USO DE BACTERIAS PROPIQNICAS PARA LA PRODUCCIÓN DE ACIDO PROPIÓNICO Y/O PROPIONATOS EN EL COLON La presente invención se refiere a la utilización de bacterias propiónicas con el objeto de optimizar la producción de ácido propiónico y/o propionatos y eventualmente ácido acético y/o acetatos a nivel del colon. Desde hace algunos años los especialistas en nutrición aconsejan a sus pacientes una alimentación rica en fibras a las cuales atribuyen efectos fisiológicos y metabólicos que pueden ser favorables para la salud. Se sabe que las fibras alimenticias resisten a la digestión enzimática en el intestino delgado y solamente son degradadas y asimiladas al nivel del colon, es decir la parte final del intestino. El efecto benéfico mencionado arriba por consiguiente solamente puede ejercerse si dicha degradación y dicha asimilación son lo más completas posibles en este lugar predeterminado: el colon. Se ha podido establecer que estas reacciones biológicas son consecutivas a la fermentación anaeróbica de fibras alimenticias bajo la acción de microorganismos en el colon. Dicha fermentación provoca la producción de ácidos grasos de cadena corta (AGCC) , de hidrógeno, de dióxido de carbono y de biomasa. Estos ácidos grasos de cadena corta son esencialmente el ácido acético, el ácido propiónico y el ácido butírico; en el organismo sano, solamente pueden ser producidos a nivel del colon, puesto que se trata del único lugar del cuerpo humano en donde imperan las condiciones anaeróbicas estrictas que permiten la fermentación que forma la base de su síntesis a excepción del ácido acético de la cual una cantidad muy pequeña puede ser producida a nivel hepático. Diferentes estudios han comprobado la importancia de estos ácidos grasos de cadena corta que son benéficos para la salud. Según la literatura parece que las funciones fisiológicas de estos tres ácidos grasos de cadena corta son diferentes entre ellos: de hecho, los ácidos acéticos y propiónicos son conducidos de manera directa hacia el hígado en donde la totalidad del ácido propiónico es metabolizado mientras que una parte del ácido acético es enviada a tejidos diferentes, mientras que el ácido butilico es utilizado de manera más especifica a nivel interno de la pared cólica. La síntesis de los ácidos grasos de cadena corta, implica por consiguiente la presencia en el colon por un lado de un sustrato basado en fibras, que es fácil de suministrar a través de la alimentación y por otra parte, de una flora bacteriana equilibrada y adaptada, presente de manera óptima y constante. Esta flora bacteriana puede provenir ya sea de la flora endógena persistente de cada individuo, ya sea de la alimentación. Se sabe de hecho que el contenido del tubo digestivo humano que es especifico para cada individuo y corresponde aproximadamente a una cantidad de 1 a 1.5 kg de materias 5 alimenticias en proceso de transformación digestiva, contiene una población importante de microorganismos constituida de una mezcla de numerosas especias que puede ser evaluada en
• una cantidad de 1011 a 10lz células por gramo en el colon; dicha población constituye una masa bacteriana de un cierto
10 peso cuyo equilibrio, bueno o malo, difícilmente puede ser modificado totalmente y sobre todo de manera duradera solamente a través de la alimentación corriente. • Además, la alimentación que se ingiere diariamente nunca es estéril y por consiguiente lleva una cantidad más o menos
15 importante de bacterias (leche, productos lácteos fermentados, queso, sidra, vino, cerveza, productos de cerdo, etc.). Las modificaciones de la flora cólica consecutivas a la absorción de estas bacterias solamente son temporales. Además se debe observar que ya se ha propuesto intentar
• 20 modificar una población microbiana del tracto intestinal mediante la administración y particularmente la ingesta voluntaria de células bacterianas que se consideran benéficas para la salud (se conoce como probióticas) particularmente bacterias lácticas y bacterias bifidas. 25 La introducción en el organismo de una población importante de estas bacterias ya sea a través de una alimentación particular, ya sea a través de la ingesta directa de estas células microbianas, ha sido propuesta particularmente con el objeto de limitar el desarrollo de especias patógenas y que 5 provocan putrefacción: se sabe que la flora endógena que se encuentra en el colon se divide en grupos diferentes de bacterias, algunos de dichos grupos son inofensivos, hasta
• benéficos, mientras que otros, particularmente los clostridium y ciertos agentes de putrefacción lleva a la
10 producción de sustancias tóxicas y tienen una influencia negativa sobre la salud. La idea de base de la invención consiste en el hecho de introducir regularmente en el organismo por via bucal una cantidad importante de una flora microbiana probiótica que
15 tiene la capacidad de favorecer la síntesis regular de ácidos grasos de cadena corta a nivel del colon. Entre las especies microbianas que pueden utilizarse para este propósito, las bacterias lácticas son poco adaptadas puesto que debido a su naturaleza producen sobre todo y antes
• 20 que nada ácido láctico y de manera secundaria un poco de ácido acético pero no producen ácido propiónico ni ácido butírico. Al contrario, bacterias de otro tipo, las bacterias propiónicas pueden producir una cantidad abundante de ácido propiónico y de ácido acético, por consiguiente los dos
25 ácidos grasos de cadena corta cuyo propósito es irrigar redes tisulares, por ejemplo, según un porcentaje de 2/3 de ácido propiónico por 1/3 de ácido acético. Estas bacterias están presentes en la alimentación humana desde hace siglos, en los quesos de pasta prensada cocida; además presenta la ventaja 5 de estar mejor equipadas que las bacterias lácticas para tener una actividad en el colon en donde la anaerobiosis es total y además resistentes a los estrés tecnológicos que las • bacterias lácticas y las bacterias bifidas. Se debe observar que ya se ha propuesto en la literatura 10 hacer absorber bacterias propiónicas, particularmente para estimular el desarrollo de bacterias bifidas en el intestino (WO-97/19689) producir monóxido de nitrógeno en el tubo digestivo humano o animal (documento WO-98/27991) . Sin embargo a la fecha nunca se habla tenido la idea de utilizar 15 estas bacterias para la producción de ácidos grasos de cadena corta a nivel del colon. La presente invención se refiere por consiguiente a la utilización de bacterias propiónicas seleccionadas en función de su carácter poco autolitico y de su capacidad para 20 resistir a las sales biliares para la obtención de una composición de alimentación corriente o de una composición dietética o medicamentosa que puede ser absorbida por el ser humano o el animal, elaborada de tal manera que las bacterias tengan protección por lo menos parcial con respecto a la 25 acidez gástrica, que contiene por lo menos 10° células/gramo
.f aiaffifjj & de dichas bacterias susceptible de estimular e incrementar de manera significativa la síntesis del ácido propiónico y/o propionato y eventualmente de ácido acético y/o acetato a nivel del colon por fermentación bacteriana anaeróbica. Para que estas bacterias puedan tener el efecto benéfico deseado, es indispensable seleccionar cepas poco autoliticas adecuadas para llegar sin daño a colon, eventualmente y desarrollarse alli y producir cantidades suficientes de ácido propiónico. Se sabe que los dos estrés principales, a las cuales las bacterias ingeridas son sometidas durante su paso por la parte superior del tubo digestivo se relacionan, por un lado, con la acidez del medio estomacal (pH de 4 a 1) , y por otra parte, a la presencia de sales biliares del intestino delgado (del orden de 15 mmoles/1 como máximo al nivel del duodeno) . Se ha podido establecer que bacterias que han sido expuestas a acidez estomacal son fragilizadas y por consiguiente inadecuadas para resistir a las sales biliares, aún cuando permanecen viables a la salida del estómago, por consiguiente, de conformidad con la presente invención es indispensable que las bacterias propiónicas sean sometidas a un tratamiento de una naturaleza adecuada para permitir a estas bacterias no estar sometidas al estrés gástrico, lo que corresponde en términos generales a una encapsulación que puede ser voluntaria o involuntaria, por ejemplo, en el caso de un alimento de tipo queso. Esta situación se ha aclarado gracias a una prueba a través de la cual se evalúa la influencia del pH ácido y las sales biliares sucesivamente o individualmente sobre la viabilidad 5 de dos cepas de bacteria propiónicas lácteas que pertenecen a la colección TL de LRTL (Laboratoire de Recherches de Technologie laitiére - InRA de Rennes) , que pertenecen a la
• especie P. Freudenreichii subespecie shermanii . Los resultados de esta prueba se describen abajo. 10 Las bacterias han sido cultivadas a una temperatura de 30° C en un medio YEL durante 2 dias (principio de la fase estacionaria) . La densidad óptica a 650 nm fue
• respectivamente de 2.28 y 2.64 en el caso de TL 162 y TL 24. - Estrés ácido 15 Los cultivos han sido diluidos a 1/10 en medio S (triptona- lactato) a un pH 2.5 (pH final de 3.0) . Después de una incubación a 37° C durante 45 minutos, los cultivos fueron centrifugados y las bacterias colocadas de nuevo en el mismo volumen de YEL. Se efectuaron numeraciones antes de la
• 20 incubación y al final de la incubación, y la reanudación del crecimiento fue seguida por mediciones de DO durante 5 dias a una temperatura de 37° C. - Estrés biliar Los cultivos iniciales fueron centrifugados y las bacterias 25 colocadas de nuevo en un volumen 10 veces superior de YEL que contenia 0.3% de bilis de res (a aproximadamente 50% de sales biliares) después de una incubación a una temperatura de 37° C durante 30 minutos, los cultivos fueron centrifugados y las bacterias colocadas de nuevo en el mismo volumen de YEL. Se 5 efectuaron numeraciones antes y al final de la incubación y la reanudación del crecimiento fue seguida por mediciones de DO durante 5 dias a una temperatura de 37° C. • - Estrés ácido y biliar sucesivos Bacterias fueron sometidas a estrés ácido de conformidad con
10 lo descrito arriba, pero después de centrifugación, las células fueron colocadas de nuevo en YEL que contenia 0.3% de bilis. Después de una segunda incubación a una temperatura de 37° C durante 90 minutos, los cultivos fueron centrifugados y las bacterias colocadas de nuevo el mismo volumen de YEL.
15 Numeraciones fueron efectuadas antes y al final de las incubaciones y el reinicio del crecimiento fue seguido por mediciones de DO durante 5 dias a una temperatura de 37° C. Los resultados obtenidos se presentan por un lado en la tabla 1 abajo que menciona la influencia del estrés ácido y/o
• 20 biliar sobre la viabilidad de las bacterias y, por otra parte en la figura 1 que es un esquema que representa la reanudación del crecimiento después de los diferentes estrés. Tabla 1: viabilidad (cfu/ml) 25 antes de después de después de estrés estrés ácido estrés bi. estrés ácido TL 162 3.0 x 108 9.7 X 10ó / solo TL 24 4.0 x 108 1.0 X ío1 / estrés biliar TL 162 3.0 x 108 / 4.4 x 10 5 solo TL 24 4.0 x 108 / 4.7 x 10: estrés TL 162 3.0 x 108 9.7 X 106 2600 sucesivos TL 24 4.0 X 108 1.0 X 107 <10 • Se puede establecer de esta forma que: La acidez provoca una mortalidad importante de las 10 bacterias (96.8% para TL 162 y 95.5% para TL 24) lo que explica un retardo relativamente grande para el reinicio del crecimiento (figura 1) . • La bilis no provoca ninguna mortalidad en las bacterias, por lo que se logra una reanudación muy rápida del 15 crecimiento. Cuando se somete las bacterias a la bilis, después de un estrés ácido previo, esto provoca una mortalidad casi total de las bacterias. Este resultado, totalmente inesperado, indica por consiguiente que bacterias que ifP 20 han sido sometidas a un estrés ácido y que sin embargo permanecen viables se vuelven totalmente sensibles a la bilis mientras que sin estrés ácido previo, estas mismas bacterias son totalmente resistentes a las sales biliares . 25 - Tomando en cuenta esta situación, se efectuaron ensayos
i í de pre-adaptación con el objeto de incrementar la resistencia de las bacterias. Se sabe de hecho que un pre-estrés ácido (pH 4.5-5) protege eficazmente las células contra un estrés ácido (pH 2) . 5 Se efectuaron también tres ensayos de adaptación sobre TL 162: Pre-estrés ácido: incubación preliminar de las células a
• una temperatura de 37° C durante 30 minutos a un pH de 5. 10 - Pre-estrés biliar: incubación durante 30 minutos en presencia de 0.08% de bilis. Pre-estrés ácido y biliar: incubación durante 30 minutos
# a pH 5 y en presencia de 0.08% de bilis. Se aplicó el mismo protocolo que el protocolo anterior y 15 se obtuvieron los resultados mencionados en la tabla 2 abajo: Tabla 2: Viabilidad (cfu/ml) antes de estrés después de ^P 20 estrés sucesivos sin adaptación previa 3 x 108 2600 adaptación acida previa 3 x 108 100 adaptación biliar previa 3 x 108 1400 adaptación acida y biliar 3 x 108 <100 25 previa Se pudo establecer de esta forma que una pre-adaptación acida fragiliza todavía más las células, mientras que una pre- adaptación biliar no tiene ningún efecto. Estos resultados permitieron por consiguiente evidenciar la 5 necesidad de tratar los estrés sucesivamente, y no separadamente según se describe en la mayoría de los estudios efectuados en este ámbito. Sin embargo se puede suponer que in vivo, las condiciones son menos drásticas para las bacterias (efecto de amortiguación
10 del alimento en el estomago, efecto bactericida menor de las sales biliares en forma miceliaria con fosfolipidos) . Tomando en cuenta lo anterior, para incrementar la cantidad
• de bacterias viables, una mejora de su resistencia a pH ácido no es eficaz puesto que las bacterias siguen sensibles al
15 efecto de las sales biliares. En contraparte, al proteger las bacterias contra el estrés ácido, en particular al ingerir dichas bacterias preacondicionadas en células gastroresistentes, se puede encontrar de nuevo en las heces bacterias naturalmente
• 20 resistentes a la bilis y esto a un nivel elevado de viabilidad. Tomando en cuenta estos resultados, se efectuó una prueba complementaria para comprobar la capacidad de diferentes cepas de bacterias propiónicas a producir cantidades
25 importantes de ácido propiónico después de la puesta en contacto con sales biliares. En esta prueba se comparó 33 cepas de bacterias propiónicas lácteas que pertenecen a la colección TL de LRPM (INR de Rennes) según su actitud para sobrevivir en presencia de 5 bilis y producir después ácido propiónico: 20 cepas que pertenecen a la especie de P. Freudenreichii subespecie shermanii • 6 cepas que pertenecen a la especie P. freudenreichii subespecie freudenreichii 10 - 7 cepas que pertenecen a la especie P. acidipropionici El protocolo de operación fue el siguiente. Cultivos en principio de fase estacionaria (de dos a tres
• dias de cultivo en medio YEK incubado a 30° C) fueron diluidos 1/10 en medio YEL que contenia 0.6% de bilis de res
15 (aproximadamente 7-8 mmoles/1 de sales biliares) . Esta concentración en bilis fue seleccionada para discriminar de la mejor manera las cepas entre ellas y constituye títulos en sales biliares del mismo orden que los títulos encontrados en el duodeno. • 20 Las diluciones fueron incubadas a una temperatura de 37° C durante 30 minutos y después centrifugadas. Las bacterias fueron colocadas de nuevo en medio YEL (volumen inicial) y sometidas de nuevo a incubación a una temperatura de 37° C. Después de 24 horas de incubación, la DO a 650 nm fue medida
25 para evaluar el reinicio del crecimiento. El sobrenadante fue cosechado y después congelado para dosificar los ácidos grasos . Para ciertas cepas la experiencia fue renovada para confirmar los resultados. 5 Los valores de densidades óptimas a 650 nm antes del estrés biliar y 24 horas después del estrés se presentan en la tabla 3 abajo. Tabla 3: Cepas: DO antes de DO a las 24 hrs . de % de DO a 10 estrés biliar incubación después las 24 hrs. (DO inicial/10) del estrés biliar /DO inicial P. shermanii TL 134 0.29-0. 26 2.60-2.04 90-78 15 TL 144 0.39 3.62 93 TL 146 0.27 1.56 58 TL 147 0.28 1.23 44 TL 148 0.23 0.04 2 TL 160 0.36-0. 32 4.67-4.03 130-126 20 TL 167 0.26 1.05 40 TL 168 0.32 0.57 18 TL 4 0.32 0.25 5 TL 14 0.23 0.73 32 TL 17 0.29 0.55 19 25 TL 22 0.28 1.39 50 TL 24 0.28 1.65 59 TL 162 0.20 2.08 104 TL 34 0.26-0.27 3.40-3.87 131-143 TL 50 0.26 2.05 79 TL 61 0.23 1.31 57 TL 63 0.27-0.26 3.26-3.55 121-137 TL 40 0.30 1.46 49 • P. freundenreichi TL 142 0.34-0.31 2.95-2.80 87-90 10 TL 3 0.24 2.66 111 TL 19 0.30 2.66 89 TL 37 0.23 1.79 78 TL 33 0.26 2.38 92 TL 64 0.29 0.31 11 15 P. acidipropionici TL 2 0.38 2.30 61 TL 9 0.34 2.29 67 TL 15 0.34 3.09 91 TL 54 0.34 1.39 41 • 20 TL 47 0.20 0.22 11 TL 223 0.29-0. 38 2.59-2.91 89-77 TL 249 0.44 3.40 77 Se observa que para ciertas cepas la DO final es superior a la DO inicial, lo que puede explicarse debido al crecimiento 25 reanudado a 37° C y no a 30° C como micialmente .
Con base en los resultados obtenidos, se pueden distinguir esquemáticamente tres tipos de cepas: las cepas que se distinguen por una reanudación rápida del crecimiento, lo que indica una baja mortalidad de las células por la bilis (entre ellas TL 34, TL 160, TL 63, TL 33, TL 15, TL 3, TL 162), Cepas muy poco resistentes a la bilis, que presentan una reanudación del crecimiento muy débil o nula (TL 148, TL 4, TL 64, TL 47) , - Cepas intermedias que se caracterizan por una mortalidad moderada provocada por la bilis (TL 146, TL 147, TL 167, TL 168, TL 14, TL 17, TL 22, TL 24, TL 61, TL 40, TL 54) . Solamente las cepas que presentan una proporción (DO a 24 horas/DO inicial) x 100) mayor que 60% (umbral seleccionado de manera arbitraria) fueron seleccionadas para la medición de lactato, acetato y propionato por HPLC en los sobrenadantes congelados. El titulo inicial de medio YEL en lactato era de 11.4 g/1. Las concentraciones en lactato, acetato y propionato de los sobrenadantes recuperados después de 24 horas de incubación, se presentan en la tabla 4 abajo. Tabla 4: Cepas: lactato acetato propionato consumido producido producido (en g/1) P. shermanii TL 125 5.6 0.6 2.4 TL 134 8.9-7.3 0.9-0.9 4.0-3.4 TL 144 8.8 1.1 4.6 TL 160 9.9-8.8 1.3-1.1 4.7-4.6 TL 162 5.3 0.6 3.3 TL 34 9.7-10.1 1.0-1.2 4.9-4.7
.4 P. freundenreichi 10 TL 142 8.1-8.2 0.9-0.9 4.5-4.0 TL 3 7.8 0.9 3.6 TL 19 6.6 0.7 3.7 TL 33 7.2 0.8 3.4 15 P. acidipropionici TL 2 2.7 0.4 1.5 TL 9 5.3 0.6 2.4 TL 15 3.7 0.4 2.0 TL 223 2.8-3. 0.4-0.4 1.8-1.7 20 TL 249 5.2 0.6 3.2 Esta tabla muestra que, de manera previsible, la cantidad de propionato que se produce se correlaciona con el grado de utilización de lactato. De manera general, las cepas que pertenecen a la especie P. 25 acidipropionici producen menos ácido propiónico que las cepas
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de la especie P. freundenreichii en 24 horas. Tomando en cuenta los resultados presentados arriba ciertas cepas comprueban ser candidatos mejores en cuanto a la producción de propionato después de la bilis. Se trata de 5 cepas que producen por lo menos 2 g/1 de propionato en las condiciones descritas arriba. TL 134, TL 50, TL 3, TL 19, TL 33, TL 249, • y de preferencia más que 4 g/1 de propionato: TL 160, TL 144, TL 34, TL 63, TL 142. 10 Un experimento se efectúo sobre voluntarios sanos con el propósito de verificar la influencia benéfica de células gastroresistentes para mejorar la supervivencia en el f intestino de una cepa de bacteria propiónica de queso ingerida en forma liofilizada (TL 162) . 15 La experiencia fue efectuada sobre 7 individuos en total, con tres periodos de tratamiento de 4 semanas, separados por intervalo de 3 semanas. El tratamiento 1 consistía en ingerir durante 3 semanas 5 x 109 cfu/dia de bacterias, acondicionadas en células no gastroresistentes. 20 El tratamiento 2 consistía en ingerir durante 5 semanas 5 x 1010 cfu/dia de bacterias, acondicionadas en células no gastroresistentes . El tratamiento 3 consistía en ingerir durante 2 semanas 5 x 109 cfu/dia de bacterias, acondicionadas en células 25 gastroresistentes.
. ,..< * Í .* ari Para cada tratamiento, se efectuaron 4 tomas de heces para investigar las bacterias propiónicas con la ayuda de un medio selectivo (Palpropiobac®) , Standda-Industrie, adicionado de 4 mg/1 de metronidazol) . Las fechas de tomas fueron: - SI : justo antes del periodo de ingesta, S2; una semana después del inicio de la ingesta, S3: dos semanas después del inicio de la ingesta, S4 : una semana después del final del periodo de ingesta, - HP (para el periodo 3) : tres semanas después del final del periodo de ingesta. A lo largo de todo este experimento, los voluntarios no podían consumir queso que contenían bacterias propiónicos en cantidad importantes (Emmental, Comté, Leer dammer, Gruyeres Suisses, ... ) , a excepción de quesos fundidos. La tabla 5 indica los resultados de viabilidad de las bacterias propiónicas en las heces. Con las células clásicas, la dosis de 5 x 109 cfu/dia
(periodo 1) parece insuficiente para encontrar bacterias propiónicas viables en cantidades importantes en todos los voluntarios. Al contrario, con la dosis de 5 x 1010 cfu/dia
(periodo 2), todos los voluntarios tienen más de log cfu/g de bacterias propiónicas viables en las heces, desde la primera semana de tratamiento. Sin embargo, los niveles máximos de viabilidad observados con las dos dosis no son diferentes
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(aproximadamente 7 logs) . La utilización de células gastroresistentes (periodo 3) mejora la viabililidad de las bacterias propiónicas en las heces especialmente en los voluntarios en los cuales se
5 encontraron pocas bacterias durante el primer tratamiento
(vol. 1, 2 y 6) . De hecho, en comparación con el periodo 2, los niveles de viabilidad obtenidos son equivalentes en
• promedio. * con base en 5 x 109 cfu/dia la utilización de células 10 gastroresistentes se justifica por consiguiente para un cierto número de individuos (vol. 1, 2, 6), para los demás no mejoran la viabilidad o mejoran poco dicha viabilidad (vol.
# 3, 4, y 5), * presentan resultados aproximadamente equivalentes a las 15 células clásicas que contienen 5 x 10ilJ cfu. Se midieron los AGCC en las heces por cromatografía en fase gaseosa. Las cantidades de propionato en las heces se indican en la tabla 6. en cuanto al análisis estadístico, dos grupos de valores han sido comparados de dos en dos: los valores que
• 20 corresponden a las muestras de heces en donde las bacterias propiónicas no estaban detectadas (menos que 4 logs) , para todos los tratamientos y periodos y los valores correspondientes a las muestras de heces en donde las bacterias propiónicas fueron numeradas a más de 6 logs cfu/g.
25 En el primer caso, la cantidad media de propionato es de 5.06 ± 2.56 umoles/g (n = 25), y en el segundo caso, la cantidad de media es de 7.19 ± 3.18 umoles/g (n = 30). Estos dos valores son significativamente diferentes en p menor que 0.06 (prueba de Student) . En el caso de los demás AGCC, no hay 5 diferencia significativas. Este experimento muestra por consiguiente que la presencia de cantidades importantes (más que 6 log cfu/g) de bacterias propiónicas en el colon después de la ingesta de TL 162 incrementa significativamente la cantidad de propionato en las heces. Sin embargo, la TL 162 10 no es el mejor candidato para optimizar la cantidad de ácido propiónico en el colon (véase criterio de selección in vitro) es probable que los resultados puedan ser mejorados con una
• cepa seleccionada según los criterios mencionados arriba. Tabla 5: Numeración de las bacterias propiónicas en las heces 15 durante los tres periodos de tratamiento (resultados en log cfu/g de heces frescas) Vol. 1 Vol. 2 Vol. 3 Vol. 4 Vol. 5 Vol. 6 Vol.7 periodo 1 SI 4.00 <4 <4 4.00 <4 4.85 4.30 S2 4.00 <4 4.70 6.00 7.15 4.85 5.68 • 20 S3 5.88 4.00 6.85 6.08 6.30 4.70 6.76 S4 <4 <4 <4 6.11 6.48 <4 5.00 periodo 2 SI 6.46 <4 6.43 6.30 <4 S2 5.83 5.40 6.69 6.32 7.20 S3 6.36 6.45 6.83 6.36 5.00 25 S4 5.11 <4 <4 <4 6.11
, ..a^ áa.
periodo 3 SI 3.85 <3 6.15 <4 6.36 <3 52 6.51 5.43 4.95 6.75 6.81 5.68 53 6.56 5.77 6.70 6.23 6.11 5.95 54 5.26 <3 <3 6.80 <3 5.89 5 HP 4.60 <2 2.77 6.23 7.30 <2 media s n* periodo 1 4.29 0.40 4/7 • 5.40 1.12 6/7 5.79 1.07 7/7 10 5.86 0.77 3/7 periodo 2 6.40 0.09 3/5 6.29 0.71 5/5 • 6.20 0.70 5/5 5.61 0.71 2/5 15 periodo 3 5.46 1.40 3/6 6.03 0.78 6/6 6.22 0.35 6/6 5.98 0.78 3/6 5.23 1.98 4/6 w 20 n* = número de individuos en los cuales las bacterias propiónicas pudieron ser numeradas células en negritas: conjunto de valores superiores a 6 log cfu/g. Tabla 6: Concentración de propionato en las heces frescas (en 25 umol/g)
M_6IÉ___5__!__S - » . - -i t - _ <- Í....?, . . . . . . ¿ «.j- L.JS Vol. 1 Vol. 2 Vol. 3 Vol. 4 Vol. 5 Vol. 6 Vol.7 periodo 1 SI 7.70 4.82 3.73 2.38 3.70 13. 83 S2 10.03 3.61 5.43 5.32 4.84 3.86 18, .08 S3 9.44 3.88 2.29 4.35 3.36 7.99 12 .01
5 S4 6.00 2.60 3.68 8.40 5.06 5.17 10, .45 periodo 2 SI 9.56 7.36 13.77 8.49 6.14 S2 7.12 1.86 7.20 5.82 3.72 • S3 10.60 5.11 3.99 6.42 4.83 S4 19.16 3.12 3.58 2.16 7.68 0 periodo 3 SI 11.90 5.05 10.82 3.43 13.45 2.04 S2 9.29 8.34 7.82 6.45 3.28 7.56 S3 10.91 6.62 10.60 7.72 4.99 2.25 S4 11.93 2.89 8.91 3.47 6.15 5.20 HP 3.58 6.57 6.49 15 células en negritas: conjunto de valores que corresponden a muestras con bacterias propiónicas superiores a 6 log cfu/g. Tomando en cuenta lo anterior y de conformidad con una característica preferente de la invención, las bacterias propiónicas seleccionadas se seleccionan entre cepas que
• 20 producen ácido propiónico en cantidad fisiológicamente significativa y en particular entre las cepas que producen 2/g de ácido propiónico y/o propionatos y de preferencia, más que 2 g/1 de ácido propiónico y/o propionatos, después de haber sido cultivadas a una temperatura de 30° C, en medio
25 YEL que contiene aproximadamente 11.4 g/1 de lactato durante 2 a 3 dias, y después diluidas 1/10 en un medio YEL que contiene 0.06% de bilis de res, incubadas a 37° C durante 30 minutos, centrifugadas, colocadas de nuevo en medio YEL y sometidas de nuevo a incubación a una temperatura de 37° C 5 durante 24 horas. Otro criterio de selección que puede ser tomado en cuenta de conformidad con la presente invención corresponde a las
• propiedades de adherencia de las cepas en los colonocitos: cepas dotadas de buenas propiedades de adhesión presentan de
10 hecho la ventaja de permanecer más tiempo en el colon, lo que les permite tener más tiempo para sintetizar el ácido propiónico; además, las cepas que se fijan pueden tomar el
• lugar de agentes patógenos. Se debe de observar que para lograr el efecto buscado, no se
15 contempla hacer absorber el ácido propiónico mismo, puesto que debido a la cadena metabólica humana, no podría llegar al colon, y que además, sea mostrado que es dañino a alta dosis para el estómago. Entre los efectos benéficos atribuidos a los ácidos grasos de 20 cadena corta sintetizados a nivel del colon y particularmente entre los efectos benéficos atribuidos al ácido acético y sobre todo al ácido propiónico se puede observar su función a nivel de la asimilación de los minerales principales y sobretodo del calcio, del hierro, del zinc o del magnesio; se
25 pudo de hecho establecer que el ácido propiónico y en menor
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medida, el ácido acético puede favorecer la absorción cólica de estos minerales y la utilización por el organismo de la fracción absorbida. Se trata de un efecto particularmente interesante tomando en 5 cuenta que la asimilación de los minerales está acompañada de efectos funcionales tales como, a titulo de ejemplo, la corrección de la anemia para el hierro o la mineralización • ósea en el caso del calcio. Los estudios experimentales o clínicos efectuados 10 proporcionan un conjunto de argumentos que concuerdan en apoyar un efecto favorable del ácido propiónico y de los propionatos y, en una menor medida, del ácido acético y de • los acetatos sobre el metabolismo de estos minerales; este efecto es probablemente más importante cuando las condiciones 15 de digestión son malas, lo que resulta en una cantidad importante de minerales no absorbidos por el intestino delgado a nivel cólico, y cuando las necesidades son elevadas . La resistencia de relaciones entre los ácidos grasos de • 20 cadena corta y el metabolismo de los minerales ha sido sugerida especialmente por estudios que utilizan fibras solubles. Por consiguiente se pudo establecer que los polisacáridos u oligosacáridos no digeridos por las enzimas digestivas y que por consiguiente son fermentados en ácidos 25 grasos de cadena corta especialmente en propionato por la
' - -a¡frtaztHÍÉ flora cólica incrementan la absorción de minerales tales como el calcio, el hierro o el zinc y que dicho incremento es más claro conforme las condiciones son más patológicas (carencias, gastrectomia, etc.). 5 Estudios de perfusión cólica y a contrario, la ausencia de efectos en sujetos colectomisados permitió confirmar la localización del sitio de acción a nivel cólico. • Se observó además que estas acciones se acompañan de una baja del pH y de una síntesis de ácidos grasos de cadena corta;
10 esto sugiere la intervención de estos ácidos a través de una fermentación, y esto todavía más puesto que se ha verificado que las fibras insolubles, que no pueden fermentar, no tienen
• efecto. Además, se ha establecido que el calcio es hipertrofiado y que el flujo sanguíneo cólico se eleva, lo
15 que muestra un efecto trófico. Los estudios clínicos efectuados sobre este tema son poco numerosos pero permiten confirmar que los efectos de las fibras solubles se obtienen por fermentación cólica y esto permite mostrar directamente el efecto de los ácidos grasos
• 20 de cadena corta sobre la absorción de los minerales. Entre estos estudios, se puede mencionar la publicación (Trinidad TP, Wolever TMS, Thompson LU, Effect of acétate and propionate on calcium absorption from the rectum and distal colon of humans, Am J. Clin. Nutr 1996, 63/574-578) que
25 presenta ensayos en los cuales se sometió a perfusión directa el colon distal de sujetos sanos con ácido acético, ácido propiónico o su asociación en concentración fisiológica; se pudo establecer asi que la desaparición del calcio del lumen cólico es incrementada por los dos ácidos grasos de cadena 5 corta, pero de manera significativamente más importante por el ácido propiónico; este estudio mostró también un efecto de dosis para soportar un sistema de absorción no saturable.
• Los autores han sugerido que la lipofilia mayor del ácido propiónico en comparación con el ácido acético podria
10 favorecer su absorción y la liberación en el colonocito de protones cuyo pasaje en el lumen digestivo favorecerla la absorción de calcio. • Tomando en cuenta lo anterior, la invención se refiere a la utilización de bacterias propiónicas seleccionadas en función
15 de su carácter poco autolitico y de su actitud a resistir a las sales biliares para obtener una composición de alimentación corriente o de una composición dietética o medicamentosa que puede ser absorbida por el hombre o por el animal, elaborada para que las bacterias tengan protección,
20 por lo menos parcialmente, con relación a la acidez gástrica, que contiene por lo menos 10° células/gramo de estas bacterias, susceptible de favorecer la asimilación de los minerales principales, especialmente calcio y/o hierro y/o zinc y/o magnesio a nivel del colon. 25 Según una variante de la invención, se propone también aplicar esta utilización para la obtención de una composición que tiene propiedades antihongos a nivel del colon y, particularmente susceptible de reducir allí el desarrollo de micodermos patógenos de tipo candida/muguete. 5 Esta utilización lleva, de hecho a aprovechar las excelentes propiedades antihongos del ácido propiónico, especialmente en el tratamiento de candidiosis provocadas por antibióticos. f Se observará que la composición utilizada de conformidad con la presente invención puede, eventualmente, contener otras
10 bacterias, particularmente bacterias lácticas y/o bacterias bifidas susceptibles de actuar en sinergia con las bacterias propiónicas para incrementar los efectos mencionados arriba f proporcionando lactato como sustrato que puede fermentar. La composición utilizada de conformidad con la invención
15 puede consistir de una preparación seca o hidratada que se presenta bajo la forma de fracciones individuales de aproximadamente 100 mg a 1 g, de preferencia de 200 a 500 mg, que contienen de preferencia por lo menos 108 células; de manera particularmente provechosa puede presentarse en forma
20 de cápsulas o cápsulas gastroresistentes. Según otra característica de la invención, dicha composición puede también consistir de una preparación elaborada, las bacterias propiónicas agregándose o asociándose a un sustrato que puede fermentar especialmente a fibras alimenticias o
25 bien agregarse o incorporarse a los alimentos líquidos, en forma de pasta o sólidos. En una preparación de este tipo, las bacterias propiónicas pueden desempeñar una doble función, específicamente, tecnológica en un primer tiempo a través de la fermentación de alimentos y funcional en un segundo tiempo, puesto que una vez ingeridas, pueden llegar al colon y desempeñar ahi la función probiótica mencionada arriba, particularmente a nivel
• de la optimización de la síntesis de ácido propiónico y de la optimización de la asimilación de minerales. 10
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