CN115960737A - 用于促进益生菌生长的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于促进益生菌生长的方法。本发明揭示一种用于促进益生菌生长的方法，其包括：将该益生菌培养于一含有一乳酸菌菌株组合的发酵产物的培养基中。
Description
技术领域
本发明涉及用于促进益生菌(probiotics)生长的方法。
背景技术
益生菌(probiotics)是一种有益于健康的活的微生物食品成分(microbial foodingredient)，可选择性地刺激肠道中的原生细菌(native bacteria)的生长。益生菌已被发现到具有抑制肠胃道病原菌生长、缓和乳糖不耐症(lactose intolerance)、免疫调节(immunoregulation)、抗癌(anti-cancer)以及降血压等功效。目前已知可作为益生菌使用的微生物包括乳杆菌属(Lactobacillus)、双叉杆菌属(Bifidobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、酵母菌属(Saccharomyces)、链球菌属(Streptococcus)等物种。
益生元(prebiotics)是人体无法消化的多醣(polysaccharide)与寡醣(oligosaccharide)类化合物，能够选择性地促进肠内菌(特别是益生菌)的活性与生长。目前常见的益生元包括，果寡糖(fructooligosaccharides)、菊糖(inulin)、寡木醣(xylo-oligosaccharides)、果胶寡醣(pectic oligosaccharides)以及巴拉金糖(palatinose)等。
目前已有研究显示，特定种类的益生元仅能对特定种类的益生菌发挥生长促进效用。例如，在
R.et al.(2016),Int.J.Biol.Macromol.,89:669-676中，
R.等人分别使用菊糖以及巴拉金糖来培养干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)A11、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)B13、乳酸乳球菌乳亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)DSM 20729以及嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)DSM 20079，而实验结果发现，菊糖仅能促进副干酪乳杆菌B13的生长，至于巴拉金糖则皆无法促进该等益生菌的生长。
因此，本领域中仍然存在有一需要去开发能够有效地促进各种不同益生菌生长的方法。
发明内容
于本发明中，申请人经实验而发现到，组合使用唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius subsp.salicinius)AP-32(CCTCC No.M 2011127)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LPL28(CGMCC No.17954)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)TYCA06(CGMCC No.15210)以及长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacteriumlongum subsp.infantis)BLI-02(CGMCC No.15212)的发酵产物能够有效地促进各种不同益生菌生长，且其效用明显优于习知的益生元。
于是，在第一个方面，本发明提供一种用于促进益生菌生长的方法，其包括：将该益生菌培养于一含有一乳酸菌菌株组合的发酵产物的培养基中，其中该乳酸菌菌株组合包含有：唾液乳杆菌AP-32、植物乳杆菌LPL28、嗜酸乳杆菌TYCA06，以及长双歧杆菌婴儿亚种BLI-02。
较佳地，该发酵产物是使用菌数比落在1：0.2：0.2：0.2至1：5：5：5的范围内的唾液乳杆菌AP-32、植物乳杆菌LPL28、嗜酸乳杆菌TYCA06以及长双歧杆菌婴儿亚种BLI-02进行培养而被制得的一液态培养物。
较佳地，该菌数比是1：1：1：1。
较佳地，该液态培养物经固液分离处理而实质上不含有菌体。
较佳地，该益生菌是选自于由下列所构成的群组：乳杆菌属物种(Lactobacillusspp.)、乳球菌属物种(Lactococcus spp.)、小球菌属物种(Pediococcus spp.)、肠球菌属物种(Enterococcus spp.)、链球菌属物种(Streptococcus spp.)、双歧杆菌属物种(Bifidobacterium spp.)、芽孢杆菌属物种(Bacillus spp.)、明串珠菌属物种(Leuconostoc spp.)，以及它们的组合。
较佳地，该乳杆菌属物种是选自于由下列所构成的群组：加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、戴白氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌，以及它们的组合。
较佳地，该乳球菌属物种是乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。
较佳地，该链球菌属物种是嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)。
较佳地，该双歧杆菌属物种是选自于由下列所构成的群组：动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)，以及它们的组合。
附图说明
下面结合附图及实施例来对本发明进行详细说明，所以本发明在上述以及其他目的与特征，可通过参照下文的描述、随文检附的权利要求书和伴随的图式而变得更为明显，附图中：
图1显示各组鼠李糖乳杆菌MP108被处理以不同的乳酸菌发酵产物后所测得的相对生长倍数，其中“*”、“**”与“***”分别表示当与对照组作比较，p＜0.05、p＜0.01与p＜0.001；
图2显示各组鼠李糖乳杆菌MP108被处理以乳酸菌发酵产物以及各种益生元后所测得的相对生长倍数，其中“*”、“**”与“***”分别表示当与对照组作比较，p＜0.05、p＜0.01与p＜0.001；
图3显示各组动物双歧杆菌乳亚种CP-9被处理以乳酸菌发酵产物以及各种益生元后所测得的相对生长倍数，其中“*”与“**”分别表示当与对照组作比较，p＜0.05与p＜0.01；以及
图4显示各组混合益生菌被处理以乳酸菌发酵产物以及各种益生元后所测得的相对生长倍数，其中“*”与“**”分别表示当与对照组作比较，p＜0.05与p＜0.01。
具体实施方式
为了这本说明书的目的，将被清楚地了解的是：文字“包含有(comprising)”意指“包含但不限于”，以及文字“包括(comprises)”具有一对应的意义。
除非另外有所定义，在本文中所使用的所有技术性与科学术语具有本领域技术人员所共同了解的意义。一本领域技术人员会认知到许多与那些被描述于本文中者相似或等效的方法和材料，它们可被用于实施本发明。当然，本发明决不受到所描述的方法和材料的限制。
本发明提供一种用于促进益生菌(probiotics)生长的方法，其包括：将该益生菌培养于一含有一乳酸菌菌株组合的发酵产物的培养基中，其中该乳酸菌菌株组合包含有：唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius subsp.salicinius)AP-32(CCTCC No.M2011127)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LPL28(CGMCC No.17954)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)TYCA06(CGMCC No.15210)，以及长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp.infantis)BLI-02(CGMCC No.15212)。
依据本发明，该含有发酵产物的培养基可藉由对一适于乳酸菌生长的基础培养基添加该发酵产物而被制得。较佳地，该基础培养基中添加有0.1-10wt％的发酵产物，更佳地，0.25-0.5wt％的发酵产物。在本发明的一个较佳具体例中，该基础培养基中添加有0.25wt％的发酵产物。在本发明的另一个较佳具体例中，该基础培养基中添加有0.5wt％的发酵产物。
依据本发明，适于乳酸菌生长的基础培养基是本领域技术人员所熟知的，并且可以是自行配制的，或者是商业上可购得的产品，这包括，但不限于：MRS肉汤培养基(MRSbroth)。
依据本发明，适用于本发明的基础培养基可包含有一选自于由下列所构成的群组中的碳源(carbon source)：葡萄糖(glucose)、果糖(fructose)、乳糖(lactose)、蔗糖(sucrose)、麦芽糖(maltose)、半乳糖(galactose)、甘露糖(mannose)、海藻糖(trehalose)、淀粉(starch)、马铃薯淀粉(potato starch)、麦芽萃取物(malt extract)、麦芽糊精(maltodextrin)，以及它们的组合。较佳地，该基础培养基包含有1-5wt％的葡萄糖。在本发明的一个较佳具体例中，该基础培养基包含有5wt％的葡萄糖。
依据本发明，适用于本发明的基础培养基可包含有一选自于由下列所构成的群组中的氮源(nitrogen source)：(NH4)2SO4、(NH4)3PO4、NH4NO3、NH4Cl、酪蛋白胺基酸(casaminoacid)、蛋白胨(peptone)、聚蛋白胨(polypeptone)、胰化胨(tryptone)、肉类萃取物(meatextract)、酵母萃取物(yeast extract)、酵母粉(yeast powder)、牛奶、脱脂奶粉、大豆粉(soybean flour)、乳清，以及它们的组合。较佳地，该基础培养基包含有2-15wt％的脱脂奶粉、3-10wt％的蛋白胨以及1-5wt％的酵母萃取物。在本发明的一个较佳具体例中，该基础培养基包含有12wt％的脱脂奶粉、7wt％的蛋白胨以及3wt％的酵母萃取物。
如本文中所使用的，术语“培养(culturing)”、“发酵(fermentation)”以及“培育(cultivation)”可被交换地使用。有关培养的操作程序与参数条件等是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。在此方面，可以参考，例如，Hsieh P.S.et al.(2013),New Microbiol.,36:167-179。
依据本发明，该培养可在一范围落在25℃至40℃内的温度下被进行。在本发明的一个较佳具体例中，该培养是于37℃下被进行。
依据本发明，该培养可被进行历时在一范围落在6至12小时内的时间。在本发明的一个较佳具体例中，该培养被进行历时6小时。
依据本发明，该发酵产物是使用菌数比落在1：0.2：0.2：0.2至1：5：5：5的范围内的唾液乳杆菌AP-32、植物乳杆菌LPL28、嗜酸乳杆菌TYCA06以及长双歧杆菌婴儿亚种BLI-02进行培养而被制得的一液态培养物。在本发明的一个较佳具体例中，唾液乳杆菌AP-32、植物乳杆菌LPL28、嗜酸乳杆菌TYCA06以及长双歧杆菌婴儿亚种BLI-02的菌数比是1：1：1：1。
依据本发明，适用于该乳酸菌菌株组合的培养基与培养条件是如上所述。
依据本发明，该液态培养物可经固液分离处理而实质上不含有(substantiallyfree of)菌体。
如本文中所使用的，术语“实质上不含有”意指一被具体指明的组分缺少有意义的含量。较佳地，该组分的含量对于该乳酸菌菌株组合的发酵产物的性质不具有可测量的影响(measurable effect)。更佳地，该乳酸菌菌株组合的发酵产物完全不含有该组分。
依据本发明，该固液分离处理是选自于下列所构成的群组：离心处理(centrifugation treatment)、过滤处理(filtration treatment)、浓缩处理(concentration treatment)，以及它们的组合。在本发明的一个较佳具体例中，该固液分离处理是离心处理。
依据本发明，该液态培养物可进一步进行一选自于下列的干燥处理而呈粉末状：冷冻-干燥(freeze-drying)、喷雾干燥(spray-drying)，以及流化床干燥(bed drying)。
如本文中所使用的，术语“益生菌”与“益生性微生物(probiotic microbes)”可被交换地使用，并且意指活性微生物(live microorganisms)的制备物(preparations)，当被一人类或动物摄食(ingested)后，该等微生物可以维持(remain)并存活在胃肠道中，而且能够发挥所欲的效用。
依据本发明，该益生菌可选自于由下列所构成的群组：乳杆菌属物种(Lactobacillus spp.)、乳球菌属物种(Lactococcus spp.)、小球菌属物种(Pediococcusspp.)、肠球菌属物种(Enterococcus spp.)、链球菌属物种(Streptococcus spp.)、双歧杆菌属物种(Bifidobacterium spp.)、芽孢杆菌属物种(Bacillus spp.)、明串珠菌属物种(Leuconostoc spp.)，以及它们的组合。
较佳地，该乳杆菌属物种是选自于由下列所构成的群组：加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、戴白氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌，以及它们的组合。在本发明的一个较佳具体例中，该乳杆菌属物种是选自于由下列所构成的群组：加氏乳杆菌AI-88、加氏乳杆菌LG21、发酵乳杆菌CECT5716、约氏乳杆菌MH-68、罗伊氏乳杆菌GL-104、瑞士乳杆菌RE-78、副干酪乳杆菌MP137、副干酪乳杆菌ET-66、鼠李糖乳杆菌MP108、鼠李糖乳杆菌CT-53、鼠李糖乳杆菌LGG、植物乳杆菌LPL28、植物乳杆菌TSP05、嗜酸乳杆菌TYCA06以及嗜酸乳杆菌LA-5。
较佳地，该乳球菌属物种是乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)[例如，乳酸乳球菌乳亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)]。在本发明的一个较佳具体例中，该乳球菌属物种是乳酸乳球菌乳亚种LY-66。
较佳地，该链球菌属物种是嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)。在本发明的一个较佳具体例中，该链球菌属物种是嗜热链球菌SY-66以及嗜热链球菌UASt-09。
较佳地，该双歧杆菌属物种是选自于由下列所构成的群组：动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)[例如，动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalissubsp.lactis)以及动物双歧杆菌乳双歧亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactisBb)]、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)[例如，长双歧杆菌婴儿亚种]、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)，以及它们的组合。在本发明的一个较佳具体例中，该双歧杆菌属物种是选自于由下列所构成的群组：动物双歧杆菌乳亚种CP-9、动物双歧杆菌乳亚种BB-12、动物双歧杆菌乳双歧亚种BB-115、长双歧杆菌婴儿亚种BLI-02、短双歧杆菌Bv-889以及长双歧杆菌BB536。
较佳地，该益生菌是一含有乳杆菌属物种与双歧杆菌属物种的组合，例如，鼠李糖乳杆菌、动物双歧杆菌以及长双歧杆菌的组合。在本发明的一个较佳具体例中，该益生菌是一含有鼠李糖乳杆菌MP108、动物双歧杆菌乳双歧亚种BB-115以及长双歧杆菌婴儿亚种BLI-02的组合。
本发明亦提供一种用于生产益生菌的方法，其包括：将该益生菌培养于一如上所述的含有一乳酸菌菌株组合的发酵产物的培养基中。
本发明将就下面的实施例来做进一步说明，但应了解的是，该等实施例只是供例示说明用，而不应被解释为本发明的实施上的限制。
<實施例>
一般實驗材料：
1.发酵培养基：
在下面的实施例中所使用的发酵培养基具有一如下面表1所示的配方。
表1.发酵培养基的配方
2.乳酸菌菌株：
在下面实施例中拿来进行功效评估的4种乳酸菌菌株已被公开于TW I709374B中，其中唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius subsp.salicinius)AP-32已另外被公开于CN 102835666 B中，这4种乳酸菌菌株并已被保藏于中国台湾的食品工业发展研究所(FoodIndustry Research and Development Institute,FIRDI)的生物资源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center,BCRC)(300新竹市食品路331号，中国台湾)。另外，该等乳酸菌菌株亦有依据布达佩斯条约(the Budapest Treaty)的规定被保藏于中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection,CCTCC)以及中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General MicrobiologicalCulture Collection Center,CGMCC)。为表清楚，各个乳酸菌菌株的相关信息(包括：学名、保藏编号以及保藏日期等)已被整合于下面表2中。
表2.各个乳酸菌菌株的相关信息
注：唾液乳杆菌AP-32以及嗜酸乳杆菌TYCA06已公众可获得。
3.在下面的实施例中所使用的各个益生元及其来源已被整合于下面表3中。
表3.各个益生元的来源
4.益生菌菌液的制备：
在下面的实施例中所使用的益生菌菌株及其来源已被整合于下面表4中。
表4.各个益生菌菌株
首先，将上述益生菌菌株分别接种至补充有0.05％半胱胺酸(cysteine)的MRS肉汤培养基(MRS broth)(BD,Cat.No.DF0881-17-5)中，并于培养箱(37℃、5％CO2)中进行培养历时16小时，俾以活化菌株。接着，将经活化的菌株分别以一为10％(v/v)的接种量接种至MRS肉汤培养基中，并在培养箱(37℃、5％CO2)中进行继代培养(subculture)历时24小时。之后，以MRS肉汤培养基将所形成的培养物调整为一具有1×109CFU/mL的细菌浓度，而得到各个益生菌的菌液。另外，将鼠李糖乳杆菌MP108、动物双歧杆菌乳双歧亚种BB-115以及长双歧杆菌婴儿亚种BLI-02的菌液各取部分并以等体积(1:1:1)混合而得到一混合菌液。
一般实验方法：
1.统计学分析(statistical analysis)：
在下面的实施例中，各组的实验被重复3次，而实验数据是以“平均值(mean)±平均值的标准误差(standard error of the mean,SEM)”来表示。所有的数据是藉由双尾史徒登氏t-试验(two-tailed Student’s t-test)来作分析，俾以评估各组间的差异性。若所得到的统计分析结果是p<0.05，这表示有统计学显著性(statistical significance)。
实施例1.乳酸菌发酵产物的制备：
首先，将上面“一般实验材料”的第2项当中所述的4种乳酸菌菌株分别接种至100mL的上面“一般实验材料”的第1项当中所述的发酵培养基中，并于37℃下进行培养历时24小时，俾以活化菌株。接着，将所得到的经活化的菌株(其具有一约为1×109CFU/mL的浓度)分别以一为3％(v/v)的接种量接种至5L的发酵培养基中，并于一厌氧条件下以及37℃下进行发酵培养历时隔夜，藉此而得到该4种乳酸菌菌株的发酵培养物。
此外，将该等经活化的乳酸菌菌株培养物依据表5所示的比例来进行混合而得到5种乳酸菌菌株组合(亦即菌株组合1至5)，并分别以一为3％(v/v)的接种量接种至5L的发酵培养基中，并于一厌氧条件下以及37℃下进行发酵培养历时隔夜，藉此而得到菌株组合1至5的发酵培养物。
之后，将该4种乳酸菌菌株以及该5种菌株组合的发酵培养物进行离心来使菌体沉淀，然后收集上清液并依序进行加热灭菌处理以及喷雾干燥处理(spray-dryingtreatment)，藉此而得到呈粉末状的乳酸菌发酵产物。
表5.各个菌株组合所使用的菌数比
| 菌株组合 | AP-32：LPL28：TYCA06：BLI-02 |
| 1 | 1：0.2：0.2：0.2 |
| 2 | 1：1：1：1 |
| 3 | 1：5：1：1 |
| 4 | 1：1：5：1 |
| 5 | 1：1：1：5 |
实施例2.乳酸菌发酵产物在促进益生菌生长上的效用评估
实验方法：
首先，将上面实施例1所得到的9种乳酸菌发酵产物分别以0.5wt％的含量配于4.5mL的发酵培养基中，接着将上面“一般实验材料”的第4项当中所得到的鼠李糖乳杆菌MP108的菌液分为4个单菌比较组(亦即，单菌比较组1至4)、5个复合菌实验组(亦即，复合菌实验组1至5)以及1个对照组(各组皆为5μL)，并且依据下面表6所示将各个单菌比较组与复合菌实验组的菌液接种至含有不同乳酸菌发酵产物的发酵培养基中，而对照组的菌液则接种至不含有任何乳酸菌发酵产物的发酵培养基中，继而在37℃下予以培养历时6小时。
表6.各组接种的发酵培养基所含有的乳酸菌发酵产物
| 组别 | 乳酸菌发酵产物 |
| 单菌比较组1 | 唾液乳杆菌AP-32 |
| 单菌比较组2 | 植物乳杆菌LPL28 |
| 单菌比较组3 | 嗜酸乳杆菌TYCA06 |
| 单菌比较组4 | 长双歧杆菌婴儿亚种BLI-02 |
| 复合菌实验组1 | 菌株组合1 |
| 复合菌实验组2 | 菌株组合2 |
| 复合菌实验组3 | 菌株组合3 |
| 复合菌实验组4 | 菌株组合4 |
| 复合菌实验组5 | 菌株组合5 |
| 对照组 | - |
之后，对各组所得到的发酵培养物各取0.02mL并以分光亮度计在波长600nm下测量吸光值(OD600)。另外，一未经接种菌液且不含有任何乳酸菌发酵产物的发酵培养基被拿来作为空白对照组，并以相同的方式来测量吸光值(OD600)。
各组的鼠李糖乳杆菌MP108的相对生长倍数是藉由将各组发酵培养物所测得的吸光值(OD600)代入下列公式(I)而被计算出：
公式(I)：A＝(B--D)/(C--D)
其中：A＝相对生长倍数
B＝各组所测得的OD600吸光值
C＝对照组所测得的OD600吸光值
D＝空白对照组所测得的OD600吸光值
之后，依照上面“一般实验方法”的第1项「统计学分析」当中所述的方法来分析所得到的实验数据。
结果：
所得到的结果被显示于图1中。由图1可见，与对照组相较下，单菌比较组1至4的相对生长倍数并无显著差异，而复合菌实验组1至5的相对生长倍数皆有显著地升高，并且其中复合菌实验组2提升的倍数幅度更是高于其他复合菌实验组所具者。这个实验结果显示：组合使用唾液乳杆菌AP-32、植物乳杆菌LPL28、嗜酸乳杆菌TYCA06以及长双歧杆菌婴儿亚种BLI-02的发酵产物能够协同地促进鼠李糖乳杆菌MP108的生长。
实施例3.乳酸菌菌株组合的发酵产物在促进不同益生菌生长上的效用评估
为了进一步评估含有唾液乳杆菌AP-32、植物乳杆菌LPL28、嗜酸乳杆菌TYCA06以及长双歧杆菌婴儿亚种BLI-02的菌株组合的发酵产物是否亦能用于促进其他的益生菌生长，下面的实验被进行。
实验方法：
首先，将上面实施例1所得到的菌株组合2的乳酸菌发酵产物以0.5wt％的含量配于4.5mL的发酵培养基中。接着，将上面“一般实验材料”的第4项当中所得到的各个益生菌菌液分别分成1个复合菌组以及1个对照组(各组皆为5μL)。然后将复合菌组的益生菌菌液接种至含有菌株组合1的乳酸菌发酵产物的发酵培养基中，而对照组的菌液则接种至不含有任何乳酸菌发酵产物的发酵培养基中，继而在37℃下予以培养历时6小时。之后，参照实施例2中所描述的方法来进行相对生长倍数的测定以及数据分析。
结果：
所得到的结果被显示于下面表7中。由表7可见，与对照组相较下，各个乳杆菌、乳球菌、链球菌以及双歧杆菌菌株的相对生长倍数皆有显著地升高。这个实验结果显示：组合使用唾液乳杆菌AP-32、植物乳杆菌LPL28、嗜酸乳杆菌TYCA06以及长双歧杆菌婴儿亚种BLI-02的发酵产物能够有效地促进各种不同菌种的益生菌生长。
表7.乳酸菌发酵产物促进不同益生菌的相对生长倍数
| 益生菌 | 相对生长倍数 |
| 加氏乳杆菌AI-88 | 1.62±0.11*** |
| 加氏乳杆菌LG21 | 1.15±0.01** |
| 发酵乳杆菌CECT5716 | 1.46±0.05*** |
| 约氏乳杆菌MH-68 | 1.31±0.07** |
| 罗伊氏乳杆菌GL-104 | 1.39±0.02*** |
| 瑞士乳杆菌RE-78 | 1.42±0.09** |
| 副干酪乳杆菌MP137 | 1.17±0.05** |
| 副干酪乳杆菌ET-66 | 1.27±0.04*** |
| 鼠李糖乳杆菌CT-53 | 1.28±0.11** |
| 鼠李糖乳杆菌MP108 | 1.34±0.03*** |
| 鼠李糖乳杆菌LGG | 1.15±0.03* |
| 植物乳杆菌LPL28 | 1.26±0.05** |
| 植物乳杆菌TSP05 | 1.21±0.25* |
| 嗜酸乳杆菌TYCA06 | 1.64±0.04** |
| 嗜酸乳杆菌LA-5 | 1.77±0.01** |
| 乳酸乳球菌乳亚种LY-66 | 1.16±0.04* |
| 嗜热链球菌SY-66 | 1.33±0.04*** |
| 嗜热链球菌UASt-09 | 1.20±0.03** |
| 动物双歧杆菌乳双歧亚种BB-115 | 1.13±0.03** |
| 动物双歧杆菌乳亚种CP-9 | 1.12±0.03** |
| 动物双歧杆菌乳亚种BB-12 | 1.27±0.07** |
| 长双歧杆菌婴儿亚种BLI-02 | 1.29±0.04** |
| 短双歧杆菌Bv-889 | 1.21±0.04* |
| 长双歧杆菌BB536 | 1.49±0.05*** |
注：“*”、“**”与“***”分别表示当与对照组作比较，p＜0.05、p＜0.01与p＜0.001。
实施例4.乳酸菌菌株组合的发酵产物与习知益生元在促进益生菌生长上的效用比较
实验方法：
首先，将上面“一般实验材料”的第3项当中所述的6种益生元以及上面实施例1所得到的菌株组合2的乳酸菌发酵产物分别以0.25wt％与0.5wt％的含量配于4.5mL的发酵培养基中。接着，将上面“一般实验材料”的第4项当中所得到的鼠李糖乳杆菌MP108的菌液分成2个人乳寡糖组(亦即人乳寡糖X1组与X2组)、2个麦芽糊精组(亦即麦芽糊精X1组与X2组)、2个果寡糖组(亦即果寡糖X1组与X2组)、2个半乳寡糖组(亦即半乳寡糖X1组与X2组)、2个山梨醇组(亦即山梨醇X1组与X2组)、2个赤藻糖醇组(亦即赤藻糖醇X1组与X2组)、2个菊糖组(亦即菊糖X1组与X2组)、2个复合菌组(亦即复合菌X1组与X2组)，以及2个对照组(亦即对照X1组与X2组)，各组皆为5μL。然后将各组的鼠李糖乳杆菌MP108菌液接种至含有具有对应浓度(X1组与X2组分别对应于0.25wt％与0.5wt％)的益生元或乳酸菌发酵产物的发酵培养基中，而对照组的菌液则接种至不含有任何乳酸菌发酵产物的发酵培养基中，继而在37℃下予以培养历时6小时。之后，参照实施例2中所描述的方法来进行各组鼠李糖乳杆菌MP108的相对生长倍数的测定以及数据分析。
此外，为了了解本发明所使用的菌株组合的乳酸菌发酵产物相较于习知益生元在促进其他益生菌或经混合的复数种益生菌的生长上的效用，参照上面针对鼠李糖乳杆菌MP108所描述的方式来进行实验，不同处在于：以上面“一般实验材料”的第4项当中所得到的动物双歧杆菌乳亚种CP-9的菌液以及混合菌液分别来代替鼠李糖乳杆菌MP108的菌液。
结果：
所得到的结果被显示于图2至图4中。由图2至图4可见，无论是对于鼠李糖乳杆菌MP108、动物双歧杆菌乳亚种CP-9以及混合益生菌，各种习知的益生元皆不必然能够有效地发挥促进益生菌生长的效用，相对地，含有唾液乳杆菌AP-32、植物乳杆菌LPL28、嗜酸乳杆菌TYCA06以及长双歧杆菌婴儿亚种BLI-02的菌株组合的发酵产物皆能够大幅地促进生长。
这个实验结果显示：组合使用唾液乳杆菌AP-32、植物乳杆菌LPL28、嗜酸乳杆菌TYCA06以及长双歧杆菌婴儿亚种BLI-02的发酵产物在不同浓度下皆能有效地促进一或多种益生菌的生长，并且可供用于取代习知的益生元。于本说明书中被引述的所有专利和文献以其整体被并入本案作为参考数据。若有所冲突时，本案详细说明(包含界定在内)将占上风。
虽然本发明已参考上述特定的具体例被描述，明显地在不背离本发明的范围和精神下可作出很多的修改和变化。因此意欲的是，本发明仅受如随文检附的权利要求书所示者的限制。
生物材料保藏信息说明
保藏编号：CCTCC No.M 2011127
分类命名：Lactobacillus salivarius subsp.salicinius AP-32
保藏日期：2011年04月10日
保藏单位：中国典型培养物保藏中心
保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学
生物材料保藏信息说明
保藏编号：CGMCC No.17954
分类命名：Lactobacillus plantarum LPL28
保藏日期：2019年06月18日
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
生物材料保藏信息说明
保藏编号：CGMCC No.15210
分类命名：嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)TYCA06
保藏日期：2018年01月15日
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
生物材料保藏信息说明
保藏编号：CGMCC No.15212
分类命名：长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp.infantis)BLI-02
保藏日期：2018年01月15日
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
Claims (9)
1.一种用于促进益生菌生长的方法，其特征在于：将该益生菌培养于一含有一乳酸菌菌株组合的发酵产物的培养基中，其中该乳酸菌菌株组合包含有：Lac tobacillussalivarius subsp.salicinius AP-32(CCTCC NO.M 2011127)、Lac tobacillus plantarum LPL28(CGMCC NO.17954)、嗜酸乳杆菌(Lac tobacillus acidophilus)TYCA06(CGMCC NO.15210)，以及长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobac terium longum subsp.infantis)BLI-02(CGMCC NO.15212)。
2.如权利要求1的方法，其特征在于：该发酵产物是使用菌数比落在1：0.2：0.2：0.2至1：5：5：5的范围内的Lac tobacillus salivarius subsp.salicinius AP-32、Lactobacillus plan tarum LPL28、嗜酸乳杆菌TYCA06以及长双歧杆菌婴儿亚种BLI-02进行培养而被制得的一液态培养物。
3.如权利要求2的方法，其特征在于：该菌数比是1：1：1：1。
4.如权利要求2的方法，其特征在于：该液态培养物经固液分离处理而实质上不含有菌体。
5.如权利要求1的方法，其特征在于：该益生菌是选自于由下列所构成的群组：乳杆菌属物种(Lac tobacillus spp.)、乳球菌属物种(Lac tococcus spp.)、小球菌属物种(Pediococcus spp.)、肠球菌属物种(En terococcus spp.)、链球菌属物种(Streptococcus spp.)、双歧杆菌属物种(Bifidobac terium spp.)、芽孢杆菌属物种(Bacillus spp.)、明串珠菌属物种(Leuconostoc spp.)，以及它们的组合。
6.如权利要求5的方法，其特征在于：该乳杆菌属物种是选自于由下列所构成的群组：加氏乳杆菌(Lac tobacillus gasseri)、发酵乳杆菌(Lac tobacillus fermen tum)、约氏乳杆菌(Lac tobacillus johnsonii)、罗伊氏乳杆菌(Lac tobacillus reuteri)、瑞士乳杆菌(Lac tobacillus helve ticus)、干酪乳杆菌(Lac tobacillus casei)、副干酪乳杆菌(Lac tobacillus paracasei)、鼠李糖乳杆菌(Lac tobacillus rhamnosus)、戴白氏乳杆菌(Lac tobacillus delbrueckii)、保加利亚乳杆菌(Lac tobacillus bulgaricus)、唾液乳杆菌(Lac tobacillus salivarius)、植物乳杆菌(Lac tobacillus plan tarum)、嗜酸乳杆菌，以及它们的组合。
7.如权利要求5的方法，其特征在于：该乳球菌属物种是乳酸乳球菌(Lac tococcuslac tis)。
8.如权利要求5的方法，其特征在于：该链球菌属物种是嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)。
9.如权利要求5的方法，其特征在于：该双歧杆菌属物种是选自于由下列所构成的群组：动物双歧杆菌(Bifidobac terium animalis)、短双歧杆菌(Bifidobac teriumbreve)、长双歧杆菌(Bifidobac terium longum)、两歧双歧杆菌(Bifidobac teriumbifidum)、乳双歧杆菌(Bifidobac terium lac tis)、青春双歧杆菌(Bifidobac teriumadolescen tis)、婴儿双歧杆菌(Bifidobac teriuminfan tis)，以及它们的组合。
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