CN108865952A - 一种溶磷降镉微生物菌剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物应用环保领域，具体涉及一种溶磷降镉微生物菌剂及其制备方法。本发明提供了一种兼具溶磷降镉作用的微生物菌剂及其制备方法：包括以下原料：复合菌剂15‑30份、载体70‑85份；所述复合菌剂中含有甲基营养型芽孢杆菌2.5‑15亿cfu/g、罗尔斯通氏菌1.0‑5.0亿cfu/g、淡紫拟青霉0.5‑4.0亿cfu/g。所述载体为草炭、硅藻土经过干燥过筛得到的粉状物，其中草炭具有提高土壤持水、通气和保肥能力的优点，硅藻土具有吸附性能强、pH中性无毒、混合均匀性好等优点。本发明提供的溶磷降镉微生物菌剂为粉状，在整地时施用，可有效改良土壤肥力、增加土壤中可供作物吸收的有效磷含量，同时通过微生物的代谢活动降低镉离子的移动性，降低作物对镉离子的吸收。

Description

一种溶磷降镉微生物菌剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种溶磷降镉微生物菌剂及其制备方法，属于微生物应用环保领域。
背景技术
中国环境与发展国际合作委员会《中国土壤环境保护政策研究》显示，我国约50％以上的耕地微量元素缺乏，耕地缺磷面积达51％，由于过度垦殖，土壤因有机质匮乏导致养分比例失衡，土壤养分的长期低投入、高支出造成全国范围土壤肥力下降，更为严重的是，根据环境保护部对30万公顷基本农田保护区土壤有害重金属抽样监测发现，有3.6万公顷土壤重金属超标，超标率达12.1％(王娇.我国土壤环境保护研究的回顾与展望[J].城市建设理论研究：电子版，2016，6(8).)，有数据显示我国受镉、砷、汞、铜、锌等重金属污染的耕地约1.5亿亩，每年因重金属污染(如镉米等)粮食达1000多万吨，直接经济损失200余亿元。目前，土壤污染类型大致分为无机型、有机型及复合型污染，其中无机污染物(重金属)超标点位数高达82.8％，镉污染物点位超标率达7.0％(杨启良，武振中，陈金陵，等.植物修复重金属污染土壤的研究现状及其水费调控技术展望[J].生态环境学报，2015，24(6)：1075-1084.)。这些重金属不能如有机物一样被微生物消化分解，只能在生态环境中迁移、转化，并不断积累，一旦重金属浓度积累到一定限度值时，就会对土壤植物系统产生毒害效应，进而通过食物链循环危害动物、人类的生命健康。
世界卫生组织(WHO)将镉列为重点研究的食品污染物；国际癌症研究机构(IARC)将镉认定为I类致癌物。镉在体内累积一定程度，能够损害泌尿系统、使身体结缔组织损伤、生殖系统功能障碍、致畸，且能引发乳腺癌。2013年春末的“镉米”食品安全事件触动了公众神经的同时，也成为了影响社会稳定不良因素之一，很多人这才意识到，原来土壤也会藏毒。常言道“民以食为天”，这让日益关注重视身体健康的老百姓产生心理恐慌，对农产品种植户更是带来了极大的创伤，从另一方面来说，不同程度地影响了国家的社会经济稳定。
中国专利CN 106187402A公开了一种土壤降镉专用肥料及其制备方法，除载体外，其中微生物为黑曲霉菌剂，功能菌种单一。而对于重金属污染土壤的修复，有必要研制出多功能微生物菌剂产品，移除或固定化重金属的同时，微生物的代谢活动可以改善土壤的营养，如降解土壤中难溶性氮、磷等，以及降低土传病害发生率等。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的是提供一种能够兼具对土壤溶磷和降镉作用的微生物菌剂及其制备方法。本发明提供的溶磷降镉微生物菌剂，在整地施用时，可有效改良土壤肥力、增加土壤中可供作物吸收的有效磷含量，同时降低作物对镉离子的吸收。
为了实现本发明目的，本发明提供的溶磷降镉微生物菌剂制备的方法，包括载体的制备、复合菌剂的制备、及载体与复合菌剂的混合，复合菌剂16～35重量份、载体65～84重量份；其中，所述复合菌剂中含有甲基营养型芽孢杆菌(英文名：Bacillusmethylotrophicus)20.0～40.0亿cfu/g、罗尔斯通氏菌(英文名：Ralstonia respiraculi)5.0-15.0亿cfu/g、淡紫拟青霉(英文名：Paecilomyces lilacinus)5.0-15.0亿cfu/g，总有效活菌数≥50.0亿cfu/g；所述载体为草炭、硅藻土经过干燥过筛处理的粉状物，其中草炭、硅藻土的用量比为1∶1。
优选地，所述溶磷降镉微生物菌剂包括复合菌剂20-28重量份、载体72-80重量份；其中，所述复合菌剂中含有甲基营养型芽孢杆菌30.0～38.0亿cfu/g、罗尔斯通氏菌7.0～12.0亿cfu/g、淡紫拟青霉7.0～12.0亿cfu/g，总有效活菌数≥50.0亿cfu/g。
更为优选地，所述溶磷降镉微生物菌剂包括复合菌剂25重量份、载体75重量份；其中，所述复合菌剂中含有甲基营养型芽孢杆菌35.0亿cfu/g、罗尔斯通氏菌7.5亿cfu/g、淡紫拟青霉7.0～12.0亿cfu/g，总有效活菌数≥50.0亿cfu/g。
本发明还提供上述溶磷降镉微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备载体；
(2)制备复合菌剂；
(3)将所述载体与复合菌剂按比例混合均匀，得到溶磷降镉微生物菌剂。
前述载体是由草炭、硅藻土按比例混合，经干燥过筛而成。
具体地，所述载体的制备方法包括：
将草炭、硅藻土按重量比例1∶1用粉碎机粉碎，优选细度为过100目筛90％以上。
本发明所述重量份可以是ug、mg、g、kg等本领域公知的重量单位，也可以是其倍数，如1/10、1/100、10倍、100倍等。
所述复合菌剂的制备方法，包括如下步骤：
I.甲基营养型芽孢杆菌芽孢粉的制备：将甲基营养型芽孢杆菌原始菌种在无菌条件下依次进行斜面培养、摇瓶培养、发酵罐培养后，将得到的发酵液与玉米淀粉混合，经过浓缩干燥制备成甲基营养型芽孢杆菌芽孢粉；
II.罗尔斯通氏菌菌粉的制备：将罗尔斯通氏菌原始菌种在无菌条件下依次进行斜面培养、摇瓶培养、发酵罐培养后，将得到的发酵液与玉米淀粉混合，经过浓缩干燥制备成罗尔斯通氏菌菌粉；
III.淡紫拟青霉孢子粉的制备：将淡紫拟青霉菌种在无菌条件下分别依次进行斜面培养、摇床培养、发酵罐培养、固体发酵产孢后，将得到的固体发酵产物浓缩干燥制备成淡紫拟青霉孢子粉；
IV.将上述制得的甲基营养型芽孢杆菌芽孢粉、罗尔斯通氏菌菌粉、淡紫拟青霉孢子粉比例混合，即得复合菌剂。
上述复合菌剂的制备步骤I、II、III具体包括：
I.甲基营养型芽孢杆菌芽孢粉的制备：
a.斜面培养：将甲基营养型芽孢杆菌原始菌种在无菌条件下接种于斜面培养基上，35℃条件下培养24-48h；
b.摇床培养：将步骤a培养的斜面菌种在无菌条件下接种于种子培养基中，35℃、160r/min条件下培养14-18h；
c.发酵罐培养：将步骤b培养好的种子液在无菌条件下接种于液体发酵培养基中，在pH7.0、罐压0.05～0.06MPa、35～37℃、通风量1∶0.4～0.6vvm的条件下，培养48-56h后，检测活菌数大于5.0×109cfu/mL，80％菌体为芽孢时，下罐，得到发酵液备用
d.将步骤c中得到的发酵液按等重量比混合玉米淀粉，经过浓缩干燥制备成甲基营养型芽孢杆菌芽孢粉。
其中，步骤a中使用的斜面培养基的配方如下：蛋白胨10.0g、牛肉粉3.0g、氯化钠5.0g、琼脂粉15-18g和水1000mL，调节pH7.3±0.1；步骤b中使用的种子培养基配方如下：葡萄糖20g、蛋白胨20g、酵母膏10g和水1000mL，调节pH7.0±0.1；步骤c中使用的液体发酵培养基配方如下：玉米粉7.5g、麸皮粉7.5g、葡萄糖5g、碳酸钙5g、硫酸镁3g、和水1000mL，pH7.0。
II.罗尔斯通氏菌菌粉的制备：
a.斜面培养：将罗尔斯通氏菌原始菌种在无菌条件下接种于斜面培养基上，35℃条件下培养24-48h；
b.摇床培养：将步骤a培养的斜面菌种在无菌条件下接种于种子培养基中，35℃、150r/min条件下培养14-18h；
c.发酵罐培养：将步骤b培养好的种子液在无菌条件下接种于液体发酵培养基中，在pH6.8～7.0、罐压0.05～0.06MPa、35℃、通风量1∶0.8～1.1vvm的条件下，培养48-56h后，检测活菌数大于2.0×109cfu/mL时，下罐，得到发酵液备用。
d.将步骤c中得到的发酵液按等重量比混合玉米淀粉，经过浓缩干燥制备成罗尔斯通氏菌菌粉。
其中，步骤a中使用的斜面培养基的配方如下：蛋白胨10.0g、牛肉粉3.0g、氯化钠5.0g、琼脂粉15-18g和水1000mL，调节pH7.3±0.1；步骤b中使用的种子培养基配方如下：葡萄糖20g、蛋白胨20g、酵母膏10g和水1000mL，调节pH7.0±0.1；步骤c中使用的液体发酵培养基配方如下：蛋白胨0.25g、胰蛋白胨0.25g、酵母粉0.5g、葡萄糖0.5g、七水硫酸镁0.03g，水1000mL，调节pH6.8-7.0。
III.淡紫拟青霉孢子粉的制备：
a.斜面培养：将淡紫拟青霉原始菌种在无菌条件下接种于斜面培养基上，在28℃条件下培养72小时；
b.摇床培养：将步骤a培养的菌种在无菌条件下接种于种子培养基中，在pH6.0～6.5、26℃条件下，160r/min摇床培养18～24h；
c.发酵罐培养：将步骤b培养的菌种在无菌条件下分别接种于液体发酵培养基，在pH6.0-7.0、罐压0.05～0.06MPa、26℃、通风量为1∶0.6～0.8vvm，在培养72小时后，菌丝体占总体积的20％时终止发酵，进行固体发酵产孢；
d.固体发酵产孢：将步骤c经过发酵罐培养后的菌丝体接种到固体发酵培养基上，培养168-180小时，待淡紫拟青霉90％产孢时停止发酵；
e.将步骤d中得到的固体发酵产物浓缩干燥制备成淡紫拟青霉孢子粉；
其中，步骤a中使用的斜面培养基的配方如下：葡萄糖20g、土豆汁200g、琼脂20g和水1000mL，pH自然；步骤b中使用的种子培养基配方如下：白糖20g、蛋白胨5g、磷酸二氢钾0.2g、硫酸镁0.2g、氯化钠2g和水1000mL；步骤c中使用的液体发酵培养基配方如下：淀粉12kg、玉米粉3kg、豆饼粉1.2kg、白糖12kg、蛋白胨3kg、硫酸镁0.12kg、氯化钠12kg、消泡剂50mL，加水至600L；步骤d中的固体发酵培养基配方如下：麸皮、玉米粉和豆饼粉按7∶2∶1重量比混合组成的固体料中加入水，即得固体发酵培养基，固体料与水的重量比为1∶0.6；
本发明中用于溶磷降镉微生物菌剂制备的菌株，甲基营养型芽孢杆菌的保藏编号为ACCC 19730，罗尔斯通氏菌的保藏编号为ACCC 01045、淡紫拟青霉的保藏编号为ACCC30673。
本发明的上述技术方案具有如下优点：
(一)本发明的溶磷降镉微生物菌剂中，微生物种类搭配合理，其中甲基营养性芽孢杆菌具有溶解磷的作用，并能在土壤或作物根部快速繁殖并定植成为优势菌种，同时其代谢产物对土壤中的镉具有吸附钝化作用；罗尔斯通氏菌对高浓度的镉有较强的耐受力，淡紫拟青霉对重金属镉也有较强耐性和吸附力，且淡紫拟青霉菌丝与土壤接触面积大，对降低土壤中的重金属镉具有良好效果，淡紫拟青霉菌对根结线虫的繁殖还具有一定的抑制作用。另外，本发明所采取的菌剂载体中，草炭具有提高土壤持水、通气和保肥能力的优点，硅藻土具有吸附性能强、pH中性无毒、混合均匀性好等优点，在一定程度上改良土壤。
(二)本发明提供的溶磷降镉微生物菌剂，在整地时施用，可有效改良土壤肥力、增加土壤中可供作物吸收的有效磷含量，同时通过微生物的代谢活动钝化镉离子，降低作物对镉离子的吸收。
以下实施例对用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1 溶磷降镉微生物菌剂及其制备方法
溶磷降镉微生物菌剂含以下重量份计的原料：
载体 75份；
复合菌剂 25份。
所述复合菌剂的构成如下：
所述载体为草炭、硅藻土按重量比例1∶1混合，然后经过干燥过筛处理的粉状物。
上述溶磷降镉微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)载体的制备
将草炭、硅藻土按重量比例1∶1用粉碎机粉碎，得到混合料；将预混料烘干、破碎、过100目筛，即得到载体。
(2)复合菌剂的制备
I.甲基营养型芽孢杆菌芽孢粉的制备：将甲基营养型芽孢杆菌原始菌种在无菌条件下依次进行斜面培养、摇瓶培养、发酵罐培养后，将得到的发酵液与玉米淀粉混合，经过浓缩干燥制备成甲基营养型芽孢杆菌芽孢粉；
II.罗尔斯通氏菌菌粉的制备：将罗尔斯通氏菌原始菌种在无菌条件下依次进行斜面培养、摇瓶培养、发酵罐培养后，将得到的发酵液与玉米淀粉混合，经过浓缩干燥制备成罗尔斯通氏菌菌粉；
III.淡紫拟青霉孢子粉的制备：将淡紫拟青霉菌种在无菌条件下分别依次进行斜面培养、摇床培养、发酵罐培养、固体发酵产孢后，将得到的固体发酵产物浓缩干燥制备成淡紫拟青霉孢子粉；
IV.将上述制得的甲基营养型芽孢杆菌芽孢粉、罗尔斯通氏菌菌粉、淡紫拟青霉孢子粉比例混合，即得复合菌剂。
实施例2 溶磷降镉微生物菌剂及其制备方法
溶磷降镉微生物菌剂含以下重量份计的原料：
载体 78份；
复合菌剂 22份。
所述复合菌剂的构成如下：
所述载体为草炭、硅藻土经过干燥过筛处理的粉状物，草炭、硅藻土的用量比为1∶1。
该溶磷降镉微生物菌剂的制备方法同实施例1。
实施例3 溶磷降镉微生物菌剂及其制备方法
溶磷降镉微生物菌剂含以下重量份计的原料：
载体 84份；
复合菌剂 16份。
所述复合菌剂的构成如下：
所述载体为草炭、硅藻土经过干燥过筛处理的粉状物，草炭、硅藻土的用量比为1∶1。
该溶磷降镉微生物菌剂的制备方法同实施例1。
实施例4 溶磷降镉微生物菌剂及其制备方法
溶磷降镉微生物菌剂含以下重量份计的原料：
载体 65份；
复合菌剂 35份。
所述复合菌剂的构成如下：
所述载体为草炭、硅藻土经过干燥过筛处理的粉状物，草炭、硅藻土的用量比为1∶1。
该溶磷降镉微生物菌剂的制备方法同实施例1。
将实施例1-4的微生物菌剂应用于镉污染土，以不施用微生物菌剂为对照组。其中，土壤中的有效磷含量采用紫外可见光分光光度计(钼锑抗比色法)测定；土壤中的有效镉含量采用原子吸收分光光度计(火焰法)测定，土壤的理化性状见表1。
表1土壤的理化性状
经测定，得到各处理组别的有效镉含量及有效磷含量：
对比实施例1
将实施例1中的甲基营养型芽孢杆菌去除(其余同实施例1)，得到微生物菌剂，并应用于镉污染土，经测定得到以下有效镉含量及有效磷含量：
由对比实施例1可知，在将甲基营养型芽孢杆菌去除的条件下，菌剂的降镉效果显著下降，且溶磷效果增加幅度较小。
对比实施例2
将实施例1中的罗尔斯通氏菌去除(其余同实施例1)，得到微生物菌剂，并应用于镉污染土，经测定得到以下有效镉含量及有效磷含量：
由对比实施例2可知，在将罗尔斯通氏菌去除的条件下，相比于对比实施例1，降镉及溶磷效果相对较好，但相较于实施例1，仍相差较大。
对比实施例3
将实施例1中的淡紫拟青霉菌去除(其余同实施例1)，得到微生物菌剂，并应用于镉污染土，经测定得到以下有效镉含量及有效磷含量：
由对比实施例3可知，在将淡紫拟青霉菌去除的条件下，菌剂的降镉及溶磷效果显著下降。
对比实施例4
将实施例1中的载体草炭去除(其余同实施例1)，得到微生物菌剂，并应用于镉污染土，经测定得到以下有效镉含量及有效磷含量：
由对比实施例4可知，在将草炭去除的条件下，镉含量下降较明显，但仍满足不了国标要求；溶磷效果增加幅度略低于实施例1。
对比实施例5
将实施例1中的载体硅藻土去除(其余同实施例1)，得到微生物菌剂，并应用于镉污染土，经测定得到以下有效镉含量及有效磷含量：
由对比实施例4可知，在将硅藻土去除的条件下，菌剂的降镉效果低于实施例1，但相较于对比实施例1、2、3，降镉效果略好菌剂的降镉能力较好；溶磷效果较好。
综上可知，本发明微生物种类搭配合理，甲基营养性芽孢杆菌、罗尔斯通氏菌、淡紫拟青霉菌具有良好的协同增效效果，在整地时施用，可有效改良土壤肥力、增加土壤中可供作物吸收的有效磷含量，同时降低作物对镉离子的吸收。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种兼具溶磷降镉作用的微生物菌剂及其制备方法，其特征在于：按重量份计，包括复合菌剂16-35份、载体65-84份；
其中，所述复合菌剂中含甲基营养型芽孢杆菌20.0-40.0亿cfu/g、罗尔斯通氏菌5.0-15.0亿cfu/g、淡紫拟青霉5.0-15.0亿cfu/g，总有效活菌数≥50.0亿cfu/g；
所述载体为草炭、硅藻土经干燥过筛处理的粉状物。
2.根据权利要求1所述的溶磷降镉微生物菌剂，其特征在于: 按重量份计，复合菌剂20-28重量份、载体72-80重量份；优选地，按重量份计，复合菌剂25重量份、载体75重量份。
3.根据权利要求1或2任一项所述的溶磷降镉微生物菌剂，其特征在于，所述复合菌剂中含有甲基营养型芽孢杆菌30.0-38.0亿cfu/g、罗尔斯通氏菌7.0-12.0亿cfu/g、淡紫拟青霉7.0-12.0亿cfu/g，总有效活菌数≥50.0亿cfu/g；优选地，所述复合菌剂中含有甲基营养型芽孢杆菌35亿cfu/g、罗尔斯通氏菌7.5亿cfu/g、淡紫拟青霉7.5亿cfu/g，总有效活菌数≥50.0亿cfu/g。
4.根据权利要求1或2任一项所述的溶磷降镉微生物菌剂，其特征在于，所述载体中草炭、硅藻土的用量比为1：1。
5.一种根据权利要求1～4任一项所述的溶磷降镉微生物菌剂，其特征在于，包括以下制备步骤：
(1) 制备载体；
(2) 制备复合菌剂；
(3) 将所述载体与复合菌剂按比例混合均匀，得到溶磷降镉微生物菌剂。
6.根据权利要求5所述的溶磷降镉微生物菌剂制备方法，其特征在于，所述载体的制备方法包括以下步骤：
(1) 将草炭、硅藻土按重量比例1：1用粉碎机粉碎，得到预混料；
(2) 将预混料烘干、破碎、过筛，即得到载体。
7.根据权利要求5所述的溶磷降镉微生物菌剂制备方法，其特征在于，所述复合菌剂的制备方法，包括以下步骤：
(1) 制备甲基营养型芽孢杆菌混合芽孢粉；
(2) 制备罗尔斯通氏菌菌粉；
(3) 制备淡紫拟青霉孢子粉；
(4) 将上述制得的甲基营养型芽孢杆菌混合芽孢粉、罗尔斯通氏菌菌粉、淡紫拟青霉孢子粉按比例混合，即得复合菌剂。
8.根据权利要求7所述的溶磷降镉微生物菌剂制备方法，其特征在于，所述甲基营养型芽孢杆菌混合芽孢粉的制备步骤为：
a. 斜面培养：将甲基营养型芽孢杆菌原始菌种在无菌条件下接种于斜面培养基上，35℃条件下培养24-48h；
b. 摇床培养：将步骤a培养的斜面菌种在无菌条件下接种于种子培养基中，35℃、160r/min条件下培养14-18h；
c. 发酵罐培养：将步骤b培养好的种子液在无菌条件下接种于液体发酵培养基中，在pH7.0、罐压0.05～0.06MPa、35～37℃、通风量1：0.4～0.6vvm的条件下，培养48-56h后，检测活菌数大于5.0×109cfu/mL，80%菌体为芽孢时，下罐，得到发酵液备用;
d. 将步骤c中得到的发酵液按等重量比混合玉米淀粉，经过浓缩干燥制备成甲基营养型芽孢杆菌芽孢粉。
9.根据权利要求7所述的溶磷降镉微生物菌剂制备方法，其特征在于，所述罗尔斯通氏菌菌粉的制备步骤为：
a. 斜面培养：将罗尔斯通氏菌原始菌种在无菌条件下接种于斜面培养基上，35℃条件下培养24-48h；
b. 摇床培养：将步骤a培养的斜面菌种在无菌条件下接种于种子培养基中，35℃、160r/min条件下培养14-18h；
c. 发酵罐培养：将步骤b培养好的种子液在无菌条件下接种于液体发酵培养基中，在pH6.8-7.0、罐压0.05～0.06MPa、35℃、通风量1：0.8～1.1vvm的条件下，培养48-56h后，检测活菌数大于2.0×109cfu/mL时，下罐，得到发酵液备用;
d. 将步骤c中得到的发酵液按等重量比混合玉米淀粉，经过浓缩干燥制备成罗尔斯通氏菌菌粉。
10.根据权利要求7所述的溶磷降镉微生物菌剂制备方法，其特征在于，所述淡紫拟青霉孢子粉的制备步骤为：
a. 斜面培养：将淡紫拟青霉原始菌种在无菌条件下接种于斜面培养基上，在28℃条件下培养72小时；
b. 摇床培养：将步骤a培养的菌种在无菌条件下接种于种子培养基中，在 pH6.0-6.5、26℃条件下，160r/min 摇床培养24小时；
c. 发酵罐培养：将步骤 b培养的菌种在无菌条件下分别接种于液体发酵培养基，在pH6.0-7.0、罐压 0.05～0.06MPa、26℃、通风量为1:0.6～0.8vvm，在培养72小时后，菌丝体占总体积的20% 时终止发酵，进行固体发酵产孢；
d. 固体发酵产孢：将步骤c经过发酵罐培养后的菌丝体接种到固体发酵培养基上，培养168-180小时，待淡紫拟青霉90% 产孢时停止发酵；
e. 将步骤d中得到的固体发酵产物浓缩干燥制备成淡紫拟青霉孢子粉。
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