CN115137756A - 使用乳酸菌菌株的发酵培养物来治疗和/或预防幽门螺旋杆菌感染的相关疾病 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及使用乳酸菌菌株的发酵培养物来治疗和/或预防幽门螺旋杆菌感染的相关疾病。本发明揭示该乳酸菌菌株的发酵培养物可被用来治疗和/或预防幽门螺旋杆菌感染的相关疾病。
Description
技术领域
本发明是有关使用乳酸菌菌株的发酵培养物来治疗和/或预防幽门螺旋 杆菌感染的相关疾病。
背景技术
幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)是一种革兰氏阴性(gram-negative)的 螺旋杆菌，它们会通过分泌大量的尿素酶(urease)来将胃粘液中的尿素(urea) 转化成氨(ammonia)以中和胃酸，使其能于胃与十二指肠中大量增殖而不受 胃酸影响，进而对粘膜组织造成破坏。当胃与十二指肠被感染以幽门螺旋杆 菌，则会导致胃部发炎并引发其相关疾病，包括：胃肠炎(gastroenteritis)[例 如，胃炎(gastritis)与十二指肠炎(duodenitis)]、胃溃疡(gastric ulcer)、十二指 肠溃疡(duodenal ulcer)、粘膜相关淋巴组织淋巴癌(mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma)以及胃腺癌(gastricadenocarcinoma)等。
近年来，越来越多幽门螺旋杆菌菌株展现出抗药性(antibiotic resistance) 而使得现有的抗生素[例如阿莫西林(amoxicillin)]的疗效逐渐下降，此外，抗 生素亦可能使病患产生副作用(side effect)与不良反应(adverse effect)。因此， 本领域的相关研究人员皆致力于开发可以有效地治疗和/或预防幽门螺旋杆 菌感染并且不会产生非所欲的副作用的药物。
乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)属于一般被公认为安全的(generallyrecognized as safe,GRAS)并且为人所熟悉与广泛使用的益生菌(probiotics)。 常见的乳酸菌包括：乳酸杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、片 球菌属(Pediococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、链球菌属(Streptococcus)、双 歧杆菌属(Bifidobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)以及明串珠菌属 (Leuconostoc)等。
目前已有研究是有关于乳酸菌菌株在抗幽门螺旋杆菌上的应用。例如， 在AsgariB.et al.(2019),Visc.Med.,36:137-143中，Asgari B.等人经由对经幽 门螺旋杆菌感染的C57BL/6J小鼠投药以活的鼠李糖乳酸杆菌(Lactobacillus rhamnosus)菌株、植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)DSM 20174以及嗜 酸乳酸杆菌(Lactobacillusacidophilus)DSM 20079而发现到，此类菌株能够在 小鼠中对抗幽门螺旋杆菌。
虽然已存在有上述文献报道，本领域中仍然存在有需要去筛选出可以有 效治疗和/或预防幽门螺旋杆菌感染的相关疾病的乳酸菌以供产业界的使用。
发明内容
于本发明中，申请人发现单独使用或组合使用鼠李糖乳酸杆菌 (Lactobacillusrhamnosus)F-1(CCTCC No.M 2011124)、植物乳酸杆菌 (Lactobacillus plantarum)LPL28(CGMCC No.17954)以及嗜酸乳酸杆菌 (Lactobacillus acidophilus)TYCA06(CGMCCNo.15210)的发酵培养物(无论 有无菌体)皆具有抗幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)的效用。
于是，在第一个方面，本发明提供一种乳酸菌菌株的发酵培养物供应用 于制备用来治疗和/或预防幽门螺旋杆菌感染的相关疾病的组合物的用途，其 中该乳酸菌菌株选自于由下列所构成的群组：鼠李糖乳酸杆菌F-1(CCTCC No.M 2011124)、植物乳酸杆菌LPL28(CGMCC No.17954)、嗜酸乳酸杆菌 TYCA06(CGMCC No.15210)，以及它们的组合。
较佳地，该乳酸菌菌株的发酵培养物是经固液分离处理而得到的菌体或 实质上不含有菌体的流体。
较佳地，该幽门螺旋杆菌感染的相关疾病选自于由下列所构成的群组中 的胃部疾病：胃溃疡、十二指肠溃疡、胃腺癌、胃食道逆流、消化不良、胃 炎、胃灼热，以及它们的组合。
较佳地，该组合物是食品组合物。
较佳地，该组合物是药学组合物。
更佳地，该药学组合物进一步包含有药学上可接受的载剂。
更佳地，该药学组合物呈供口服投药、局部投药或非经肠道投药的剂型。
在第二个方面，本发明提供一种用于治疗具有或被怀疑具有幽门螺旋杆 菌感染的相关疾病的个体的方法，其包括对该个体投予如上所述的乳酸菌菌 株的发酵培养物。
较佳地，该乳酸菌菌株是含有鼠李糖乳酸杆菌F-1(CCTCC No.M 2011124)、植物乳酸杆菌LPL28(CGMCC No.17954)以及嗜酸乳酸杆菌 TYCA06(CGMCC No.15210)的组合。
更佳地，鼠李糖乳酸杆菌F-1(CCTCC No.M 2011124)、植物乳酸杆菌 LPL28(CGMCCNo.17954)以及嗜酸乳酸杆菌TYCA06(CGMCC No.15210) 的发酵培养物的相对比例落在1：0.3：0.3至1：3：3的范围内。
较佳地，该组合物进一步包含有选自于由下列所构成的群组中的益生菌 菌株的培养物：唾液乳酸杆菌(Lactobacillus salivarius subsp.salicinius)AP-32、 约氏乳酸杆菌(Lactobacillus johnsonii)MH-68，以及它们的组合。
附图说明
下面结合附图及实施例来对本发明进行详细说明，所以本发明在上述以 及其他目的与特征，可借由参照下文的描述、随文检附的权利要求书和伴随 的图式而变得更为明显，附图中：
图1显示幽门螺旋杆菌被处理以不同种的乳酸菌菌株的悬浮菌液后所测 得的存活率，其中正常对照组表示未经任何处理的幽门螺旋杆菌；正对照组 表示被处理以阿莫西林(amoxicillin)的幽门螺旋杆菌；负对照组表示被处理以 大肠杆菌BCRC 51534的悬浮菌液的幽门螺旋杆菌；各个单菌组分别表示被 处理以如下面表2所示的乳酸菌菌株的悬浮菌液的幽门螺旋杆菌；各个复合 菌组分别表示被处理以使用不同比例来相互混合的鼠李糖乳酸杆菌F-1 (CCTCC No.M 2011124)、植物乳酸杆菌LPL28(CGMCC No.17954)以及嗜酸 乳酸杆菌TYCA06(CGMCC No.15210)的悬浮菌液(这些乳酸菌菌株的菌数 比如下面表3所示)的幽门螺旋杆菌；以及“***”表示：当与正常对照组作比 较，p＜0.001；
图2显示幽门螺旋杆菌被处理以不同种的乳酸菌菌株的发酵培养上清液 后所测得的存活率，其中正常对照组表示未经任何处理的幽门螺旋杆菌；正 对照组表示被处理以阿莫西林的幽门螺旋杆菌；负对照组表示被处理以大肠 杆菌BCRC 51534的培养上清液的幽门螺旋杆菌；各个单菌组分别表示被处 理以如下面表2所示的乳酸菌菌株的发酵培养上清液的幽门螺旋杆菌；各个 复合菌组分别表示被处理以使用不同比例来相互混合的鼠李糖乳酸杆菌F-1 (CCTCC No.M 2011124)、植物乳酸杆菌LPL28(CGMCC No.17954)以及嗜酸乳酸杆菌TYCA06(CGMCC No.15210)的发酵培养上清液(这些乳酸菌菌株 的体积比如下面表3所示)的幽门螺旋杆菌；以及“**”与“***”分别表示：当 与正常对照组作比较，p＜0.01与p＜0.001；
图3显示幽门螺旋杆菌被处理以不同种的乳酸菌菌株的悬浮菌液后所测 得的尿素酶活性，其中正常对照组表示未经任何处理的幽门螺旋杆菌；正对 照组表示被处理以阿莫西林的幽门螺旋杆菌；负对照组表示被处理以大肠杆 菌BCRC 51534的悬浮菌液的幽门螺旋杆菌；各个单菌组分别表示被处理以 如下面表2所示的乳酸菌菌株的悬浮菌液的幽门螺旋杆菌；各个复合菌组分 别表示被处理以使用不同比例来相互混合的鼠李糖乳酸杆菌F-1(CCTCC No.M 2011124)、植物乳酸杆菌LPL28(CGMCC No.17954)以及嗜酸乳酸杆菌TYCA06(CGMCC No.15210)的悬浮菌液(这些乳酸菌菌株的菌数比如下面 表3所示)的幽门螺旋杆菌；以及“*”与“**”分别表示：当与正常对照组作比 较，p＜0.05与p＜0.01；以及
图4显示幽门螺旋杆菌被处理以不同种的乳酸菌菌株的发酵培养上清液 后所测得的尿素酶活性，其中正常对照组表示未经任何处理的幽门螺旋杆菌； 正对照组表示被处理以阿莫西林的幽门螺旋杆菌；负对照组表示被处理以大 肠杆菌BCRC 51534的培养上清液的幽门螺旋杆菌；各个单菌组分别表示被 处理以如下面表2所示的乳酸菌菌株的发酵培养上清液的幽门螺旋杆菌；各 个复合菌组分别表示被处理以使用不同比例来相互混合的鼠李糖乳酸杆菌 F-1(CCTCC No.M 2011124)、植物乳酸杆菌LPL28(CGMCC No.17954)以及嗜酸乳酸杆菌TYCA06(CGMCC No.15210)的发酵培养上清液(这些乳酸菌 菌株的体积比如下面表3所示)的幽门螺旋杆菌；以及“*”、“**”与“***”分 别表示：当与正常对照组作比较，p＜0.05、p＜0.01与p＜0.001。
具体实施方式
除非另外有所定义，在本文中所使用的所有技术性与科学术语具有本领 域技术人员所共同了解的意义。本领域技术人员会认知到许多与那些被描述 于本文中者相似或等效的方法和材料，它们可被用于实施本发明。当然，本 发明决不受到所描述的方法和材料的限制。
本发明提供一种乳酸菌菌株的发酵培养物供应用于制备用来治疗和/或 预防幽门螺旋杆菌感染的相关疾病的组合物的用途，其中该乳酸菌菌株选自 于由下列所构成的群组：鼠李糖乳酸杆菌(Lactobacillus rhamnosus)F-1 (CCTCC No.M 2011124)、植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)LPL28 (CGMCC No.17954)、嗜酸乳酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)TYCA06 (CGMCC No.15210)，以及它们的组合。
依据本发明，该幽门螺旋杆菌感染的相关疾病选自于由下列所构成的群 组中的胃部疾病：胃溃疡(gastric ulcer)、十二指肠溃疡(duodenal ulcer)、胃腺 癌(gastricadenocarcinoma)、胃食道逆流(gastroesophageal reflux)、消化不良 (dyspepsia)、胃炎(gastritis)[例如萎缩性胃炎(atrophic gastritis)]、胃灼热 (pyrosis)，以及它们的组合。
如本文中所使用的，术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”幽门螺旋杆 菌感染的相关疾病意指该疾病的严重性(severity)或症状(symptom)被减少 (reduced)，或是该疾病被部分地(partially)或完全地(entirely)消除(eliminated)。
如本文中所使用的，术语“预防(preventing)”或“预防(prevention)”幽门螺 旋杆菌感染的相关疾病意指个体在还没有被诊断具有该疾病时，消除(eliminate)或减少(reduce)该疾病的发生率(incidence)，以及减缓(slow)、延迟 (delay)、控制(control)或减少(decrease)该疾病的可能性(likelihood)或机率 (probability)。
依据本发明，该幽门螺旋杆菌感染的相关疾病的治疗和/或预防可包括 下列至少一者：抑制和/或防止幽门螺旋杆菌的生长、抑制和/或防止幽门螺 旋杆菌的定殖、抑制幽门螺旋杆菌的尿素酶(urease)的表达，以及抑制幽门螺 旋杆菌的尿素酶的活性。
依据本发明，该乳酸菌菌株的发酵培养物是通过将具有范围落在106至 1010CFU/mL内的细菌浓度的这些乳酸菌菌株发酵培养于适于生长的培养基 中而被获得的。在本发明的一个较佳具体例中，这些乳酸菌菌株具有范围落 在107至109CFU/mL内的细菌浓度。
依据本发明，适用于发酵培养这些乳酸菌菌株的培养基可以是本领域技 术人员自行配制的，或者是商业上可购得的产品，这包括，但不限于：MRS 肉汤培养基(MRS broth)以及添加有半胱氨酸(cysteine)的MRS肉汤培养基。
如本文中所使用的，术语“培养(culturing)”、“发酵(fermentation)”以及“培 育(cultivation)”可被交换地使用。
有关发酵培养的操作程序与参数条件等落在本领域技术人员的专业素 养与例行技术范畴内。在此方面，可以参考，例如，Hsieh P.S.et al.(2013),New Microbiol.,36:167-179。
依据本发明，该发酵培养可在范围落在25℃至40℃内的温度下被进行。
在本发明的一个较佳具体例中，该发酵培养是于37℃下被进行。
依据本发明，该发酵培养被进行历时一段范围落在20至40小时内的时间。 在本发明的一个较佳具体例中，该发酵培养被进行历时24小时。
依据本发明，该乳酸菌菌株的发酵培养物可具有范围落在106至1010 CFU/mL内的细菌浓度。在本发明的一个较佳具体例中，该乳酸菌菌株的发 酵培养物具有为109CFU/mL的细菌浓度。
依据本发明，该乳酸菌菌株的发酵培养物是经固液分离处理而得到的菌 体或实质上不含有菌体的流体。
依据本发明，该固液分离处理选自于由下列所构成的群组：离心处理(centrifugation treatment)[例如，多级离心处理(Multi-stage centrifugationtreatment)]、浓缩处理(concentration treatment)，以及它们的组合。
在本发明的一个较佳具体例中，该不含有菌体的流体是通过将该乳酸菌 菌株的发酵培养物进行离心处理而被获得的。
如本文中所使用的，术语“实质上不含有(substantially free of)”意指被具 体指明的组分缺少有意义的含量。较佳地，该组分的含量对于该乳酸菌菌株 的发酵培养物的性质不具有可测量的影响(measurable effect)。更佳地，该乳 酸菌菌株的发酵培养物完全不含有该组分。
依据本发明，该组合物可以是食品组合物(food composition)，例如，呈 食品添加物(food additive)的形式，其可以被添加至可食性材料(edible material) 中以制备供人类或动物食用的食品产品。依据本发明，该食物产品的种类可 包括，但不限于：奶粉(milk powder)、发酵乳(fermented milk)、优格(yogurt)、 乳酪(butter)、饮料(beverages)(例如，茶、咖啡)、功能性饮料(functional beverages)、面制品(flourproduct)、烘焙食品(baked foods)、甜点(confectionery)、 糖果(candies)、发酵食品(fermented foods)、动物饲料(animal feeds)、保健食 品(health foods)、婴儿食品(infant food)，以及膳食补充品(dietary supplements)。
依据本发明，该组合物可以是药学组合物(pharmaceutical composition)。
依据本发明，该药学组合物可呈适合于口服投药(oral administration)、局 部投药(topical administration)或非经肠道投药(parenteral administration)的剂 型(dosage form)。
依据本发明，该药学组合物可进一步包含有被广泛地使用于药物制造技 术的药学上可接受的载剂(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，该药学 上可接受的载剂可包含一种或多种选自于下列的试剂：溶剂(solvent)、缓冲 液(buffer)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspending agent)、分解剂(decomposer)、 崩解剂(disintegrating agent)、分散剂(dispersing agent)、粘结剂(binding agent)、 赋形剂(excipient)、稳定剂(stabilizing agent)、螯合剂(chelating agent)、稀释 剂(diluent)、胶凝剂(gelling agent)、防腐剂(preservative)、润湿剂(wetting agent)、润滑剂(lubricant)、吸收延迟剂(absorption delaying agent)、脂质体(liposome) 以及类似物。有关这些试剂的选用与数量落在本领域技术人员的专业素养与 例行技术范畴内。
依据本发明，该药学组合物可利用本领域技术人员所详知的技术而被制 造成适合于口服投药的剂型，这包括，但不限于：无菌的粉末、锭剂(tablet)、 片剂(troche)、口含锭(lozenge)、丸剂(pellet)、胶囊(capsule)、分散性粉末 (dispersible powder)或细颗粒(granule)、溶液、悬浮液(suspension)、乳剂 (emulsion)、糖浆(syrup)、酏剂(elixir)、浓浆(slurry)以及类似物。
依据本发明，该药学组合物可利用本领域技术人员所详知的技术而被制 造成适合于非经肠道途径投药的剂型[包括注射品(injection)，例如，无菌的 水性溶液(sterileaqueous solution)或分散液(dispersion)]，且以选自于由下列所 构成的群组中的途径来投药：腹膜内注射(intraperitoneal injection)、皮下注射 (subcutaneousinjection)、皮内注射(intradermal injection)以及舌下投药 (sublingualadministration)。
依据本发明，该乳酸菌菌株是含有鼠李糖乳酸杆菌F-1(CCTCC No.M 2011124)、植物乳酸杆菌LPL28(CGMCC No.17954)以及嗜酸乳酸杆菌 TYCA06(CGMCC No.15210)的组合。较佳地，在该组合物中，鼠李糖乳酸 杆菌F-1(CCTCC No.M 2011124)、植物乳酸杆菌LPL28(CGMCC No.17954) 以及嗜酸乳酸杆菌TYCA06(CGMCC No.15210)的发酵培养物的相对比例落 在1：0.3：0.3至1：3：3的范围内。在本发明的一个较佳具体例中，该相对 比例是菌数比。在本发明的另一个较佳具体例中，该相对比例是不含有菌体 的流体的体积比。
依据本发明，该组合物可进一步包含有选自于由下列所构成的群组中的 益生菌菌株的培养物：唾液乳酸杆菌(Lactobacillus salivarius subsp.salicinius) AP-32、约氏乳酸杆菌(Lactobacillus johnsonii)MH-68，以及它们的组合。
本发明亦提供一种用于治疗具有或被怀疑具有幽门螺旋杆菌感染的相 关疾病的个体的方法，其包括对该个体投予(administering)如上所述的乳酸菌 菌株的发酵培养物。
如本文中所使用的，术语“投予”以及“投药(administration)。可被交 换地使用，并且意指通过任何合适的途径来对个体导入(introducing)、提供 (providing)或递送(delivering)预定的活性成分以执行其预期的效用。
如本文中所使用的，术语“个体(subject)术意指任何感兴趣的哺乳类动 物，诸如人(humans)、猴子(monkeys)、牛(cows)、绵羊(sheeps)、马(horses)、 猪(pigs)、山羊(goats)、狗(dogs)、猫(cats)、小鼠(mice)以及大鼠(rats)。
依据本发明，该乳酸菌菌株的发酵培养物的投药剂量与投药次数会视下 列因素而变化：要被改善的疾病的严重性，投药途径，以及要被改善的个体 的体重、年龄、身体状况与反应。一般而言，该乳酸菌菌株的发酵培养物可 呈单一剂量或是分成多个剂量的形式而被口服地、局部地或非经肠道地投药。
较佳实施例的详细说明
本发明将就下面的实施例来做进一步说明，但应了解的是，这些实施例 仅是供例示说明用，而不应被解释为本发明的实施上的限制。
实施例
一般实验材料：
1.乳酸菌菌株：
在下面实施例中拿来进行功效评估的乳酸菌菌株已被公开于TW I709374 B中，并且已被保藏于中国台湾的食品工业发展研究所(Food Industry Research andDevelopment Institute,FIRDI)的生物资源保存及研究中心 (Bioresource Collectionand Research Center,BCRC)(300新竹市食品路331号， 中国台湾)。另外，这些乳酸菌菌株亦有依据布达佩斯条约(the Budapest Treaty) 的规定被保藏于中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection,CCTCC)以及中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (China General Microbiological Culture CollectionCenter,CGMCC)。为表清楚， 各个乳酸菌菌株的相关信息(包括：学名、保藏编号以及保藏日期等)已被整 合于下面表1中。
表1.各个乳酸菌菌株的相关信息
注：鼠李糖乳酸杆菌F-1(CCTCC No.M 2011124)以及嗜酸乳酸杆菌TYCA06 (CGMCCNo.15210)已公众可获得。
为供比较，亦有使用下列乳酸菌菌株：申请人从人类的母乳中所分离出 的鼠李糖乳酸杆菌L-12与加氏乳酸杆菌(Lactobacillus gasseri)L-2，以及从健 康人体的肠道中所分离出的植物乳酸杆菌L-305、嗜酸乳酸杆菌L-7以及干酪 乳酸杆菌(Lactobacilluscasei)L-10。
2.在下面的实施例中所使用的大肠杆菌(Escherichia coli)BCRC 51534 以及幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)BCRC 17219皆是购自于中国台湾的 食品工业发展研究所(FIRDI)的生物资源保存及研究中心(BCRC)(300新竹市 食品路331号，中国台湾)。
3.幽门螺旋杆菌菌液的制备：
首先，将50μL的经活化的幽门螺旋杆菌BCRC 17219添加至450μL的胰 蛋白酶大豆肉汤培养基(tryptic soy broth,TSB)(BD Difco)中并予以混合均匀， 接着添加至胰蛋白酶大豆血琼脂(tryptic soy blood agar)的斜面培养基(agar slant)上，并于37℃下进行双相培养历时72小时，借此而得到具有为5×106至 5×107CFU/mL的细菌浓度的幽门螺旋杆菌菌液。
一般实验方法：
1.统计学分析(statistical analysis)：
在下面的实施例中，各组的实验被重复3次，而实验数据以“平均值(mean) ±平均值的标准误差(standard error of the mean,SEM)”来表示。所有的数据通 过双尾史徒登氏t-检验(two-tailed Student’s t-test)来作分析，以评估各组间的 差异性。若所得到的统计分析结果是p<0.05，这表示有统计学显著性 (statistical significance)。
实施例1.乳酸菌菌株的悬浮菌液(suspended bacterial solution)与发酵培养上清液(fermented culture supernatant)在抗幽门螺旋杆菌上的效用评估：
实验材料：
1.各种乳酸菌菌株的悬浮菌液与发酵培养上清液的制备：
首先，将上面“一般实验材料”的第1项当中所述的8种乳酸菌菌株分别接 种至补充有0.05％半胱氨酸(cysteine)的MRS肉汤培养基(MRS broth)(Difco)中， 并于37℃下进行培养历时24小时，以活化菌株。接着，将经活化的菌株分别 以为2％(v/v)的接种量接种至MRS肉汤培养基中，并于厌氧条件下以及37℃ 下进行培养历时隔夜。之后，所形成的发酵培养物在4℃下以3,000rpm来进 行离心历时10分钟使菌体沉淀，继而收取上清液，而分别得到各个乳酸菌菌 株的发酵培养上清液，至于沉淀物(pellets)则以适量的0.1M磷酸盐缓冲生理 盐水(phosphate buffered saline,PBS)予以洗涤，接着使用适量的0.1M PBS来予以散浮，而分别得到各个乳酸菌菌株的悬浮菌液。
2.大肠杆菌BCRC 51534的悬浮菌液与培养上清液的制备：
首先，将大肠杆菌BCRC 51534接种至营养培养基(nutrient broth)(HIMEDIA)中，并于37℃下进行培养历时16小时，以活化菌株。接着， 将经活化的菌株以为2％(v/v)的接种量接种至营养培养基中，并于好氧条件 下以及37℃下进行培养历时16小时。之后，所形成的培养物在4℃下以 3,000rpm来进行离心历时10分钟使菌体沉淀，继而收取上清液，而分别得到 大肠杆菌BCRC 51534的培养上清液，至于沉淀物则以适量的0.1M PBS予以 洗涤。接着，使用适量的0.1M PBS来予以散浮并将大肠杆菌BCRC 51534调 整成具有为108CFU/mL的细菌浓度(以平板计数培养基来进行菌数计数)，借 此而得到大肠杆菌BCRC51534的悬浮菌液。
实验方法：
A、使用乳酸菌菌株的悬浮菌液与发酵培养上清液来处理幽门螺旋杆菌：
将上面“一般实验材料”的第3项当中所得到的幽门螺旋杆菌菌液分成21 组，其中包括1个正常对照组、1个正对照组、1个负对照组、3个单菌实验组 (亦即，单菌实验组1至3)、5个单菌比较组(亦即，单菌比较组1至5)、7个复 合菌实验组(亦即，复合菌实验组1至7)以及3个复合菌比较组(亦即，复合菌 比较组1至3)，各组的体积皆为900μL。接着，使用适量的0.1M PBS来将上 面“实验材料”的第1项当中所得到的各个乳酸菌菌株的悬浮菌液调整成具有 为109CFU/mL的细菌浓度(以平板计数培养基来进行菌数计数)并分别取100 μL，继而依据下面表2所示添加至各个单菌实验组与单菌比较组的幽门螺旋 杆菌菌液中，以及将100μL的上面“实验材料”的第2项当中所得到的大肠杆 菌BCRC 51534的悬浮菌液添加至负对照组的幽门螺旋杆菌菌液中，将100 μL的240μg/mL的阿莫西林(amoxicillin)添加至正对照组的幽门螺旋杆菌菌 液中。
另外，将鼠李糖乳酸杆菌F-1(CCTCC No.M 2011124)、植物乳酸杆菌 LPL28(CGMCCNo.17954)以及嗜酸乳酸杆菌TYCA06(CGMCC No.15210) 的悬浮菌液以不同比例来相互混合，而使得所形成的混合物的总细菌浓度皆 为109CFU/mL且其中各个乳酸菌菌株的菌数比如下面表3所示，继而分别取 100μL添加至对应的各个复合菌实验组与复合菌比较组的幽门螺旋杆菌菌 液中。至于正常对照组则不作任何处理。
表2各个单菌组所处理的乳酸菌菌株
表3各个复合菌组所处理的乳酸菌菌株的混合比例
| 组别 | F-1：LPL28：TYCA06 |
| 复合菌实验组1 | 1：0.3：0.3 |
| 复合菌实验组2 | 1：0.5：0.5 |
| 复合菌实验组3 | 1：1：1 |
| 复合菌实验组4 | 1：1：2 |
| 复合菌实验组5 | 1：1：3 |
| 复合菌实验组6 | 1：2：1 |
| 复合菌实验组7 | 1：3：1 |
| 复合菌比较组1 | 1：0.1：0.1 |
| 复合菌比较组2 | 1：10：1 |
| 复合菌比较组3 | 1：1：10 |
此外，为了解各个乳酸菌菌株的发酵培养上清液在抗幽门螺旋杆菌上的 效用，申请人大体上参照上面针对悬浮菌液所描述的方式来进行幽门螺旋杆 菌菌液的分组以及处理，不同的处在于：以发酵培养上清液来代替悬浮菌液， 亦即，对各个单菌组处理以表2所示的乳酸菌菌株的发酵培养上清液，对各 个复合菌组处理以使用表3所示比例来混合不同体积的乳酸菌菌株的发酵培 养上清液而形成的混合物。
之后，将各组添加有悬浮菌液或发酵培养上清液的幽门螺旋杆菌菌液分 别取1mL来添加至胰蛋白酶大豆血琼脂的斜面培养基中，并于微好氧条件下 以及37℃下进行双相培养历时48小时。接着，收取所形成的培养物并以4,000 rpm来进行离心历时10分钟使菌体沉淀，继而分别收取菌体以及上清液并分 别拿来进行下面第B与C项的分析。
B、幽门螺旋杆菌的存活率(survival rate)的测定：
将上面第A项当中所得到的各组的菌体以1mL的TSB培养基予以散浮， 继而取出100μL并将其均匀涂布在胰蛋白酶大豆血琼脂上，然后于微好氧条 件下进行培养历时96小时。接着，以平板计数培养基来进行幽门螺旋杆菌的 菌数计数。
幽门螺旋杆菌的存活率(％)是通过将所得到的菌数代入下列公式(1)而被 计算出的：
公式(1)：A＝(B/C)×100
其中：A＝幽门螺旋杆菌的存活率(％)
B＝各组所得到的菌数
C＝正常对照组所得到的菌数
之后，依照上面“一般实验方法”的第1项“统计学分析”当中所述的方法 来分析所得到的实验数据。
C、尿素酶活性(urease activity)的测定：
将上面第A项当中所得到的各组的上清液各取10μL添加至300μL的尿 素酶反应缓冲液(urease reaction buffer,pH 6.5)[配于PBS中的20％尿素(urea) 以及0.012％酚红(phenol red)]中，并予以充分混合。接着，将所形成的混合 物置于37℃下进行反应历时1小时，然后于550nm的波长下以ELISA读取机 (ELISA reader)(型号为MQX200，厂牌为BioTek)来测量吸光值(OD550)。若所 测得的吸光值越高，代表幽门螺旋杆菌的活性越高且所分泌的尿素酶越多。
之后，依照上面“一般实验方法”的第1项“统计学分析”当中所述的方法 来分析所得到的实验数据。
结果：
A、幽门螺旋杆菌的存活率的测定：
图1以及图2分别显示幽门螺旋杆菌被处理以不同种的乳酸菌菌株的悬 浮菌液与发酵培养上清液后所测得的存活率。从图1以及图2可见，与正常对 照组相较下，各个单菌比较组的存活率皆无明显的差异，而各个单菌实验组 的存活率皆有明显的降低，这表示：鼠李糖乳酸杆菌F-1(CCTCC No.M 2011124)、植物乳酸杆菌LPL28(CGMCC No.17954)以及嗜酸乳酸杆菌 TYCA06(CGMCC No.15210)的悬浮菌液与发酵培养上清液皆能够有效地抑 制幽门螺旋杆菌生长，而其他同属或相同物种的不同分离株的悬浮菌液与发 酵培养上清液则不具有此效用。
再者，相较于单菌实验组1至3，复合菌实验组1至7的存活率更呈现出显 著的降低并且低于正对照组所具者，而复合菌比较组1至3的存活率与单菌实 验组1至3所具者则无明显的差异，这表示：以1：0.3：0.3至1：3：3的比例 来组合使用鼠李糖乳酸杆菌F-1(CCTCCNo.M 2011124)、植物乳酸杆菌 LPL28(CGMCC No.17954)以及嗜酸乳酸杆菌TYCA06(CGMCCNo.15210) 的悬浮菌液或发酵培养上清液皆能够展现出协同效应(synergistic effect)。
B、尿素酶活性的测定：
图3显示幽门螺旋杆菌被处理以不同种的乳酸菌菌株的悬浮菌液后所测 得的尿素酶活性。从图3可见，与正常对照组相较下，各个单菌比较组的尿 素酶活性皆无明显的差异，而各个单菌实验组的尿素酶活性皆有明显的降低， 这表示：鼠李糖乳酸杆菌F-1(CCTCCNo.M 2011124)、植物乳酸杆菌LPL28 (CGMCC No.17954)以及嗜酸乳酸杆菌TYCA06(CGMCCNo.15210)的悬浮 菌液皆能够有效地抑制尿素酶活性，而其他同属或相同物种的不同分离株的 悬浮菌液则不具有此效用。
再者，相较于单菌实验组1至3，复合菌实验组1至7的尿素酶活性更呈现 出显著的降低并且近似于正对照组所具者，而复合菌比较组1至3的尿素酶活 性与单菌实验组1至3所具者则无明显的差异。这表示：以1：0.3：0.3至1：3： 3的比例来组合使用鼠李糖乳酸杆菌F-1(CCTCC No.M 2011124)、植物乳酸 杆菌LPL28(CGMCC No.17954)以及嗜酸乳酸杆菌TYCA06(CGMCC No.15210)能够展现出协同效应。
图4显示幽门螺旋杆菌被处理以不同种的乳酸菌菌株的发酵培养上清液 后所测得的尿素酶活性。从图4可见，与正常对照组相较下，单菌比较组2与 3的尿素酶活性皆无明显的差异，而单菌比较组1与4以及各个单菌实验组的 尿素酶活性则有呈现降低的情形，并且各个单菌实验组的降低幅度是显著高 于单菌比较组1与4所具者。这表示：鼠李糖乳酸杆菌F-1(CCTCC No.M 2011124)、植物乳酸杆菌LPL28(CGMCC No.17954)以及嗜酸乳酸杆菌TYCA06(CGMCC No.15210)的发酵培养上清液皆能够有效地抑制尿素酶活 性，并且其效用是显著优于其他同属或相同物种的不同分离株所具者。
另外，相较于单菌实验组1至3，复合菌实验组1至7的尿素酶活性更呈现 出显著的降低并且还显著地低于正对照组所具者，而复合菌比较组1至3的尿 素酶活性则是略高于单菌实验组1至3所具者。这表示：以1：0.3：0.3至1：3： 3的比例来组合使用鼠李糖乳酸杆菌F-1(CCTCC No.M 2011124)、植物乳酸 杆菌LPL28(CGMCC No.17954)以及嗜酸乳酸杆菌TYCA06(CGMCC No.15210)能够展现出协同效应。
综合以上的实验结果可知，鼠李糖乳酸杆菌F-1(CCTCC No.M 2011124)、 植物乳酸杆菌LPL28(CGMCC No.17954)以及嗜酸乳酸杆菌TYCA06 (CGMCC No.15210)的发酵培养物无论有无含有菌体皆具有优异的抗幽门螺 旋杆菌效用，并且在相互组合下还能进一步增强此效用，因而被预期可供用 于制备用来治疗和/或预防幽门螺旋杆菌感染的相关疾病，特别是胃部疾病。
于本说明书中被引述的所有专利和文献以其整体被并入本申请作为参 考资料。若有所冲突时，本申请详细说明(包含界定在内)将占上风。
虽然本发明已参考上述特定的具体例被描述，明显地在不背离本发明的 范围和精神下可作出很多的修改和变化。因此意欲的是，本发明仅受如随文 检附的权利要求书所示者的限制。
生物材料保藏信息说明
保藏编号：CGMCC No.17954
分类命名：Lactobacillus plantarum
保藏日期：2019年06月18日
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
Claims (10)
1.一种乳酸菌菌株的发酵培养物供应用于制备用来治疗和/或预防幽门螺旋杆菌感染的相关疾病的组合物的用途，其特征在于，该乳酸菌菌株选自于由下列所构成的群组：鼠李糖乳酸杆菌(Lactobacillus rhamnosus)F-1(CCTCC No.M 2011124)、植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)LPL28(CGMCC No.17954)、嗜酸乳酸杆菌(Lactobacillusacidophilus)TYCA06(CGMCC No.15210)，以及它们的组合。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，该幽门螺旋杆菌感染的相关疾病选自于由下列所构成的群组中的胃部疾病：胃溃疡、十二指肠溃疡、胃腺癌、胃食道逆流、消化不良、胃炎、胃灼热，以及它们的组合。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，该乳酸菌菌株的发酵培养物是经固液分离处理而得到的菌体或实质上不含有菌体的流体。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，该组合物是食品组合物。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，该组合物是药学组合物。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，该药学组合物进一步包含有药学上可接受的载剂。
7.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，该药学组合物呈供口服投药、局部投药或非经肠道投药的剂型。
8.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，该乳酸菌菌株是含有鼠李糖乳酸杆菌F-1(CCTCC No.M 2011124)、植物乳酸杆菌LPL28(CGMCC No.17954)以及嗜酸乳酸杆菌TYCA06(CGMCC No.15210)的组合。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，鼠李糖乳酸杆菌F-1(CCTCC No.M2011124)、植物乳酸杆菌LPL28(CGMCC No.17954)以及嗜酸乳酸杆菌TYCA06(CGMCCNo.15210)的发酵培养物的相对比例落在1：0.3：0.3至1：3：3的范围内。
10.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，该组合物进一步包含有选自于由下列所构成的群组中的益生菌菌株的培养物：唾液乳酸杆菌(Lactobacillus salivariussubsp.salicinius)AP-32、约氏乳酸杆菌(Lactobacillus johnsonii)MH-68，以及它们的组合。
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