CN107109351A - 作为新型菌株的具有改善治疗过敏、遗传过敏性皮炎、鼻炎、搔痒症等及免疫力调节功能的植物乳杆菌k‑1 br菌株 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有抗过敏效果，能够改善治疗过敏性疾病、遗传过敏性皮炎、鼻炎、搔痒症(pruritus)、过敏反应(anaphylaxis)等疾病并调节免疫力的从泡菜分离及鉴定的作为乳酸菌的植物乳杆菌‑K‑1 BR(LP，L.plantarum‑K‑1 BR)。

Description

作为新型菌株的具有改善治疗过敏、遗传过敏性皮炎、鼻炎、 搔痒症等及免疫力调节功能的植物乳杆菌K-1 BR菌株
技术领域
本发明涉及如下的植物乳杆菌K-1 BR菌株，即，因西方化的饮食、文明的单一化的生活环境、不规则的生活习惯及压力等复杂的原因而导致肠道微生物群(Microbiota)的变化，因此，上述植物乳杆菌 K-1 BR菌株作为对抗多种消化性炎症疾病、免疫过敏性疾病的发生的乳酸菌的一种，具有改善治疗遗传过敏性皮炎、鼻炎等及免疫力调节功能。
背景技术
过敏是对异物(抗原，Allergen)产生特异性且变形的反应的生化学现象，此时，若排出的物质引起症状，则称为过敏原(Allergen)，将其结果出现的疾病称为过敏性疾病。
乳酸菌作为大量消耗碳水化合物来大量生产乳酸等有机酸的细菌，没有分解蛋白质并使之腐败的能力的有益菌。
与此相反，腐败菌为在人体内与拟杆菌(Bacteroides)属菌株一同分解蛋白质并产生氨、硫化氢、胺、吲哚、苯酚等有恶臭的细菌。最近，将乳酸菌称为益生菌(probiotics)(为生活(for the life))。
目前，根据多个菌株的形状将乳酸菌区分为球菌和杆菌，球菌有链球菌(Streptococcus)、片球菌(Pediococcus)、明串珠菌(Leuconos toc)等，杆菌有乳酸杆菌(Lactobacillus)、芽孢乳杆菌(Sporolactoba cillus)、双歧杆菌(Bifidobacterium)等。
乳酸菌与人类历史一同起源，为历史悠久的有益菌，如记载于希波克拉底的著书。
希波克拉底(Hippocrates)(460-377B.C.)记录了发酵食品对腹泻患者有效。
最初观察乳酸菌的研究人员推定为安东·列文虎克(Antony van Leeuwenhoek)，然而未能成为乳酸菌的发现者，最初发现乳酸菌的科学家为路易斯·巴斯德，他认为乳酸菌为腐败菌，但是之后在1899年， Tisser从粪便第一次发现作为乳酸菌的双歧杆菌(Bifidus)，在1900年，小儿科医生摩洛(Moro)在研究患有腹泻的儿童与健康儿童的粪便中的肠道菌群的区别的过程中，指出作为乳酸菌的嗜酸乳杆菌(Lactoba cillusacidophilus)为有益菌。
以利.梅契尼柯夫主张了在消化道内应栖息着有益的细菌才能长寿。推定为此主张为肠道细菌以对人体有益的乳酸菌栖息为前提。人体肠道存在对人体起好作用的菌和对人体起坏作用的菌。因压力或疲劳或老化等多种影响而失去肠道内环境的均衡。乳酸菌具有乳酸菌的乳糖不耐症改善效果、血液中的胆固醇降低效果、乳酸菌的便秘改善效果、乳酸菌的有害菌抑制效果、乳酸菌的偏头痛改善效果、乳酸菌的肝脏保护效果、乳酸菌的抗突变效果、乳酸菌的皮肤美容效果、乳酸菌的炎症性肠疾病(克隆氏症及大肠炎)改善效果、抗癌效果及免疫增强作用、抗过敏效果等。
若失去肠道内细菌的均衡，则出现肠道的状态变坏或引起便秘且皮肤变得粗糙等恶劣影响。恶劣影响不仅仅停留于此。成为问题的是，若失去肠道的均衡，则可引起各种过敏性疾病或多种生活习惯病。
肠道是人类最大的免疫器官。即，肠道与身体的免疫力及整个身体的状态有密切的关系。植物性乳酸菌增加有益的菌并维持肠道的均衡，因此改善健康状态。
好中球作为管理免疫的白细胞的中间体，用于吞噬入侵到体内的细菌等异物，其数量的增加暗示最终植物性乳酸菌使免疫力恢复。
美国ABC电台报道如下：在韩国多位科学家对感染于禽流感(A I)的13只鸡中，11只吃了与酸菜(sauerkraut)类似的韩国泡菜提取物后，开始恢复进行报告之后，最近，此发酵食品备受瞩目。
克服具有如大蒜、生姜、辣椒面、葱、盐等具有天然抗生力的材料的栖息环境，而发育增殖的泡菜乳酸菌，其细胞连接结构发生改变，并且其生成物也可能存在差异。克服这种环境而生成的乳酸菌整顿肠道内环境，由此不仅使皮肤或细胞回春，而且提高身体的免疫力，从而对花粉过敏或遗传过敏性皮炎等过敏性疾病及生活习惯疾的预防及改善有相当大的帮助。
过敏性疾病逐年增加，2000年代急剧增长至5％以上，若包括潜在的患者，则推定为超过10％。
以过敏的发生原因抗原抗体反应的结果来呈现的活体的生病过程且最常见的过敏反应为引起哮喘、过敏性鼻炎、花粉症及遗传过敏性皮炎等的即速发型过敏反应，有Ⅰ型超敏反应及Ⅳ型超敏反应，例如，慢性炎症反应。
如过敏反应等过敏性反应由肥胖细胞等对Fc受体的抗原、抗免疫球蛋白抗体(anti-IgE)、凝集素(lectin)等的结合、过敏毒素(anaph ylatoxin)等的刺激、钙离子载体(calcium ionopore)、复合物K48/80、可待因(codeine)等药物而产生，如合成皮质刺激激素。
并且，乳酸菌在人体内增加免疫机理来抑制引起疾病的病原性细菌的感染。若乳酸菌如此活化免疫系统，则即使病毒入侵人体，防御能力也将增加。泡菜乳酸菌消除禽流感病毒的方法也应为与此相同的方法。因此，分离、鉴定并寻找对人体有益的强有力的乳酸菌将能够维持人类的健康而带来幸福。
韩国公开专利公报公开号第1020050076374(2005.07.26)号公开了功能性产品及其制备方法，上述功能性产品包含通过提取于酒精或聚乙二醇并干燥来得到具有抗过敏及抗遗传过敏性皮炎效果并可抑制肠道细菌起因性氨的生产性的用于治疗过敏及炎症的豆类或在豆类提取物接种豆类嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、融合魏斯菌、罗伊氏乳杆菌、干酪乳杆菌、短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、两岐双岐杆菌、嗜热双歧杆菌、乳酸粪链球菌、嗜热链球菌中的至少一种来得到的具有抑制遗传过敏性皮炎和抗过敏及肠道有害细菌的氨生产的活性的豆类乳酸菌发酵物。
可知，从泡菜提取的益生菌摄取在遗传过敏性动物模型NC/Nga 小鼠中对免疫指标的影响，公开于韩国食品科学会刊第40卷第1号总第197号(2008年2月)的82-87页。
发明内容
技术问题
本发明为了解决上述问题而提出，人类生活的环境中生存着许多微生物。微生物栖息在从人的皮肤至消化道多种地方，将这些多种细菌称为正常微生物群，在这些肠道微生物群中，与人的健康具有最密切的关系的消化道菌株为乳酸菌。
肠道微生物群受宿主的环境，即，消化道内的pH(胃酸)、肠道运动、消化酶、粘液、胆汁等影响。例如，当人受到压力时，停止肠道运动，胃酸和肠液的分泌变多或变少，其结果肠道微生物群丧失均衡，严重时，将会产生菌交代症。
基于如上所述的原因，本发明的目的在于，提供现代人认为无法治愈的遗传过敏性皮炎症或由免疫力低下而引起的各种疾病等多种消化性炎症疾病、在因免疫过敏性疾病而发生的情况下，通过动物实验来确认各自的功能性，并由作为对比评价的健康材料的泡菜强有力表达的乳酸菌。
解决问题的方案
为了解决如上所述的问题，本发明的技术方案为提供从泡菜分离的抑制AP-1及NF-B活化的作为乳酸菌的植物乳杆菌K-1 BR(L.pl antarum-K-1 BR，LP)，具有改善治疗遗传过敏性皮炎、鼻炎等及免疫力调节功能的植物乳杆菌K-1 BR菌株(保藏编号：KCCM11209P)。
发明的效果
文明的单一化的生活环境、西方化的饮食、不规则的生活习惯及压力等复杂的原因而导致肠道微生物群的变化，因此，本发明可抑制多种消化性炎症疾病(腹泻、溃疡性大肠炎、过敏性大肠综合征)、免疫过敏性疾病(遗传过敏性皮炎、哮喘、各种过敏性疾病、糖尿病、关节炎等)、炎症性疾病及各种代谢性疾病)的发生，并且，可积极地改善治疗这些多种疾病。
将因免疫过敏性疾病而受损的肠道免疫系统转换为健康人的肠道微生物群，由此期待能够控制各种疾病。并且，乳酸菌能够调节肠道免疫系统来改善及治疗多种免疫疾病，例如，作为多种过敏性疾病的过敏反应、瘙痒反应等。
附图说明
图1为示出植物乳杆菌K-1 BR的由佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA)刺激的大鼠嗜碱性细胞白血病细胞(RBL-2H3)的白细胞介素-4(IL-4)、肿瘤坏死因子-α(TNF-alpha)表达(1A)及转录因子NF-kappaB、转录因子AP-1的活化(1B)抑制效果的曲线图。
图2为示出作为乳酸菌的植物乳杆菌K-1 BR对小鼠的由免疫球蛋白(IgE)诱导的被动皮肤过敏反应的抑制效果的曲线图。
图3为示出作为乳酸菌的植物乳杆菌K-1 BR对小鼠的由组胺诱导的瘙痒行为的抑制效果的曲线图。图3示出乳酸菌和氮卓斯汀(azel astine)的抗瘙痒效果(3A)和乳酸菌及氮卓斯汀的血管通透性抑制效果(3B)。
图4为示出作为乳酸菌的植物乳杆菌K-1 BR对小鼠的由组胺对白细胞介素-4(4A)、肿瘤坏死因子-α(4B)、白细胞介素-1β(IL-1b eta)(4C)及免疫球蛋白(4D)表达的抑制效果的曲线图。
图5为示出乳酸菌K-1 BR的脱颗粒抑制效果的曲线图。
图6为示出乳酸菌K-1 BR对由环磷酰胺(Cyclophosphamide)诱导的骨髓及脾脏的T(6B)及NK(6A)细胞数量减少的免疫抑制小鼠的效果的曲线图。
具体实施方式
本发明的新型乳酸菌的分离及鉴定
取10g的泡菜来制备泡菜破碎液。泡菜破碎条件为，使用搅拌机 (RPM搅拌机)以2000rpm充分破碎2分钟后，利用106倍的灭菌的蒸馏水稀释并涂抹于MRS(Man RogosaSharpe)琼脂(agar)培养基后，培养24小时，收集30个菌落，利用API 50CHL试剂盒(API 50CHL kit)进行分离鉴定，从而制备植物乳杆菌K-1 BR。
本发明涉及植物乳杆菌K-1 BR，即，从泡菜中搜索由佛波醇-12- 肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA，phorbol 12'-myristate 13'-acetate)诱导的大鼠嗜碱性细胞白血病细胞((Rat basophilic leukemia，RBL)-2 H3)的NF-kB及AP-1的活化的菌株，最强有力地抑制转录因子NF-k B及转录因子AP-1活化的菌株，2011年9月20日以保藏编号KCCM 11209P保藏于作为国际保藏机关的韩国微生物保存中心。
植物乳杆菌作为乳酸杆菌(Lactobacillus)中的乳酸菌，是杆状的革兰氏阳性杆菌。
一般情况下，植物乳杆菌作为不仅在诸多发酵食品，而且在厌氧性食品或食物等物质中所发现的乳酸菌种，广泛存在于自然界。
植物乳杆菌的大小为0.7～1.0×3.0～8.0μ，生存适当温度为29～3 3℃，为微好氧性菌。植物乳杆菌发酵阿拉伯糖(arabinose)、葡萄糖 (glucose)、果糖(fructose)、半乳糖(galactose)、麦芽糖(malto se)、蔗糖(sucrose)、右旋糖酐(dextran)、棉子糖(raffinose)及海藻糖(trehalose)等来生成乳酸。主要从腌菜类、西红柿等分离，如牛奶、奶酪、黄油、开菲尔(kefir)、发酵的香肠、发酵的土豆、谷物、面包的酸性面团(dough)、酸黄瓜或泡菜，是自然界中分布最广的乳酸菌中的一种。尤其，作为对韩国泡菜发酵起着重要作用的乳酸菌，盐耐性约为5.5％。
据报告，韩国泡菜中有约30余种的多种多样的乳酸菌等，随着泡菜的发酵、熟成、温度而生存的菌的种类不同。在泡菜的发酵初期，生长着称为肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)的菌，在发酵后期，生长着耐酸性强的杆形状的作为乳酸杆菌的植物乳杆菌。植物乳杆菌作为主要在泡菜发酵较多而有酸味时生长的菌，具有强的耐酸性及耐胆汁性。在欧洲，酸奶中添加作为益生菌菌株的植物乳杆菌。
针对本发明的植物乳杆菌K-1 BR菌株，分析革兰氏染色、植物乳杆菌K-1 BR菌株的一般特性及API糖利用性，针对此菌株的基因分析，利用QIAamp DNA小量提取试剂盒(QIAamp DNA Mini Kit) 来提取DNA后，对16S rRNA执行聚合酶链式反应(PCR)并进行序列分析的结果，对所得到的16S rRNA的序列进行比较(参照表1及表2)。
结果为革兰氏阳性杆菌，糖分析结果如表1所示，序列分析结果与植物乳杆菌非常类似，但并不相同。
表1
表2
K-1 BR菌株与植物乳杆菌的16S rRNA类似性
图1示出植物乳杆菌K-1 BR的由佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯刺激的大鼠嗜碱性细胞白血病细胞的白细胞介素-4、肿瘤坏死因子- α表达(1A)及转录因子NF-kappaB、转录因子AP-1的活化(1B)抑制效果。
利用20nM的佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PM)刺激大鼠嗜碱性细胞白血病细胞(2×105)，处理了作为乳酸菌的植物乳杆菌K -1 BR(LPL，0.2×109CFU/孔(well)；LPH，1109CFU/孔)。对正常组(NOR)仅以媒介物(vehicle)代替乳酸菌进行处理。通过酶联免疫吸附法(ELISA)来测定TNF-及白细胞介素-4，通过蛋白质印迹法 (immunoblotting)测定NF-B及AP-1。平均数(Mean)±标准差(S D)(n＝5)。#p<0.05vs.正常组(normal controlgroup)。*p<0.05 vs.利用佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯处理的组(PMA-treated group)。
图2示出作为乳酸菌的植物乳杆菌K-1 BR对小鼠的由免疫球蛋白诱导的被动皮肤过敏反应的抑制效果。将乳酸菌与作为对照药物的氮卓斯汀每日给药一次，给药3日。正常组为仅诱导媒介物的组，CO N为利用免疫球蛋白诱导过敏反应的组，LPL为给药免疫球蛋白和1 ×109CFU的植物乳杆菌K-1 BR的组，LPH为给药免疫球蛋白和1×1 010CFU的植物乳杆菌K-1 BR乳酸菌的组，AZ为给药免疫球蛋白和1 0mg/kg的氮卓斯汀的组。平均数±标准差(n＝5)。#p＜0.05vs.正常组。*p＜0.05vs.利用免疫球蛋白-抗原复合物处理的组(IgE-antigen complex-treated group)。
图3示出示出作为乳酸菌的植物乳杆菌K-1 BR对小鼠的由组胺诱导的瘙痒行为的抑制效果。图3示出乳酸菌和氮卓斯汀的抗瘙痒效果(3A)和乳酸菌及氮卓斯汀的血管通透性抑制效果(3B)。
将乳酸菌与作为对照药物的氮卓斯汀每日给药一次，给药3日。正常组为仅诱导媒介物的组，CON为利用免疫球蛋白诱导过敏反应的组，LPL为给药组胺和1×109CFU的植物乳杆菌K-1 BR的组，LPH 为给药组胺和1×1010CFU的植物乳杆菌K-1 BR乳酸菌的组，AZ为给药组胺和10mg/kg的氮卓斯汀的组。平均数±标准差(n＝5)。#p＜ 0.05vs.正常组。*p＜0.05vs.利用组胺处理的组(histamine-treated group)。
图4示出示出作为乳酸菌的植物乳杆菌K-1 BR对小鼠的由组胺对白细胞介素-4(4A)、肿瘤坏死因子-α(4B)、白细胞介素-1β(4 C)及免疫球蛋白(4D)表达的抑制效果。将乳酸菌与作为对照药物的氮卓斯汀每日给药一次，给药3日。正常组为仅诱导媒介物的组，CON为利用免疫球蛋白诱导过敏反应的组，LPL为给药组胺和1×109CF U的植物乳杆菌K-1 BR的组，LPH为给药组胺和1×1010CFU的植物乳杆菌K-1 BR乳酸菌的组，AZ为给药组胺和10mg/kg的氮卓斯汀的组。平均数±标准差(n＝5)。#p＜0.05vs.正常组。*p＜0.05vs.利用免疫球蛋白-抗原复合物处理的组。
图5示出乳酸菌K-1 BR的脱颗粒抑制效果。
图6示出示出乳酸菌K-1 BR对由环磷酰胺诱导的骨髓及脾脏的T (6B)及NK(6A)细胞数量减少的免疫抑制小鼠的效果。
以下，例举实施例来详细说明本发明的具体结构，但本发明的发明要求保护范围不仅仅限于下述实施例。
实施例1本发明的新型乳酸菌的分离及鉴定
取10g泡菜的来制备泡菜破碎液。泡菜破碎条件为，使用搅拌机 (RPM搅拌机)以2000rpm充分破碎2分钟后，利用106倍的灭菌的蒸馏水稀释并涂抹于MRS(Man RogosaSharpe)琼脂培养基后，培养24小时，收集30个菌落，利用API 50CHL试剂盒进行分离鉴定，从而制备植物乳杆菌K-1 BR。
植物乳杆菌K-1 BR的16S rRNA序列
实施例2肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-4的测定
利用杜氏改良依格尔培养基(DMEM)在37℃的温度下有水分的 5％的二氧化碳(CO2)培养箱中培养大鼠嗜碱性细胞白血病细胞(3 ×106细胞)，使用胰蛋白酶(trypsin)-乙二胺四乙酸(EDTA)溶液使具有固着性的细胞漂浮，并进行分离回收其来用于实验。24孔(we ll)中每孔接种5×105cell/well的大鼠嗜碱性细胞白血病细胞后，向小鼠的单克隆(monoclonal)细胞中加入0.5μg/ml的免疫球蛋白，在培养箱中培养12小时并进行增减。利用0.5ml的siraganian缓冲剂(119m M的NaCl、5mM的KCl、0.4mM的MgCl2、25mM的哌嗪-1，4-二乙磺酸(PIPES)、40mM的NaOH，pH为7.2)清洗细胞后，加入0.16 的siraganian缓冲剂(加入5.6mM的葡萄糖、1mM的CaCl2、0.1％的牛血清白蛋白(BSA))后，在37℃的培养箱中培养了10分钟。
之后，加入0.04ml的在60℃的温度下处理30分钟的本发明的作为乳酸菌的植物乳杆菌K-1 BR(2×108或1×109CFU/ml)后，经过2 0分钟后，接着利用0.02ml的佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(1μg/ ml)在37℃的温度下活化细胞40分钟后，在2000rpm下离心分离10 分钟，将0.025ml的上清液移到96孔，用Endogen酶联免疫吸附试剂盒(Elisa kit，美国)测定了白细胞介素-4和肿瘤坏死因子-α。
实施例3免疫印迹分析(Immunoblot analysis)
利用杜氏改良依格尔培养基在37℃的温度下有水分的5％的二氧化碳培养箱中培养大鼠嗜碱性细胞白血病细胞(3×106细胞)，使用胰蛋白酶-乙二胺四乙酸溶液使具有固着性的细胞漂浮，并进行分离回收其来用于实验。24孔中每孔接种5×105cell/well的大鼠嗜碱性细胞白血病细胞后，向小鼠的单克隆细胞中加入0.5μg/ml的免疫球蛋白，在培养箱中培养12小时并进行增减。利用0.5ml的siraganian缓冲剂 (119mM的NaCl、5mM的KCl、0.4mM的MgCl2、25mM的哌嗪-1, 4-二乙磺酸、40mM的NaOH，pH为7.2)清洗细胞后，加入0.16ml 的siraganian缓冲剂(加入5.6mM的葡萄糖、1mM的CaCl2、0.1％的牛血清白蛋白)后，在37℃的培养箱中培养了10分钟。
之后，加入0.04ml的在60℃的温度下处理30分钟的本发明的作为乳酸菌的植物乳杆菌K-1 BR(2×108或1×109CFU/ml)后，经过2 0分钟后，接着利用0.02ml的佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(1μg/ ml)在37℃的温度下活化细胞40分钟后，在2000rpm下离心分离10 分钟，加入0.1ml的低渗缓冲液(hypotonic buffer)(10mM的Tris- HCl、1.5mM的MgCl2、1mM的二硫苏糖醇(DTT)、0.1％的乙基苯基聚乙二醇(NP-40)、5μg/ml的胃蛋白酶抑制剂(pepstatin)、5μg/ ml的抑肽酶(aprotinin))来悬浮后，在冰上放置15分钟。
并且，在4℃的温度下，在12000rpm下离心分离15分钟后，取作为上清液的细胞质内所有可溶蛋白(cytosol fraction)，在沉淀物中再次加入0.1ml的提取缓冲液(extraction buffer)(10mM的Tris-HCl、 50mM的KCl、300mM的NaCl、1mM的二硫苏糖醇、5μg/ml的胃蛋白酶抑制剂、5μg/ml的抑肽酶)来悬浮后，在冰上放置30分钟，并且，在4℃的温度下，在12000rpm下离心分离30分钟后，取作为上清液的细胞核内所有可溶蛋白(nuclearfraction)。在10％的十二烷基硫酸钠 (SDS)聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel)状态下对细胞裂解物(C ell lysate，40μg)进行电泳后，转移(transfer)至聚偏氟乙烯(微孔)(PVDF(Millipore))膜(membrane)后，在常温下利用溶解于磷酸缓冲盐溶液(PBS)的2％脱脂牛奶(skim milk)溶液对膜进行封闭(blocking)处理1小时，在1％的脱脂牛奶溶液中浸渍以1：500稀释的一抗(primary antibody)(NF-kB、AP-1、phosphor-AP-1、phospho r-NF-kB)2小时后，缓慢地震荡。去除一抗稀释溶液，利用清洗溶液(0.05％的磷酸缓冲盐溶液-吐温(tween))清洗两次，每次清洗10 分钟后，在1％的脱脂牛奶溶液中再次浸渍以1：5000稀释的二抗(se condary antibody)1小时，并缓慢地震荡。如上，去除二抗稀释溶液，利用清洗溶液清洗三次，每次清洗10分钟，利用增强化学发光体系(e nhancedchemilluminescence system)(PIERCE)进行检测。
其结果，在多种泡菜乳酸菌中植物乳杆菌K-1 BR最有力有效地抑制了由佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯活化的大鼠嗜碱性细胞白血病细胞的白细胞介素-4及肿瘤坏死因子-α的表达。(参照图1的(1A) 部分、(1B)部分)或者植物乳杆菌K-1 BR非常优选地抑制了作为肿瘤坏死因子-α的转录因子的NF-kB的活化(p-p65)及作为白细胞介素-4的转录因子的AP-1的活化(p-c-jun)。
实施例4被动皮肤过敏反应(抗过敏)测定试验
在制作被动皮肤过敏性反应模型动物时，首先，将利用生理盐水稀释的10μg的与二硝基苯酚-牛血清白蛋白(DNP-BSA，Dinitropheno l-bovine serum albumin)有关的免疫球蛋白血清注射于用乙醚麻醉的小鼠的背部来使小鼠被动致敏，48小时后，将包含0.2mg的DNP-HA S和1.6mg的埃文斯蓝(evans blue)的0.2ml的生理盐水注射于尾部静脉，30分钟后，以颈部脱臼的方式使小鼠致死，来测定暴露于背部的伊文思蓝色素量。切割小鼠背部的规定部位放入试管中，加入0.7ml 的1N-KOH，并在37℃的温度下培养过夜，在此试管中加入4ml的0. 6N磷酸-丙酮混合液(5：13)后，对通过震荡并过滤来提取的色素在 620nm下进行比色定量。在给药抗原一小时之前，通过使试料溶解或悬浮于生理盐水来进行口服给药或腹腔给药。
在给药免疫球蛋白之前，口服给药作为乳酸菌的植物乳杆菌K-1 BR(LPL，1×109CFU/小鼠(mouse)；LPH，1×1010CFU/小鼠)和氮卓斯汀(AZ，10mg/kg)3日。
其结果，当给药1×1010个的作为乳酸菌的植物乳杆菌K-1 BR时，呈现出比对照药物更有效地抑制过敏反应的效果。(参照图2)
实施例5抗瘙痒效果
向体重为20g左右的BALB/c小鼠口服给药3日作为乳酸菌的植物乳杆菌K-1 BR，在最后给药1小时之后，分别放入压克力观察箱(2 2cm×22cm×24cm)10分钟，在环境中进行循环后，去除后颈的毛，使用29计量注射针(gauge neddle)皮下注射300μg/μL的组胺后，立即放入观察箱中，在无人条件下，用摄像机摄像1小时来观察瘙痒行为。将小鼠用后脚挠后颈的行为视为一次的瘙痒行为，当连续进行挠的行为时，若超过1秒，则视为增加一次，不将挠耳朵或挠头或舔前脚等行为视为瘙痒行为。
在给药组胺之前，口服给药乳酸菌(LPL，1×109CFU/小鼠；LP H，1×1010CFU/小鼠)和氮卓斯汀(AZ，10mg/kg)3日。
其结果，当给药1×1010个的作为乳酸菌的植物乳杆菌K-1 BR时，呈现出比对照药物更优越地抑制过敏反应的效果。(参照图3的(3A) 部分)
实施例6血管通透性评价实验
在制作被动皮肤过敏性反应模型动物时，首先，将利用生理盐水稀释的10μg的与二硝基苯酚-牛血清白蛋白有关的免疫球蛋白血清注射于用乙醚麻醉的小鼠的背部来使小鼠被动致敏，48小时后，将包含 0.2mg的DNP-HAS和1.6mg的埃文斯蓝的0.2ml的生理盐水注射于尾部静脉，30分钟后，以颈部脱臼的方式使小鼠致死，来测定暴露于背部的伊文思蓝色素量。切割小鼠背部的规定部位放入试管中，加入0.7 ml的1N-KOH，并在37℃的温度下培养过夜，在此试管中加入4ml的 0.6N磷酸-丙酮混合液(5：13)后，对通过震荡并过滤来提取的色素在620nm下进行比色定量。在给药抗原一小时之前，通过使试料溶解或悬浮于生理盐水来进行口服给药或腹腔给药。在给药组胺之前，口服给药作为乳酸菌的植物乳杆菌K-1 BR(LPL，1×109CFU/小鼠；LP H，1×1010CFU/小鼠)和氮卓斯汀(AZ，10mg/kg)3日。
其结果，当给药1×1010个的乳酸菌时，呈现出比对照药物更卓越地抑制血管通透性的效果。(参照图3的(3B)部分)
实施例7植物乳杆菌K-1 BR乳酸菌抑制免疫球蛋白、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β、白细胞介素-4表达的效果
向体重为20g左右的BALB/c小鼠口服给药3日作为乳酸菌的植物乳杆菌K-1 BR，在最后给药1小时后，去除后颈的毛，使用29计量注射针皮下注射300μg/μL的组胺1小时后，剜出注射部位(1cm×1 cm)并用冷裂解缓冲液(ice-cold lysis buffer)(10mM的Tris、pH 为7.5、10mM的NaCl、3mM的MgCl2、0.05％的乙基苯基聚乙二醇(N onidet P-40)、1mM的乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)、 1：100的蛋白酶抑制剂混合物(protease inhibitorcocktail)、1：100 的蛋白磷酸酶抑制剂混合物(phosphatase inhibitor cocktail))进行洗脱。在4℃的温度下对2700g的所洗脱的液体进行离心分离10分钟。在4℃的温度下对液20800xg的其上清进行离心分离15分钟(用于免疫球蛋白、白细胞介素-4、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β的分析)。将上清液移到96孔，通过酶联免疫吸附法(Enzyme-linkedimmunoso rbent assay，ELISA，R&D systems)(明尼阿波利斯(Minneapolis)， MN，USA)进行测定。
在给药组胺之前，口服给药作为乳酸菌的植物乳杆菌K-1 BR(L PL，1×109CFU/小鼠；LPH，1×1010CFU/小鼠)和氮卓斯汀(AZ，1 0mg/kg)3日。
其结果，当给药1×109、1×1010个的作为乳酸菌的植物乳杆菌K -1 BR时，与对照药物相比，以更优越的程度抑制了免疫球蛋白、白细胞介素-4、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β的表达。(参照图4的 (4A)部分、(4B)部分、(4C)部分、(4D)部分)
实施例8
植物乳杆菌K-1 BR乳酸菌抑制NF-kB、AP-1活化的效果
向体重为20g左右的BALB/c小鼠口服给药3日作为乳酸菌的植物乳杆菌K-1 BR，在最后给药1小时后，去除后颈的毛，使用29计量注射针皮下注射300μg/μL的组胺1小时后，剜出注射部位(1cm×1 cm)并用冷裂解缓冲液(10mM的Tris、pH为7.5、10mM的NaCl、3 mM的MgCl2、0.05％的乙基苯基聚乙二醇、1mM的乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸、1：100的蛋白酶抑制剂混合物、1：100的蛋白磷酸酶抑制剂混合物)进行洗脱。在4℃的温度下对2700g的所洗脱的液体进行离心分离10分钟。在4℃的温度下对液20800xg的其上清进行离心分离15分钟。利用清洗缓冲液(wash buffer)(10mM的哌嗪-1，4 -二乙磺酸、pH为6.8、300mM的蔗糖、3mM的MgCl2、1mM的乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸、25mM的NaCl、1:100的蛋白酶抑制剂混合物和1:100的蛋白磷酸酶抑制剂混合物)对其沉淀物进行离心分离3次并进行清洗。悬浮其沉淀物来用于NF-kB、AP-1免疫印迹分析。
在给药组胺之前，口服给药作为乳酸菌的植物乳杆菌K-1 BR(L PL，1×109CFU/小鼠；LPH，1×1010CFU/小鼠)和氮卓斯汀(AZ，1 0mg/kg)3日。
免疫印迹分析
在10％的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel) 状态下对试料裂解物(40μg)进行电泳后，转移至聚偏氟乙烯(微孔) 膜后，在常温下利用溶解于磷酸缓冲盐溶液的2％脱脂牛奶溶液对膜进行封闭处理1小时，在1％的脱脂牛奶溶液中浸渍以1：500稀释的一抗(NF-kB、AP-1、phosphor-AP-1、phosphor-NF-kB)2小时后，缓慢地震荡。去除一抗稀释溶液，利用清洗溶液(0.05％的磷酸缓冲盐溶液 -吐温)清洗两次，每次清洗10分钟后，在1％的脱脂牛奶溶液中再次浸渍以1：5000稀释的二抗1小时，并缓慢地震荡。如上，去除二抗稀释溶液，利用清洗溶液清洗三次，每次清洗10分钟，利用增强化学发光体系(PIERCE)进行检测。
其结果，当给药1×1010个作为乳酸菌的植物乳杆菌K-1 BR时，与对照药物相比，非常优秀地抑制了NF-kB、AP-1的活化。
实施例9脱颗粒试验
从韩国细胞株银行购买大鼠嗜碱性细胞白血病细胞，在含有10％的胎牛血清(FBS)及L-谷氨酰胺的杜氏改良依格尔培养基中，在5 ％的二氧化碳、在37℃的温度下进行了培养。一周继代培养了2～3次左右。
在进行大鼠嗜碱性细胞白血病细胞的脱颗粒抑制活性测定时，24 孔板中每孔接种0.8mL的大鼠嗜碱性细胞白血病细胞(5×105cell/ml) 后，添加小鼠单克隆免疫球蛋白(0.5μg/ml)培养过夜。次日去除培养基，利用siraganian缓冲溶液(119mM的NaCl、5mM的KCl、0.4mM 的MgCl2、25mM的哌嗪-1，4-二乙磺酸、40mM的NaOH，pH为7.2) 清洗两次，每次用0.5mL清洗。再次加入0.16mL的siraganian缓冲溶液(添加5.6mM的葡萄糖、1mM的CaCl2、0.1％的牛血清白蛋白)，在37℃的温度下培养10分钟。接着，添加0.04mL的试料，在37℃的温度下培养20分钟。添加0.02ml的作为抗原(antigen)的二硝基苯酚 -牛血清白蛋白(1g/ml)，在37℃的温度下培养10分钟，并在冰上放置10分钟来停止反应。以测定被脱颗粒并暴露于上述反应液中的β- 氨基己糖苷酶(β-hexosaminidase)的酶活性的方法来评价脱颗粒抑制效果。即，离心分离反应液后，在96孔板中，在37℃的温度下使0.0 25mL的上清液与0.025mL的溶解于柠檬酸盐缓冲液(0.1M，pH为4. 5)的1mM的对硝基苯基N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷(p-NAG，p-nitr ophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide)反应1小时。然后，添加0.2mL 的0.1M的Na2CO3/NaHCO3来停止反应后，用酶联免疫吸附仪在405n m下测定吸光度。
其结果，虽然植物乳杆菌K-1 BR抑制了脱颗粒，但其效果并不强。(参照图5)
实施例10免疫增强作用
用于鉴定细胞的表型(phenotype)的细胞染色
向小鼠给药300mg/kg的环磷酰胺来制作免疫低下模型动物，次日开始将作为乳酸菌的植物乳杆菌K-1 BR(1×108，1×109CFU)每日口服给药一次，给药3日。
收集脾脏细胞及骨髓细胞，用荧光活化细胞分选(FACS)缓冲液 (buffer)清洗两次，对在4℃的暗室粘贴与具有异硫氰酸荧光素(FI TC)的波长的CD3相对应的抗体或与具有PE的波长的NK1.1相对应的抗体而被染色的细胞进行清洗两次后，利用溶解于荧光活化细胞分选缓冲液的1％的多聚甲醛(paraformaldehyde)固定后，通过荧光活化细胞分选仪进行分析。
其结果，K-1 BR使随着环磷酰胺而减少的NK及Tc细胞增加。 (参照图6)
即，在利用佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯刺激的大鼠嗜碱性细胞白血病细胞(rat basophilic leukemia)中，LP不仅卓越地抑制了作为转录因子的NF-kB及c-jun的活化，而且还抑制了肿瘤坏死因子-α及白细胞介素-4的表达。并且，LP呈现出对小鼠的由免疫球蛋白抗原诱导的被动皮肤过敏反应的强有力的抑制效果，当使每只小鼠摄取1 ×1010时，抑制率达到92.3％。当使每只小鼠摄取1×1010CFU的LP 时，由组胺诱导的瘙痒行为的抑制率也达到了75.4％。LP大大抑制了由组胺引起的血管渗透性。LP抑制了由组胺诱导的血管渗透性的增加，其效果与LP的瘙痒行为抑制效果成正比。LP(1×1010CFU)分别对由组胺诱导的白细胞介素-4、白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α的表达抑制率达到了92.7％、94.5％、99.2％。LP对由组胺诱导的免疫球蛋白的抑制率达到了93.6％。最终，LP在免疫细胞中抑制作为转录因子的 NF B及AP-1的活化来调节作为免疫球蛋白-转换因子(switching cytokine)的白细胞介素-4及作为促炎细胞因子(proinflammatory cytoki nes)的白细胞介素-1β和肿瘤坏死因子-α的表达，从而呈现出抗过敏效果，并能够改善及治疗过敏性疾病、遗传过敏性皮炎、鼻炎、搔痒症等疾病。
产业上的可利用性
本发明为了解决上述问题而提出，作为乳酸菌的植物乳杆菌K-1 BR不仅增加免疫力，还呈现抗过敏效果，由于能够改善及治疗过敏性疾病、遗传过敏性皮炎、鼻炎、搔痒症等疾病，因此充分地用作各种健康功能食品、医药品、化妆品、宠物及家畜的疾病治疗改善剂。
序列表
<110> （株）生命工学节奏
<120> 作为新型菌株的具有改善治疗过敏、遗传过敏性皮炎、鼻炎、搔痒症等及免疫力调节功能的植物乳杆菌K-1 BR菌株
<130> P-1412-1
<150> KR 10-2014-0175693
<151> 2014-12-09
<160> 1
<170> KoPatentIn
<210> 1
<211> 504
<212> RNA
<213> Unknown
<220>
<223> Lactobacillus plantarum K-1 BR
<400> 1
agagtttgaa cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgaac 60
gaactctggt attgattggt gcttgcatca tgatttacat ttgagtgagt ggcgaactgg 120
tgagtaacac gtgggaaacc tgcccagaag cgggggataa cacctggaaa cagatgctaa 180
taccgcataa caacttggac cgcatggtcc gagtttgaaa gatggcttcg gctatcactt 240
ttggatggtc ccgcggcgta ttagctagat ggtggggtaa cggctcacca tggcaatgat 300
acgtagccga cctgagaggg taatcggcca cattgggact gagacacggc ccaaactcct 360
acgggaggca gcagtaggga atcttccaca atggacgaaa gtctgatgga gcaacgccgc 420
gtgagtgaag aagggtttcg gctcgtaaaa ctctgttgtt aaagaagaac atatctgaga 480
gtaactgttc aggtatgacg gtat 504
PCT/RO/134表

Claims (1)

1.一种植物乳杆菌K-1BR菌株，其特征在于，从泡菜分离鉴定并抑制转录因子NF-kB及转录因子AP-1的活化，上述种植物乳杆菌K-1BR菌株的保藏编号为KCCM11209P。
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PCT/KR2015/006103 WO2016093450A1 (ko) 2014-12-09 2015-06-17 신규한 균주로 알러지, 아토피성 피부염, 비염, 가려움증 등의 개선치료 및 면역력조절 기능을 갖는 락토바실러스 플랜타럼 k-1 br 균주

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