CN112538431A - 一株蛋白核小球藻及其制备生物环境修复液和应用 - Google Patents

Abstract

一株蛋白核小球藻及其制备生物环境修复液和应用，它涉及绿藻活性细胞生物修复液，本发明是要提供一种采用修复环境的小球藻及其应用。它为蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)ZXL X，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武汉大学，保藏日期为2020年11月18日，保藏编号：CCTCC NO：M 2020760。它用于改善土壤环境、促进作物增产和改善农作物品质。修复液制备：蛋白核小球藻用营养液培养至指数生长期与海藻酸盐溶液混合；挤压至氯化钙溶液，得小球；与使用液混合，即得生物环境修复液。本发明环境修复液含有价值高，不产生药物残留，能实现农业可持续发展。

Description

一株蛋白核小球藻及其制备生物环境修复液和应用

技术领域

本发明涉及绿藻活性细胞生物修复液，具体涉及一种绿藻活性细胞生物环境修复液制 备与应用。

背景技术

土壤有机质平均不到1％，而自然提升1％要100年；过度开采造成植被破坏，水土流失，如生态修复可能需要长达上千年以上的时间。土壤表层缺乏有机质，养分比例失调，土壤中毛细管孔隙缺少，通气、透水性较差，微生物的活性较差，造成土壤酸碱性过大或 过小，导致其保水、保肥、透气性差，难以满足农作物的实际生长需要。再有工业污染对 土壤的破坏，加剧了土壤有机质的破坏。

农业生态环境恶化，化肥施入农田后，实际利用率平均只有30％，大部分随农田排水流入江河湖泊或残留于土壤和植株及农作物体内，不仅带来环境污染而且危及人类和生命的安全和健康，这些都成为农业可持续性发展的障碍。中药材也属连茬作物，土壤同样会受到农残的污染，毋庸置疑，土壤不健康中药材也不会健康。担心天天要吃果蔬农产品受到各种有害物质的污染，担心给健康带来的危害。化学肥料的大量应用，土壤盐渍化、 土壤板结现象以及土传病害变得越来越严重，成为制约蔬菜生产(尤其是设施蔬菜生产) 的一大问题。同时化肥每年7000多万吨，进口5000多万吨。使用量是美国2.6倍、欧盟 2.5倍。

重金属、农药、激素的严重超标已成为国内土壤中的最大的健康隐形杀手；14亿人口，每人每年要消耗掉2.67公斤的农药；蔬菜、水果中大量使用化学激素，对人类健康 和繁衍有重大影响。

农作物的根系分泌物和腐解物(比如对羟基苯甲酸PA)能抑制连作植物根系生长及活 性，自毒作用最强，导致土壤中有益微生物含量减少，使土壤中微生物失衡，进而导致农 作物在生长过程中出现连作障碍。

为了有效保证土壤的潜在肥力，需要人为地向土壤中添加大量的有益微生物，从而更 好地保证土壤中微生物的活性，实现对土壤营养条件的全面改善，但是采用藻类活性细胞 生物肥的研究报道较少。

发明内容

本发明的目的是为了提供一种采用修复环境的小球藻及其应用。

本发明的一株蛋白核小球藻，它为蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)ZXLX，保 藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武汉大学，保藏日期为2020 年11月18日，保藏编号：CCTCC NO：M 2020760。

进一步地，它用于改善土壤环境、提高作物长势或改善农作物品质。

进一步地，所述的改善土壤环境为改变土壤溶氧量，土壤环境中蛋白质、维生素、藻 多糖和生长因子营养元素的供应，改善土壤团粒结构，提高有益微生物的量，抑制并减少 有害菌致病菌的量，调节土壤的酸碱性或修复土壤盐碱化。

进一步地，改善农作物品质是指为作物生长持续地提供全面均衡的养分、提高果实品 质或促进果品早熟。

进一步地，所述的农作物为粮食、蔬菜、瓜果、花卉或中药药材。

本发明的一株蛋白核小球藻制备生物环境修复液制备方法，它是按照以下步骤进行 的：

取蛋白核小球藻用营养液培养至指数生长期时，将其与质量百分含量为2％的海藻酸 盐溶液混合均匀，得蛋白核小球藻混合液；然后用挤压设备将蛋白核小球藻混合液加入至 浓度为0.2mol/L氯化钙溶液中后静置30min，形成小球；再按每1L的使用液放入200个小球的方式配制，即得生物环境修复液；

所述的蛋白核小球藻与质量百分含量为2％的海藻酸盐溶液的质量体积比为1g：50mL，蛋白核小球藻混合液与氯化钙溶液的体积比为1：5～7；所述的使用液为营养液；

所述的营养液为每升纯水中含有0.2g的(NH₄)₂SO₄，25mg的氯化钾，30mg的过磷酸钙，0.15mL的质量百分含量为1％的FeCl₃，80mg的七水硫酸镁，0.1g的碳酸氢钠，0.5mL 的土壤浸出液。

所述的土壤浸出液是取土壤1kg，加纯水1L，煮沸60min，在暗处放置2d，过滤， 收集滤液600mL，加纯水400mL制得。

本发明施用微藻细胞生物修复液可以充分利用有益微生物的不断繁殖来达到修复土 壤，从而极大地满足农作物生长所需营养，以保证农作物健康生长。将活性微藻液施入土 壤，改变土壤溶氧量(盆栽萝卜实验如图3，结果表明，同时使用市面上购买的两株小球 藻相比，施用活性微藻液的土壤氧化还原电位分别提高20％、24％(施用修复液20天后，用氧化还原电位比测量土壤的氧化还原电位)，为有益菌和植物根系创造更适宜的生境，改变其他生态位，改善土壤的理化性质(如实施例2中修复盐渍土壤的实验以及图2中有 益菌群的增多，普通土壤和酸性土壤pH得到提升，盐碱土壤pH降低数据，可以说明本 发明的微藻细胞生物修复液具有良好的改善土壤作用)，从而改变以药治病、以菌治菌的 传统方法，达到减少施用农药和化学肥料所带来的负面影响，减少病害对作物危害程度。

本发明采用蛋白核小球藻可以将土壤中难溶的磷、钾释放出来为作物吸收利用(通过 实施例表中的氮磷含量，可以证明本发明的蛋白核小球藻具有上述功效)，从而改善土壤 环境中营养元素的供应状况，增加土壤中有机质含量，提高土壤肥力。同时本发明蛋白核 小球藻能够产生大量的多糖物质，这些多糖物质与植物分泌物、矿物胶体和有机胶体结合 在一起，可改善土壤团粒结构和物理性能，使土壤富有活力。

在土壤中加入本发明的蛋白核小球藻后，有机物分解、矿质元素转化，土壤活力上升， 代表土壤活力水平的蚯蚓等大量繁殖。小球藻中含有C.G.F促生长因子、维生素、氨基酸 等，与蔬菜生长中自身产生的产物相同，根系可以直接吸收利用这些产物，满足自身生长 的需求，植株的生长更加健壮，调控生长。

除此之外，蛋白核小球藻通过分泌大量的诱导物，能提高土壤的酶活性，促使土壤中 的养分转化为农作物生长所需要的营养物质。绿藻在保持自身持续裂变繁殖的同时，还可 以增加土壤的含氧量，丰富结构形成，有效调节土壤酸碱度，改善土壤板结状况(氧化还原电位升高，pH增加，土壤板结情况没有了，出现了一层绿色青苔)。

藻类活性细胞生物肥能分解和清除作物体内亚硝酸盐、硫化氢和农药的残留，绿藻所 含的生物活性因子(C.G.F.)能迅速修复受损细胞(用了微藻修复液花生的果实中没有检 测出农药，而在对照组中有溴氰菊酯。叶绿素提高说明促进了植物的光合作用，光合作用 大使果实的可溶性固形物大大增加以及风味度的提高)，提高果实糖度，让食品安全又好 吃。藻类活性细胞生物肥可减少30％的尿素施用(由实施例可知，水稻、花生、板蓝根在减少30％的肥料，却达到了增产的目的)，在有效促进光合作用的同时，为作物生长 持续地提供全面均衡的养分，从而改善作物的品质，提高作物的产量，提高化学肥料的利 用率。

蛋白核小球藻，光合作用非常强，被称为灌装的太阳，可以大大提高有机质的积累， 固碳；吸附重金属并促进植物体将有害物质排出，降解农药残留；CGF活性因子修复细胞作用非常强，增加抗逆性(抗病、抗旱、抗寒、抗倒伏)，在北方黑龙江泰来种植水稻 发现用微藻修复液的水稻经过低温及3次台风后依然没有倒伏现象，生长势好图6。而在 南方湖北荆州用完修复液后水稻经过旱灾和涝灾，没有倒伏和减产情况图7。

藻类作为一类光合自养生物对许多重金属都具有良好的生物吸附能力，且来源广泛， 在对重金属修复过程中能耗低、吸附量高、环境友好。藻类细胞壁是由纤维素、呆胶质、藻酸铵岩藻多糖和聚半乳糖硫酸酯等多层微纤维组成的多孔结构，其具有比表面积相对较大。细胞壁上的多糖、蛋白质、磷脂等多聚复合体为藻类提供了大量可以与金属离子结合的官能团(如氨基、硫基、巯基、羧基、羰基等)，同时这些官能团合理地排列在藻类细 胞壁上。有些官能团会失去质子而带负电荷，并在静电引力的作用下吸附金属离子，有些 官能团则带孤对电子，可与金属离子形成配位键而络合吸附金属离子，因而对重金属具有 良好的吸附效果。此外，细胞壁带有一定的电荷和粘性，这也增强了其吸附能力。蛋白核 小球藻是有害物质的直接利用者，有机物转化成无机物的最终利用者，从而降解残留。将 培养到指数生长期OD值为1的蛋白核小球藻取180毫升，然后加入20毫升浓度为1mg.L^-1的重金属Cu，1h后用火焰原子吸收分光光度计检测Cu的含量降低了85％，且24h维持 在86％。

蛋白核小球藻可以合成和分泌多种促生长物质，如生长素、赤霉素和细胞分裂素，这 些生物活性物质在植物发育、植物代谢和植物生长调节等方面具有重要的作用，可以促进 种子萌发、幼苗生长，影响果实品质以及作物产量，如图8。在种子萌芽方面，本发明蛋白核小球藻能够对萝卜产生影响，用5毫升藻液浸润2g萝卜种子，可以显著提高种子的 发芽速率，缩短种子的萌芽周期(图4)；在土壤中添加本发明蛋白核小球藻的藻液也显 著增加了幼苗的鲜重、干重和叶绿素含量。对水稻幼苗的根长、鲜重和干重均有提高的作 用。蛋白核小球藻能够使果实中糖浓度和可溶性固体显著升高。

蛋白核小球藻一方面能增强土壤团聚体的稳定性，另一方面能提高土壤中有机质和 氮、磷的含量，同时对土壤pH产生重要影响。施用蛋白核小球藻的水稻，种植前pH为 7，50天后测量pH＝7.23，氮比对照组增加14％，磷比对照组增加36％，钾含量提高24％， 电导率降低39％。pH稳定的土壤团聚体是维持土壤肥力的一个重要因素，土壤团聚体为 植物提供了生长和根部渗入土壤所需的最小孔隙，良好的土壤团聚结构能够增加土壤中氧 含量和提高土壤的持水能力。

本发明制得的绿藻活性细胞生物环境修复液含有多种微量元素，价值高，且不会产生 药物残留，能够实现农业的可持续发展。在促进作物增产、提高植物抗逆能力、以及无公 害等方面都具有不可比拟的优势。相对于常规农业肥料，它不仅能显著地促进作物根系发 育，提高植物光合作用，而且还能促进果品早熟，大大改善农作物品质，特别是对蔬菜、瓜果、花卉等经济作物，应用效果更为显著。通过改善土壤性质、提高土壤肥力，减少化 肥被固定和流失，络合化学元素、刺激作物增长，提高农作物对肥料的利用率。

附图说明

图1为施用修复液后萝卜的叶绿素图；

图2为施用修复液后油菜的指标图；

图3为施用修复液和其他藻的对比生长图；

图4为施用修复液后萝卜的发芽情况图；

图5为施用修复液后花生叶片变化图；

图6为施用修复液后水稻抗旱、抗风、抗寒图；

图7为施用修复液后水稻抗旱、抗洪图；

图8为施用修复液后洋葱的发芽和根部情况图。

具体实施方式

本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在 实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面将详细叙述清楚说明 本发明所揭示内容的精神，任何所属技术领域技术人员在了解本发明内容的实施例后，当 可由本发明内容所教示的技术，加以改变及修饰，其并不脱离本发明内容的精神与范围。

本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但并不作为对本发明的限定。

本发明的蛋白核小球藻获取方式如下：

取天津津南双港地区桃树根部的土壤，经过分离、纯化，进行扩培繁殖，再进行反复 的实验，最后筛选出光合能力强，营养丰富，在土壤中易于生存，且可以降解重金属、农药等有害物质，固碳，提供氧气、可以提高植物的抗逆性和改善作物的品质的品种(一种 蛋白核小球藻)。

具体过程如下：

收集从中国天津市津南区一株桃树的根部，取回根部的土壤分装到6个自制的过滤装 置中，向土壤中加入灭菌纯水，使纯水漫过土壤并能滤出液体，第十天观察滤液中已有藻 色，然后镜检视野中出现不同门类的微藻。随后制作Bristol培养液(0.3g NaNO₃、0.05g NaCl、0.5g KH₂PO₄、0.01g FeCl₃.6H₂O、0.15g MgSO₄.7H₂O、0.05g CaCL₂、1000ml淡水) 和“水生4号”固体平板，把滤液稀释1000倍进行涂布，15天左右当平板生长出菌落，在显微镜下找到小球藻活性较好的单细胞个体，用灭菌的接种环接入6孔板中，在温度 22-28℃，光照3000Lx，光照周期(12h:12h)进行培养，光照培养箱(型号为MGC-250B-LED 常州诺基仪器光照培养箱)，等生长到呈绿色时转接装有培养液的三角锥瓶中进行培养， 每天摇晃3次，每次摇1分钟左右，给藻生长补充碳源，结果发现BG11培养基的效果是 最好的。

形态学鉴定：光学显微镜下，挑取培养5天的蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa) ZXL X置于载玻片上，通过盖玻片加以固定，进行观察。本实施例中获得的蛋白核小球 藻(Chlorella pyrenoidosa)ZXL X，为单细胞绿藻，有蛋白核。

再经过和市面上其他藻肥以及从不同地区筛选的藻种进行种植萝卜实验，本发明的这 株蛋白核小球藻的效果是最好的。

通过以下实施例验证本发明的有益效果：

实施例1

本实施例的蛋白核小球藻制备生物环境修复液，是按照以下步骤进行的：

取蛋白核小球藻用营养液培养至指数生长期后，将其与质量百分含量为2％的海藻酸 盐溶液混合均匀，得蛋白核小球藻混合液；然后滴加至浓度为0.2mol/L氯化钙溶液中保 持30min，形成小球；然后按每1L的使用液放入200小球的方式配制，即得生物环境修 复液；

所述的蛋白核小球藻与2％的海藻酸盐溶液的质量体积比为1g：50mL的比例混合，蛋白核小球藻混合液与氯化钙溶液的体积比为1：5-7；所述的使用液为营养液；

所述的营养液为每升纯水中含有0.2g的(NH₄)₂SO₄，25mg的氯化钾，30mg的过磷酸钙，0.15mL的质量百分含量为1％的FeCl₃，80mg的七水硫酸镁，0.1g的碳酸氢钠，0.5mL 的土壤浸出液。

所述的土壤浸出液是取土壤1kg，加纯水1L，煮沸60min，在暗处放置2d,过滤，收集滤液600mL，加纯水400mL制得。

本实施例制得的绿藻活性细胞生物环境修复液含有多种微量元素，价值高，且不会产 生药物残留，能够实现农业的可持续发展。在促进作物增产、提高植物抗逆能力、以及无 公害等方面都具有不可比拟的优势。相对于常规农业肥料，它不仅能显著地促进作物根系 发育，提高植物光合作用，而且还能促进果品早熟，大大改善农作物品质，特别是对蔬菜、 瓜果、花卉或中药药材等经济作物，应用效果更为显著。通过改善土壤性质、提高土壤肥 力，减少化肥被固定和流失，络合化学元素、刺激作物增长，提高农作物对肥料的利用率。

实施例2

以下是功能验证：

将实施例1制备的生物环境修复液进行水稻的生长状态验证：

在水稻苗期2块试验田，每块2亩。一块只施加化肥的为对照组(只施化肥70kg)，一块加对照组2/3化肥和2L实施例的绿藻活性细胞生物肥(施入化肥46kg和2L绿藻活 性细胞生物肥)为小球藻组，20天后观察记录水稻的生长情况并记录。

准备2块试验田，每块3亩。一块只施加化肥的为对照组(只施化肥60kg)，一块加对照组2/3化肥和3L绿藻活性细胞生物肥(施入化肥40kg和3L绿藻活性细胞生物肥) 为小球藻组，20天后观察记录花生的生长情况并记录。

花生	平均株高	平均叶宽	叶颜色	须根(条)	整齐度
						对照组	25	6.3	嫩绿	20	一般
小球藻组	25	6.5	壮绿	29	好

在花生大基地实验表明，施用微藻细胞修复液20天后，花生根部发现4个小蚯蚓，而蚯蚓是活化土壤，增加有机质的有益生物。表明，在土壤中加入本发明的蛋白核小球藻后，有机物分解、矿质元素转化，土壤活力上升，代表土壤活力水平的蚯蚓等大量繁殖。 且叶片颜色更绿，叶片更大，茎更粗，如图5。

准备2块试验田，每块1亩。一块只施加化肥的为对照组(只施化肥20kg)，一块加对照组2/3化肥和1L绿藻活性细胞生物肥(施入化肥13kg和1L绿藻活性细胞生物肥) 为小球藻组，观察记录板蓝根的生长情况并记录，在开花期再以同样的量补一次小球藻， 最后计算产量和土壤指标情况。

板蓝根	平均株高	平均叶宽	叶厚度	产量	生长状态
						对照组	24	9.8	一般	-	有虫害
小球藻组	24	10	叶厚实	-	没有病虫害、叶子更绿

准备直径25厘米，高20厘米的花盆中，装上同样的土壤，土壤来自黑龙江泰来县，分别设置4个对照组(分别施入2g全效速效肥，分别标出对1、对2、对3、对4)，4个 小球藻组(分别施入2g全效速效肥和20mL绿藻活性细胞生物肥，分别标绿1、绿2、绿 3、绿4)，最后结果取平均值，分别记对照组和小球藻组。绿1-4组电导率明显低于对照 组1-4，说明绿藻活性细胞生物肥能修复盐渍土壤，防止土壤退化。用后20天效果见下 表。

把泰来实验基地种植5年的桃种植园分出两个区，每个区1亩，一个区施3升微藻细胞修复液加20斤全效速效肥，另一个区只加25斤速效肥的对照组。收获期对比桃子的果 实品质并记录。

处理	最大果种(克)	最小果重(克)	平均单果重(克)	可溶性固形物(％)
					施修复液	296	228	250	13.5
对照组	304	179	223	12.7

本发明的蛋白核小球藻，光合作用非常强，被称为灌装的太阳，可以大大提高有机质 的积累，固碳；吸附重金属并促进植物体将有害物质排出，降解农药残留；CGF活性因 子修复细胞作用非常强，增加抗逆性(抗病、抗旱、抗寒、抗倒伏)，在北方黑龙江泰来 种植水稻发现用本发明的微藻修复液的水稻经过低温及3次台风后依然没有倒伏现象，生 长势好图6。而在南方湖北荆州用完修复液后水稻经过旱灾和涝灾，没有倒伏和减产情况 图7。

图6是实施案例2的实验后期。图7是一个湖北荆州水稻种植户，在2020年7月10 号既种苗的第二天，将本发明的蛋白核小球藻稀释100倍，然后均匀的泼洒到水稻田中， 试验田为16.8亩，每亩1升。8月6号再以同样的量，同样的方法补充一次藻。图7左图 为8.6号拍摄记录，右图为经历过7-8月连续暴雨灾害后9.2号拍摄记录，没有出现倒伏 情况。

本发明的蛋白核小球藻可以合成和分泌多种促生长物质，如生长素、赤霉素和细胞分 裂素，这些生物活性物质在植物发育、植物代谢和植物生长调节等方面具有重要的作用， 可以促进种子萌发、幼苗生长，影响果实品质以及作物产量，如图8(分别设1、2、3号， 1号加10毫升蛋白核小球藻，2号加5毫升蛋白核小球藻，3号只加自来水，然后每瓶放 入一颗洋葱，观察洋葱的生长情况，结果显示加入10毫升蛋白核小球藻组无论是发芽情 况还是须根数都多于5毫升蛋白核小球藻组大于空白组。说明蛋白核小球藻可以促进植物 的萌发和根部的生长)。

在种子萌芽方面，本发明蛋白核小球藻能够对萝卜产生影响，2020年6月15号下午3点，分别用纯净水、鱼腥藻、细长聚球藻、市面上购买的一家微藻细胞肥，自家水产调 水常用的小球藻、本发明从土壤中分离出来的蛋白核小球藻，培养到一定的浓度，均稀释 成OD值为0.5的密度，分别取5毫升藻液浸润200粒萝卜种子，在6月16号下午3点 数每组种子的发芽数，计算种子的发芽率，24h发芽率分别为25％、24.5％、29％、28.5％、 27％、34％。ZXLX明显提高萝卜种子的发芽速率，缩短种子的萌芽周期(图4)。

Claims (6)

1.一株蛋白核小球藻，其特征在于它为蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)ZXLX，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武汉大学，保藏日期为2020年11月18日，保藏编号：CCTCC NO：M 2020760。

2.如权利要求1所述的一株蛋白核小球藻的应用，其特征在于它用于改善土壤环境、提高作物长势或改善农作物品质。

3.根据权利要求2所述的一株蛋白核小球藻应用，其特征在于所述的改善土壤环境为改变土壤溶氧量，土壤环境中蛋白质、维生素、藻多糖和生长因子营养元素的供应，改善土壤团粒结构，提高有益微生物的量，抑制并减少有害菌致病菌的量，调节土壤的酸碱性或修复土壤盐碱化。

4.根据权利要求2所述的一株蛋白核小球藻应用，其特征在于改善农作物品质是指为作物生长持续地提供全面均衡的养分、提高果实品质或促进果品早熟。

5.根据权利要求2所述的一株蛋白核小球藻应用，其特征在于所述的农作物为粮食、蔬菜、瓜果、花卉或中药药材。

6.采用权利要求1所述的一株蛋白核小球藻制备生物环境修复液，其特征在于它是按照以下步骤进行的：

取蛋白核小球藻用营养液培养至指数生长期时，将其与质量百分含量为2％的海藻酸盐溶液混合均匀，得蛋白核小球藻混合液；然后用挤压设备将蛋白核小球藻混合液加入至浓度为0.2mol/L氯化钙溶液中后静置30min，形成小球；再按每1L的使用液放入200个小球的方式配制，即得生物环境修复液；

所述的蛋白核小球藻与质量百分含量为2％的海藻酸盐溶液的质量体积比为1g：50mL，蛋白核小球藻混合液与氯化钙溶液的体积比为1：5～7；所述的使用液为营养液；

所述的营养液为每升纯水中含有0.2g的(NH₄)₂SO₄，25mg的氯化钾，30mg的过磷酸钙，0.15mL的质量百分含量为1％的FeCl₃，80mg的七水硫酸镁，0.1g的碳酸氢钠，0.5mL的土壤浸出液。

所述的土壤浸出液是取土壤1kg，加纯水1L，煮沸60min，在暗处放置2d，过滤，收集滤液600mL，加纯水400mL制得。

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