CN108124566A

CN108124566A - 接种根瘤菌的箭筈豌豆在烟地轮作中减施增效的方法

Info

Publication number: CN108124566A
Application number: CN201711434097.7A
Authority: CN
Inventors: 陈远学; 徐开未; 刘明; 廖金山; 蒋帆; 陈强; 张小平; 陈翠平
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2017-12-26
Filing date: 2017-12-26
Publication date: 2018-06-08

Abstract

接种根瘤菌的箭筈豌豆在烟地轮作中减施增效的方法，包括步骤一：绿肥种植(1)以泥炭及助剂作为载体，将已纯化好的菌株进行扩大培养至对数生长期，将形成的菌悬液与灭菌的泥炭在无菌条件下，充分混匀制成菌剂；(2)在大田条件下，按照箭筈豌豆与菌剂质量比(7～10):1的比例拌种、阴干、撒播、翻压入土；不施用化肥，常规方式灌溉；步骤二：待箭筈豌豆植株生长至盛花期时，全部翻压进10～20cm深的土壤中；步骤三：烟草种植中，育苗、灌溉按常规方式进行，化肥用量减少20％；成熟期后进行采收和指标测定。本发明减少了化肥使用量，提升了烟草产量和烤烟的品质，提供了一种新的绿肥—烤烟轮作模式。

Description

接种根瘤菌的箭筈豌豆在烟地轮作中减施增效的方法

技术领域

本发明属于微生物应用领域，具体涉及一种接种根瘤菌的箭筈豌豆在烟地轮作中减施增效的方法。

背景技术

烟草作为一种特殊的经济作物，要实现烟草的优质生产，就必须为烟草生长创造一个良好土壤环境。随着中国烤烟生产的迅速发展，长期大量施用化肥以及不合理的轮作等导致烟叶产量和质量下降、土壤板结、地力衰退、有机质含量降低等问题，已成为烟叶生产可持续发展的瓶颈。在这种背景下，探寻一种能提高烟叶产量和质量、改良土壤、实现烟叶生产可持续发展的栽培措施，成为烤烟种植亟需解决的问题之一。

研究者尝试通过改良土壤来改善烟株大田生长状况和提升烤烟产量和品质，尤其对不同有机肥的研究成为了土壤—烤烟系统的研究热点(彭华伟等，2008)，施用有机肥不仅能提高土壤养分水平，促进烤烟生长发育，改善烟叶品质，而且能够达到土地用养结合的效果。绿肥作为一种重要的有机肥料，其在减少化肥用量、提高作物产量、培肥土壤地力等方面起到了积极的作用，且种植绿肥已成为目前改良土壤的重要手段(王瑞宝等，2010)。绿肥品种繁多，譬如黑麦草、满园花、箭筈豌豆、紫花苕子等，其中豆科绿肥箭筈豌豆和紫花苕子是最常见的旱地绿肥作物。豆科绿肥通过根瘤菌的固氮作用，能固定空气中的氮素，把不能直接利用的氮气固定转化为可被作物吸收利用的有机态氮，增加土壤氮素营养。通过发达的根系吸收深层土壤中的养分，尤其对土壤难溶性磷酸盐有较强的吸收能力，从而能提高土壤中的磷含量(王秀芝等，2005)。利用烟田冬闲时间种植绿肥，翻压后可以增加土壤有机质含量(石屹等，2009)，降低土壤容重，增加土壤中氮、磷、钾含量(王岩等，2006；潘福霞等，2011)。大量的试验研究表明，翻压绿肥后产生的腐熟物质有利于植烟土壤的改良、微生物活性的增强(程森等，2008)、烤烟产量和质量的提升(王先伟等，2001；张会芳等，2007)。敬海霞等(2013)的研究也表明翻压绿肥或绿肥与化肥按比例配施均能明显促进烟株生长，提高烟叶产质量水平。和七红等(2016)在湘西烟区的试验也证实了翻压紫花苕子对烤烟经济效益有明显的提升作用。石屹等(2002)研究也表明连续种植富钾绿肥籽粒苋，压青后种植烤烟可较大幅度地提高烟叶含钾量，含糖量较对照也有所提高，总氮、烟碱含量低于对照，烟叶化学成分较对照协调。王先伟(2001)等研究结果表明，种植毛叶苕子的烟田，烤后烟叶桔黄，香气量足，香气质佳，吃味醇和，燃烧性好，上、中等烟比例提高8-10个百分点。

为响应《到2020年化肥使用量零增长行动方案》，在烟草生产中，可充分利用冬闲地以及光热资源，不用化肥，仅用高效根瘤菌接种生产优质豆科绿肥，翻压后改土培肥植烟土壤，进而为后期的烤烟生产达到化肥使用量零增长或减施化肥，并能提质增效作好科学的准备。早先有针对烟区轮作箭筈豌豆的发明专利(申请号为201210459188.7)，但是在绿肥生长过程中不是接种根瘤菌，而是用过磷酸钙、尿素，以促进绿肥生长，增大了生产成本，增加了环境压力。施用根瘤菌菌剂能促进豆科植物结瘤，有效提高豆科植物的产量，减少生产中的化肥使用量，降低生产成本，而且可以提高土壤肥力。豆科绿肥生产环节中仅接种根瘤菌，可以不施用任何肥料，但是，豆科绿肥接种根瘤菌的报道少。要提高根瘤菌的共生固氮作用，菌株和豆科植物品种是两个根本因素。根瘤菌的群体分布具有地理局限性，在根瘤菌的筛选中，需要注意对应用地区环境的适应能力(陈文新等，2004)。一般来说，在某个区域内最为有效的根瘤菌往往来自本地区或者与本地区条件相似地区的菌株(Jia et al，2008；陈文新等，2011)。因此在根瘤菌选种时，不仅要考虑根瘤菌与豆科植物品种的匹配性，还必须重视菌剂应用的地域性。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种接种根瘤菌的箭筈豌豆在烟地轮作中减施增效的方法，可以减少化肥使用量，并能提升烤烟产量和品质。

本发明采取的技术方案是：

接种根瘤菌的箭筈豌豆在烟地轮作中减施增效的方法，包括以下步骤：

步骤一：绿肥种植

(1)制备菌剂

制备菌株载体：该载体由泥炭、蔗糖、过100目筛的过磷酸钙、钼酸钠、硼酸组成，以蔗糖为基准，其它组分与蔗糖的质量比分别为：泥炭488.5、过磷酸钙0.5、钼酸钠0.0.005、硼酸0.005，将各组分混合均匀，使用石灰调节pH值至中性；

将已纯化好的菌株，扩大培养至对数生长期的菌悬液与灭菌的泥炭充分混匀制成菌剂，其中，要求根瘤菌菌剂中根瘤菌含量不低于2×10⁸CFU/g，含水量25％～50％；

(2)播种

在大田条件下，选用饱满的川北箭筈豌豆种子，按照箭筈豌豆与菌剂质量比(7～10):1的比例拌种阴干后，均匀撒种、翻入土；

(3)水肥管理

在箭筈豌豆生长过程中不施用任何化肥，灌溉与常规绿肥种植方式相同；

步骤二：绿肥翻压

待箭筈豌豆植株生长至盛花期(生育期148d)时，全部翻压进10～20cm深的土壤中，且保证没有箭筈豌豆植株裸露在土壤表面；

步骤三：烟草种植

烟草育苗、灌溉的管理按照常规方式进行，本发明仅改变化肥用量，将常规基肥、常规提苗肥、常规揭膜上厢肥的用量均减少20％；

所述常规基肥标准为：每亩施肥40kg，有效含量50％，氮、磷、钾比例为1：1.2：2.8；

所述常规提苗肥标准为：每亩施肥8kg，有效含量51.5％，氮、磷、钾比例为1：0.76：1.24；

所述常规揭膜上厢肥标准为：每亩施肥30kg，有效含量36％，氮、磷、钾比例为1：0.45：7.62；

步骤四：烟草采收及指标测定

在烤烟成熟期，按照常规方法测定烟草农艺性状，以小区为单位，选取代表性烟株10株，测量株高、叶片数、节距、茎围，并计算叶面积系数；

烟草采收实行单采、单烤、单收、单独计产的原则，烘烤后，进行烟叶等级划分并测定烟叶化学品质，测试指标有氯、钾、总氮、烟碱、总糖、还原糖含量。

进一步的，步骤一所述菌株为根瘤菌属Rhizobium leguminosarum的箭筈豌豆根瘤菌JSP1-3-1，保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2017年10月23日，保藏编号为CCTCC NO:M 2017617。

进一步的，扩大培养方法为：将该根瘤菌株接种到液体YMA培养基中，在28℃摇床中摇培养4天即得，培养液的配方为：甘露醇10g，酵母粉0.8g，KH₂PO₄0.25g，MgSO₄.7H₂O0.2g，CaCl₂.6H₂O 0.1g，NaCl 0.1g，1％钼酸铵2ml，1％硼酸2ml，水1000ml。

本发明的有益效果：

通过接种根瘤菌剂，不施用化肥种植箭筈豌豆，对环境友好，并以此作为绿肥，在烟草种植时，再进一步减少常规种植方式化肥使用量的20％，降低了土壤污染。另外，利用本发明方法，不仅减少了化肥使用量，还提升了烟草产量，同时，也提升了烤烟的品质，提供了一种新的绿肥—烤烟轮作模式。

具体实施方式

在种植烟草前，先种植接种根瘤菌菌剂的箭筈豌豆至盛花期、翻压后形成优质绿肥，使得在种植烟草时减施肥料并能提升烤烟产量和品质。

实施例1制备根瘤菌菌剂

(1)箭筈豌豆根瘤菌JSP1-3-1的分离和纯化

在四川省泸州古蔺箭竹乡采集野生的健壮箭筈豌豆根瘤，清洗干净，带部分根皮取下，用吸水纸吸干外表水分，装在放有无水氯化钙的并覆有脱脂棉的小管中。在实验室进行以下操作：将采集的根瘤用无菌水浸泡吸胀，用95％的乙醇浸泡30s以消除表面张力，接着用0.1％(质量体积比)的升汞表面消毒5min，再用无菌水冲洗6-8次，在无菌操作的情况下，将单个根瘤夹破后在加有刚果红的YMA培养基(甘露醇10g，酵母粉0.8g，KH₂PO₄0.25g，MgSO₄.7H₂O 0.2g，CaCl₂.6H₂O 0.1g，NaCl 0.1g，1％(质量体积比)钼酸钠2ml，1％(质量体积比)硼酸2ml，1％(质量体积比)刚果红2.5ml，pH6.8-7.0，琼脂18～20g，水1000ml)上划线，在28℃的恒温箱中培养。

待长出菌落后，从平板上挑选不吸红、形态上像根瘤菌的菌落在平板上稀释划线培养。3d左右观察菌落形态，一直观察到10d左右，因慢生根瘤菌需6～10d出现菌落。重复稀释划线反复分离，直到纯化为止。根据以下两方面进行初步判定是否为根瘤菌：(1)加刚果红的YMA培养基上的菌落形态：不吸红，菌落圆形、乳白色、隆起、边缘整齐不蔓延、表面光滑、较粘稠、较湿润。培养3～5d就长出菌落的为快生根瘤菌，培养6～10d长出菌落的为慢生根瘤菌；(2)细胞形态：对确认的根瘤菌菌落作标记，制片进行革兰氏染色，根瘤菌的镜检结果为细胞呈小杆状且形态一致，无芽孢，细胞内常含β-羟基丁酸而呈环节状，革兰氏阴性(G-)。如果上述标记菌落具有上述两方面特征，则将该菌落接入YMA培养基的试管斜面培养保存。

本实施例的分离纯化得到的菌株JSP1-3-1为快生根瘤菌，在加刚果红的YMA培养基上培养，菌体不吸红，菌落较小、圆形、乳白色、粘稠、隆起度较高、稍透明，2-3天长出菌落，经革兰氏染色镜检为G^-，呈小杆状。

(2)制备菌剂

经鉴定，该菌种为根瘤菌属(Rhizobium leguminosarum)，保藏于中国湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2017年10月23日，保藏编号为CCTCCNO:M 2017617。

将该根瘤菌株接种到液体YMA培养基中进行扩大培养：培养液配方为：甘露醇10g，酵母粉0.8g，KH₂PO₄0.25g，MgSO₄.7H₂O 0.2g，CaCl₂.6H₂O 0.1g，NaCl 0.1g，钼酸铵(1％)2ml，硼酸(1％)2ml，水1000ml，在28℃摇床中摇培养4天即得扩大后的对数生长期的菌悬液；

选用过100目筛的泥炭488.5g，蔗糖1g，过100目筛的过磷酸钙0.5g，0.5％钼酸钠1mL，0.5％硼酸1mL，配制成菌株载体，并将pH值用石灰调至中性；

将培养至对数生长期的菌悬液与灭菌后的载体充分混匀即制成菌剂，经检测，菌剂中根瘤菌JSP1-3-1细胞含量为2.8×10⁸CFU/g。

实施例2绿肥种植与翻压

大田试验在攀枝花市仁和区平地镇烤烟基地进行，试验设计3个处理，CK(冬闲空地，不种绿肥)，Vs(不接种根瘤菌的箭筈豌豆绿肥)，Vs+R(接种根瘤菌的箭筈豌豆绿肥，R为实施例1中制备的根瘤菌JSP1-3-1菌剂)。

选用饱满的川北箭筈豌豆种子，将箭筈豌豆与菌剂拌种，箭筈豌豆的播种量为8.5kg/亩，菌剂用量为1kg/亩，2015年10月7日撒播种子，播种前利用旋耕机耕地，然后再利用旋耕机将土壤表面的种子翻入土壤，在箭筈豌豆生长过程中不施用任何化肥，适当挖排水沟，确保能排能灌。

箭筈豌豆盛花期时，采用旋耕机将箭筈豌豆全量翻压入10～20cm深的土壤中，且保证没有箭筈豌豆植株裸露在土壤表面。

表1接种根瘤菌对箭筈豌豆生物量的影响

测定箭筈豌豆盛花期(翻压期)的生物量，Vs+R比Vs增加152.2％，根瘤数增加189.9％，株高增加18.2％，说明接种根瘤菌，能提高箭筈豌豆根部结瘤率和生物量。

表2接种根瘤菌对箭筈豌豆植株养分含量的影响

盛花期的箭筈豌豆养分含量如表2，Vs+R相比Vs，全氮、全磷、全钾含量分别增加15.7％、11.1％、18.5％，说明接种根瘤菌后，能增加箭筈豌豆的全氮、全磷、全钾含量。

实施例3烤烟种植试验效果

在实施例2的基础上种植烟草，试验设计3个处理，CF100％(攀枝花烟草公司推荐施肥量，即全量施肥)，CF80％+Vs(箭筈豌豆生产不接种根瘤菌，翻压后种植烟草但仅用全量施肥的80％)，CF80％+Vs+R(箭筈豌豆生产接种高效根瘤菌JSP1-3-1，翻压后种植烟草也仅用全量施肥的80％)。每个处理重复3次，随机区组排列。小区面积24m²，烟苗40株。

表3翻压接种根瘤菌的箭筈豌豆对烤烟产量、产值的影响

从表3可以看出，CF80％+Vs处理的产量相比CF100％增加了10.1％，产值增加14.2％。CF80％+Vs+R处理的产量相比CF100％增加27.1％，上等烟的比例增加14.9％，均价增加1.3元/kg，增长率为6.7％，每亩产值增加26.8％。

以上数据说明翻压箭筈豌豆能提高烤烟的产量和产值，而翻压接种根瘤菌菌剂的箭筈豌豆在提升烤烟的产量和产值的同时，也提升了烤烟的品质。

表4翻压接种根瘤菌的箭筈豌豆对烤烟农艺性状的影响

在烤烟成熟期对烤烟的农艺性状测定结果如表4。CF80％+Vs处理相比CF100％处理，株高、节距占了一定的优势，分别增加了6.4％、4.0％。CF80％+Vs+R处理相比CF100％处理，株高、茎围、叶面积系数分别增加了6.6％、3.6％、14.4％，说明翻压接种根瘤菌的箭筈豌豆在烤烟生长期对烤烟的生长起到了促进作用，尤其是对叶面积系数的影响较大。

表5烟叶化学品质

(1)烟草是忌氯作物，氯含量过高降低烟叶的燃烧性，但作为烟草必须营养元素，含量过低导致烟叶干燥粗糙易碎，对烟叶品质产生不利影响。氯含量适宜范围为0.3％-0.8％。由表5可知，CF80％+Vs处理的中部及下部烟叶的氯离子含量相较于CF100％有所增加，而CF80％+Vs+R处理的上中部烟叶的氯离子相较于CF100％都有所下降，分别降低了9.0％、15.7％，且处于正常氯离子含量范围内。说明翻压接种根瘤菌的箭筈豌豆可以降低烤烟氯离子含量，使烤烟品质提升，成为更优质烟叶。

(2)钾是烟草吸收量最大的生长必需营养元素，对于提高烟叶的燃烧性和持火力、提高烟叶的弹性和质地、改善叶片色泽等均有重要作用，适宜范围：下部烟叶钾含量为1.8％-2.7％，中部烟叶钾含量为1.4％-2.3％，上部烟叶钾含量为1.2％-2.7％。CF80％+Vs的上中下部烟叶的钾含量相较于CF100％都有所下降，CF80％+Vs+R的中下部烟叶钾含量分别增加了33.7％、32.7％。说明在减施20％化肥的情况下仅翻压箭筈豌豆没有提升烤烟钾含量，而翻压接种根瘤菌的箭筈豌豆能有效地提升中下部烟叶的钾含量，进而提升烤烟品质。

(3)烟碱含量一般在1.5％-3.5％，以2.5％左右为宜，下部叶适宜烟碱含量1.5％-2.1％、中部叶2.0％-2.8％、上部叶2.5％-3.5％为适宜。CF80％+Vs比CF100％的上中下部烟叶烟碱含量都低，且都不在适宜含量范围。相比CF100％，CF80％+Vs+R的上部烟叶烟碱含量下降2.1％，中部下降29.0％，下部上涨4.1％，虽然有增有减，但是都在适宜烟碱含量范围。且上部及下部烟叶烟碱含量更靠近2.5％，因此，在减肥20％的情况下，翻压接种根瘤菌的箭筈豌豆提升了烟叶品质。

(4)总氮一般在1.5％-3.5％之间，2.5％最佳，过低则吃味差，有杂气；过高则劲头强，有刺激性。CF80％+Vs处理相比于CF100％仅增加了1.4％上部烟叶的总氮含量，中部反而下降10.2％。而CF80％+Vs+R相比CF100％上中部烟叶总氮含量分别上涨2.8％、38.0％，虽然上部和下部烟叶没有处于正常范围内，但是由于翻压了接种根瘤菌的箭筈豌豆，使得中部烟叶的总氮含量达到正常范围内，从而是烤烟品质提升。

(5)还原糖含量低能引起刺呛的吃味，含量过高则产生酸吃味，且焦油量高。还原糖含量介于5％-25％之间，最适含量为18％-22％。由表5可看出，所有处理的还原糖含量都高出最适范围，这与四川烟区的还原糖含量普遍高于最适范围的情况相符。CF80％+Vs处理相较于CF100％，上中下部烟叶还原糖含量分别下降1.9％、12.7％、6.4％，而CF80％+Vs+R相比CF100％只有上中部烟叶分别下降0.3％、15.7％，这可能与接种了根瘤菌使得箭筈豌豆植株养分含量增高，翻压后进而使得烤烟吸收养分含量不同所致。

(6)烤烟总糖含量一般在15％-35％之间，在20％-25％的范围内较适宜，与还原糖相同，总糖含量都超出了适宜范围，与四川烤烟总糖含量情况相符。CF80％+Vs处理相较于CF100％中下部烟叶总糖含量降低8.5％、2.2％，而CF80％+Vs+R相比CF100％只有中部降低16.0％，说明在减肥20％的情况下，翻压绿肥能降低总糖含量。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 接种根瘤菌的箭筈豌豆在烟地轮作中减施增效的方法

<141> 2017-12-25

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1376

<212> DNA

<213> 根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)

<400> 1

tggcggagct taccatgcaa gtcgagcgcc ccgcaagggg agcggcagac gggtgagtaa 60

cgcgtgggaa tctacccttg actacggaat aacgcaggga aacttgtgct aataccgtat 120

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ggttttaccc gaaggtagtg cgctaaccgc aaggaggcag ctaaccacgt agtcct 1376

<210> 2

<211> 496

<212> DNA

<213> 持家基因(atpd)

<400> 2

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<210> 3

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<212> DNA

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<210> 4

<211> 493

<212> DNA

<213> 持家基因(reca)

<400> 4

ctcgatcatg aaactcggct ccaacgagaa tgttgtcgag atcgagacga tctcgaccgg 60

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tcccggcctg caggcacgac tgatgagcca ggcgctgcgc aagctcaccg cttcgatctc 480

caaatcgaac acc 493

Claims

1.接种根瘤菌的箭筈豌豆在烟地轮作中减施增效的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：绿肥种植

(1)制备菌剂

制备菌株载体：该载体由泥炭、蔗糖、过100目筛的过磷酸钙、钼酸钠、硼酸组成，以蔗糖为基准，其它组分与蔗糖的质量比分别为：泥炭488.5、过磷酸钙0.5、钼酸钠0.005、硼酸0.005，将各组分混合均匀，使用石灰调节pH值至中性；

将已纯化好的菌株进行扩大培养后，在无菌条件下，将培养至对数生长期的菌悬液与灭菌的载体充分混匀制成菌剂，其中，要求根瘤菌菌剂中根瘤菌含量不低于2×10⁸CFU/g、含水量25％～50％；

(2)播种

在大田条件下，选用饱满的川北箭筈豌豆种子，按照箭筈豌豆与菌剂质量比(7～10):1的比例拌种阴干后，均匀撒种、翻入土壤；

(3)水肥管理

步骤二：绿肥翻压

待箭筈豌豆植株生长至盛花期时，全部翻压进10～20cm深的土壤中，且保证没有箭筈豌豆植株裸露在土壤表面；

步骤三：烟草种植

步骤四：烟草采收及指标测定

烟草采收施行单采、单烤、单收、单独计产的原则，烘烤后，进行烟叶等级划分并测定烟叶化学品质，测试指标有氯、钾、总氮、烟碱、总糖、还原糖含量。

2.如权利要求1所述的接种根瘤菌的箭筈豌豆在烟地轮作中减施增效的方法，其特征在于，步骤一所述菌株为根瘤菌属Rhizobium leguminosarum的箭筈豌豆根瘤菌JSP1-3-1，保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2017年10月23日，保藏编号为CCTCCNO:M 2017617。

3.如权利要求1所述的接种根瘤菌的箭筈豌豆在烟地轮作中减施增效的方法，其特征在于，步骤一所述扩大培养方法为：将根瘤菌株接种到液体YMA培养基中，在28℃摇床中摇培养4天即得，培养液的配方为：甘露醇10g，酵母粉0.8g，KH₂PO₄0.25g，MgSO₄.7H₂O 0.2g，CaCl₂.6H₂O 0.1g，NaCl 0.1g，1％钼酸铵2ml，1％硼酸2ml，水1000ml。