NL8502260A - Preparaat en werkwijze voor het verbeteren van het nuttige effect van de benutting van voer voor herkauwers. - Google Patents

Description

> NL 33.021 Kp/vdM **' 1 - 1 -

Preparaat en werkwijze voor het verbeteren van het nuttige effect van de benutting van voer voor herkauwers.

De uitvinding heeft betrekking op een preparaat voor het verbeteren van het nuttige effect van de benutting van voer voor herkauwers. Meer in het bijzonder heeft de uitvinding betrekking op een preparaat, dat als werkzaam bestand-5 deel één of meer microbische culturen bevat, die in staat zijn de gewichtsverhouding van azijnzuur tot propionzuur op een optimale waarde te stellen, bij voorkeur op een waarde van 1,5-4,0 : 1, en het vermogen hebben in de herkauwers te groeien en daar te blijven gedurende tenminste 60 dagen, even-10 tueel gemengd met dragers, verdunningsmiddelen, conserveermiddelen, die in de veeteelt gewoonlijk worden toegepast, alsmede voedingsstoffen en/of andere stoffen, die normaal aan herkauwers worden toegediend. De uitvinding heeft verder betrekking op de bereiding van microbische culturen, die als 15 werkzaam bestanddeel worden gebruikt in de boven genoemde preparaten, alsmede op de toepassing van dergelijke preparaten.

Hierkauwers die een samengestelde maag hebben, zoals schapen (Ovis aries aries), rundvee (Bos primigenius 20 taurus), geiten (Capra hircus) en hun wilde verwanten (herten en muflons, enz.), spelen een belangrijke rol in de voedingsketen en in de economie. Hun speciaal belang is dat zij leven op voedingsstoffen, die voor andere herbivoren niet benut kunnen worden. De voormaag zorgt voor een anaëroob milieu 25 voor de rumenflora, die in staat is cellulose te verteren en naast de normale voedingsstoffen niet-proteïnestikstof benut.

De samenstelling van de rumenflora is grotendeels afhankelijk van de voerverhouding en past zich aan aan het dieet. Deze aanpassing neemt echter diverse dagen in beslag, terwijl de 30 eindstabilisatie diverse weken kan duren. Abrupte verandering van de verhouding beïnvloedt op nadelige wijze de opname, vertering en produktie en het kan tot ziekte en zelfs tot de dood leiden.

S302 2SC

' - 2 - Λ .

Bekend is, dat in 1 ml rumenvloeistof miljoenen bacteriën leven en groeien. Anaerobe fermentatie door bacteriën is van groot belang voor de normale vertering en voer-opname. Energie producerende voedingsstoffen worden gefermen-5 teerd tot azijnzuur, propionzuur en boterzuur, die door het gastdier als vetzuren worden gebruikt; de bacteriemassa, die het darmkanaal doorloopt, zal worden verteerd en als proteïne-bron worden gebruikt. Met betrekking tot de melk- en vlees-produktie speelt de aanvoer van azijnzuur en propionzuur, 10 alsmede hun onderlinge verhouding, een essentiële rol. Dientengevolge speelt de rumenflora een belangrijke rol in het behoud en de produktie van de veestapel.

Na de geboorte ontwikkelt zich de rumenflora spontaan en bereikt deze zijn volwassen samenstelling na het 15 overschakelen op vast voer. Het is echter niet zeker dat deze toevallige flora het optimale fermentatieve systeem vormt.

Het zou gunstig zijn een werkwijze te hebben voor het wijzigen van de samenstelling en/of het aantal van de rumenflora overeenkomstig economische belangen.

20 De toename van vluchtige vetzuurproduktie in de rumen en daarbij de verbetering van voerbenutting en dientengevolge de vlees- of melkproduktie, is iets dat in de veeteelt sinds lange tijd wordt nagestreefd. Bepaalde resultaten zijn verkregen met behulp van monensin /2-/5-ethyltetrahydro-25 5-{tetrahydro-3-methyl-5-/tetrahydro-6-hydroxy-6-(hydroxymethyl) -3,5-dimethyl-2H-pyran-2-yl7-2-furyl}-2-furyl7”9-hydroxy-$-methoxy-α,γ,2,8-tetramethyl-2,6-dioxaspiro/4,57” decaan-7-boterzuur7, welke stof oorspronkelijk als coccidio-staat werd gebruikt (zie bijv. het Amerikaanse octrooischrift 30 nr. 4.085.255). Experimentele toepassing van andere verwante polyethers, zoals salinomycine, lasalocide, enz., ftalide-derivaten (Amerikaanse octrooischrift nr. 4.333.923) en glycopeptiden, zoals avoparcine, actaplanine e.d. (Ingle e.a., Abstr. Am. Soc. Anim. Sci. 424 /1*9787) werd eveneens gepubli-35 ceerd. Het waargenomen effect is echter zeer verschillend bij voer bij diverse voedingsstoffen en is alles bij elkaar niet wezenlijk (Chalupa, W., Chemical Control of Rumen Microbial Metabolism, Digestive Physiology and Metabolism in Ruminants, 8*02260 ♦ 4 < ' - 3 - MTP Press, Lancaster, Engeland, 1980 en Chalupa, W. e.a., Manipulating Ruinen Fermentation with Monensin and Amicloral, Abstr. Am. Soc. Anim. Sci., 410 /19787). In de stand der techniek is er geen methode bekend, waarlangs de microbische 5 cultuur, aanwezig in de rumen van herkauwers, zodanig kon worden beïnvloed, dat significante resultaten konden worden verkregen.

Volgens de uitvinding is echter gebleken, dat genetische recombinatiemethoden met succes kunnen worden toe-10 gepast voor het afscheiden van mieroorganismen. Praktisch elke bacteriestam kan via genetische merkers gelabeld worden, bijv. door een antibiotische resistentiefactor, die identificatie van de bacterie tussen andere bacteriën mogelijk maakt.

15 Volgens de uitvinding werden rumenbacteriën ge ïsoleerd, de stammen werden genetisch gelabeld en na het kweken werden ze in de herkauwers opnieuw geïntroduceerd. Daarna werden van tijd tot tijd monsters van het rumengehalte genomen, gevolgd door deze in selectieve media te kweken, waarbij 20 gevonden werd dat sommige van de stammen die fermentatieve eigenschappen hadden, die gunstig waren voor het gastdier en die in staat waren in vitro te groeien, in de herkauwers konden groeien en daar gedurende lange tijd konden bestaan, indien dezelfde voedingsstof werd toegediend als tijdens de 25 isolatie en dat zij de vertering stimuleerden en tevens de veerbenutting bij het gastdier bevorderden.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een preparaat, dat als werkzaam bestanddeel één of meer microbische culturen bevat, die in staat zijn de gewichtsverhouding 30 van azijnzuur tot propionzuur op een optimale waarde van 1,5-4,0 : 1 af te stellen en het vermogen hebben in de rumen te groeien en daar gedurende tenminste 60 dagen te blijven bestaan, eventueel vermengd met dragers, verdunningsmiddelen, conserveermiddelen, die gewoonlijk in de veeteelt worden ge-35 bruikt en voedingsstoffen en/of andere stoffen, die gewoonlijk aan herkauwers worden toegediend.

Indien de preparaten worden gebruikt voor het doen toenemen van de vleesproduktie is het werkzame bestand- 8502280 ’ - 4 - Λ I' deel bij voorkeur een microbische cultuur, die in staat is de gewichtsverhouding van azijnzuur tot propionzuur af te stellen op een waarde van 2,0-3,5 : 1, bijv. 2:1. Voor melkproduktie is de optimale azijnzuur- tot propionzuurverhouding ca.

53,0 : 1, voor onderhoud of drachtigheid ca. 4,0 : 1 en voor vaarsteelt ca. 2,0-3,0 : 1. Het is derhalve raadzaam gebruik te maken van preparaten, die in staat zijn de azijnzuur- tot propionzuurverhouding op een optimale waarde voor deze doeleinden af te stemmen. In de literatuur bestaat er zekere 10 onzekerheid ten aanzien van de meest gunstige azijnzuur- tot propionzuurverhoudingen, waarbij de voorkeursverhouding een functie is van de herkauwer, het toegepaste voer en andere factoren, waarbij de keuze wordt overgelaten aan de vakman (zie bijv. Kaufmann, W. en Rohr, K., Der Einfluss des Futters 15 auf die bacterielle Fermentation in VormSgen, Handbuch der Tiernahrung, 263, 1969, Parey, Hamburg, Berlin).

De uitvinding heeft verder betrekking op een werkwijze voor de bereiding van microbische culturen, die in de boven genoemde preparaten als werkzaam bestanddeel worden 20 gebruikt, waarbij uit de rumen van de dieren die gevoederd worden op een gegeven voedingsstof of rantsoen, monsters worden genomen, gevolgd door het onderzoeken van metabolisme van de microben, die uit het monster zijn geïsoleerd, in vitro 25 en/of in vivo, gevolgd door het kweken van de microben met geschikte metabolische eigenschappen in media, die dezelfde voedingsstof of rantsoen bevatten als koolstof- of stikstof-bron, waarna in de groeimicroben een genetische merker, 30 die de selectie mogelijk maakt, wordt geïntroduceerd, waarbij de genetisch gelabelde stammen worden gekweekt, de culturen opnieuw in de rumen van de dieren, die met dezelfde voedingsstof of rantsoen worden gevoederd, 35 worden geïntroduceerd, gevolgd door het nemen van monsters uit de rumen, waarna het aantal cellen van de genetisch gelabelde stam wordt geteld, 8502 2 6 0 % - 5 - « * waarbij de stammen, die tenminste 60 dagen blijven bestaan en waarbij de azijnzuur- tot propionzuurverhouding wordt afgesteld op een optimale waarde, bij voorkeur op I, 5-4,0 : 1, worden afgezonderd en 5 waarna tenslotte deze stammen desgewenst worden overgebracht in een vorm, die geschikt is voor de praktijk van de veeteelt en voederen.

Volgens een voorkeursuitvoeringsvorm van de onderhavige werkwijze worden monsters genomen uit de rumen van een 10 gefistuleerd rundvee, gevoederd met hooi, graanmeel of melasse waarna de culturen met de rumenbacteriën erin worden uitgespreid over vaste media, die N- en C-bronnen, anorganische zouten, rumenvloeistof en agar bevatten (Bryant en Burkey, J. Dairy Sci., 36.» 205, 1953). De culturen worden geïncubeerd 15 onder anaerobe omstandigheden, waarna de clonen worden geïsoleerd en in soortgelijke media als boven gekweekt.

De uitgegroeide culturen worden geïnoculeerd in vloeibare media met daarin stikstofbron, anorganische zouten, rumenvloeistof en als koolstofbron hooi of' cellulose, of in 20 andere gevallen graanmeel of melasse, terwijl zij zolang worden geïncubeerd tot er een intensieve groei in de media is waar te nemen.

Cellen die groeien op hooi (cellulose), graanmeel (zetmeel) of melasses (sucrose) als koolstofbronnen worden 25 verspreid, gekweekt en geïsoleerd op vaste media, die cellulose (voor celgroei met hooi), glucose (voor celgroei met graanmeel) of sucrose (voor celgroei met melasse) als koolstofbron bevatten.

De verkregen culturen worden genetisch gelabeld.

30 Voor de labeling kan gebruik worden gemaakt van elke erfelijke genetische merker, die de identificatie van de gelabelde microben tussen andere microben mogelijk maakt.

Volgens een andere voorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding worden antibiotisch resistente genen in de ge-35 selecteerde cellen geïntroduceerd. Indien de in de rumen levende bacteriën gevoelig zijn voor een bepaald antibioticum en resistente cellen ermee worden vermengd, kan groei en dood van de laatste microben gemakkelijk worden gevolgd, indien de 8502260 *\ · - 6 - monsters worden uitgespreid over media die hetzelfde antibioticum bevatten. In dit geval zullen slechts de resistente cellen groeien.

Door transformatie (Bergmans e.a.., J. Bacteriol.

5 146, 564 /T981_7) wordt pi 011 plasmide geïntroduceerd (Simon e.a., Proc. 8ste North American Rhizobium Conference, Winnipeg, Canada, üniv. of Manitoba Press, 1983) , die kanamycine en chloramfenicol resistente genen dragen, in de geselecteerde culturen geïntroduceerd, die op cellulose, graanmeel of 10 melasse groeien. Plasmide DNA werd geïsoleerd uit E. colli-cellen (Bimboim en Doly, Nucl. Acid. Res. 1_, 1513 /19797) ·

De stam is gedeponeerd bij de Hungarian National Collection of Medical Bacteria of the National Institute of Hygiene, Budapest, onder nr. 00264.

15 Na transformatie met DNA dragende antibiotisch resistente genen worden de cellen, die de nieuwe genetische informatie bevatten en deze uitdragen, geselecteerd op vaste media met de boven genoemde samenstelling, doch aangevuld met kanamycine. De resistente stammen worden bewaard.

20 Met de geïsoleerde en bewaarde culturen worden media, die een stikstofbron, anorganische zouten, rumen-vloeistof en agar bevatten (teneinde een half-vaste consistentie te verkrijgen) geïnoculeerd en geïncubeerd onder anaerobe omstandigheden. De ontwikkelde culturen worden gemengd 25 met het voer voor schapen, die gedurende een dag nuchter waren. Vöór en na het voeren van de bacteriën aan de dieren worden dagelijks rumenmonsters getrokken, die op de boven beschreven vaste media met daarin kanamycine, worden uitgespreid, waarna de bacteriecellen, die resistent en gevoelig 30 zijn voor antibiotica, worden geteld. De ruminale produktie van vluchtige vetzuren wordt eveneens kwalitatief en kwantitatief bepaald. Bekend is dat voerbenutting bij herkauwers wordt beïnvloed door de gewichtsverhouding van vluchtige vetzuren (Eskeland e.a., J. Anim. Sci. 33_, .282 /T971^7; Church 35 e.a., Digestive Physiology and Nutrition of Ruminants, Vol. 2, biz. 622-625, /19717). Zoals boven vermeld bedraagt de optimale verhouding van azijnzuur tot propionzuur 2,0-3,5 : 1, 3 : 1 en 4 ï 1, voor resp. de groei, melkproduktie en onder- 85 0 2 2 6 0 % - 7 - • < houd, alsmede zwangerschap (Kaufmann, W. en Rohr, K.: Der Einfluss des Futters auf die bakterielle Fermentation in VormSgen. In: Handbuch der Tieremahrung, blz. 263, Parey, Hamburg-Berlin, 1969).

5 Volgens een voorkeursuitvoeringsvorm van de onderhavige werkwijze worden bacteriën geïsoleerd uit rumen-monsters, waarna de capaciteit van de isolaten voor het produceren van vluchtige vetzuren wordt onderzocht. Het micro-organisme wordt onder anaerobe omstandigheden gekweekt in de 10 beschreven complete media, die rumenvloeistof bevatten, waarna de azijnzuurconcentratie, propionzuürconcentratie en boterzuurconcentratie van de culturen worden bepaald. De vluchtige vetzuren producerende microbische cellen in de vereiste verhoudingen worden genetisch gelabeld, waarna hun 15 ruminale groei wordt onderzocht.

Stammen die in staat zijn in de rumen van het dier dat gevoederd werd met de beschreven voedingsstof gedurende tenminste 60 dagen en die in staat zijn voedingskool-hydraten te fermenteren tot vluchtige vetzuren in optimale 20 verhoudingen, worden geselecteerd, gekweekt, geïsoleerd, behouden en opgeslagen en indien gewenst worden hun culturen in een voor de veeteelt geschikte vorm oraal aan de herkauwers toegediend voor het ontwikkelen of modificeren van de rumen-flora.

25 Er zijn drie stammen, Hh-GYOKI-1-123Sz, Hh-GYOKI- 2-14Ab en Hh-GYOKI-3-81Me, die in staat zijn in de rumen van met hooi, graanmeel of melasse gevoederde dieren te groeien en die in de rumen gedurende lange tijd kunnen bestaan en de vertering gunstig beïnvloeden, gedeponeerd bij de Hungarian 30 National Collection of Medical Bacteria of the National Institute of Hygiene onder resp. de nummers 00287, 00288 en 00289.

Volgens de uitvinding verdient het de voorkeur de mieroorganismen van rumenorigine tussen 32 en 37°C, onder an-35 aerobe omstandigheden, met uitsluiting van zuurstof in media die koolstof- en stikstofbronnen, anorganische zouten, reduc-tiemiddelen en rumenvloeistof bevatten, te kweken; waarvan de laatste de groeifactoren levert. Als koolstofbron kan gebruik 5502260 »' 2 - 8 - worden gemaakt van glucose, cellulose, hooi, graanmeel of melasse, terwijl anorganische zouten, gistextract, caseïne en soortgelijke toevoegsels geschikte N-bronnen zijn.

Een essentiëel aspect van de uitvinding is dat er 5 gebruik wordt gemaakt van unicellulaire organismen, die op geschikte wijze de toegevoerde voedingsstof of rantsoen fermenteren en in staat zijn in de rumen gedurende lange periode te verblijven, die worden gebruikt voor het modificeren van de rumenflora. Voor de selectie van dergelijke stammen wordt 10 gebruik gemaakt van genetische merkers, zoals boven beschreven, bijv. genen die antibiotische resistentie, enzymprote-inen of andere detecteerbare proteïnen coderen. Er kunnen ook auxotrofe cellen worden gebruikt.

De genetische merker wordt in de cel geïntrodu-15 ceerd met behulp van een vector DNA-molecuul, bijv. via een plasmide of fage, waarbij echter de selecteerbare eigenschappen, bijv. resistentie tegen een antibioticum, gekozen kan worden via spontane selectie.

De geselecteerde stammen, die gunstige fermenta-20 tieve eigenschappen hebben en gedurende lange tijd in de rumen kunnen verblijven, worden gebruikt voor hetzij het bevorderen van de ontwikkeling van rumenflora bij zuigherkauwers, of voor het gunstig modificeren van de samenstelling van de bestaande rumenflora. Aanbevolen wordt het preparaat toe te 25 dienen samen met het voer of drinkwater.

Het voor de bereiding van het onderhavige preparaat gekozen microorganisme wordt gekweekt in media, die een organische koolstofbron, een organische of anorganische stikstofbron en organische en anorganische zouten bevatten, 30 gevolgd door isoleren in een voor orale toediening of voor transport geschikte vorm. Desgewenst wordt de microorganisme-cultuur geformuleerd door het vermengen met vaste of vloeibare dragers of andere toevoegsels. Het preparaat kan worden gemengd met het voer of drinkwater, of het kan als zodanig 35 worden toegediend.

In het geval van schapen wordt van de micro-organismecultuur volgens de uitvinding bijv. 1-20 g, bij voorkeur 5 g, aan ca. 0,5 kg voer toegevoegd. Als voedingsstof 8502260 % - 9 - • * kan bijv. een mengsel van maïsmeel, lucemehooi en rundervoer worden gebruikt, terwijl de werkelijke verhoudingen bepaald kunnen worden met het oog op de actuele condities en de gewenste dagelijkse gewichtstoename. Aan rundvee wordt in het 5 algemeen 10-200 g, bij voorkeur 50 g, van een microorganisme-cultuur volgens de uitvinding per dag toegediend, bijv. vermengd met ca. 5 kg van een conventionele voedingsstof.

De methode van verbeteren van het nuttige effect van de benutting van voer bij herkauwers valt ook binnen het 10 kader van de uitvinding.

Na kweken in vloeibare media, zoals boven vermeld, worden de mieroorganismen via centrifugeren of filtreren afgezonderd. Er kunnen pastas, gevriesdroogde preparaten, of suspensies, die sporen of vegetatieve vormen bevatten, enz.

15 worden bereid, terwijl toevoegsels die aanvaardbaar zijn voor veeteelt en voeding, kunnen worden toegevoegd. Andere toevoegsels, bijv. proteïnen, aminozuren of glycerol kunnen helpen bij het levend houden van het microorganisme. Aan de preparaten volgens de uitvinding, gebruikt voor'het bevorderen van 20 de benutting van het voer bij herkauwers, kunnen andere in de praktijk gewoonlijk gebruikte stoffen worden toegevoegd, bijv. antibiotica, die de groei van het gastdier stimuleren (monensin, nigericin, salynomycin, enz.) of die de persistentie van het toegediende microorganismè bevorderen.

25 De microbische culturen volgens de uitvinding maken derhalve de vorming van een levende microbische cultuur in de rumen mogelijk dan wel de gunstige modificatie van een reeds bestaande flora.

Tijdens de zuigperiode is de rumenflora niet in 30 staat de gebruikelijke voedingsstoffen effectief te fermenteren. De flora ontwikkelt zich spontaan en toevallig en het is geenszins zeker dat zijn samenstelling optimaal is voor het gastdier.

Door de geselecteerde microbische stammen toe te 35 dienen kan in plaats van de langzame en spontane ontwikkeling van de rumenflora een snelle ontwikkeling worden bereikt, terwijl de rumenflora in staat is om het voer optimaal te benutten.

Het voordeel van de onderhavige werkwijze is, dat 8502260 - 10 - ·. * met de op de beschreven wijze bereide microorganismen (bijv. met de stammen 00287, 00288 en 00289) de'snelle aanpassing of ontwikkeling van de rumenflora tijdens voerverandering of afwenning kan worden bevorderd door de ruminale groei van de 5 microorganismen, die in staat zijn optimale afbraak van het voer te bewerkstelligen, te bevorderen.

De werkwijze kan o.a. worden toegepast in de volgende gevallen: - voor melkkoeien tijdens verandering van lactatie 10 aan het eind van het drachtig zijn en tijdens seizoens- en andere veranderingen van het rantsoen; - voor vleesrundvee aan het begin en aan het eind van de graasperiode, bij de verandering van het vet mesten met ruw voer tot een intensieve vetmesting met graanmeel en tij- 15 dens andere veranderingen van groei-vetmestdieet; - voor schapen tijdens de seizoenveranderingen van voer, bij het. begin en aan het eind van de graasperiode en tijdens de aanvang van een intensieve groei en vetmest-periode. .

20 De mogelijkheden zijn ook soortgelijk bij geiten teelt. De volgens de onderhavige werkwijze bereide microbi-sche culturen kunnen ook in diverse speciale gevallen worden gebruikt, bijv. voor in het wild levende herkauwers, in wildreservaten en voor damherten.

25 Opgemerkt wordt, dat ofschoon de microbische cul turen, die in de preparaten volgens de uitvinding kunnen worden gebruikt bij voorkeur van rumenorigine zijn, ook andere azijnzuur en/of propionzuur producerende bacteriën die niet noodzakelijk van de rumen afkomstig zijn, geschikt zijn.

30 Dergelijke bacteriën zijn bepaalde vertegenwoordigers van het genus Angerovibrio (lipolytica), Bacterorden Selenomonas (ruminanticum) en Propionibacteriën.

De uitvinding wordt thans nader toegelicht aan de hand van de volgende niet limitatieve voorbeelden. De berei- 35 ding van microbische stammen, die in staat zijn basisrantsoenen te benutten die in hoofdzaak cellulose (hooi), zetmeel (graanmeel) of sucrose (melasse) bevatten en gedurende lange tijd in de rumen kunnen verblijven, zal nader worden beschre- 3502260 « * -liven. De toepassing van het preparaat is beschreven voor schapen, waarbij echter de omvang van de beschrijving zich uitstrekt tot microorganismen, die in staat zijn te groeien op andere voedingsstoffen en voor de ontwikkeling of modifi-5 catie van de rumenflora van andere herkauwersoorten.

VOORBEELD I

Modificeren van de rumenflora van dieren, die als voer hooi kregen.

a) Isoleren van de microorganismen, die op hooi 10 kunnen groeien.

Schapen werden gelaparatomiseerd, voorzien van rumenfistula en gedurende een maand met hooi gevoerd. Een rumenmonster werd.via de fistula getrokken, verdund en over RGCA vast medium met de volgende samenstelling verspreid: 15 zoutoplossing 1: K2HP04 0,6 g gedestilleerd water ad 100,0 g zoutoplossing 2:

NaCl 1,2 g 20 (NH4)2S04 1,2 g KH2P04 0,6 g

CaCl2 0,12 g

MgS04.7H20 0,25 g gedestilleerd water ad 100,0 ml 25 Resazurin (0,1 % oplossing) 0,1 ml *

Agar (Bacto) 2,5 g

Rumenvloeistof 10,0 ml

Glucose 0,005 g

Cellobiose 0,005 g 30 Cysteine.HCl-monohydraat 0,05 g

Natriumcarbonaat (8 % oplossing) 5,0 g

Gedestilleerd water ad 50,0 ml *) Difco Labs, Detroit, Verenigde Staten van Amerika **) Het monster van rumengehalte werd via diverse lagen gaas 35 gefiltreerd, waarna het filtraat onder kooldioxide bij -20°C werd bewaard.

Voorafgaande aan steriliseren onder C02-gas werd de pH van het medium RGCA ingesteld op 6,8. Steriliseren, 8502230 - 12 - bereiden van het medium en het kweken werden uitgevoerd volgens de methode van Bryant en Burkey (J. Dairy Sci., 36, 205 /1953?).

De rumenvloeistof werd verdund met een steriel 5 mengsel met de volgende samenstelling: zoutoplossing 1 (zie boven) 7,5 ml zoutoplossing 2 (zie boven) 7,5 ml cysteine.HCl-monohydraat 0,05 g

Na2C03 0,3 g 10 resazurine (0,1 % oplossing) 0,1 ml gedestilleerd water ad 100,0 ml

Dit mengsel wordt aangegeven door HB.

De culturen werden geïncubeerd onder anaerobe omstandigheden bij 35°C (zie Atlas of Rumen Microbiology, 15 Ogimoto en Imai, Japan Scientific Societies Press, Tokyo, 1981) gedurende 120 uur, waarna de afzonderlijke clonen in de media werden geïnoculeerd, waarin geëxtraheerd hooi aanwezig was, met de volgende samenstelling: zoutoplossing 1 (zie boven) 15,0 % 20 zoutoplossing 2 (zie boven) 15,0 % resazurine (0,1 % oplossing) 0,1 % •k

Tripton L42 (Oxoid) 15. % * gistextract (Oxoid) 0,5 % •kit rumenvloeistof 10,0 % 25 Na2C03 0,4 % cysteine.HCl-monohydraat 0,05 % •β» ·β* geëxtraheerd hooi 10,0 %

Dit medium wordt genoemd: RGCP-vloeibaar medium.

*) Oxoid Ltd., Londen, Groot-Britannië 30 **) Zie boven ***) Voor de bereiding van geëxtraheerd hooi werden fijn gesneden hooideeltjes gesuspendeerd in water, gekookt en gefiltreerd. Het na het filtreren overgebleven residu werd aan het medium toegevoegd voorafgaande aan sterili-35 seren.

Voorafgaande aan het steriliseren werd de pH van het medium ingesteld op een waarde van 6,5.

Reageerbuizen met daarin 5 ml steriel medium wer- 8502260 - 13 - den geïnoculeerd met de microbische suspensie, die bij afzonderlijke clonen, gekweekt op RGCA vast medium en geïncubeerd onder anaerobe omstandigheden bij 35°C, werd verkregen. De groei werd gecontroleerd met behulp van een microscoop, waar-5 na de culturen werden uitgespreid over RGCA vast medium, terwijl 2,0 % Bacto cellulose werd gebruikt in plaats van het glucose en de cellobiose.

De culturen werden onder anaerobe omstandigheden bij 35°C gedurende 120 uur geïncubeerd, waarna de afzonder-10 lijke clonen, verkregen bij cellen die cellulose hadden gebruikt, werden geïnoculeerd op RGCA medium met daarin cellulose.

Op deze manier kunnen ruminale microorganismen worden verkregen, die in staat zijn op hooi of cellulose te 15 groeien.

b) Genetisch labelen van rumenbacteriën, die op hooi kunnen groeien.

Genetisch labelen werd uitgevoerd met behulp van E. coli pi 011 plasmide, volgens de methode van Siiïion ë.a. 20 (Proc. 8ste North American Rhizobium Conference, Winnipeg,^ Canadat, üniv. of Manitoba Press. 1983) .

De plasmide DNA werd geïsoleerd uit een E. coli cultuur volgens Bimboim en Doly (Nucl. Acid Res. 7, 1513 /19797), gevolgd door oplossen in een waterige oplossing met 25 de volgende componenten: 75 mM CaCl2 5 mM MgCl0 Δ * 10 mM tris.HCl-buffer , pH 7,5 *) tris-(hydroxymethyl)-aminomethaan.hydrochloride.

30 Microben die in staat zijn op hooi te groeien, en die geïsoleerd werden volgens a) van voorbeeld I, werden gekweekt op RGCF-medium en door centrifugeren onder C02 gesepareerd. De cellen werden gesuspendeerd in een waterige oplossing, die per liter de volgende componenten bevatte: 35 75 mM CaCl2 5 mM MgCl2 10 mM tris.HCl-buffer, pH 7,5 1 mM cysteine.HCl-monohydraat 1 mM natriumthiosulfaat 85 02260 - 14 - 9 •••De suspensies dienen 5 x 10 cellen per ml te bevatten. De suspensie werd verdund met hetzelfde volume oplossing van plasmide DNA (0,1 ^ig/ml) , welke suspensie gedurende 60 min. bij 4°C werd geïncubeerd. Dan werd de incubatie gedurende 2 5 min. bij 41°C voortgezet, waarna de cultuur werd uitgespreid over vast medium, dat 500 ^ig/ml kenamycine B bevatte en cellulose als koolstofbron. De cultuur werd gedurende 120 uur bij 35°C onder anaerobe omstandigheden geïncubeerd, terwijl de clonen, die in staat waren te groeien in aanwezigheid van 10 500 jig/ral kanamycine B, werden onderzocht.

Plasmide p1011 draagt genen, die bestand zijn tegen kanamycine en chloramfenicol; bovendien bevat het plasmide replicatieorigine, die de start van replicatie in E. coli-cellen mogelijk maakt. Bij overbrengen in andere bacte-15 riën ten gevolge van het ontbreken van geschikte origine om replicatie mogelijk te maken, werd het plasmide DNA hetzij geëlimineerd, hetzij in het chromosoom ingebouwd (gedeeltelijk of volledig), waarna genetische recombinatie plaatsvond. Eventueel wordt het gen, dat is opgenomen in het chromosoom, 20 uitgedrukt en verleent aan de cellen resistentie tegen kanamycine en chloramfenicol.

Volgens de uitgevoerde proeven werden kanamycine B resistente clonen verkregen met een transformatiefrekwentie -5 van 3 x 10 .

25 Diverse resistente clonen werden geïsoleerd, waarbij de gevoeligheid voor antibiotica van de oorspronke-

R

lijke en kanamycine B resistente (Km ) stammen werd bepaald. De met diverse stammen verkregen resultaten zijn in Tabel A vermeld.

30 3502260

- 15 -TABEL A

Gevoeligheid voor kanamycine B van rumenbacteriën en van genetisch gelabelde stammen en het afbreken van hooi kleinste effectieve concentra- 5 microï:>e tie van kanamycine B, ^ig/ml rumenvloeistof 31 oorspronkelijke stammen 4,0 tot 7,5

R

genetisch gelabelde Km -stammen

Hh-GYOKI—1-8 500 10 -27 250 -91 500 -123 1000 -142 500

Op die manier kunnen microorganismen van ruinen -15 origine worden verkregen, die in staat zijn hooi of cellulose te benutten en te groeien in aanwezigheid van grote hoeveelheden kanamycine B.

De stam Hh-GYOKI-1-123 (KmR) werd uitgespreid over RGCA-medium, dat cellulose bevatte, waarna kanamycine B 20 in concentraties van 1000, 5000 en 10.000 ^ig/ml werd toegevoegd. De culturen werden gedurende 168 uur bij 35°C onder anaerobe omstandigheden geïncubeerd, waarna de stammen die in .aanwezigheid van 10.000 jig/wl antibioticum groeiden, werden geïsoleerd. Zo werden onder spontane selectie spontane rautan-25 ten, die zeer resistent waren tegen kanamycine B, verkregen. Eén van deze stammen werd aangeduid als Hh-GYOKI-1-123Sz en gedeponeerd bij de Hungarian National Collection of Medical Bacteria of the National'Institute of Hygiene, Budapest, onder nummer 00287.

30 c) ReIntroductie van de gelabelde microben in de rumen.

Een steriel vast medium, aangeduid als RGCPa, werd geïnoculeerd met de cultuur van de stam Hh-GYOKI-1-123 15 (Km ), welke werd bewaard op RGCA-"slants" bij +4°C. De samen- 8502260 - 16 - stelling van het RGCA-medium was als volgt: 1. K^HPO^ 0,3 % 45 ml oplossing 2. (NH4)2S04 0,6 %

NaCl 0,6 % 5 MgS04.2H20 0,06 %

CaCl2.2H20 0,06 % KH2P04 0,3 % 45 ml oplossing van het mengsel * 3. cellulose (Bacto) 1,8 % * 10 agar (Bacto) 3,0 % 65 ml oplossing van het mengsel 4. gistextract 0,1 % 20 ml oplossing 5. cysteine.HC1.H20 0,1 % 20 ml oplossing 6. natriumthiosulfaat 0,1 % 15 Na2C02 0,2 % -10 ml oplossing van het mengsel 7. rumenvloeistof 20 ml *) Difco Labs, Detroit, V.S.

**) Zie boven.

20 De 7 oplossingen werden afzonderlijk bereid en in de aangegeven volgorde gemengd.

Het kweken werd uitgevoerd in 500 ml Erlenmeyer-kolven,. die 150 ml medium bevatte onder anaerobe omstandigheden. De groei werd na 48 uur gecontroleerd, waarna de cul-25 tuur werd bijgemengd bij het voer bestemd voor een met hooi gevoerd schaap. 340 ml Van een kweek, die 4,7 x 10 bacteriën per ml bevatte, werd oraal aan het schaap toegediend. Voorafgaande aan de toediening en op de daarop volgende dagen werden via de rumenfistula 50-200 ml monsters genomen. De monsr . 30 ters werden verdund met HB-oplossing en over RGCA-medium, dat geen kanamycine B of andere antibiotica bevatte, uitgespreid. De culturen werden onder anaerobe omstandigheden gedurende 72 uur bij 35°C geïncubeerd, waarna de bacterieclonen werden geteld. De resultaten zijn in Tabel B vermeld.

8502260 - 17 -

TABEL B

Veranderingen van rumenflora bij een schaap behandeld met stam

Hn-GYOKI-1-123 (KmR) cel teil ing/ml 5 in aanwezigheid monster zonder antibiotica van 1000 jig/ml

.;· kanaijrycine B

v66r toediening 5 x 10^ 0 na toediening 10 dag 1 5,9 x 106 2,0 x 104 dag 2 3,2x10^ 4,1x104 dag 3 2,4 x 106 3,1 x 104 dag 6 3,9 x 107 1 ,8 x 104 dag 8 9,8 x 106 1,05 x 105 15 dag 15 8,1 x 105 3,1 x 104 , Uit tabel B blijkt duidelijk dat het aan het dier toegediende microorganisme in de rumen blijft bestaan en groeien.

Volgens de boven genoemde methode werd ook de 20 stam Hh-GYOKI-1-123Sz gekweekt, die resistent was tegen 10.000 jig/ml kanamycine B. Deze stam werd oraal toegediend aan dezelfde schapen op de 15de dag.

O

Hierbij werd 140 ml kweek met daarin 2 x 10 bacteriën per ml oraal toegediend.

25 Bacteriën uit rumenmonsters werden gekweekt en geteld zoals eerder beschreven. De resultaten zijn in tabel C opgenomen.

30

Ss 0 2 2 δ ö - 18 -

TABEL C

Veranderingen in de rumenflora bij een schaap, behandeld met de stam Hh-GYOKI-1-123Sz (KmR) celtelling/ml 5 in aanwezigheid monster zonder antibiotica van 8000 ^ig/ml

kanamycine B

6 vóór toediening 1,4 x 10 0 na toediening 10 dag 1 7,4 x 106 3,2 x 104 dag 2 1,7 x 105 1,3 x 104 dag 5 4,0 x 106 9,1 x 103 dag 7 - 1,1 x 107 2,0 x 104 dag 14 8,0 x 106 3,1 x 104 · 15 dag 21 7,1 x 105 6,2 x 104 dag 28 8,2 x 106 8,1 x 104 dag 35- 8,7 x 106 1 ,8 x 104

De gegevens uit tabel C laten duidelijk zien, dat het toegediende mieroorganisme in de runen in significante 20 hoeveelheden aanwezig is en omdat de vloeistoffase uit het rumengehalte continu wordt verwijderd, het microorganisme zich gemakkelijk vermenigvuldigt.

De verschillen van bacteriëntellingen tussen monsters kan worden verklaard door de variaties van de con-25 sistentie van de rumeninhoud en wel van dik tot vloeistof. VOORBEELD II

Modificatie van de rumenflora bij schapen, die gevoederd werden met graanmeel.

a) Isoleren van microorganismen, die in staat zijn 30 om op graanmeel te groeien.

De onder a) van voorbeeld I beschreven methode werd herhaald met dit verschil, dat het oorspronkelijke monster genomen werd uit de rumen van een schaap, dat gevoed werd met graanmeel, waarna de afzonderlijke isolaten werden 35 geïnoculeerd in RGCF vloeistofmedium (zie boven) met daarin 3502260 * - 19 - 2 % graanmeel, fijn gemaakt in een mortier, in plaats van geëxtraheerd hooi, de in RGCF-vloeistofmedium gekweekte culturen werden uitgespreid over RGCA vast medium (zie boven), waarna de clonen, ontwikkeld uit de cellen, die graanmeel benutten, 5 op hetzelfde medium werden geïsoleerd.

Op die manier werden microorgansimen verkregen, die in staat waren op graanmeel als koolstofbron te groeien.

b) Genetisch labelen van rumenbacteriën, die graanmeel benutten.

10 De onder b) van voorbeeld I beschreven methode werd herhaald met dit verschil, dat de onder a) van voorbeeld II verkregen stammen werden gebruikt voor transformatie door p1011 plasmide DNA, in plaats van die welke werden verkregen bij a) van voorbeeld II.

15 De resistentie tegen kanamycine B van diverse ge- transformeerde Km -stammen is afgebeeld in tabel D.

TABEL D

Gevoeligheid voor kanamycine B van rumenbacteriën en genetisch gelabelde stammen en benutting van graanmeel 20 laagste kanamycine B concentra- microorganismen tie, die de groei belet, ^ig/ml rumenvloeistof 31 oorspronkelijke stammen 1,8 £ genetisch gelabelde Km -stammen 25 Hh-GYOKI-2-4 250 -14Ab 250 -37 250 -81 125

Bij het uitvoeren van de boven genoemde methode 30 werden microben van het rumenorigine verkregen, die in staat waren graanmeel te benutten als koolstofbron en die acht keer meer resistent tegen kanamycine B waren dan de rumenflora.

De stam, aangeduid als Hh-GYOKI-2-14Ab, werd gedeponeerd bij de Hungarian National Collection of Medical 35 Bacteria of the National Institute of Hygiene, Budapest, 8502250 m - 20 - onder nummer 00283.

c) Reïntroductie van genetisch gelabelde micro-organ ismen in de rumen.

De onder c) van voorbeeld I beschreven methode 5 werd herhaald met dit verschil, dat het steriele RGCFa-medium dat in plaats van 1,8 % cellulose (Bacto) 1,8 % zetmeet bevatte, werd geïnoculeerd, met schapenvoer vermengd en waarbij voorafgaande aan de toediening en na de toediening dagelijks via de fistula monsters werden getrokken. Aan de schapen 10 werd normaal 310 ml cultuur, die 7,1 x 10 bacteriën/ml bevatte, toegediend.

TABEL E

Veranderingen in de rumenflora van de schapen, behandeld met de stam Hh-GYOKI-2-14Ab (KmR) 15 celaantal/ml in aanwezigheid monster zonder antibiotica van 250 jiq/ml

. kanamycine B

vóör toediening 4,3x106 1,4x10^ 20 na toediening dag 1 4,1 x 106 1,8 x 103 dag 2 3,2 x 106 2,1 x 103 dag 3 8,0 x 103 1,1 x 103 dag 6 9,1 x 106 7,1 x 102 25 dag 8 8,0 x 106 8,1%x 103 dag 15 6,8 x 106 8,7 x 103 dag 22 5,0 x 106 9,8 x 103 dag 29 8,0 x 106 1,1 x 104 dag 36 9,1 x 106 7,0 x 103 30 dag 43 7,0 x 106 7,9 x 103 dag 60 6,1 x 106 7,0 x 103

De in tabel E vermelde resultaten laten duidelijk zien, dat het toegediende mieroorganisme in de rumen gedurende lange tijd blijft bestaan en zich vermenigvuldigt.

8502260 * Λ - 21 -

VOORBEELD III

Modificeren van de rumenflora bij een schaap, dat met melasse werd gevoederd.

a) Isoleren van mieroorganismen/ die in staat zijn 5 op melasse te groeien,

De onder a) van voorbeeld I beschreven methode werd herhaald met het verschil, dat de oorspronkelijke monsters werden genomen uit een schaap, dat met melasse werd gevoederd, waarna de afzonderlijke isolaten werden geïnocu-10 leerd in een RGCF-medium, dat in plaats van geëxtraheerd hooi glucose bevatte, waarna de in een vloeistofmedium gekweekte culturen werden uitgespreid over een RGCA-medium, terwijl de uit de cellen die melasse benutten, ontstane clonen op hetzelfde RGCA-medium werden gelnoculeerd.

15 Op die manier werden microorganismen van rumen- origine, die melasse benutten, verkregen.

b) Genetisch labelen van bacteriën, die melasse benutten.

De -onder b) van voorbeeld I beschreven methode 20 werd herhaald met dien verstande, dat de cellen, bereid volgens a) van voorbeeld III, werden getransformeerd door p1011-plasmide DNA, in plaats van die, welke werden verkregen volgens a) van voorbeeld I.

De resistentie tegen kanamycine B van diverse £ 25 Km -stammen is afgeheeld in tabel F.

TABEL F

Resistentie tegen kanamycine B van rumenbacteriën en van genetisch gelabelde stammen, die melasse benutten.

30 laagste concentratie van kanamycine microorganismen B die de groei belet rumenvloeistof 31 oorspronkelijke stammen 7,5 T3 genetisch gelabelde Km -stammen 35 Hh-GYOKI-3-2 250 -14 500 -34 250 -81Me 500 -132 500 83TZTT5 :- - 22 -

Op die manier werden isolaten verkregen, die zeer resistent waren tegen kanamycine B en die bovendien melasse benutten.

De als Hh-GYOKI-3-81Me aangegeven stam werd ge-5 deponeerd bij de Hungarian National Collection of Medical Bacteria of the National Institute of Hygiene, Budapest onder nummer 00289.

c) Relntroductie van genetisch gelabelde bacteriën in de rumen.

10 De onder c) van voorbeeld I beschreven methode werd herhaald met dien verstande, dat de stam Hh-GYOKI-3-81Me op een RGCFa-medium, dat in plaats van 1,8 % cellulose 1,8 % glucose bevatte, werd geïnoculeerd, waarna de kweek werd gemengd met het voer voor de schapen, die op melasse werden 7 15 gevoederd. Oraal werd 380 ml van een kweek van 1,6 x 10 bacteriën/ml toegediend. Dagelijks werd via een rumenfistula een monster genomen vöór en na de toediening.

TABEL G

Veranderingen in de rumenflora bij een schaap, behandeld met 20 de stam Hh-GYOKI-3-8iMe (KmR) celaantal/ml in aanwezigheid monster zonder antibiotica van 500 ^ig/ml

kanamycine B

. .....- ' .....

25 vóór toedienting 5,0 x 10 0 na toediening dag 1 1,1 x 106 1,9 x 105 dag 2 1 ,8 x 107 2,5 x 105 dag 3 6,2x106 6,1x105 3 0 dag 6 8,1 x 106 8,7 x 105 dag 8 6,2 x 106 9,1 x 105 dag 15* 1,3 x 101 1,3 x 102 dag 22 3,0 x 106 3,1 x 105 dag 29 1 ,1 x 106 7,0 x 105 35 dag 36 8,0 x 105 9,1 x 104 dag 43 6,1x106 8,1x105 dag 60_6,8 x IQ6_6,4 x 1Q5_ 8502260 - 23 - *) bemonsteringsfout.

Uit de gegevens blijkt, dat hettoegediende micro-organisme gedurende een lange tijd in de rumen van met melasse gevoederde schapen bleef bestaan.

5 VOORBEELD IV

Veranderingen in de verhouding van vluchtige vetzuren ten gevolge van behandeling met het bacteriepreparaat.

Twee schapen werden gevoederd met een compleet 10 rantsoen gedurende 14 dagen, waarbij via een fistula rumen-monsters werden genomen. Van de rumenvloeistof werden 2 liter via diverse lagen gaas gefiltreerd. Het deeltjes bevattende residu werd gesuspendeerd in 1 liter fysiologische buffer (zie onder), gemengd en zoals eerder beschreven gefiltreerd.

15 De twee filtraten werden vermengd en vervolgens liet men ze gedurende een uur staan. De aan het oppervlak drijvende vaste stoffen werden verwijderd, terwijl de vloeistoffase voor het * onderzoek werd gebruikt.

De samenstelling van de fysiologische buffer is 20 als volgt:

Na2HP04 0,316 g/1 KH2P04 0,152 g/1

NaHC03 2,260 g/1 KC1 0,375 g/1 25 NaCl 0,375 g/1

MgS04 0,112 g/1

CaCl2.H20 0,050 g/1

FeS04.7H20 0,008 g/1

MnS04.H20 0,004 g/1 30 ZnS04.7H20 0,004 g/1

CuS04.5H20 0,002 g/1

CoC12.6H20 0,001 g/1 1 5 * 3 0 $ Λ t. t-" ia ^ ^ - 24 -

De pH van het mengsel werd gecontroleerd en desgewenst ingesteld op een waarde van 7,2 met behulp van een waterige HCl- of NaOH-oplossing (Cheng e.a.: J. Dairy Sci.

38, 1225 /19557).

5 Aan het aldus verkregen mengsel werd hetzelfde volume fysiologische buffer toegevoegd, waarna in 1 liter van het verdunde mengsel 4 g van het rantsoen werd gesuspendeerd. Van de suspensie werd telkens 30 ml overgebracht in Erlen-meyerkolven van 100 ml. 200 Doses werden gesteriliseerd en 10 een andere 200 niet.

Steriele media en media, die levende rumenbacte-riën bevatten, werden geïnoculeerd met bacteriestammen, teneinde de produktie van azijnzuur, propionzuur en boterzuur te onderzoeken.

15 Bacteriestammen, die in staat waren in de rumen gedurende lange tijd te blijven bestaan, werden na in vitro te zijn gekweekt onderzocht. Bovendien werden bacteriestammen, geïsoleerd uit de rumenvloeistof van een schaap dat gevoederd werd op een compleet of een ander rantsoen volgens a), b) 20 en c) van voorbeeld I, eveneens onderzocht.

De te onderzoeken bacteriën werden gekweekt op RGC+CG-media (zie onder) onder anaerobe omstandigheden bij 37°C gedurende 48 uur.

Samenstelling van RGC+CG-medium: 25 zoutoplossing 1 (zie a van voorbeeld I) 15 % zoutoplossing 2 (zie a van voorbeeld I) 15 % „ · spore-element oplossing* 0,3 % gistextract (Oxoid) 0,5 % gefiltreerde rumenvloeistof 10,0 % 30 Na2C03 0,4 % cysteine.HCl.H20 0,05 % natriumthiosulfaat 0,008% cellulose (Bacto) 0,3 % glucose 2,0 % 35 *De samenstelling van de spore-elementoplossing:

ZnCl2 40 mg

CuCl2.2H20 10 mg dinatriumtetraboraatdekahydraat 10 mg 8502260 -25- ammoniummolybdenaattetrahydraat 10 mg

FeCl3.6H20 200 mg

MnCl2.4H20 10 mg gedeïoniseerd water ad 1000 ml 5 Culturen werden geïnoculeerd in media, die waren bereid in Erlenmeyerkolven. Er werd telkens 2 ml cultuur ge-inoculeerd in 50 ml medium, in 2 parallelle kolven. Niet-steriele culturen werden eveneens geïnoculeerd.

De kolven werden geïncubeerd onder anaerobe om-10 standigheden gedurende 40 uur. De groei werd gestopt met 10 % mierezuuroplossing, waarna het vluchtige vetzuurgehalte van de culturen werd onderzocht.

De culturen werden gefiltreerd via gaaslagen en vervolgens bij 4000 omw./min. gedurende 15 min. gecentrifu-15 geerd. Dan werden ze wederom gefiltreerd en daarna in een scheidingskolom van een Carlo Erba GI-452 gas-vloeistofchroma tograaf overgebracht, welke kolom was voorzien van een vlam-ionisatiedetector voor het bepalen van de C^-C^-vetzuren. Temperatuur van de kolom: 150°C.

20 Scheidingskolom: 2 *m lang, 4 mm breed (binnen- diameter), glazen buis gevuld met 10 % ethyleenglycoladipaat en 2 % o-fosforzuur op een gesilaneerde silicageldrager (0,2-0,3 mm 25 deeltjesgrootte).

Temperatuur van de injector: 190°C.

Stikstofstroomsnelheid: 50 ml/min.

H2-stroomsnelheid: 50 ml/min.

Stroomsnelheid van de lucht: 200 ml/min.

30 Snelheid van het papier: 160 cm/uur.

Duur van de chromatografie: 20 min.

Monstervolume: 1 jil.

Triplicaatmetingen werden verricht bij elk monster. De standaardoplossing bevatte azijnzuur, propionzuur, 35 isoboterzuur, boterzuur, isovaleriaanzuur en valeriaanzuur.

Uit een schaap, gevoederd op een compleet rantsoen, werden meer dan 90 bacteriestammen geïsoleerd. Daarna 4 2 4 £ δ € --— . .............

- 26 - werden de stammen genetisch gelabeld en onderzocht (de positieve stammen werden diverse keren onderzocht). Representatieve resultaten zijn in tabel H vermeld.

Uitleg van de in tabel H gebruikte symbolen: 5 s : geïnoculeerd na sterilisatie NS: cultuur, die levende rumenflora bevat, werd geïnoculeerd a) sporehoeveelheden; b) negatieve controle: het vluchtig vetzuurgehalte van een medium bereid uit rumenvloeistof, fysiologische buffer en 10 voer, gebruikt voor de proef (gemiddeld 12 metingen); c) positieve controle: vluchtig vetzuurgehalte van de ge-incubeerde cultuur met daarin de initiële rumenbacteriën en overigens op dezelfde wijze bereid (gemiddeld 12 metingen); 15 d) als c) waarbij echter 5 dpm monensin Na aan het medium werd toegevoegd (gemiddeld 6 bepalingen); e) als c) met dien verstande, dat 10 dpm monensin Na aan het medium werd toegevoegd (gemiddeld 6 bepalingen).

20 8502 2 60 - 27 - ^ 3 j j 3 n ï— r·' in ro σ» c-* l -^^0-0- l σι r- μ ^ oj 3ö <r>n'co-tf0j*j<iococor^ir'-in<y>cooco NO » * » » » » I *· ^ ** I H * ' “ *“ ‘ ö -H o o o»- nnl cnt— T- j ooooidcn ii ft \

•HO n H

d ft } J

'a I I

Rj RS rH _ H S-l ë | CTi 1

3 I | IRJI I I Rj o Rj (fl I IRJI I I I

o) p β» ! _* | fl " ^

> ! I

! i ö | | rj

Rj r4 I

5 4 04 ! 1- i CO in m OJdO^ RjtÖflJr-nJ(Öl Rjr-dfdJ Rj'^,(D'“RJ,“ ï N ^ o ίο ! o o o f i 1 *H J j

I

g inOLDOl I <Tc τ- f' I (N rf Λ Ό in <D H ^ cn ιΛ o> m I rocnrfd I fnmrorodd -Udtn k ··>·* rJ Rj I ----l - J* *· *· O 3 pL o O O O | o o o o I o o o o o o Λ N ί · ! x s s j i i ! H H H J |

§ ijs RlRifljRjRjRjl-RjRJdRSjRJRSdRJdRJ

f O J3 O' j f N ^ } 1 •H j j • ^ i !

O i-1 ë Γ*- O CO CO θ' τ- I T— CO t— I O 00 CO t— O' O

•Hd \ to cd w n co co I ο o o o I co co en o -rf o·

ON dl T- 04 O T- O O I O O T- O I v- OJ t- 04 O O

U ^ J * . ! ‘

I I

ü g τ— O 00 ΙΟ τ- r- I r- CO σι CO r· η ο IN

π μ s ο ο en σι μ co I m co co co l en n ^ o rn o

•H d t?l ^ 1 ^ _ ! _ Aj AAI

NSlfNOrNNI r-r-T-r- I r f r r « IN

R! N ^ { | I i o» ! ! d * 1

•Η I (D J

V ï i—i 1 U cncocni 0 i ca en en <D wjscQjztQZi u i en 3 en s en 3 £ ί £ 8* ! § I o

c I I r3 RJ RS

5 | I 00 o r-

jj | | ^ ΙΛ LD

en l i II I *

(ühnhhi | £ 5 S

•h 3 en w λ 3 <d j μ m «

nomocps o O O

ü) >i OJ >4 >H <- I I ÏÏ

+J ο*“0τ-θοοΙΛϋΌβ>Ιϋ O O

O I I I I I I I ‘ L L

d ^ r- ^ N ,ί en I I I I 1 £ β β

,q tu i ffi i d! i i I X W SJ

en ° “2 ° r- ^ v 1 8302280 - 28 - μ ^ β Μ 53 3 N r^cnr'LDOognv-mn

NO

g ·Μ <3<CNCMCMT-CNLnoOO© •o a H 0

N M

nj 0« β

Hj rH

te μ s •H 3 'v. o

MdtnlllllliinJf" <U N JA -

H ^ O

£ β te

!Ö H

•H M S

M d ^ ^ *“ <D d tP (Ö r | I I I I Itd*-H N 1 *·

nj o O

>

(ji -H

iH

O

> l r-\ M MMS <jr»<i>rro\ONin tl) <u d ^ nnncNfnnCNnmin k· -p 3 (ji W ONSLOOOOOOOOOr- Λ

W

J I

W Μ -H

CQ Φ M S

<1 -μ d ^ njfettjtetetenjrtjtete

Eh O d tP

Λ N dL

1 ^ rl β ΓΗ OMS T-cor'Or^T-mvoO'# Η β \ ιηΓ^νο^οοοσν^οονοτ- 0 N 2L OOOOOOOOOt—

M

a β Η OOOCnr"T-CM<J\CMVOn

•|—| MS t— t— fOhf’lO^fOlttlCO

r-l £j \

Nd O1 N ΓΊ r· γ-t— CM CM CM O O

(d N d^ tr> fi

H

Μ ω ω cn ω cn o) cascnscoiscozwis S a o Λ S rö m cm <y> vo

rd in *— cm o CM

+1 til t— t— r- r— 10 I I I I 1

CD Η Η Η Η H

Ή « « W « «

M O O O O O

CU X X X X X

+1 o o o o o

0 1 I I I I

fd ,β Λ Λ Λ Λ Λ X Ε Ε Ε Ε ιη ο ιη Γ“ 8502260 * - 29 -

De gegevens uit tabel H laten zien-, dat de verhoudingen van vluchtige vetzuren, geproduceerd door de fermen-tatieve functie van de rumenflora, over een breed traject kunnen worden gemodificeerd door de toediening van microbi-5 sche culturen, welke zijn bereid volgens de uitvinding. Zo kan bijv. de produktie van propionzuur aanzienlijk worden gestimuleerd met behulp van een cultuur, bereid uit de stam Hh-GYOKI-48a, terwijl de stam Hh-GYOKI-109b de produktie van azijnzuur stimuleert. Het stimuleren van de produktie van 10 afzonderlijke vetzuren werd onderzocht zowel op media waarin geen (S) aanwezig was, als in media die (NS) levende rumen-microben bevatten. Volgens het onderhavige experimentele systeem bleek monensin Na de verhouding van azijnzuur tot propionzuur te doen afnemen met een factor van 0,1 of 0,2 15 (d, e) .

Microorganismen, gekozen volgens de boven genoemde methode, worden genetisch gelabeld, vervolgens aan herkauwers toegediend en op ruminale groei en persistentie onderzocht door herhalen van de onder b) van voorbeeld I be-20 schreven methode. Stammen met een gunstig fermentatief patroon en lange ruminale persistentie werden oraal toegediend teneinde de produktie van vluchtige vetzuren te modificeren.

VOORBEELD V

25 Bacteriepreparaat voor orale toediening aan her kauwers .

De toe te dienen bacteriën werden gekweekt op RGCA+CG-medium (voorbeeld IV) onder anaerobe omstandigheden volgens de boven beschreven methode. Na het kweken werden de 30 cellen door filtreren of centrifugeren afgezonderd. De afgezonderde cellen werden gesuspendeerd in een fysiologische buffer (voorbeeld IV) en vervolgens gevriesdroogd. Het gevriesdroogde bacteriepreparaat werd bewaard, op geschikte wijze geformuleerd en vervolgens oraal aan herkauwers toege-35 diend.

De microorganismen kunnen worden gekweekt op andere gebruikelijke media, bijv. in een medium dat als kool-stofbron glucose en zetmeel, enz. bevat, alsmede anorganische 8502260 V * - 30 - zouten als N-bron.

Het preparaat kan gemakkelijk worden toegediend door het te vermengen met het voer of drinkwater, alleen of samen met andere biologisch werkzame middelen, bijv. anti-5 biotica en vitaminen.

Naast het gevriesdroogde preparaat kunnen evenzeer andere produkten worden bereid. De mieroorganismen kunnen ook worden toegediend na het mengen van de gefiltreerde of gecentrifugeerde bacteriemassa met een geschikte drager of 10 verdunningsmiddel, bijv. CaC03, concentraten, voormengsels of andere voedingsstoffen.

De bacteriestammen worden uit de mieroorganismen gekozen, welke zijn bereid volgens de onderhavige werkwijze en die in staat zijn de rumenflora te modificeren, terwijl 15 hun toe te dienen hoeveelheid afhankelijk is van het rantsoen en de toepassing van het dier. Indien een afname van de azijnzuur- tot propionzuurverhouding gewenst is, kan bijv.

gebruik worden gemaakt van een kweek, bereid uit de stam

Hh-GYOKI-48a, terwijl voor de toename van de verhouding de 20 toediening van de stam Hh-GYOKI-3-81Me aanbeveling verdient.

De bepaling van het vereiste microbencelaantal levert geen moeilijkheden voor de vakman op. Aanbevolen wordt 12 de cellen toe te dienen in een hoeveelheid van 5x10 tot 7 5x10 gekweekte mieroorganismen per ml rumenvloeistof.

25 VOORBEELD VI

Toediening van stammen Hh-GYOKI-48a en Hh-GYOKI- 1-123SZ aan schapen.

Hh-GYOKI-48a-stam wordt gekweekt op RGCA-CG-medium (voorbeeld IV) in twee 5-liter fermentoren (nuttig 30 volume) bij 37°C onder anaerobe omstandigheden. De fermentatie werd ingezet door inoculeren met een 10 ml kweek van soortgelijke samenstelling. Na 48 uur kweken werden de cellen door centrifugeren afgezonderd (5000 omw./min.) terwijl het natte sediment met een gewicht van 58 g voorzichtig werd vermengd 35 met 4 kg maismeel. Het mengsel werd verdeeld in 8 gelijke delen en vervolgens oraal toegediend aan 8 schapen, die tevoren gedurende 24 uur nuchter waren. Stam Hh-GYOLI-1-123Sz kan evenzeer worden gebruikt bij een bacterie-oogst van 53 g.

8502 2 60 - 31 -

Bij een·groei-vetmestexperiment werden 23 schapen ad libitum* gevoederd met slecht grashooi, waarbij de dieren iedere week gedurende 5 weken werden gewogen. De experimentele groepen, bestaande uit 8 schapen, werden gevoederd met behulp 5 van één van de bacteriepreparaten, elk voor een enkele voeding terwijl 7 schapen dienden als controle. Er werd 600 tot 900 g hooi per dag per dier geconsumeerd, terwijl het mineralen- en vitaminenvoormengsel met het maismeel werd vermengd (100 g).

De resultaten zijn in tabel I vermeld.

1° TABEL I

Gewichtstoename bij schapen, ad libitum gevoederd met grashooi serie- aanvankelijk 1ste 2de 3de 4de 5de nummer gewicht week controle 15 1 29,0 29,5 30,0 29,5 29,5 29,5 2 27,0 27,5 28,5 27,0 26,5 ' 28,0 3 28,5 27,0 27,0 27,5 26,5 26,5 4 30,0 30,5 30,0 30,5 30,0 29,0 5 29,5 30,0 29,0 30,5 29,5 30,0 20 6 25,0 25,5 26,5 26,0 26,0 27,5 7 27,0 27,0 27,5 28,0 28,0 28,0

Behandeld met de stam Hh-GYOKI-1-123Sz 8 29,5 32,0 32,5 33,0 33,5 34,0 9 25,5 26,5 27,0 28,5 29,5 29,0 25 10 25,0 25,5 25,0 28,0 29,0 28,5 11 25,5 24,5 25,5 27,5 27,0 28,0 12 29,0 28,0 29,0 28,5 29,0 30,0 13 29,5 30,0 30,5 29,5 29,5 30,5 14 29,5 28,5 29,5 30,0 30,5 31,0 30 15 28,5 29,0 30,5 30,0 30,5 32,0

Behandeld met stam Hh-GYOKI-48a 16 29,5 30,0 30,5 31,0 32,0 33,5.

17 26,5 25,0 26,5 27,0 29,0 30,0 18 27,0 27,5 28,5 29,5 30,5 31,0 35 19 26,0 26,0 27,0 28,0 29,0 30,5 20 29,5 30,5 31,0 31,5 32,5 33,0 8502260 r» k - 32 - TABEL I (vervolg) serie- aanvankelijk 1ste 2de 3de 4de 5de nummer gedicht week controle 5 21 28,0 28,0 28,0 29,0 29,0 30,0 22 29,0 30,5 33,2 30,0 32,8 33,5 23 27,0 26,0 27,5 29,0 31,0 32,0

De gemiddelde dagelijkse gewichtstoename werd berekend uit de in tabel I vermelde gegevens en is weergege-10 ven in tabel J.

TABEL J

Gemiddeld gewicht en dagelijkse gewichtstoename van experimentele en controleschapen.

aanvankelijk 1ste 2de 3de 4de 5de 15 gewicht week· controle gemiddeld lichaamsgewicht (kg) 28,00 28,14 28,36 28,43 28,00 28,36 gemiddelde dagelijkse 20 gewichtstoename (g) +20 +31 +10 -61 -51 behandeld met de stam Hh-GYOKI-1-123Sz gemiddeld lichaamsgewicht (kg) 27,75 28,00 28,69 29 ,31 29,81 30,37 gemiddelde dagelijkse 25 gewichtstoename (g) +31 +86 +77 +62 +70 behandeld met de stam Hh-GYOKI-48a gemiddeld lichaamsgewicht (kg) 27,81 27,94 29,02 29,37 30,73 31,69 gemiddelde dagelijkse 30 gewichtstoename (g) +16 +135 +44 +170 +120

Schapen, behandeld met de stammen Hh-GYOKI-1-123Sz en Hh-GYOKI-48a en de controlegroep namen bij het slechte rantsoen gemiddeld 2620, 3875 en 360 g resp. in gewicht toe tijdens het 35 dagen durende experiment: 8502260 4 - 33 -

De oorspronkelijke lichaamsgewichten vertoonden geen significante verschillen tussen de groepen, waarbij echter wel significante verschillen waren waar te nemen bij de eindlichaamsgewichten (tabel K) en in de dagelijkse ge-5 wichtstoenamen (tabel L) .

TABEL K

Statistische evaluatie van de eindlichaamsgewichten.

controle Hh-GYOKI-1-123Sz Hh-GYOKI-48a gemiddeld (kg) 28,357 30,375 31,6875 10 gecorrigeerd kwadraat van de standaarddeviatie 1,476 3,910 2,281 p (%) <5,0 < 0,1

TABEL L

15 Statistische evaluatie van de lichaamsgewichtstoenamen..

(5 weken) controle Hh-GYOKI-1-123Sz Hh-GYOKI-48a aantal dieren 78 8 totale gewichts-20 toename van de groep (kg) 2,5 21,0 31,0 maximumgewichts- toename (kg) 2,5 4,5 5,0 minimumgewichts- 25 toename (kg) -2,0 1,0 2,0 gemiddelde gewichts-toename per schaap (kg) 0,3571 2,6250 3,8750 gecorrigeerd kwa-30 draat van de standaarddeviatie 2,143 1,768 0,839 standaarddeviatie ±1,355 ±1,244 ±0,857

De gegevens laten zien dat de volgens de uitvinding bereide preparaten de gewichtstoename bij schapen 35 merkbaar kunnen stimuleren.

8502260 - 34 -

VOORBEELD IX

Persistentie van genetisch gelabelde bacteriën in de runderrumen.

De onder c) van voorbeeld I beschreven methode 5 werd herhaald met dien verstande, dat de stam Hh-GYOKI-1-123Sz, resistent tegen 10.000 ^ig/ml kanamycine, werd gekweekt in 4 1 RGCFa-medium. Na het bereiken van de stationaire fase (38ste uur) werd de kweek geoogst door centrifugeren (5000 omw./min.), waarna de cellen grondig werden vermengd met 500 g 10 maismeel en vervolgens aan koeien toegediend. Wekelijks werden er monsters genomen via een fistula en de ruminale persistentie van de toegediende stam werd bepaald volgens c) van voorbeeld I.

Uit de gevonden resultaten is gebleken, dat de 15 stam Hh-GYOKI-1-123Sz in de runderrumen groeit en daarin gedurende tenminste 40 dagen kan persisteren.

20 850 2 2 60

Claims (12)

1. Preparaat voor het verbeteren van het nuttige effect van de benutting van voer door herkauwers, met het kenmerk, dat het preparaat als werkzaam be- 5 standdeel één of meer microbische culturen bevat, welke in staat zijn de gewichtsverhouding van azijnzuur tot propionzuur af te stellen op een optimale waarde van 1,5-4,0 : 1 en in de rumen te groeien en daarin te persisteren gedurende tenminste 50 dagen, eventueel vermengd met dragers, verdunningsmiddelen, 10 conserveermiddelen, die gewoonlijk in de veeteelt worden gebruikt en voedingsstoffen en/of andere stoffen, die gewoonlijk aan herkauwers worden toegediend.

2. Preparaat volgens conclusie 1, met het kenmerk , dat het maximaal 95 gew.% van het werkzame 15 bestanddeel bevat.

3. Preparaat volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat het preparaat een microbische cultuur bevat, die in staat is de azijnzuur- tot propionzuur-verhouding in de rumen af te stellen op 2,0-3,5 : 1.

4. Preparaat volgens een der voorgaande conclu sies 1-3, met het kenmerk, dat als microbische cultuur één of meer van de microorganismen, welke zijn gedeponeerd bij de Hungarian National Collection of Medical Bacteria of the National Institute of Hygiene, onder de 25 nummers 00287, 00288 en 00289, bevat.

5. Preparaat volgens een der voorgaande conclusies 1-4, in de vorm van een microorganismepasta, een gevriesdroogd preparaat of een suspensie.

6. Werkwijze voor de bereiding van microbische 30 culturen voor gebruik als werkzaam bestanddeel in een preparaat volgens een der voorgaande conclusies 1-5, m e t het kenmerk, dat uit de rumen van dieren, die gevoederd worden met een bepaalde voedingsstof of bepaald rantsoen, monsters worden genomen, 35 waarbij het metabolisme van microorganismen, geïsoleerd uit het monster, in vitro en/of in vivo wordt onderzocht en de miesoorganismen met gunstige metabolische eigenschappen worden gekweekt in een medium, dat als kool- 85 02 2 50 - 36 - stof- of stikstofbron dezelfde voedingstof of hetzelfde rantsoen bevat, in de groeiende microorganismen een genetische merker wordt geïntroduceerd, die de selectie mogelijk maakt, 5 de genetisch gelabelde stammen worden gekweekt, de culturen opnieuw in de rumen van de dieren, die dezelfde voedingsstof of hetzelfde rantsoen kregen toegediend, worden geïntroduceerd, uit de rumen monsters worden genomen, 10 het celgetal van de genetisch gelabelde stam wordt geteld, de stammen, die gedurende tenminste 60 dagen persisteren en die de azijnzuur- tot propionzuurverhouding op een optimale waarde van 1,5-4,0 : 1 afstellen, worden af-15 gezonderd en deze stammen desgewenst worden geformuleerd in een voor de praktijk van de veeteelt en voeding accepteerbare vorm.

7. Werkwijze volgens conclusie 6, met het 20 ken merk, dat de antibiotische resistentie wordt gebruikt als genetische merker.

8. Werkwijze volgens conclusie 6 of 7, met het kenmerk, dat de microorganismen uit de rumen van dieren, gevoederd op een cellulose bevattende voedings- 25 stof, bij voorkeur hooi, een zetmeel bevattende voedingsstof, bij voorkeur droog voeder of een mono- en/of disaccharide bevattende voedingsstof, bij voorkeur melasse, worden geïsoleerd en de genetisch gelabelde stammen opnieuw in de rumen van de dieren, gevoederd met één van de boven genoemde voe-30 dingsstoffen, worden geïntroduceerd voor het onderzoeken, de geschikte microbische culturen worden gekweekt en geïsoleerd en de verkregen culturen desgewenst worden geformuleerd in een geschikte vorm.

9. Werkwijze volgens een der voorgaande conclu-35 sies 6-8, met het kenmerk, dat de micro- organismecellen in een gevriesdroogde vorm worden afgezonderd.

10. Werkwijze voor de bereiding van een preparaat voor het verbeteren van het nuttige effect van de benut- 8502260 - 37 - ting van het voer door herkauwers, met het kenmerk , dat de microbische culturen, bereid volgens een der voorgaande conclusies 6-9, alleen of eventueel vermengd met dragers, verdunningsmiddelen, conserveermiddelen, 5 die gewoonlijk in de veeteelt worden gebruikt en voedingsstoffen en/of andere stoffen, die gewoonlijk aan herkauwers worden toegediend, worden geformuleerd tot een oraal preparaat.

11. Werkwij ze voor het verbeteren van het nut-10 tige effect van de benutting van voer voor herkauwers, met het kenmerk, dat aan de dieren een effectieve hoeveelheid van éën of meer microbische culturen wordt toegediend, die in staat zijn de azijnzuur- tot propionzuurverhou-ding tot een optimale waarde van 1,5-4,0 : 1 af te stemmen en 15 in de rumen te groeien en daarin te persisteren gedurende tenminste 60 dagen.

12. Werkwij ze volgens conclusie 11, met het kenmerk, dat als microbische cultuur één of meer vertegenwoordigers van de groep van de microorganisme- 20 stammen, welke zijn gedeponeerd bij de Hungarian National Collection of Medical Bacteria of the National Institute of Hygiene onder de nummers 00287, 00288 en 00289, worden gebruikt. 25 8502260