CH676189A5 - - Google Patents

Description

  
 



  Die Erfindung betrifft ein Präparat zur Verbesserung der Futterverwertung von Wiederkäuern, welches gegebenenfalls neben in der Tierhaltung und Fütterung üblichen Trägerstoffen, Verdünnungs- und/oder Konservierungsmitteln und/oder anderen üblichen Stoffen, die Wiederkäuern gegeben, als Wirkstoff eine oder mehrere Mikroorganismenkulturen enthält, die das Gewichtsverhältnis der im Pansen produzierten Essigsäure und Propionsäure auf einen Optimalwert, auf einen Bereich von 1,5-4,0:1, einstellen und fähig sind, im Magen mindestens 60 Tage lang am Leben zu bleiben und sich zu vermehren. Gegenstand der Erfindung ist weiterhin die Herstellung der als Wirkstoff der Präparate verwendeten Mikroorganismenkulturen und die Anwendung der Präparate. 



  Die Tiere mit zusammengesetztem Magen, wie Schaf (Ovis aries aries), Rind (Bos primigenius taurus), Ziege (Capra hircus) bzw. ihre wild lebenden Verwandten (Hirsch, Reh, Mufflon usw.) spielen als Pflanzenfresser eine unentbehrliche Rolle in der Ernährungskette. Sie haben grosse wirtschaftliche Bedeutung, da sie auch Futter verwerten können, das für andere Arten nicht nutzbar ist. Diese Tiere bauen in ihrem mehrteiligen Magen mittels ihrer eigenen, grösstenteils auf dem Metabolismus von Mikroorganismen basierenden Verdauungsvorgänge aus pflanzlichen Stoffen vollwertige Nahrung auf. Die im Magen unter anaeroben Bedingungen lebenden Mikroorganismen, die Pansenflora, passt sich dem Futter an, das man dem Tier über längere Zeit verfüttert. So, wie sich die Qualität und Zusammensetzung des verzehrten Futters ändern, ändert sich auch die Pansenflora.

  Die Veränderung der Pansenflora geht jedoch langsam vor sich, sie stabilisiert sich nach einer Futterver änderung erst nach Wochen. Dies beeinflusst die Fleisch- und Milchproduktion ungünstig, ausserdem wird ein Teil des aufgenommenen Futters unverdaut oder in nicht völlig aufgeschlossener Form wieder ausgeschieden. Bei schneller, rücksichtsloser Futterumstellung ist die Wirkung noch stärker, die Umstellung kann das Verenden, Erkranken des Tieres zur Folge haben. 



  Es ist weiterhin bekannt, dass sich im Wiederkäuerpansen pro Milliliter mehrere Millionen verschiedener Bakterien vermehren. Der unter anaeroben Bedingungen stattfindende Metabolismus der Bakterien ist unter dem Aspekt der geregelten Verdauung und Nahrungsaufnahme des Tieres von grundlegender Wichtigkeit. Die in den Pansen gelangende Nahrung wird von den einzelligen Mikroorganismen in für das Tier verwertbare Verbindungen, z.B. in Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure usw., zerlegt. Die aus dem Pansen weitergelangende Biomasse findet dagegen an anderen Stellen des Verdauungstraktes, z.B. als Eiweissquelle, Verwendung. Für die Milchproduktion und die Fleischausbeute ist die Versorgung mit Essigsäure und Propionsäure bzw. das Verhältnis dieser beiden Verbindungen zueinander von grundlegender Wichtigkeit. 



  Deshalb haben die sich im Wiederkäuerpansen vermehrenden Mikroorganismen eine sehr grosse Bedeutung im Leben des Tieres und sind daher in der Haltung von Nutztieren mit zusammengesetztem Magen von entscheidender Bedeutung. Die Mikroorganismenflora des Pansens bildet sich nach der Geburt spontan aus den in der aufgenommenen Nahrung bzw. im Trinkwasser enthaltenen Einzellern heraus und erfüllt dann in stabilisierter Form ihre Funktion. Es ist jedoch keineswegs sicher, dass die zufällig entstandene Mikroorganismenkultur mit der bestmöglichen Wirksamkeit arbeitet. Es wäre vorteilhaft, wenn ein Verfahren zur Verfügung stände, das eine vom wirtschaftlichen Standpunkt aus vorteilhafte Herausbildung und Beeinflussung der im Wiederkäuerpansen lebenden  Mikroorganismenkultur ermöglicht. 



  Die Erhöhung der Produktion von flüchtigen Fettsäuren innerhalb des Pansens und dadurch die Steigerung der Futterverwertung, letztendlich jedoch der Milchproduktion oder der Fleischausbeute, ist seit langem angestrebtes Ziel. Auf diesem Gebiet wurden bisher mit dem als Coccodiostatikum verwendeten Monensin bestimmte Ergebnisse erzielt (siehe US Patentschrift Nr. 4 085 255). Es laufen Versuche mit anderen, dem Monensin verwandten Polyätherverbindungen, zum Beispiel mit Salinomycin, Lasalocid usw., ferner mit Phthalid-Derivaten (US Patentschrift Nr. 4 333 923) und auch mit Glykopeptiden, wie mit Avoparcin, Actaplanin usw. (Ingle und Mitarb., Abstr. Am. Soc. Anim. Sci. 424/1978/).

  Die erreichten Wirkungen weichen jedoch bei verschiedenen Futtermitteln stark voneinander ab und sind alles in allem nicht von Bedeutung (Chalupa, W., Chemical control of rumen microbial metabolism, Digestive Physiology and Metabolism in Ruminants, MTP Press, Lancester, England, 1980 und Chalupa, W. und Mitarb.: Manipulating rumen fermentation with monensin and amicloral, Abstr. Am. Soc. Anim. Sci., 410/1978/). 



  Ein Verfahren, mit dem direkt durch Beeinflussung der im Wiederkäuerpansen lebenden Mikroorganismenkultur Ergebnisse erzielt werden, ist bis zum heutigen Tage nicht bekannt. 



  In eigenen Versuchen wurde nun festgestellt, dass zur Isolation von Mikroorganismen, die sich in einem gegebenen Futter vermehren und vorteilhaft metabolisieren, die genetischen (gentechnologischen) Rekombinationsmethoden erfolgreich angewendet werden können. Diese Methoden ermöglichen, dass praktisch jeder beliebige Mikroroganismus mit einem genetischen Marker versehen werden kann, auf Grund dessen der betreffende Mikroorganismus neben anderen Mikroorganismen selektiv bestimmt werden kann. Der genetische Marker kann z.B. ein  Gen sein, das die Resistenz gegenüber einem Antibiotikum bestimmt.

  Zum Zweck der vom gegebenen Futter abhängigen, vorteilhaften  Herausbildung der Mikroorganismenkultur des Pansens werden aus dem Pansen von Tieren mit zusammengesetztem Magen Mikroorganismen isoliert, die einzelnen Stämme genetisch gekennzeichnet, dann nach Anlegen einer Kultur in den Pansen zurückgebracht und ihr Vorhandensein durch von dort entnommene Proben unter selektiven Bedingungen bestimmt. Dabei wurde gefunden, dass ein Teil der isolierten, in verschiedenen Tierfuttern in vitro fortpflanzungsfähigen und mit einem vorteilhaften Metabolismus ausgestatteten Bakterien überraschenderweise auch im Pansen des Tieres unter Verwertung des gegebenen Futters über lange Zeit die Fähigkeit zur Fortpflanzung und Erhaltung besitzt. Dadurch wird die Verdauung der Tiere und auf diese Weise die Futterverwertung günstig beeinflusst. 



   Gegenstand der Erfindung ist demnach ein Präparat zur Verbesserung der Futterverwertung von Wiederkäuern, welches gegebenenfalls neben in der Tierhaltung und Fütterung üblichen Trägerstoffen, Verdünnungs- und/oder Konservierungsmitteln und/oder anderen üblichen Stoffen, die an Wiederkäuer verfüttert werden, als Wirkstoff eine oder mehrere Mikroorganismenkulturen enthält, die das Gewichtsverhältnis der im Pansen produzierten Essigsäure und Propionsäure auf einen Optimalwert, auf einen Bereich von 1,5-4,0:1, einstellen und fähig sind, im Pansen mindestens 60 Tage lang am Leben zu bleiben und sich zu vermehren. 



  Wenn die Präparate zur Erhöhung der Fleischausbeute der Wiederkäuer verwendet werden sollen, ist es vorteilhaft, als Wirkstoff Mikroorganismenkulturen zu verwenden, die das Verhältnis Essigsäure:Propionsäure auf einen Bereich von 1,0-3,5:1, z.B. auf einen Wert von 2:1, einstellen können. Für die Milchproduktion beträgt der Optimalwert des Essigsäure:Propionsäure- Verhältnisses etwa 3,0:1, während der Wert bei der Aufzucht von Färsen 2,0-3,0:1 beträgt. Deshalb ist es vorteilhaft, für den jeweiligen Zweck Präparate zu verwenden, die Mikroorganismenkulturen enthalten, welche das Essigsäure:Propionsäure-Verhältnis auf den jeweils gewünschten Wert einstellen können.

  In der Fachliteratur gibt es im Zusammenhang mit dem Essigsäure:Propionsäure-Verhältnis noch Unklarheiten, die Wahl des vorteilhaftesten Verhältnisses ist Aufgabe des Fachmannes und hängt von der Art des Wiederkäuers, vom verwendeten Futter und anderen ähnlichen Faktoren ab. (Fachliteratur dazu siehe: Kaufmann, W., Rohr, K.: Der Einfluss des Futters auf die bakterielle Fermentation im Vormägen, Handbuch der Tierernährung, S. 263, 1969, Parey, Hamburg, Berlin). 



  Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von Mikroorganismen, die den Wirkstoff der obigen Präparate bilden. Das Verfahren besteht darin, dass
 aus dem Pansen der mit dem jeweiligen Futter gefütterten Tiere eine Probe genommen,
 der Stoffwechsel der aus der Probe isolierten Mikroorganismen in vitro und/oder in vivo untersucht und von den vorteilhaft metabolisierenden Mikroorganismen auf einem Nährboden, der das jeweilige Futter als Kohlenstoff- oder Stickstoffquelle enthält, eine Kultur angelegt wird,
 in die wachsenden Zellen Selektion ermöglichende genetische Marker eingeschleust werden,
 die genetisch markierten Stämme gezüchtet und
 die Kulturen in den Pasen der mit dem jeweiligen Futter ernährten Tiere zurückgebracht werden. 



  Aus den Pansen werden von Zeit zu Zeit Proben genommen, und die Zahl der genetisch markierten Mirkoorganismen wird bestimmt, dann werden diejenigen Stämme, die mindestens 60 Tage am Leben bleiben und das Gewichtsverhältnis von Essigsäure und Propionsäure auf  einen Bereich von 1,5-4,0:1, einstellen können, isoliert, und gewünschtenfalls nach Anlegen einer Kultur in einer vom Standpunkt der Tierzucht und Fütterung aus verträglichen Form formuliert. 



  Nach einer vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens werden aus dem Pansen von mit Heu, Hafer und Melasse gefütterten Tieren durch eine dorthin operierte Fistel Proben genommen, und die die Pansenbakterien enthaltenden Kulturen werden auf einem festen Nährboden, der eine Stickstoffquelle, Kohlenstoffquelle, anorganische Salze, Pansenflüssigkeit und Agar (Bryant und Burkey, J. Dairy Sci., 36, 205/1953/) enthält, selektiert. Die Kulturen werden unter anaeroben Bedingungen inkubiert, dann werden die getrennt aufwachsenden Kolonien auf Nährböden ähnlicher Zusammensetzung isoliert und gezüchtet. 



  Mit den ausgewachsenen Kulturen werden flüssige Nährböden, die eine Stickstoffquelle, anorganische Salze, Pansenflüssigkeit, weiterhin als Kohlenstoffquelle Heu oder Cellulose bzw. Hafer oder Melasse enthalten, geimpft. Unter anaeroben Bedingungen wird so lange inkubiert, bis auf den Nährböden ein intensives Wachstum zu beobachten ist. 



  Die an als Kohlenstoffquelle Heu (Cellulose), Getreide (Stärke) bzw. Melasse (Saccharose) enthaltenden Medien wachstumfähigen Zellen werden nach Selektieren und Anlegen einer Kultur auf einem festen Nährboden mit der obigen Zusammensetzung - als Kohlenstoffquelle Cellulose bzw. im Falle der in Gegenwart von Getreide und Melasse gewachsenen Zellen Glucose oder Saccharose enthaltend - isoliert. 



  Die so erhaltenen Kulturen werden genetisch markiert. Als Markierung kann ein beliebiger, sich vererbender genetischer Marker verwendet werden, der den Nachweis der gekennzeichneten Mikroorganismen unter anderen Einzellern ermöglicht. 



  Nach einer weiteren vorteilhaften Ausführungs form des erfindungsgemässen Verfahrens werden resistenzbestimmende Gene in die ausgewählten Zellen gebracht. Wenn die im Pansen lebenden Bakterien einem bestimmten Antibiotikum gegenüber empfindlich sind und dem gleichen Antibiotikum gegenüber resistente Bakterien unter sie gebracht werden, können die Vermehrung und das Absterben dieser letzteren Mikroorganismen gut verfolgt werden, indem die Proben auf einem das betreffende Antibiotikum enhaltenden Nährboden selektiert werden. In diesem Fall werden nur die resistenten Zellen wachsen. 



  In die ausgewählten, auf Cellulose, Getreideprodukten bzw. Melasse wachstumfähigen Kulturen gibt man auf dem Wege der Transformation (Bergmans und Mitarb., J. Bacteriol., 146, 564/1931/) Plasmid p1011, das die Resistenz gegenüber den Antibiotika Kanamycin und Chloramphenicol bestimmende Gene trägt (Simon und Mitarb., Proc. of the 8th North American Rhizobium Conference, Winnipeg, Canada, Univ. of Manitobe Press, /1983/). Die Plasmid-DNS wurde aus Zellen von Escherichia coli isoliert (Birnboim und Doly, Nucl. Acids. Res., 7 1513/179/). Der Stamm wurde am 19. April 1983 unter der Nummer NCAIM B/P/000264 beim National Collection of Agricultural and Industrial Microoganisms, H-1502 Budapest deponiert. 



  Nach der Transformation der DNS, die die Antibiotikaresistenz bestimmenden Gene enthält, werden die Zellen, welche die neue genetische Information stabil enthalten und exprimieren, auf einem festen Nährboden von obiger Zusammensetzung, der mit Kanamycin ergänzt wurde, selektiert. Die resistenten Stämme werden gespeichert. 



   Mit den isolierten und gespeicherten Kulturen wird ein Nährboden beimpft, der eine Stickstoffquelle, anorganische Salze, Pansenflüssigkeit und die für eine halbfeste Konsitenz notwendige Agarmenge, weiterhin als Kohlenstoffquelle Cellulose bzw. Glucose enthält, und die Kultur wird unter anaeroben Bedingungen 2-6 Tage  lang inkubiert. Die ausgewachsenen Kulturen werden unter das Futter von einen Tag lang nicht gefütterten Schafen gemischt und den Tieren verfüttert. Vor dem Füttern, danach täglich wird eine Probe aus dem Pansen entnommen. Die Proben werden auf einem festen Nährboden von obiger Zusammensetzung, der durch Kanamycin ergänzt wurde, selektiert, und es wird die Zahl der im Magen lebenden, gegenüber Antibiotika empfindlichen bzw. resistenten MIkroorganismuszellen bestimmt.

  Weiterhin werden Art und Menge der während der metabolischen Vorgänge der Mikroorganismen im Pansen entstehenden flüchtigen Fettsäuren bestimmt. Es ist bekannt, dass das Verhältnis dieser zueinander die Futterverwertung der Wiederkäuer beeinflusst (Eskeland und Mitarb., J. An. Sci., 33, 282/1971/ und Church und Mitarbeiter, Digestive Physiology and Nutrition of Ruminants, Band 2, S. 622-625/1971/). Wie bereits erwähnt, ist das gewünschte Verhältnis Essigsäure:Propionsäure bei der Mast 2,0-3,5:1, z.B. 2:1, bei der Milchproduktion etwa 3:1, im Falle normaler Tierhaltung, Trächtigkeit etwa 4:1. 



  Nach einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung werden diese Bestimmungen durchgeführt, indem man aus der dem Pansen entnommenen Probe Bakterien isoliert und die Fähigkeit der einzelnen Isolate zur Biosynthese der flüchtigen Fettsäuren untersucht. Auf einem mit durch das jeweilige Futter ergänzten, Pansenflüssigkeit enthaltenden kompletten Nährboden wird unter anaeroben Bedingungen eine Mikroorganismenkultur angelegt, dann wird mittels gaschromatographischer Analyse die Essigsäure-, Propionsäure- und Buttersäurekonzentration der Kultur bestimmt. Die Mikroorganismuszellen, die die genannten organischen Säuren in einem vorteilhaften Verhältnis produzieren, werden genetisch markiert, dann wird ihre Vermehrung im Wiederkäuerpansen untersucht. 



  Die Stämme, die mindestens 60 Tage lang im Pansen des mit dem jeweiligen Futter gefütterten Tieres teilungsfähig sind und den Abbau der im Futter enthaltenen Kohlehydrate zu Essigsäure, Propionsäure und Buttersäure günstig beeinflussen, werden ausgewählt, gezüchtet, getrennt, konserviert, gespeichert, und ihre Kulturen können gewünschtenfalls, in eine für die Tierzucht anehmbare Form gebracht, den Wiederkäuern zum Zwecke einer günstigen Herausbildung und Beeinflussung der Pansenflora oral verabreicht werden. 



  Drei Stämme, die im Pansen von mit Heu, Getreide bzw. Melasse gefütterten Tieren forpflanzungsfähig sind und über lange Zeit am Leben blieben und die Verdauung günstig beeinflussen (mit Hh-GYOKI-1-123Sz, Hh-GYOKI-2-14Ab bzw. Hh-GYOKI-3-81Me bezeichnet), wurden am 26. Juni 1984 unter den Nrn. NCAIM B/P/000287, NCAIM B/P/000288 und NCAIM B/P/000289 beim National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, H-1502 Budapest, POB 53 deponiert. 



  Das Anlegen einer aus dem Pansen stammenden Mikroorganismenkultur erfolgt im Sinne der Erfindung auf Nährböden, die eine Kohlenstoff- und Stickstoffquelle, anorganische Salze, den entsprechenden reduzierten Zustand des Nährbodens gewährleistende Salze und die aus unbekannten Gründen für die Zellteilung von Fall zu Fall unentbehrliche Pansenflüssigkeit enthalten, unter anaeroben Bedingungen, unter Ausschluss von Sauerstoff, vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen 32 DEG C und 37 DEG C. Als Kohlenstoffquelle werden vorzugsweise z.B. Glucose, Cellulose oder diese als Metaboliten bildende andere Zuschlagstoffe, z.B. Heu, Getreide oder Melasse, verwendet. Als Stickstoffquelle können anorganische Salze oder organische Stoffe z.B. Hefeextrakt, Casein oder ähnliches zum Nährboden gegeben werden. 



  Ein wesentlicher Punkt des erfindungsgemässen Verfahrens ist, dass für die Beeinflussung der Pansenflora der Wiederkäuer Einzeller verwendet werden,  die ein bestimmtes Futter vorteilhaft metabolisieren können und unter den Verhältnissen des Pansens lange Zeit lebensfähig bleiben. Für die Auswahl solcher Bakterien werden, wie schon erwähnt, für Selektionen geeignete genetische Marker verwendet. Ein derartiger genetischer Marker kann z.B. eine Resistenz gegenüber einem Antibiotikum kodierendes Gen sein, aber es kann auch ein Gen sein, das z.B. ein beliebiges Enzym oder ein biologisch inaktives, aber durch eine Reaktion nachweisbares Eiweiss exprimiert. Es können auch auxotrophe Zellen verwendet werden. 



  Der genetische Marker wird mit Hilfe eines Vektor-DNS-Moleküls, z.B. mit einem Plasmid oder einem Phagen, in die Zelle eingeführt, aber auch durch spontane Selektion kann eine bestimmte selektierbare Eigenschaft, z.B. Antibiotikaresistenz, ausgelöst werden. 



  Die ausgewählte, im Pansen eines Wiederkäuers vorteilhaft metabolisierende und dort lange Zeit aus Leben bleibende Kultur kann dem Tier zur Herausbildung der Pansenflora nach der Geburt oder zur günstigen Beeinflussung der im Pansen von Tieren mit bereits ausgebildeter Pansenflora lebenden Mikroorganismenzusammensetzung in Form eines zweckmässigen Präparates oral verabreicht werden. Es ist zweckmässig, das Präparat zusammen mit dem Futter oder Trinkwasser zu verabreichen. 



  Zur Herstellung der zu verabreichenden Kultur wird von dem ausgewählten Mikroorganismus auf einem Nährboden, der eine organische Kohlenstoffquelle und eine organische oder anorganische Stickstoffquelle und organische oder anorganische Salze enthält, eine Kultur angelegt, dann werden die Mikroorganismen in zur Verabreichung und zum Transport geeigneter Form getrennt und gewünschtenfalls mit festen oder flüssigen Trägerstoffen und gegebenenfalls mit übrigen Zusätzen vermischt und formuliert. Die auf diese Weise erhaltenen Präparate können in das Futter und Trinkwasser der Tiere gemischt  oder auch selbständig gegeben werden. 



  Im Fall von Schafen werden zum Beispiel im allgemeinen täglich zu 0,5 kg üblicher Nahrung 1-20 g, vorzugsweise 5 g erfindungsgemässe Mikroorganismenkultur gegeben. Das Futter kann beispielsweise ein Gemisch aus Maisschrot, Luzerneheu und Mastfutter sein, wobei die genauen Verhältnisse entsprechend den jeweiligen Umständen und unter Berücksichtigung der angestrebten täglichen Gewichtszunahme festgelegt werden müssen. Im Fall von Kühen ist im allgemeinen die Gabe von 10-200 g, vorzugsweise von etwa 50 g erfindungsgemässer Mikroorganismenkultur zweckmässig, z.B. mit etwa 5 kg üblicher Nahrung vermischt. 



   Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren, das zur Verbesserung der Nahrungsverwertung von Wiederkäuern dient. 



  Aus dem mittels der bereits früher erwähnten Fermentation erhaltenen Fermentbrühe werden auf bekannte Weise, z.B. durch Zentrifugieren oder Filtern, die Mikroorganismenzellen abgetrennt. Aus den abgetrennten Zellen können unter anderem Mikroorganismen-Pasten, gefriergetrocknete Präparate, Sporen oder vegetative Formen enthaltende Suspensionen usw. hergestellt werden, dazu werden die für die Tierhaltung und Tierfütterung annehmbaren Zuschlagstoffe gegeben. Zu den Präparaten können auch die Lebensfähigkeit der Mikroorganismen erhaltende ergänzende Zuschlagstoffe gegeben werden, z.B. Eiweisse, Aminosäuren oder beispielsweise Glycerin.

  Zu den zur Verbesserung der Futterverwertung von Wiederkäuern anwendbaren erfindungsgemässen Präparaten können ausser den oben genannten Substanzen auch in der Praxis verwendete und Wiederkäuern verabreichte Stoffe, beispielsweise Antibiotika wie Monenzin, Nigericin, Salinomycin usw., gegeben werden, ferner können auch solche Stoffe dosiert werden, z.B. auch Antibiotika, die die Erhaltung der verabreichten Mikroorganismen im Pansen begünstigen. 



  Die mit dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellten Mikroorganismenkulturen ermöglichen demnach, dass sich mit ihrer Hilfe im Widerkäuerpansen eine lebende Mikroorganismenkultur herausbildet, die die Verdauung der Tiere günstig beeinflusst, bzw. dass sich die bereits vorhandene vorteilhaft verändert. 



  Während der Säugezeit befindet sich im Wiederkäuerpansen keine zur Metabolisierung des Futters geeignete Mikroorganismenflora, diese entsteht spontan, zufällig und ist keineswegs mit Sicherheit vorteilhaft. Durch gezielte Fütterung mit vorher bestimmten Bakterien kann anstelle der langsamen, spontanen Herausbildung der Pansenflora schnell und in vorteilhafter Zusammensetzung sofort eine fertige Mikroflora gebildet werden, die zur optimalen Verwertung des gegebenen Futters geeignet ist. 



  Ein Vorteil des erfindungsgemässen Verfahrens besteht darin, dass mit den gemäss der Beschreibung hergestellten Mikroorganismen (z.B. den Stämmen 000287, 000288, 000289) bei Änderung des Futters, bzw. nach der Säugeperiode die schnelle Anpassung der Pansenflora bzw. ihre Herausbildung begünstigt wird, indem sich im Pansen Mikroorganismen vermehren, die das Futter optimal abbauen können. 



  Die erfindungsgemässen Präparate werden beispielsweise in den hier nur zum besseren Verständnis dargelegten und nicht als Einschränkung zu betrachtenden folgenden Fällen angewendet. 



  Für Rinder bei der Milchproduktion zur jahreszeitlichen Futterumstellung, in verschiedenen Phasen der Milchproduktion, am Ende der Trächtigkeit bei der physiologischen Futterumstellung, bei betriebsbedingten Futterumstellungen usw. In der Fleischproduktion bei Änderung der Mastmethode, bei auf Massenfutter basierender Mast oder bei intensiver, auf Getreidefutter basierender  Haltung, bei Beginn des Austreibens, bei Veränderung der Weide usw. 



  In der Schafhaltung bei jahreszeitlich bedingter Futterumstellung (Herbst-Winter-Sommer-Frühlings-Fütterung), bei Beginn der Weide, bei intensiver Aufzucht. 



  Ähnlich ist die Situation bei der in Ungarn weniger verbreiteten Ziegenzucht. Die nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellten Mikroorganismenkulturen können jedoch auch in einigen Spezialfällen, bei wild lebenden Wiederkäuern, bei der Tierhaltung in Wildgärten, in der Dammwildzucht angewendet werden. 



  Es ist zu bemerken, dass - obwohl in den erfindungsgemässen Präparaten vorzugsweise Mikroorganismenkulturen aus dem Pansen verwendet werden - auch andere Essigsäure und/oder Propionsäure produzierende Bakterien, die nicht unbedingt aus dem Pansen stammen, zu diesem Zweck verwendet werden können. 



  Dies sind z.B. Angehörige der Stämme Angerovibrio (lipolytica), Bacteroides, Sclenamonas (ruminanticum) Propionbacterium. 



  Das erfindungsgemässe Verfahren wird mit den nachstehenden Beispielen veranschaulicht. Die Herstellung und Verwendung von Mikroorganismen, die drei Grundfutter, nämlich das cellulosehaltige Heu, das hauptsächlich Stärke enthaltende Getreidefutter und die Melasse, verwerten können und im Pansen über lange Zeit am Leben bleiben, werden für Schafe detailliert angegeben. Die nachfolgend beschriebenen Ausführungen stellen Beispiele der Erfindung dar. Selbstverständlich kann erfindungsgemäss die Herstellung von in anderen Futtermitteln wachstumsfähigen Mikroorganismen und Präparaten sowie deren Anwendung zur Herausbildung oder Beeinflussung der Pansenflora von anderen Wiederkäuern erfolgen. 


 Beispiel 1 
 


 Beeinflussung der Pansenflora von mit Heu gefütterten Tieren 
 


 A) Isolierung von bei Heufutter wachstumsfähigen Mikroorganismen 
 



  Schafe werden einen Monat lang mit Heu gefüttert, dann wird an der operativ in den Pansen eingeführten verschliessbaren Fistel eine Probe genommen. Die Probe wird direkt nach ihrer Entnahme auf einem Nährboden von nachstehender Zusammensetzung selektiert, nach Verdünnung: 
<tb><TABLE> Columns=3 
<tb> <SEP>Salzlösung I. 7,5 ml <SEP>Dikaliumhydrogenphosphat <SEP>0,6 g 
<tb> <SEP>dest. Wasser ad <SEP>100 ml 
<tb> <SEP>Salzlösung II. 7,5 ml <SEP>Natriumchlorid <SEP>1,2 g 
<tb> <SEP>Diammoniumsulfat <SEP>1,2 g 
<tb> <SEP>Kaliumdihydrogenphosphat <SEP>0,6 g 
<tb> <SEP>Ca <SEP>Calciumchlorid <SEP>0,12 g 
<tb> <SEP>Magnesiumsulfat-heptahydrat <SEP>0,25 g 
<tb> <SEP>dest.

  Wasser ad <SEP>100 ml 
<tb> <SEP>Resazurin 
<tb> <SEP>0,1%ige Lösung <SEP>0,1 ml 
<tb> <SEP>Agar (Bacto)<+> <SEP>2,5 g 
<tb> <SEP>Pansenflüssigkeit<++> <SEP>10,0 ml 
<tb> <SEP>Glucose <SEP>0,05 g 
<tb> <SEP>Cellobiose <SEP>0,05 g 
<tb> <SEP>Cystein-hydrochlorid-monohydrat <SEP>0,05 g 
<tb> <SEP>Natriumcarbonat, 8%ige Lösung <SEP>5,0 ml 
<tb> <SEP>dest. Wasser ad <SEP>100 ml <SEP>Bezeichnung des Nährbodens: RGCA 
 <+>Difco Laboratories, Detroit, USA
<++>Die aus dem Pansen entnommene Probe wird durch ein lockeres Gazefilter filtriert, das Filtrat wird dann unter CO2 bei einer Temperatur von -20 DEG C gelagert.
  
<tb></TABLE> 



  Der pH-Wert des Nährbodens wird auf 6,8 eingestellt, dann wird sterilisiert. Die Sterilisation wird unter CO2-Atmosphäre durchgeführt. Sterilisation, Nähr bodenbereitung und Züchtung erfolgen nach Bryant und Burkey (J. Dairy Sci., 36, 205/1953/). 



   Verdünnt wird mit einem sterilen Gemisch folgender Zusammensetzung: 
<tb><TABLE> Columns=3 
<tb> <SEP>Salzlösung I (siehe oben) <SEP>7,5 ml 
<tb> <SEP>Salzlösung II (siehe oben) <SEP>7,5 ml 
<tb> <SEP>Cystein-hydrochlorid-monohydrat <SEP>0,05 g 
<tb> <SEP>Natriumcarbonat <SEP>0,3 g 
<tb> <SEP>Resazurin, 0,1%ige Lösung <SEP>0,1 ml 
<tb> <SEP>dest. Wasser ad <SEP>100 ml <SEP>Bezeichnung des Gemisches: HB 
<tb></TABLE> 



  Die Kulturen werden bei 35 DEG C unter anaeroben Bedingungen (siehe Atlas of Rumen Microbiology, Ogimoto und Imai, Japan Scientific Societies Press, Tokyo,/1981/) 120 Stunden lang inkubiert, dann wird mit den einzelnen Kolonien ein Heu-extrakt enthaltender Nährboden von folgender Zusammensetzung geimpft: 
<tb><TABLE> Columns=2 
<tb> <SEP>Salzlösung I (siehe oben) <SEP>15,0% 
<tb> <SEP>Salzlösung II (siehe oben) <SEP>15,0% 
<tb> <SEP>Resazurin, 0,1%ige Lösung <SEP>0,1% 
<tb> <SEP>Tripton L42 (Oxoid)<+> <SEP>1,5% 
<tb> <SEP>Hefeextrakt (Oxoid)<+> <SEP>0,5% 
<tb> <SEP>Pansenflüssigkeit<++> <SEP>10,0% 
<tb> <SEP>Natriumcarbonat <SEP>0,4% 
<tb> <SEP>Cystein-hydrochlorid-monohydrat <SEP>0,05% 
<tb> <SEP>Heuextrakt<+++> <SEP>10,0% Zeichen:

  RGCF 
 <+>Oxoid Limited, London, Anglia.
<++>Siehe vorn.
<+++>Zur Herstellung des Heuextraktes werden kleingeschnittene Pflanzenteile in Wasser suspendiert, gekocht und dann abfiltriert. Der Filterrückstand wird vor dem Sterilisieren zum Nährboden gegeben.
  
<tb></TABLE> 



  Der pH-Wert des Nährbodens wird mit Salzsäure auf 6,5 eingestellt, dann wird sterilisiert. 



  Die in Reagenzgläsern sterilisierten Nährböden  von 5 ml Volumen werden mit einer Zellsuspension, die aus auf dem festen Nährboden RGGA aufgewachsenen, isolierten Kolonien gewonnen wurde, geimpft. Die Kulturen werden 5 Tage lang bei 35 DEG C unter anaeroben Bedingungen inkubiert. Das Wachstum wird durch mikroskopische Untersuchungen überprüft, dann wird die Kultur auf dem Nährboden RGCA der angegebenen Zusammensetzung selektiert, es werden jedoch weder Glucose noch Cellobiose in den Nährboden gegeben, statt dessen werden 2% Bacto Cellulose eingesetzt. 



  Die Kulturen werden bei einer Temperatur von 35 DEG C 120 Stunden lang inkubiert, dann werden die einzelnen Kolonien, die sich aus den zur Celluloseverwertung fähigen Zellen entwickelt haben, auf die cellulosehaltigen RGCA-Nährboden isoliert. 



  Auf diese Weise werden aus dem Pansen stammende Mikroorganismen gewonnen, die auf Heu bzw. Cellulose wachstumfähig sind. 


 B) Markierung von heuabbauenden Magenbakterien 
 



  Die genetische Markierung erfolgt mit dem Escherichia coli Plasmid p 1011 (Simon und Mitarb., Proc. of the Eight North American Rhizobium Conference, Winnipeg, Canada: Univ. of Maniota Press,/1983/) in an sich bekannter Weise. 



  Aus der E. Coli-Kultur wird nach Birnboim und Doily (Nucl. Acids Res., 7, 1513/1979) die Plasmid-DNS isoliert und in einem Gemisch der folgenden Zusammensetzung gelöst:
 
 75 mM Calciumchlorid
 5 mM Magnesiumchlorid
 10 mM Tris-Hydrochlorid-Puffer<+> pH 7,5
 <+>(Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan)-hydrochlorid
 



  Nach den Angaben in Punkt A des Beispiels 1 werden auf Heu wachstumsfähige Mikroorganismen auf dem Nährboden RGCF (siehe Beispiel 1 Punkt A) gezüchtet und durch Zentrifugieren unter CO2 abgetrennt. Die Zellen  werden in einem Gemisch folgender Zusammensetzung suspendiert:
 
 75 mM Calciumchlorid
 5 mM Magnesiumchlorid
 10 mM TRIS-Hydrochlorid-Puffer pH 7,5
 1 mM Cystein-hydrochlorid-monohydrat
 1 mM Natriumthiosulfat.
 



  Die Suspensionen enthalten 5 x 10<9> Zellen pro Milliliter. Die Zellsuspensionen werden im Verhältnis 1:1 (0,1  mu g/ mu l) mit dem die p1011 Plasmid-DNS enthaltenden Gemisch verdünnt und dann bei einer Temperatur von 4 DEG C 60 Minuten lang inkubiert. Die Inkubation wird danach zwei Minuten lang bei einer Temperatur von 41 DEG C fortgesetzt, darauffolgend wird die Kultur auf feste Nährböden, die als Kohlenstoffquelle Cellulose enthalten, ausgestrichen und zu den Nährböden werden vor der Sterilisation 500  mu /ml Kanamycin B gegeben. Die Kulturen werden 120 Stunden lang bei einer Temperatur von 35 DEG C und unter anaeroben Bedingungen inkubiert, dann werden die in Gegenwart von 500  mu g/ml Kanamycin B wachstumsfähigen Kolonien untersucht. 



  Das Plasmid p1011 trägt Kanamycin- und Chloramphenicolresistenz bestimmende Gene, enthält weiterhin das in den Zellen von E. Coli die Replikation erlaubende Replikationsorigo. Da die Plasmid-DNS über kein entsprechendes Replikationsorigo verfügt, wird sie - nachdem sie in ein anderes Bakterium gelangt ist - entweder eliminiert oder aber ganz oder teilweise in das Chromosom eingebaut, es findet eine genetische Rekombination statt. Das in das Chromosom eingebaute Gen wird im günstigen Fall manifest und sichert Resistenz gegen Kanamycin bzw. Chloramphenicol. 



  Während dieser Versuche entstanden gegenüber Kanamycin B resistente Kolonien, die Transformationsfrequenz betrug 3 x 10<-><5>. 



  Einige resistente Kolonien wurden isoliert, und  es wurde die Antibiotika-Empfindlichkeit der Ausgangsstämme und der gegenüber Kanamycin B resistenten (Km<R>) Stämme bestimmt. Die bei einigen Stämmen erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben. 
<tb><TABLE> Columns=3 
<tb>Title: Tabelle 1 
<tb>Head Col 01 to 03 AL=L: Kanamycin B-Empfindlichkeit der Pansenbakterien und der genetisch markierten, heuabbauenden Stämme 
<tb>SubHead Col 01 to 02 AL=L: Mikroorganismus 
<tb>SubHead Col 03 AL=L>Kleinste wachstumshemmende Konzentration von Kanamycin B
 mu g/ml: 
<tb> <SEP>Panseninhalt <SEP>31 
<tb> <SEP>Ausgangsstämme <SEP>4,0-7,5 
<tb> <SEP>Genetisch markierte Km<R>-Stämme 
<tb> <SEP> Hh-GYOKI-1-8 <SEP>500 
<tb> <SEP>-27 <SEP>250 
<tb> <SEP>-91 <SEP>500 
<tb> <SEP>-123 <SEP>1000 
<tb> <SEP>-142 <SEP>500 
<tb></TABLE> 



  Auf diese Weise erhält man Mikroorganismen, die aus dem Pansen stammen und fähig sind, Heu oder Cellulose zu verwerten. Sie sind in Gegenwart einer bedeutenden Menge Kanamycin B wachstumsfähig. 



  Der Stamm Hh-GYOKI-1-123 (Km<R>) wird auf dem cellulosehaltigen Nährboden RGCA ausgestrichen, und zu den Nährböden werden 1000, 5000 bzw. 10 000  mu g/ml Kanamycin B gegeben. Die Kulturen werden 168 Stunden lang bei einer Temperatur von 35 DEG C unter anaeroben Bedingungen inkubiert, dann werden die in Gegenwart von 1000  mu g/ml Antibiotikum wachsenden Stämme isoliert. Auf diese Weise erhält man durch spontane Selektion aus dem Stamm Hh-GYOKI-1-123 Kanamycin B gegenüber in starkem Masse resistente spontane Mutanten. Der eine Stamm erhielt die Bezeichnung Hh-GYOKI-1-123Sz und wurde in der Nationa len Sammlung für Mikroorganismen beim ungarischen Landesinstitut für Gesundheitswesen deponiert. 


 C) Das Wiedereinbringen der genetisch markierten Mikroorganismen in den Pansen 
 



   Mit der Kultur des auf Schrägagar bei +4 DEG C gelagerten Stammes Hh-GYOKI-1-123 (Km<R>) wird der sterile Nähboden RGCFa von folgender Zusammensetzung geimpft: 
<tb><TABLE> Columns=3 
<tb> <SEP>1. <SEP>Dikalium-hydrogen-phosphat 0,3% <SEP>45 ml Lösung 
<tb> <SEP>2. <SEP>Diammoniumsulfat 
<tb> <SEP>Natriumchlorid 
<tb> <SEP>Magnesiumsulfat-monohydrat 
<tb> <SEP>Calciumchlorid-dihydrat 
<tb> <SEP>Kalium-dihydrogen-phosphat <SEP>45 ml Gemisch 
<tb> <SEP>3. <SEP>Bacto-Cellulose<+> 
<tb> <SEP>Agar (Bacto)<+> <SEP>65 ml Gemisch 
<tb> <SEP>4. <SEP>Hefeextrakt <SEP>20 ml Gemisch 
<tb> <SEP>5. <SEP>Cystein-hydrochlorid-monohydrat <SEP>20 ml Lösung 
<tb> <SEP>6. <SEP>Natriumthiosulfat <SEP>20 ml Lösung 
<tb> <SEP>Natriumcarbonat 
<tb> <SEP>7. <SEP>Pansenflüssigkeit<++> <SEP>20 ml 
 <+>Difco Laboratories, Detroit, USA
<++>Siehe oben.
  
<tb></TABLE> 



  Die angegebenen Mengen der sieben gesondert hergestellten Gemische werden in der angegebenen Reihenfolge miteinander vermischt. 



  Das Anlegen der Kultur findet unter anaeroben Bedingungen in Kolben mit einem Volumen von 500 ml statt, die 150 ml Nährmedium enthalten. Nach 48 Stunden wird das Wachstum kontrolliert, dann wird die Kultur in das Futter von Schafen gemischt, die mit Heu gefüttert werden. Vor der Gabe und an den darauffolgenden Tagen werden an der in den Pansen einoperierten Fistel Proben genommen, das Volumen der Proben beträgt 50-200 ml. 



  Die Proben werden nach entsprechender Verdünnung mit HB-Lösung auf RGCA-Nährböden ausgestrichen, die kein Kanamycin und Antibiotikum enthalten. Die Kulturen werden 72 Stunden lang bei einer Temperatur von 35 DEG C und unter anaeroben Bedingungen inkubiert, dann wird die Zahl der entwickelten Bakterienkolonien bestimmt.

  Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 angegeben. 
<tb><TABLE> Columns=3 
<tb>Title: Tabelle 2 
<tb>Head Col 01 to 03 AL=L: Veränderungen der Pansenflora von mit dem Stamm Hh-GYOKI-1-123 (Km<R>) behandelten Tieren 
<tb>Head Col 01 to 03 AL=L: Dem Tier wurden oral 340 ml Kultur verabreicht, die 4,7 x 10<6> Bakterien pro Milliliter enthält. 
<tb>SubHead Col 01 AL=L>Probe: 
<tb>SubHead Col 02 to 03 AL=L: Zellenzahl/ml 
<tb>SubHead Col 02 AL=L>ohne Antibiotikum: 
<tb>SubHead Col 03 AL=L>in Gegenwart von 1000 Microgramm/ml Kanamycin B: 
<tb> <SEP>Vor der Gabe: <SEP>5 . 10<6> <SEP>0 
<tb> <SEP>Nach der Gabe: 
<tb> <SEP>1. Tag <SEP>45,9 . 10<6> <SEP>2,0 . 10<4> 
<tb> <SEP>2. Tag <SEP>3,2 . 10<7> <SEP>4,1 . 10<4> 
<tb> <SEP>3. Tag <SEP>2,4 . 10<6> <SEP>3,1 . 10<4> 
<tb> <SEP>6. Tag <SEP>3,9 . 10<7> <SEP>1,8 . 10<4> 
<tb> <SEP>8. Tag <SEP>9,8 . 10<6> <SEP>1,05 . 10<5> 
<tb> <SEP>15.

  Tag <SEP>8,1 . 10<5> <SEP>3,1 . 10<4> 
<tb></TABLE> 



  Aus den Angaben der Tabelle geht hervor, dass der verabreichte Mikroorganismus lange Zeit im Pansen ist und sich vermehrt. 



  Nach den obigen Angaben wurde eine Mikroorganismenkultur Hh-GYOKI-1-123Sz gezüchtet, die gegenüber 10 000  mu g/ml Kanamycin B resistent ist, und den  Tieren am 15. Tag verabreicht. Nach der Züchtung der Proben auf die beschriebene Weise erhielt man die in Tabelle 3 angegebenen Ergebnisse. 
<tb><TABLE> Columns=3 
<tb>Title: Tabelle 3 
<tb>Head Col 01 to 03 AL=L: Veränderung der Pansenflora von mit dem Stamm Hh-GYOKI-1-123Sz (Km<R>) behandelten Tieren 
<tb>Head Col 01 to 03 AL=L: Dem Tier wurden oral 140 ml Kultur verabreicht, die 2 x 10<8> Bakterien pro Milliliter enthielt. 
<tb>SubHead Col 01 AL=L>Probe: 
<tb>SubHead Col 02 to 03 AL=L: Zellzahl/ml 
<tb>SubHead Col 02 AL=L>ohne Antibiotikum: 
<tb>SubHead Col 03 AL=L>in Gegenwart von 8000  mu g/ml Kanamycin B: 
<tb> <SEP>Vor der Gabe: <SEP>1,4 x  10<6> <SEP>0 
<tb> <SEP>Nach der Gabe: 
<tb> <SEP>1.

  Tag <SEP>7,4 x 10<6> <SEP>3,2 x 10<4> 
<tb> <SEP>2. Tag <SEP>1,7 x 10<5> <SEP>1,3 x 10<4> 
<tb> <SEP>5. Tag <SEP>4 x 10<6> <SEP>9,1 x 10<3> 
<tb> <SEP>7. Tag <SEP>1,1 x 10<7> <SEP>2 x 10<4> 
<tb> <SEP>14. Tag <SEP>8 x 10<6> <SEP>3,1 x 10<4> 
<tb> <SEP>21. Tag <SEP>7,1 x 10<5> <SEP>6,2 x 10<4> 
<tb> <SEP>28. Tag <SEP>8,2 x 10<6> <SEP>8,1 x 10<4> 
<tb> <SEP>35. Tag <SEP>8,7 x 10<6> <SEP>1,8 x 10<4> 
<tb></TABLE> 



  Aus den Angaben der Tabelle geht hervor, dass der verabreichte Mikroorganismus in bedeutender Menge im Pansen vorhanden ist, und in Anbetracht dessen, dass der verdaute Mageninhalt ständig entleert wird, sich auch unbedingt vermehrt. Die in den einzelnen Proben gemessenen Unterschiede in der Bakterienanzahl sind dadurch zu erklären, dass die Konsistenz des Mageninhalts von Probe zu Probe sehr verschieden war, von völlig viskos bis dünnfliessend. 


 Beispiel 2 
 


 Beeinflussung der Pansenflora von mit Getreideprodukten gefütterten Tieren 
 


 A) Isolation von bei Getreidefutter wachstumsfähigen Mikroorganismen 
 



  Die Massnahmen von Punkt A des Beispiels 1 werden wiederholt mit dem Unterschied, dass die Ausgangsprobe aus dem Pansen vom mit Getreideprodukten gefütterten Tieren genommen wird. Die einzelnen Isolate werden auf einen RGCF-Nährboden (siehe dort), der anstelle von Heu im Reibmörser pulverisierte Körnernahrung enthält (2%), geimpft. Die auf dem flüssigen RGCF-Nährboden heranwachsenden Kulturen werden auf einem festen RGCA-Nährboden ausgestrichen, und auf einen solchen Nähboden werden die sich aus Zellen, die die Getreideprodukte verwerten können, entwickelten Kolonien isoliert. 



  So erhält man aus dem Pansen stammende Mikroorganismen, die auf Getreide als Kohlenstoffquelle wachstumsfähig sind. 


 B) Genetische Markierung der stärkeabbauenden Pansenbakterien 
 



  Die Massnahmen von Punkt B des Beispiels 1 werden wiederholt mit dem Unterschied, dass bei der mit der p1011 Plasmid-DNS stattfindenden Transformation anstelle der nach Punkt A des Beispiels 1 hergestellten Mikroorganismen die nach den Angaben des Punktes A des Beispiels 2 erhaltenen Stämme verwendet werden. 



  Die Resistenz gegenüber Kanamycin B einiger transformierter und Km<R>-Zellen wird in Tabelle 4 angegeben. 
<tb><TABLE> Columns=3 
<tb>Title: Tabelle 4 
<tb>Head Col 01 to 03 AL=L: Kanamycin-Empfindlichkeit der Pansenbakterien und der genetisch markierten, stärkeabbauenden Stämme 
<tb>SubHead Col 01 to 02 AL=L: Mikroorganismus 
<tb>SubHead Col 03 AL=L>Kleinste wachstumshemmende Konzentration von Kanamycin B
 mu g/ml: 
<tb> <SEP>Panseninhalt <SEP>31 
<tb> <SEP>Ausgangsstämme <SEP>1,8 
<tb> <SEP>Genetisch markierte Km<R>-Stämme 
<tb> <SEP> Hh-GYOKI-2-4 <SEP>250 
<tb> <SEP>-14Ab <SEP>250 
<tb> <SEP>-37 <SEP>250 
<tb> <SEP>-81 <SEP>125 
<tb></TABLE> 



   Wie beschrieben, erhält man demnach aus dem Pansen stammende Mikroorganismen, die fähig sind, Getreidestärke als Kohlenstoffquelle zu verwerten und auf die vorhandenen Bakterien gerechnet gegenüber Kanamycin B 8x resistenter sind. 



  Der Stamm Hh-GYOKI-2-14Ab wurde unter der Nummer 00288 in der Nationalen Sammlung für Mikroorganismen beim ungarischen Landesinstitut für Gesundheitswesen deponiert. 


 C) Wiedereinbringen genetisch markierter Mikroorganismen in den Pansen 
 



  Es wird nach den Angaben des Punktes C des Beispiels 1 verfahren mit dem Unterschied, dass mit dem Stamm Hh-GYOKI-2-14Ab anstelle des 1,8% Bacto-Cellulose enthaltenden Nährbodens steriler RGCFa-Nährboden, der 1,8% lösliche Stärke enthält, beimpft wird. Dann wird die Kultur in das Futter von Tieren gemischt, die mit Kornfutter gefüttert werden. Vor der Gabe und danach täglich wird eine Probe an der Fistel genommen.

  Die Anzahl der in den Proben enthaltenen Km<R>-Zellen ist in der folgenden Tabelle aufgeführt. 
<tb><TABLE> Columns=3 
<tb>Title: Tabelle 5 
<tb>Head Col 01 to 03 AL=L: Veränderungen der Pansenflora von mit dem Stamm Hh-GYOKI-2-14Ab (Km<R>) behandelten Tieren 
<tb>Head Col 01 to 03 AL=L: Dem Tier wurden oral 310 ml Kultur verabreicht, die insgesamt 7,1 x 10<5> Bakterien  enthält. 
<tb>SubHead Col 01 AL=L>Probe: 
<tb>SubHead Col 02 to 03 AL=L: Zellenzahl/ml 
<tb>SubHead Col 02 AL=L>ohne Antibiotikum: 
<tb>SubHead Col 03 AL=L>in Gegenwart von 250  mu g/ml Kanamycin B: 
<tb> <SEP>Vor der Gabe: <SEP>4,3 x  10<6> <SEP>1,4 x 10<1> 
<tb> <SEP>Nach der Gabe: 
<tb> <SEP>1. Tag <SEP>4,1 x 10<6> <SEP>1,8 x 10<3> 
<tb> <SEP>2. Tag <SEP>3,2 x 10<6> <SEP>2,1 x 10<3> 
<tb> <SEP>3. Tag <SEP>8 x 10<3> <SEP>1,1 x 10<3> 
<tb> <SEP>6. Tag <SEP>9,1 x 10<6> <SEP>7,1 x 10<2> 
<tb> <SEP>8.

  Tag <SEP>8 x 10<6> <SEP>8,1 x 10<3> 
<tb> <SEP>15. Tag <SEP>6,8 x 10<6> <SEP>8,7 x 10<3> 
<tb> <SEP>22. Tag <SEP>5 x 10<6> <SEP>9,8 x 10<3> 
<tb> <SEP>29. Tag <SEP>8 x 10<6> <SEP>1,1 x 10<4> 
<tb> <SEP>36. Tag <SEP>9,1 x 10<6> <SEP>7 x 10<3> 
<tb> <SEP>43. Tag <SEP>7 x 10<6> <SEP>7,9 x 10<3> 
<tb> <SEP>60. Tag <SEP>6,1 x 10<6> <SEP>7 x 10<3> 
<tb></TABLE> 



  Aus der Tabelle ist klar zu entnehmen, dass der verabreichte Mikroorganismus lange Zeit im Pansen am Leben bleibt und sich vermehrt. 


 Beispiel 3 
 


 Beeinflussung der Pansenflora von mit Melasse gefütterten Tieren 
 


 A) Isolation von bei Melassefütterung wachstumsfähigen Mikroorganismen 
 



  Es wird nach den Angaben des Punktes A des Beispiels 1 vorgegangen mit dem Unterschied, dass die Ausgangsprobe aus dem Pansen von mit Melasse gefütterten  Tieren genommen wird. Die einzelnen Isolate werden auf einen RGCF-Nährboden geimpft, der anstelle von Heuextrakt Glucose enthält. Die in dem flüssigen Nährmedium herangewachsenen Kulturen werden auf einem RGCA-Nährboden ausgestrichen. Auf den gleichen Nährboden werden die Kolonien geimpft, die sich aus zum Verwerten der Melasse fähigen Zellen entwickeln. 



  Auf diese Weise erhält man aus dem Pansen stammende Mikroorganismen, welche die Melasse metabolisieren können. 


 B) Genetische Markierung von melasseverwertenden Bakterien 
 



  Die Massnahmen von Punkt B des Beispiels 1 werden wiederholt mit dem Unterschied, dass anstelle der nach den Angaben von Punkt A des Beispiels 1 erhaltenen Mikroorganismen die nach Punkt A des Beispiels 3 hergestellten Zellen mit der Plasmid-DNS von p1011 transformiert werden. 



  Die Resistenz einiger Km<R>-Zellen gegenüber Kanamycin B ist in Tabelle 6 angegeben. 
<tb><TABLE> Columns=3 
<tb>Title: Tabelle 6 
<tb>Head Col 01 to 03 AL=L: Kanamycin B-Empfindlichkeit der Pansenbakterien und der genetisch markierten, melasseabbauenden Stämme 
<tb>SubHead Col 01 to 02 AL=L: Mikroorganismus 
<tb>SubHead Col 03 AL=L>Kleinste wachstumshemmende Konzentration von Kanamycin B
( mu g/ml): 
<tb> <SEP>Panseninhalt <SEP>31 
<tb> <SEP>Ausgangsstämme <SEP>7,5 
<tb> <SEP>Genetisch markierte Km<R>-Stämme 
<tb> <SEP> Hh-GYOKI-3-2 <SEP>250 
<tb> <SEP>-14 <SEP>500 
<tb> <SEP>-34 <SEP>250 
<tb> <SEP>-81Me <SEP>500 
<tb> <SEP>-132 <SEP>500 
<tb></TABLE> 



  Auf die beschriebene Weise erhält man Melasse verwertende, gegenüber Kanamycin B in hohem Masse resistente Isolate. 



  Der Stamm Hh-GYOKI-3-81Me wurde unter der Nummer 00289 in der Nationalen Sammlung für Mikroorganismen beim Ungarischen Landesinstitut für Gesundheitswesen deponiert. 


 C) Das Wiedereinbringen der genetisch markierten Zellen in den Pansen 
 



  Es wird nach Punkt C des Beispiels 1 verfahren mit dem Unterschied, dass mit dem Stamm Hh-GYOKI-3-81Me ein RGCFa-Nährboden, der anstelle von 1,8% Cellulose 1,8% Glucose enthält, geimpft wird. Die Kultur wird unter das Futter von mit Melasse gefütterten Tieren gemischt. Vor der Fütterung und danach täglich werden durch eine in den Pansen eingeführte Fistel Proben genommen. 



  Die Anzahl der in den Proben enthaltenen Km<R>-Zellen ist in Tabelle 7 angegeben. 
<tb><TABLE> Columns=3 
<tb>Title: Tabelle 7 
<tb>Head Col 01 to 03 AL=L: Veränderung der Pansenflora von mit Hh-GYOKI-3-81Me (Km<R>)-Zellen behandelten Tieren 
<tb>Head Col 01 to 03 AL=L: Dem Tier wurden oral 380 ml Kultur verabreicht, die 1,6 x 10<7> Zellen pro Milliliter   enthält. 
<tb>SubHead Col 01 AL=L>Probe: 
<tb>SubHead Col 02 to 03 AL=L: Zellenzahl/ml 
<tb>SubHead Col 02 AL=L>ohne Antibiotikum: 
<tb>SubHead Col 03 AL=L>in Gegenwart von 500  mu g/ml Kanamycin B: 
<tb> <SEP>Vor der Gabe: <SEP>5 x  10<6> <SEP>0 
<tb> <SEP>Nach der Gabe: 
<tb> <SEP>1. Tag <SEP>1,1 x 10<6> <SEP>1,9 x 10<5> 
<tb> <SEP>2. Tag <SEP>1,8 x 10<7> <SEP>2,5 x 10<5> 
<tb> <SEP>3. Tag <SEP>6,2 x 10<6> <SEP>6,1 x 10<5> 
<tb> <SEP>6. Tag <SEP>8,1 x 10<6> <SEP>8,7 x 10<5> 
<tb> <SEP>8.

  Tag <SEP>6,2 x 10<6> <SEP>9,1 x 10<5> 
<tb> <SEP>15. Tag<+> <SEP>1,3 x 10<3> <SEP>1,3 x 10<2> 
<tb> <SEP>22. Tag <SEP>3 x 10<6> <SEP>3,1 x 10<5> 
<tb> <SEP>29. Tag <SEP>1,1 x 10<6> <SEP>7 x 10<5> 
<tb> <SEP>36. Tag <SEP>8 x 10<5> <SEP>9,1 x 10<4> 
<tb> <SEP>43. Tag <SEP>6,1 x 10<6> <SEP>8,1 x 10<5> 
<tb> <SEP>60. Tag <SEP>6,8 x 10<6> <SEP>6,4 x 10<5> 
<tb> 
 <+>Fehlerhafte Probenentnahme
  
<tb></TABLE> 



  Aus den Angaben der Tabelle ist zu entnehmen, dass der verabreichte Mikroorganismus lange Zeit im Pansen des mit Melasse gefütterten Tieres ist. 


 Beispiel 4 
 


 Die Änderung des Verhältnisses der im Pansen produzierten flüchtigen Fettsäuren durch Gabe von Bakterien 
 



   Zwei Schafe bekommen komplettes Futter (Gemisch aus Heu und Schaffutter), dann wird nach 14 Tagen durch die Fistel eine Probe aus dem Pansen genommen. 2 Liter Pansensaft werden durch mehrschichtige Gaze filtriert, das Filtrat wird abgetrennt. Die in der Gaze zurückbleibenden Stücke werden in 1 Liter physiologischem Puffer suspendiert, dann nach Rühren auf die gleiche Weise wie vorher filtriert. Die beiden Filtrate werden vereinigt, stehengelassen, nach einer Stunde werden die sich an der Oberfläche absondernden festen Stoffe entfernt, und nur die Flüssigkeit wird für die Untersuchungen verwendet.

  Die Zusammensetzung des physiologischen  Puffers ist wie folgt: 
<tb><TABLE> Columns=2 
<tb> <SEP>Dinatrium-hydrogen-phosphat <SEP>0,316 g/l 
<tb> <SEP>Kalium-dihydrogen-phosphat <SEP>0,152 g/l 
<tb> <SEP>Natrium-hydrogen-carbonat <SEP>2,260 g/l 
<tb> <SEP>Kaliumchlorid <SEP>0,375 g/l 
<tb> <SEP>Magnesiumsulfat <SEP>0,112 g/l 
<tb> <SEP>Calciumdichlorid-dihydrat <SEP>0,050 g/l 
<tb> <SEP>Eisen(II)sulfat-heptahydrat <SEP>0,008 g/l 
<tb> <SEP>Mangansulfat-monohydrat <SEP>0,004 g/l 
<tb> <SEP>Zinksulfat-heptahydrat <SEP>0,004 g/l 
<tb> <SEP>Kupfersulfat-pentahydrat <SEP>0,002 g/l 
<tb> <SEP>Kobaltdichlorid-hexahydrat <SEP>0,001 g/l 
<tb></TABLE> 



  Der pH-Wert des Gemisches wird kontrolliert, notwendigenfalls mit verdünnter wässrigen Lösung von Wasserstoffchlorid Salzsäure oder Natronlauge auf 7,2 eingestellt (Cheng und Mitarb.: J. Dairy Sci., 38, 1225, /195/). 



  Das auf diese Weise hergestellte Gemisch wird im Verhältnis 1:1 mit dem erwähnten physiologischen Puffer verdünnt, und einem Liter der Lösung werden 4 g des dem Tier verabreichten Futtergemisches zugesetzt. Je 30 ml der so erhaltenen Suspension werden in einen Erlenmeyerkolben von 100 ml Volumen gefüllt, dann werden zweihundert Portionen des so vorbereiteten Nährbodens sterilisiert, zweihundert weitere werden nicht sterilisiert. 



  Die sterilen und die die lebenden Pansenbakterien enthaltenden Nährböden werden mit Bakterien geimpft, die unter dem Aspekt der Essigsäure-, Propionsäure- und Buttersäureproduktion zu untersuchen sind. 



  Es werden diejenigen Bakterien untersucht, von denen erwiesen ist, dass sie auch nach der Züchtung in vitro lange Zeit im Pansen erhalten bleiben. Weiterhin werden die aus der Pansenflüssigkeit von Tieren, die mit komplettem oder einem beliebigen Futter gefüttert wurden, nach Punkt A, B und C des Beispiels 1 isolierten Bakterienstämme untersucht. 



  Die zu untersuchenden Bakterien werden auf RGCA+CG-Nährboden der folgenden Zusammensetzung bei einer Temperatur von 37 DEG C, unter anaeroben Bedingungen und 48 Stunden lang inkubiert: 
<tb><TABLE> Columns=2 
<tb> <SEP>Salzlösung I (siehe Beispiel 1 Punkt A) <SEP>15% 
<tb> <SEP>Salzlösung II (siehe Beispiel 1 Punkt A) <SEP>15% 
<tb> <SEP>Spurelemente-Lösung <SEP>0,3% 
<tb> <SEP>Hefeextrakt (Oxoid)<+> <SEP>0,5% 
<tb> <SEP>Filtrierte Pansenflüssigkeit <SEP>10,0% 
<tb> <SEP>Natriumcarbonat <SEP>0,4% 
<tb> <SEP>Cystein-hydrochlorid-monohydrat <SEP>0,05% 
<tb> <SEP>Natriumthiosulfat <SEP>0,008% 
<tb> <SEP>Cellulose (Bacto)<+> <SEP>0,3% 
<tb> <SEP>Glucose <SEP>2,0% 
 <+>siehe oben
  
<tb></TABLE> 



  Die Zusammensetzung der Spurenelemente-Lösung ist wie folgt: 
<tb><TABLE> Columns=2 
<tb> <SEP>Zinkdichlorid <SEP>40 mg 
<tb> <SEP>Kupferdichlorid-dihydrat <SEP>10 mg 
<tb> <SEP>Dinatriumtetraborat-dekahydrat <SEP>10 mg 
<tb> <SEP>Ammoniummolybdinat-tetrahydrat <SEP>10 mg 
<tb> <SEP>Eisentrichlorid-hexahydrat <SEP>200 mg 
<tb> <SEP>Mangandichlorid-tetrahydrat <SEP>10 mg 
<tb> <SEP>ionenfreies Wasser ad <SEP>1000 ml 
<tb></TABLE> 



  Mit den Kulturen werden die wie oben hergestellten vorbereiteten Nährböden in den Erlenmeyerkolben beimpft. Die Impfung wird im Verhältnis 2 ml Kultur/50 ml Nährboden durchgeführt. Für jede Kultur werden zwei Ansätze bereitet. Auch die nicht sterile Kultur wird geimpft. 



  Nach der Impfung wird 40 Stunden lang unter anaeroben Bedingungen inkubiert, dann wird die Vermehrung mit 10% konzentrierter Ameisensäure zum Stehen gebracht und der Gehalt der Kulturen an flüchtigen Fettsäuren untersucht. 



  Die Kulturen werden durch Gaze filtriert und dann 15 Minuten lang in einem Rotor mit einer  Umdrehungszahl von 4000 zentrifugiert. Das Gemisch wird nochmals filtriert und dann zur Bestimmung der Fettsäuren mit 2-5 C-Atomen auf die Trennsäule eines Gaschromatographen gebracht, der mit einem Flammenionisationsdetektor vom Typ Carlo Erba GI-452 ausgestattet ist. 
<tb><TABLE> Columns=2 
<tb> <SEP>Säulentemperatur: <SEP>150 DEG C 
<tb> <SEP>Trennsäule: <SEP>2 m langes Glasrohr mit einem inneren Durchmesser von 4 mm, Füllung: 10% Äthylenglycoladipat + 2% Ortho-Phosphorsäure, auf silanisiertem Silikagel-Träger
(0,2-0,3 mm). 
<tb> <SEP>Injektortemperatur: <SEP>190 DEG C 
<tb> <SEP>N2-Strömungsgeschwindigkeit: <SEP>50 ml/min 
<tb> <SEP>H2-Strömungsgeschwindigkeit: <SEP>50 ml/min 
<tb> <SEP>Luft-Strömungsgeschwindigkeit: <SEP>200 ml/min 
<tb> <SEP>Papiergeschwindigkeit:

  <SEP>160 cm/h 
<tb> <SEP>Chromatographierzeit: <SEP>20 min 
<tb> <SEP>Probenmenge: <SEP>1  mu l 
<tb></TABLE> 



  Von jeder Probe werden 4 parallele Messungen durchgeführt. Die Standardlösung enthält Essigsäure, Propionsäure, i-Buttersäure, Buttersäure, i-Valeriansäure und Valeriansäure. 



  Von den aus den Pansen von mit komplettem Futter gefütterten Tieren isolierte bzw. genetisch markierten Bakterien wurden mehr als 90 untersucht, im Falle positiver Ergebnisse mehrfach. Die representativen Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle 8 aufgeführt. Die Bedeutung der in der Tabelle verwendeten Zeichen ist die folgende:
 
 + S: nach Sterilisation geimpft
 NS: lebende Pansenflora enthaltende Kultur geimpft
 a. ny: geringe Menge
 b. negative Kontrolle:

  Gehalt des Nährbodens (Pansenflüssigkeit, physiologischer Puffer und Futter) an flüchtigen Fettsäuren (Durchschnitt von 12 Messungen)
 c. positive Kontrolle - Gehalt der die ursprünglichen Pansenbakterien enthaltenden und inkubierten Kultur  (Nährboden aus Pansenflüssigkeit, physiologischem Puffer und Futter) an flüchtigen Fettsäuren (Durchschnitt von 12 Messungen)
 d. wie c., zum Nährboden wurden jedoch 5 ppm Monenzin (Na-Salz)(Eli Lilly, Indianapolis 46 206, USA) gegeben; Durchschnitt von 6 Messungen
 e. wie c., der Nährboden wurde jedoch durch 10 ppm Monenzin (Na-Salz) ergänzt (Durchschnitt von 6 Messungen) 
<tb><TABLE> Columns=9 
<tb>Title: Tabelle 8 
<tb>Head Col 01 AL=L: Bakteriumstamm 
<tb>Head Col 02 AL=L: Bemerkung<+
 mu >g/ml 
<tb>Head Col 03 AL=L: Essigsäure
 mu g/ml 
<tb>Head Col 04 AL=L:

   Propionsäure
 mu g/ml 
<tb>Head Col 05 AL=L: i-Buttersäure
 mu g/ml 
<tb>Head Col 06 AL=L: Buttersäure
 mu g/ml 
<tb>Head Col 07 AL=L: i-Valeriansäure
 mu g/ml 
<tb>Head Col 08 AL=L: Valeriansäure
 mu g/ml 
<tb>Head Col 09 AL=L: Essigsäure/Propionsäure 
<tb> <SEP>Hh-GYOKI <SEP>S <SEP>1,71 <SEP>1,87 <SEP>a <SEP>0,35 <SEP>a <SEP>- <SEP>0,91 
<tb> <SEP>-1-123Sz <SEP>NS <SEP>2,00 <SEP>2,60 <SEP>a <SEP>0,50 <SEP>a <SEP>- <SEP>0,77 
<tb> <SEP>Hh-GYOKI <SEP>S <SEP>0,38 <SEP>0,58 <SEP>a <SEP>0,35 <SEP>a <SEP>- <SEP>0,65 
<tb> <SEP>-2-14Ab <SEP>NS <SEP>1,95 <SEP>1,36 <SEP>a <SEP>0,52 <SEP>0,12 <SEP>a <SEP>1,43 
<tb> <SEP>Hh-GYOKI <SEP>S <SEP>2,21 <SEP>0,67 <SEP>a <SEP>a <SEP>a <SEP>- <SEP>3,29 
<tb> <SEP>-3-81Me <SEP>NS <SEP>2,81 <SEP>0,81 <SEP>a <SEP>a <SEP>a <SEP>- <SEP>3,47 
<tb> <SEP>- b <SEP>1,51 <SEP>0,74 <SEP>a <SEP>0,39 <SEP>a <SEP>a <SEP>2,04 
<tb> <SEP>- c <SEP>Kontrol <SEP>1,68 

   <SEP>0,91 <SEP>a <SEP>0,51 <SEP>0,11 <SEP>0,09 <SEP>1,84 
<tb> <SEP>- d <SEP>1,69 <SEP>1,08 <SEP>a <SEP>0,41 <SEP>a <SEP>a <SEP>1,67 
<tb> <SEP>- e <SEP>1,61 <SEP>0,91 <SEP>a <SEP>0,37 <SEP>a <SEP>a <SEP>1,77 
<tb> <SEP>Hh-GYOKI-48a <SEP>S <SEP>1,26 <SEP>1,60 <SEP>a <SEP>0,32 <SEP>a <SEP>- <SEP>0,79 
<tb> <SEP>NS <SEP>1,21 <SEP>2,38 <SEP>a <SEP>0,34 <SEP>0,48 <SEP>a <SEP>0,51 
<tb> <SEP>Hh-GYOKI-50a <SEP>S <SEP>1,44 <SEP>1,56 <SEP>a <SEP>0,34 <SEP>a <SEP>- <SEP>0,92 
<tb> <SEP>NS <SEP>1,73 <SEP>2,01 <SEP>a <SEP>0,35 <SEP>0,15 <SEP>- <SEP>0,86 
<tb> <SEP>Hh-GYOKI-51a <SEP>S <SEP>2,37 <SEP>0,47 <SEP>a <SEP>0,36 <SEP>a <SEP>- <SEP>5,04 
<tb> <SEP>NS <SEP>2,02 <SEP>0,70 <SEP>a <SEP>0,35 <SEP>0,15 <SEP>- <SEP>2,89 
<tb> <SEP>Hh-GYOKI-55a <SEP>S <SEP>2,10 <SEP>0,51 <SEP>a <SEP>0,34 <SEP>a <SEP>- <SEP>4,12 
<tb> <SEP>NS <SEP>2,18 <SEP>0,78 <SEP>a <SEP>0,37 <SEP>0,14 <SEP>- <SEP>2,79 
<tb> 

   <SEP>Hh-GYOKI-113 <SEP>S <SEP>1,39 <SEP>0,67 <SEP>a <SEP>0,34 <SEP>- <SEP>- <SEP>2,07 
<tb> <SEP>NS <SEP>1,77 <SEP>0,60 <SEP>a <SEP>0,27 <SEP>- <SEP>- <SEP>2,95 
<tb> <SEP>Hh-GYOKI-122 <SEP>S <SEP>1,31 <SEP>0,87 <SEP>a <SEP>0,31 <SEP>- <SEP>- <SEP>1,50 
<tb> <SEP>NS <SEP>2,02 <SEP>0,91 <SEP>a <SEP>0,31 <SEP>- <SEP>- <SEP>2,22 
<tb> <SEP>Hh-GYOKI-109b <SEP>S <SEP>2,49 <SEP>0,45 <SEP>a <SEP>0,29 <SEP>- <SEP>- <SEP>5,53 
<tb> <SEP>NS <SEP>2,92 <SEP>0,36 <SEP>a <SEP>0,30 <SEP>- <SEP>- <SEP>8,11 
<tb> <SEP>Hh-GYOKI-126 <SEP>S <SEP>0,56 <SEP>0,60 <SEP>a <SEP>0,52 <SEP>a <SEP>a <SEP>0,93 
<tb> <SEP>NS <SEP>0,83 <SEP>1,14 <SEP>a <SEP>1,55 <SEP>0,11 <SEP>0,70 <SEP>0,73 
<tb></TABLE> 



  Aus den Tabellenangaben ist ersichtlich, dass durch Gabe der erfindungsgemässen Mikroorganismenkulturen das Verhältnis der durch die metabolische Tätigkeit der Pansenflora entstehenden flüchtigen Fettsäuren in einem breiten Bereich geändert werden kann. Mit der aus dem Stamm Hh-GYOKI-48a hergestellten Kultur kann zum Beispiel die Propionsäureproduktion gesteigert werden, gleichzeitig ist durch die Kultur des Mikroorganismus Hh-GYOKI-109b die Essigsäureproduktion erhöhbar. Die Steigerung der Produktion der einzelnen Fettsäuren kann auch auf Nährböden, die keine anderen Mikroorganismen enthalten (S), oder in Gegenwart der üblichen Pansenbakterien (NS) beobachtet werden. In dem verwendeten Versuchssystem mit Monenzin-Na-Salz sank das Essigsäure/Propionsäure-Verhältnis (d, e) um 1-2 Zehntel. 



  Die nach dem Verfahren des Beispiels ausgewählten Mikroorganismen werden durch Wiederholung der in Punkt B des Beispiels 1 beschriebenen Massnahmen genetisch gekennzeichnet, wiederkäuenden Tieren verabreicht, und ihre Vermehrung im Pansen wird untersucht. Der sich im Pansen lange Zeit vermehrende und mit einem günstigen Metabolismus ausgestattete Stamm wird in entsprechender Form zur Steuerung der Produktion von flüchtigen Fettsäuren verwendet. 


 Beispiel 5 
 


 Herstellung eines Bakterienpräparates, das Tieren verabreicht werden kann 
 



  Das zu verabreichende Bakterium wird auf RGCA-CG-Nährboden der in Beispiel 4 angegebenen Zusammensetzung unter anaeroben Bedingungen gezüchtet. Nach der Züchtung werden die Zellen auf bekannte Weise getrennt, z.B. durch Filtrieren oder Zentrifugieren. Die abgetrennten Zellen werden in physiologischem Puffer (siehe Beispiel 4) suspendiert und gefriergetrocknet. Das lyophilisierte Bakterienpräparat wird gespeichert und  gegebenenfalls, entsprechend formuliert, Tieren verabreicht. 



  Das Anlegen einer Mikroorganismenkultur kann auch auf anderen, in Fachkreisen gut bekannten Nährböden durchgeführt werden, beispielsweise auf Nährböden, die als Kohlenstoffquelle Glucose, Stärke usw., als Stickstoffquelle anorganische Salze enthalten. 



  Das Präparat kann unter das Futter gemischt verabreicht werden, aber auch im Trinkwasser, selbständig oder mit anderen biologisch aktiven Stoffen, wie z.B. mit Antibiotika, Vitaminen, zusammen. 



  Ausser dem lyophilisierten Präparat können auch andere Produkte hergestellt werden. Der Mikroorganismus kann auch nach dem Mischen der durch Zentrifugieren oder Filtrieren abgetrennten Bakterienmasse mit den entsprechenden Träger- oder Verdünnungsstoffen, z.B. mit Calciumcarbonat, Getreide, Premix oder anderen Futtermitteln, verabreicht werden. 



  Abhängig vom verwendeten Futter und von der Produktionsrichtung wird festgelegt, welche der mit dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellten und die Pansenflora günstig beeinflussenden Mikroorganismen verabreicht werden, und in welcher Menge. Soll der Essigsäure-Propionsäure-Quotient gesenkt werden, wird z.B. die aus dem Stamm Hh-GYOKI-48a hergestellte Kultur verabreicht, soll er erhöht werden, wird beispielsweise die Kultur des Mikroorganismus Hh-GYOKI-3-81Me gegeben. Werden stickstoffbindende Bakterien gegeben, so kann die Menge der den Wiederkäuern zu verabreichenden Menge an organischer Stickstoffquelle verringert werden. Die Festlegung der zum Erreichen der gewünschten Wirkung notwendigen Zellenanzahl ist für einen Fachmann kein Problem.

  Die Zellen werden im allgemeinen in einer Menge verabreicht, dass sich in einem Milliliter des Panseninhalts die Zahl der gegebenen Mikroorganismenzellen zwischen 5 x 10<2> und 5 x 10<7> bewegt. 


 Beispiel 6 
 


 Die Gabe der Stämme Hh-GYOKI-48a und Hh-GYOKI-1-123Sz an Schafe 
 



   Auf dem Nährboden RGCA-CG der in Beispiel 4 angegebenen Zusammensetzung wird eine Kultur des Mikroorganismus Hh-GYOKI-48a angelegt. Die Züchtung wird in zwei Fermentoren mit einem Nutzvolumen von 5 Litern, bei einer Temperatur von 37 DEG C, unter anaeroben Bedingungen durchgeführt. Die Fermentation wird mit dem Impfen von 10 ml eines auf Nährboden gleicher Zusammensetzung hergestellten Inokulums begonnen und 48 Stunden hindurch fortgesetzt. Danach werden die Zellen durch Zentrifugieren in einem Rotor mit einer Umdrehungszahl von 5000/min abgetrennt, und der so erhaltene zentrifugenfeuchte Niederschlag von 58 g wird sorgfältig mit 4 kg Maisschrot vermischt. Das Gemisch wird in 8 Teile geteilt und an 8 Schafe verabreicht. Die Tiere liess man vorher einen Tag lang hungern. 



  Der obige Vorgang wird wiederholt, anstelle des Mikroorganismus Hh-GYOKI-48a wird jedoch der Stamm Hh-GYOKI-1-123Sz verwendet. Das aus 53 g Biomasse und 4 kg Maisschrot bereitete Präparat wird 8 Schafen verabreicht. 



  Die Tiere bekamen das Präparat in einem Alter von 3 Monaten. Als Kontrolle dienten 8 Tiere. Nach der Gabe wurde die Fütterung ad libitum mit Heu fortgeführt und wöchentlich das Gewicht der Tiere bestimmt. 



  Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 angegeben: 
<tb><TABLE> Columns=7 
<tb>Title: Tabelle 9 
<tb>Head Col 01 to 07 AL=L: Gewichtsveränderung von ad libitum mit Wiesenheu gefütterten Schafen (kg) 
<tb>Head Col 01 to 07 AL=L: (Futter: Wiesenheu ad libitum (600-900 g/Tag) und 100 g/Tag Mineralsalz- und Vitaminzusatz im Maisschrot-Trägerstoff). 
<tb>SubHead Col 01 AL=L>Lfd.

  Nr.: 
<tb>SubHead Col 02 AL=L>Ausgangsgewicht: 
<tb>SubHead Col 03 AL=L>1.: 
<tb>SubHead Col 04 AL=L>2.: 
<tb>SubHead Col 05 AL=L>3.: 
<tb>SubHead Col 06 AL=L>4.: 
<tb>SubHead Col 07 AL=L>5.: 
<tb>SubHead Col 03 to 07 AL=C: Woche 
<tb> <SEP>Kontrol 
<tb> <SEP>1 <SEP>29.0 <SEP>29.5 <SEP>30.0 <SEP>29.5 <SEP>29.5 <SEP>29.5 
<tb> <SEP>2 <SEP>27.0 <SEP>27.5 <SEP>28.5 <SEP>27.0 <SEP>26.5 <SEP>28.0 
<tb> <SEP>3 <SEP>28.5 <SEP>27.0 <SEP>27.0 <SEP>27.5 <SEP>26.5 <SEP>26.5 
<tb> <SEP>4 <SEP>30.0 <SEP>30.5 <SEP>30.0 <SEP>30.5 <SEP>30.0 <SEP>29.0 
<tb> <SEP>5 <SEP>29.5 <SEP>30.0 <SEP>29.0 <SEP>30.5 <SEP>29.5 <SEP>30.0 
<tb> <SEP>6 <SEP>25.0 <SEP>25.5 <SEP>26.5 <SEP>26.0 <SEP>26.0 <SEP>27.5 
<tb> <SEP>7 <SEP>27.0 <SEP>27.0 <SEP>27.5 <SEP>28.0 <SEP>28.0 <SEP>28.0 
<tb>SubHead Col 01 to 07 AL=C:

  Behandelt mit dem Stamm Hh-GYOKI-1-123Sz 
<tb> <SEP>8 <SEP>29.5 <SEP>32.0 <SEP>32.5 <SEP>33.0 <SEP>33.5 <SEP>34.0 
<tb> <SEP>9 <SEP>25.5 <SEP>26.5 <SEP>27.0 <SEP>28.5 <SEP>29.5 <SEP>29.0 
<tb> <SEP>10 <SEP>25.0 <SEP>25.5 <SEP>25.0 <SEP>28.0 <SEP>29.0 <SEP>28.5 
<tb> <SEP>11 <SEP>25.5 <SEP>24.5 <SEP>25.5 <SEP>27.5 <SEP>27.0 <SEP>28.0 
<tb> <SEP>12 <SEP>29.0 <SEP>28.0 <SEP>29.0 <SEP>28.5 <SEP>29.0 <SEP>30.0 
<tb> <SEP>13 <SEP>29.5 <SEP>30.0 <SEP>30.5 <SEP>29.5 <SEP>29.5 <SEP>30.5 
<tb> <SEP>14 <SEP>29.5 <SEP>28.5 <SEP>29.5 <SEP>30.0 <SEP>30.5 <SEP>31.0 
<tb> <SEP>15 <SEP>28.5 <SEP>29.0 <SEP>30.5 <SEP>30.0 <SEP>30.5 <SEP>32.0 
<tb>SubHead Col 01 to 07 AL=C:

  Behandelt mit dem Stamm Hh-GYOKI-48a 
<tb> <SEP>16 <SEP>29.5 <SEP>30.0 <SEP>30.5 <SEP>31.0 <SEP>32.0 <SEP>33.5 
<tb> <SEP>17 <SEP>26.5 <SEP>25.0 <SEP>26.5 <SEP>27.0 <SEP>29.0 <SEP>30.0 
<tb> <SEP>18 <SEP>27.0 <SEP>27.5 <SEP>28.5 <SEP>29.5 <SEP>30.5 <SEP>31.0 
<tb> <SEP>19 <SEP>26.0 <SEP>26.0 <SEP>27.0 <SEP>28.0 <SEP>29.0 <SEP>30.5 
<tb> <SEP>20 <SEP>29.5 <SEP>30.5 <SEP>31.0 <SEP>31.5 <SEP>32.5 <SEP>33.0 
<tb> <SEP>21 <SEP>28.0 <SEP>28.0 <SEP>28.0 <SEP>29.0 <SEP>29.0 <SEP>30.0 
<tb> <SEP>22 <SEP>29.0 <SEP>30.5 <SEP>33.2 <SEP>30.0 <SEP>32.8 <SEP>33.5 
<tb> <SEP>23 <SEP>27.0 <SEP>26.0 <SEP>27.5 <SEP>29.0 <SEP>31.0 <SEP>32.0 
<tb></TABLE> 



  Aus den obigen Angaben wird die auf ein Tier entfallende durchschnittliche tägliche Gewichtszunahme errechnet. Die Ergebnisse sind aus Tabelle 10 ersichtlich. 
<tb><TABLE> Columns=7 
<tb>Title: Tabelle 10 
<tb>Head Col 01 to 07 AL=L: Die durchschnittliche tägliche Gewichtsveränderung der Versuchstiere, auf ein Tier gerechnet, und die Durchschnittsgewichte 
<tb>SubHead Col 01 to 02 AL=L: Ausgangsgew. 
<tb>SubHead Col 03 AL=L>1.: 
<tb>SubHead Col 04 AL=L>2.: 
<tb>SubHead Col 05 AL=L>3.: 
<tb>SubHead Col 06 AL=L>4.: 
<tb>SubHead Col 07 AL=L>5.: 
<tb>SubHead Col 03 to 07 AL=C: Woche 
<tb> <SEP>Kontrolle 
<tb> <SEP>Durchschnittsgew. (kg) <SEP>28.00 <SEP>28.14 <SEP>28.36 <SEP>28.43 <SEP>28.00 <SEP>28.36 
<tb> <SEP>Gewichtsveränd.

  <SEP>(g) <SEP>+20 <SEP>+31 <SEP>+10 <SEP>-61 <SEP>+51 
<tb>SubHead Col 01 to 07 AL=C: Behandelt mit dem Stamm Hh-GYOKI-1-123Sz 
<tb> <SEP>Durchschnittsgew. (kg) <SEP>27.75 <SEP>28.00 <SEP>28.69 <SEP>29.31 <SEP>29.81 <SEP>30.37 
<tb> <SEP>Gewichtsveränd. <SEP>(g) <SEP>+31 <SEP>+86 <SEP>+77 <SEP>+62 <SEP>+70 
<tb>SubHead Col 01 to 07 AL=C: Behandelt mit dem Stamm Hh-GYOKI-48a 
<tb> <SEP>Durchschnittsgew. (kg) <SEP>27.81 <SEP>27.94 <SEP>29.02 <SEP>29.37 <SEP>30.73 <SEP>31.69 
<tb> <SEP>Gewichtsveränd. <SEP>(g) <SEP>+16 <SEP>+135 <SEP>+44 <SEP>+170 <SEP>+120 
<tb></TABLE> 



  Bei den Tieren der Kontrollgruppe konnte bei kargem Futter innerhalb von 35 Tagen eine Gewichtszunahme von 360 g, bei den mit dem Stamm Hh-GYOKI-1-123Sz behandelten Tieren eine Gewichtszunahme von 2620 g und bei den mit dem Stamm Hh-GYOKI-48a behandelten Tieren eine Gewichtszunahme von 3875 g verzeichnet werden. 



  Die Ausgangskörpergewichte zeigen keine signifikanten Abweichungen, im Gegensatz zu den End-Körpergewichten und der täglichen Gewichtszunahme (Tabelle 11 und 12, wo signifikante Unterschiede gefunden wurden). 



  Die sich auf die Daten von 5 Wochen beziehenden mathematisch-statistischen Angaben sind in Tabelle 12 aufgeführt. 
<tb><TABLE> Columns=4 
<tb>Title: Tabelle 11 
<tb>Head Col 01 to 04 AL=L: Mathematisch-statistische Angaben 
<tb>SubHead Col 02 AL=L>Kontrolle: 
<tb>SubHead Col 03 AL=L>Hh-GYOKI-1-123Sz: 
<tb>SubHead Col 04 AL=L>Hh-GYOKI-48a: 
<tb> <SEP>Arithmetisches Mittel (kg) <SEP>28,357 <SEP>30,375 <SEP>31,6875 
<tb> <SEP>Korr. quadrat. Strennung <SEP>1,476 <SEP>3,910 <SEP>2,281 
<tb> <SEP>Korr. relat.

  Strennung <SEP>&lt 5,0 <SEP>&lt 0,1 
<tb></TABLE> 
<tb><TABLE> Columns=4 
<tb>Title: Tabelle 12 
<tb>Head Col 01 to 04 AL=L: Statistische Auswertung der Gewichtszunahme 
<tb>SubHead Col 02 AL=L>Kontrolle: 
<tb>SubHead Col 03 AL=L>Hh-GYOKI-1-123Sz: 
<tb>SubHead Col 04 AL=L>Hh-GYOKI-48a: 
<tb> <SEP>Zahl der Tiere <SEP>7 <SEP>8 <SEP>8 
<tb> <SEP>gesamte Gewichtszunahme der Gruppe (kg) <SEP>2,5 <SEP>21,0 <SEP>31,0 
<tb> <SEP>maximale Steigerung (kg) <SEP>2,5 <SEP>4,5 <SEP>5,0 
<tb> <SEP>minimale Steigerung (kg) <SEP>-2,0 <SEP>1,0 <SEP>2,0 
<tb> <SEP>durchschnittl. Steiger./Schaf (kg) <SEP>0,3571 <SEP>2,6250 <SEP>3,8750 
<tb> <SEP>korr. quadrat. Strennung <SEP>2,143 <SEP>1,768 <SEP>0,839 
<tb> <SEP>Standardabweichung <SEP>+/- 1,355 <SEP>+/- 1,244 <SEP>+/- 0,857 
<tb></TABLE> 



   Aus den obigen Angaben ist ersichtlich, dass die mit dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellten Präparate die Gewichtszunahme der Schafe bedeutend steigern. 


 Beispiel 9 
 


 Erhaltung von genetisch markierten Bakterien im Pansen von Rindern 
 



   Es wird nach Punkt C des Beispiels 1 verfahren mit dem Unterschied, dass der gegenüber 10 000  mu g/ml Kanamycin resistente Stamm Hh-GYOKI-1-123Sz in 4 l RGCFa-Medium gezüchtet wird. Nach Erreichen der stationären Phase (38. Stunde) wird die Biomasse durch Zentrifugieren (5000 Umdrehungen/min) abgetrennt, die Zellen werden gründlich mit 500 g Maismehl vermischt und dann an eine Kuh verfüttert. Durch die Fisteln werden wöchentlich Proben entnommen, das Vorhandensein des verabreichten Stammes im Pansen wird nach Punkt C des Beispiels 1 bestimmt. 



  Die Ergebnisse beweisen, dass der Stamm Hh-GYOKI-1-123Sz sich im Pansen von Kühen gut vermehrt und dort mindestens 40 Tage lang am Leben bleibt. 

Claims (10)

1. Präparat zur Verbesserung der Futterverwertung von Wiederkäuern, dadurch gekennzeichnet, dass es als Wirkstoff eine oder mehrere Mikroorganismenkulturen enthält, die das Gewichtsverhältnis der im Pansen produzierten Essigsäure und Propionsäure auf einen Bereich von 1,5-4,0:1 einstellen können und fähig sind, im Pansen mindestens 60 Tage lang am Leben zu bleiben und sich zu vermehren.

2. Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirkstoff höchstens in einer Menge von 95 Gew.-% enthalten ist.

3. Präparat nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass eine Mikroorganismenkultur enthalten ist, die das Gewichtsverhältnis der im Pansen produzierten Essigsäure und Propionsäure auf einen Bereich von 2,0-3,5:1 einstellen kann.

4.

Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass als Mikroorganismenkultur der in der National Collection of Agricultural and Idustrial Microorganisms, H-1502 Budapest unter der Nummer NCAIM B/P/00287 und/oder NCAIM B/P/000288 und/oder NCAIM B/P/00289 deponierte Mikroorganismenstamm enthalten ist.

5. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus in Pastenform in Form von gefriergetrockneten Präparaten oder Suspensionen formuliert ist.

6.

Verfahren zur Herstellung von den Wirkstoff des Präparates nach Anspruch 1 bildenden Mikroorganismenkulturen, dadurch gekennzeichnet, dass aus dem Pansen von mit einem gegebenen Futter gefütterten Wiederkäuern Proben genommen werden, der Stoffwechsel der aus den Proben isolierten Mikroorganismen in vitro und/oder in vivo untersucht wird und von den Mikroorganismen, die einen vorteilhaften Stoffwechsel aufweisen, auf einem Nährboden, der das jeweilige Futter als Kohlenstoff- oder Stickstoffquelle enthält, eine Kultur angelegt wird, in die wachsenden Mikroorganismenzellen Selektion ermöglichende genetische Marker eingeführt werden die genetisch markierten Stämme gezüchtet und die Kulturen in den Pansen von mit dem jeweiligen Futter ernährten Tieren zurückgebracht werden, aus den Pansen Proben genommen werden, die Anzahl der genetisch markierten Mikroorganismenzellen bestimmt wird,

dann die mindestens 60 Tage lange vorhandenen und die Verdauung der Tiere günstig beeinflussenden Stämme abgesondert werden.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass als genetischer Marker Antibiotikumresistenz verwendet wird.

8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikroorganismen aus dem Pansen von mit cellulosehaltigem Futter, vorzugsweise Heu, gefütterten, mit stärkehaltigem Futter, vorzugsweise Getreideprodukten, gefütterten oder Mono- und/oder Disaccharide enthaltendem Futter, vorzugsweise Melasse, gefütterten Tieren isoliert werden, dann die genetisch markierten Stämme zum Zwecke von Untersuchungen in den Pansen der mit einem der obigen Futter gefütterten Tiere zurückgebracht, nach dem Anlegem einer Kultur die Mikroorganismen abgetrennt und die erhaltenen Kulturen gewünschtenfalls in geeigneter Weise formuliert werden.

9.

Verfahren nach einem der Ansprüche 6-8, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikroorganismenzellen in lyophilisierter Form abgetrennt werden.

10. Verfahren zur Verbesserung der Futterverwertung von Wiederkäuern, dadurch gekennzeichnet, dass diesen Tieren eine wirksame Menge Mikroorganismenkultur verabreicht wird, die das Gewichtsverhältnis der im Pansen produzierten Essigsäure und Propionsäure auf einen optimalen Bereich von 1,5-4,0:1 einstellen kann und fähig ist, wenigstens 60 Tage lang am Leben zu bleiben und sich zu vermehren.