JPS6192539A - 反▲すう▼動物飼料の利用効率を改良するための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、反Ｉ６！Ｉｌｌ物飼料の利用効率を改良する
ための組成物に係る。更に詳しくは、本発明は、有効成
分として、酢酸対プロピオン酸の重量比を最適値、好ま
しくは１．５〜４，０　：　１に調整することができか
つルーメン内で増殖しまたルーメン内で少なくとも６０
日間残存することができるＩＦＩＩ以上の微生物培養物
を、随時キャリヤー、希釈剤、畜産および栄養物におい
て通常用いられる防腐剤、ならびに／または反襲動物に
通常投与される他の物質と混合して含んでなる組成物に
係る。更に、本発明は、上記組成物中で有効成分として
用いられる微生物培養物の調整および該組成物の応用に
係る。

羊〔オビス　ニアリーズ　ニアリーズ（Ｏｖｉｓａｒｉ
ｅｓ　　ａｒｉｅｓ））、畜牛〔ボス　プリミデニウス
　タウラス（Ｂｏｓ　　ｐｒｉｍｉ−Ｈｅｎｉｕｓ　　
ｔａｕｒｕｓ））、やぎ〔カブラヒルカス（Ｃａｐｒａ
　　ｈｉｒｃｕｓ））並びに鹿およびムチ０ン（ｍｏｕ
ｆｌｏｎ）等の同じ系統の野性動物のような複合前を有
する反葛動物は、栄養連鎖でかつ経済上で重要な役割を
演じている。

これらの反葛動物が他の草食獣では利用できない飼料を
食べて生理でいる点が特に重要なのである。

前冑はルーメン　７０−ラ（ｒｅｕｍｅｎｆｌｏｒａ）
のために嫌気性環境を提供し、これは、セルロースを消
化することができかつ普通の栄養分の他に蛋白質白米で
ない窒素を利用する。

ルーメン　７０−ラの組成は、与えられる規定食（ｒａ
ｔｉｏｎ）に依ることが大でありかつ飼料に順応する。

しかしながら、この順応には数日かかり、最終的に安定
するには数週間を要するかも１　　　　°ｔｔＺｖ’ａ
　ｍ’？＝ｆＲｙ＞＊”°１３°°゛゛１“１１化率お
よび生産量に悪影響を及ぼし、病気にかかったりまたは
死さえ生じせしめるかもしれない。

１ｄのルーノン分泌液中には、無数の細菌が生存しかつ
増殖していることは周知である。通常の消化および飼料
摂取のためには、細菌による嫌気性醗酵が極めて重要で
ある。エネルギー生産性栄養分はｌ’ｌｌ＃して、宿主
動物により脂肪酸として使用される酢酸、プロピオン酸
および酪酸となり、腸へと通過する細菌集団は、消化さ
れ、蛋白質源として用いられろ。乳および肉の生産に関
して、酢酸およびプロピオン酸の供給ならびにこれらの
相互の割合が本質的な役割を演じる。従って、ルーメン
　７０−ラは、反ｓ！１ｉｌＪ物飼育場の動物の管理お
よび生産に重要な役割を演する。

誕生後、ルーメン　７０−ラは自然に発育し、固形食へ
の離乳後に成体の組成に達する。しかしながら、この偶
発的７０−ラが最適の醗酵系を示すかは確かでない。経
済上の利益に従って、ルーノン　７０一ラ組成お上り／
または数を？！４整する方法を入手することが有利であ
る６ ルーメン内での揮発性脂肪酸生産の増加、およびそれに
よる飼料利用の改良、かくして肉または乳の生産は畜産
における長い間の切実な要求である。初めは抗コクシジ
ウム剤として使用されていたモネンシン（２−［５−エ
チル−テトラヒドロ−５−（テトラヒドロ−３−メチル
−５−［テトラヒドロ−６−ヒドロキシ−６−（ヒドロ
キシメチル）　−３、５−ジメチル−２Ｈ−ピラン−２
−イル１−２７リルｌ−２−７リルコー９−ヒドロキシ
−β−メトキシ−ａ、γ、２，８−テトラメチルー１，
６−シオキサスピロ［４，５］デカン−７−酪酸］を用
いて、成る種の結果が得られた（例えば、米国特許第４
，０８５，２５５号明細書参照）。サラ／マイシン、ラ
サロシド等のような他の関連ポリエーテル、７タリド誘
導体（米国特許ｍ　４，３３３，９２３号明細書）およ
びアボパルシン、アクタプラニン等のようなグリコペプ
チド〔イングルら（Ｉｎｇｌｅ　　ｅｔ　　ａｌ、）ｗ
　アブストラクト　アメリカン　ソサイエティ　アニマ
ル　サイエンス（ａｂｓｔｒ、Ａｍ、Ｓｏｃ、Ａｎｉｍ
。

Ｓｃｉ、）、４２４頁、１９７８年〕の実験的使用もま
た報告されている６　しかしながら、観察された効果は
、種々の飼料で飼をした動物によりかなり異なっており
、まるで価値がない〔チャルパ。

ダブリｚ＋、（Ｃｈａｌ　ｕｐａ、Ｗ、）による“ルー
メン微生物代署、消化生理機能お上び反葛動物内での代
謝の化学的制御（ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｎｔｒｏｌ　　
ｏｆ　　Ｒｕｍｅｎ　　Ｍｉｃｒｏ−ｂｉａｌ　　Ｍｅ
ｔａ））ｏｌｉｓｍ”、Ｄｉｇｅｓ−ｔｉｖｅ’Ｐｈｙ
ｓｉｏｌｏＨｙａｎｃｌ　　Ｍｅ−ｔａｂｏｌｉｓｍ　
　　　ｉｎ　　　Ｒｕｍ１ｎａｎｔｓ）″會エム働ティ
・ビー　プレス（ＭＴＰ　　ｐｒｅｓｓ）。

ランカスター、英国、１９８０年およびチャルバグブリ
ューら（Ｃｈａｌｕｐａ、Ｗ、ｅｔ　　ａｌ、）による
“モネンシンおよびアミクロラールによるルーノン醗酵
操作（Ｍａｎｉｐｕｌａｔ　ｉｎｇＲｕｍｅｎ　　Ｆｅ
ｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　　ｗｉｔｈＭｏｎｅｎｓｉｎ　
　ａｎｄ　　Ａｍ１ｃｌｏｒａｌ）”。

アブストラクト　アメリカン　ソサイエティ　アニマル
　サイエンス（ａｌ＝＋ｓｔｒ、Ａｍ、Ｓｏｃ。

Ａｎ　ｉ　ｍ、　Ｓｃ　ｔ−）ｗ　４１０Ｅ’（，１９
７８年〕。

反葛動物のルーメン内に存在する微生物培養物が意義の
ある結果を与えるのに直接的に影響を及ばし得るという
方法は本発明の技術分野では知られていない。

本発明者らは、その叉験中に、微生物の分離のために遺
伝的ＭＬ換え法を使用すると好結果を得ることができる
ことに気が付いた。実際には、いがなる細菌菌株も、遺
伝標識、例えば、異った細菌の間での特定の細菌の同定
を可能にする抗生物質耐性因子によって標識することが
可能である。

本発明者らはルーメン微生物を分離し、菌株を遺伝的に
標識し、そして培養後ルーメン内へ再取込みした。次い
で、ルーメンの中味の試料を定期的に採取し、それらの
試料を選択信地で培養した。

宿主動物のために有利な醗酵特性を有しかつ試駐管内で
増殖可能であったいくつかの菌株は、分離中と同じ飼料
が与えられた場合、ルーメン内で増殖しかつルーメン内
に長期間残存することが可能であったし、またこれらの
菌株は消化を刺激し、それによって宿主動物による飼料
利用が刺′ａ？！−れることかわかった。

本発明は、有効成分として、酢酸対プロピオン酸の重量
比を１．５〜４．０　：　１の最適値に調整することが
できかつルーメン内で増殖することができかつルーメン
内で少なくとも６０日間残存することができる１種以上
の微生物培養物を、随時キャリヤー、希釈剤、畜産およ
び栄養物において通常用いられる防腐剤、ならびに／ま
たは反芻動物に通常投与される他の物質と混合して含ん
でなる組成物に係る。

組成物を自生産量の増加のために使用する場合、有効成
分は、好ましくは、酢酸対プロピオン酸の比を２．０〜
３．５　：　１　、例えば２：１に調整することのでき
る微生物培養物である。乳生産のためには、酢酸対プロ
ピオン酸の最適比は約３．０　：　１であり、生存また
は妊娠のためには約４．０　：　１であり、若し雌牛の
飼育のためには約２．０〜３，０　：　１である。従っ
て、酢酸対プロピオン酸の比をこれらの目的のための最
適値に調整することのできる組成物を使用することが得
策である。文献では極めて所望の酢酸対プロピオン酸の
比についてはいくらか不確定であり、好ましい比は反葛
動物使用する飼料および他の因子の関数であって、その
選択は当業者の仕事である（例えば、カウフマン。

グブリュ−（Ｋａｕｆｍａｎｎ、Ｗ）およびロール、ケ
ー（Ｒｏｈｒ、Ｋ）による“デル　アインフルス　デス
　７・７テルス　アラ７　ディ　バクテリーレ　７エル
メンタツイオン　イン　ホルメー　デ　ン゛　　（Ｄｅ
ｒ　　　　　Ｅｉｎｆｌｕｓｓ　　　　　ｄ　ｅｓＦ　
ｕ　ｔ　ｔ、　ｅ　ｒ　ｓ　　ａ　ｕ　ｆ　　ｃｌ　ｉ
　ｅ　　））　ａ　ｋ　ｔ　ｅ−ｒｉｅｌｌｅ　　Ｆｅ
ｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　　ｉｎＶ　Ｏｒ　ｍ　ａ已ｅｎ
）”、ハントフンク　デル　チールネールン（Ｈａｎｄ
ｂｕｃｈ　　ｃｌｅｒＴｉｅｒｎａｈｒｕｎｇ）、２６
３頁、１９６９年、バレイ、ハンブルグ、ベルリン（Ｐ
ａｒｅｙ。

Ｈａｍｂｕｒ３．Ｂｅｒｌ　ｉ　ｎ）参照〕。

本発明は、更に、上記組成物中で有効成分として使用し
た微生物培養物のＳ！４’！１方法であって、一定の飼
料または規定文で飼をした動物のルーメンがら試料を採
取し、 該試料から分離した微生物の代謝を試験管内および／ま
たは生体内で調べ、そして有利な代＃特性を持つ微生物
を、炭素源または窒素源として該飼料または規定文と同
じものを含む培地で培養し、選択を可能にする遺伝標識
形質を増殖微生物に取込み、 遺伝的に標識された菌株を培養し、 培養物を該飼料または規定文と同じもので飼■された動
物のルーメンへ再取込みし、 該ルーメンから飼料を採取し、 遺伝的に標識された菌株の細胞数を数え、少なくとも６
０日問残存しかつ酢酸対プロピオン酸の比を最適値、好
ましくは１．５〜４．０　：　１に調整する菌株を分離
し、そして 所望ならば、これらの菌株を畜産および栄養の実行のた
めに受け入れ得る形に処方してなる該調製方法に係る。

本発明の方法の好ましい実施態様によれば、試料は、干
し草、ひき割り穀類または糖蜜で飼育された贋管付き反
葛動物のルーメンから採取され、またルーノン細菌含有
培養物は、窒素源、炭素源、無機塩類、ルーメン液およ
び寒天な含む固形培地上に広げられる〔プライアント　
アンド　バーキ（Ｂｒｙａｎｔ　　ａｎａｌ　　Ｂｕｒ
ｋｅｙ）、“°ツヤーナル　ディリー　サイエンス（Ｊ
。

Ｄａｉｒｙ　　Ｓｅｔ、）”、　３６，２０５Ｌ１９５
３年〕。培養物を嫌気性条件下でインキュベーシヨンし
、次いでクローンを分離して上記と同じ培地内で培養す
る。

増殖した培！物を、窒素源、無機塩類、ルーメン液およ
び炭素源としてほし草もしくはセルロース、または他の
場合には、ひき割り穀類もしくは糖蜜を含む液体培地に
接種し、培地内で強い増殖が始まるまでインキニーベー
ジタンする。

炭素源としての干し草（セルロース）、ひき割り穀類（
′ＩＱ粉）または糖蜜（ショ糖）上で増殖した細胞を、
炭素源としてセルロース（干し草で増殖した細胞のため
）、グルツース（ひき割り穀類で増殖した細胞のため）
またはショ糖（糖蜜で増殖した細胞のため）を含む固形
培地上に広げ、培養し、分離する。

得られた培養物を遺伝的に標識する。標識のためには、
標識された微生物を他の微生物の開から同定することを
可能にするある種の遺伝する遺伝標識を用いることがで
きる。

本発明のさらに好ましい実施態様によれば、抗生物質耐
性遺伝子が所定の細胞内に取込まれる。

ルーメン内で生存している細菌がある種の抗生物質に対
して感受性でありかつ耐性細胞が細菌に混合されている
場合、試料を同じ抗生物質を含む培地上に拡散させるな
らば、後者の微生物の増殖および死が、容易に伴なって
起るかもしれない。この場合には、耐性細胞だけが増殖
することになる。

形質転換〔ベルグマンズら（Ｂｅｒｇｍａｎｓｅｔ　　
ａｌ−Ｌ　〕ニー・バクテリオロジ−（Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）、１４６，５６４１．１９８１
年〕によって、カナマイシンおよびクロラム７ヱニコー
ル耐性遺伝子を運搬するｐ１０１１プラスミド〔サイモ
ンら（Ｓｉｍｏｎ　　ｅｔａｌ、）、　　Ｐｒｏｃ、　
　　８ｔｈ　　　　Ｎｏｒｔｈ　　　　Ａ　　−ｍｅｒ
ｉｃａｎ　　Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　　Ｃｏｎ−ｆｅｒｅ
ｎｃｅｌＷｉ　ｎｎ　ｉ　ｐｅｇ、Ｃａｎａ　−ｄａｓ
　Ｕｎｉｖ、ｏｆ　　ＭａｎｔｔｏｂａＰｒｅｓｓ、１
９８３年〕を、セルロース、ひき削りｇｌ類またはａｉ
ｆｆｉで増殖する所定の培養物に取込む。プラスミドＤ
ＮＡを大腸菌細胞から分離した〔パーンポイム　アンド
　ドーリ−（Ｂ　ｉ　ｒ　ｎ−ｂｏｉｍ　　ａｎｃｌ　
　Ｄｏｌｙ）、Ｎｕｃｌ、Ａｃ−１ｄ、Ｒｅｓ、７，１
５１３頁、１９７９年〕。

この菌株は、ブタペストのザ　ハン〃リアン　ナショナ
ル　コレクシタン　オプ　メディカル　バクテリア　オ
ブ　ザ　ナショナル　インスティテユート　オブ　ハイ
ジーン（ｔｈｅ　　Ｈｕｎ−ｇａｒｉａｎ　　Ｎａｔｉ
ｏｎａｌ　　Ｃｏ１１ｅｃ−ｔｉｏｎ　　ｏｆ　　Ｍｅ
ｃｌｉｃａｌ　　Ｂａｃｔｅ−ｒｉａ　　ｏｆ　　ｔｈ
ｅ　　Ｎａｔｉｏｎａｌ　　Ｉｎ−５ｔｉｔｕｔｅ　　
ｏｆ　　Ｈｙｇｉｅｎｅ）（ＮＣＭＢ）にＰＪＪ００２
６４号として寄託されている。

抗生物質耐性遺伝子を運搬するＤＮＡによる形質転換後
、新しい遺伝情報を含みかつ表現する細胞は、上記組成
を有するがしかしカナマイシンで補足された固形培地上
で選択される。耐性菌株は貯蔵される。

分離されかつ貯蔵された培養物を、窒素源、無機塩類、
ルーメン液及び果実（半固体軟度を達成するため）を含
む培地に接種し、嫌気性条件下インキュベージタンする
。発育した培養物を、１日間絶食せしめた羊の飼料に混
合する。動物に細菌を与える前後に、ルーノン試料を毎
日採取し、該試料を、カナマイシンを含有する上記固形
培地上に広けて、抗生物質に耐性でかつ感受性の細菌細
胞の数を数える。ルーメン内の揮発性脂肪酸の生産もま
た定性的かつ定量的に測定する。反葛動物による飼料利
用が揮発性脂肪酸の割合により影響を受けることは知ら
れている〔エスヶランドら（ＥＯｋｅｌａｎｄ　　ｅｔ
　　ａｌ、）、ジェー・アニマル　サイエンス（Ｊ、Ａ
ｎ　ｉｍ、Ｓｃ　ｔ、）ｔ３３．２８２真、１９７１年
：チャーチら（Ｃｈｕｒｃｈ　　ｅｔ　　ａｌ、）、”
ＪＸ’ｌｌ）動物の消化生Ｑ　ｔｆｉ能および栄１！（
ＤｉｇｅｓｔｉｖｅＰｈｙＳｉｏｌｏｇｙ　　ａｎｄ　
　Ｎｕｔｒｉ　−ｔｉｏｎ　　ｏｆ　　Ｒｕｍ１ｎａｎ
ｔｓ）”、Ｖｏｌ。

２．６２２〜６２５頁、１９７１年〕。上記したように
、酢酸対プロピオン酸の最適比は、増殖の場合、乳生産
の場合ならびに飼養および妊娠の場合に、それぞれ２．
０〜３．５　：　１　、３　：　１および４：１である
と認められる〔カウフマン　ヴエ及びロール　カー（Ｋ
ａｕｆｍａｎｎ、Ｗ、ａｎｄＲｏｈｒ、に、）：デル　
フインフルス　デス７ツテルス　アラ７　ディ　バクテ
リーレ　フェルメンタツイオン　イン　ホルメーデン（
ＤｅｒＥｉｎｆｌｕｓｓ　　ｄｅｓ　　Ｆｕｔｔｅｒｓ
ａｕｆ　　ｄｉｅ　　ｂａｋｔｅｒｉｅｌｌｅ　　Ｆｅ
ｒ−ｍｅｎｔａｔｉＯｎ　　ｉｎ　　Ｖｏｒｍａｇｅｎ
）＋ハンドブー７　デル　ティエルナールンク（Ｈａｎ
ｄ！＝＋ｕｃｈ　ｃｌｅｒ　Ｔｉｅｒｎａｈｒｕｎｇ）
＋ｐ、２６３．バレイ　ハンブルグーベルリン（Ｐａｒ
ｅｙ、Ｈａｍｂｕｒ　ｇ−Ｂｅｒ　１　ｉ　ｎ）１９６
９）。

本発明の方法の好ましい実施態様に従って、ルーノン試
料から細菌を分離し、分離物の揮発性脂肪酸の生産能を
調べる。微生物を、ルーメン液を含む上記完全培地内で
嫌気性条件で培養し、次いで培養物の酢酸、プロピオン
酸および酪酸濃度を調べる。揮発性脂肪酸を所望の割合
で生産する微生物＃胞を遺伝的に標識し、それらのルー
メン内増殖を調べる。

少なくとも６０日間上記飼料で飼育した動物のルーメン
内で増殖することができかつ規定文の炭水化物をｒｓ酵
して最適比の揮発性脂肪酸にすることがでさる菌株を選
択し、増殖し、分離し、保持し、貯蔵する。所望ならば
、これらの培養物を、畜産のために受容でさる形状にし
て、ルーメン７０−ラを発育させまたは調節するために
、反葛動物に経口投与する。

干し草、ひき割り穀Ｍまたは糖蜜でそれぞれ飼育した動
物のルーメン内で増殖することのできる３１９１の菌株
、Ｈｈ−ＧＹＯＫＩ−１−１２３Ｓｚ。

Ｈｈ−ＧＹＯＫＩ−２−１４ＡｂおよびＨｈ−ＧＹＯＫ
Ｉ−３−８１Ｍｅは、長期間ルーメン内に残存すること
が可能であり、かつ消化作用に有利な影響を及ぼしたが
、それぞれ、前記ハン〃リアン　ナショナル　コレクシ
ョン　オプ　メディカル　バクテリア　オプ　ザ　ナシ
ョナル　インスティテエート　オブ　ハイジーンに、ｆ
ｊＳ００２Ｂ７号、１００２８８および第００２８９号
としで寄託された。

本発明に従って、炭素源、窒素源、無機塩類、還元剤お
よびルーメン液を含む培地内で、酸素を排除した嫌気性
条件下、３２℃〜３７°Ｃで、ルーメン由来の微生物を
培養することが好ましい。ルーメン液が増殖因子を与え
る。炭素源として、グルコース、セルロース、干し草、
ひき割り穀類または糖類を使用することができ、無機塩
類、酵母エキス、カゼインおよび類似添加物は窒素源と
して適している。

本発明の本質的Ｕ徴は、与えられた飼料または規定文を
有利に醗酵しかつ長期間ルーメン内に残存することので
きるｍ細胞微生物をルーノン　７０−ラの調節のために
使用するということである。

かかる菌株の選択のために、上記したように、例えば遺
伝子の暗号性は抗生物質耐性、酵素蛋白質または他の検
出可能な蛋白質のような遺伝標識を使用する。栄養素要
求体細胞もまた使用できる。

ベクターＤＮＡ分子、例えばプラスミドまたは７アーノ
によって、遺伝標識を細胞に取込むが、自然選択によっ
ても、選択性特性、例えば抗生物質耐性を選択すること
ができる。

搾乳反芻動物におけるルーメン　、７０−ラの発■を強
めるため、または馴化したルーノン　７０−ラの組成を
有利に改良するため、有利な醗酵特性を有しかつ長期間
ルーメン内に残存する所定の菌株が使用される。製剤を
飼料または飲料水とともに投与することが推奨される。

本発明に従って製剤を造るために選択された微生物を、
有機炭素源、有機または無機窒素源ならびに有機および
無機塩類を含む培地で培養し、次いで分離して経口投与
または輸送のために適した形状にする。所望ならば、微
生物培養物を固体もしくは液体キャリヤーまたは他の添
加剤と混合することにより、該培養物を処方する。製剤
は、飼料もしくは飲料水に混合することができまたは単
独で与えることもできる。

羊の場合、例えば１〜２０ｇ１好ましくは５ｓの本発明
による微生物培養物を約０．５幻の飼料に１　　　　　
１″・１料２Ｉ′″ｆ・０堅：Ｉ−＞５−を喧ｃｏｒｎ
　−’　　　　　　　ｍｅｅｌ）、アル７ｒルアｒ、干
し草および肉牛飼料の混合物を使用することが可能であ
り、実際の割合は、実際の条件および所望の毎日の体重
増加を考慮して決められるべきである。畜牛には、１日
のために一般に１０〜２００　ｇ、好ましくは５０ｇの
本発明による微生物培養物を、例えば、約５に１！の通
常の飼料と混合して投与する。

反葛動物の飼料の利用効率を改良するための方法もまた
本発明の範囲内にある。

上記したように、液体培地内で培養した後、遠心分離ま
たはＦ’過によって微生物を分離する。胞子または発育
形等を含むペースト、凍結乾燥製剤または懸濁液を調製
することが可能でありまた畜産及び栄養のために受容で
きる添加剤を加えることも可能である。他の添加剤、例
えば蛋白質、アミノ酸またはグリセロールは微生物を生
■しうるようにするのに役立ち得る０反勢動物における
飼料の利用を改良するに使用する本発明の組成物に、通
常実際に使用される他の物質、例えば、宿主動物の生育
を刺激する抗性物質（モネンシン、ニブリシン、サリノ
マイシン等）または与えられる微生物の残存を高める抗
生物質を加えることも可能である。

本発明による微生物培養物はルーメン内における生存微
生物培養物の形成または馴化した７０−ラの有利な改良
を可能にする。

搾乳期間の間、ルーメン　７０−ラは普通の飼料を効果
的に醗酵することができない。７０−ラは自然的にかつ
偶然的に生育する。その組成が宿主動物に対して最適で
あるとは必ずしもいえない。

選ばれた微生物菌株を供給することによって、ルーノン
　７０−ラの遅い、自然生育の代りに、速い生育を達成
することが可能であり、またそのルーノン　７０−ラは
飼料を最適に利用することが可能である。

本発明の利点は、上記方法で調製した微生物（例えば、
菌株ＮＣＭＢ第００２８７号、ｆＩＳｏ。

２８８号および第００２８９号）の場合、飼料の最適劣
化を可能にする微生物のルーメン内増殖を増すことによ
って、飼料の変化または離乳の間、ルーノン　７０−ラ
の速い適合または発育を促進することができる。

上記方法は、とりわけ次の場合に、すなわち−乳汁分泌
が変化している間、妊娠の終りに、ならびに規定食が季
節的におよび他の原因で変化している開、毎日、牛に対
して、 一放牧期間の始めと終りに、粗質物による肥育からひき
割り穀類による強力な肥育へと変化する際、および発育
−肥育食の他の変化の間、肉牛に対して、 一飼料摂取が季節的に変化している間、放牧期間の初め
と終りに、および強力な成長および肥育が始まる間、羊
に対して、 使用することができる。

ヤギの育種においてもまた、同様な可能性がある。本発
明に方法によって調製された微生物培養物は、数種の特
別な場合においても、例えば野性反葛動物に対して、猟
烏′ｖ、類保護地域においておよびグマジカ（ｆａｌ　
ｌｏｗｓ−ｄｅｅｒ）に対しても使用することが可能で
ある。

本発明の組成物中で使用される微生物培養物は、好まし
くはルーノン由来のものであるけれども、必ずしものル
ーメンから生じていない他の酢酸および／またはプロピ
オン酸生産性細菌もまた適していることは注目すべきで
ある。かかる細菌には、アンゾロビブリオ（リポリチカ
）（Ａｎｇｒｏ−ｖｉｂｒｉｏ）（１１ｐｏｌｙｔｉｃ
ａ）属、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｃ（ｅｓ）
属１セレノモナス（ルミナンチカム）（Ｓｅｌｅｎｏ−
ｍｏｎａｓ　（ｒｕｍｉｎａｎｔｉｃｕｍ））属および
プロピオニバクテリア（Ｐｒｏｐｉｏｎｉ　−ｂａｃｔ
ｅｒｉａ）属のある種のものが含まれる。

本発明を、以下の、非制限的な実施例の助けによってさ
らに説明する。

セルロース（干し草）、澱粉（ひき割り穀類）またはシ
１糖（糖蜜）を主として含む基礎食料を利用することが
できかつルーメン内に長期間残存する微生物菌株の調製
について詳細に記載する６調製法は羊に対して記載しで
あるが、保護の範囲は、他の飼料で成長することのでき
る微生物、ならびにその上池の反葛動物種のルーメン　
７ｕ−ラの発育または改良にまでわたっている。

実施例１ 干し草で飼育した動物のルーメン　７０−ラの改良 Ａ）干し草で増殖可能な微生物の分離 羊を開腹してルー７ン痘管を取り付け、１ケ月間干し草
で飼育した。ルーノン試料を贋管を通して採取し、希釈
し、次の組成を有するＲＧＣＡ固形培地上に拡散せしめ
た。

塩溶ａｔ： に２ＨＰＯ４０，６ＦＩ 蒸留水　　　　　　全量１００，０．まで添加塩溶液■
： ＮａＣ１１，２ｇ （Ｎ　Ｈ４）２８０４　　　　　　１．２　ｙＫＨ２Ｐ
Ｏ４０，６ＪＦ ＣａＣ１２０，１２ｙ Ｍ　ｇ　Ｓ　０４・７Ｈ２００，２５ｙ蒸留水　　　　
　　全量１００．Ｏｄ虫で添加レサズリン（０，１％溶
液）　　　０．ｉｎ本 寒天〔バクト（Ｂａｃｔｏ））　　　　２．５　ｇルー
メン液”　　　　　　　１０．Ｏｗｌ！グルコース　　
　　　　　　Ｏ，ＯＳ　。

セロビオース　　　　　　　０．０５　。

システィン塩酸−水和物　　０．０５　ｇ炭酸ナトリウ
ム（８％溶液）５，０゜ 蒸留水　　　　　　　全量５０．０ｄまで添加本）米国
、デトロイト市、ディ７コ、ラボラトリーズＣＤ　ｉ　
ｆ　ｃｏ　　Ｌａｂｓ、　）製＊＊）ルーノンの中味の
試料を数層の〃−ゼを通しで濾過し、次いで炉液を二酸
化炭素下、−２０℃で貯薫した。

Ｃｏ２ｆｆス下での滅菌前に、ＲＧＣＡ培地のｐＨを６
．８に？ｆ４整した。滅菌、培地調製および培養は、プ
ライアント　アンド　バーキー（Ｂ　ｒ　ｙ−ａｎｔ　
　ａｎｃＪ　　ＢｕｒＩｃｅｙ）［ジャーナル　ディリ
ー　サイエンｌ　（Ｊ、Ｄａ　ｉ　ｒｙ　　Ｓｃ　ｉ、
）。

３６．２０５頁、１９５３年］に従って行った。

ルーメン液を、次の組成を有する無菌混合物で希釈した
。

塩溶ＩＩ　（上記参ｆｆ１）　　　　　　７．５ｎ塩溶
液■（上記参照）　　　　　　７．５　ｄシスティン塩
酸−水和物　　　０，０５　。

Ｎ　ａ２ｃＯ３０−３ＪＦ レサズリン（０，１％溶液）　　　　０．１！蒸留水　
　　　　　　全量１００．Ｏｄまで添加この混合物の記
号をＨＢとする。

培養物を３５℃で１２０時間嫌気性条件下でインキエベ
ーシ１ンし〔アトラス　オブ　ルーノンマイクロバイオ
ロジー（Ａｔｌａｓ　　ｏｆＲｕｍｅｎ　　Ｍｉｃｒｏ
ｂ；ｏｌｏｇｙ）　）、オギモトおよびイマイ　（Ｏｇ
ｉｍｏｔｏ　　ａｎａｌＩｍａｉ）、ツヤパン　サイエ
ンティフイックンサイエティズ　プレス（Ｊａｐａｎ　
　Ｓｃ　１−ｅｎｔｉｆｉｃ　　５ｏｃｉｅｔｉｅｓＰ
ｒｅｓｓ）、東京、１９８１年参照〕、次いで個々のク
ローンを、次の組成を有しかつ抽出された干し草を含有
する培地に接種した。

塩溶液Ｉ　（上記参照＞　　　　　　　ｉ　ｓ、ｏ％塩
溶液■（上記参照）　　　　　　　１５．０％レサズリ
ン（，０，１％溶ｆｉ）　　　　　　　０．１％酵母エ
キス（オキソイド（０にｏｉｄ））　　　０．５％ルー
メン液０　　　　　　　　　ｉｏ、ｏ％Ｎａ２ＣＯ３０
，４％ システィン塩酸−水和物　　　　　　０．０５％抽出さ
れた干し草＊　＊　＊　　　　　　ｉ　ｏ　、　ｏ％上
記培地の記号をＲＧＣＦ液体培地とした。

本）英国、ロンドン、オキソイド　リミテッド（Ｏｘｏ
ｉｃｌ　　Ｌｔｃｌ、）！１ 本＊）前記参照 京京京）抽出されたモし草を調製するために、細かく切
断した干し草の微片を水に懸濁せしめ、煮浦し、濾過し
た。濾過残分を滅菌前の培地に加えた。

滅菌前に、培地の［司−■を６．５に調整した。

１５、。。９ｏ、ヮ１゜、　ＲＧＣ□イ培地で増殖した
個々のクローンから得た微生物懸濁液を接種し、嫌気性
条件下３５℃でインキュベーションした。顕微鏡検査に
より増殖を調べ、培養物を、グルコースおよびセロビオ
ースの代りに２％バクト　セルロースを使用したＲＧＣ
Ａ固形培地上に拡散せしめた。

培養物を、嫌気性条件下、３５℃で１２０時間インキュ
ベージタンし、次いで、セルロースを利用する細胞から
作り出した個々のクローンを、セルロース含有ＲＧＣＡ
培地に接種した。

このようにして、干し草またはセルロースで増殖可能な
ルーメン微生物を得ることができた。

Ｂ）干し草で増殖可能なルーメン細菌の遺伝的標識 サイモンら（Ｓｉｍｏｎ　　ｅｔ　　ａｌ、）の方法〔
プロスイーデングズ　ジ　エイゾ　ノースアメリカン　
リゾビウム　コン７エランス（Ｐｒｏｃ、８ｔｈ　　Ｎ
ｏｒｔｈ　　Ａｍｅｒｉ　−ｃａｎ　　Ｒｈｉｚｏｂｉ
ｕｍ　　Ｃｏｎｆｅｒ−ｅｎｃｅ）、ウイニベッグ、カ
ナダ、ユニバーシティ　オプ　マニトバ　プレス（Ｗｉ
ｎｎｉ−ｐｅｇ、Ｃａｎａｄａ、Ｕｎｉｖ、ｏｆ　　Ｍ
ａｎ−ｉ　ｔ　ｏ　ｂ　ａ　　Ｐ　ｒ　ｅ　ｓ　ｓ　）
　　ｇ　１９８　Ｊ年〕に従って、遺伝的標識を大腸菌
ｐｌｏ１１プラスミドで行なった。バーンボイムおよび
ドリイ　（Ｂｉｒｍ−Ｉ）ｏｉｍ　　ａｎｃｌ　　Ｄａ
ｌｙ）（ヌクル・アシツジ・レス（Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄ
　　Ｒｅｓ、）、’Ｉｔ１５１３．１９７９年〕に従っ
て、大腸菌培養物からプラスミドＤＮＡを分離し、次の
組成を有する水溶液に溶解せしめた。

ＣａＣｌ２　　　　　　　　　　７５ｍＭＭ　ｇ　Ｃ１
２５ｔｎ　Ｍ 京トリス−（ヒドロキシメチル）−７ミノメタン塩酸塩 干し草で増殖可能な微生物であってかつ実施例１の　Ａ
）項に従って分離されたものを、ＲＧ　ＣＦ培地で培養
し、ＣＯ２下で遠心沈澱法により分離した。細胞を＋、
Ｃ中に次の成分を含む水溶液に懸濁せしめた。

Ｃａ　Ｃ１２７５ｍ　Ｍ ＭｇＣ１２５瀦Ｍ システィン塩酸塩−永和物　　　１ｍＭチオ硫酸ナトリ
ウム　　　　　　　１ｍＭこの懸濁液には、１ｄに付き
５×１０９個の細胞が含まれていた。懸濁液をプラスミ
ドＤＮＡ含有溶液（０，１〜／ｄ）の同量で希釈し、４
℃で６０分間インキュベージａンした。次いで、４１℃
で２分間インキュベーションを続け、培養物を、５００
ＰｆＩ／ｄのカナマイシンＢおよび炭素源としてセルロ
ースを含有する固形培地上に拡散した。

培養物を嫌気性条件下３５℃で１２０時間インキュベー
ションし、５００ＰＩＩ／ｄのカナマイシンＢの存在下
で増殖可能なりローンを調べた。

プラスミドｐｌｏ１１は、カナマイシン耐性およびクロ
ラムフェニコール耐性を決める遺伝子を保有しており、
またこのプラスミドは大腸菌細胞における複製の開始を
可能にする複製原点を含んでいる。他の細菌に形質転換
された場合、複製を可能による適当な原点がないため、
プラスミドＤＮＡは取り除かれまたは染色体へ取り込ま
れ（部分的にまたは完全に）、遺伝的組換えが起るうつ
いに、染色体に取込まれた遺伝子が表現され、この遺伝
子は細胞にカナマイシン耐性およびクロラムフェニフー
ル耐性を与える。

本発明者らの実験では、３Ｘ１０−５の形質転換頻度を
有するカナマイシンＢ耐性クローンが得られた。

数種の耐性クローンを分離して、初めの菌株およびカナ
マイシンＢ耐性（ＫｍＲ）菌株の抗性物質感受性を調べ
た。数種の菌株について得られた結果を表１に示す。

表　　１ ルーノン細菌および遺伝的に標識されかつ干し草を′　
する　　のカナマイシンＢ１こ大・する感　性。

ル　　−　　メ　　ン　　液　　　　　　　　　　　　
　　　　　３１初めの菌株　　　　４．０〜７．５ Ｈｈ−ＧＹＯＫＩ−１−８５００ かくして、干し草またはセルロースを利用することがで
きかつ多量のカナマイシンＢの存在下で増殖でさるルー
ノン起源の微生物が得られた。

Ｈｈ　　ＧＹＯＫＩ　　１　１２３（ＫｍＲ）菌株をセ
ルロース含有ＲＧＣＡ培地上に拡散し、その後１＝００
０．５＊０００　オヨヒ１０，０００　ｐｇ／　ｉｆａ
度のカナマイシンＢを加えた。培養物を、嫌気性条件下
、３５℃で、１６８時間インキュベージ３し、１０，０
００　Ｐｆ！／ｙｆｉの抗生物質の存在下で増殖する菌
株を分離した。自然選択により、カナマイシンＢに極め
て耐性のある自然突然変異体を得た。

これらの菌株のＩＩＩをＨｈ−ＧＹＯＫＩ−１−１２３
Ｓｚと表示して、プダベスト　（Ｂｕｃｌａ−ｐｅｓｔ
）にある寄託機関、ザ　ハン〃リアンナンヨナル　コレ
クンタン　オプ　メディカルバクテリア　オブ　ザ　ナ
ショナル　インステイチュート　オブ　ハイジーン（ｔ
ｈｅ　　Ｈｕｎ−ｇａｒｉａｎ　　Ｎａｔｉｏｎａｌ　
　Ｃｏ１１ｅｃ−ｔｉｏｎ　　ｏｆ　　Ｍｅｃｌｉｃａ
ｌ　　Ｂａｃｔｅ　−ｒｉａ　　ｏｆ　　ｔｈｅ　　Ｎ
ａｔｉｏｎａｌ　　Ｉｎ−５ｔｉｔｕｔｅ　　ｏｆ　　
Ｈｙｇｉｅｎｅ）に、第００２８７号として寄託した。

Ｃ）ｔ２ｉｎ微生物のルーメンへの再取込みＲＧＣＦａ
と呼ぶ無菌固形培地に、＋４℃でＲＧＣＡスラントに貯
蔵したＨｈ−ＧＹＯＫＩ−１１２３（ＫｍＲ）菌株の培
養物を接種した。

ＲＧＣＦａ培地の組成は次の通りである。

１、に２ＨＰ０．　　　　０．３％　　　溶液４５＊１
２　、（Ｎ　Ｈ４）２Ｓ　０４　　　０，６％ＮａＣ１
０，６％ Ｍ９ＳＯ４・２Ｈ２００，０６％ Ｃａ　Ｃ１２・２　Ｈ２００，０６％ ４、酵母エキス　　　　　０．１％　　　溶液２０ｄ溶
液１０ｄ ７．ルーメン液”　　　　　　　　　　　２０！＊）米
国、デトロイト市、ディ７コ、ラボラトリーズ（Ｄ；　
ｆｃｏ　　Ｌａｂｓ、）５９本本）前記参照 上記７種の溶液を別々に調製し、一定の順序で混合した
。

培地１５０ｄの入った５００ｄ容のエレンマイエル　フ
ラスコ中で、嫌気性条件下、培養を行なった。４８時間
後に増殖を調べ、次いで培養物を干し草で飼Ｈした羊の
飼料に混合した。１ｄに付き４．７×１０６個の細菌を
含んでいる培養物３４０ＷＩｌを羊に経口投与した。投
与前そして引き続いて毎日、５０〜２００ｄの試料をル
ーメン痩１７°１°″″′ｌ″Ｉｆ、　ｔ″ＲｅＨ“１
“＄１ｆ゛カナマイシンＢまたは他の抗生物質を含まな
いＲＧＣＡ培地上に拡散せしめた。培養物を、嫌気性条
件下、３５℃で、７２時間、インキュベーションし、細
菌クローンの数を数えた６その結果を表２に示す。

表　　２ で処理した　のルーノン　７０−ラの゛細胞数／ｄ 投与前　５Ｘ１０６　　０ 投与後 １日後　　　　５．９Ｘ１０６　　２．ＯＸｌ　０’２
日後　　　　３，２Ｘ１０’　　　　４．ｌＸ１０’３
日後　　　　２，４Ｘ１０６　　３．ｌＸ１０’６日後
　　　　３．９Ｘ１０？　　　　１，８×１０４８日後
　　　　９，８Ｘ１０”　　　　１．０５Ｘ１０５表２
かられかるように、羊に投与した微生物は残存しており
、ルーメン内で増殖する。

上記方法に従って、カナマイシンＢ　１０，０００ｈ／
ｄｌ耐性のＨｈ−ＧＹＯＫＩ−１−１２３Ｓｚ菌株をも
培養し、培養物を、同じ羊に１５日目上経口投与した。

１ｄに付き２Ｘ１０”個の細菌を含む培養物１４０ｄを
経口投与した。

ルーノン試料の細菌を培養し、上記したように数を数え
た。その結果を表３に示す。

聚−−１ Ｈｈ　　ＧＹＯＫＩ　　１　１２３Ｓｚ（Ｋｍ”）菌株
で処　した　のルーノン７０−ラにおける・細胞数／ｄ 投与前　１．４Ｘ１０６　０ 投与後 １日後　　　　７，４Ｘ１０’　　　　３，２Ｘ１０’
２日後　　　　１．７Ｘ１０５　　　１，３×１０４５
日ｆ＆　　　　　４．０ｘ１０８　　９，１ｘｌＯ’７
日後　　　　１．ｌＸ１０７　　２，０ＸＩＯ’１４日
後　　　　８．０×１０６　　　３．１×１０４２１日
後　　　　７．ｌＸ１０５　　　６．２×１０４２８日
後　　　　８，２Ｘ１０６　　８．ｌＸ１０’３５日後
　　　　８．７Ｘ１０６　　　１．８Ｘ１０’表３のデ
ータは、投与した微生物がルーメン内に有意な量で存在
していること、また、ルーメンの中味の液相が連続的に
からになるので微生物は必ず複シするということを示し
ている。

試料間の細菌数の差は、ルーメンの中味の濃度の濃厚か
ら流動性への変動により説明することができるかもしれ
ない。

実施例２ ひき割り穀類（ｃｅｒｅａｌ　　ｍｅａｌ）で飼育した
手内のルーメン　７０−ラの改Ｊ％Ａ）ひき割り穀類で
増殖可能な微生物の分離実施例１の　Ａ）項記載の方法
を繰り返した。但し、初めの試料がひき割り穀類で飼育
した羊のルーメンから採取された点、また個々の分離物
が抽出された干し草の代りに乳鉢内で砕いたひき割り穀
類２％を含んでいるＲＧＣＦ液体培地（前記参照）に接
種された点、またＲＧＣＦ液体培地内で増殖した培養物
がＲＧＣＡ固形培地（前記参照）上に拡散された点、ま
たひき割り穀類を利用することの可能な細胞から発生し
たクローンが同様な培地上で分離された点では相違する
。

以上のようにして、炭素源としてひき割り穀類で増殖可
能な微生物を得た。

Ｂ）ひき？！？１１’）穀類を利用するルーノン細菌の
遺伝的標識 実施例１の　Ｂ）項記載の方法を繰返した。但し、実施
例１の　Ａ）項に従って得られた菌株の代りに実施例２
の　Ａ）項に従って得られた菌株を用いて、ｐｌｏｌ　
ｉプラスミドＤＮＡにより形質転換を行なった点では相
違する。

数種の形質転換されたＫｍＲ菌株のカナマイシンＢ１１
ｔ性を表４に示す。

一１ に・する感　。

ｌし　　−　　メ　　ン　　ｆｉ　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　３１初めの菌株　　　　　１．８ 遺伝的に標識された Ｋｍ’−菌株 Ｈｈ−ＧＹＯＫＩ−２−４２５０ −１４Ａｂ　　　　２５０ 上記方法を行なうことによって、炭素源としてひき割り
穀類を利用することができかつカナマイシンＢ耐性がル
ーノン　７０−ラの場合よりも８倍高いルーノン起源の
微生物が得られた。

Ｈｈ−ＧＹＯＫＩ−２−１４Ａｂとして表示される菌株
は、ブタペストの前記寄託機関ザ　ハン〃リアン　ナシ
ョナル　フレクション　オブ　メディカル　バクテリア
　オブ　ザ　ナショナルインスティテユート　オブ　ハ
イノーン（ｔｈｅＨｕｎｇａｒｉａｎ　　Ｎａｔｉｏｎ
ａｌ　　Ｃｏ１−１ｅｃｔｉｏｎ　　ｏｆ　　Ｍｅｄｉ
ｃａｌ　　Ｂａｃ−ｔｅｒｉａ　　ｏｆ　　ｔｈｅ　　
ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅ　　ｏｆ　　Ｈｙ
ｇｉｅｎｅ。

Ｂｕｄａｐｅｓｔ）にｔ５００２８８号として寄託され
た。

Ｃ）遺伝的に標識された微生物のルーメンへの再取込み 実施例１のＣ）項記載の方法を繰返した。但し、セルロ
ース（バクト）１．８％の代りに澱粉１．８％を含んで
いる無菌ＲＧＣＦａ培地に接種されて、これが羊の飼料
に混合された点、および試料が投与前と投与後とに實管
を通して毎日採取された点では相違する。１ｄに付き７
．ｌＸ１０５個の細菌を含んでいる培養物３１０１ｄｌ
を羊に経口投与した。

森−一Σ 処理された・のルーメン　７０−ラにおケル変細胞数／
ｄ 投与前　４，３Ｘ１０６１．４Ｘ１０電投与後 １日後　　　　４．ｌＸ１０Ｂ　　　　１，８Ｘ１０３
２日後　　　　３，２Ｘ１０’　　　　２．ｌＸ１０５
個日後　　　　８，０ＸＩＯ３１，ｌＸＩＯ３６日後　
　　　９．ｌＸ１０Ｂ　　　　？、ｌＸ１０２８日後　
　　　８．０Ｘ１０６　　　８．ｌＸ１０Ｇ１５日後　
　　　６．８Ｘ１０Ｇ　　　　　Ｂ、７Ｘ１０３２２日
後　　　　５．０Ｘ１０６　　　９．８Ｘ１０’２９日
後　　　　８，０ＸＩＯ６１，ｌＸｌ０’３６日後　　
　　９．ｌＸ１０６　　　７．０ＸＩＯ’４３日後　　
　　？、０Ｘ１０６　　　　７．９ＸＩＱ’表５のデー
タは、投与された微生物が長期間にわたってルーメン内
で残存しかつ複製することを示している。

実施例３ 糖蜜で飼育した羊のルーノン　７０−ラの改良Ａ）糖蜜
で増殖可能な微生物の分離 実施例１の　Ａ）項記載の方法を繰返した。但し、始め
の試料が糖蜜で飼育した羊から採取された点、個々の分
離物が抽出された干し草の代りにグルコースを含んでい
るＲＧＣＦ培地に接種された点、液体培地で増殖した培
養物がＲＧＣＡ培地上に拡散された点お上り糖蜜利用細
胞から増殖したクローンが同じＲＧＣＡ培地に接種され
た点では相違する。

かくして、糖蜜を利用するルーノン起源の微生物が得ら
れた。

Ｂ）糖蜜利用細菌の遺伝的標識 実施例１の　Ｂ）項記載の方法を繰返した。但し、実施
例１の　Ａ）項に従って、得られた細胞の代りに実施例
３の　Ａ）項に従って調製された細胞を、ｐ１０１１プ
ラスミドＤＮＡによって形質転換せしめた点では相違す
る。

数種のＫｍ”菌株のカナマイシンＢ耐性を表６に示す。

表　　６ ルーノン細菌および遺伝的に標識されたのカナマイシン
Ｂ耐□ ルーノン液　　　　　　　　　　　　　　３１初めの菌
株　　　　　　　　　　　　　　７．５）１ｈ−ＧＹＯ
ＫＩ−３−２２５０ 一８１Ｍｅ　　　５００ 上記のようにして、カナマイシンＢに極めて耐性でかつ
糖蜜を利用する分離物が得られた。

Ｈｈ−ＧＹＯＫＩ−３−８１Ｍｅ菌株は、ブタペストの
前記ザ　ハン〃リアン　ナショナル　フレクシコン　オ
プ　メディカル　バクテリア　オブ　ザ　ナショナｌし
　インステイテユート　オプハイジーン（ｔｈｅ　　Ｈ
ｕｎｇａｒｉａｎＮａｔｉｏｎａｌ　　Ｃｏ１１ｅｃｔ
ｉｏｎ　　ｏｆＭｅｃｌｉｃａｌ　　Ｂａｃｔｅｒｉａ
　　ｏｆ　　ｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌ　　Ｉｒ＋５ｔｉ
ｔｕｔｅ　　ｏｆＨｙｇｉｅｎｅ、ＢｕｃｌａｐｅＳｔ
）に第００２８９号として寄託した。

Ｃ）遺伝的に探識された細菌ルーメンへの再取込み 実施例１のＣ）項記載の方法を繰返した。但し、Ｈｈ−
ＧＹＯＫＩ−３−８１Ｍｅ菌株がセルロース１．８％の
代りにグルコース１．８％を含むＲＧＣＦａ培地に接種
された点および培養物が糖蜜で飼￥７された羊の飼料と
混合された点では相違する。ｌｄに付き１．６Ｘ１０？
個の細菌を含む培養物３８０ｄを経口投与した。投与前
および投与後毎日、ルーメン度管を通して１種の試料を
それぞれ採取した。

表　　７ 細胞数／ｄ 投与前　５．０Ｘ１０６　０ 投与後 １日後　　　　１．ｌＸ１０６　　　１．９Ｘ１０５２
日後　　　　１．８Ｘ１０’　　　　２．５Ｘ１０５３
日後　　　　６．２Ｘ１０６　　６．ｌＸ１０５６日後
　　　　８．ｌＸ１０６　　８．７Ｘ１０５８日後　　
　　６．２Ｘ１０６　　９．ｌＸ１０５本 １５日後　　　　１．３Ｘ１０’　　　　１．３Ｘ１０
２２２日後　　　　３．０Ｘ１０Ｇ　　　　３．ｌＸ１
０５２９日第　　　　１．ｌＸ１０６　　　７．０Ｘ１
０５３６日後　　　　８．０ＸＩＯ５９，ｌＸｌ０’４
３日後　　　　６．ｌＸ１０６　　　８．ｌＸ１０５本
　サンプリングエラー 上記データは、投与された微生物が、糖蜜で飼育した羊
のルーメン内で長時間にわたって残存していることを示
している。

実施例４ 細ＭＬｌ剤での処理による揮発性曜肪酸の割合の変化 ２匹の羊を１４日問完全な規定食料で飼育し、次いでル
ーノン試料を僕管を通して採取した。ルーメン液２１を
数層のガーゼを通して濾過した。

粒状残分を生理緩衝液（下記参照）ｉＩＬにＩｇｌ濁し
、混合し、前記のように濾過した。二種の炉液を混合し
て、１時間放置し、表面に浮いている固体を捨て、液相
を用いて試験した。

生理緩衝液の組成は次の通りである。

Ｎａ２ＨＰＯ４０，３１６ｇ／Ｉ Ｋ　Ｈ４Ｆ　Ｏ４０，１５２ＦＩ／　ｌ１ＮａＨＣＯ３
２，２６０ｇ／Ｉｔ ＫＣＩ　　　　　　　　　　Ｏ，３７５ｇ／又ＮａＣ１
０，３７５ｇ／Ｉ Ｍ　ｇ　Ｓ　０４　　　　　　　０，１１２　ｇ　／　
ＩｔＣａＣｌ２・Ｈ２Ｏ０，０５０ｇ／ＩＩ。

ＦｅＳＯ４・７Ｈ２００，００８ｙ／、＋２ＭｎＳＯ４
・Ｈ２Ｏ０，００４Ｊ／ｌ１ＺｎｓＯ４・’？）（２ｏ
　　　　Ｏ，００４１？／ｊｉｊＣ（ＪＳＯ４・　５　
　Ｈ２Ｏ０，００２ｇ／ｌＣｏＣｌ２・６Ｈ２００，０
０１ｙ／ＩＬ」−記混合物のｐ　Ｈを調べ、必要とする
ならばＭＣＩまたはＮａＯＨ水溶液でｐＨ７，２に３１
整する〔チヱンら（Ｃｈｅｎｇ　　ｅｔ　　ａｌ、）：
ノヤーナル　ディリー　サイエンス（Ｊ、ＤａｉｒｙＳ
ｃｉ、））３８．１２２５頁、１９５５年〕６得られた
混合物に、同量の生理緩衝液を加え、希釈された混合物
１見に規定食料４ｇを懸濁せしめた。懸濁液３０ｄを１
００１１１．客の複数のエルレンマ／ヤ−７２スフにそ
れぞれ注入した。２００ドース（ｃｌｏｓｅｓ）は滅菌
したが別の２００ド１　　　　−スについては滅菌しな
かった。

無菌培地および生きているルーノン細菌含有培地に細菌
菌株を接種して、酢酸、プロピオン酸および酪酸の生産
について試験した。

試験管内培養後、長い間にわたってルーメン内で残存す
ることがでさるとわかった細菌菌株を試験することにし
た。さらに、また、実施例１のＡ）、Ｂ）お上びＣ）項
に従って、完全なまたは任意の規定食で飼育した羊のル
ーメン液から分離した細菌菌株も試験した。

試験すべき細菌を、嫌気性条件下、３７″Ｃで、４８時
間、ＲＧＣ＋ＣＧ培地（以下参照）で培養した。

ＲＧＣ＋ＣＧ培地の組成： 塩溶ａｔ　　（実施ｆｉｌのＡ）項１ｉ１ｔｔ）　　１
’ｓ％塩溶液■（実施例１のＡ）項参照）　１５％微量
元素溶液４　　　　　　　　　０．３％酵母エキス〔オ
キソイド（Ｏｘｏｉｄ））　　　０．５％濾過されたル
ーメン液　　　　　　１０．０％Ｎａ２ＣＯ３０，４％ システィン・ＨＣｌ−８２００，０５％チオ硫酸ナトリ
ウム　　　　　　　　　ｏ、ｏ　ｏ　ａ％セＡ／Ｄ−ス
〔バクト（Ｂａｃｔｏ））　　　　　　０．３％グルコ
ース　　　　　　　　　　　　２．０％本）微量元素溶
液の組成： ＺｎＣｌ２　　　　　　　　　　　　４０ｗ！ＩＣＬＩ
Ｃ１２・２Ｈ２０１０ｑ 四ホウ酸二ナトリワム・　　　　　１０゜１０水和物 “リブデ′酸ア′モ°ウム　　　　１ｏ。

・６水和物 ＦｅＣｌ３・６Ｈ２０２００ｔ、ｙ Ｍ　ｎ　Ｃ１２・４　Ｈ２０１０ｔｙｔ脱イオン水　　
　　　　　全量１０００−まで添加培養物を、エルレン
マイヤ−７ラスフ内で調製した培地に接種した。２個の
フラスコを並列して、５０ｎの培地に、培養物２ｄをそ
れぞれ接種した。無菌でない培養物もまた接種した。

フラスコを、嫌気性条件下で、４０時間インキエベーシ
ョンした。１０％ギ酸溶液を用いて増殖を停止せしめて
、培養物の揮発性脂肪酸含量を調べた７ 培養物は〃−ゼ層を通して濾過し、４０００ｒ、ｐ、ｍ
、で１５分間遠心分離し、次いで再び濾過し、そして０
２−０５脂肪酸を測定するために、水素炎イオン化検出
器を備えたカル口　エルバノーフイ−４５２（Ｃａｒ　
１　ｏ　　Ｅｒｂａ　　ＧＩ−４５２）気液クロマトグ
ラフの分離カラムへ導いた。

カラム温度＝１５０℃ 分離カラム：長さ２ｍ、幅（内径）４ｆｌのガラス管で
あり、これはシラン化シリカゲル担体（０，２〜０．３
籠粒径）上アジピン酸エチレングリコール１０％および
正リンＦｌ！２％で充填されていた。

インゼクタ一温度＝１９０℃ Ｎ２流量：５０Ｗｉ／分 Ｎ２流量：５０１１／分 空気流量：２００ｄ／分 クロマトグラフィ一時Ｉ１１：２０分 試料容ｆｆＬ：１μ更 各試料に三重反復測定がなされた。標準溶液には、酢酸
、プロピオン酸、イソ酪酸、酪酸、イソ吉草酸および吉
草酸が含まれていた。

９０以上の細菌菌株を、完全な規定食料で飼育した羊か
ら分離した。次いで、菌株を遺伝的に標識し、試験した
（陽性菌株を数回試駆した）。代表的結果を表８に示す
。

表８で示されている記号の説明： Ｓ　二滅菌後接種、 ＮＳ　：生さているルーノン７０−ラを含む培養物を接
種、 ａ　　：ｉ量、 ｂ　：陰性対照、実験のために使用した飼料、生理緩衝
液およびルーメン液から調製 した培地の揮発性脂肪酸含量（１２回 測定の平均）、 Ｃ：陽性対照、同じ方法によって調製された初めのルー
ノン細菌その他を含むイ ンキュベージタンした培養物の揮発性 脂肪酸含量（１２回測定の平均）、 ｄ　：上記Ｃと同じであるが、５ｐｐｍのモネンシンＮ
ａを培地に加えた（６回測 定の平均）、 ｅ　：上記Ｃと同じであるが、１０ｐｐｍモネンシンＮ
ａを培地に加えた（６回測 定の平均）。

表８のデータは、ルーメン　７０−ラの醗酵（攻能によ
り生産された揮発性脂肪酸の割合が本発明に従って調製
された微生物培養物の投与によって広範囲に変化し得る
ことを示している０例えば、プロピオン酸の生産は、Ｈ
ｈ−ＧＹＯＫＩ−４８ａ［株から調製した培養物により
有意に刺激され得るし、一方Ｈｈ−ＧＹＯＫＩ−１０９
ｂ菌株は酢酸の生産を刺激する１個々の脂肪酸の生産の
刺激は、生きているルーメン微生物を含んでいない培地
（Ｓ）または該微生物を含んでいる培地（ＮＳ）の両方
で観察された０本発明者らの実験方法では、モネンシン
Ｎａが酢酸対プロピオン酸の比を０．１または０．２だ
け減少せしめた（ｄ　、　ｅ）。

上記方法によって選択された微生物を遺伝的に標識し、
反芻動物に投与し、実施例１の　Ｂ）項記載の方法を繰
返すことによって、ルーメン内の増殖および残存につい
て試験した。有利な醗酵パターンを有しかつルーメン内
で長期残存する菌株を、揮発性脂肪酸の生産を改良する
ために経口投与せしめた。

実施例５ 反芻動物へ経口役すするための細菌製剤投与すべき細菌
を、上記方法によって、嫌気性条件下、ＲＧＣＡ＋ＣＧ
培地（実施例４）で培養した。培養後、濾過または遠心
分離によって細胞を分離した１分離した細胞を生理緩衝
Ｎ、（実施例４）に懸濁せしめ、凍結乾燥した。凍結乾
燥した細Ｍ’ＪＲ剤を供給し、適当に処分して、反芻動
物に経口投与した 微生物は、他の通常使用される培地内でも、例えば炭素
源としてグルコースおよび澱粉等ならびに窒素源として
無機塩類を含む培地内でも培養することが可能である。

製剤は、製剤単独でまたは他の生物学者に活性な薬剤、
例えば抗性物質およびビタミン類といっしょに、飼料ま
たは飲料水に混合することにより容易に投与するこ−と
が可能である。

凍結乾燥製剤に加えて他の生１＆物も調製することが可
能である。微生物はまた、濾過されまたは遠心分離され
た細菌集団を適当なキャリヤーもしくは希釈物質（例え
ばＣａＣ０３）、濃縮物、プレミックスまたは他の飼料
と混合した後に投与することも可能である。

細菌菌株は、本発明の方法によってｉｖ４製されかつ有
利にはルーメン　７０−ラを改良する微生物から選択さ
れ、その与えるべき量は、規定食料および動物の用途に
依って決められる。酢酸対プロピオン酸の比の減少を必
要とする場合には、例えばＨｈ−ＧＹＯＫＩ−４８ａ１
株からｍ製した培養物を使用してもよいが、該比の増加
を必要とする場合には、Ｈｈ−ＧＹＯＫＩ−３−８１Ｍ
ｅ菌株の投与が推奨される。

必要な微生物細胞数の測定は、当業者にはひとつも困難
ではない、ルーメンｄｉｄに付き５×１０２ないし５Ｘ
ｌＯ？個の培！！微生物にするような量で細胞を投＋ｊ
、することが推奨される。

実施例６ 羊へのＨｈ−ＧＹＯＫＩ−４８ａ菌株およびＨｈ−ＧＹ
ＯＫＩ−１−１２３Ｓｚ菌株の投与Ｈｈ−ＧＹＯＫＩ−
４８ａＭ株を、５１容（有効容Ｍ）　ノｒｆｉｉｌ’ｉ
Ｆ器内テ、ｎ　’Ａ　性条件下、３７°ＣでＲＧＣＡ＋
ＣＧ培地（実施例４）で培養した。同じ１成の培養物１
０ｄを接種して発酷を開始せしめた。４８時間培養後、
遠心分離（５００ｒ、２０ｍ、）によって細胞を分離し
、生産ＭＳ　８　ｍの沈澱物をコーンミール４ｋＩ！と
注意深く混合した。混合物を８種の等量部分に分割し、
予め２　＝１時間絶食せしめておいた８匹の羊に経口投
すした。ｔｌｈ−ＧＹＯＫＩ　　１　１２３Ｓｚ菌株を
同様に使用して、細菌収穫物５３３を得た。

肥Ｙｒさせる成訂実貌において、２３匹の羊を不十分な
牧草干し草で任意に飼Ｈし、５週間、毎週計量した。８
匹の羊からなる複数の実験群は単一の飼［（ｓｉｎｇｌ
ｅ　　ｆｅｅｃｌｉｎＨ）に対してそれ（’し上記ｔｊ
ＭＭ’ＪＲ剤の１種によ’）ｆ４Ｙｒシ、７匹の羊は対
照として取り扱った。１匹に１０に付き６００〜９００
ｇの干し草を食べさせ、さらにコーンミールと混合した
無機物およびビタミンプレミックスを１００．食べさせ
た。結果を表９に示す。

表　　９ ・、こ　　　し−で　　した　の　ｌ 羊の通　初めの 、番号　体重　第１週第２週ｆｉ３週第４週！￥１５週
対照 １　　２９．０　２９．５　３０，０　２９．５　２９
，５　２９．５２　　２７．０　２７．５　２８，５　
２７，０　２６．５　２８．０３　　２８．５　２７．
０　２７．０　２７．５　２６，５　２６，５４　　３
０．０　３０．５　３０．０　３０．５　３０，０　２
９，０５　　２９．５　３０．０　２９．０　３０．５
　２９．５　３０．０６　　２５．０　２５．５　２６
，５　２６．０　２６．０　２７．５７　　２７．０　
２７．０　２７．５　２８．０　２Ｂ、０　２８，０Ｈ
ｈ−ＧＹＯＫＩ−１−１２３６ｚ菌株による処理８　　
２９．５　３２．０　３２．５　３３．０　３３，５　
３４．０９　　２５．５　２６．５　２７．０　２８．
５　２９，５　２９．０１０　　２５．０　２５，５　
２５，０　２８，０　２９，０　２８．５１１　　２５
．５　２４．５　２５，５　２７，５　２７，０　２８
，０１２　　２９．０　２８，０　２９．０　２８，５
　２９，０　３０．０１５　　２８．５　２９．０　３
０．５　３０．０　３０．５　３２．０１ｇ　　　２７
．０　２７．５　２８．５　２９．５　３０，５　３１
．０１９　　２６．０　２６．０　２７．０　２Ｂ、０
　２９．０　３０．５２０　　２９．５　３０．５　３
１．０　３１．５　３２．５　３３．０表　　９ （絞さ） 表９のデータから平均の毎日の体重増加を、！１“ヰし
、表１０に示す。

Ｈｂ　　Ｇ　Ｙ　ＯＫ　ｌ−１−１２３Ｓ　７．　＠株
オヨび）１）＋　　ＧＹＯＫＩ　　４８ａ菌林により処
Ｊ！Ｉ！された羊ならびに対照群の羊は、３５日の実験
期間の間に、不充分な規定食で、それぞれ平均２Ｇ２０
ｇ・３８７５＆および３６０ｇ増加した。

初めの体重は、各群の間で有意に異なＣ）なかったが、
最終体重（表１１）および毎日の増加（表１２）におい
て有意な差が見出された。

表　　１１ 区劃１駐」ｕｕ９Ｍ魚 平均（Ｊｌ）　　２８．３５７　３ｔｌ、３７５３１．
（１）８７５人−１−、ｊ、、、ｉ、。

辰胚本玉＠机北工０匝毀 平均（ｋｙ）　　２８．３５？　　３０，３７５　　３
１．６８７５上記データは、本発明に従って造った製剤
が泊の体重増加を顕著に刺激することがでさることを示
している。

実施例９ ウシ　ルーメン内の遺伝的に標識された＃ＩＩ菌の残存 実施例１のＣ）項記載の方法を繰返したが、但し、カナ
マイシン１０＋０００　ｐｇ　／−耐性のＨｈ　−ＧＹ
ＯＫＩ−１−１２３Ｓｚ苗株をＩｔ　Ｇ　ＣＦ　ａ培地
４ｕ内で培養した点で相違する。定常期に達した後（３
８時間）、培養物を遠心分Ｎ、　（５，０００ｒ、ｐ、
ｍ、）により収穫しまた５００ｇのフーンミールと充分
に混合した細胞をウシにすえた６１週１度試料を痩管を
通して採取し、投す・した菌株のルーメン内残存を実施
例１の　Ｃ）項に従って測定した。

その結果は、Ｉ（ｌ＋−ＧＹＯＫＩ　　１　１２３Ｓｚ
Ｙ４株がウシ　ルーメン内で増殖しまた少なくとも４０
日間ルーメン内に残存し得ることを示している。

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. （１）反芻動物飼料の利用効率を改良するための組成物
   であって、有効成分として、酢酸対プロピオン酸の重量
   比を１．５〜４．０：１の最適値に調整することができ
   かつルーメン内で増殖することができかつルーメン内で
   少なくとも６０日間残存することができる１種以上の微
   生物培養物を、随時キャリヤー、希釈剤、畜産および栄
   養物において通常用いられる防腐剤ならびに／または反
   芻動物に通常投与される他の物質と混合して含んでなる
   該組成物。
2. （２）有効成分をせいぜい９５重量％含んでなる特許請
   求の範囲第（１）項に記載の組成物。
3. （３）ルーメン内の酢酸対プロピオン酸の比を２．０〜
   ３．５：１に調整することのできる微生物培養物を含ん
   でなる特許請求の範囲第（１）項または第（２）項に記
   載の組成物。
4. （４）「ザ　ハンガリアン　ナショナル　コレクション
   　オブ　メディカル　バクテリア　オブ　ザ　ナショナ
   ル　インスティテュート　オブ　ハイジーン（ｔｈｅ　
   Ｈｕｎｇａｒｉａｎ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｌｌｅｃ
   ｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｂａｃｔｅｒｉａ　
   ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉ−ｔｕｔ
   ｅ　ｏｆ　Ｈｙｇｉｅｎｅ）」に第００２８７号、第０
   ０２８８号および第００２８９号として寄託された微生
   物菌株からなる群から選ばれた１種以上の微生物を微生
   物培養物として含んでなる特許請求の範囲第（１）ない
   し（３）項のいずれか１項に記載の組成物。
5. （５）微生物のペースト、凍結乾燥物または懸濁液の形
   である特許請求の範囲第（１）ないし（４）項のいずれ
   か１項に記載の組成物。
6. （６）特許請求の範囲第（１）ないし（５）項のいずれ
   か１項に記載の組成物中で有効成分として使用する微生
   物培養物の調製方法であって、一定の飼料または規定食
   で飼育した動物のルーメンから試料を採取し、 該試料から分離した微生物の代謝を試験管内および／ま
   たは生体内で調べ、そして有利な代謝特性を持つ微生物
   を、炭素源または窒素源として該飼料または規定食と同
   じものを含む培地で培養し、 選択を可能にする遺伝標識形質を増殖微生物に取込み、 遺伝的に標識された菌株を培養し、 培養物を該飼料または規定食と同じもので飼育された動
   物のルーメンへ再取込みし、 該ルーメンから試料を採取し、 遺伝的に標識された菌株の細胞数を数え、 少なくとも６０日間残存しかつ酢酸対プロピオン酸の比
   を１．５〜４．０：１の最適値に調整する菌株を分離し
   、そして所望ならば、これらの菌株を、畜産および栄養
   の実行のために受け入れ得る形に処方することを特徴と
   する調製方法。
7. （７）抗生物質耐性を遺伝標識として使用する特許請求
   の範囲第（６）項に記載の方法。
8. （８）セルロース含有飼料、好ましくは干し草、澱粉含
   有飼料、好ましくはかいば、または単糖類および／もし
   くは二糖類含有飼料、好ましくは糖蜜で飼育した動物の
   ルーメンから微生物を分離し、また遺伝的に標識した菌
   株を、試験のために上記飼料の１種で飼育した動物のル
   ーメン内に再取込みし、また適当な微生物培養物を培養
   し、次いで分離し、また所望ならび、得られた培養物を
   適当な形に処方する、特許請求の範囲第（６）項または
   第（７）項に記載の方法。
9. （９）微生物細胞を凍結乾燥形で分離してなる特許請求
   の範囲第（６）ないし（８）項のいずれか１項に記載の
   方法。
10. （１０）反芻動物飼料の利用効率を改良するための組成
    物の調製方法であって、 特許請求の範囲第（６）ないし（９）項のいずれか１項
    に記載の方法に従って調製した微生物培養物を、単独で
    または随時、キャリヤー、希釈剤、畜産および栄養物に
    おいて通常用いられる防腐剤、ならびに／または経口処
    方として反芻動物に通常投与される他の物質と混合して
    処方してなることを特徴とする調製方法。
11. （１１）酢酸対プロピオン酸の比を１．５〜４．０：１
    の最適値に調整することができかつルーメン内で増殖し
    また少なくとも６０日間ルーメン内に残存することがで
    きる１種以上の微生物培養物の有効量を該動物に経口投
    与することを特徴とする反芻動物飼料の利用効率を改良
    するための方法。
12. （１２）微生物培養物として、「ザ　ハンガリアン　ナ
    ショナル　コレクション　オブ　メディカル　バクテリ
    ア　オブ　ザ　ナショナル　インスティテュート　オブ
    　ハイジーン（ｔｈｅ　Ｈｕｎｇａｒｉａｎ　Ｎａｔｉ
    ｏｎａｌ　 Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｂａｃ
    ｔｅｒｉａ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａ− ｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｈｙｇｉｅ
    ｎｅ）」に第００２８７号、第００２８８号および第０
    ０２８９号として寄託された微生物菌株からなる群から
    選ばれた１種以上の微生物を使用することを特徴とする
    特許請求の範囲第（１１）項に記載の方法。