GEBIET DER ERFINDUNG
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Diese Erfindung betrifft neue Mikroorganismen.
Insbesondere betrifft sie ein Milchsäure verbrauchendes
Pansenbakteriuin, welches insbesondere bei abrupt von Viehfutter auf
konzentriertes (getreidereiches) Futter uingestellten Rindern
eine akute Milchsäureazidose zu verhindern vermag.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Eine intensive Rindfleischproduktion beinhaltet die
Verfütterung eines energiereichen, hochkonzentrierten Futters an
Rinder. Dieses konzentrierte Futter enthält einen hohen
Prozentanteil an Mais, Weizen, Milo oder sonstiger
Stärkekomponenten. Wenn Starterrinder von Viehfutter auf konzentriertes
Futter umgestellt werden, kann es zu akuten
Verdauungsstörungen kommen (C.J. Elam in "J. Anim. Sci." 43, Seiten 898-901
(1976); T.L. Huber in "J. Anim. Sci.", 43, Seiten 902-909
(1976) und B.A. Uhart und F.D. Carroll in "J. Anim. Sci.", 26,
Seiten 1195-1198 (1967)). Diese Verdauungsstörungen sind auf
die rasche und extensive Fermentation des Stärkekorns durch
die Pansenmikrobengemeinschaft zurückzuführen. Dabei entstehen
große Mengen an organischen Säuren einschließlich Milchsäure.
Die Produktion organischer Säuren kann so stark sein, daß das
Gleichgewicht zwischen der Pansensäureproduktion und -nutzung
und der Pansenpufferkapazität zerstört wird. Dieser Zustand
wird als "Azidose" bezeichnet. Eine akute Azidose ist durch
einen raschen pH-Wertabfall und eine scharfe Zunahme im
Milchsäurespiegel im Pansen und im Blut gekennzeichnet (vgl. C.J.
Elam, aaO, L.L. Slyter in "J. Anim. Sci.", 43, Seiten 910-929
(1976) und B.A. Uhart und F.D. Carroll, aaO). Wenn genügend
schwer kann die Überproduktion von Milchsäure und sonstiger
Säuren zu einer Senkung des Pansen-pH-Werts dergestalt
beitragen, daß die normale Mikrobenflora umkippt. Oftmals besteht
das Ergebnis darin, daß lediglich einige wenige
Bakterienarten,
die die Säurebedingungen tolerieren, überleben (vgl.
N. Krogh in "Acta Vet. Scand.", 2, Seiten 102-119 (1961);
R.I. Mackie und F.M.C. Gilchrist in "Appl. Environ.
Microbiol.", 38, Seiten 422-430 (1979) sowie S.O. Mann in
"J. Appl. Bacteriol.", 33, Seiten 403-409 (1970)).
STAND DER TECHNIK
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Zur Steuerung des Problems einer akuten Milchsäureazidose
haben verschiedene Forscher versucht, in den Pansen von abrupt
von niedrig- auf hochkonzentriertes Futter umgestellten
Rindern lebende lactatverbrauchende Bakterien oder
Pansenbakterien aus Tieren, die an getreidereiches Futter gewöhnt sind,
einzubringen (vgl. M.J. Allison und Mitarbeiter in "J. Anim.
Sci.", 23, Seiten 1164-1171 (1964); P.T. Chandler und
Mitarbeiter in "J. Dairy Sci.", 38, Seiten 1660-1665 (1975); M.K.
Cook und Mitarbeiter in "Am. J. Vet. Res.", 38, Seiten 1015-
1017 (1977) und T.L. Huber in "Am. J. Vet. Res.", 35, Seiten
639-641 (1974). Sie sagten vorher, daß die zugesetzten
Bakterien die größeren Mengen an gebildetem Lactat verbrauchen
würden, das Gleichgewicht zwischen Produktion und Verbrauch
aufrechterhalten und dabei das Azidoseproblem abschwächen oder
beseitigen. Allison und Mitarbeiter und Huber (lc) fanden, daß
beim Beimpfen des Pansens eines mit Rauhf utter gefütterten
Tieres mit Pansenfluidum eines an hochkonzentriertes Futter
gewöhnten Tieres bei abrupter Rationumstellung das Problem
einer akuten Azidose gemildert wurde. Die US-PS 4 138 498
beschreibt die Verfütterung von Pansenbakterienkulturen eines an
ein konzentriertes Futter gewöhnten Tieres an ein an
Rauhfutter gewöhntes und dann mit konzentriertem Futter gefüttertes
Tier und beansprucht eine Verminderung oder Beseitigung der
Symptome von Milchsäureazidose. Rinder, die diese Kulturen
erhalten haben, sollten im Vergleich zu Kontrollrinder auch eine
erhöhte Gewichtszunahme und eine gesteigerte Futterumwandlung
zeigen. Die US-PS 3 857 791 beschreibt eine Pansenbeimpfung
mit "angepaßten Pansenmikroorganismen" bzw. einem Gemisch von
Megashpaera elsdenii und Selenomonas ruminantium, zur
Verminderung oder Beseitigung der Symptome von Milchsäureazidose
während der Anpassung der Wiederkäuer an getreidereiche
Rationen.
Darüber hinaus wurde auch berichtet, daß durch die
Einimpf ung von an bestimmte Lebensumstände angepaßten
Pansenmikroorganismen in den Pansen von Milchkühen die
Milchproduktion gesteigert wurde (vgl. Chandler und Mitarbeiter, aaO;
US-PS 3 956 482).
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Trotz der Tatsache, daß diese Literaturstellen diese
Verfahren zur Verhinderung einer Azidose bzw. zur Unterstützung
einer Anpassung von Rindern an hochkonzentriertes Futter
beschreiben, ist bislang auf dem Markt noch kein einschlägiges
Produkt erschienen. Um den geschilderten Schwierigkeiten zu
begegnen, haben wir ein spezifisches, Milchsäure
verbrauchendes Pansenbakterium aus konzentriert gefütterten Rindern zur
Verwendung als Panseninokulum zur Verhinderung einer Azidose
bei abrupt von einer hohen Vierfutterration auf eine
hochkonzentrierte Ration umgestellten Rindern isoliert.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung betrifft eine Bakterienkultur
NRRL B-18624. Das Bakterium ist dadurch gekennzeichnet, daß es
Milchsäure verbraucht, gegen Monensin, Lasalacid,
2-Cleoxyglucose und niedrigen pH-Wert (5,3) resistent ist, Lactat in
Gegenwart sonstiger Zucker ausnutzt und Butyrat produziert.
Die Kultur NRRL B-18624 wird hierin auch als "Isolat 407A"
bzw. als Kultur "UC-12497" bezeichnet.
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Die Erfindung betrifft ferner eine Zubereitung zur
Erleichterung der Anpassung von Wiederkäuern von Rauhf
utteroder normalen Weidegrasrationen an eine hochenergetische
Stärkeration, die im wesentlichen aus der Bakterienkultur NRRL
B-18624 besteht.
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Beschrieben wird ferner ein Verfahren zur Erleichterung
der Anpassung von Wiederkäuern von einer Rauhfutter- oder
normalen Weidegrasration an eine hochenergetische Ration,
umfassen die Verabreichung einer (bestimmten) Menge einer
Bakterienkultur NRRL B-18624 an den betreffenden Wiederkäuer
während der Anpassung.
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Beschrieben wird weiterhin ein Verfahren zur Verhinderung
einer akuten Milchsäureazidose bei wiederkäuenden Tieren,
umfassend die Verabreichung einer zur Verhinderung einer
derartigen
Azidose ausreichenden Menge einer Bakterienkultur NRRL
B-18624 an den betreffenden Wiederkäuer.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Beispiel 1
Isolierung und Anreicherung von Milchsäure verbrauchenden
Pansenbakterien
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Tiere und Futter: Es wurden gekreuzte Hereford X Angus-
Stiere benutzt. Vier Tiere wurden mit einer Ration von 60%
gestoßenem Mais, 30% Silage und 10% B282-Ergänzung (Tabelle 1)
bei einmaliger Erhaltungsdosis pro Tag gefüttert. Drei
gekreuzte Rinder mit Pansenfistel erhielten eine Ration von 90%
B-376 und 10% Heuschnipsel (Tabelle 2) bei einer
Erhaltungsdosis von einmal pro Tag. Die Tiere konnten während der gesamten
Zeit frei (Wasser) trihken.
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Medien: Nach den Verfahren von M.P. Bryant und L.A.
Burkey in "J. Dairy Sci.", 36, Seiten 205-212 (1953) wurde
eine anaerobe Verdünnungslösung (ADS) zubereitet. Die
Beimpfungen und Bakterienübertragungen erfolgten in einem anaeroben
Handschuhkasten (Coy Lab. Products, Ann Arbor, MI; Atmosphäre:
85% N&sub2;, 10% H&sub2; und 5% CO&sub2;, Raumtemperatur). Sämtliche Medien
wurden nach den zuvor von M.P. Bryant in "Am. J. Clin. Nutr.",
25, Seiten 1324-1328 (1972); R.E. Hungate, Academic Press,
New York (1966) beschriebenen Verfahren unter 100% CO&sub2;
zubereitet. Die Medien für die Untersuchung sind in Tabelle 3
aufgelistet. Als L-Medium, jedoch ohne Lactat und mit 0,2 - 0,5%
der folgenden Verbindungen: Glucose, Maltose, Mannit oder
lösliche Stärke (Difco) wurden
Differentialkohlenhydratmediumplatten hergestellt. Im L-Medium wurde in einer Menge von 0,5%
2-Desoxy-D-glucose (2-DG, Grad 11, Sigma) zugesetzt. Ferner
wurde dem L-Medium Monensin oder Lasalocid in einer
Endkonzentration von 6 ppm zugesetzt. Ferner wurde eine Reihe des
Mediums (mit "B" bezeichnet) ohne Pansenflüssigkeit und mit
verschiedenen pH-Werten sowie reduzierende Lösungen (Medien B1,
B2, B3 und B14) zubereitet. Für andere Tests wurde
ultra-geklärte Pansenflüssigkeit zu den B-Medien rückgeführt und mit
B11-R, B12-R und B13-R (Tabelle 3) bezeichnet.
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Sammlung von Pansenflüssigkeit: Für in
vitro-Anreicherungen wurde Pansenflüssigkeit 2 - 5 h nach der Fütterung von
vier Tieren auf B282-Ergänzung gesammelt. Für direkte
Plattenversuche wurde Pansenflüssigkeit 5 h nach der Fütterung von
drei Tieren auf B-376-Ergänzung gesammelt. Sämtliche
Panseninhaltsproben wurden unter einem CO&sub2;-Strom in Flaschen
gesammelt und bis zur Lieferung an das Labor auf Eis aufbewahrt.
Jedes Tier bedeutete eine getrennte Quelle für mögliche
Bakterienisolierungen.
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Anreicherungen und Beschickung von Kulturschalen: Bei den
in vitro-Anreicherungen wurden gleiche Mengen
Pansenflüssigkeit und 2% (g/g) Amylopectin (Sigma A-7780) in ADS unter CO&sub2;
gemischt. 10 ml aliquote Teile jeder der vier zubereiteten
Pansenflüssigkeiten: 1% Amylopectin-Mischungen wurden in 50
ml-Serumflaschen pipettiert und mit geschlitzten Gummistopfen
verschlossen. Durch die Stopfen wurden zur Entspannung von
überschüssigem Druck Bunsenventile eingeführt. Nach
4-stündiger Inkubation bei 38ºC wurde 0,55 ml Flascheninhalt zu 5 ml
B2-Medium zugegeben und 18 h lang inkubiert. Von jeder der
vier Anreicherungen wurden 10fache Verdünnungen hergestellt.
Diese wurden täglich an 3 aufeinanderfolgenden Tagen
auffrisches B2 übertragen. Danach wurden von jeder Quelle 10fache
Reihenverdünnungen in B3-Medium auf 10&supmin;&sup9; durchgeführt. Die
10&supmin;&sup5;- bis 10&supmin;&sup9;-Verdünnungen wurden auf B2-Agarmedium plattiert
(0,1 ml/Platte). Die Platten wurden bei 38ºC 5 Tage lang unter
5 psi CO&sub2; inkubiert.
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Für die direkten Plattenversuche wurden 10fache
Verdünnungen (bis 10&supmin;&sup9;) der von jedem der drei Tiere auf
B-376-Ergänzung gesammelten Pansenflüssigkeit in 814-Medium
hergestellt. Aliquote Teile von 0,1 ml jeder Verdünnungsreihe
(10&supmin;&sup5;- bis 10&supmin;&sup9;) wurden auf 814-Agar plattiert und - wie
beschrieben - inkubiert.
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Isolierungssequenz: Gründlich isolierte repräsentative
Kolonien wurden gepflückt und auf L-Agarplatten in einer
Anordnung entsprechend dem Gitter auf einer aus nichtrostendem
Stahl bestehenden Replikationsvorrichtung getüpfelt. Die
Platten wurden - wie beschrieben - 48 h lang inkubiert. Das auf
den L-Agarplatten Gewachsene diente als "Master"-Platten und
wurde zur Beimpfung der Differentialplatten mit der
Replikationsvorrichtung benutzt.
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Charakterisierung der Isolate: Das Schema für die Wahl
der Milchsäure verbrauchenden Isolate ist in Schema 1
dargestellt. Zunächst wurden die Isolate auf die
Kohlenhydratausnutzung und die Widerstandsfähigkeit gegen 6 ppm Monensin oder
Lasalocid getestet. Die auf dem L-Medium in Gegenwart eines
der beiden Antibiotika nicht wachsenden Isolate wurden
eliminiert. Die in Gegenwart von Monensin oder Lasalocid
gewachsenden Isolate wurden zur Bestimmung einer
Niedrig-pH-Werttoleranz auf Lactat bei einem pH-Wert von 5,3 in B2-Brühe
wachsengelassen. Die nicht wachsenden Isolate wurden eliminiert. Die
in B2-Medium bei einem pH-Wert von 5,3 gewachsenen Isolate
wurden in B2-Brühe auf ihre Fermentationssäureprofile hin
bewertet. Die Wachstumsraten der Isolate wurden in L-Brühe
bestimmt. Schließlich wurden Medien mit niedrigem Lactatgehalt
(0,55 mM; B11-R, B12-R und B13-R) in Gegenwart und Abwesenheit
von 0,2% Glucose oder Maltose eingeimpft, um zu bestimmen, ob
Lactat in Gegenwart dieser beiden Zucker ausgenutzt wird.
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Analytisches: Nach Standardverfahren wurde eine Analyse
flüchtiger Fettsäuren (VFA) durchgeführt. Die
Milchsäurekonzentrationen wurden nach dem Verfahren von S.B. Barker und
W.H. Summerson in "J. Biol. Chem.", 138, Seiten 535-554 (1941)
bestimmt.
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Die Anreicherungs- und direkten Plattiertechniken
lieferten Milchsäure verbrauchende Pansenbakterienisolate. Aus der
Anreicherungsstufe wurde das B2-Medium hinsichtlich solcher
Isolate, die auf Lactat bei einem pH-Wert von 5,3 rasch
wuchsen, selektiert. Der pH-Wert der Flüssigkeit in den in vitro-
Anreicherungsflaschen nach 4-stündiger Inkubation (zu diesem
Zeitpunkt wurden aliquote Teile aus den Flaschenkulturen in B2
überführt) betrug 5,1 bis 5,4.
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Für die direkten Plattenversuche wurden Isolate auf dem
einen niedrigen pH-Wert aufweisenden Medium (814) in Gegenwart
von Monensin und 2-DG wachsengelassen. Dieses Medium wurde auf
solche Lactat-Nutzer selektiert, die gegen 6 ppm Monensin
widerstandsfähig waren und in Gegenwart von 2-DG bei einem pH-
Wert von 5,3 wachsen konnten. 2-DG wurde als selektives Mittel
gewählt, weil es solche Organismen zu hemmen vermag, die
Glucose oder Maltose sowie Milchsäure transportieren (A.H. Romano
und Mitarbeiter in "J. Bacteriol.", 139, Seiten 93-97 (1979);
Thompson in "J. Biochimie", 70, Seiten 325-336 (1988)).
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Insgesamt 142 Kolonien aus den Anreicherungs- und
direkten Plattierisolierungstechniken wurden gepflückt und auf
Differentialkohlenhydratplatten bewertet. Von diesen wurden 14
repräsentative Isolate aus den Anreicherungsreihen und 8 aus
den direkten Plattierreihen entsprechend Schema 1 getestet.
10 der 22 Isolate wurden für weitere Tests aufbewahrt. Die
Substratausnutzungsprofile dieser 10 sind in Tabelle 4
dargestellt. Die Isolate Nr. 252 bis 320 wuchsen auf löslicher
Stärke schlecht. Es wurde Mannit zugegeben, da relativ wenige
Pansenbakterien diesen verstoffwechseln können. Mannit
differenziert zwei wichtige Lactat ausnutzende Pansenarten, nämlich
Megasphaera elsdenii und Selenomonas ruminantium, von Lactat
ausnutzenden Bakterien, die dies nicht tun.
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Von den 6 getesteten Isolaten wuchsen sämtliche mit
Ausnahme von Nr. 298 gut auf Mannit. Sämtliche 10 wuchsen gut auf
Lactatmedium in Gegenwart von Verbindungen (Monensin,
Lasalocid und 2-DG), die andere Bakterien hemmen. Monensin und
Lasalocid wurden als Selektionskriterien mitverwendet, da diese
ionophoren Antibiotika derzeit an Futterlosrinder verfüttert
werden. Die meisten Lactat ausnutzenden Pansenbakterien sind
gegen mindestens 48 ppm dieser Antibiotika resistent (S.M.
Dennis und Mitarbeiter in "J. Anim. Sci.", 52, Seiten 418-426
(1981)).
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Es wurden die Wachstumskurven typischer Isolate in
L-Medium bestimmt. Die spezifischen Wachstumsraten bzw. die
Generationszeiten reichten von 0,187 und 3,71 h für das Isolat Nr.
394 bis 0,644 und 1,08 h für das Isolat Nr. 382 (Tabelle 5).
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Wurden die Isolate auf dem B2-Lactatmedium
wachsengelassen, bestanden die meisten produzierten VFA aus Butter- und
Propionsäuren mit untergeordneten Mengen an Valerian- und
Isovaleriansäuren (Tabelle 6). Die negativen Werte für Acetat und
Isobutyrat belegen deren Ausnutzung. Von sämtlichen Isolaten
mit Ausnahme von Nr. 394 wurden große Mengen an Butyrat
produziert. Von den meisten Isolaten wurden geringe Mengen
Capronsäure
produziert.
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Es wurde der Lactatverbrauch in einen niedrigen
Lactatgehalt aufweisenden Medien (0,55 mM Anfangskonzentration) in
Gegenwart und Abwesenheit von Maltose oder Glucose bestimmt.
Durch die Isolate wurde selbst in Gegenwart eines der beiden
Zucker Lactat ausgenutzt. Die scheinbaren Unterschiede in der
anfänglichen Konzentration von DL-Milchsäure in den
kohlenhydrathaltigen Kulturen waren auf eine Störung des Lactattests
durch die Zucker zurückzuführen. Bei sämtlichen 5 getesteten
Isolaten wurde die anfängliche Milchsäurekonzentration (35
ug/ml) um 60% auf etwa 15 ug/ml nach 24 h vermindert. Die
Isolate fermentierten auch die zugestzte Glucose oder Maltose,
da der Hintergrundabsorptionswert im Laufe der Zeit geringer
wurde.
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Morphologisch handelt es sich bei sämtlichen Isolaten
entweder um große Kokken (1,2 um), einzeln oder in Paaren,
oder Kugelbazillen (1,0 X 3,0 um). Diese Information zusammen
mit der Resistenz gegen Lasalocid und Monensin bei 6 ppm legt
nahe, daß es sich bei den Isolaten um M. elsdenii handelt
(L.V. Holdeman und Mitarbeiter, "Anaerobe Laboratory Manual",
4. Ausgabe, Virginia Polytechnic Institute and State
University, Blacksburg (1977); N.R. Krieg und J.G. Holt,
"Bergey's manual of systematic bacteriology", Band 1,
Williams and Wilkins, Baltimore (1984)).
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Zusammenfassend wurde unter Benutzung von
Anreicherungs- und direkten Plattiertechniken 10 Milchsäure verbrauchende
Pansenbakterien isoliert. Diese Isolate sind gegen Monensin,
Lasalocid, 2-Desoxy-glucose und niedrigen pH-Wert (5,3)
resistent. Die meisten wachsen ebenso gut auf Glucose, Maltose und
Mannit wie auf Lactat, sie fahren jedoch mit der
Lactatausnutzung auch in Gegenwart dieser Zucker fort. Sämtliche Isolate
produzieren Butyrat, ein unerwartetes Ergebnis, da sie
morphologisch Propionat produzierende M. elsdenii zu sein scheinen.
TABELLE 1 - Tierfutter
Bestandteile
% im Futte¹
Gestoßener Mais
Maissilage (Harvestore)
B-282 Proteinergänzung²
¹ Auf Trockengewichtsbasis
² Enthält folgende Bestandteile:
Sojabohnenölmehl, 49%
Alfalfamehl, entwässert, 17%
Melasse, getrocknet
Gelber Talk, stabilisiert
Entfluoriertes Phosphat (CDP), 18% P
Kalkstein, gemahlen
Salz
Spuren Mineralgemisch (CCC, 10% Zn)
Vitamin A, 30 000 IU/g
Vitamin D, 15 000 IU/g
Vitamin E, 20 000 IU/Pfund
Natriumselenit, 0,2 mg/g
TABELLE 2 - Tierfutter
Bestandteile
% als Futter
Heu, gekürzt auf eine Länge von 3"
¹Enthält folgende Bestandteile:
Gewalzter Mais (8,5 wie er ist)
Sojabohnenmehl (48,5% wie es ist)
Fett (tierisch)
Dical (18,5%)
Kalkstein
Salz
Dyna K (Kaliumchlorid)
Selen-Vormischung (0,2%)
Spurenmineralvormischung
Vitamin A (30 000 IU/g)
Vitamin D (15 000 IU/g)
Vitam E (20 000 IU/Pfund)
TABELLE 3 - Medienzusammensetzung
Medium¹
Mineral
Resazaurin
Trypticase (BBL)
Hefeextract (Difco)
VFA-Lösung
Hemin-Lösung
Spuren Mineralien
Vitaminlösung
DL-Lactat-Lösung
Essigsäure
Natriumacetat, wasserfrei
Reduktionsmittel³
Natriumcarbonat, 8%ige Lösung
Ultrageklärte Pansenflüssigkeit
Destilliertes Wasser
TABELLE 3 - Medienzusammensetzung (Fortsetzung)
Medium¹
Cystein
Glucose
Maltose
2-Desoxy-D-glucose
Monensin-Lösung&sup6;
End-pH-Wert
¹Sämtliche Medien wurden unter 100% CO&sub2; zubereitet. Für feste Medien wurde Agar in einer
²DL-Natriumlactat, 60%iger Sirup (Baker): 83,3 g, mit destilliertem Wasser auf 500 ml aufgefüllt,
um eine 10%ige g/v-Lösung herzustellen. Die Endkonzentration in den Medien betrug 0,5% g/v.
³Reduktionsmittel: 2,5% von jeweils Cystein HCL H&sub2;O bzw. Na&sub2;S 9H&sub2;O - zugesetzt nach dem Kochen
des Mediums und vor der Autoklavenbehandlung.
&sup4;DL-Natriumlactat, 60%iger Sirup (Baker): 1,0 ml eingemischt in 332,3 ml destilliertem Wasser
zur Bereitdtellung von 1,8 mg/ml. Die Endkonzentration in den Medien B11-R, B12-R und B-13R
betrug 200um (0,0018%).
&sup5;Pansenflüssigkeit wurde von konzentratgefütterten Stieren 5 h nach dem Füttern gesammelt, einer
Autoklavenbehandlung unterworfen, zentrifugiert und durch ein 0,2 um-Filter filtriert.
&sup6;Monensin-Lösung: Die Endkonzentration im Medium betrug 6 ppm.
TABELLE 4 - Wachstum von Lactat ausnutzenden Isolaten auf verschiedenen Substraten¹
Substrat
Lactat plus
Isolat
Lactat
Glucose
Maltose Mannit
Lösliche Stärke
Monensin
Lasalocid
¹Grad des wachstums auf Agarplatten:
--- = nicht bestimmt, + = sehr schwaches Wachstum, ++ = gute Wachstum,
+++ = starkes Wachstum, ++++ = verschwenderisches Wachstum
²L-Medium ohne Lactat
³Monensin und Lasalocid in einer Konzentration von 6 ppm;
2-DG in einer Konzentration von 0,5%, eingestellt auf einen pH-Wert von 5,8.
TABELLE 5
Bestimmungen der Wachstumsrate
verschiedener Lactat ausnutzender Bakterien¹
Isolat
spezifische Wachstumsrate
Generationszeit
¹In L-Medium gewachsene Isolate
TABELLE 6
Profile flüchtiger Fettsäuren von in B2-Medium¹
gewachsenen, Lactat ausnutzenden Bakterien
Fermentationssäuren (mM)
Isolat
Essigsäure
Propionsäure
Isobuttersäure
Buttersäure
Isovaleriansäure
Valeriansäure
¹Nettoproduktion von Säuren im Vergleich zu
nichtbeimpftem B2-Medium
SCHEMA 1. Selektionsschema für Lactat ausnutzende Bakterien
Repräsentative Kolonien aus einer Anreicherung und
direkten Plattierung
Test auf die Kohlenhydratausnutzung und das
Wachstum auf Lactat in Gegenwart von 6 ppm Monensin oder
Lasalocid
Wiederausstreichen zur Reinigung auf L-Medium
Test auf die Toleranz eines niedrigen pH-Werts
Bestimmung der Fermentationssäuren
nach dem Wachstum auf Lactat
Ausnutzung von 50 ug/ml (0,55 mM) Lactat
in Gegenwart von 0,2% Glucose oder Maltose
(B11-R, B12-R und B13-R)
Aufbewahren der Isolate in B-Medium mit
20% g/v Glycerin bei -153ºC
Beispiel 2
In vitro-Acidosetestsystem zur Bestimmung des
Milchsäureverbrauchs durch Lactat verbrauchende Pansenbakterien
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Dieses Beispiel zeigt die Entwicklung eines in vitro-
Testsystems zur Nachahmung des azidotischen Verfahrens in
Pansen und zur Benutzung desselben zur Selektierung von Stämmen
Milchsäure verbrauchender Pansenbakterien zur Verwendung als
Panseninocula für eine Verhinderung von Azidose in vivo.
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Das in vitro-Testsystem wird wie folgt zusammengefaßt
Von mit Viehfutter gefütterten Tieren gesammelte
Pansenflüssigkeit wird im Verhältnis 50:50 mit 2% (g/v) Amylopectin in
anaerober Verdünnungslösung gemischt und unter Schütteln 12 h
bei 38ºC inkubiert. Die Antwortvariablen, d.h. der pH-Wert und
die Milchsäurekonzentrationen, wurden in stündlichen
Intervallen gemessen. Während der Inkubationsdauer kam es innerhalb
von 6 h zu einem Abfall des pH-Werts des
Pansenflüssigkeitsgemischs auf < 6,0 und einer Ansammlung von Milchsäure auf > 35
mM. Diese Antworten entsprechen den im Pansen von Rindern, die
von Viehfutter auf Futter auf Getreidebasis umgestellt wurden,
beobachteten Ergebnisse. Wir benutzten dieses in vitro-System
zum Testen selektierter Stämme Milchsäure verbrauchender
Pansenbakterien (Beispiel 1) auf ihre Fähigkeit zur Verhinderung
eines Absinkens des pH-Werts und (oder) der Zunahme der
Milchsäure. Kriterien für den Erfolg waren eine Erhaltung des pH-
Werts über 6,0 und eine mindestens 80%ige Reduktion in der
relativ zu nicht beimpften Kontrolltieren produzierten
Milchsäuremenge. Sechs anaerobe, Milchsäure verbrauchende Bakterien,
die zuvor aus den Pansen von mit Getreide gefütterten Rindern
von Beispiel 1 isoliert worden waren, wurden getestet. Vier
Stämme erfüllten die Erfolgskriterien. Diese vier Stämme
wurden im Hinblick auf die Wachstumsrate auf Milchsäure, auf den
Milchsäureverbrauch in Gegenwart von Zuckern und auf die
Empfindlichkeit bezüglich üblicherweise im Futterhof verwendete
Antibiotika weiter verglichen. Während dieses Testschemas
wurden zwei Stämme, Nr. 320 und Nr. 407, selektiert.
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Tiere und Futter: Es wurden gekreuzte Hereford X Angus-
Stiere, die ad libitum eine hohe Viehfutterration (> 70%
Alfalfaheu bzw. Maissilage, auf Trockenbasis) erhielten, verwendet.
Die Panseninhalte wurden durch eine Magensonde
(nicht-fistulierte
Tiere) bzw. eine Pansenfistel gesammelt. Die Tiere
konnten während der gesamten Zeit frei (Wasser) trinken. Für
jeden Versuch wurde die Pansenflüssigkeit von drei Tieren
gesammelt.
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Medien: Amylopectin (Sigma) wurde als 2%ige (g/v)
Suspension in anaerober Verdünnungslösung (ADS, 5) zubereitet.
Stämme Milchsäure verbrauchender Bakterien wurden auf
B1-Medium mit 0,5% (g/v) Natrium(DL-)lactat gehalten. Die
Bakterienbeimpfungen und -übertragungen erfolgten in einem
anaeroben Handschuhkasten (Coy Lab. Products, Ann Arbor, MI;
Atmosphäre: 85% N&sub2;, 10% H&sub2; und 5% CO&sub2;, Umgebungstemperatur).
Sämtliche Medien wurden nach den zuvor beschriebenen Verfahren
(Beispiel 1) unter 100% CO&sub2; hergestellt.
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Verfahren des in vitro-Azidosetests: Panseninhaltproben
wurden 1,5 h nach der Fütterung unter einem CO&sub2;-Strom in
Flaschen gesammelt und bis zur Lieferung an das Labor auf Eis
aufbewahrt. Die Pansenproben wurden durch ein 2 mm Nylonnetz
gepreßt, in gleichen Gewichtsmengen gepoolt und 20 min lang
auf Eis gekühlt. Nach Zugabe wurden 400 ml B1-Brühekultur der
Teststämme der Milchsäure verbrauchenden Bakterien bis zur
mid-log-Phase wachsengelassen, durch anaerobes Zentrifugieren
geerntet und zur Verwendung als Beimpfungsmittel in 14 ml ADS
resuspendiert. Unter einem CO&sub2;-Strom wurden 10 ml gepoolte
Pansenflüssigkeit und 0,5 ml Bakterienbeimpfungsmittel (bzw.
0,5 ml ADS) in 60 ml Serumflaschen gefüllt. Letztere wurden
mit grauen Stopfen verschlossen und auf Eis gekühlt. 22
Flaschen wurden für jeden getesteten Stamm (Kontrollstamm bzw.
Behandlungsstamm) gefüllt. Nachdem die letzte Flasche gefüllt
war, wurden sämtliche Flaschen mit Bunsenventilen versehen und
in einen Drehrüttelinkubator (New Brunswick, 160 Umin&supmin;¹) bei
38ºC gestellt. Die Flaschen wurden 20 min lang in einen
Gleichgewichtszustand übergehen gelassen, dann wurden 2
Flaschen für jede Behandlung bei 0, 2 und danach in stündlichen
Intervallen für 12 h gesammelt.
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Wachstumsbestimmungen: Die Wachstumsraten selektierter
Stämme wurden auf Bls-Brühemedium verglichen. B15 bestand aus
einer Modifizierung des zuvor beschriebenen (Beispiel 1)
Grundmediums (B) und enthielt zusätzlich (Prozentanteil im
fertigen Medium) Natriumlactat (99,5 + % L-Lactat, Baker,
0,18%), Glucose (0,2%) und Maltose (0,2%). Die optischen
Dichtewerte wurden bei 650 nm in einem
Perkin-Elmer-Spektralphotometer (Modell 55) bei einer Weglänge von 18 mm gemessen.
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Analytik: Der pH-Wert wurde nach Übertragung des
Flascheninhalts in ein Kunststoffzentrifugenröhrchen und
Eintauchen einer Standardkombinations-pH-Elektrode ermittelt. Danach
wurden die Proben bei -20ºC für eine spätere Analyse der
Fermentationssäuren eingefroren. Die Milchsäurekonzentrationen
wurden nach den Verfahren von S.B. Barker und W.H. Summerson
(lc) oder einer Modifizierung derselben bestimmt. Soweit nicht
anders angegeben wurden beide Milchsäureformen, nämlich die
D(-)- und L(+)-Formen, bestimmt. Hinweise auf Milchsäure
beziehen sich hierin auf die gesamten D(-)- und L(+)-Formen. Die
flüchtigen Fettsäuren wurden - wie zuvor in Beispiel 1
beschrieben - analysiert.
-
Antibiotikumanfälligkeit: Nach den NCCLS-Richtlinien
(National Committee for Clinical Laboratory Standards,
Approved standard M11-A: Referenzagarverdünnungsverfahren für
das Austesten anaerober Bakterien auf ihre antimikrobielle
Anfälligkeit, National Committee for Clinical Laboratory
Standards, Villanova, PA (1985)) wurden die
Mindesthemmkonzentrationen (MIC) selektierter Antibiotika bestimmt. Die Bestimmung
erfolgt auf Wilkins-Chalgren-Agarmedium (Difco) mit 1% (v/v)
Reduktionsmittel (2,5% L-Cysteinhydrochlorid/2,5%
Natriumsulfid, g/v). Es wurden folgende Antibiotika getestet: Naxcel\
(The Upjohn Co.), Oxytetracycline (P-L Biochemicals),
Erythromycin (Sigma), Penicillin G (Sigma), Lincomycin (Hydrochlorid,
The Upjohn Co.), Tylosin (Tartrat, Sigma), Rifampin (Sigma),
Thiopeptin (Fugisawa), Thiostrepton (Sigma) und
Chlortetracyclin (ICN Nutritional Biochemicals). Naxcel\, Penicillin G,
Lincomycin und Tylosin wurden in Wasser gelöst. Sämtliche
anderen wurden in DMSO gelöst. Die Antibiotikakonzentrationen
betrugen 0,25 bis 128 ug/ml (bzw. Einheiten/ml) unter
Korrektur auf die angegebene Reinheit für jedes Mittel. Wenn keine
Information verfügbar war, wurde die Reinheit mit 100%
angesetzt. Bei der MIC-Bestimmung wurden drei Stämme anaerober
Bakterien als positive Kontrollen (bekannte MIC-Werte für die
benutzten Antibiotika) mitgetestet. Bei diesen Bakterien
handelte es sich um Bacteroides fragilis ATCC 25285, Bacteroides
thetaiotaomicron ATCC 29741 und Clostridium perfringens ATCC
13124.
-
Die Abnahme im pH-Wert auf unter 6,0 und die Zunahme der
Milchsäurekonzentration auf über 35 mM war zwischen
Replikatflaschen und zwischen Experimenten reproduzierbar. Vorherige
Bewertungen von Kandidatenstämmen von Milchsäure
verbrauchenden Pansenbakterien wurden mit den "besten" 6 Stämmen
Milchsäure verbrauchender Bakterien (identifiziert durch das
Selektionsschema in Beispiel 1) durchgeführt.
-
Für den Versuch Nr. 8 wurde Pansenflüssigkeit von
sämtlichen mit Weidegras gefütterten Tieren gesammelt. Die
Teststämme Nr. 310, Nr. 320 und Nr. 382 wurden gegen ADS-beimpfte
Kontrollflaschen verglichen. Der pH-Wert der Kontrollflaschen
des inkubierenden Pansenflüssigkeit-Amylopectin-Gemischs sank
nach 3 h von seinem Anfangswert von 6,7 auf 5,8 nach 6 h.
Danach blieb der pH-Wert unter 6,0. Gleichzeitig stieg die
Milchsäurekonzentration in den Kontrollflaschen vom
Nachweiswert (etwa 0,5 mM) auf 39 mM nach 6 h. Die Konzentration der
Milchsäure sank nach 6 h auf 24 mM nach 12 h. In den mit
irgendeinem der drei Teststämme beimpften Flaschen blieb der
pH-Wert des inkubierenden Gemischs über 6,0. Die Konzentration
an Milchsäure stieg niemals über 7 mM (4 - 5 h). Sämtliche
gebildete Milchsäure wurde von den Isolaten innerhalb von 3 h
verbraucht.
-
Es wurden auch die während der Inkubationszeit gebildeten
Fermentationssäuren bestimmt. Nach 6 h war eine Plateaubildung
der Fermentationssäureansammlung feststellbar, die Vergleiche
erfolgten nach 12 h. Die gesamten Säurekonzentrationen nach
12 h betrugen in den Kontrollflaschen 468 mM, für die Stämme
Nr. 310, Nr. 320 bzw. Nr. 382 542, 511 bzw. 526 mM. In den
nicht beimpften Kontrollflaschen waren Acetat, Propionat,
Butyrat und Valerat in Mengen von 59, 24, 15 bzw. 2 Mol-%
enthalten. Bei Zusatz der Teststämme änderten sich diese
Molprozente auf (durchschnittlich) 50, 17, 26 bzw. 7%.
Sämtliche Teststämme lieferten ähnliche Fermentationssäureprofile.
Im Durchschnitt wurden in Flaschen mit zugesetzten Teststämmen
58 mM mehr Gesamtsäuren produziert als in den
Kontrollflaschen. Die Milchsäure in den Kontrollflaschen umfaßte einen
Teil dieses Unterschieds (nach 12 h), obwohl wahrscheinlich
die Fermentation in den Kontrollflaschen in ihrem Ausmaß durch
den niedrigen pH-Wert nach 6 h begrenzt war.
-
Pansenflüssigkeit für den nächsten Versuch wurde von
sämtlichen mit Weidegras gefütterten Tieren gesammelt. Die
Teststämme Nr. 394, Nr. 407 bzw. Nr. 414 wurden gegen ADS-
beimpfte Kontrollflaschen verglichen. Der pH-Wert der
Kontrollflaschen sank nach 4 h von seinem Anfangswert von 6,8 auf
5,7 nach 6 h. Wie bei dem vorhergehenden Versuch blieb der pH-
Wert danach unter 6,0. Bei diesem Versuch hielten die
Teststämme Nr. 407 und Nr. 414 den pH-Wert über 6,0, der Stamm Nr.
394 tat dies nicht. 4 h nach der Inkubation begann sich in den
Flaschen Milchsäure anzusammeln. Die Konzentration der
Milchsäure in den Kontrollflaschen stieg von der Nachweisgrenze auf
45 mM nach 6 h. Nach 6 h blieb die
Kontrollflaschenmilchsäurekonzentration bei etwa 45 mM bis 12 h, danach erhöhte sich die
Konzentration auf 66 mM. Bei Zusatz der Stämme Nr. 407 und Nr.
414 sammelte sich Milchsäure innerhalb von 6 h auf 15 mM an
und wurde dann innerhalb 1 h auf die Nachweisgrenze
verbraucht. Bei Zusatz des Stamms Nr. 394 sammelte sich jedoch
die Milchsäure nach 6 h auf 36 mM an und sank nur schrittweise
auf 12 mM nach 12 h.
-
Bei diesem zweiten Versuch waren die Fermentationssäuren
stärker variabel; nach 6 h war anders als bei dem ersten
Versuch keine Plateaubildung einzelner Säurekonzentrationen
feststellbar. Die gesamten Säurekonzentrationen nach 12 h betrugen
476 mm in den Kontrollflaschen bzw. 513, 561 und 579 mM für
die Stämme Nr. 394, Nr. 407 und Nr. 414. In den
Kontrollflaschen waren Acetat, Propionat, Butyrat und Valerat in Mengen
von 63, 26, 9 bzw. 1 Mol-% vorhanden. Bei Zusatz des
Teststamms Nr. 394 betrugen dies molaren Prozentanteile 62, 17, 11
bzw. 10%. Bei Zusatz der Stämme Nr. 407 und Nr. 414 betrugen
diese molprozentualen Mengen 45, 15, 30 bzw. 10%. Im
Durchschnitt entstanden in den Flaschen mit zugesetzten Teststämmen
im Vergleich zu den Kontrollflaschen 75 mM mehr an
Gesamtsäuren. Wurde der Stamm Nr. 394 weggelassen, lieferten die
Stämme Nr. 407 und Nr. 414 jeweils durchschnittlich 94 mM mehr
an Gesamtsäuren als die Fermentationen in der
Vergleichsflasche. Wie zuvor umfaßte die Milchsäurekonzentration in den
Kontrollflaschen einen Teil dieses Unterschieds, obwohl es
wahrscheinlich ist, daß die Fermentationen in der
Kontrollflasche durch den niedrigen pH-Wert begrenzt waren.
-
Keiner der in diesem in vitro-Inkubationssystem
getesteten sechs Stämme produzierte Propionat, das bevorzugte
Fermentationsprodukt (basierend auf einer positiven Korrelation mit
einer verbesserten Tierleistung) als hauptsächliche
Fermentationssäure. Sämtliche schienen große Mengen an Butyrat bei um
30% abnehmendem molprozentualem Anteil an Acetat und Propionat
zu produzieren. In gleicher Weise erhöhte die Anwesenheit der
zugesetzten Teststämme die molprozentualen Anteile an Butyrat
und Valerat um das 2- bis 3-fache bzw. 3- bis 10-fache. Diese
Daten stimmen mit den durch die Teststämme in Reinkultur
(Beispiel 1) produzierten Fermentationssäuren überein.
-
Fünf der sechs Teststämme hielten den pH-Wert des
Flascheninhalts über 6,0. Ein solcher pH-Wert ist für die
Kontinuität einer ausgeglichenen Pansenfermentation von Vorteil.
Die Kontinuität der Fermentation unter diesen Bedingungen
wurde durch die höheren Gesamtsäurekonzentrationen in den
Flaschen mit den Teststämmen im Vergleich zu den Kontrollflaschen
(mit Milchsäure) gestützt.
-
Wichtiger ist jedoch, daß die durch die angeborenen
Pansenbakterien auf dem zugesetzten Amylopectin (Stärkesubstrat)
produzierte Milchsäure von 5 der 6 zugesetzten Teststämme
Milchsäure verbrauchender Bakterien verbraucht wurde. Wir
wählten die besten Stämme für die zwei Versuche zur weiteren
Bewertung. Bei diesen Stämmen handelt es sich um die Nummern
320, 382, 407 und 414.
-
Diese 4 Stämme wurden auf ihre Fähigkeit zum Verbrauch
von Milchsäure in Gegenwart von Glucose und Maltose (Medium
B15) hin getestet. Ein Vergleich ihrer Wachstumskurven und
Verbrauchsrate von Lactat und Glucose zeigten, daß sämtliche
Stämme mit gleicher oder höherer Rate wuchsen als andere
Pansenbakterien. Die Generations-(Verdoppelungs-)Seiten in B15-
Medium waren 0,93, 1,21, 0,87 bzw. 1,56 h für die Stämme Nr.
320, Nr. 382, Nr. 407 bzw. Nr. 414. Sämtliche 4 Stämme besaßen
die Fähigkeit zur gemeinsamen Verstoffwechselung von Lactat
und Glucose (die Maltosekonzentrationen im Medium waren zu
niedrig, um eine Interpretation zu erlauben), obwohl die
Stämme Nr. 320 und Nr. 407 beide die Substrate rascher
ausnutzten. Somit waren die Stämme Nr. 320 und Nr. 407 mit
Verdoppelungszeiten von 1 h oder weniger "besser" als die Stämme
Nr. 382 und Nr. 414. Deren raschere Wachstumsraten könnten sie
dazu befähigen, im Pansen besser zu konkurrieren.
-
Mit einer Antibiotikumreihe (Tabelle 7) wurden die
Mindesthemmkonzentrationen für die 4 selektierten Stämme
bestimmt. Die MIC-Ergebnisse lassen sich innerhalb von ± zwei 2-
fachen Verdünnungen als "dieselben" interpretieren. Daten für
die Kontrollmikroorganismen stimmten mit deren bekanten MIC-
Werten überein. Wir fanden Stammunterschiede für Naxcel,
Erythromycin, Penicillin G, Lincomycin und Tylosin. Sämtliche 4
Teststämme waren in gleicher Weise gegen Rifampin empfindlich
und tolerierten Oxytetracycline, Thiopeptin und Thiostrepton
(Tabelle 7). Der Stamm Nr. 414 war gegen Tylosin, einen
üblichen Rinderfutterzusatz, am tolerantesten. Der Stamm Nr. 320
war gegen Lincomycin, einen üblichen Schweinefutterzusatz, am
empfindlichsten.
-
Für eine weitere Bewertung als mögliches Mittel zur
Verhinderung einer akuten Azidose wählten wir die Stämme Nr. 320
und Nr. 407, und zwar aufgrund der Ergebnisse der in vitro-
Milchsäureazidosetests, Stammwachstumsraten und der MIC-Daten.
-
Verfahren zur Verabreichung mikrobieller Kulturen an
Tiere sind auf dem einschlägigen Fachgebiet bekannt (vgl.
beispielsweise US-PS 4 138 498, auf die hierin Bezug genommen
wird).
TABELLE 7
Mindesthemmkonzentrationen (ug/ml) ausgewählter Antibiotika¹
Referenzstämme
Milchsäure ausnutzende Teststämme
Antibiotikum
B. Fragilis
B. theta
Naxcel
Oxytetracycline
Erythromycin
Penicillin G
Lincomycin
Tylosin
Rifampin
Thiopeptin
Thiostrepton
Chlortetracycline
¹Verfahren wie bei (17). Penicillin in Einheiten/ml
Beispiel 3
Charakterisierung und mutmaßliche Identifizierung des Lactat
ausnutzenden Pansenbakteriums 407A
-
Nach veröffentlichten Richtlinien wurden das Lactat
ausnutzende Pansenbakterienisolat 407A (NRRL B-18624; UC-12497)
und zwei Stämme von Megasphaera elsdenii (Stämme B159 und ATCC
25940) charakterisiert. Das Isolat 407A war dem M. elsdenii-
Stamm B159 und dem Typenstamm ATCC 25940 darin ähnlich, daß es
aus einem großen, nicht-beweglichen, gram-negativen und
Isobuttersäure, Buttersäure, Isovaleriansäure, Valeriansäure und
Capronsäure produzierenden Kokkus bestand. Von sämtlichen drei
Bakterien wurde aufgrund des Lactatstoffwechsels Wasserstoff
produziert. Sämtliche wuchsen bei einem pH-Wert von 5,4 auf
Lactat, lediglich das Isolat 407A wuchs auf Lactat bei einem
pH-Wert von 5,0 in Gegenwart von 6 ppm Monensin. Sämtliche
wandelten Threonin in Propionat um, waren Indol-negativ,
reduzierten Nitrat nicht und hydrolysierten Stärke nicht. Das
Isolat 407A wurde durch Galle gehemmt, während dies bei 25940 und
B159 nicht der Fall war. Der Stamm B159 produzierte in
Glucose, Maltose oder Mannit enthaltenden Medien Säure, während
dies 407A nicht tat. Der Typenstamm 25940 produzierte aus
Maltose und Mannit lediglich eine schwache Säure. Die für das
Isolat 407A erhaltenen Ergebnisse belegen, daß es den
Beschreibungen von M. elsdenii ähnlich ist. Das Wachstum von
407A in lactathaltigen Medien bei einem pH-Wert von 5,0 in
Gegenwart von Monensin kann jedoch dazu veranlassen, dieses
Bakterium in eine andere taxonomische Gruppe einzuordnen als
M. elsdenii.
-
Bakterien und deren Züchtung: Der Stamm 407A (UC-12497)
wurde gemäß Beispielen 1 und 2 isoliert und unter flüssigem
Stickstoff aufbewahrt. Der Typenstamm von Megasphaera
elsdenii, Stamm Nr. 25940, wurde von der American Type Culture
Collection, Rockville, MD, erhalten und ursprünglich aus dem
Pansen eines Schafs isoliert. Der Stamm B159 wurde von der
Kultursammlung von Dr. M.P. Bryant, Universität von Illinois,
erhalten und ursprünglich aus einem Schafpansen isoliert.
Sämtliche Stämme wurden routinemäßig auf B18c-Medium (Tabelle
8) bei 38ºC unter CO&sub2;-Kopfraum gezüchtet.
-
Testmedien: Handelsübliche Präparate an anaeroben
Pepton/Hefeextrakt-Fermentationsmedien entsprechend den
Rezepturen und Methoden von "Virginia Polytechnic Institute (V.P.I.)
Anaerobe Laboratory manual", L.V. Holdeman, E.P. Cato und
W.E.C. Moore (Herausgeber), Anaerobe laboratory manual,
4.Ausgabe, Virginia Polytechnic Institute and State University,
Blacksburg, wurden von Carr-Scarborough Microbiologicals, Inc.
(Stone Mountain, GA) erworben. Ferner wurden einen niedrigen
pH-Wert aufweisende, lactathaltige Medien ohne und mit 0,5%
2-Desoxy-D-glucose bzw. 6 ppm Monensin hergestellt und mit
B20, B21 bzw. B22 (Tabelle 8) bezeichnet. Die endgültigen
pH-Werte der B20-, B21- und B22-Medien betrugen 5,43, 5,65
bzw. 5,04.
-
Maßnahmen: Junge (7 h) Kulturen, die in B18c gewachsen
waren, dienten zur Bestimmung der Gram-Färbung und zum
Beimpfen eines Hackfleisch/Kohlenhydrat(CMC)-Mediums (Carr-
Scarborough Microbiologicals, Inc.). Die CMC-Kulturen wurden
über Nacht (17 h) inkubiert und dann zum Beimpfen der
Testmedienröhrchen (4 Tropfen/Röhrchen) und von B18c-Agarplatten
verwendet. Die Röhrchen wurden - um den V.P.I.-Vorschriften
(vgl. L.V. Holdeman und Mitarbeiter, aaO) zu genügen - unter
CO&sub2; beimpft. Die Stopfen wurden unter einem Strom eines
anaerob reinen CO&sub2; entfernt, worauf die Röhrchen beimpft und
wieder verschlossen wurden. Nachdem die Röhrchen statisch und
aufrecht 46 - 47 h bei 38ºC inkubiert worden waren, wurden sie
geöffnet. Danach wurden der pH-Wert der Inhalte gemessen und
geeignete biochemische Tests durchgeführt (Tabelle 9).
-
Analytik: Die Messung des pH-Werts erfolgte mit einem pH-
Meter (Corning Modell 12), mit einer
Corning-Halbmikrokombinationselektrode (Modell 476541). PY-Lactatkulturen wurden auf
D(-)- und L(+)-Milchsäure hin getestet. PY-Basal-, Lactat-,
Glucose- und Threonin-Kulturen wurden mittels
Flammenionisationsgaschromatographie auf den Gehalt an flüchtigen
Fettsäuren hin analysiert. Die Wasserstoffmessung erfolgte mit einem
Gaschromatographen mit einem Wärmeleitfähigkeitsdetektor unter
ähnlichen Bedingungen, wie sie von D.R. Nelson und J.G. Zeikus
in "Appl. Environ. Micro.", 28, Seiten 258-261 (1974)
beschrieben wurden.
-
Die zur Identifizierung von 407A gewählten biochemischen
Tests basieren auf dem Schlüssel für anaerobe Bakterienarten
entsprechend der Beschreibung in dem V.P.I.-Manual (vgl. L.V.
Holdeman und Mitarbeiter, aaO). Der Schlüssel in dem Handbuch
deutet an, daß der Stamm 407A wahrscheinlich aus der
Megasphaera-Art ist, da es sich dabei um einen großen,
gram-negativen und Isobuttersäure, Buttersäure, Isovaleriansäure,
Valeriansäure und Capronsäure produzierenden Kokkus handelt.
Folglich wurden diejenigen Tests durchgeführt, die eine
ausreichende Differenzierung von Megasphaera von sämtlichen anderen
charakterisierten anaeroben Kokken gestatten. Darüber hinaus
wußten wir, daß das Isolat 407A in den einen niedrigen pH-Wert
aufweisenden, lactathaltigen Medien (B20, B21 und B22) wachsen
würde. Wir testeten diese Medien, um herauszufinden, ob sie
auf die M. elsdenii-Stämme 25940 und B159 hemmend sind.
-
Die zur Charakterisierung der Baktien benutzten
Ergebnisse der biochemischen Tests und VFA-Analysen sind in Tabelle
9 zusammengestellt. Eine Prüfung der drei Stämme mittels
Phasenkontrastmikroskopie zeigte große (ca. 2,3 um Durchmesser)
Zellen, die einzeln, in Paaren oder in kurzen Ketten vorkamen.
In älteren Kulturen waren im allgemeinen mehr Ketten
feststellbar. Sämtliche drei Bakterien färbten gram-negativ. Die
Oberflächenkolonienmorphologien nach 2-tägiger Inkubation
waren für die drei Stämme ähnlich. Sie waren von einem
Durchmesser von 2 - 3 mm, kreisförmig und vollständig, lederfarben und
besaßen eine butterartige Konsistenz.
-
Sämtliche Bakterien vermochten, wenn Cellobiose, Esculin,
Lactose, Stärke, Saccharose und Xylose die Kohlenstoffquellen
in den Testmedien bildeten, keine Säure zu produzieren.
Catalase war nicht nachweisbar. Esculin wurde nicht hydrolysiert.
Sämtliche Bakterien waren obligat anaerob. Keine der Bakterien
verdaute Fleisch, reduzierte Nitrat, hydrolysierte Stärke,
produzierte Indol oder war beweglich. B159 produzierte in
Glucose, Maltose und Mannit mehr Säure als 407A und 25940. Galle
hemmte das Wachstum von 407A, jedoch nicht dasjenige der
anderen beiden Stämme. Sämtliche wuchsen gut auf Lactat bei
einem pH-Wert von 5,3 - 5,7 in Gegenwart oder Abwesenheit von
2-Desoxy-D-glucose. Lediglich 407A wuchs bei einem pH-Wert von
5,0 in Gegenwart von 6 ppm Monensin. Threonin wurde durch
sämtliche drei Bakterien in Propionat umgewandelt. Durch
sämtliche drei Bakterien wurde Wasserstoff in Mengen von 6,2, 12,9
bzw. 26,7% von 407A, 25940 bzw. B159 produziert. Die
VFA-Profile waren für sämtliche auf den Basal-, Lactat-,
Glucoseund Threoninmedien gewachsenen Mikroorganismen ähnlich. Bei
den drei getesteten Bakterien war Butyrat das
Hauptfermentationsendprodukt. Dies stimmt mit den von anderen Autoren für
M. elsdenii berichteten Daten überein.
-
Die für den Stamm 407A einzigartigen Tests waren
-
1) Fehlen einer Säureproduktion aus Glucose, Maltose und
Mannit,
-
2) schlechteres Wachstum in Gegenwart von Galle und
-
3) Wachstum in lactathaltigem Medium bei einem pH-Wert von 5,0
in Gegenwart von 6 ppm Monensin (Tabelle 9).
-
Die Säureproduktion (oder deren Fehlen) aus Kohlenhydraten
durch ein Bakterium ist eines der Schlüsselmerkmale für seine
Identifizierung. Lediglich die für B159 durchgeführten Tests
stimmten vollständig mit den Ergebnissen im V.P.I.-Handbuch
überein. Der Typenstamm 25940 stimmte nicht vollständig
überein, da Glucose negativ war und Maltose und Mannit lediglich
Zwischenmengen an Azidität ("schwache Azidität", Tabelle 9)
produzierten.
-
Lediglich zwei andere Arten anaerober Kokken, Veillonella
und Acidaminococcus, sind gram-negativ. Das Isolat 407A
unterscheidet sich von Veillonella wegen seiner weit stärkeren
Produktion von Isobutter-, Butter-, Isovalerian- und Capronsäuren
und wegen seiner Fähigkeit zur Umwandlung von Threonin zu
Prpionat. Es unterscheidet sich von Acidaminococcus, da
letztere kleiner ist, kein Caproat produziert und Lactat nicht
ausnutzt. Somit sind die Kennwerte des Isolats 407A eher mit
der Taxonomie von M. elsdenii vergleichbar, da es aber bei
einem pH-Wert von 5,0 in Gegenwart von Monensin gut wachsen
kann, kann 407A eine neue Art oder Unterart der Gattung
Megasphaera sein.
-
Die phylogenetische Beziehung von Megasphaera zu anderen
anaeroben Kokken ist kaum bekannt (G.B. Hill (1981), "The
anaerobic cocci", Seiten 1631-1650, In M.P. Starr, H. Stolp,
H.G. Truper, A. Balows und H.G. Schlegel (Herausgeber), "The
Prokaryotes: a handbook on habitats, isolation, and
identification of bacteria", Springer-Verlag, New York; M.
Rogosa, "Anaerobic gram-negative cocci", Seiten 680-685. In
N.R. Kreig und J.G. Holt (Herausgeber) "Bergey's manual of
systematic bacteriology", Band 1, The Williams & Wilkins Co.,
Baltimore (1984)). Bis heute ist lediglich eine Art von
Megasphaera, nämlich M. elsdenii, bekannt. Obwohl es einige
Diskrepanzen zwischen den Ergebnissen unserer Tests und den
jenigen des V.P.I.-Handbuchs gibt, kann es hierfür noch nicht
ausreichend Belege geben, um sagen zu können, daß 407A etwas
anderes ist als ein neuer Stamm von M. elsdenii. Die
Identifizierung des Isolats 407A auf der Basis der in dieser Studie
durchgeführten biochemischen Tests sollte jedoch als
präsumptiv angesehen werden.
TABELLE 8
Vergleich von B18c-, B20-, B21- und B22-Medien
Menge pro Liter
Natriumlactat, 60%iger Sirupa
Mineral
Resazurin (0,1%ige Lösung)
Trypticase (BBL)
Pepton (Bacto, Difco)
Hefeextrakt (Difco)
Destilliertes Wasser
Kochen unter CO&sub2;, Abkühlen, dann Zugabe:
Cystein HCL H&sub2;O
Natriumcarbonat (8% g/v, hergestellt unter CO&sub2;)
Essigsäure
Natriumacetat (wasserfrei)
20-minütige Äutoklavenbehandlung bei 121ºC
2-Desoxy-D-glucose
Monensin-Lösungf
aNatriumlactat: Sigma Nr. L-1375 - mit etwa gleichen Mengen D(-)- und L(+)-Isomeren
bmineral 1:6 g K&sub2;HPO&sub4; pro Liter destilliertes Wasser
cMineral 2:6 g KH&sub2;PO&sub4;; 6 g (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;; 12 g NaCl; 2,45 g MgSO&sub4; 7H&sub2;O und 1,59 g
CaCl&sub2;-2H&sub2;O pro Liter destilliertes Wasser
dDer pH-Wert des Mediums wird vor der Autoklavenbehandlung auf 5,2 eingestellt
eHergestellt in einem anaeroben Handschuhkasten mit von Sauerstoff befreitem
Wasser und dann aseptisch zu sterilem, jedoch gekühltem Medium unter Filtration
zugegeben.
f32,4 mg Monensinnatrium (Sigma M-2513) werden zu 50 ml 200 proof Ethanol
zugegeben. Nach dem Mischen wird die filtrationssterilisierte Lösung zu sterilem
Medium zugegeben. Die Endkonzentrationen an Monensin betragen 6 ppm.
TABELLE 9
Tests und Verfahren zur Charakterisierung des Bakterienisolats
407A und von Megasphaera elsdenii, Stämme 25940 und B159a
Test
Medienb
Maßnahmen und Interpretation
pH-Wert
Galle
Catalase
Esculin-Hydrolyse
aerobes Wachstum
Basal (PY) +:
Cellobiose
Esculin
Glucose
Lactose
Maltose
Mannit
Stärke
Saccharose
Xylose
Glucose + Galle
Hackfleisch
Esculin
B18c-Agar
Ausmessen der 48 h-Kultur mit
einer pH-Elektrode - wenn der
pH-Wert > 6,0 ist, ist die
Bewertung negativ (-), wenn der pH-Wert
5,5 bis 6,0 ist, ist die
Bewertung "schwache Säure" (w),
wenn der pH-Wert < 5,5 ist, ist die
Bewertung "starke Säure" (a).
Wachstumsvergleich zu PY-Glucose - bewertet
als "gehemmt" (kein Wachstum),
Wachstum (+ bis ++++) oder
stimuliert (Wachstum besser als in
PY-Glucose).
0,5 ml-Kultur wird in ein kleines
Röhrchen eingetragen - 0,5 ml 3%
H&sub2;O&sub2; wird zugegeben - kontinuierliche Blasen = +
Zugabe von 3 Tropfen 1% Eisen(III)-Ammoniumcitrat - Schwarzfärbung = +
Bestreichen von Platten mit einer
Übernachtkultur, aerobe Inkubation,
Wachstumsprüfung, 48 h
aDie meisten Tests und Maßnahmen sind in dem V.P.I.-Anaerobier-Laborhandbuch
(5) beschrieben.
bVorreduzierte, anaerob sterilisierte Medien - vgl. Anhang zu Rezeptur.
TABELLE 9 (Fortsetzung)
Tests und Verfahren zur Charakterisierung des Bakterienisolats
407A und von Megasphaera elsdenii, Stämme 25940 und B159a
Test
Medienb
Maßnahmen und Interpretation
Wachstum auf
Lactat bei einem
pH-Wert von 5,4
Wachstum auf
Lactat bei einem
pH-Wert von 5,6
in Gegenwart von
2-DG
Wachstum auf
Lactat bie einem
pH-Wert von 5,0
in Gegenwart von
6 ppm Monensin
Wasserstoffproduktion auf Lactat
Indol
Lactatausnutzung
Fleischverdauung
Beweglichkeit
Indolnitrat
Lactat
Hackfleisch
Bewertet als "gehemmt"
(kein Wachstum) oder Wachstum (+ bis ++++)
Bestimmung von % H&sub2; im Kopfraum
2 ml Kultur + 1 ml Xylol,
Vermischen, 2 min Stehenlassen. Langsame Zugabe von
0,5 ml Erlich's Reagenz.
Rosa Färbung = positiv,
gelb = negativ.
Bestimmung des Gesamtlactats
- Vergleich mit unbeimpftem
PY-Lactat und in PY-Basal-Lactat - Lactatabnahme =
Ausnutzung (+).
Zerfall von Fleischteilchen = positive Reaktion. 14- bis
21-tägige Inkubation.
Betrachtung einer 4 - 6 h
alten Kultur mittels Phasenkontrastmikroskopie.
aDie meisten Tests und Maßnahmen sind in dem V.P.I.-Anaerobier-Laborhandbuch
(5) beschrieben.
bVorreduzierte, anaerob sterilisierte Medien - vgl. Anhang zu Rezeptur.
TABELLE 9 (Fortsetzung)
Tests und Verfahren zur Charakterisierung des Bakterienisolats
407A und von Megasphaera elsdenii, Stämme 25940 und B159a
Test
Medienb
Maßnahmen und Interpretation
Nitratreduktion
Stärkehydrolyse
VFA-Profile von:
Indolnitrat
Stärke
PY-Basal
Glucose
Lactat
Threonin
Zugabe von 1 ml Nitratreagenz A
und 0,5 ml Nitratreagenz B zu
der Kultur. Rot = positiv
(Nitrit ist vorhanden). Bei
fehlender Rotfärbung wird Zn-Staub
zugesetzt - Rotfärbung =
negativ, keine Färbung = vollständige
Reduktion.
Zugabe von 2 oder 3 Tropfen
Gram-Jod zu der Kultur. Sofortige
Betrachtung.
Schwarz = keine Hydrolyse.
Gaschromatographie - Vergleich
der Ergebnisse mit unbeimpften
Medien - wenn Säuren in Mengen
> 1 Milliäquivalent/100 ml
produziert wurden erscheint
die Abkürzung für die betreffende
Säure in Großbuchstaben.
Werden Säuren in Mengen < 1
Milliäquivalent/100 ml produziert,
erscheint die Abkürzung
für die betreffende Säure im
Kleinbuchstaben. Die
Abkürzungen sind dieselben wie in
V.P.I.-Handbuch (5)
aDie meisten Tests und Maßnahmen sind in dem V.P.I.-Anaerobier-Laborhandbuch
(5) beschrieben.
bVorreduzierte, anaerob sterilisierte Medien - vgl. Anhang zu Rezeptur.
TABELLE 10 - Biochemische Reaktionen und gaschromatographische
Profile für das Lactat ausnutzende Isolat 407A und
die Megasphaera elsdenii-Stämme 25940 und B159a
Reaktionen/Profile
Test
Isolat 407A
Stamm 25940
Stamm B159
Gram-Färbung Koloniemorphologie
2-3 mm Durchmesser,
kreisförmig,
vollständig,
beige, butterartig
pH-Wert in: PY(basal)
Celliboise
Esculin
Glucose
Lactose
Maltose
Mannit
Stärke
Saccharose
Xylose
Galle
Catalase
Esculin-Hydrolyse
aerobes Wachstum
Wachstum bei einem pH-Wert von 5,4
Wachstum bei einem
pH-Wert von 5,6 in Gegenwart von 2-DG
Wachstum bei einem pH-Wert von 5,0 in Gegenwart von 6 ppm Monensin
Wasserstoffproduktion aus Lactatb
Indol
Lactatausnutzung
Fleischverdauung
Beweglichkeit
Nitratreduktion
Stärkehydrolyse
Threonin-Umwandlung zu Propionat
VFA aus;c
-
Fußnote:
-
aVgl Tabelle 2 und den Text zur Interpretation sowie die
Schlüssel. Die Methoden basieren auf den des V.P.I.-Handbuchs
(5).
-
bProzent H&sub2; im Kopfraum.
-
cVergleich mit nicht-beimpften Medien.
Beispiel 4
-
Dieses Beispiel faßt die Daten von drei mit dem Stamm
407A pansenbeimpften Tierpaaren zusammen. Jedes Paar wurde zu
einem anderen Zeitpunkt während der Azidoseeinleitung beimpft.
Verglichen wurden sie mit den ensprechenden kontemporären
(Block)-Kontrollen.
-
Versuchsgestaltung: Die Ausgestaltung der Urstudie
basiert auf einem in vivo-Modell einer akuten Milchsäureazidose.
Es wurden jeweils vier Blöcke von vier Tieren verwendet. Die
einzelnen Blöcke wurden zeitlich um 2 - 4 Wochen getrennt. Bei
jedem der Blöcke 2, 3 und 4 wurden zwei weitere Stiere mit
Ruminalfisteln mitbenutzt, um die Gruppe auf sechs auf
zufüllen. Die Stiere wurden willkürlich als entweder Kontroll- oder
Impf(407A-dosiert)-Behandlungsgruppen bezeichnet. Der Block 1
wurde nicht benutzt, da keine 407A-Zellen verfügbar waren. Die
unten zusammengefaßten Ergebnisse stammten von den Stieren in
den Blöcken 2, 3 und 4.
-
Tiere und deren Behandlung: Es wurden gekreuzte
Hereford/Angus-Stiere verwendet. Diese Rinder (eines
Körpergewichts von etwa 300 - 380 kg) erhielten eine Pansenfistel,
wurden in Ställen gehalten und ad libitum mit einem qualitativ
minderwertigen Alfalfaheu/Weizenstroh-Futter (5:2;
Mindestzunahme: 0,1 - 0,2 kg/Tag) für mindestens 3 Wochen gefüttert.
Unmittelbar vor dem Test wurde jedes Tier gewogen (Tabelle
11). Eine spätere Verfütterung von Kurzheu bzw.
Azidose-induzierendem Getreidemehl basierten auf diesem Körpergewicht
(BW).
-
Fütterungsvorschrift und Probensammlung aus dem Pansen:
Die Rinder wurden am Nachmittag vor der Versuchsperiode in den
Meßraum geführt und bis zum folgenden Tag nicht mehr
gefüttert. Während der Fütterungs- und Fastenperiode stand immer
Wasser zur Verfügung. Am Tag 1 wurden die Tiere mit 0,5% BW
Mahlzeiten aus gehäksteltem Alfalfa um 7 Uhr morgens und 3 Uhr
Nachmittag gefüttert. Am Tag 2 erfolgte die Fütterung um 7 Uhr
morgens. Jegliches restliches Futter wurde über die Fistel in
den Pansen eingebracht. Am Tag 3 wurde nicht gefüttert. Die
akute Azidose wurde am Tag 4 um 6 Uhr morgens eingeleitet. Die
Fistel wurde geöffnet, worauf zwei 5 ml-Proben Panseninhalt
gesammelt wurden. Die Proben wurden sofort in in
Trockeneis/Ethanol getauchten Plastikröhrchen eingefroren und zur
Lactatanalyse und Analyse aufflüchtige Fettsäuren (VFA) bei
-20ºC gelagert. Der Pansen-pH-Wert wurde mit einer
eintauchbaren flachen Oberflächenelektrode (Sensorex 450C, Stranton, CA)
und einem MP-815-pH-Meter (Fisher Scientific) gemessen. Die
Sonde wurde etwa im Mittelpunkt des Pansens gehalten.
Unmittelbar anschließend wurde die erste der vier 0,5%
BW-Mahlzeiten aus 90% gemahlenem Mais und 10% Melasse von Hand mit einem
gleichen Gewicht Wasser gemischt und als Bolusdosis in den
jeweiligen Pansen über die Fistel eingeführt. Die restlichen
Mahlzeiten wurden in ähnlicher Weise um 7 Uhr, 8 Uhr bzw. 9
Uhr vormittags verabreicht. Neben den um 6 Uhr vormittags
gesammelten Pansenproben wurden in (bestimmten) Intervallen nach
der Bolusdosierung weitere Pansenproben über die Fistel
entnommen. In diesen Fällen wurden nach Messung des pH-Werts
nicht mehr als 1250 ml Pansenflüssigkeit je Tier gesammelt.
-
Erholung der Tiere nach Einleitung der Azidose: Nach
Entnahme der letzten Probe von jedem Tier erhielten die Stiere
at libitum gehäkseltes Heu. Am folgenden Tag wurden die Tiere
in ihren Stall zurückgebracht. Dort hatten sie freien Zugang
zu langem Heu und Minimalergänzung.
-
Herstellung des Stamms 407A zur Pansenbeimpfung: Der
Milchsäure verbrauchende Pansenbakteriumstamm 407A (UC-12497)
wurde in statischer Kulur auf Medium BlBc (Tabelle 8) bei 37ºC
wachsengelassen. Es erfolgten Routineübertragungen unter
Verwendung von (falzversiegelter) Serumröhrchen (5 ml
Medium/Röhrchen). Unter Benutzung eines 1%igen Inokulatgehalts diente
eine Übernachtkultur zum Beimpfen von 2,60 ml Brühe in 100 ml
Serumflaschen. Diese in die Höhe getriebenen Kulturen wurden
6 - 7 h lang inkubiert und dann zum Beimpfen eines 20 l
Glasballons
mit 12 l B18c-Medium verwendet. Der beimpfte
Glasballon wurde statisch über Nacht (16 - 18 h) bei 37ºC
inkubiert. Danach wurde aseptisch eine Probe zur OD-Bestimmung
(650 nm, Weglänge: 18 mm) und zur Bestimmung der Menge an
lebensfähigen Zellen (vgl. später) abgezogen.
-
Anaerobes Ernten und Auf bewahrung lebender Zellen: 407A-
Zellen wurden durch anaerobes Zentrifugieren geerntet.
Luftdichte, mit einem o-Ring versiegelte Zentrifugenflaschen
(Dupont), die durch vorheriges Ausgleichen in einem anaeroben
Handschuhkasten von Sauerstoff befreit worden waren, wurden
verwendet. Die Flaschen wurden in dem Handschuhkasten unter
Verwendung eines Gehäusevakuums zur Abgabe der
Glasballonkultur gefüllt, ausgeglichen (gewogen) und versiegelt. Danach
wurden die Flaschen in einem GS-3-Rotor (Sorvall) 20 min lang
bei Raumtemperatur bei 6250 x g zentrifugiert. In dem
Handschuhkasten wurden die Überstände verworfen. Die
pelletisierten Zellen wurden in einer geringen Menge B18c-Medium ohne
Lactat, jedoch mit 20% (v/v) Glycerin resuspendiert. Nachdem
die Zellen resuspendiert waren, wurden die Suspensionen
gepoolt, das Gesamtvolumen aufgezeichnet und eine Bestimmung
(vgl. später) der Zahl lebender Zellen durchgeführt. Das
durchschnittliche Gesamtvolumen der konzentrierten Zellensus-
Pension aus sämtlichen 12 l-Glasballons betrug 123 ml
entsprechend einem 100-fachen Konzentrationsfaktor. Die B18c-
Glycerin-Zellsuspensionen wurden in 100 ml Serumflaschen
gefüllt und bei -70ºC eingefroren. Die maximale Gefrierzeit vor
Gebrauch betrug 3 Wochen. Lebensfähigkeitstests zeigten, daß
die gefrorenen Suspensionen mindestens 3 Monate lang stabil
waren. Unmittelbar nach dem Auftauen und vor dem Beimpfen der
Rinder mit der Suspension erfolgte eine weitere Zählung
lebender Zellen.
-
Bestimmung der Zahl lebender Zellen: 1 ml Kultur oder
konzentrierte Zellensuspension wurde in 10-fachen Stufen in
ADS-Puffer der Reihenverdünnung unterworfen (M.P. Bryant und
L.A. Burkey in "J. Dairy Sci.", 36, Seiten 205-217 (1953)).
B18c-Agar (1,5% g/v)-Platten wurden mit 50 bzw. 100 ul Mengen
an gewählten Verdünnungen beimpft. Die Platten wurden unter
5 lbs. CO&sub2; 48 h lang in Inkubationsgefäßen aus nichtrostendem
Stahl inkubiert. Danach wurden die Kolonien auf die Population
an lebenden Zellen in der Kultur oder in den frischen oder
aufgetauten Zellensuspensionen ausgezählt.
-
Selektion der Pansendosis: Zuvor bestimmten wir, daß eine
Beimpfungsmenge von 2 x 10&sup8; lebenden Zellen pro ml eine
wirksame Dosis zur Verminderung der Ansammlung von Milchsäure und
zur Verhinderung eines Absinkens des pH-Werts in vitro
darstellte. Somit strebten wir diese Konzentration für unsere in
vivo-Dosiermenge an. Da die tatsächlichen Pansenvolumina der
Versuchsstiere unbekannt waren, gingen wir von einem
jeweiligen Nominalflüssigkeitsvolumen von 30 l aus. Das Ziel war die
Beimpfung mit 6 x 10¹² lebensfähigen 407A-Zellen pro Pansen
oder etwa 2 x 10&sup8; lebensfähigen Zellen pro ml
Pansenflüssigkeit. Da jeder Glasballon ein anderes Volumen und eine andere
Lebensfähigkeit von 407A-Zellen lieferte, wurden für jeden
Block konzentrierte Zellensuspensionen aus drei Glasballons
kombiniert. Somit erhielt jeder Block neben einer Beimpfung zu
verschiedenen Zeitpunkten nach der Azidoseeinleitung eine
schwach unterschiedliche Dosis (vgl. Tabelle 12).
-
Pansenbeimpfungsmaßnahme: Am Tag der Azidoseeinleitung
bei jedem Versuchsblock wurden konzentrierte
Zellensuspensionen von drei getrennten Glasballonkulturen bei Raumtemperatur
aufgetaut und in dem anaeroben Handschuhkasten vereinigt. Von
den vereinigten Suspensionen wurde die Zahl lebensfähiger
Zellen ermittelt (Tabelle 12). Danach wurde die betreffende
Suspension in zwei gleiche Teile (einer für jedes der zwei
Versuchstiere) geteilt und in Erlenmeyer-Kolben verschlossen.
Diese wurden aus dem Handschuhkasten entnommen und zum
festgelegten Zeitpunkt im Pansen geöffnet und gründlich von Hand mit
dem Panseninhalt jedes Tiers gemischt. Das Inokulat war nicht
früher als 30 min vor dem Zeitpunkt für eine
Pansenverabreichung fertig. Die behandelten Tiere erhielten ihr
Panseninokulat 4, 3 bzw. 2 h nach Einleitung (6 Uhr morgens) der Azidose
den Blöcken 2, 3 bzw. 4.
-
Analyseverfahren: Die Milchsäurekonzentrationen wurden
nach dem vorbeschriebenen Verfahren bestimmt. Die
Konzentrationen an flüchtigen Fettsäuren wurden nach einer HPLC-Methode
(Dionex Corporation, "Ion chromatogrpahy cookbook: a practical
guide to quantitative analysis by ion chromatography", Seiten
II-15-16 (1987)) bestimmt.
-
Bei Block 2 wurde das behandelte Rind 4 h nach der
Azidoseeinleitung beimpft. Von dem Stamm 407A wurde zuvor gezeigt,
daß er die in vitro-Ansammlung von Milchsäure zu diesem
Zeitpunkt vermindert.
-
Bei Block 2 sank der Pansen-pH-Wert rasch bei den
Vergleichstieren von einem Mittelwert von etwa 8,0 auf unter 5,0
innerhalb von 6 h nach Einleitung der akuten Azidose. Der
Pansen-pH-Wert bei den beiden Stieren, die die Dosis des
Stamms 407A erhalten hatten, fiel ebenfalls in 6 h auf 5,0 ab,
er blieb jedoch bei 5,0 oder darüber während der restlichen
Zeit. Bei den Kontrolltieren sank der pH-Wert (dagegen)
weiter.
-
Die Pansenmilchsäure bei den Kontrolltieren sammelte sich
zwischen 4 und 8 h nach der Azidoseeinleitung auf über 100 mM
an und blieb auch während des restlichen Beobachtungszeitraums
hoch. Das bei den dosierten Stieren angesammelte Pansenlactat
stieg zwischen 4 und 6 h nach der Azidoseeinleitung auf etwa
60 mM. Danach sanken die Milchsäurekonzentrationen
kontinuierlich auf weniger als 20 mM.
-
Die Pansenkonzentrationen an den VFAs wurden die ersten
12 h lang überwacht. Vor der Azidoseeinleitung war bei den
Versuchstieren (nur) eine sehr geringe
Pansenfermentationsaktivität feststellbar. So betrugen beispielsweise die
Acetatkonzentrationen etwa 10 mM. Die sich in der "Acetatansammlung"
darstellende Pansenfermentationsaktivität erhöhte sich bei
jeder Mahlzeit bzw. Futteraufnahme stetig. Zwischen 5 und 12 h
sank die Pansenacetatkonzentration bei den Kontrolltieren
stetig auf einen Wert von etwa 5 mM. Diese zeitliche Abnahme fiel
mit der starken Zunahme in der Milchsäureproduktion zusammen.
Im Gegensatz dazu erhöhten sich die
Pansenacetatkonzentrationen bei den Stieren, die eine 407A-Dosis erhalten hatten, über
die ersten 6 h und schienen dann über den 12-stündigen
Überwachungszeitraum hinweg bei 28 mM stehenzubleiben.
-
Bei den Kontrolltieren waren über den
Beobachtungszeitraum hinweg nur sehr geringe Gehalte an Propionat, Butyrat und
Valerat (weniger als 5, 2 bzw. 1 mM) feststellbar. Nach der
Pansenbeimpfung mit dem Stamm 407A erhöhte sich jedoch nach 4
h der Propionatgehalt auf das etwa 8-fache. Eine 8-fache
Zunahme war auch für Butyrat und Valerat feststellbar. Beide
stiegen stetig von dem 4 h-Zeitpunkt und erreichten mittlere
Konzentrationen von 14 bzw. 4,5 mM nach 12 h. Bei den
Kontrolltieren bzw. dosierten Tieren waren weniger als 1 mM
Konzentrationen an Isobutyrat und Isovaleriat feststellbar.
-
Bei Block 3 wurde die Pansenbeimpfungszeit auf bis zu 1 h
verrückt. Die Tiere wurden 3 h nach Einleitung der Azidose
beimpft.
-
Der Pansen-pH-Wert bei den Kontrolltieren sank erneut rasch
von einem Mittelwert von 8,4 auf weniger als 5,0 innerhalb von
9 h nach der Azidoseeinleitung. Der Pansen-pH-Wert bei den
dosierten Stieren sank jedoch weniger rasch als bei Block 2
und blieb bei etwa 5,5. Ein niedriger mittlerer pH-Wert von
5,2 wurde bei den dosierten Stieren nach 16 h erreicht. Die
Pansenmilchsäurekonzentration bei den Kontrollstieren
kletterten wiederum zwischen 4 und 8 h auf über 100 mM und blieben
hoch. Bei den dosierten Tieren stiegen die
Lactatkonzentrationen zwischen 4 und 6 h auf etwa 45 mM und fielen dann nach
12 h auf nahe Null nach 24 h.
-
Bei den Kontrollstieren stiegen die
Pansenacetatkonzentrat Ionen während der Dauer der Fütterung, sie fielen jedoch
danach wie bei Block 2 ab. Bei den dosierten Stieren blieben
die Acetatkonzentrationen etwa bei 20 mM. Erneut war die
Propionat-, Butyrat- und Valeratkonzentrationen bei den
Kontrolltieren sehr niedrig (weniger als 5, 2 bzw. 1 mM). Bei den
dosierten Stieren stieg Propionat 5 h nach der Azidoseeinleitung
auf das 5-fache. Butyrat und Valerat stiegen stetig jeweils
nach 3 h, dem Zeitpunkt der Pansenbeimpfung, auf das etwa 10-
fache. Bei den Kontrolltieren und den beimpften Tieren waren
geringere als 1 mM Konzentrationen an Isobutyrat und
Isovalerat feststellbar.
-
Aufgrund der fertigen Analysen von Milchsäureblöcken aus
früheren Blöcken schien es, daß 407A Lactat augenblicklich bei
Beimpfung zu metabolisieren vermag. Ferner schien es dem
betreffenden Stamm nichts auszumachen, wenn die
Pansenkonzentration
an Milchsäure niedrig war. Aufgrund des Erfolgs einer
Beimpfung 1 Stunde früher bei Block 3 wurde die
Pansenbeimpfungszeit für Block 4 eine weitere Stunde auf 2 h nach der
Azidoseeinleitung aufgeschoben.
-
Bei Block 4 verursachte ein mechanischer Fehler ein
Verlust von Pansen-pH-Wert-Daten. Die
Pansenmilchsäurekonzentrationen zeigten, daß die Einleitung einer akuten Azidose ebenso
erfolgreich war wie bei den vorhergehenden Blöcken. Die
Kontrolltiere zeigten wiederum eine rasche Ansammlung von
Pansenmilchsäure zwischen 4 und 8 h nach de Azidoseeinleitung. Eine
Beimpfung mit 407A 2 h nach der Azidoseeinleitung schien
jedoch einen Hauptteil der Milchsäureansammlung aufzuhalten. Der
höchste nachgewiesene Spiegel bei dosierten Stieren lag unter
20 mM nach 5 - 6 h. Danach betrug die Milchsäurekonzentration
weniger als 4 mM.
-
Bei Block 4 entsprachen die Profile der
Acetatkonzentration sowohl bei den Kontrollstieren als auch bei den dosierten
Stieren denjenigen vorhergehender Blöcke, obwohl die
Acetatkonzentration bei den dosierten Stieren (hier) höher war. Die
Propionat-, Butyrat- und Valeratkonzentrationen bei den
Kontrolltieren entsprachen denjenigen der vorhergehenden Blöcke.
Im Gegensatz zu den vorhergehenden Blöcken war (hier) bei den
dosierten Stieren nur wenig Propionat produziert worden.
Butyrat und Valerat stiegen jedoch stetig auf das etwa 40-fache 2
h nach der Pansenbeimpfung bei dosierten Stieren auf 50 bzw.
10 mM. Bei den Kontrolltieren und dosierten Tieren waren
geringere als 1 mM Konzentrationen an Isobutyrat und Isovalerat
feststellbar.
-
Das in diesem Beispiel benutzte Azidose-Tiermodell dient
zum Austesten des Milchsäure verbrauchenden Bakteriums 407A.
Zunächst wurden die Tiere auf einem qualitativ sehr
minderwertigen Futter gehalten, dann mit Heu bei 1% BW gefüttert und
schließlich 24 h lang hungern gelassen, bevor die
Azidoseeinleitung erfolgte. Dadurch wurden diese Stiere auf sehr
geringen Grad einer endogenen Pansenfermentationsaktivität
prädisponiert. Sie zeichnete sich durch einen hohen Pansen-pH-Wert
(≥ 8,0), möglicherweise infolge überschüssigen Bicarbonats,
geringere Mengen an produziertem CO&sub2; und niedrige
Konzentrationen
an VFAs aus. Zweitens initiierte die Einführung von
Getreidemahlzeiten (2% BW insgesamt) in dieses System einen
Stoffwechsel der überlebenden Pansenmikroben. Dies wird durch
die stetige Zunahme in sämtlichen Haupt-VFAS über die ersten 4
h belegt. Nach 4 h war es jedoch offensichtlich, daß die
rascher wachsenden, Milchsäure produzierenden Mikroben ihre
VFA-produzierenden Gegenspieler überwältigt hatten und eine
Milchsäurefermentation in Gang gekommen ist. Drittens, obwohl
es für den zum Abfall des Pansen-pH-Werts auf unter 5,0 und
den Anstieg der Milchsäurekonzentration auf über 100 mM
notwendigen Zeitbedarf gewisse Schwankungen gibt, ist das Modell
konstistent. Die Einführung des Milchsäure verbrauchenden
Bakteriums 407A in dieses (Milchsäure)azidosemodell war ein
rigoroser Test seiner Unversehrtheit und seines Stoffwechsels.
Bei Block 2 wurde 407A 4 h nach der Azidoseeinleitung
beimpft. Dieser Zeitpunkt fiel mit den größten Abnahmeraten im
Pansen-pH-Wert und der Zunahme der Pansenmilchsäure zusammen.
Mit Ausnahme der Tatsache, daß der Pansen-pH-Wert nicht auf
unter 5,0 abfiel, zogen wir den Schluß, daß 407A zu spät
geimpft wurde, um einen signifikanten Einfluß auf den pH-Wert
auszuüben. Bei Block 3 (Pansenbeimpfung 3 h nach Beginn der
Azidoseeinleitung) war der Einfluß auf den Pansen-pH-Wert
deutlicher. Die Daten des Blocks 3 belegten einen mittleren
Pansen-pH-Wert von 5,5 oder darüber bei mit 407A dosierten
Tieren. Wegen technischer Schwierigkeiten konnten die pH-Wert-
Daten des Blocks 4 nicht angegeben werden. Die Unterschiede in
den pH-Werten zwischen Kontrollstieren und 407A-dosierten
Stieren könnten jedoch noch größer gewesen sein, da die
Milchsäurespiegel bei diesen dosierten Tieren weit geringer waren
als bei denen in Block 3.
-
Die Wirkung von 407A auf die Milchsäureansammlung war bei
sämtlichen getesteten Blöcken hoch. Bei Block 2 erreichte
nicht nur deren Konzentration die Hälfte derjenigen der
Kontrolltiere, die Milchsäure wurde sogar bei den mit
407A-dosierten Tieren im Laufe der Zeit kontinuierlich vermindert.
Diese Daten belegten, daß eingefrorene und aufgetaute 407A-
Zellen bei Pansenbeimpfung zu einem augenblicklichen
Milchsäurestoffwechsel fähig sind. Bei den früheren Beimpfungen der
Blöcke 3 und 4 wurden Pansenmilchsäureansammlungen wirksam
durch 407A blockiert, so daß sich keine akuten
Milchsäureazidosebedingungen entwickeln konnten.
-
Wie bereits erwähnt, zeigen sämtliche Tiere vor der
Azidoseeinleitung niedrige VFA-Konzentrationen. Bei azidotischen
Kontrolltieren wurde die Erhöhung der Haupt-VFAS 4 h nach der
Einleitung durch Milchsäure ersetzt. Unabhängig vom Zeitpunkt
der Pansenbeimpfung der mit 407A dosierten Tiere stiegen
Butyrat und Valerat, die Hauptfermentationsprodukte von 407A beim
Wachsen auf Lactat, sofort nach der Beimpfung. Die
Propionatzunahme folgte 1 - 2 h später bei den Blöcken 2 und 3.
-
Die Butyratspiegel waren die höchsten, wenn die
Propionatspiegel die niedrigsten waren (Block 4). Im Gegensatz dazu
waren die Butyratspiegel die niedrigsten, wenn die
Propionatspiegel die höchsten waren (Block 2). Erhielten die Pansen
eine Dosierung zum Zeitpunkt 4 h (Block 2), war die
Konzentration an löslichem Zucker (hauptsächlich Glucose und Maltose)
hoch und lag nahe bei 50 mM. Somit sind für 407A sowohl Zucker
als auch-Milchsäure verfügbar. Bei Block 4 war beim Beimpfen
der Pansen zum Zeitpunkt 2 h entsprechend weniger Zucker und
mehr Milchsäure zur Fermentation verfügbar. Da 407A auch auf
einigen Zuckern wachsen kann, können diese Pansenbedingungen
für die Unterschiede in den beobachteten VFA-Profilen
verantwortlich sein. Dieses Phänomen wurde zuvor in vitro bei
Megasphaera elsdenii beobachtet (M. Marounek und Mitarbeiter
in "Appl. Environ. Microbiol.", 55, Seiten 1570-1573 (1989)).
M. elsdenii kann gleichzeitig verschiedene Substrate ausnutzen
und Propionat, Butyrat und Valerat herstellen (vgl. M.
Marounek und Mitarbeiter, aaO, und J.B. Russell und R.L.
Baldwin in "Appl. Environ. Microbiol.", 36, Seiten 319-329
(1978)).
-
Zusammenfassend war eine Verhinderung einer akuten
Milchsäureazidose mehr und mehr erfolgreich (ausgedrückt als
Erhaltung eines neutraleren Pansen-pH-Werts und einer niedrigen
Milchsäurekonzentration), wenn der Pansen 4, 3 bzw. 2 h nach
der Azidoseeinleitung mit 1 bis 2 x 10&sup8; lebensfähigen 407A-
Zellen pro ml Pansenflüssigkeit beimpft wurde. Aus diesen
Ergebnissen geht offensichtlich hervor, daß sich das
Milchsäure
verbrauchende Bakterium 407A (UC-12497) als Mittel zur
Verhinderung einer Azidose bzw. als Umstellungshilfsmittel
eignet.
-
Das Isolat 407A wurde bei der The Upjohn Culture
Collection, The Upjohn Company, Kalamazoo, MI 49001 hinterlegt
und erhielt die Hinterlegungsnummer UC-12497. Das Isolat 407A
wurde ferner bei der ARS-Patent Culture Collection,
Agricultural Research Service Culture Collection, Northern
Regional Research Center, 1815 North University Street,
Peoria, Illinois 61604, am 15. Februar 1990 unter der
Hinterlegungsnummer NRRL B-18624 hinterlegt.
TABELLE 11
Anzahl der Versuchstiere, Körpergewicht, Malzeitgröße
und Zeitpunkt der Pansenbeimpfung
Block Nr.
Versuchsdaten
Versuchstier Nr.
Aktuell verwendetes Tier Nr.
Körpergewicht (kg)
0,5% BW Mahlzeiten (kg)
Zeitpunkt der Pansenbeimpfunga
März
April
Juni
aStunden-nach der Azidoseeinleitung
bIn diesem Block erfolgte eine unrichtige Berechnung
der Größe der 0,5% BW-Mahlzeiten
cNicht erfolgt
TABELLE 12
Lebensfähigkeitsdaten - 407A
Glasballon
Vereinigte Zellensuspension
Panseninokulat/Block
Block Nr.
Volumen (ml)
Geschätzt Dosis x 10&sup8;
a Zahl lebensfähiger Zellen
bpro Stier
c6 l Glasballon
dNicht bestimmt
eDie Glasballone für diesen Block wurden am selben Tag
kollektiv bearbeitet.