CN114410531B - 降低血浆tmao及缓解、预防动脉粥样硬化的长双歧杆菌ccfm1216及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了降低血浆TMAO及缓解、预防动脉粥样硬化的长双歧杆菌CCFM1216及其应用，属于微生物技术领域。本发明的长双歧杆菌CCFM1216能够降低血浆TMAO和盲肠TMA的水平；能够改善肠道菌群的结构，恢复高胆碱造成的肠道菌群紊乱，降低有害菌的丰度(Bilophila属、Anaeroplasma属和Ruminococcaceae UCG‑009属)，减少肥胖、非酒精性脂肪肝、高脂血症、高血压、心血管疾病发生的风险。因此，具有广阔的应用价值。

Description

降低血浆TMAO及缓解、预防动脉粥样硬化的长双歧杆菌 CCFM1216及其应用
技术领域
本发明涉及降低血浆TMAO及缓解、预防动脉粥样硬化的长双歧杆菌CCFM1216及其应用，属于微生物技术领域。
背景技术
心血管疾病是世界范围内致病率和致死率主要的原因，动脉粥样硬化(AS)是心血管的病理基础。目前，公认的AS的始动因素为动脉壁内皮损伤及脂质的沉积；危险因子为高血压，血脂升高，炎症，氧化高胆碱，肥胖，抽烟等。
有研究表明，肠道微生物主要通过细菌感染、调节胆固醇和脂质代谢、食物及微生物代谢产物三种途径对动脉粥样硬化产生影响。经膳食-肠道微生物-肝脏-氧化三甲胺(TMAO)途径产生的TMAO可以促进心血管疾病发生发展。依赖微生物的三甲胺(TMA)/TMAO途径被证明与心血管疾病的发病机制相关，是心血管疾病的重要诊断和治疗靶点。干预肠道菌群代谢，或许可以成为预防和治疗心血管疾病方法之一。
大量的科学研究和临床实验已经证明，益生菌对便秘、肠炎、乳糖不耐、抗感染、炎症、过敏、糖脂代谢紊乱均具有显著改善作用。补充益生菌能直接给人体肠道注入大量的有益菌群，帮助改善菌群的代谢功能。
发明内容
本发明提供了一种长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM1216，其于2021年12月31日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号为GDMCC No：62175。
本发明还提供一种发酵食品，所述发酵食品为使用长双歧杆菌CCFM1216发酵生产制得，所述发酵食品包括固态食品、液态食品、半固态食品。
在一种实施方式中，所述发酵食品包括乳制品、豆制品、果蔬制品，所述乳制品包括牛奶、酸奶油、干酪；所述果蔬制品包括黄瓜、胡萝卜、甜菜、芹菜、圆白菜制品。
本发明还提供长双歧杆菌CCFM1216在制备体内定植益生菌制剂中的应用。
在一种实施方式中，所述益生菌制剂中长双歧杆菌CCFM1216的含量≥1×109CFU/mL或≥1×109CFU/g。
本发明还提供长双歧杆菌CCFM1216在制备减少肥胖、非酒精性脂肪肝、高脂血症、高血压、心血管疾病中至少一种疾病的发病风险的药物中的应用；所述心血管疾病包括但不限于动脉粥样硬化。
在一种实施方式中，所述应用包括如下至少一种作用：
(1)降低血浆TMAO的水平；
(2)降低盲肠TMA的水平；
(3)改善肠道菌群的结构，恢复高胆碱造成的肠道菌群紊乱。
在一种实施方式中，所述改善肠道菌群的结构包括降低有害菌的丰度。
在一种实施方式中，所述有害菌包括但不限于Bilophila属、Anaeroplasma属和Ruminococcaceae UCG-009属)。
本发明还提供长双歧杆菌CCFM1216在与药物联合使用时促进药物增效方面的应用。
在一种实施方式中，所述药物包括但不限于他汀类药物。
在一种实施方式中，所述药物增效物还含有药学上可接受的载体。
在一种实施方式中，所述药学上可接受的载体包括但不限于：填充剂、润湿剂、崩解剂、粘合剂或润滑剂中的一种或多种。
本发明的有益效果：
本发明提供的长双歧杆菌CCFM1216具有减少动脉粥样硬化、肥胖、非酒精性脂肪肝、高脂血症、高血压、心血管疾病等发病风险等作用，可用于制备药品，具有非常广泛的应用前景。在高胆碱模型小鼠实验中，服用本发明的长双歧杆菌CCFM1216能够显著降低血浆TMAO、血浆TMA和盲肠TMA的水平，能够改善肠道菌群的结构，恢复高胆碱造成的肠道菌群紊乱，降低有害菌的丰度(Bilophila属、Anaeroplasma属和Ruminococcaceae UCG-009属)，减少肥胖、非酒精性脂肪肝、高脂血症、高血压、动脉粥样硬化等心血管疾病发生的风险。
生物材料保藏
长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM1216，分类命名为Bifidobacteriumlongum，已于2021年12月31日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号为GDMCC No：62175。
附图说明
图1是发酵用乳酸菌长双歧杆菌CCFM1216的菌落形态；
图2是长双歧杆菌CCFM1216对胆碱饲料饲养的小鼠的血浆TMAO的影响；其中***P<0.001，****P<0.0001。
图3是长双歧杆菌CCFM1216对胆碱饲料饲养的小鼠的盲肠TMA的影响；其中**P<0.01，****P<0.0001。
图4为是长双歧杆菌CCFM1216对胆碱饲料饲养的小鼠的盲肠Bilophila属、Anaeroplasma属和Ruminococcaceae UCG-009属的影响；其中*P<0.05，**P<0.01。
图5是不同长双歧杆菌对胆碱饲料饲养的小鼠的血浆TMAO的影响；其中***P<0.001，****P<0.0001。
具体实施方式
所述长双歧杆菌CCFM1216具有以下生物学特性：
(1)菌体特征：呈革兰氏染色阳性，不形成抱子，不运动的细菌。
(2)菌落特征：菌落呈乳白色，圆形，边缘整齐，微凸起，不透明，表面湿润光滑；
(3)生长特性：该菌株的最适生长温度是35-37℃，最适生长pH为6.5，培养18h后进入稳定期；
(4)在高胆碱小鼠模型中能够显著降低血浆TMAO的水平；
(5)在高胆碱小鼠模型中能够显著降低盲肠TMA的水平；
(6)在高胆碱小鼠模型中能够显著降低Bilophila属、Anaeroplasma属和Ruminococcaceae UCG-009属的丰度，减少肥胖、非酒精性脂肪肝、高脂血症、高血压、心血管疾病的风险。
所述长双歧杆菌CCFM1216的提取方法为：
(一)长双歧杆菌的分离筛选：
(l)取1g健康人的新鲜粪便。梯度稀释后涂布于mMRS固体培养基，置于厌氧环境下37℃培养72小时；
(2)观察记录菌落形态，挑取菌落划线纯化；
(3)在MRS液体培养基中，37℃培养48小时，所得菌落进行革兰氏染色，记录菌落形态。
(4)弃除菌落中的革兰氏阴性菌菌株和革兰氏阳性球菌，挑选得到革兰氏阳性杆菌。
(5)过氧化氢酶分析后，弃除过氧化氢酶阳性菌株，保留过氧化氢酶阴性菌株。
(二)长双歧杆菌的分子生物学鉴定：
(l)单菌基因组抽提：将步骤(二)所筛选得到的乳酸片球菌培养过夜，取培养过夜的菌悬液lmL于1.5mL离心管，10000rpm离心2min，弃上清得菌体；用lmL无菌水吹洗菌体后，10000rpm离心2min，弃上清得菌体；加入200μL SDS裂解液，80℃水浴30min；加入酚-氯仿溶液200μL于菌体裂解液中，其中酚-氯仿溶液的组成成分及体积比为Tris饱和酚:氯仿:异戊醇＝25:24:1，颠倒混匀后，12000rpm离心5-10min，取上清200μL；加入400μL冰乙醇或冰异丙醇于200uL上清中，﹣20℃静置1h，12000rpm离心5-10min，弃上清；加入500μL70％(体积百分数)冰乙醇重悬沉淀，12000rpm离心1-3min，弃上清；60℃烘箱烘干，或者自然晾干；50μLddH2O重溶沉淀以备PCR；
(2)16S rDNA PCR：
A.细菌16S rDNA 50μLPCR反应体系：
10×Taq buffer，5μL；dNTP，5μL；27F，0.5μL；1492R，0.5μL；Taq酶，0.5μL；模板，0.5μL；ddH2O，38μL。
B.PCR条件：
95℃5min；95℃10s；55℃30s；72℃30s；step2-4 30×；72℃5min；12℃2min；
C.制备1％琼脂糖凝胶，之后将PCR产物与10000×loading buffer混合，上样量2μL，120V跑30min，然后进行凝胶成像；
D.将得到PCR产物送专业测序公司，将得到的测序结果与使用BLAST在GeneBank中进行搜索和相似性比对，鉴定为长双歧杆菌。
(3)全基因组测序
将提取的全基因组送专业测序公司，利用二代测序仪对菌的全基因组进行测序，将得到的序列结果使用BLAST在GeneBank中进行搜索和相似性比对，测序结果鉴定为属于长双歧杆菌的一种新发现的菌株。菌株-80℃保藏备用。
实施例1：长双歧杆菌CCFM1216对模拟胃肠液的耐受性
将冷冻保存的长双歧杆菌CCFM1216接种于MRS培养基中，在温度37℃厌氧培养48h，再经MRS培养液传代培养2～3次后，取1mL长双歧杆菌CCFM1216的培养液，与9.0mLpH2.5人工模拟胃液(含1％胃蛋白酶、pH＝2.5的MRS培养基)混合，并在37℃下厌氧培养，分别在0h、0.5h、1h和2h时取样，用MRS琼脂培养基浇注培养进行平板菌落计数，测定活菌数并计算其存活率。
存活率是在该培养液中在取样时的活菌数对数值与在第0h时活菌数对数值之比，以％表示。取1mL长双歧杆菌CCFM1216的培养液加入9mL人工模拟肠液(含0.3％牛胆盐、1％胰蛋白酶、pH＝8.0的MRS培养基)中，在37℃下厌氧培养，分别在0h、0.5h、1h、2h、3h和4h时取样，用MRS琼脂培养基浇注培养进行平板菌落计数，测定活菌数并计算其存活率。存活率是在该培养液中在取样时的活菌数对数值与在第0h时活菌数对数值之比，以％表示。实验结果如表1和表2所示。结果表明，长双歧杆菌CCFM1216对人工胃肠液具有较好的耐受性。
表1长双歧杆菌CCFM1216在人工模拟胃液中的耐受性
表2长双歧杆菌CCFM1216在人工模拟肠液中的耐受性
实施例2：长双歧杆菌CCFM1216用于降低血浆TMAO的水平
取体重18-20g的健康雌性C57BL/6J小鼠24只，适应环境1周，随机分为4组：空白对照组(Control)、模型对照组(Choline)、长双歧杆菌CCFM1216组(CCFM1216)、长双歧杆菌FJSNT53M9对照组(按照相同方法筛选自江苏省南通市人体粪便的另一株长双歧杆菌FJSNT53M9，菌株公开于：朱如意，杭锋，张灏等.双歧杆菌生物膜形成规律及其表面性质相关性研究[J].食品与发酵工业,2020)。每组含小鼠6只，灌胃的剂量为每天每只小鼠灌胃0.2mL菌浓不低于1×109cfu/mL的菌液。
菌液的制备方法为：将长双歧杆菌CCFM1216和长双歧杆菌FJSNT53M9分别划线接种至MRS固体培养基中，在37℃条件下培养72h得到单菌落，将制备得到的单菌落分别接种至MRS液体培养基中，在37℃条件下培养24h进行活化；将活化3代后的菌液分别以2％的接种量接种至1L MRS液体培养基中，振荡混匀后于厌氧培养箱中37℃培养24h。在8000g/min，4℃的条件下离心15min，去上清后，用无菌生理盐水(含0.05％-0.1％的L-半胱氨酸盐酸盐)进行清洗2次，同样以相同条件进行离心，去上清后，用30％的甘油进行重悬，获得菌浓数量级不低于1×109CFU/mL的菌液。
将菌液于-80℃冰箱冻存一周。在进行动物实验前，将冰箱中冻存的菌液取出，将菌液以6 000r/min离心5min，再用无菌生理盐水清洗两遍，用10％脱脂乳重悬菌液，震荡均匀后用平板倾注法测定初始和冻存一周后的活菌数量。实验结果：初始活菌数分别为2.1×109CFU/mL，2.0×109CFU/mL，1周后活菌数为1.8×109CFU/mL，1.6×109CFU/mL数量级并没有产生变化，说明将菌液冻存后不会对实验产生影响，可用于动物实验。实验动物分组及处理方法见表3。
表3实验动物分组
第2-7周：正常组小鼠喂食普通饲料，其余小鼠喂食胆碱饲料。C57BL/6J小鼠(雌性，7周龄)，购自于北京维通利华实验动物技术有限公司。普通饲料(LAD 3001M，胆碱含量为0.1％)和胆碱饲料(LAD 3001M，胆碱含量为1.0％)，购自于南通特洛菲饲料科技有限公司。
试验结束前，小鼠禁食禁水4h，通过眼眶周围毛细管取血。血液样本4000×g、4℃条件下离心15min，取上清，冻存于-80℃冰箱，取20μL血浆样品加入80μL(V：V，1：4)乙腈沉淀血浆样品中的蛋白质，同时加入终浓度为2.0μM的d9-TMAO到血浆样品中作为内标。混匀，-80℃静置2h，在4℃条件下12000g 15分钟，吸上清至进样瓶中，保存在-80℃冰箱，通过HPLC-MS/MS测定血浆TMAO水平。
血浆TMAO实验结果如图2所示，胆碱饲料组小鼠血浆TMAO显著高于对照饲料组，大约比对照组高出5.78倍，与胆碱组小鼠相比，灌胃长双歧杆菌CCFM1216显著降低血浆TMAO的水平，与胆碱组小鼠比，灌胃长双歧杆菌CCFM1216小鼠的血浆TMAO降低了27.60％，而灌胃对照菌FJSNT53M9小鼠的血浆TMAO只降低了0.04％。
实施例3：长双歧杆菌CCFM1216用于降低盲肠TMA的水平
C57BL/6J小鼠分组、造模及处理方法同实施例2。
试验结束时，小鼠禁食禁水12h，腹腔注射10％的水合氯醛溶液麻醉后，取小鼠盲肠，冻存于-80℃冰箱，称取小鼠盲肠内容物，每mg盲肠内容物加入20μL的混合溶液(乙腈：甲醇：水以体积比40:40:20混合)，同时加入终浓度为2.5μM的d9-TMA到盲肠样品中作为内标，振荡混匀，-80℃静置2h，在4℃条件下12000g15分钟，吸上清至进样瓶中，保存在-80℃冰箱，通过HPLC-MS/MS测定小鼠盲肠中TMA的含量。
盲肠TMA实验结果如图3所示，胆碱饲料组小鼠盲肠TMA显著高于对照饲料组，大约比对照组高出3.13倍，与胆碱组小鼠相比，灌胃长双歧杆菌CCFM1216显著降低盲肠TMA的水平，与胆碱组小鼠比，灌胃长双歧杆菌CCFM1216的小鼠盲肠TMA降低了50.68％，而灌胃对照菌FJSNT53M9的小鼠盲肠TMA只降低了11.45％。
实施例4：长双歧杆菌CCFM1216用于降低盲肠有害微生物的丰度
C57BL/6J小鼠分组、造模及处理方法同实施例2。
试验结束时，小鼠禁食禁水12h，腹腔注射10％的水合氯醛溶液麻醉后，取盲肠，按照粪便DNA试剂盒的方法提取盲肠DNA，利用二代测序仪对盲肠的V3-V4区进行16S rDNA菌群分析。
实验结果如图4所示。胆碱饲料组小鼠盲肠Bilophila属、Anaeroplasma属和Ruminococcaceae UCG-009属的相对丰度显著高于对照饲料组，与胆碱组小鼠相比，灌胃长双歧杆菌CCFM1216显著降低盲肠Bilophila属、Anaeroplasma属和Ruminococcaceae UCG-009属的相对丰度。
实施例5：比较不同长双歧杆菌对胆碱饲料喂养的小鼠的血浆TMAO的影响
小鼠造模及处理方法同实施例2，分别用16株不同株的长双歧杆菌灌胃胆碱饲料喂养的小鼠，检测血浆TMAO。如图5所示，只有CCFM1216具有显著的降低胆碱饲料喂养的小鼠血浆TMAO的能力，相比胆碱组下降了27.60％，其它长双歧杆菌均未显著降低胆碱饲料喂养的小鼠血浆的TMAO。
实施例6：利用本发明长双歧杆菌CCFM1216制造含该菌的发酵食品
选用新鲜苹果洗净后榨汁，接着进行高温瞬间灭菌，在温度140℃下高温热杀菌2秒后，立即降温至37℃，再接入本发明制备的长双歧杆菌CCFM1216菌剂发酵剂，使其浓度达到108CFU/mL以上，在温度4℃下冷藏保存，于是得到含有本发明长双歧杆菌CCFM1216活菌的果蔬饮料。
利用本发明能够使用长双歧杆菌CCFM1216发酵生产制备其他发酵食品，所述发酵食品包括固态食品、液态食品、半固态食品。所述发酵食品包括乳制品、豆制品、果蔬制品，所述乳制品包括牛奶、酸奶油、干酪；所述果蔬制品包括黄瓜、胡萝卜、甜菜、芹菜、圆白菜制品。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）CCFM1216，其于2021年12月31日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号为GDMCC No：62175。
2.一种发酵食品，其特征在于，所述发酵食品为使用长双歧杆菌CCFM1216发酵生产制得，所述发酵食品含权利要求1所述的长双歧杆菌CCFM1216。
3.根据权利要求2所述的发酵食品，其特征在于，所述发酵食品为发酵乳制品、发酵豆制品、或发酵果蔬制品。
4.权利要求1所述的长双歧杆菌CCFM1216在制备益生菌制剂中的应用。
5.一种益生菌制剂，其特征在于，所述益生菌制剂中含有权利要求1所述的长双歧杆菌，所述长双歧杆菌CCFM1216的含量≥1×109CFU/mL或≥1×109CFU/g。
6.权利要求1所述的长双歧杆菌CCFM1216在制备减少动脉粥样硬化的发病风险的药物中的应用。
7.权利要求1所述的长双歧杆菌CCFM1216在制备减少心血管疾病的发病风险的药物中的应用。
8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述应用包括如下至少一种作用：
（1）降低血浆TMAO的水平；
（2）降低盲肠TMA的水平；
（3）改善肠道菌群的结构，恢复高胆碱造成的肠道菌群紊乱。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述改善肠道菌群的结构包括降低有害菌的丰度。
10.含有权利要求1所述长双歧杆菌CCFM1216的药物，其特征在于，还含有药学上可接受的载体。
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