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Gebiet der Erfindung
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Die
Erfindung betrifft einen neuen probiotischen Stamm von Lactobacillus
pentosus, essbare und pharmazeutische Zusammensetzungen, in die dieses
Bakterium eingearbeitet ist und medizinische Anwendungen des Bakteriums
bei der Förderung
guter Gesundheit, insbesondere bei der Stimulierung des Immunsystems,
bei der Bekämpfung
der Candidiase, bei der Hilfe der Verdauung im allgemeinen und bei
der Linderung der Symptome des irritablen Darmsyndroms (IBS).
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Hintergrund der Erfindung
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Die
gesunde dauerhafte Darmmikroflora umfasst eine Vielzahl an nützlichen
Bakterien, vorwiegend Vertreter der Gattungen Lactobacillus und
Bifidobakterium. Die Balance der Mikroorganismen kann durch Infektion,
Veränderung
der Nahrung, durch antibiotische Behandlung und durch Stress oder
physiologisches Trauma zerstört
werden. Wenn dies auftritt, können
viele schädliche
Wirkungen ausgelöst werden.
Verdauungsmuster können
verändert
werden, wobei Diarrhoe, Verstopfung und andere Symptome der Darmstörung auftreten.
Das Immunsystem kann gestört
werden, woraus eine verringerte Resistenz gegenüber infektiösen Erkrankungen folgt. Pathogene
Bakterien oder Pilze nehmen überhand
und kolonialisieren das Verdauungssystem und andere Teile des Körpers.
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Traditionellerweise
werden fermentierte Milchprodukte, wie Joghurts, als gesunde Lebensmittel
angesehen, die zur Beruhigung des Verdauungssystems fähig sind,
wobei diese Beobachtung nun durch das Vorkommen von Milchsäurebakterien
erklärt
wird. Mikroorganismen, wie Lactobacillen und Bifidobakterien, die
die Gesundheit fördern
können, werden "Probiotika" genannt. Die Forschung
hat gezeigt, dass bestimmte probiotische Mikroorganismen die Zusammensetzung
die Darmmikroflora durch Konkurrenz gegenüber pathogenen Bakterien und Hefen
beeinflussen können.
Von Probiotika wird auch behauptet, dass sie die Heilung der Dünndarmmukosa
fördern
können,
beispielsweise bei Patienten mit Milchallergie durch die Verringerung
der Darmpermeabilität
und durch Förderung
der lokalen Immunreaktionen des Dünndarms. Die Verwendung von
Probiotika wird für
die Prophylaxe und Behandlung von Durchfall und zur Erhöhung der
Wiedergewinnung der kommensalen Flora nach einer antibiotischen
Therapie befürwortet.
Es wurde in klinischen Versuchen mit Probiotika auch eine anticarzinogene Aktivität gezeigt.
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Von
einer Vielzahl an "lebenden" Milchprodukten auf
dem Markt wird behauptet, dass sie eine besonders hohe Anzahl an
probiotischen Lactobacillen- oder Bifidobakterienarten zur Förderung
der Verdauung und eines gesunden Immunsystems enthalten. Jedoch
ist der gesamte Bereich an erwünschten probiotischen
Effekten nur durch wenige ausgewählte
Stämme
ausgelöst.
Es muss auch in das Bewusstsein gelangen, dass die Überlebensfähigkeit
eines Stamms im Gastrointestinaltrakt (GI) für die biologische Wirksamkeit
des Stamms in situ entscheidend ist. Damit sich der Stamm selbst
im Dünndarm
einnisten und etablieren kann, sollte er Idealerweise an die Mukosaoberfläche des
GI Trakts haften und zum Überleben
in den Transitkräften
der Darmpassage fähig
sein, wie der Exposition gegenüber
Magen- und Gallensäuren.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft einen neuen probiotischen Stamm von
Lactobacillus, der Lactobacillus pentosus LPK genannt wird und am
28. August 2001 unter dem Budapester Abkommen bei der NCIMB, Aberdeen,
UK hinterlegt wurde und die Hinterlegungsnummer NCIMB 41114 erhalten
hat. Zusätzlich
zu den gezeigten Eigenschaften typischer Lactobacillen im allgemeinen
hat dieser Stamm eine weitere überraschende
Eigenschaft: Er ist zur Unterdrückung
des Wachstums von Candida Spezies in einem Ausmaß fähig, das vorher nie durch die
Verwendung eines Probiotikums erreicht wurde. Ferner haben Tetracyclin
und verwandte Antibiotika keinen Einfluss auf diesen Stamm. Diese
einzigartige Kombination an Eigenschaften kann zur Bekämpfung des unerwünschten
Wachstums von Candida in jeder Region des Körpers ausgenutzt werden. Da
Candida insbesondere als ein verursachender Faktor beim irritablen
Darmsyndrom (IBS) betrachtet wird, wird in Betracht gezogen, dass
dieser neue Stamm von L. pentosus bei der Behandlung oder Prävention
der Störung
verwendet werden könnte.
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Zusammenfassung der Erfindung
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In
einem Aspekt der Erfindung wird ein Stamm von Lactobacillus pentosus
mit der Hinterlegungsnummer NCIMB 41114 bereitgestellt.
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In
einem zweiten Aspekt der Erfindung wird eine biologisch reine Kultur
eines Lactobacillus Stamms bereitgestellt, der alle identifizierenden
Charakteristiken des Lactobacillus pentosus Stamms NCIMB 41114 aufweist.
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In
einem dritten Aspekt der Erfindung wird eine Ernährungszusammensetzung oder
pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, die den Lactobacillus
pentosus Stamm NCIMB 41114 umfasst.
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In
einem vierten Aspekt der Erfindung wird eine Ernährungszusammensetzung oder
pharmazeutische Zusammensetzung oder ein Kit bereitgestellt, welche
den Lactobacillus pentosus Stamm NCIMB 41114 und ein Antibiotikum
enthalten.
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In
einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die Verwendung des Lactobacillus
pentosus Stamms NCIMB 41114 als Arzneimittel bereitgestellt.
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In
einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die Verwendung des Lactobacillus
pentosus Stamms NCIMB 41114 zur Herstellung eines Arzneimittels oder
einer Ernährungsformulierung
zur Förderung
einer gesunden Darmmikroflora und zur Prophylaxe oder Behandlung
von Bakterien- oder Hefeinfektionen, Candidiase, Diarrhoe oder anderen
gastrointestinalen Störungen,
irritablem Darmsyndrom oder der Symptome hiervon und einem geschwächten Immunsystem
bereitgestellt.
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In
einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Isolierung
eines probiotischen Stamms der Milchsäurebakterien bereitgestellt,
das die Anzucht einer fäkalen
Zellkultur in Gegenwart einer bakteriziden Menge an Tetracyclin
und die Gewinnung der lebensfähigen
Milchsäurebakterienzellen
aus der Kultur und einem Milchsäurebakterienstamm
bereitgestellt, der durch dieses Verfahren erhalten werden kann.
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Beschreibung der Figuren
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Die
1 zeigt
das Co-Kulturwachstum von Candida albicans (∎) und L. pentosus
NCIMB 41114 (♦)
und das reine Kulturwachstum von Candida albicans (
)
unter denselben Bedingungen und in identischen Medien.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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Der
neue L. pentosus Stamm, der Gegenstand der vorliegenden Erfindung
ist, wurde aus einer fäkalen
Kultur isoliert, die aus einem gesunden erwachsenen Individuum erhalten
wurde und in Gegenwart von Tetracyclin kultiviert wurde.
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Zwei
bemerkenswerte und unerwartete Beobachtungen führen zur Auffindung und Isolierung
des Mikroorganismus. Erstens überleben
und vermehren sich der Lactobacillus Stamm der Erfindung und der bakterielle
Stamm alleine in einem Medium, das Tetracyclin enthält, einem
Breitspektrumantibiotikum, das alle anderen Milchsäurebakterien
in den Kulturen abtötet.
Zweitens wurde, obwohl Candida in den meisten Fäkalkulturen von Beginn an vorhanden
war, das Wachstum dieser Hefe in Gegenwart des erfindungsgemäßen Lactobacillus
eingestellt. Im Gegensatz dazu wächst
in den Kulturen, denen der neue Stamm der Erfindung fehlt, Candida
bis zur Dominanz der Nische, die von den durch Tetracyclin getöteten Bakterien
zurückgelassen
wurde.
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Das
neue Bakterium der Erfindung und die Zusammensetzungen, die dieses
Bakterium enthalten, sind für
die Gesundheit allgemein nützlich
und werden von Personen aller Alterstufen gut toleriert. L. pentosus
NCIMB 41114 kann prophylaktisch oder therapeutisch bei gesunden
Personen verwendet werden, um gegen kleinere Leiden vorzubeugen,
wie Magenverstimmungen, Gastritis, Magengeschwüre, milde Diarrhoe (einschließlich Antibiotikum-assoziierter
Diarrhoe), unregelmäßiger Verdauung,
Sodbrennen und anderen Verdauungsbeschwerden. Die Wirkungen der
Förderung
einer gesunden Darmflora, Immunstimulierung, Krebsvorsorge, Stimulierung des
Knochenwachstums und der Cholesterinreduktion können auch von der allgemeinen
Population genossen werden. Das neue Bakterium der Erfindung kann
auch besonders nützlich
sein für
Patienten in Krankenhäusern,
Individuen, die in Pflegeheimen leben, immungeschwächten Personen,
Patienten, die Antibiotikumbehandlungen erhalten, wie auch Kinder,
beispielsweise Neugeborene. Beispielsweise kann das Bakterium der
Erfindung auch dazu verwendet werden, um die Mikroflora von Kindern ähnlicher
zur Mikroflora von gestillten Kindern zu machen.
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Das
Bakterium der Erfindung kann auch verwendet werden, um bestimmte
Erkrankungszustände
anzugehen, insbesondere als Alternative oder zusammen mit einer
pharmazeutischen Arzneimittelbehandlung. Beispielsweise können Kleinkinddiarrhoe (die
beispielsweise durch Rotaviren verursacht wird), Cholera, Ruhr und
Infektionen mit Shigella, E. coli 0157:H7, Clostridium difficile
und Salmonella durch die Einnahme des erfindungsgemäßen Bakteriums geheilt
oder gelindert werden. Für
Personen, die aus irgendeinem Grund immungeschwächt sind (beispielsweise nach
einer Chemotherapie, Leukämie, HIV/AIDS
usw.) kann die Einnahme von L. pentosus NCIMB 41114 eine sehr brauchbare
prophylaktische und therapeutische Behandlung sein, um Infektionen durch
pathogene Mikroorganismen vorzubeugen oder diese zu unterdrücken.
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Da
L. pentosus LPK gegenüber
Tetracyclin und verwandten Antibiotika resistent ist, bleibt der probiotische
Nutzen der Einnahme oder der Anwendung dieses Mikroorganismus während der
Behandlung mit Antibiotika bestehen.
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Ein
Hauptvorteil dieser Lactobacillus Spezies gegenüber anderen Lactobacillen ist,
dass der Stamm zur Bekämpfung
des übermäßigen Wachstums
von Hefen, speziell Candida Infektionen fähig ist. Candida Infektionen
finden man speziell bei bestimmten Kategorien von empfindlichen
Individuen, einschließlich
Individuen, die in Pflegeheimen leben, immungeschwächten Patienten,
wie HIV-positiven oder AIDS Patienten, Patienten, die sich einer
Strahlentherapie, Chemotherapie oder Knochenmarkstransplantation
unterziehen, Krankenhauspatienten mit einer erhöhten Exposition gegenüber Candida, Neugeborenen,
Frauen mit Empfängnisverhütungspillen
und allen, die eine Antibiotikumbehandlung erhalten. Die Candidiase
kann durch Candida parapsilosis, Candida tropicalis oder Torulopsis
glabrata verursacht werden, wird aber typischerweise durch Candida
albicans verursacht.
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Candida
albicans kann den Mund (Mundsoor), den Harntrakt, die Vagina (Vaginalsoor
oder Vaginitis), den Ösophagus,
den Intestinaltrakt und die Haut (beispielsweise Windelausschlag)
infizieren und so zu Reizung, Entzündung und anderen Symptomen
führen.
Diese Infektionen werden herkömmlicherweise
durch die Verwendung von Antipilzmitteln geheilt. Es wurde auch
eine Rolle von übermäßigem Wachstum
von Candida bei IBS postuliert. Derzeitige Behandlungen von IBS
sind primär
pharmazeutische Präparationen,
die sich auf die Linderung der Symptome anstatt auf die zugrunde
liegenden Ursachen der Erkrankung richten. Obwohl von bestimmten
probiotischen Bakterien eine anti-Candida Aktivität berichtet
wurde, ist die scheinbare Aktivitätsstärke nicht ausreichend groß, um ein
großes
Interesse unter Gastroenterologen als potentielle therapeutische
Behandlung hervorzurufen. Aufgrund der starken Fähigkeit von L. pentosus LPK,
das heißt
von Stamm NCIMB 41114, das Candidawachstum zu unterdrücken, ist
die vorliegende Erfindung ein Durchbruch bei der Behandlung und
Prävention
von Candidainfektionen.
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Daher
kann in einem Aspekt der Erfindung die Verabreichung einer wirksamen
Menge des Lactobacillus pentosus Stamms NCIMB 41114 in einem Verfahren
zur Prävention
oder Behandlung von Bakterien- oder Hefeinfektionen, Candidiase,
insbesondere Harntraktinfektionen, beispielsweise Harnröhreninfektionen,
Soor, Diarrhoe oder gastrointestinalen Störungen, irritablem Darmsyndrom
oder Symptomen hiervon und einem geschwächten Immunsystem verwendet
werden. Das neue Bakterium der Erfindung kann auch in einem Verfahren
zur Förderung einer
gesunden Darmmikroflora verwendet werden.
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In
einer Ausführungsform
der Erfindung wird ein Verfahren zur Behandlung oder Prävention
von Bakterien- oder Hefeinfektionen, beispielsweise Candidainfektionen,
Harnröhreninfektionen,
Soor, irritablem Darmsyndrom (IBS) oder der Symptome hiervon, Diarrhoe
oder anderen gastrointestinalen Störungen bereitgestellt, das
die Verabreichung einer wirksamen Menge einer Zusammensetzung, die
lebenden, attenuierten oder abgetöteten Lactobacillus pentosus Stamm
NCIMB 41114 enthält,
an einen Patienten umfasst, der einer solchen Behandlung bedarf.
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In
einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Förderung
einer gesunden Darmmikroflora und zur Stimulierung des Immunsystems bereitgestellt,
das die Verabreichung einer wirksamen Menge einer Zusammensetzung,
die lebenden, attenuierten oder abgetöteten Lactobacillus pentosus Stamm
NCIMB 41114 enthält,
an einen Patienten umfasst, der einer solchen Behandlung bedarf.
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Die
Ernährungszusammensetzungen
oder die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung, die L.
pentosus NCIMB 41114 enthalten, können enteral, beispielsweise
oral, parenteral oder durch physikalischen Kontakt mit der Haut
oder den Mukosamembranen verabreicht werden. Die Ernährungszusammensetzungen
oder pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung können direkt oder
in den Darm, beispielsweise durch einen Tubus oder einen Katheter
verabreicht werden.
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Der
L. pentosus Stamm der Erfindung kann in großem Maßstab kultiviert und in lyophilisierter,
gefriergetrockneter oder hydratisierter Form therapeutisch verwendet
werden. Das neue Bakterium der Erfindung kann auch zusammen mit
einer pharmazeutisch annehmbaren Trägersubstanz oder einer Ernährungsmatrix
verabreicht werden.
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Im
Fall einer pharmazeutischen Präparation kann
das Produkt in Form von Tabletten, Kapseln, Implantaten, Zäpfchen,
Pessaren, beispielsweise Vaginalpessaren, Pulvern, Lösungen,
Gelen, flüssigen bakteriellen
Suspensionen und so weiter bereitgestellt werden. Langsame Freisetzungsformen
sind besonders erwünscht.
In einer Ausführungsform
der Erfindung wird der neue L. pentosus Stamm als Zusatztherapie
zu einer antibakteriellen Antibiotikabehandlung (beispielsweise
Tetracyclin) verabreicht, um die Risiken und Nebenwirkungen der
Antibiotika zu verringern. Zu diesem Zweck können das Antibiotikum und das
Bakterium zusammen in einer einzelnen Dosierungsform formuliert
werden. Alternativ dazu können
die Bakterien und Antibiotika in Kitform bereitgestellt werden für eine getrennte,
gleichzeitige oder sequenzielle Verwendung. Eine weitere Option ist
die Co-Verabreichung von L. pentosus NCIMB 41114 und eines Antipilzmittels,
wie sie herkömmlich zur
Behandlung der Candidiase verwendet werden, einschließlich Fluconazol,
Itraconazol und Clotrimazol. Diese zwei Komponenten wirken zur Bekämpfung des
Pilzwachstums zusammen und können
in einer einzelnen Dosierungsform oder als Kit für eine getrennte, gleichzeitige
oder sequenzielle Verabreichung zugänglich gemacht werden.
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Wenn
L. pentosus NCIMB 41114 in einer Ernährungsformulierung verabreicht
wird, kann dieser zu allen Nahrungsmittel- oder Getränkeprodukten
zugegeben werden, insbesondere gekühlten, gefrorenen oder Langzeitmilchprodukten,
wie Milch, auf Milch basierende Pulver, Joghurt, Kefir, Eiscreme, Milchshakes,
Käse, Sahne,
Quark, fermentierte Milch und auf Milch basierende, fermentierte
Produkte, aber auch Sojaprodukte, fermentierte, auf Getreide basierende
Produkte, Nahrungsaufstriche, gebackene Produkte, fertige Ernährungsprodukte,
Sondenernährungsformulierungen
und Kleinkindformulierungen. Es ist auch möglich, die Bakterien in essbaren Formen
bereitzustellen, die zum Füttern
von Tieren geeignet sind, wie Pferden und Haustieren.
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Oft
ist es bevorzugt, den Bakterienstamm der Erfindung auf einem fermentierbaren
Substrat zu kultivieren, wie Milch oder stärkehaltigen Substraten, wie
einer Getreideaufschlämmung
und dann das fermentierte Produkt in einer Ernährungszusammensetzung zu verwenden,
beispielsweise einem Nahrungsmittel oder einem Getränk.
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In
einer Ernährungszusammensetzung,
beispielsweise Nahrungsmittel- oder Getränkeformulierungen, kann das
Produkt eine oder mehrere Ernährungskomponenten
enthalten, die ausgewählt
sind aus Fett, Protein, Kohlenhydraten, Fasern, Mineralien und Vitaminen
zusätzlich
zu den L. pentosus LPK Bakterien. In Anbetracht der Wichtigkeit
der Faser bei der Regulierung der Verdauung ist es bevorzugt, dass
eine Sorte an Fasern in ein Ernährungsprodukt oder
ein pharmazeutisches Produkt der Erfindung einbezogen wird. Es ist
bekannt, dass probiotische Bakterien zur Proliferation stimuliert
werden, wenn sie mit Nahrungsfasersubstraten versorgt werden, die "präbiotische" Komponenten genannt
werden. Dies hat Vorteile bei der Förderung der Kolonialisierung
des Gastrointestinaltrakts und der Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit
der Kultur sogar nachdem der Konsum des Probiotikums beendet wurde. Daher
wird in einer bevorzugten Ausführungsform der
Erfindung der probiotische Stamm der Erfindung zusammen mit einem
präbiotischen
Substrat entweder in einer einzelnen, gemeinsamen Dosierungsform
oder als Kit aus Bestandteilen zur gleichzeitigen, getrennten oder
sequenziellen Verabreichung verabreicht.
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Obwohl
der neue Stamm von L. pentosus zur Bereitstellung von Gesundheitsnutzen
an sich fähig ist,
existiert auch die Möglichkeit
der Co-Verabreichung dieses Bakteriums mit anderen Bakterien, die bekanntermaßen probiotische
Eigenschaften haben.
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Der
Stamm wird vorzugsweise zu einem Nahrungsmittelträger oder
pharmazeutischen Träger in
einer Menge von 105 CFU/g bis etwa 1011 CFU/g, vorzugsweise etwa 106 bis
1010 CFU/g und vor allem etwa 107 bis etwa 109 CFU/g
des Trägers
gegeben. Es ist bevorzugt, dass der Bakterienstamm in lebender Form
verabreicht wird, aber vor der Verabreichung können die Bakterien attenuiert
oder getötet werden.
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Typischerweise
ist die Verabreichung von zumindest 104 CFU/Tag
des erfindungsgemäßen Stamms
klinisch wirksam. Bevorzugter liegen Tagesdosierungen im Bereich
von 106 bis 1012 CFU/Tag. Am
bevorzugtesten sind 107 bis 1010 CFU/Tag.
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Beispiele
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Beispiel 1: Isolierung
des L. pentosus Stamms LPK (NCIMB 41114)
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(i)
Kontinuierliches Kultursystem: Es werden 3 Chemostaten parallel
angesetzt, wobei jeder unter Stickstoffgas bei 37°C pH 6,5
und einer Verdünnungsrate
von 0,066 h–1 gehalten
wird. Diese Bedingungen werden so eingestellt, dass sie den Bedingungen ähneln, die
typischerweise in der distalen Region des menschlichen Kolons gefunden
werden. Die Chemostaten werden mit einem Kontrollwachstumsmedium
versorgt, das sich zusammensetzt aus (gl–1 in
destilliertem Wasser): Hefeextrakt 2, Peptonwasser 2, NaCl 0,1,
K2HPO4 0,04, KH2PO4 0,04, MgSO4 × 7
H2O 0,01, CaCl2 × H2O 0,01, NaHCO3 2,
Tween 80 2, Hämin
0,05, Vitamin K1 0,01, Cystein × HCl
0,5, Gallensalze 0,5, Glucose 0,4, Stärke 3, Pectin 2 und Arabinogalactan
1. Das Medium wird bei 121 °C
für 30
Minuten autoklaviert und während
es noch heiß ist,
unter Stickstoffgas gesetzt. Nachdem sich das Medium abgekühlt hat
wird 1 gl–1 sterilfiltriertes
Tetracyclin oder 1 gl–1 filtersterilisiertes
Nystatin aseptisch zum Mediumreservoir gegeben. Kontrollchemostaten ohne
antimikrobielle Mittel werden ebenfalls angesetzt.
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(ii)
Beimpfung: Frisch entleerte Fäkalproben werden
aus gesunden Freiwilligen (n = 6) erhalten und es werden 10 % (G/V)
Aufschlämmungen
anaerob mittels 0,1 mol l–1 Phosphatpuffer pH
7 (26) hergestellt. Keiner der Freiwilligen hatte eine gastrointestinale
Störung
und hat Antibiotika für
zumindest 3 Monate vor der Studie vermieden. Die 300 ml Chemostatenbehälter sind
halb mit Medium gefüllt
und es werden 150 ml Aufschlämmung
zu jedem Behälter gegeben.
Das System wird dann für
24 Stunden stehengelassen, bevor die Mediumpumpen gestartet werden.
Das Experiment wird mit 6 unterschiedlichen Fäkeldonoren jeweils dreifach
wiederholt.
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(iii)
Mikrobielle Kulturtechniken: Es wird eine Probe aus jeder fäkalen Aufschlämmung als
Inokulum entnommen und 1 ml Proben werden ebenfalls aus jedem Chemostaten
entfernt, wenn das Fermentationssystem einen statischen Zustand
erreicht hat (nach 164 Stunden). Diese werden dann seriell mit vorreduziertem
Peptonwasser der halben Konzentration verdünnt (sechsfach). Jede Verdünnung wird dreifach
auf vorreduzierte Agarmedien plattiert (unter einer anaeroben Atmosphäre mit 10
% CO2, 10 % H2, 80
CO2 bei 37°C) die zur Selektion von prädominanten
Gruppen der Darmbakterien entwickelt wurden: Wilkins Chalfren (Oxoid)
für gesamte
Anaerobe, Rogosa (Oxoid) für
Lactobacillen, Beerens für
Bifidobakterien, KVLB für
Bakteroides, verstärkter
Clostridienagar (Oxoid) + Novobiocin 8 mg/l und Colostin 8 mg/l
für Clostridien
und Azidagar (Oxoid) für Gram-positive
Kokken. Jede Verdünnung
wird dann aerob auf Nutrient Agar (Oxoid) plattiert, um auf Gesamtaerobe
zu selektieren, Sabouraud Dextroseagar + Chloramphenicol und Cyclohexamid
für Hefe
und Mac Conkey Agar Nr. 3 (Oxoid) für Coliforme und bei 37°C inkubiert.
Nach einer Inkubation für
24–48
Stunden werden die aeroben Kolonien gezählt und nach einer Inkubation
für 48–72 h werden
die anaeroben Platten ausgezählt.
Es werden auch Kolonien mit unterschiedlichen Morphotypen von den
Platten für
die Gramfärbung,
die mikroskopische Untersuchung und die phänotypische (biochemische) Charakterisierung gepickt,
um die Kulturidentitäten
zu bestätigen.
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Ergebnisse:
Die Anzahl der prädominanten Darmorganismen
in den 6 verwendeten Inokula wird nach den Bedingungen des statischen
Zustands in den Kontrollchemostaten aufrechterhalten. Dies bestätigt, dass
das verwendete Wachstumsmedium bei der Erhaltung der Populationen
in den kontinuierlichen Kulturexperimenten effizient ist. Daher
sind alle Unterschiede in den Profilen, die aus einer Antibiotikaexposition
kommen, auf diese Zusätze
anstatt auf andere experimentale Variationen zurückzuführen. Hefen werden in 4 der
6 getesteten Fäkalproben
der Freiwilligen detektiert.
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Die
Wirkung von Tetracyclin ist die deutliche Verringerung der Populationen
aller getesteten Bakterien im Vergleich zu den Kontrollen, wobei
das breite Aktivitätsspektrum
bestätigt
wird. Eine interessante Beobachtung ist, dass die Wirkung von Tetracyclin es
Hefen erlaubt, in den Fermentationssystemen im Vergleich zu Kontrollchemostatenmengen
zahlenmäßig zuzunehmen.
Dies hat klinische Auswirkungen auf die Verwendung von Tetracyclin
und assoziierten Risiken durch ein übermäßiges Wachstum von Hefen. Tatsächlich werden
in einem der hierin verwendeten Inokula Hefen anfänglich nicht
detektiert, aber im Verlauf der Tetracyclinchemostaten angereichert.
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Wie
erwartet werden die Hefen in den Nystatinchemostaten gehemmt. Jedoch
werden auch bestimmte Bakteriengattungen beeinflusst. Prinzipiell umfasst
dies eine Reduktion der Lactobacillen, die allgemeine probiotische
Mikroorganismen sind, welche als wichtig für die gastrointestinale Gesundheit betrachtet
werden. Die klare Indikation ist, dass die Nystatinverwendung nicht
zum Erhalt der inhärenten probiotischen
Spiegel beiträgt.
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Während der
Tetracyclinchemostatenexperimente zeigt einer der Läufe ein
unerwartetes Ergebnis. Die Hefen sind am Anfang des Experiments
vorhanden, aber im Gegensatz zum allgemein beobachteten Trend, wachsen
sie nicht weiter. Anstelle dessen ist ein Gram-positives Stäbchen vorherrschend, wobei
keine anderen Zelltypen detektiert werden. Es wurde daher eine genotypische
Arbeit ausgeführt, um
diesen Mikroorganismus zu identifizieren.
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(iv)
16S rRNA Isolierung und Amplifizierung: Die gesamt DNA wird aus
dem Lactobacillus mittels einer InstaGene Matrix (Biorad, Hemel
Hempstead, Hertfordshire, UK) gemäß den Anleitungen des Herstellers
extrahiert. Die 16S rRNA Gene werden dann durch PCR mittels konservierter
Primer nahe den 3' und
5' Enden des Gens
amplifiziert. Das amplifizierte Fragment entspricht den Positionen
~30 bis ~1500 des Escherichia coli 16S rRNA Gens. In einem Endvolumen
von 50 μl
enthält
das Reaktionsgemisch die Amplifizierungsprimer, die vorgemischten
Desoxynukleosidtriphosphate, MgCl2, die
Matrize und Taq DNA Polymerase, die nach einer Vorzyklusstufe zugegeben
wird, bei der das Reaktionsgemisch für 4 Minuten auf 96°C erhitzt
wird und dann bei 0°C
gehalten wird. Die PCR Amplifizierungsbedingungen betragen 1 Minute
bei 95°C,
1 Minute bei 55°C
und 1,5 Minuten bei 72°C
für 30
Zyklen. Nach dem letzten Zyklus wird die Reaktion für 10 Minuten
verlängert
und dann auf 10°C
gehalten. Die Amplifizierungsprodukte werden durch Elektrophorese
mittels eines 1 % (G/V) Agarosegels in 1 × TEA (40 mM Tris-Acetat, 1
mmol l–1 EDTA)
sichtbar gemacht, das Ethidiumbromid enthält (0,5 μg ml–1).
Die Reaktionsprodukte, die Banden zeigen, die den Produkten mit
der korrekten Größe entsprechen
(1500 Basenpaare für
die Primer pA-pH) werden mittels eines QIA-Quick PCR Reinigungskits (QIAgen,
Crawley, West Sussex, UK) gemäß den Anleitungen
des Herstellers gereinigt.
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(v)
rRNA Sequenzierung: Zur Sequenzierung der PCR Produkte werden etwa
1500 Nukleotide proximal zum 5' Ende
der rRNA mittels eines dRhodamin-Terminationszyklussequenzierkits
(PE Applied Biosystems, Inc., Foster City California, USA) und eines
automatischen Modell 377 DNA Sequenziergeräts (PE Applied Biosystems,
Inc., Foster City California, USA) angegangen. Die erzeugten Sequenzen
werden mit 16S rRNA Gensequenzen verglichen, die in der GenBank/EMBL
Datenbank mittels des FASTA Programms und des Ribosomalen Database
Projects (RDP) unter Bildung der prozentualen Identitätsbewertungen
mit anderen Bakterienspezies verglichen.
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Ergebnisse:
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Von
den 1600 Basen in diesem Gen werden etwa 1500 sequenziert und zeigen,
dass der Organismus ein naher Verwandter des Lactobacillus pentosus
und Lactobacillus plantarum ist, die phylogenetisch ähnlich sind.
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L.
pentosus LPK wird anschließend
gemäß dem Budapester
Abkommen am 28. August 2001 bei der NCIMB, Aberdeen, UK hinterlegt
und erhält
die Hinterlegungsnummer NCIMB 41114.
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Beispiel 2: Wechselwirkungen
zwischen dem isolierten Lactobacillus und Candida albicans
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Experiment
1: Candida albicans und ein Lactobacillus, der aus den Chemostaten
isoliert wurde, werden über
Nacht jeweils in Sabouraud Dextrose Medium (Oxoid) und MRS Medium
(Oxoid) angezogen. Dann wird jeweils 1 ml in einem 750 ml Batchfermenter
angeimpft, der die folgenden Medienbestandteile enthält (gl–1 in
destilliertem Wasser): Hefeextrakt 2, Peptonwasser 2, NaCl 0,1,
K2HPO4 0,04, KH2PO4 0,04, MgSO4 × 7
H2O 0,01, CaCl2 × H2O 0,01, NaHCO3 2,
Tween 80 2, Cystein × HCl
0,5 und Glucose 1,0. Das Medium wird bei 121 °C für 30 Minuten autoklaviert und
solange es noch heiß ist
unter Stickstoffgas gestellt. Die Co-Kulturfermentation wird anaerob
bei 37°C
und pH 6,5 gehalten. Es werden regelmäßig Proben über 48 Stunden entnommen und die
Zellzahlen mikroskopisch ausgezählt.
Die Kulturidentität
wird durch eine Kombination aus phänotypischen und biochemischen
Merkmalen bestätigt.
Am Ende der Fermentation wird 1 ml aus dem Fermenter entfernt, seriell
verdünnt
und auf MRS und Sabouraud Dextrose Agar plattiert und anaerob für 48 Stunden
inkubiert.
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Experiment
2: Candida albicans und der isolierte Lactobacillus werden über Nacht
jeweils in Sabouraud Dextrose und MRS angezogen. 6 MRS Agarplatten
(2 % G/V) werden auf eine gleiche Dicke gegossen und anaerob reduziert.
Die isolierte Lactobacillus Kultur wird dann auf jede Platte ausgestrichen.
7 ml Sabouraud Dextrose Agar (0,7 % G/V) wird bei 50°C gehalten
und in 50 μl
der C. albicans Kultur angeimpft. Diese wird dann gleichmäßig über die
mit der Lactobacillus Kultur ausgestrichenen Platten gegossen. Die
Platten werden anaerob für
48 Stunden bei 37°C
inkubiert und auf Hemmzonen untersucht. Beide Experimente werden
sechsmal wiederholt.
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(Falls
nichts anderes angegeben ist, werden alle Chemikalien von Sigma
Chemical Co. bezogen).
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In
Experiment 1 wächst
dieser neue Lactobacillus Stamm gut und hemmt das Wachstum von Candida,
wobei er diese auf die Animpfmengen reduziert (1).
Im Experiment 2 gibt es große
Hemmzonen über
den Lactobacillus Kolonien, in denen Candida nicht fähig war
zu wachsen (Daten nicht gezeigt). Die Resistenz dieses Stamms gegenüber der
antimikrobiellen Attacke und dessen kräftiger Antagonismus gegenüber Candida
spp. hat eine Relevanz für
eine mögliche
Aufrechterhaltung der Darmfunktion während einer Therapie für Zustände, wie
IBS.
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Auf
der Basis dieser Experimente wird antizipiert, dass der Mikroorganismus
als Zusatz oder alternativ zu einer herkömmlichen Therapie für mit Hefe
zusammenhängende
Zustände,
wie Soor und IBS angewendet werden kann.