. 정상군 (NOR)은 유산균 대신에 vehicle만을 처리했다. TNF-α 및 IL-4는 ELISA로 측정했으며, NF-B 및 AP-1 는 immunoblotting으로 측정했다. Mean ± SD (n=5). ^# p < 0.05 vs. normal control group (정상군). ^* p < 0.05 vs. PMA-treated group(PMA처리한 군).

도2는 생쥐에 IgE로 유도한 수동형 피부아낙필락시스반응에 유산균 Lactobacillus plantarum K-1 BR의 억제효과를 나타냈다. 유산균과 대조약물 azelastine은 하루에 한번씩 3일간 투여함. 정상군은 vehicle만을, CON는 IgE로 아낙필락시스를 유도한군, LPL은 IgE 와 1 ×10⁹CFUL . plantarum K-1 BR 를 투여한군, LPH은 IgE와 1 ×10¹⁰CFUL . plantarum K-1 BR 유산균을 투여한군, AZ는 IgE와 10 mg/kg azelastine 을 투여한 군이다. Mean ± SD (n=5). ^# p < 0.05 vs. normal control group. ^* p < 0.05 vs. IgE-antigen complex-treated group.

도3은 생쥐에 히스타민으로 유도한 소양행동에 유산균 Lactobacillus plantarum K-1 BR의 억제효과를 나타냈다. 유산균과 azelastine의 항소양 효과 (3A) 유산균 및 azelastine의 혈관투과성 억제효과(3B).

유산균과 대조약물 azelastine은 하루에 한번씩 3일간 투여하였다. 정상군은 vehicle만을, CON는 IgE로 아낙필락시스를 유도한군, LPL은 히스타민과 1×10⁹CFUL . plantarum K-1 BR 를 투여한군, LPH은 히스타민과 1 × 10¹⁰CFUL . plantarum K-1 BR 유산균을 투여한군, AZ는 히스타민과 10 mg/kg azelastine 을 투여한 군이다. Mean ±SD (n=5). ^# p < 0.05 vs. normal control group. ^* p < 0.05 vs. histamine-treated group.

도4는 생쥐에 히스타민으로 IL-4 (4A), TNF-alpha (4B), IL-1beta (4C) 및 IgE (4D)의 발현에 유산균 Lactobacillus plantarum K-1 BR의 억제효과.를 나타냈다. 유산균과 대조약물 azelastine은 하루에 한번씩 3일간 투여하였다. 정상군은 vehicle만을, CON는 IgE로 아낙필락시스를 유도한군, LPL은 히스타민과 1×10⁹CFUL . plantarum K-1 BR 를 투여한군, LPH은 히스타민과 1×10¹⁰CFUL . plantarum K-1 BR 유산균을 투여한군, AZ는 히스타민과 10 mg/kg azelastine 을 투여한 군이다. Mean ±SD (n=5). ^# p < 0.05 vs. normal control group. ^* p < 0.05 vs. IgE-antigen complex-treated group.

도5는 유산균 K-1 BR의 탈과립 억제효과를 나타냈다.

도6은 Cyclophosphamide로 유도한 골수 및 비장의 T(6B) 및 NK(6A) 세포수가 감소한 면역억제 생쥐에 유산균 K-1 BR의 효과를 나타냈다.

이하, 본 발명의 구체적인 구성을 실시예를 들어 상세히 설명하지만 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 제한되는 것을 아니다.

실시예 1 본 발명 신규한 유산균의 분리 및 동정

김치 10g을 취하여 김치 파쇄액을 만들었다. 김치 파쇄 조건으로는 믹서기(RPM블랜더)로 2분동안 2000rpm으로 충분히 파쇄한 다음, 10^6배의 멸균된 정제수로 희석하여 MRS(Man Rogosa Sharpe) agar배지에 도말한 후 24시간 동안 배양하여 콜로니 30개를 채취하여 API 50CHL kit를 이용한 분리 동정하여 Lactobacillus plantarum K-1 BR을 제조하였다.

Lactobacillus plantarum K-1 BR의 16S rRNA 서열

<110> BIORHYTHM CO.LTD

<120> Lactobacillus plantarum, K-1 BR on antiallergic properties, anti

atopic dermatitis, anti rhinitis, anti pruritus. egulation of

level of immunity, microbial agent

<130> P-1412-1

<160> 1

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 504

<212> RNA

<213> Lactobacillus plantarum K-1 BR

<400> 1

agagtttgaa cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgaac 60

gaactctggt attgattggt gcttgcatca tgatttacat ttgagtgagt ggcgaactgg 120

tgagtaacac gtgggaaacc tgcccagaag cgggggataa cacctggaaa cagatgctaa 180

taccgcataa caacttggac cgcatggtcc gagtttgaaa gatggcttcg gctatcactt 240

ttggatggtc ccgcggcgta ttagctagat ggtggggtaa cggctcacca tggcaatgat 300

acgtagccga cctgagaggg taatcggcca cattgggact gagacacggc ccaaactcct 360

acgggaggca gcagtaggga atcttccaca atggacgaaa gtctgatgga gcaacgccgc 420

gtgagtgaag aagggtttcg gctcgtaaaa ctctgttgtt aaagaagaac atatctgaga 480

gtaactgttc aggtatgacg gtat 504

실시예 2TNF-a와 IL-4의 측정

RBL-2H3 cells (3×10⁶ cells)을 DMEM을 이용하여 37℃, 수분이 있는 5% CO2 인큐베이터에서 배양하며, 고착성을 갖는 세포를 트립신(trypsin)-EDTA 용액을 사용하여 부유시키며 이를 분리, 회수하여 실험에 사용하였다. RBL-2H3 세포를 24 웰(well)에 각각 5×10⁵cell/well씩 분주한 후 쥐의 단일세포의 인(monoclonal)에 IgE 0.5㎍/㎖를 넣어 12시간 인큐베이터에서 배양시키면서 증감하였다. 세포를 0.5㎖의 시라가니안 완충제(119mM NaCl, 5mM KCl, 0.4mM MgCl₂, 25mM PIPES, 40mM NaOH, pH7.2)로 씻어준 후 0.16㎖의 시라가니안 완충제(5.6mM 글루코즈(glucose), 1mM CaCl₂, 0.1% BSA를 첨가)를 넣은 다음 37℃에서 10분간 인큐베이터에서 배양시켰다.

그 후, 본 발명에 따른 60℃에서 30분간 처리한 유산균 Lactobacillus plantarum K-1 BR (2 x 10⁸또는 1 x 10⁹CFU/ml)0.04㎖를 가한 다음 20분 경과한 후에 0.02㎖의 PMA 1㎍/㎖)으로 37℃에서 40분간 세포를 활성화한 다음 2,000rpm에서 10분간 원심 분리하여, 0.025㎖의 상등액을 96웰(well)로 옮겼고, Endogen Elisa kit (미국)로 IL-4 와 TNF-a를 측정하였다.

실시예 3 Immunoblot analysis

RBL-2H3 cells (3×10⁶cells)을 DMEM을 이용하여 37℃, 수분이 있는 5% CO2 인큐베이터에서 배양하며, 고착성을 갖는 세포를 트립신(trypsin)-EDTA 용액을 사용하여 부유시키며 이를 분리, 회수하여 실험에 사용하였다. RBL-2H3 세포를 24 웰(well)에 각각 5×10⁵cell/well씩 분주한 후 쥐의 단일세포의 인(monoclonal)에 IgE 0.5㎍/㎖를 넣어 12시간 인큐베이터에서 배양시키면서 증감하였다. 세포를 0.5㎖의 시라가니안(siraganian) 완충제(119mM NaCl, 5mM KCl, 0.4mM MgCl2, 25mM PIPES, 40mM NaOH, pH7.2)로 씻어준 후 0.16㎖의 시라가니안 완충제(5.6mM 글루코즈(glucose), 1mM CaCl₂, 0.1% BSA를 첨가)를 넣은 다음 37℃에서 10분간 인큐베이터에서 배양시켰다. 그 후,

본 발명에 60℃에서 30분간 처리한 유산균 Lactobacillus plantarum K-1 BR (2 x 10⁸또는 1 x 10⁹CFU/ml)0.04㎖를 가한 다음 20분 경과한 후에 0.02㎖의 PMA 1㎍/㎖)으로 37℃에서 40분간 세포를 활성화한 다음 2,000rpm에서 10분간 원심 분리하여, hypotonic buffer(10mM Tris-HCl, 1.5mM MgCl₂, 1mM DTT, 0.1% NP-40, pepstatin 5μg/ml, aprotinin 5μg/ml) 0.1ml을 가해 현탁 후 15분간 얼음 위에서 방치하였다.

그리고 4℃, 12,000rpm에서 15분간 원심분리 후 상등액인 cytosol fraction을 취하고 다시 침전에 extraction buffer (10mM Tris-HCl, 50mM KCl, 300mM NaCl, 1mM DTT, pepstatin 5μg/ml, aprotinin 5μg/ml) 0.1ml을 가해 현탁 후 30분간 얼음 위에서 방치하고, 그리고 4℃, 12,000rpm에서 30분간 원심분리 후 상등액인 nuclear fraction을 취하였다. Cell lysate(40μg)를 10% SDS polyacrylamide gel상에서 전기영동 한 후 PVDF (Millipore) membrane에 transfer한 후 membrane은 PBS에 녹인 2% skim milk용액으로 상온에서 1시간 동안 blocking하고, 다시 1% skim milk 용액에 1:500으로 희석한 primary antibody(NF-kB, AP-1, phosphor-AP-1, phosphor-NF-kB)를 2시간 동안 담가 천천히 진탕하였다. Primary antibody 희석용액을 버리고 세척 용액 (0.05% PBS-tween)으로 10분씩 두 번 세척 후 다시 1% skim milk 용액에 1:5000으로 희석한 secondary antibody를 1시간 동안 담가 천천히 진탕하였다. 위와 같이 secondary antibody 희석용액을 버리고 세척 용액으로 10분씩 세 번 세척하고 enhanced chemilluminescence system (PIERCE)을 이용하여 검출하였다.

그 결과 김치유산균들 중 Lactobacillus plantarum K-1 BR이 가장 강하게 PMA를 활성화된 RBL-2H3 세포의 IL-4 및 TNF-a의 발현을 우수하게 억제하였다.[도1 (1A),(1B) 참조] 또는 Lactobacillus plantarum K-1 BR은 TNF-a의 전사인자인 NF-kB의 활성화(p-p65) 및 IL-4의 전사인자인 AP-1의 활성화(p-c-jun)을 아주바람직하게 억제하였다.

실시예 4 수동형 피부 아낙필락시스 (항알러지) 측정 시험

수동형 피부아낙필락시스 모델 동물 제작은 먼저 DNP-BSA(Dinitrophenol-bovine serum albumin)에 대한 IgE 혈청을 생리 식염수로 희석한 10ug를 에테르로 마취시킨 생쥐의 등에 주사하여 수동감작시키고 48 시간 후 DNP-HSA 0.2mg과 에반스 블루(evans blue) 1.6 mg을 포함한 생리 식염수 0.2 ml를 꼬리정맥에 주사하고 30 분후 경부탈골로 치사시켜 등에 누출된 에반스 블루 색소량을 측정함. 생쥐의 등의 일정 부위를 잘라 시험관에 넣고 1N-KOH 0.7 ml을 넣고 37℃에서 하룻밤 동안 배양하고, 이 시험관에 0.6 N 인산^.아세톤혼합액 (5:13) 4 ml를 가한 다음 진탕하고 여과하여 추출된 색소를 620 nm에서 비색정량하였다. 검체는 생리 식염수에 용해 또는 현탁하여 경구 또는 복강으로 항원투여 한 시간 전에 투여하였다.

유산균 Lactobacillus plantarum K-1 BR (LPL, 1×10⁹CFU/mouse;LPH,1×10¹⁰CFU/mouse)과 azelastine (AZ, 10 mg/kg) 은 IgE 투여하기 전 3일간 경구투여하였다.

그 결과 1x10¹⁰개의 유산균 Lactobacillus plantarum K-1 BR 을 투여하였을 때 대조약물보다도 더 효능적으로 강한 아낙필락시스 반응 억제효과를 보였다. [도2 참조]

실시예 5 항소양효과

체중 20g 전후의 BALB/c 마우스에 유산균 Lactobacillus plantarum K-1 BR 을 3일간 경구 투여하고 마지막 투여한 투여 1 시간 후에 각각 아크릴 관찰 상자(22×22×24cm)에 10 분간 두어 환경에 순화시킨 뒤 목뒤의 등털을 제거하고 히스타민 300μg/μL를 29 게이지 니들(gauge neddle)로 피하 주사한 뒤 즉시 관찰상자에 넣고 1 시간 동안 무인 조건에서 소양행동을 비디오카메라로 녹화하여 관찰하였다. 소양행동은 생쥐의 뒷발로 목뒤를 긁는 행동을 1 회로 간주하며 연속적인 긁는 행위를 할 때에는 1초를 넘기면 1회 추가 한 것으로 간주하며, 귀나 머리를 긁거나 앞발을 핥는 등의 행동은 소양행위로 간주하지 아니하였다.

유산균 (LPL, 1 ×10⁹CFU/mouse ; LPH,1×10¹⁰CFU/mouse)과 azelastine (AZ, 10 mg/kg) 은 histamine 투여하기 전 3일간 경구투여하였다.

그 결과 1x10¹⁰개의 유산균 Lactobacillus plantarum K-1 BR 을 투여하였을 때 대조약물보다도 우월하게 강한 아낙필락시스반응 억제효과를 보였다. [도3 (3A) 참조]

실시예 6 혈관투과성 평가 실험

수동형 피부아낙필락시스 모델동물 제작은 은 먼저 Dinitrophenol-bovine serum albumin (DNP-BSA)에 대한 IgE 혈청을 생리식염수로 희석한 10ug를 에테르로 마취시킨 생쥐의 등에 주사하고 수동감작시키고 48시간 후 DNP-HSA 0.2mg과 evans blue 1.6mg을 포함한 생리식염수 0.2ml를 꼬리정맥에 주사하고 30분후 경부탈골로 치사시켜 등에 누출된 evans blue 색소량을 측정했다. 생쥐의 등의 일정부위를 잘라 시험관에 넣고 1N-KOH 0.7 ml을 넣고 37도에서 하룻밤 동안 배양한다. 이 시험관에 0.6N 인산.아세톤 혼액 (5:13) 4ml를 가한 다음 진탕하고 여과하여 추출된 색소를 620nm에서 비색정량 했다. 검체는 생리식염수에 용해 또는 현탁하여 경구 또는 복강으로 항원투여 한시간 전에 투여했다. 유산균 Lactobacillus plantarum K-1 BR (LPL, 1 × 10⁹CFU/mouse;LPH,1×10¹⁰CFU/mouse)과 azelastine (AZ, 10 mg/kg) 은 histamine 투여하기 전 3일간 경구투여하였다.

그 결과 1x10¹⁰개의 유산균을 투여하였을 때 대조약물보다도 탁월하게 강한 혈관투과성 억제효과를 보였다. [도3 (3B) 참조]

실시예 7 Lactobacillus plantarum K-1 BR 유산균의 IgE, TNF-a, IL-1beta, IL-4 발현 억제효과

체중 20g 전후의 BALB/c 마우스에 유산균 Lactobacillus plantarum K-1 BR 을 3일간 경구 투여하고 마지막 투여한 투여 1 시간 후에 목뒤의 등털을 제거하고 히스타민 300㎍/μL를 29 게이지 니들(gauge neddle)로 피하 주사한 뒤 1 시간 후에 주사부위(1x1 cm)를 도려내 ice-cold lysis buffer (10 mM Tris, pH 7.5, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl₂, 0.05% Nonidet P-40, 1mM EGTA, 1:100 protease inhibitor cocktail ,and 1:100 phosphatase inhibitor cocktail)으로 용출했다. 이 용출한 액을 2,700 g, 4^oC에서 10 분간 원심분리했다. 이 상등액을 20,800 × g, 4^oC에서 15분간 원심분리했다 (IgE, IL-4, TNF-a, IL-1beta 분석에 사용했다). 상등액을 96웰(well)로 옮겨 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA, R&D systems (Minneapolis, MN, USA)로 측정하였다. .

유산균 Lactobacillus plantarum K-1 BR (LPL, 1 × 10⁹CFU/mouse ; LPH,1×10¹⁰CFU/mouse)과 azelastine (AZ, 10 mg/kg) 은 histamine 투여하기 전 3일간 경구투여하였다.

그 결과 1x10⁹, 1x10¹⁰개의 유산균 Lactobacillus plantarum K-1 BR 을 투여하였을 때 대조약물과 훨씬 우수할 정도로 IgE, IL-4, TNF-a, IL-1beta 의 발현을 억제하였다. [도4 (4A),(4B),(4C),(4D) 참조]

실시예 8

Lactobacillus plantarum K-1 BR 유산균의

NF-kB, AP-1 활성화 억제효과

체중 20g 전후의 BALB/c 마우스에 유산균 Lactobacillus plantarum K-1 BR 을 3일간 경구 투여하고 마지막 투여한 투여 1 시간 후에 목뒤의 등털을 제거하고 히스타민 300μg/μL를 29 게이지 니들(gauge neddle)로 피하 주사한 뒤 1 시간 후에 주사부위(1x1 cm)를 도려내 ice-cold lysis buffer (10 mM Tris, pH 7.5, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl₂ ,0.05% Nonidet P-40,1mMEGTA,1:100 protease inhibitor cocktail ,and 1: 100 phosphatase inhibitor cocktail)으로 용출했다. 이 용출한 액을 2,700 g, 4^oC에서 10 분간 원심분리했다. 이 상등액을 20,800 × g, 4^oC에서 15분간 원심분리했다. 이 침전물을 wash buffer (10 mM PIPES, pH 6.8, 300 mM sucrose, 3 mM MgCl₂ _,1mMEGTA,25mM NaCl,1: 100 protease inhibitor cocktail and 1: 100 phosphatase inhibitor cocktail)로 3회 원심분리하여 세척했다. 이 침전물을 현탁하여 NF-kB, AP-1 immunoblot 분석에 사용했다.

유산균 Lactobacillus plantarum K-1 BR (LPL, 1 × 10⁹CFU/mouse;LPH,1×10¹⁰CFU/mouse)과 azelastine (AZ, 10 mg/kg) 은 histamine 투여하기 전 3일간 경구투여하였다.

Immunoblot analysis

검체 lysate(40㎍)를 10% SDS polyacrylamide gel상에서 전기영동 한 후 PVDF (Millipore) membrane에 transfer한 후 membrane은 PBS에 녹인 2% skim milk용액으로 상온에서 1시간 동안 blocking하고, 다시 1% skim milk 용액에 1:500으로 희석한 primary antibody(NF-kB, AP-1, phosphor-AP-1, phosphor-NF-kB)를 2시간 동안 담가 천천히 진탕하였다. Primary antibody 희석용액을 버리고 세척 용액 (0.05% PBS-tween)으로 10분씩 두 번 세척 후 다시 1% skim milk 용액에 1:5000으로 희석한 secondary antibody를 1시간 동안 담가 천천히 진탕하였다. 위와 같이 secondary antibody 희석용액을 버리고 세척 용액으로 10분씩 세 번 세척하고 enhanced chemilluminescence system (PIERCE)을 이용하여 검출하였다.

그 결과 1x10¹⁰개의 유산균 Lactobacillus plantarum K-1 BR 을 투여하였을 때 대조약물에 비해서 NF-kB, AP-1의 활성화를 매우 우수하게 억제하였다.

실시예 9 탈과립 시험

RBL-2H3 세포는 한국 세포주 은행에서 분양받았으며, 10% FBS 및 L-글루타민이 함유된 DMEM 배지, 5% CO₂, 37℃에서 배양하였다. 일주일에 2-3번 정도 계대배양 하였다.

RBL-2H3 세포의 탈과립 저해 활성 측정은 RBL-2H3 세포(5×10⁵cells/ml)을 24 웰 플레이트에 0.8 mL씩 분주한 뒤 마우스 모노클로날 IgE (0.5ug/ml)을 첨가하여 하룻밤 배양함. 다음날 배지를 걷어내고 시라가니안 완충용액(siraganian buffer) (119 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.4 mM MgCl₂ ,25mM PIPES, 40mM NaOH, pH7.2)으로 0.5 mL씩 2 번 세척하였다. 다시 시라가니안 완충용액 (5.6mM 글루코오스, 1mM CaCl₂, 0.1%BSA첨가) 0.16 mL를 가해 37℃에서 10 분간 배양하였다. 이어서 검체를 0.04 mL 첨가하여 37℃에서 20 분간 배양하였다. 항원(antigen)인 DNP-BSA (1μg/ml) 0.02ml를 첨가하고 37에서 10 분간 배양하고 얼음 위에서 10 분간 방치하여 반응을 정지시켰다. 위의 반응액 중에 탈과립되어 유출되는 β-헥소사미니다제(β-hexosaminidase) 효소 활성을 측정하는 방법으로 탈과립 억제 효과를 평가하였다. 즉, 반응액을 원심분리한 후 96 웰 플레이트에 상등액 0.025 mL와 시트레이트 완충액(0.1M, pH 4.5)에 녹인 1 mM p-NAG(p-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide) 0.02 5mL를 37℃에서 1 시간 반응시켰다. 그리고 나서 0.1M Na₂CO₃ / NaHCO₃ 0.2mL를 첨가하여 반응을 정지한 후 ELISA 리더 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과 Lactobacillus plantarum K-1 BR은 탈과립를 억제하였으나, 그 효과는 강하지는 않았다.[도5 참조]

실시예 10 면역증강작용

세포의 phenotype 동정을 위한 세포염색

생쥐에cyclophosphamide 300mg/kg 투여하여 면역저하 모델 동물을 제작하고 익일부터 유산균 Lactobacillus plantarum K-1 BR를 (1x10⁸, 1x10⁹CFU)를 매일 1회씩 3일간 경구투여 투여했다

비장세포 및 골수세포를 채취하여 FACS buffer로 두 번 세척하고, FITC의 파장을 갖는 CD3 대응 항체 또는 PE의 파장을 갖는 NK1.1 에 대응하는 항체를 4℃의 암실에서 붙여 염색된 세포는 두 번 세척 후 FACS buffer에 녹인 1% paraformaldehyde로 고정시킨 후 FACS로 분석했다

그 결과 K-1 BR은 cyclophosphamide에 의해 감소한 NK 및 Tc 세포를 증가시켰다[도6 참조]

즉, LP는 phorbol 12'-myristate 13'-acetate (PMA)로 자극한 RBL-2H3 세포(rat basophilic leukemia)에서 전사인자인 NF-kB 및 c-jun 활성화뿐만 아니라 TNF-α 와 IL-4 의 발현을 탁월하게 억제했다. 또한 LP는 생쥐에 IgE-antigen 으로 유도된 수동형 피부과민 반응에 대해 강력한 억제효과를 보였으며, 생쥐당 1×10¹⁰섭취를 시켰을 때, 92.3%까지 억제하였다. 생쥐당 1×10¹⁰CFU의 LP을 섭취시시켰을 때도 histamine으로 유도한 소양행동을 75.4%까지 억제했다. LP는 히스타민에 의해 야기된 혈관 삼투압성을 크게 저해시켰다. LP는 histamine으로 유도한 혈관삼투압 증가를 억제하였으며, 이 효과는 LP의 소양행동 억제효과와 정비례하였다. LP ( 1×10¹⁰CFU)를 histamine에 의해 유도된 IL-4, IL-1β, TNF-α의 발현을 각각 92.7%, 94.5%, 99.2%을 저해했다. LP는 histamine에 의해 유도된 IgE도 93.6%까지 억제시켰다. 결과적으로 LP는 면역세포에서 전사인자인 NF B 및 AP-1의 활성화를 억제하여 IgE-switching cytokine IL-4 및 proinflammatory cytokines IL- 1와 TNF- 발현을 조절하여 항알러지 효과를 나타내며, 알레르기 질환, 아토피성 피부염, 비염, pruritus 등의 질병을 개선 및 치료할 수 있다.

본 발명은 상기한 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 유산균 Lactobacillus plantarum K-1 BR은 면역력증진 뿐 아니라 항알러지 효과를 나타내며, 알레르기 질환, 아토피성 피부염, 비염, pruritus 등의 질병을 개선 및 치료 할 수 있기 때문에 각종 건강기능식품, 의약품, 화장품, 애완용 및 가축의 질병치료 개선제로 활용이 충분하다

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11209P

20110920

<110> BIORHYTHM CO.LTD
<120> Lactobacillus plantarum, K-1 BR on antiallergic properties, anti
atopic dermatitis, anti rhinitis, anti pruritus. egulation of
level of immunity, microbial agent
<130> P-1412-1
<160> 1
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 504
<212> RNA
<213> Lactobacillus plantarum K-1 BR
<400> 1
agagtttgaa cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgaac 60
gaactctggt attgattggt gcttgcatca tgatttacat ttgagtgagt ggcgaactgg 120
tgagtaacac gtgggaaacc tgcccagaag cgggggataa cacctggaaa cagatgctaa 180
taccgcataa caacttggac cgcatggtcc gagtttgaaa gatggcttcg gctatcactt 240
ttggatggtc ccgcggcgta ttagctagat ggtggggtaa cggctcacca tggcaatgat 300
acgtagccga cctgagaggg taatcggcca cattgggact gagacacggc ccaaactcct 360
acgggaggca gcagtaggga atcttccaca atggacgaaa gtctgatgga gcaacgccgc 420
gtgagtgaag aagggtttcg gctcgtaaaa ctctgttgtt aaagaagaac atatctgaga 480
gtaactgttc aggtatgacg gtat 504

Claims

김치에서 분리동정되어 NF-kB 및 AP-1 전사인자의 활성화를 억제하는Lactobacillus plantarum K-1 BR 균주(수탁번호; KCCM11209P)