TW202239422A - 使用乳酸菌菌株的發酵培養物來治療和/或預防幽門螺旋桿菌感染的相關疾病 - Google Patents
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Abstract
本發明揭示乳酸菌菌株的發酵培養物可被用來治療和/或預防幽門螺旋桿菌感染的相關疾病。
Description
本發明是有關使用乳酸菌菌株的發酵培養物來治療和/或預防幽門螺旋桿菌感染的相關疾病。
幽門螺旋桿菌(
Helicobacter pylori)是一種革蘭氏陰性(gram-negative)的螺旋桿菌，它們會藉由分泌大量的尿素酶(urease)來將胃黏液中的尿素(urea)轉化成氨(ammonia)以中和胃酸，使其能於胃與十二指腸中大量增殖而不受胃酸影響，進而對黏膜組織造成破壞。當胃與十二指腸被感染以幽門螺旋桿菌，則會導致胃部發炎並引發其相關疾病，包括：胃腸炎(gastroenteritis)[例如，胃炎(gastritis)與十二指腸炎(duodenitis)]、胃潰瘍(gastric ulcer)、十二指腸潰瘍(duodenal ulcer)、黏膜相關淋巴組織淋巴癌(mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma)以及胃腺癌(gastric adenocarcinoma)等。
近年來，越來越多幽門螺旋桿菌菌株展現出抗藥性(antibiotic resistance)而使得現有的抗生素[例如阿莫西林(amoxicillin)]的療效逐漸下降，此外，抗生素亦可能使病患產生副作用(side effect)與不良反應(adverse effect)。因此，本領域的相關研究人員皆致力於開發可以有效地治療和/或預防幽門螺旋桿菌感染並且不會產生非所欲的副作用的藥物。
乳酸菌(lactic acid bacteria, LAB)是屬於一般被公認為安全的(generally recognized as safe, GRAS)並且是為人所熟悉與廣泛使用的益生菌(probiotics)。常見的乳酸菌包括：乳酸桿菌屬(
Lactobacillus)、乳球菌屬(
Lactococcus)、小球菌屬(
Pediococcus)、腸球菌屬(
Enterococcus)、鏈球菌屬(
Streptococcus)、雙歧桿菌屬(
Bifidobacterium)、芽孢桿菌屬(
Bacillus)以及明串珠菌屬(
Leuconostoc)等。
目前已有研究是有關於乳酸菌菌株在抗幽門螺旋桿菌上的應用。例如，在Asgari B.
et al.(2019),
Visc . Med., 36:137-143中，Asgari B.等人經由對經幽門螺旋桿菌感染的C57BL/6J小鼠投藥以活的鼠李糖乳酸桿菌(
Lactobacillus rhamnosus)菌株、植物乳酸桿菌(
Lactobacillus plantarum) DSM 20174以及嗜酸乳酸桿菌(
Lactobacillus acidophilus) DSM 20079而發現到，該等菌株能夠在小鼠中對抗幽門螺旋桿菌。
雖然已存在有上述文獻報導，本技藝中仍然存在有一需要去篩選出可以有效治療和/或預防幽門螺旋桿菌感染的相關疾病的乳酸菌以供產業界之用。
發明概要
於本發明中，申請人發現單獨使用或組合使用鼠李糖乳酸桿菌(
Lactobacillus rhamnosus) F-1 (BCRC 910469)、植物乳酸桿菌(
Lactobacillus plantarum) LPL28 (BCRC 910536)以及嗜酸乳酸桿菌(
Lactobacillus acidophilus) TYCA06 (BCRC 910813)的發酵培養物(無論有無菌體)皆具有抗幽門螺旋桿菌(
Helicobacter pylori)的效用。
於是，在第一個方面，本發明提供一種乳酸菌菌株的發酵培養物供應用於製備一用來治療和/或預防幽門螺旋桿菌感染的相關疾病之組成物的用途，其中該乳酸菌菌株是選自於由下列所構成的群組：鼠李糖乳酸桿菌F-1 (BCRC 910469)、植物乳酸桿菌LPL28 (BCRC 910536)、嗜酸乳酸桿菌TYCA06 (BCRC 910813)，以及它們的組合。特別地，該發酵培養物可為經固液分離處理而得到的菌體或實質上不含有菌體的流體。
在第二個方面，本發明提供一種用於治療一具有或被懷疑具有幽門螺旋桿菌感染的相關疾病之個體的方法，其包括對該個體投予一如上所述的乳酸菌菌株的發酵培養物。
較佳地，該乳酸菌菌株是一含有鼠李糖乳酸桿菌F-1 (BCRC 910469)、植物乳酸桿菌LPL28 (BCRC 910536)以及嗜酸乳酸桿菌TYCA06 (BCRC 910813)的組合。
發明的詳細說明
要被瞭解的是：若有任何一件前案刊物在此被引述，該前案刊物不構成一個下述承認：在台灣或任何其他國家之中，該前案刊物形成本技藝中的常見一般知識之一部分。
為了這本說明書之目的，將被清楚地瞭解的是：文字“包含有(comprising)”意指“包含但不限於”，以及文字“包括(comprises)”具有一對應的意義。
除非另外有所定義，在本文中所使用的所有技術性與科學術語具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同瞭解的意義。一熟悉本技藝者會認知到許多與那些被描述於本文中者相似或等效的方法和材料，它們可被用於實施本發明。當然，本發明決不受到所描述的方法和材料之限制。
本發明提供一種乳酸菌菌株的發酵培養物供應用於製備一用來治療和/或預防幽門螺旋桿菌感染的相關疾病之組成物的用途，其中該乳酸菌菌株是選自於由下列所構成的群組：鼠李糖乳酸桿菌(
Lactobacillus rhamnosus) F-1 (BCRC 910469)、植物乳酸桿菌(
Lactobacillus plantarum) LPL28 (BCRC 910536)、嗜酸乳酸桿菌(
Lactobacillus acidophilus) TYCA06 (BCRC 910813)，以及它們的組合。
依據本發明，該幽門螺旋桿菌感染的相關疾病是選自於由下列所構成之群組中的胃部疾病：胃潰瘍(gastric ulcer)、十二指腸潰瘍(duodenal ulcer)、胃腺癌(gastric adenocarcinoma)、胃食道逆流(gastroesophageal reflux)、消化不良(dyspepsia)、胃炎(gastritis)[例如萎縮性胃炎(atrophic gastritis)]、胃灼熱(pyrosis)，以及它們的組合。
如本文中所使用的，術語“治療(treating)”或“治療(treatment)”幽門螺旋桿菌感染的相關疾病意指該疾病的嚴重性(severity)或症狀(symptom)被減少(reduced)，或是該疾病被部分地(partially)或完全地(entirely)消除(eliminated)。
如本文中所使用的，術語“預防(preventing)”或“預防(prevention)”幽門螺旋桿菌感染的相關疾病意指一個體在還沒有被診斷具有該疾病時，消除(eliminate)或減少(reduce)該疾病的發生率(incidence)，以及減緩(slow)、延遲(delay)、控制(control)或減少(decrease)該疾病的可能性(likelihood)或機率(probability)。
依據本發明，該幽門螺旋桿菌感染的相關疾病的治療和/或預防可包括下列至少一者：抑制和/或防止幽門螺旋桿菌的生長、抑制和/或防止幽門螺旋桿菌的定殖、抑制幽門螺旋桿菌的尿素酶(urease)之表現，以及抑制幽門螺旋桿菌的尿素酶之活性。
依據本發明，該乳酸菌菌株的發酵培養物是藉由將具有一範圍落在10
6至10
10CFU/mL內之細菌濃度的該等乳酸菌菌株發酵培養於一適於生長的培養基中而被獲得。在本發明的一個較佳具體例中，該等乳酸菌菌株具有一範圍落在10
7至10
9CFU/mL內的細菌濃度。
依據本發明，適用於發酵培養該等乳酸菌菌株的培養基可以是熟習此項技藝者自行配製的，或者是商業上可購得的產品，這包括，但不限於：MRS肉湯培養基(MRS broth)以及添加有半胱胺酸(cysteine)的MRS肉湯培養基。
如本文中所使用的，術語“培養(culturing)”、“發酵(fermentation)”以及“培育(cultivation)”可被交換地使用。
有關發酵培養的操作程序與參數條件等是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。在此方面，可以參考，例如，Hsieh P.S.
et al. (2013),
New Microbiol.,36:167-179。
依據本發明，該發酵培養可在一範圍落在25℃至40℃內的溫度下被進行。在本發明的一個較佳具體例中，該發酵培養是於37℃下被進行。
依據本發明，該發酵培養被進行歷時一段範圍落在20至40小時內的時間。在本發明的一個較佳具體例中，該發酵培養被進行歷時24小時。
依據本發明，該乳酸菌菌株的發酵培養物可具有一範圍落在10
6至10
10CFU/mL內的細菌濃度。在本發明的一個較佳具體例中，該乳酸菌菌株的發酵培養物具有一為10
9CFU/mL的細菌濃度。
依據本發明，該乳酸菌菌株的發酵培養物是經固液分離處理而得到的菌體或實質上不含有菌體的流體。
依據本發明，該固液分離處理是選自於由下列所構成的群組：離心處理(centrifugation treatment)[例如，多級離心處理(Multi-stage centrifugation treatment)]、濃縮處理(concentration treatment)，以及它們的組合。
在本發明的一個較佳具體例中，該不含有菌體的流體是藉由將該乳酸菌菌株的發酵培養物進行離心處理而被獲得。
如本文中所使用的，術語“實質上不含有(substantially free of)”意指一被具體指明的組分缺少有意義的含量。較佳地，該組分的含量對於該乳酸菌菌株的發酵培養物的性質不具有可測量的影響(measurable effect)。更佳地，該乳酸菌菌株的發酵培養物完全不含有該組分。
依據本發明，該組成物可以是一食品組成物(food composition)，例如，呈一食品添加物(food additive)的形式，其可以被添加至一可食性材料(edible material)中以製備一供人類或動物食用的食品產品。依據本發明，該食物產品的種類可包括，但不限於：奶粉(milk powder)、發酵乳(fermented milk)、優格(yogurt)、乳酪(butter)、飲料(beverages)(例如，茶、咖啡)、機能性飲料(functional beverages)、麵製品(flour product)、烘焙食品(baked foods)、甜點(confectionery)、糖果(candies)、發酵食品(fermented foods)、動物飼料(animal feeds)、保健食品(health foods)、嬰兒食品(infant food)，以及膳食補充品(dietary supplements)。
依據本發明，該組成物可以是一藥學組成物(pharmaceutical composition)。
依據本發明，該藥學組成物可呈一適合於口服投藥(oral administration)、局部投藥(topical administration)或非經腸道投藥(parenteral administration)之劑型(dosage form)。
依據本發明，該藥學組成物可進一步包含有一被廣泛地使用於藥物製造技術之藥學上可接受的載劑(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，該藥學上可接受的載劑可包含一或多種選自於下列的試劑：溶劑(solvent)、緩衝液(buffer)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、崩解劑(disintegrating agent)、分散劑(dispersing agent)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤濕劑(wetting agent)、潤滑劑(lubricant)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)以及類似之物。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
依據本發明，該藥學組成物可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於口服投藥的劑型，這包括，但不限於：無菌的粉末、錠劑(tablet)、片劑(troche)、口含錠(lozenge)、丸劑(pellet)、膠囊(capsule)、分散性粉末(dispersible powder)或細顆粒(granule)、溶液、懸浮液(suspension)、乳劑(emulsion)、糖漿(syrup)、酏劑(elixir)、濃漿(slurry)以及類似之物。
依據本發明，該藥學組成物可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於非經腸道途徑投藥的劑型[包括注射品(injection)，例如，無菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液(dispersion)]，且以一選自於由下列所構成的群組中的途徑來投藥：腹膜內注射(intraperitoneal injection)、皮下注射(subcutaneous injection)、皮內注射(intradermal injection)以及舌下投藥(sublingual administration)。
依據本發明，該乳酸菌菌株是一含有鼠李糖乳酸桿菌F-1 (BCRC 910469)、植物乳酸桿菌LPL28 (BCRC 910536)以及嗜酸乳酸桿菌TYCA06 (BCRC 910813)的組合。較佳地，在該組成物中，鼠李糖乳酸桿菌F-1 (BCRC 910469)、植物乳酸桿菌LPL28 (BCRC 910536)以及嗜酸乳酸桿菌TYCA06 (BCRC 910813)的發酵培養物的相對比例是落在1：0.3：0.3至1：3：3的範圍內。在本發明的一個較佳具體例中，該相對比例是菌數比。在本發明的另一個較佳具體例中，該相對比例是不含有菌體的流體之體積比。
依據本發明，該組成物可進一步包含有一選自於由下列所構成之群組中的益生菌菌株的培養物：唾液乳酸桿菌(
Lactobacillus salivariussubsp.
salicinius) AP-32 (BCRC 910437)、約氏乳酸桿菌(
Lactobacillus johnsonii) MH-68 (BCRC 910438)，以及它們的組合。
本發明亦提供一種用於治療一具有或被懷疑具有幽門螺旋桿菌感染的相關疾病之個體的方法，其包括對該個體投予(administering)一如上所述的乳酸菌菌株的發酵培養物。
如本文中所使用的，術語“投予”以及“投藥(administration)”可被交換地使用，並且意指藉由任何合適的途徑來對一個體導入(introducing)、提供(providing)或遞送(delivering)一預定的活性成分以執行其預期的效用。
如本文中所使用的，術語“個體(subject)”意指任何感興趣的哺乳類動物，諸如人(humans)、猴子(monkeys)、牛(cows)、綿羊(sheeps)、馬(horses)、豬(pigs)、山羊(goats)、狗(dogs)、貓(cats)、小鼠(mice)以及大鼠(rats)。
依據本發明，該乳酸菌菌株的發酵培養物的投藥劑量與投藥次數會視下列因素而變化：要被改善的疾病之嚴重性，投藥途徑，以及要被改善的個體之體重、年齡、身體狀況與反應。一般而言，該乳酸菌菌株的發酵培養物可呈單一劑量或是分成數個劑量的形式而被口服地、局部地或非經腸道地投藥。
較佳實施例之詳細說明
本發明將就下面的實施例來做進一步說明，但應瞭解的是，該等實施例僅是供例示說明用，而不應被解釋為本發明的實施上的限制。
實施例 一般實驗材料： 1. 乳酸菌菌株：
在下面實施例中拿來進行功效評估的乳酸菌菌株已被揭露於TW I709374 B中，並且已被寄存於台灣的食品工業發展研究所(Food Industry Research and Development Institute, FIRDI)的生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center, BCRC)(300新竹市食品路331號，台灣)。另外，該等乳酸菌菌株亦有依據布達佩斯條約(the Budapest Treaty)的規定被寄存於中國典型培養物保藏中心(China Center for Type Culture Collection, CCTCC)以及中國普通微生物菌種保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC)。為表清楚，各個乳酸菌菌株的相關資訊(包括：學名、寄存編號以及寄存日期等)已被整合於下面表1中。
表1. 各個乳酸菌菌株的相關資訊
註：鼠李糖乳酸桿菌F-1 (BCRC 910469)以及嗜酸乳酸桿菌TYCA06 (BCRC 910813)已可自由分讓。
| 菌株 | 寄存編號 | 寄存日期 |
| 鼠李糖乳酸桿菌( Lactobacillus rhamnosus) F-1 | BCRC 910469 | 2010/04/08 |
| CCTCC No.M 2011124 | 2011/04/10 | |
| 植物乳酸桿菌( Lactobacillus plantarum) LPL28 | BCRC 910536 | 2011/12/27 |
| CGMCC No.17954 | 2019/06/18 | |
| 嗜酸乳酸桿菌( Lactobacillus acidophilus) TYCA06 | BCRC 910813 | 2018/01/18 |
| CGMCC No.15210 | 2018/01/15 |
為供比較，亦有使用下列乳酸菌菌株：申請人從人類的母乳中所分離出的鼠李糖乳酸桿菌L-12與加氏乳酸桿菌(
Lactobacillus gasseri) L-2，以及從健康人體的腸道中所分離出的植物乳酸桿菌L-305、嗜酸乳酸桿菌L-7以及乾酪乳酸桿菌(
Lactobacillus casei) L-10。
2. 在下面的實施例中所使用的大腸桿菌(
Escherichia coli) BCRC 51534以及幽門螺旋桿菌(
Helicobacter pylori) BCRC 17219皆是購自於台灣的食品工業發展研究所(FIRDI)的生物資源保存及研究中心(BCRC)(300新竹市食品路331號，台灣)。
3. 幽門螺旋桿菌菌液的製備：
首先，將50 µL之經活化的幽門螺旋桿菌BCRC 17219添加至450 µL的胰蛋白酶大豆肉湯培養基(tryptic soy broth, TSB)(BD Difco)中並予以混合均勻，接著添加至胰蛋白酶大豆血瓊脂(tryptic soy blood agar)的斜面培養基(agar slant)(Taiwan Prepared Media, Cat. No. 1080801-G1)上，並於37℃下進行雙相培養歷時72小時，藉此而得到具有一為5×10
6至5×10
7CFU/mL的細菌濃度之幽門螺旋桿菌菌液。
一般實驗方法： 1. 統計學分析(statistical analysis)：
在下面的實施例中，各組的實驗被重複3次，而實驗數據是以“平均值(mean)±平均值的標準誤差(standard error of the mean, SEM)”來表示。所有的數據是藉由雙尾史徒登氏t-試驗(two-tailed Student’s t-test)來作分析，俾以評估各組之間的差異性。若所得到的統計分析結果是
p＜0.05，這表示有統計學顯著性(statistical significance)。
實施例1. 乳酸菌菌株的懸浮菌液(suspended bacterial solution) 與發酵培養上澄液( fermented culture supernatant) 在抗幽門螺旋桿菌上的效用評估： 實驗材料： 1. 各種乳酸菌菌株的懸浮菌液與發酵培養上澄液的製備：
首先，將上面“一般實驗材料”的第1項當中所述的8種乳酸菌菌株分別接種至補充有0.05%半胱胺酸(cysteine)的MRS肉湯培養基(MRS broth)(Difco)中，並於37℃下進行培養歷時24小時，俾以活化菌株。接著，將經活化的菌株分別以一為2% (v/v)的接種量接種至MRS肉湯培養基中，並於一厭氧條件下以及37℃下進行培養歷時隔夜。之後，所形成的發酵培養物在4℃下以3,000 rpm來進行離心歷時10分鐘使菌體沉澱，繼而收取上澄液，而分別得到各個乳酸菌菌株的發酵培養上澄液，至於沉澱物(pellets)則以適量的0.1 M磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline, PBS)予以洗滌，接著使用適量的0.1 M PBS來予以散浮，而分別得到各個乳酸菌菌株的懸浮菌液。
2. 大腸桿菌BCRC 51534的懸浮菌液與培養上澄液的製備：
首先，將大腸桿菌BCRC 51534接種至營養培養基(nutrient broth)(HIMEDIA)中，並於37℃下進行培養歷時16小時，俾以活化菌株。接著，將經活化的菌株以一為2% (v/v)的接種量接種至營養培養基中，並於一好氧條件下以及37℃下進行培養歷時16小時。之後，所形成的培養物在4℃下以3,000 rpm來進行離心歷時10分鐘使菌體沉澱，繼而收取上澄液，而分別得到大腸桿菌BCRC 51534的培養上澄液，至於沉澱物則以適量的0.1 M PBS予以洗滌。接著，使用適量的0.1 M PBS來予以散浮並將大腸桿菌BCRC 51534調整成具有一為10
8CFU/mL的細菌濃度(以平板計數培養基來進行菌數計數)，藉此而得到大腸桿菌BCRC 51534的懸浮菌液。
實驗方法： A、 使用乳酸菌菌株的懸浮菌液與 發酵培養上澄液來處理幽門螺旋桿菌：
將上面“一般實驗材料”的第3項當中所得到的幽門螺旋桿菌菌液分成21組，其中包括1個正常對照組、1個正對照組、1個負對照組、3個單菌實驗組(亦即，單菌實驗組1至3)、5個單菌比較組(亦即，單菌比較組1至5)、7個複合菌實驗組(亦即，複合菌實驗組1至7)以及3個複合菌比較組(亦即，複合菌比較組1至3)，各組的體積皆為900 µL。接著，使用適量的0.1 M PBS來將上面“實驗材料”的第1項當中所得到的各個乳酸菌菌株的懸浮菌液調整成具有一為10
9CFU/mL的細菌濃度(以平板計數培養基來進行菌數計數)並分別取100 µL，繼而依據下面表2所示添加至各個單菌實驗組與單菌比較組的幽門螺旋桿菌菌液中，以及將100 µL之上面“實驗材料”的第2項當中所得到的大腸桿菌BCRC 51534的懸浮菌液添加至負對照組的幽門螺旋桿菌菌液中，將100 µL之240 µg/mL的阿莫西林(amoxicillin)添加至正對照組的幽門螺旋桿菌菌液中。
另外，將鼠李糖乳酸桿菌F-1 (BCRC 910469)、植物乳酸桿菌LPL28 (BCRC 910536)以及嗜酸乳酸桿菌TYCA06 (BCRC 910813)的懸浮菌液以不同比例來相互混合，而使得所形成的混合物的總細菌濃度皆為10
9CFU/mL且其中各個乳酸菌菌株的菌數比如下面表3所示，繼而分別取100 µL添加至對應的各個複合菌實驗組與複合菌比較組的幽門螺旋桿菌菌液中。至於正常對照組則不作任何處理。
表2 各個單菌組所處理的乳酸菌菌株
表3 各個複合菌組所處理的乳酸菌菌株的混合比例
| 組別 | 鼠李糖乳酸桿菌 | 植物乳酸桿菌 | 嗜酸乳酸桿菌 | 加氏乳酸桿菌 | 乾酪乳酸桿菌 |
| 單菌實驗組1 | F-1 | - | - | - | - |
| 單菌實驗組2 | - | LPL28 | - | - | |
| 單菌實驗組3 | - | - | TYCA06 | - | - |
| 單菌比較組1 | L-12 | - | - | - | - |
| 單菌比較組2 | - | L-305 | - | - | - |
| 單菌比較組3 | - | - | L-7 | - | - |
| 單菌比較組4 | - | - | - | L-2 | - |
| 單菌比較組5 | - | - | - | - | L-10 |
| 組別 | F-1：LPL28：TYCA06 |
| 複合菌實驗組1 | 1：0.3：0.3 |
| 複合菌實驗組2 | 1：0.5：0.5 |
| 複合菌實驗組3 | 1：1：1 |
| 複合菌實驗組4 | 1：1：2 |
| 複合菌實驗組5 | 1：1：3 |
| 複合菌實驗組6 | 1：2：1 |
| 複合菌實驗組7 | 1：3：1 |
| 複合菌比較組1 | 1：0.1：0.1 |
| 複合菌比較組2 | 1：10：1 |
| 複合菌比較組3 | 1：1：10 |
此外，為瞭解各個乳酸菌菌株的發酵培養上澄液在抗幽門螺旋桿菌上的效用，申請人大體上參照上面針對懸浮菌液所描述的方式來進行幽門螺旋桿菌菌液的分組以及處理，不同之處在於：以發酵培養上澄液來代替懸浮菌液，亦即，對各個單菌組處理以表2所示之乳酸菌菌株的發酵培養上澄液，對各個複合菌組處理以使用表3所示比例來混合不同體積的乳酸菌菌株的發酵培養上澄液而形成的混合物。
之後，將各組添加有懸浮菌液或發酵培養上澄液的幽門螺旋桿菌菌液分別取1 mL來添加至胰蛋白酶大豆血瓊脂的斜面培養基中，並於一微好氧條件下以及37℃下進行雙相培養歷時48小時。接著，收取所形成的培養物並以4,000 rpm來進行離心歷時10分鐘使菌體沉澱，繼而分別收取菌體以及上澄液並分別拿來進行下面第B與C項的分析。
B、 幽門螺旋桿菌之存活率 (survival rate) 的測定：
將上面第A項當中所得到之各組的菌體以1 mL的TSB培養基予以散浮，繼而取出100 µL並將之均勻塗佈在胰蛋白酶大豆血瓊脂上，然後於一微好氧條件下進行培養歷時96小時。接著，以平板計數培養基來進行幽門螺旋桿菌的菌數計數。
幽門螺旋桿菌的存活率(%)是藉由將所得到的菌數代入下列公式(1)而被計算出：
公式 (1) ： A ＝ (B/C) × 100其中：A＝幽門螺旋桿菌的存活率(%)
B＝各組所得到的菌數
C＝正常對照組所得到的菌數
之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項「統計學分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。
C、 尿素酶活性 (urease activity) 的測定：
將上面第A項當中所得到之各組的上澄液各取10 μL添加至300 μL的尿素酶反應緩衝液(urease reaction buffer, pH 6.5)[配於PBS中的20%尿素(urea)以及0.012%酚紅(phenol red)]中，並予以充分混合。接著，將所形成的混合物置於37℃下進行反應歷時1小時，然後於550 nm的波長下以一ELISA讀取機(ELISA reader)(型號為MQX200，廠牌為BioTek)來測量吸光值(OD
550)。若所測得的吸光值越高，代表幽門螺旋桿菌的活性越高且所分泌的尿素酶越多。
之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項「統計學分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。
結果： A、 幽門螺旋桿菌之存活率 的測定：
圖1以及圖2分別顯示幽門螺旋桿菌被處理以不同種的乳酸菌菌株的懸浮菌液與發酵培養上澄液後所測得的存活率。從圖1以及圖2可見，與正常對照組相較之下，各個單菌比較組的存活率皆無明顯的差異，而各個單菌實驗組的存活率皆有明顯的降低，這表示：鼠李糖乳酸桿菌F-1 (BCRC 910469)、植物乳酸桿菌LPL28 (BCRC 910536)以及嗜酸乳酸桿菌TYCA06 (BCRC 910813)的懸浮菌液與發酵培養上澄液皆能夠有效地抑制幽門螺旋桿菌生長，而其他同屬或相同物種的不同分離株的懸浮菌液與發酵培養上澄液則不具有此效用。
再者，相較於單菌實驗組1至3，複合菌實驗組1至7的存活率更呈現出顯著的降低並且低於正對照組所具者，而複合菌比較組1至3的存活率與單菌實驗組1至3所具者則無明顯的差異，這表示：以1：0.3：0.3至1：3：3的比例來組合使用鼠李糖乳酸桿菌F-1 (BCRC 910469)、植物乳酸桿菌LPL28 (BCRC 910536)以及嗜酸乳酸桿菌TYCA06 (BCRC 910813)的懸浮菌液或發酵培養上澄液皆能夠展現出協同效應(synergistic effect)。
B、 尿素酶活性的測定：
圖3顯示幽門螺旋桿菌被處理以不同種的乳酸菌菌株的懸浮菌液後所測得的尿素酶活性。從圖3可見，與正常對照組相較之下，各個單菌比較組的尿素酶活性皆無明顯的差異，而各個單菌實驗組的尿素酶活性皆有明顯的降低，這表示：鼠李糖乳酸桿菌F-1 (BCRC 910469)、植物乳酸桿菌LPL28 (BCRC 910536)以及嗜酸乳酸桿菌TYCA06 (BCRC 910813)的懸浮菌液皆能夠有效地抑制尿素酶活性，而其他同屬或相同物種的不同分離株的懸浮菌液則不具有此效用。
再者，相較於單菌實驗組1至3，複合菌實驗組1至7的尿素酶活性更呈現出顯著的降低並且近似於正對照組所具者，而複合菌比較組1至3的尿素酶活性與單菌實驗組1至3所具者則無明顯的差異。這表示：以1：0.3：0.3至1：3：3的比例來組合使用鼠李糖乳酸桿菌F-1 (BCRC 910469)、植物乳酸桿菌LPL28 (BCRC 910536)以及嗜酸乳酸桿菌TYCA06 (BCRC 910813)能夠展現出協同效應。
圖4顯示幽門螺旋桿菌被處理以不同種的乳酸菌菌株的發酵培養上澄液後所測得的尿素酶活性。從圖4可見，與正常對照組相較之下，單菌比較組2與3的尿素酶活性皆無明顯的差異，而單菌比較組1與4以及各個單菌實驗組的尿素酶活性則有呈現降低的情形，並且各個單菌實驗組的降低幅度是顯著高於單菌比較組1與4所具者。這表示：鼠李糖乳酸桿菌F-1 (BCRC 910469)、植物乳酸桿菌LPL28 (BCRC 910536)以及嗜酸乳酸桿菌TYCA06 (BCRC 910813)的發酵培養上澄液皆能夠有效地抑制尿素酶活性，並且其效用是顯著優於其他同屬或相同物種的不同分離株所具者。
另外，相較於單菌實驗組1至3，複合菌實驗組1至7的尿素酶活性更呈現出顯著的降低並且還顯著地低於正對照組所具者，而複合菌比較組1至3的尿素酶活性則是略高於單菌實驗組1至3所具者。這表示：以1：0.3：0.3至1：3：3的比例來組合使用鼠李糖乳酸桿菌F-1 (BCRC 910469)、植物乳酸桿菌LPL28 (BCRC 910536)以及嗜酸乳酸桿菌TYCA06 (BCRC 910813)能夠展現出協同效應。
綜合以上的實驗結果可知，鼠李糖乳酸桿菌F-1 (BCRC 910469)、植物乳酸桿菌LPL28 (BCRC 910536)以及嗜酸乳酸桿菌TYCA06 (BCRC 910813)的發酵培養物無論有無含有菌體皆具有優異的抗幽門螺旋桿菌效用，並且在相互組合下還能進一步增強此效用，因而被預期可供用於製備一用來治療和/或預防幽門螺旋桿菌感染的相關疾病，特別是胃部疾病。
於本說明書中被引述之所有專利和文獻以其整體被併入本案作為參考資料。若有所衝突時，本案詳細說明(包含界定在內)將佔上風。
雖然本發明已參考上述特定的具體例被描述，明顯地在不背離本發明之範圍和精神之下可作出很多的修改和變化。因此意欲的是，本發明僅受如隨文檢附之申請專利範圍所示者之限制。
本發明的上述以及其它目的、特徵與優點，在參照以下的詳細說明與較佳實施例和隨文檢附的圖式後，將變得明顯，其中：
圖1顯示幽門螺旋桿菌被處理以不同種的乳酸菌菌株的懸浮菌液後所測得的存活率，其中正常對照組表示未經任何處理的幽門螺旋桿菌；正對照組表示被處理以阿莫西林(amoxicillin)的幽門螺旋桿菌；負對照組表示被處理以大腸桿菌BCRC 51534的懸浮菌液的幽門螺旋桿菌；各個單菌組分別表示被處理以一如下面表2所示之乳酸菌菌株的懸浮菌液的幽門螺旋桿菌；各個複合菌組分別表示被處理以使用不同比例來相互混合之鼠李糖乳酸桿菌F-1 (BCRC 910469)、植物乳酸桿菌LPL28 (BCRC 910536)以及嗜酸乳酸桿菌TYCA06 (BCRC 910813)的懸浮菌液(該等乳酸菌菌株的菌數比如下面表3所示)的幽門螺旋桿菌；以及“***”表示：當與正常對照組作比較，
p＜0.001；
圖2顯示幽門螺旋桿菌被處理以不同種的乳酸菌菌株的發酵培養上澄液後所測得的存活率，其中正常對照組表示未經任何處理的幽門螺旋桿菌；正對照組表示被處理以阿莫西林的幽門螺旋桿菌；負對照組表示被處理以大腸桿菌BCRC 51534的培養上澄液的幽門螺旋桿菌；各個單菌組分別表示被處理以一如下面表2所示之乳酸菌菌株的發酵培養上澄液的幽門螺旋桿菌；各個複合菌組分別表示被處理以使用不同比例來相互混合之鼠李糖乳酸桿菌F-1 (BCRC 910469)、植物乳酸桿菌LPL28 (BCRC 910536)以及嗜酸乳酸桿菌TYCA06 (BCRC 910813)的發酵培養上澄液(該等乳酸菌菌株的體積比如下面表3所示)的幽門螺旋桿菌；以及“**”與“***”分別表示：當與正常對照組作比較，
p＜0.01與
p＜0.001；
圖3顯示幽門螺旋桿菌被處理以不同種的乳酸菌菌株的懸浮菌液後所測得的尿素酶活性，其中正常對照組表示未經任何處理的幽門螺旋桿菌；正對照組表示被處理以阿莫西林的幽門螺旋桿菌；負對照組表示被處理以大腸桿菌BCRC 51534的懸浮菌液的幽門螺旋桿菌；各個單菌組分別表示被處理以一如下面表2所示之乳酸菌菌株的懸浮菌液的幽門螺旋桿菌；各個複合菌組分別表示被處理以使用不同比例來相互混合之鼠李糖乳酸桿菌F-1 (BCRC 910469)、植物乳酸桿菌LPL28 (BCRC 910536)以及嗜酸乳酸桿菌TYCA06 (BCRC 910813)的懸浮菌液(該等乳酸菌菌株的菌數比如下面表3所示)的幽門螺旋桿菌；以及“*”與“**”分別表示：當與正常對照組作比較，
p＜0.05與
p＜0.01；以及
圖4顯示幽門螺旋桿菌被處理以不同種的乳酸菌菌株的發酵培養上澄液後所測得的尿素酶活性，其中正常對照組表示未經任何處理的幽門螺旋桿菌；正對照組表示被處理以阿莫西林的幽門螺旋桿菌；負對照組表示被處理以大腸桿菌BCRC 51534的培養上澄液的幽門螺旋桿菌；各個單菌組分別表示被處理以一如下面表2所示之乳酸菌菌株的發酵培養上澄液的幽門螺旋桿菌；各個複合菌組分別表示被處理以使用不同比例來相互混合之鼠李糖乳酸桿菌F-1 (BCRC 910469)、植物乳酸桿菌LPL28 (BCRC 910536)以及嗜酸乳酸桿菌TYCA06 (BCRC 910813)的發酵培養上澄液(該等乳酸菌菌株的體積比如下面表3所示)的幽門螺旋桿菌；以及“*”、“**”與“***”分別表示：當與正常對照組作比較，
p＜0.05、
p＜0.01與
p＜0.001。
TW中華民國；食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心(BCRC of FIRDI)；2011/12/27；BCRC 910536。
Claims (10)
- 一種乳酸菌菌株的發酵培養物供應用於製備一用來治療和/或預防幽門螺旋桿菌感染的相關疾病之組成物的用途，其中該乳酸菌菌株是選自於由下列所構成的群組：鼠李糖乳酸桿菌( Lactobacillus rhamnosus) F-1 (BCRC 910469)、植物乳酸桿菌( Lactobacillus plantarum) LPL28 (BCRC 910536)、嗜酸乳酸桿菌( Lactobacillus acidophilus) TYCA06 (BCRC 910813)，以及它們的組合。
- 如請求項1的用途，其中該幽門螺旋桿菌感染的相關疾病是選自於由下列所構成之群組中的胃部疾病：胃潰瘍(gastric ulcer)、十二指腸潰瘍(duodenal ulcer)、胃腺癌(gastric adenocarcinoma)、胃食道逆流(gastroesophageal reflux)、消化不良(dyspepsia)、胃炎(gastritis)、胃灼熱(pyrosis)，以及它們的組合。
- 如請求項1的用途，其中該乳酸菌菌株的發酵培養物是經固液分離處理而得到的菌體或實質上不含有菌體的流體。
- 如請求項1的用途，其中該組成物是一食品組成物。
- 如請求項1的用途，其中該組成物是一藥學組成物。
- 如請求項5的用途，其中該藥學組成物進一步包含有一藥學上可接受的載劑。
- 如請求項5的用途，其中該藥學組成物是呈一供口服投藥、局部投藥或非經腸道投藥的劑型。
- 如請求項1的用途，其中該乳酸菌菌株是一含有鼠李糖乳酸桿菌F-1 (BCRC 910469)、植物乳酸桿菌LPL28 (BCRC 910536)以及嗜酸乳酸桿菌TYCA06 (BCRC 910813)的組合。
- 如請求項8的用途，其中鼠李糖乳酸桿菌F-1 (BCRC 910469)、植物乳酸桿菌LPL28 (BCRC 910536)以及嗜酸乳酸桿菌TYCA06 (BCRC 910813)的發酵培養物的相對比例是落在1：0.3：0.3至1：3：3的範圍內。
- 如請求項1的用途，其中該組成物進一步包含有一選自於由下列所構成之群組中的益生菌菌株的培養物：唾液乳酸桿菌( Lactobacillus salivariussubsp. salicinius) AP-32 (BCRC 910437)、約氏乳酸桿菌( Lactobacillus johnsonii) MH-68 (BCRC 910438)，以及它們的組合。
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