FR2569085A1 - Composition et procede pour ameliorer l'efficacite de l'utilisation de la nourriture par des ruminants - Google Patents

Abstract

L'INVENTION EST RELATIVE A UNE COMPOSITION AMELIORANT L'EFFICACITE DE L'UTILISATION DE L'ALIMENTATION PAR UN RUMINANT, QUI COMPREND COMME COMPOSANT ACTIF, UNE OU PLUSIEURS CULTURES MICROBIENNES, CAPABLES D'AJUSTER LE RAPPORT PONDERAL D'ACIDE ACETIQUE A ACIDE PROPIONIQUE A UNE VALEUR OPTIMALE, DE PREFERENCE DE 1,5 A 4,0:1 ET DE SE DEVELOPPER DANS LE RUMEN, ET D'Y PERSISTER PENDANT AU MOINS 60 JOURS, EVENTUELLEMENT EN MELANGE AVEC DES SUPPORTS, DILUANTS, CONSERVATEURS HABITUELLEMENT UTILISES DANS L'ELEVAGE ANIMAL ET DES SUBSTANCES NUTRITIVES ETOU AUTRES ADMINISTREES CLASSIQUEMENT A DES RUMINANTS.

Description

l La présente invention est relative à une

composition pour améliorer l'efficacité de l'utilisa-

tion de la nourriture par des ruminants. Plus particu-

lièrement, elle concerne une composition qui comprend comme composant actif, une ou plusieurs cultures micro- biennes, capables d'ajuster le rapport pondéral de l'acide acétique à l'acide propionique à une valeur optimale, de préférence à 1,5-4,0:1, de se développer dans la panse et d'y persister pendant au moins 60 jours, éventuellement en mélange avec des supports, diluants, conservateurs habituellement utilisés dans l'élevage des animaux et des substances nutritives et/ou d'autres

substances classiquement administrées aux ruminants.

L'invention est aussi relative à la prépara-

tion de cultures microbiennes utilisées comme composant

actif dans les compositions ci-dessus et à l'applica-

tion de ces dernières.

Des ruminants possédant un estomac complexe, comme le mouton (Ovis aries aries), le bétail (Bos primigenius taurus), la chèvre (Capra hircus) et leurs parents sauvages (cerf et muflon, etc.), jouent un important rôle dans la cha5ne alimentaire et dans l'économie. Leur importance particulière découle du

fait qu'ils peuvent se nourrir de matières alimentai-

res qui ne peuvent pas être utilisées par d'autres herbivores. Les premiers estomacs fournissent un

milieu anaérobie pour le flore du rumen, qui est capa-

ble de digérer la cellulose et utilise l'azote non-

protéinique en plus des éléments nutritifs courants.

La composition de la flore du rumen dépend largement de la ration alimentaire et s'adapte au régime. Cette adaptation prend cependant plusieurs jours et la

stabilisation finale peut nécessiter plusieurs semaines.

Un changement brutal de l'alimentation nuit à la prise,

à la digestibilité et à la production et il peut provo-

quer une maladie ou même la mort.

On sait que des millions de bactéries vivent et se développent dans 1 litre de liqueur provenant du rumen. La fermentation anaérobie par des bactéries est

très importante pour la digestion et la prise alimen-

taire normales. Des éléments nutritifs produisant de l'énergie fermentent en donnant des acides acétique, propionique et butyrique, qui sontutilisés par l'animal hôte comme-acides gras; la masse bactérienne passant dans les intestins sera digérée et utilisée en tant que source de protéines. L'apport en acide acétique et en acide propionique et leur proportion, jouent un rôle

essentiel dans la production du lait et de la viande.

La flore du rumen exerce donc un rôle important dans

l'entretien et la production des ruminants domestiques.

La flore du rumen se développe spontanément après la naissance et atteint sa composition de l'âge adulte après le sevrage, avec la prise de nourriture solide. Il n'est pas sûr cependant, que cette flore

fortuite représente le-système de fermentation optimum.

Il serait avantageux d'avoir un procédé permettant de moduler la composition et/ou le nombre de la flore du

rumen en fonction des intérêts économiques.

L'augmentation de la production d'acides gras

volatils dans le rumen, donc l'augmentation de l'utili-

sation des aliments et en conséquence de la production de viande ou de lait, est recherchée depuis longtemps en élevage. On a obtenu certains résultats avec le

12- 5-éthyltétrahydro-5- {tétrahydro-3-méthyl-5-

[tétrahydro-6-hydroxy-6-(hydroxyméthyl)-3,5-diméthyl-2H-

pyran-2-yl -2-furyl} -2-furyl]-9-hydroxy-0-méthoxy,a,y, 2,8-tétraméthyl-1, 6-dioxaspiro[4.5]décane-7-butyrique acide], utilisé à l'origine comme coccidiostat (voir par exemple, le brevet US 4 085 255). On a aussi décrit

l'utilisation expérimentale d'autres polyéthers apparen-

tés, comme le salinomycine, le lasalocide, etc., des

dérivés de phtalide (brevet US 4 333 923) et des glyco-

peptides, comme l'avoparcine, l'actaplanine et similaires

(Ingle et coll., Abstr. Am. Soc, Anim. Sci. 424/1978/).

L'aspect observé est cependant fortement différent sur des animaux alimentés avec diverses nourritures et n'est pas vraiment important (Chalupa, W., Chemical Control of Rumen Microbial Metabolism, Digestive Physiology and Metabolism in Ruminants, MTP Press, Lancaster, England, 1980 and Chalupa, W. et coll., Manipulating Rumen Fermentation with Monensin and Amicloral, Abstr. Am. Soc. Anim. Sci., 410/1978/). On ne connait aucune méthode

dans l'art, permettant d'influencer directement la cul-

ture microbienne présente dans le rumen des ruminants

pour fournir des résultats notables.

Au cours de ses expériences, la Demanderesse a constaté qu'on peut utiliser avec succès des méthodes de recombinaison génétique pour réaliser la séparation des microorganismes. On peut marquer pratiquement une

quelconque souche bactérienne par des marqueurs généti-

ques, par exemple, par un facteur de résistance aux

antibiotiques, qui permet l'identification de la bacté-

rie parmi d'autres bactéries.

La Demanderesse a isolé des bactéries du rumen, marqué génétiquement les souches et après les

avoir cultivées, elles les a introduites dans le rumen.

Elle a ensuite prélevé périodiquement des échantillons du contenu du rumen, elle les a cultivés dans des milieux sélectifs et constaté que certaines des souches, qui ont des caractéristiques fermentatives avantageuses pour l'animal hôte et sont capables de se développer in vitro, peuvent croltre dans le rumen et y persister pendant longtemps, si l'on donne la même alimentation qu'au moment de l'isolation et qu'elles stimulent la digestion et donc l'utilisation des aliments par

l'animal hôte.

La présente invention fournit une composition qui comprend comme composant actif, une ou plusieurs cultures microbiennes, capables d'ajuster le rapport pondéral d'acide acétique à acide propionique à une valeur optimale-de 1,5-4,0:1 et de se développer dans le rumen et d'y persister au moins 60 jours, éventuellement en mélange avec des supports, diluants, conservateurs utilisés habituellement en élevage et des éléments nutritifs et/ou autres couramment administrés

aux ruminants.

Si les compositions sont utilisées pour aug-

menter la production de viande, le composant actif est de préférence une culture microbienne capable d'ajuster le rapport d'acide acétique à acide propionique à 2,0-3,5:1, par exemple 2:1. Pour la production de lait, le rapport optimum d'acide acétique à acide propionique

est d'environ 3,0:1; pour la subsistance ou la gesta-

tion, il est de 4,0:1 et d'environ 2,0-3,0:1, pour

l'élevage des génisses. Il est donc judicieux d'utili-

ser des compositions capables d'ajuster le rapport

d'acide acétique à acide propionique à la valeur opti-

male en fonction du but. La littérature n'est pas très précise à propos des rapports d'acide acétique à acide propionique les plus avantageux, le rapport préféré dépendant du ruminant, de l'alimentation employée et

d'autres facteurs et son choix est l'affaire du spé-

cialiste (par exemple voir: Kaufmann, W. and Rohr, K.,

Der Einfluss des Futters auf die bakterielle Fermenta-

tion in Vormâgen, Handbuch der Tiernâhrung, 263, 1969,

Parey, Hamburg, Berlin).

La présente invention concerne aussi un pro-

cédé de préparation de cultures microbiennes utilisées comme composant actif dans les compositions ci-dessus, selon lequel: on prélève des échantillons dans le rumen d'animaux alimentés avec une ration ou nourriture donnée,

on examine in vitro et/ou in vivo le métabo-

lisme des microbes isolés à partir de l'échantillon, et

l'on cultive des microbes ayant d'avantageu-

ses caractéristiques métaboliques dans des milieux contenant la même ration ou alimentation, comme source de carbone ou d'azote,

on introduit dans les microbes qui se dévelop-

pent un marqueur génétique, qui rend possible la sélec-

tion, on cultive les souches marquées génétiquement, on réintroduit les cultures dans le rumen des animaux alimentés avec la même ration ou nourriture, on prélève des échantillons du rumen, on dénombre les cellules de la souche marquée génétiquement, on sépare les souches persistant pendant au moins 60 jours et qui ajustent le rapport d'acide acétique à acide propionique à une valeur optimale, de préférence à 1,5-4, 0:1, et si cela est souhaité, on met ces souches sous une forme acceptable pour être utilisée pour la nutrition

et l'élevage des animaux.

Suivant un mode de réalisation préféré du

procédé de la présente invention, on prélève des échan-

tillons du rumen pourvu d'une-fistule d'un ruminant nourri de foin, de farine de céréales ou de mélasse et l'on étale les cultures contenant des bactéries du rumen sur des milieux solides contenant des sources d'azote et de carbone, des sels minéraux, de la liqueur provenant du rumen et de l'agar (Bryant and Burkey,

J. Dairy Sci., 36, 205, 1953). Les cultures sont incu-

bées dans des conditions anaérobies, puis les clones sont isolés et cultivés dans des milieux analogues aux

précédents.

Les cultures développées sont inoculées dans des milieux liquides contenant une source d'azote, des sels minéraux, de la liqueur du rumen et comme source de carbone, du foin ou de la cellulose ou dans d'autres cas, de la farine de céréales ou de la mélasse, et elles sont incuvées jusqu'une croissance importante commence

dans les milieux.

Des cellules développées sur du foin (cellulose) de la farine de céréales (amidon) ou de la mélasse

(sucrose) comme sources de carbone, sont étalées, culti-

vées et isolées sur des milieux solides contenant de la cellulose (pour des cellules croissant avec du foin), du glucose (pour des cellules croissant avec de la farine de céréales) ou du sucrose (pour des celluloses

croissant avec de la mélasse) comme source de carbone.

Les cultures obtenues sont marquées généti-

quement. On peut utiliser pour le marquage un quelcon-

que marqueur génétique transmissible, qui permet l'identification du microbe marqué parmi d'autres

microbes.

Selon un autre aspect préféré de la présente invention, on introduit des gènes de résistance aux

antibiotiques dans les cellules choisies. Si les bacté-

ries vivant dans le rumen sont sensibles à un certain antibiotique et qu'on les mélange à des cellules résistantes, le développement et la mort des premiers

microbes peuvent être facilement suivis si les échan-

tillons sont étalés sur des milieux contenant le même antibiotique. Dans ce cas, seules les cellules

résistantes vont se développer.

Par une transformation (Bergmans et coll.,

J. Bacteriol. 146, 564 /1981/) on introduit le plas-

mide p1011 (Simon et coll., Proc. 8th North American Rhizobium Conference, Winnipeg, Canada, Univ. of Manitoba Press, 1983) portant des fènes de résistance à la kanamycine et au chloramphénicol dans des cultures choisies qui se développent sur la cellulose la farine de céréales ou la mélasse. On isole l'ADN du plasmide à partir des cellules d'E. coli (Birnboim and Doly, Nucl. Acid. Res. 7, 1513 /1979/). La souche est déposée à la hungarian National Collection of Medical Bacteria of the National Institute of Hygiene, Budapest,

sous le n 00264.

Apres transformation avec l'ADN portant des gènes de résistance aux antibiotiques, des cellules

contenant et répliquant la nouvelle information généti-

que, sont choisies sur des milieux solides ayant la composition mentionnée plus haut, mais complétée avec

de la kanamycine. Les souches résistantes seront stockées.

Des milieux contenant une source d'azote, des sels minéraux, de la liqueur de rumen et de l'agar (pour avoir une consistance semi-solide, sont inoculés avec des cultures isolées et stockées, et incubés dans des conditions anaérobies. Les cultures développées sont mélangées à l'alimentation d'un mouton à jeun

depuis ce jour. On prélève quotidiennement des échantil-

lons du rumen avant et après avoir fourni des bactéries à l'animal, on étale ces échantillons sur les milieux solides décrits plus haut contenant de la kanamycine et l'on dénombre des cellules bactériennes qui résistent et sont sensibles à l'antibiotique. On détermine aussi qualitativement et quantitativement la production d'acides gras volatils dans le rumen. On sait que le

rapport des acides gras volatils a un rôle dans l'utili-

sation des aliments par des ruminants (Eskeland et coll., J. Anim. Sci. 33, 282 /1971/; Church et coll., Digestive Physiology and Nutrition of Ruminants, Vol. 2, pp. 622-625, 1971/. Comme cela est mentionné plus haut, on considère

que le rapport optimum d'acide acétique à acide propio-

nique est de 2,0-3,5:1, 3:1 et 3:1, respectivement,

pour la croissance, la production laitière et la sub-

sistance ainsi que la gestation, respc. (Kaufmann, W. and Rohr, K.: Der Einfluss des Futters auf die bakterielle Fermentation in Vormâgen. In: Handbucj der Tierernâhrung, p. 263, Parey, Hamburg-Berlin, 1969). Conformément à ce mode de réalisation préféré du procédé de la présente invention, on isole des bactéries à partir d'échantillon du rumen et l'on examine la capacité des isolats à produire des acides gras volatils. Le microorganisme est cultivé dans des conditions anaérobies dans les milieux complets décrits,

contenant de la liqueur du rumen, puis les concentra-

tions des acides acétique, propionique et butylique des cultures sont déterminées. Des cellules microbiennes produisant des acides gras volatils selon des rapports requis, sont marquées génétiquement et leur croissance

dans le rumen est examinée.

Des souches capables de se développer dans le rumen de l'animal nourri avec l'alimentation décrite pendant au moins 60 jours et qui peuvent fournir, par fermentation des hydrates de carbone de l'alimentation, des acides gras volatils selon des rapports optimum, sont choisies, développées, isolées, conservées et stockées et, si cela est désiré leurs cultures seront adminsitrées par voie orale à des ruminants sous la forme acceptable en élevage, pour faire croître ou

moduler la flore du rumen.

On a déposé à la Hungarian National Collection of Medical Bacteria of the National Institute of Hydiene sous les numéros 00287, 00288 et 00289, respectivement, trois mouches, Hh-GYOKI-1-123Sz, Hh-GYOKI-2-14Ab et HhGYOKI-3-81Me, capables de se développer dans le rumen des animaux nourris avec du foin, de la farine de céréales ou de la mélasse, respectivement, qui peuvent persister dans le rumen pendant un certain

temps et exercent un rôle avantageux sur la digestion.

Conformément à la présente invention, on préfère cultiver des microorganismes provenant du rumen entre 32 et 37 C, dans des conditions anaérobies, en l'absence d'oxygène, dans des milieux contenant des sources de carbone et d'azote, des sels minéraux, des agents réducteurs et de la liqueur du rumen; cette dernière fournit des facteurs de croissance. La source de carbone peut être par exemple, du glucose, de la cellulose, du foin, de la farine de céréales ou de la mélasse, tandis que des sels minéraux, de l'extrait de levure de la caséine et des additifs analogues

constituent des sources d'azote convenables.

Une caractéristique essentielle de la présente invention réside en ce qu'on utilise pour moduler la flore du rumen, des organismes unicellulaires faisant avantageusement fermenter la ration ou les aliments fournis et capables de persister dans le rumen pendant

une longue période de temps. La sélection de ces sou-

ches est assurée à l'aide de marqueurs génétiques, tels qu'ils sont décrits plus haute par exemple des gènes codant pour la résistance aux antibiotiques, des

protéines de type enzyme ou autres protéines détecta-

bles. On peut aussi utiliser des cellules auxotrophes.

Le marqueur génétique est introduit dans la cellule par une molécule d'ADN servant de vecteur, par exemple par un plasmide ou un phage, mais des

caractéristiques éventuelles, par exemple une résis-

tance à un antibiotique, peuvent être choisies par

sélection spontanée également.

Les souches choisies, qui présentent des caractéristiques fermentatives avantageuses et persistent dans le rumen pendant une longue période, sont utilisées, soit pour améliorer le développement de la flore du rumen chez des ruminants qui têtent

encore, soit pour modifier avantageusement la composi-

tion de la flore du rumen déjà établie. Il est recommandé d'administrer la préparation avec les aliments ou l'eau

de boisson.

Le microorganisme choisi pour faire la prépara- tion conforme à la présente invention, est cultivé dans des milieux contenant une source de carbone organique, une source d'azote organique ou minérale et des sels organiques et minéraux et il est ensuite isolé sous une forme convenable pour être transportée ou administrée par voie orale. Si cela est désiré, on formule la

culture du microorganisme en le mélangeant à des sup-

ports solides ou liquides ou à d'autres additifs. La préparation peut être mélangée aux aliments ou à l'eau

de boisson ou elle peut être donnée seule.

Dans le cas des moutons, on ajoute par exemple, 1 à 20 g, de préférence 5 g de culture du microorganisme

suivant la présente invention, à environ 0,5 kg d'ali-

ments. L'alimentation peut être par exemple, un mélange de farine de mais, de luzerne en sac et d'aliments pour

bovins, et les proportions réelles doivent être détermi-

nées en fonction des conditions présentes et du gain

de poids quotidien recherché. Le bétail reçoit générale-

ment 10 à 200 g, de préférence 50 g d'une culture de microorganisme conforme à la présente invention par jour, par exemple en mélange avec environ 5 kg d'aliment classique. La présente invention est aussi relative à la

méthode permettant d'améliorer l'efficacité de l'utili-

sation des aliments par les ruminants.

Après culture dans des milieux liquides, comme cela est mentionné plus haut, les microorganismes sont séparés par centrifugation ou filtration. On peut préparer des pâtes, des préparations hyophilisées ou des suspensions contenant des spores ou des formes végétatives, etc., et l'on peut ajouter des additifs

acceptables pour la nutrition et l'élevage des animaux.

D'autres additifs, par exemple des protéines, des acides aminés ou du glycérol peuvent contribuer à maintenir viables les microorganismes. Les compositions

conformes -à la présente invention utilisées pour amé-

liorer l'utilisation des aliments par les ruminants,

peuvent être additionnées d'autres substances habituel-

lement mises en oeuvre en pratique, par exemple des antibiotiques, qui stimulent la croissance de l'animal hôte (monensine, nigêricine, salynomycine, etc.) ou

augmentent la persistance des microorganismes fournis.

Les cultures microbiennes conformes à la présente invention permettent donc la formation d'une

culture microbienne vivante dans le rumen ou une modi-

fication avantageuse d'une flore établie.

Pendant la période d'allaitement, la flore du rumen est incapable de faire fermenter efficacement les aliments courants. La flore se développe spontanément et fortuitement et il n'est pas du tout sûr que sa

composition soit optimale pour l'animal hôte.

En administrant les souches microbiennes choisies, on peut obtenir un rapide développement de la flore du rumen à la place d'un développement lent et spontané, et cette flore du rumen sera capable

d'utiliser au mieux l'alimentation.

La présente invention est avantageuse en ce qu'avec les microorganismes préparés de la façon ainsi décrite (par exemple avec les souches 00287, 00288 et

00289), on peut promouvoir l'adoption ou le développe-

ment rapide et la flore du rumen pendant le changement

d'alimentation ou le sevrage, en augmentant la crois-

sance des microorganismes dans le rumen, capables de

dégrader le plus efficacement les aliments.

Le procédé peut être utilisé, entre autres,

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dans les cas suivants:

pour des vaches laitières pendant des change-

ments de lactation, à la fin de la gestation et pendant des changements alimentaires saisonniers et autres; 5. pour les bovins au début et à la fin de la période de pâturage, lorsqu'ils passent d'un engraissage

effectué avec des parties non digestibles à un engrais-

sage intensif avec de la farine de céréales, et pendant d'autres changements du régime d'engraissage et de croissance; pour les ovins pendant des changements saisionniers d'alimentation, au début et à la fin de la période de pâturage et pendant le commencement de la

croissance et de l'engraissage intensifs.

Les possibilités sont analogues dans l'élevage caprin également. Des cultures microbiennes préparées selon le procédé de la présente invention peuvent être utilisées aussi dans plusieurs cas particuliers, par exemple pour des ruminants vivant à l'état sauvage, dans

les réserves de gibier et pour le daim.

On doit remarquer que, bien que les cultures microbiennes utilisées dans les compositions conformes à la présente invention proviennent de préférence du rumen, on peut aussi employer d'autres bactéries qui

produisent de l'acide acétique et/ou de l'acide propio-

nique, qui ne proviennent pas nécessairement du rumen.

Ces bactéries comprennent certains membres du genre angerovibrio (lipolythioa), Bacteroides, Selenomonas

(ruminanticum) et des Propionibactéries.

La préparation de souches microbiennes capa-

bles d'utiliser des rations fondamentales contenant principalement de la cellulose (foin), de l'amidon (farine de céréales) ou du sucrose (mélasse) et qui persistent dans le rumen pendant une longue période, est décrite en détail, ainsi que l'utilisation de la

préparation pour le mouton, mais la portée de l'inven-

tion s'étend aux microorganismes capables de se déve-

lopper sur d'autres aliments, et au développement ou à la modification de la flore du rumen d'autres espèces de ruminant également.

- Outre les dispositions qui précèdent, l'in-

vention comprend encore d'autres dispositions, qui

ressortiront de la description qui va suivre.

Exemple 1

Modification de la flore du rumen d'animaux nourris avec du foin A) Isolation des microorganismes capables de se développer sur du foin Des moutons sont laparatomisés, pourvus d'une fistule sur le rumen et nourris de foin pendant un mois. On prélève un échantillon de rumen par la fistule, on le dilue et on l'étale sur le milieu solide RGCA ayant la composition suivante: Solution saline -I: K2HPO4 0,6 g eau distillée ad 100,0 g

Solution saline II::.

NaCl 1,2 g (NH4)2SO4 1,2 g KH2PO4 0,6 g CaCl2 -0,12 g MgSO4,7H20 0,25 g eau distillée ad 100,0 ml Résazurine (solution à 0,1%) 0,1 ml Agar (Bacto) x 2,5 g Liqueur de rumenxx 10,0 ml Glucose 0,05 g Cellobiose 0,05 g Cystéine, HCl monohydrate 0,05 g Carbonate de sodium (solution à 8%) 5,0 g Eau distillée ad 50,0 ml x) Difco Labs, Detroit, USA xx) L'échantillon du contenu du rumen est filtré à travers plusieurs couches de gaze, puis le filtrat

est stocké sous dioxyde de carbone, à -20 C.

Le pH du milieu RGCA est ajusté à 6,8 avant stérilisation sous CO2 gazeux. La stérilisation, la préparation du milieu et la culture sont réalisées selon la méthode de bryant and Burkey (J. Dairy Sci.,

36, 205 /1953/).

La liqueur de rumen est diluée avec un mélange stérile ayant la composition suivante: solution saline I (voir plus haut) 7,5 ml solution saline II (voir plus haut) 7,5 ml cystéine, HCl monohydrate 0,05 g Na2CO3 0,3 g résazurine (solution à 0,1%) 0,1 ml eau distillée ad 100,0 ml

Ce mélange est dénommé HB.

Les cultures sont incubées dans des conditions anaérobies à 35 C (voir Atlas of Rumen Microbiology, Ogimoto and Imai, Japan Scientific Societies Press,

Tokyo, 1981) pendant 120 heures, puis les clones indi-

viduels sont inoculés dans des milieux contenant du foin extrait et ayant la composition suivante: solution saline I (voir plus haut) 15,0% solution saline II (voir plus haut) 15,0% résazurine (solution à 0,1%) 0, 1% Tripton L42 (Oxoid)x 15,0% extrait de levure (Oxoid)x 0,5% liqueur de rumenxx 10,0% Na2CO3 0,4% cystéine, HCl monohydrate 0,05% foin extraitxxx 10,0% Ce milieu est dénommé: milieu liquide RGCF

x) Oxoid Ltd., Londres UK.

xx) Voir ci-dessus.

xxx) On prépare du foin extrait en mettant en suspen-

sion dans de l'eau des particules de foin finement

découpé, on le portant à ébullition et en le filtrant.

Le reste de la filtration est ajouté au milieu avant la stérilisation.

Le pH du milieu est ajusté à 6,5 avant la stérili-

sation.

Des tubes à essais contenant 5 ml de milieu stérile sont inoculés avec la suspension microbienne obtenue à partir de clones individuels développés sur un milieu solide RGCA et incubés dans des conditions anaérobies à 35 C. La croissance est surveillée par examen microscopique et les cultures sont étalées sur du milieu solide RGCA, dans lequel 2,0% de Bacto

cellulose remplacent le glucose et la cellobiose.

Les cultures sont incubées dans des conti-

tions anaérobies à 35 C pendant 120 heures, puis des clones individuels faits de cellules utilisant la cellulose sont inocubés sur le milieu RGCA contenant

la cellulose.

On peut ainsi obtenir des microorganismes de ruminant capable de se développer sur du goin ou

de la cellulose.

B) Marquage génétique des bactéries de rumen

capables dese développer sur du foin.

Le marquage génétique est effectué avec le

plasmide p1011 d'E. coli, selon Simon et coll. (Proc.

8th North American Rhizobium Conference, Winnipeg,

Canada, Univ. of Manitoba Press, 1983).

L'ADN du plasmide est isolé à partir d'une culture d'E. coli selon Birnboim and Doly (Nucl. Acid Res. 7, 1513 /1979/) et il est dissous dans une solution aqueuse contenant les composants suivants: mM de CaCl2 mM de MgC12 mM de tampon tris,HClx, pH 7,5

x) chlorate de tris-(Hydroxyméthyl)-aminométhane.

Des microbes capables de se développer sur du foin et isolés selon le point A) l'exemple 1, sont

cultivés sur un milieu RGCF et séparés par centrifuga-

tion sous C02. Les cellules sont mises en suspension dans une solution aqueuse contenant les composants suivants dans 1 litre: mM de CaCl2 mM de MgCl2 10 mM de tampon de tris,HC1, pH 7,5 1 mM de cystéine, HCl monohydrate 1 mM de thiosulfate de sodium

la suspension devant contenir 5.109 cellules par ml.

La suspension est diluée avec le même volume de solution

contenant l'ADN du plasmide (0,1 pg/ml) et incubée pen-

dant 60 minutes à 4 C. L'incubation est ensuite poursui-

vie à 41 C pendant 2 minutes, puis la culture eSt étalée sur un milieu solide contenant 500 gg/ml de

kanamycine B et de la cellulose comme source de carbone.

La culture est incubée à 35 C pendant 120 heures dans des conditions anaérobies et des clones capables de se développer en présence de 500 gg/ml de kanamycine B

sont examinés Le plasmide p1011 porte des gènes déterminant des résistances à la

kanamycine et au chloramphénicol;

de plus, il contient une origine de réplicationpermet-

tant le début de la réplication des cellules d'E. coli.

* S'il est transformé dans d'autres bactéries, en raison de son manque d'origine convenable permettant une réplication, l'ADN du plasmide est, soit éliminé, soit

incorporé dans le chromosome (partiellement ou complè-

tement) et la recombinaison génétique a lieu. Eventuel-

lement, le gène incorporé dans le chromosome est repliqué et confère aux cellules une résistance à ce kanamycine et au chloramphénicol.

La Demanderesse a obtenu des clones résis-

tant à la kanamycine B, avec une fréquence de trans-

formation de 3.10-5.

Plusieurs clones résistants furent isolés et

la Demanderesse a déterminé la sensibilité à l'anti-

biotique des souches initiales et des souches (KmR) résistant à la kanamycine B. Les résultats obtenus avec plusieurs souches sont rassemblés dans le

Tableau I.

Tableau I Sensibilité à la kanamycine B des bactéries du rumen et de souches marquées génétiquement et dégradant le foin Microbe Plus faible concentration efficace de kanamycine B, gg/ml Liqueur de rumen 31 Souches initiales 4,0 à 7,5 R Souches KmR génétiquement marquées Hh-GYOKI-1-8 500

-27 250

-91 500

-123 1000

-142 500

On a aussi pu obtenir des microorganismes provenant du rumen, qui sont capables d'utiliser du foin ou de la cellulose et de se développer en présence de fortes quantités de kanamycine B. La souche Hh-GYOKI-1-123 (KmR) est étalée sur un milieu RGCA contenant de la cellulose, puis de la kanamycine B est ajoutée aux concentrations de 1000, 5000 et 10 000 gg/ml. Les cultures sont incubées dans des conditions anaérobies à 35 C pendant 168 heures et les souches se développent en présence de 10 000 gg/ml d'antibiotique sont isolées. On obtient ainsi avec

une sélection spontanée, des mutants spontanés forte-

ment résistants à la kanamycine B. L'une de ces souches a été désignée HhGYOKI-1-123Sz et déposée à la Hungarian National Collection of Medical Bacteria of the National Institute of Hygiene, Budapest, sous le

n 00287.

C. Réintroduction de microbes marqués dans le rumen Des milieux stériles solides dénommés RGCFa sont inocubés avec la culture de la souche HhGYOKI-1-123 (KmR) stockés sur des milieux RGCA inclinés à 4 C. La composition du milieu RGCFa est la suivante: 1.K2HPO4 0,3% 45 ml de solution

2. (NH4)2SO4 0,6%

NaCl 0,6% MgSO4 2H2 0,06% CaC122H2 0 0,06%

KH2PO4

KH2PO 4 0,3% 45 ml de solution du mélange 3. Cellulose (Bacto)x 1,8% Agar (Bacto)X 3,0% 65 ml de solution du mélange 4. Extrait de levure 0,1% 20 ml de solution 3 5. Cystéine, HCl,H20 0,1% 20 ml de solution 6. Thiosulfate de sodium 0,1% Na2CO3 0,2% 10 ml de solution du mélange 7. Liqueur de rumenxx 20 ml x) Difco Labs, Detroit, USA xx) Voir plus haut Les 7 solutions sont préparées séparément

et mélangées dans l'ordre indiqué.

La culture est effectuée dans des flacons Erlenmeyer de 500 ml contenant 150 ml de milieu, dans des conditions anaérobies. La croissance est évaluée

après 48 heures, puis la culture est mélangée à l'ali-

mentation d'un mouton nourri de foin. On a administré oralement au mouton, 340 ml de culture contenant 4,7.106 bactéries par ml. On prélève des échantillons

de 50 à 200 ml par la fistule de rumen avant l'adminis-

tration et les jours suivants. Les échantillons sont dilués avec une solution de HB et étalés sur des milieux

RGCA dépourvus de kanamycine B ou d'autres antibioti-

ques. Les cultures sont incubées dans des conditions

anaérobies à 35 C pendant 72 heures et les clones bacté-

riens sont dénombrés. Les résultats sont rassemblés

dans le tableau II.

Tableau II

Changements de la flore du rumen d'un mouton traité avec la souche HhGYOKI-1-123 (KmR) Echantillon Nombre de cellules/ml Sans antibiotique En présence de 1000 gg/ml de --kanamycine B Avant administration 5x106 0 Après administration Jour 1 5,9x106 2,0x104 Jour 2 3,2x107 4,1x104 Jour 3 2,4x106 3,1x104 Jour 6 3,9x107 1,8x104 Jour 8 9,8x106 1,05x105 Jour.15 8, 1x105 3,1x104

On constate d'après le tableau II, que le micro-

organisme administré à l'animal persiste et se développe

dans le rumen.

On cultive aussi selon la procédure ci-dessus, la souche Hh-GYOKI-1-123Sz résistant à 10 000 Lg/ml de kanamycine B, et on l'administre par voie orale au

même mouton, le 15e jour.

On administre par voie orale 140 ml de culture

contenant 2,108 bactéries par ml.

Des bactéries d'échantillons de rumen sont cultivées et dénombrées comme ci-dessus. Les résultats

sont indiqués dans le tableau III.

Tableau III

Changements de la flore du rumen d'un mouton traité avec la souche Echantillon Nombre de cellules/ml Sans antibiotique En présence de 8000 gg/ml de kanamycine B Avant administration 1,4x106 0 Après administration Jour 1 7,4x106 3,2x104 Jour 2 1,7x105 1,3x104 Jour 5 4,0x106 9,1x103 Jour 7 1,lx107 2,0x104 Jour 14 8,0x106 3,1x104 Jour 21 7,1x105 6,2x104 Jour 28 8,2x106 8,1x104 Jour 35 8,7x106 -1,8x104 Les données du tableau III indiquent que le microorganisme administré est présent en quantités significatives dans le rumen et qu'il se réplique sûrement parce que la phase fluide du contenu du rumen est vidée en continu. On peut expliquer des différences de nombres de bactéries entre les échantillons, par les variations de la consistance du contenu de rumen

passant de l'épais au fluide.

Exemple 2

Modification de la flore du rumen chez un mouton nourri de farine de céréales A) Isolation de microorganismes capables de se développer sur la farine de céréales

On répète la procédure du point A de l'exem-

ple 1 sauf que l'on prélève l'échantillon initial dans le rumen d'un mouton nourri de farine de céréales, qu'on inocule les isolats individuels sur un milieu liquide RGCF (voir ci-après) contenant 2% de farine de céréales pulvérisées dans un mortier, à la place de foin extrait, qu'on développe les cultures dans un milieu liquide RGCF, puisqu'on les étale sur un milieu solide RGCA (voir ci-après) et qu'on isole sur un milieu analogue des clones développés à partir de

cellules capables d'utiliser la farine de céréales.

On obtient ainsi, des microorganismes capables de se développer sur de la farine de céréales à titre

de source de carbone.

B) Marquage génétique des bactéries du rumen utilisant la farine de céréales La procédure décrite dans le point B) de l'exemple 1 est répétée, sauf que des souches obtenues selon le point A) de l'exemple 2, sont utilisées pour effectuer la transformation par l'ADN du plasmide p1011, à la place de celles qui sont préparées dans le

point A) de l'exemplel.

La résistance à la kanamycine B de plusieurs

souches transformées KmR est indiquée dans le tableau IV.

Tableau IV

Sensibilité à la kanamycine B des bactéries du rumen et de souches marquées génétiquement et utilisant la farine de céréales Microorganismes Plus faible concentration de kanamycine B inhibant la croissance, gg/ml Liqueur de rumen 31 Souches initiales 1,8 Souches KmR génétiquement marquées Hh-GYOKI-2-4 250 -141b 250

-37 250

-81 125

En effectuant le procédé mentionné ci-dessus, on recueille des microbes provenant du rumen qui sont capables d'utiliser la farine de céréales, comme source de carbone et qui sont huit fois plus résistants à la

kanamycine B que la flore du rumen.

La souche désignée Hh-GYOKI-2-14Ab a été déposée à la Hungarian National Collection of Medical Bacteria of the National Institute of Hygiene,

Budapest, sous le n 00288.

C) Réintroduction des microorganismes marqués génétiquement dans le rumen La procédure décrite dans le point C) de l'exemple T est répétée, sauf qu'un milieu RGCFa stérile contenant 1,8% d'amidon à la place de 18% de

cellulose (Bacto), est inoculé, mélangé à l'alimenta-

tion du mouton et que des échantillons sont prélevés quotidiennement par l'intermédiaire de la fistule avant et après l'administration. On administre oralement au mouton 310 ml de culture contenant 7,1.105 bactéries/ml.

Tableau V

Changements de la flore du rumen d'un mouton traité avec la souche HhGYOKI-2-14Ab (KmR) Echantillon Nombre de cellules/ml Sans anti- En présence de biotique 250 gg/ml de kanamycine B Avant administration 4, 3x106 1,4x101 Après administration Jour 1 4,1x106 1,8x103 Jour 2 3,2x106 2,1x103 Jour 3 8,0x103 1,1x103 Jour 6 9,6x106 7,1x102 Jour 8 8,0x106 8, 1x103 Jour 15 6,8x106 8,7x103 Jour 22 5,0x106 9,8x103 Jour 29 8,0x10 6 1, 1x104 Jour 36 9,1x106 7,0x103 Jour 43 7,0x106 7,9x103 Jour 60 6,1x106 7, 0x103 Les données du Tableau V montrent que le microorganisme administré persiste et se réplique dans

le rumen pendant une longue période.

Exemple 3

Modification de la flore du rumen d'un mouton nourri de mélasse A) Isolation des microorganismes capables de se développer sur la mélasse La procédure décrite dans le point A) de m'exemple 1 est répétée, sauf que les échantillons initiaux sont prélevés chez un mouton nourri de mélasse, que les isolats individuels sont inoculés sur un milieu RGCF contenant du glucose à la place du foin extrait, que les cultures développées dans un milieu liquide sont étalées sur des milieux RGCA et que des clones développés à partir de cellules utilisant la

mélasse sont inoculés sur le même milieu RGCA.

On obtient ainsi des microorganismes prove-

nant du rumen et utilisant la mélasse.

B) Marque génétique des bactéries utilisant la mélasse La procédure décrite dans le point B) de

l'exemple 1 est répétée, sauf que des cellules prépa-

rées selon le point A) de l'exemple 3 sont transformées par l'ADN du plasmide p1011, à la place de celles qui

sont obtenues selon le point A) de l'exemple 1.

La résistance à la kanamycine B de plusieurs

souches KmRest indiquée dans le-Tableau VI.

Tableau VI

Résistance à la kanamycine B de bactéries du rumen et de souches génétiquement marquées et utilisant la mélasse Microorganismes Plus faible concentration de kanamycine B inhibant la croissance Liqueur de rumen 31 Souches initiales 7,5 Souches KmR génétiquement marquées Hh- GYOKI-3-2 250

-14 500

-34 250

-81Me 500

-132 500

On obtient ainsi des isolats fortement résis-

tants à la kanamycine B et utilisant la mélasse.

La souche désignée Hh-GYOKI-3-81Me a été déposée à la Hungarian National Collection of Medical Bacteria of the National Institute of Hygiene,

Budapest sous le n 000289.

C) Réintroduction de bactéries génétiquement marquées dans le rumen La procédure décrite dans le point C) de l'exemple 1 est répétée, sauf que la souche Hh-GYOKI-3-81Me est inoculée sur un milieu RGFa contenant 1,8% de glucose à la place de 1,8% de cellulose.et que la culture est

mélangée à l'alimentation du mouton nourri de mélasse.

On lui administre oralement 380 ml d'une culture conte-

nant 1,6.107 bactéries/ml. On prélève chaque jour un

échantillon avant et après l'administration, par l'inter-

médiaire de la fistule du rumen.

Tableau VII

Changements de la flore du rumen d'un mouton traité avec la souche HhGYOKI-3-81Me (Km) Echantillon Nombre de cellules/ml Sans anti- En présence de 500 gg/ml biotiques de kanamycine B Avant administration 5, 0x106 0 Apres administration Jour I 1,1x106 1,9x105 Jour 2 1,8x107 2, 5x105 Jour 3 6,2x106 6,1x105 Jour 6 8,1x106 8,7x105 Jour 8 6,2x106 9, 1x105 Jour 15x 1,3x103 1,3x102 Jour 22 3,0x106 3,1x105 Jour 29 1,1x106 7, 0x105 Jour 36 8,0x105 9,1x104 Jour 43 6,1x106 8,1x105 Jour 60 6,8x106 6, 4x105 x) Erreur dans la prise d'échantillon Ces données montrent que le microorganisme administré persiste pendant longtemps dans le rumen

d'un mouton nourri de mélasse.

Exemple 4

Changements du rapport d'acides gras volatils dus à un traitement avec la préparation bactérienne Deux moutons reçoivent une ration alimentaire complète pendant 14 jours, puis un échantillon du rumen est prélevé par une fistule. On filtre deux litres de

liqueur de rumen à travers plusieurs couches de gaze.

Le reste particulaire est mis en suspension dans 1 litre de tampon physiologique (voir ci-après) mélangé et filtré comme ci-dessus. Les deux filtrats sont mélangés, laissés reposer pendant une heure, les solides flottant

à la surface sont rejetés et la phase liquide est examinée.

La composition du tampon physiologique est la suivante: Na2HP04 0,316 g/1 2po4 4 0 152 g/1 NaHCO3 2,260 g/1 KC1 0,375 g/1 NaCl 0t375 MgS04 0,112 v/1 CaC12H20 0 050 g/1 Feso4t7H20 0,008 g/1 MnSO4 H20 0,004 g/1 ZnSO4 47H20 0,004 g/1 CuSO4)5H20 0,002 g/1 CoCI2 6H20 0>001 g/1 On évalue le pH du mélange et on l'ajuste à 7,2 si cela est nécessaire, avec une solution aqueuse de HC1 ou de NaOH (Cheng et coll.: J. Dairy Sci. 38,

1225 /1955/).

Le mélange obtenu est additionné du même volume de tampon physiologique et 4 g de la ration alimentaire sont mis en suspension dans 1 litre du

mélange dilué. On verse des portions de 30 ml de la sus-

pension dans des flacons Erlenmeyer de 100 ml. On stéri-

lise 200 doses, tandis que 200 autres ne le sont pas.

Des milieux stériles et des milieux contenant des bactéries du rumen sont inoculés avec des souches

bactériennes dont on veut étudier la capacité à pro-

duire des acides acétique, propionique et butyrique.

On examine des souches bactériennes qui se révèlent capables de persister dans le rumen pendant une longue période après une culture in vitro. De plus, on étudie aussi des souches bactériennes isolées à partir de la liqueur du rumen d'un mouton recevant une ration complète ou une quelconque ration suivant les

points A, B et C de l'exemple 1.

Les bactéries à étudier sont cultivées sur des milieux RGC+CG (voir ciaprès) dans des conditions

anaérobies à 37 C pendant 48 heures.

Composition du milieu RGC+CG: solution saline I (voir point A de l'exemple 1) 15% solution saline II (voir point A de l'exemple 1) 15% solution d'oligoélémentsx 0,3% extrait de levure (Oxoid) 0,5% liqueur de rumen 10,0% Na2C03 0,4% 0,05% cystéine, HCl,H20 0,05%

2 0,.008%

thiosulfate de sodium 0,008% cellulose (Bacto) 0,3% glucose 2,0% glucose XComposition de la solution d'oligoéléments: ZnC12 40 mg CCl2, 2H20 10 mg tétraborate disodique décahydraté 10 mg molybdénate d'ammonium tétrahydraté 10 mg FeCl3,6H20 200 mg MnCl2, 4H20 10 mg eau désionisée ad 1000 ml Des cultures sont inoculées sur des milieux préparés dans des flacons Erlenmeyer. On inocule 2 ml

de culture dans 50 ml de milieu, dans des flacons paral-

lèles. On inocule aussi des cultures non stériles.

Les flacons sont incubés dans des conditions anaérobies pendant 40 heures. La croissance est stoppée avec une solution d'acide formique à 10% et la teneur

en acides gras volatils des cultures est alors déterminée.

Les cultures sont filtrées à travers des coy-

ches de gaze et centrifugées à 4000 tpm pendant 15 minu-

tes, puis filtrées à nouveau et envoyées sur la colonne de séparation d'un chromatographe gaz-liquide Carlo Erba GI-452, muni d'un détecteur d'ionisation à flamme, pour déterminer la teneur en acides gras en C2 à 5' Température de la colonne: 150 C Colonne de séparation: 2 m de long, 4 mm de diamètre intérieur; tube de verre garni de 10% d'adipate d'éthylène glycol et 2% d'acide o-phosphorique sur un support de gel de silice silané (particules ayant un

diamètre de 0,2 à 0,3 mm).

Température de l'injecteur: 190 C.

Débit du courant d'azote: 50 ml/minute.

Débit du courant d'hydrogène: 50 ml/minute.

Débit du courant d'air: 200 ml/minute.

Déplacement du papier: 160 cm/heure.

Durée de la chromatographie: 20 minutes.

Volume de l'échantillon: 1 il.

On effectue trois mesures pour chaque échan-

tillon. La solution standard contient l'acide acétique, propionique, l'acide isobutyrique, l'acide butyrique,

l'acide isovalérique et l'acide valérique.

On isole plus de 90 souches de bactéries pro- venant d'un mouton recevant une ration complète. Les

souches sont ensuite marquées génétiquement et exami-

nées (les souches positives sont examinées à plusieurs reprises). Les résultats représentatifs sont indiqués

dans le Tableau VIII.

Les signes utilisés dans le Tableau VIII ont le sens suivant: S: inoculée après stérilisation; NS: une culture contenant la flore vivante du rumen est inoculée, a) quantités à l'état de traces; b) témoin négatif: teneur en acide gras volatil du milieu préparé à partir de la liqueur de rumen, de tampon physiologique et d'aliments utilisés pour l'expérience (moyenne de 12 mesures); c) témoin positif: teneur en acide gras volatil de la culture incubée contenant des bactéries initiales du rumen et préparée par ailleurs selon la même procédure (moyenne de 12 mesures); d) comme c) mais avec addition de 5 ppm de monensine Na au milieu (moyenne de 6 déterminations); e) comme c), mais avec addition de 10 ppm de monensine

Na au milieu (moyenne de 6 déterminations).

Tableau VIII

Acid e Acide Acide Acide Acide Acéique Souche de Remarque Acide Acide proi-buty- buty- i-valé- valé-ctique/ bactérie acétique pionique rique rique rique rique Acide g/ml 9/mlp/ml./ml 9/ml propionique gg/ml kt2/Mgg/ml -gg/l gg/ml LL/ml Hh-GYOKI S 1,71 1,87 a 0,35 a - 0,91 -1- 123Sz NS 2,00 2,60 a 0,50 a - 0,77 Hh-GYOKI S 0,38 0,58 a 0,35 a - 0,65 - 2-14Ab NS 1,95 1,36 a 0,52 0,12 a 1,43 Hh-GYOKI- S 2,21 0,67 a a a - 3,29 -3-8lMe NS 2,81 0,81 a a a - 3,47 - b 1,51 0',74 a 0,39 a a 2,04 -. 1,68' 0,91 a 0,51 0,11 0,09 1,84 - d. 1,69 1,08 a 0,41 a a 1,67 - e 1,61 0,91 a 0,37 a a 1,77 Hh-GYOKI-48a S 1926 1,60 a 0,32 a - 0,79 NS 1,21 2,38 a 0, 34 0,48 a 0,51 O Hh-GYOKI-50a S 1,44 1,56 a 0,34 a - 0,92 NS 1,73 2,01 a 0,35 0,15 - 0,86 Tableau VIII (suite) Acide Acide Acide Acide Acide Souche de Remarque Acide Acide pro- i-buty- buty- i-valé- valé- acétique/ bactérie acétique pionique rique rique rique rique Acide gg/ml tg/ml gg/ml gg/ml g/ml ig/ml propionique Hh-GYOKI-51a S 2,37 0,47 a 0,36 a - 5, 04 NS 2,02 0,70 a 0,35 0,15 - 2,89 Hh-GYOKI-55a S 2,10 0,51 a 0,34 a - 4, 12 W NS 2,18 0,78 a 0,37 0,14 - 2,79 Hh-GYOKI-113 S 1,39 0,67 a 0,34 - - 2,07 NS 1,77 0,60 a 0,27 - - 2,95 Hh-GYOKI-122 S 1,31 0,87 a 0,31 - - 150 NS 2,02 0,91 a 0,31 - - 2,22 Hh-GYOKI-109b S 2,49 0,45 a 0,29 - - 5,53 NS 2,92 0,36 a 0,30 - 8,11 }h-GYOKI-126 S 0,56 0,60 a 0,52 a a 0,93 NS 0, 83 1,14 a 1,55 0,11 0,70 0,73 o Les données du Tableau VIII indiquent que les

rapports des acides gras volatils produits par la fonc-

tion fermentative de la flore du rumen, peuvent être modulés dans une large gamme par l'administration de cultures microbiennes préparées conformément à la présente invention. On peut par exemple, stimuler notablement la production d'acide propionique avec une culture préparée à partir de la souche Hh-GYOKI-48a,

tandis que la souche Hh-GYOKI-109b stimule la produc-

tion d'acide acétique. On observe une stimulation de la production des acides gras individuels, à la fois sur des milieux manquant (S) de microbes vivants du

rumen ou en contenant (NS). Dans le système expérimen-

tal de la demanderesse, le monensine Na a diminué le repport des acides acétique à propionique de 0,1 ou

0,2 (d, c).

Des microorganismes choisis selon le procédé

mentionné ci-dessus sont marqués génétiquement, admi-

nistrés aux ruminants, puis leur développement et leur

persistance dans le rumen sont examinés selon la pro-

cédure qui est décrite dans le point B) de l'exemple 1.

Des souches présentant un modèle de fermentation avanta-

geux et une longue persistance dans le rumen, seront administrés par voie orale pour modifier la production

des acides gras volatils.

Exemple 5

Préparation bactérienne à administrer par voie orale à

des ruminants.

Des bactéries à administrer sont cultivées

sur des milieux RGCA+CG (exemple 4) dans des condi-

tions anaérobies selon le procédé décrit. Apres la culture, des cellules sont séparées par filtration ou centrifugation. Des cellules séparées sont mises en suspension dans du tampon physiologique (exemple 4) et hyophilisées. La préparation bactérienne hyophilisée est stockée, convenablement formulée et administrée

aux ruminants par voie orale.

Des microorganismes peuvent être aussi culti-

vés dans d'autres milieux habituellement utilisés, par exemple, dans des milieux contenant du glucose et de l'amidon, etc., comme source de carbone et des sels

minéraux comme source d'azote.

La préparation peut être facilement adminis-

trée par mélange à l'alimentation ou l'eau de boisson, seule ou avec d'autres agents biologiquement actifs,

par exemple, avec des antibiotiques et des vitamines.

D'autres produits peuvent aussi être prépares

en plus de la préparation hyophilisée. Des microorga-

nismes peuvent aussi être administrés après mélange de la masse bactérienne filtrée ou centrifugée avec des diluants ou des supports, par exemple, du CaCO3, des

concentrés, des prémélanges ou d'autres-aliments.

La ou les sondes bactériennes sont choisies à partir de microorganismes préparés selon le procédé de l'invention et modifiant avantageusement la flore du rumen et la quantité à administrer est déterminée

en fonction de la ration alimentaire et de l'utilisa-

tion de l'animal. Si l'on cherche à réduire le rapport d'acides acétique, propionique, on peut utiliser par exemple, une culture préparée à partir de la souche

Hh-GYOKI-48a mais, pour augmenter ce rapport, l'adminis-

tration de la souche Hh-GYOKI-3-81Me est recommandée.

Les spécialistes sauront déterminer le nombre de cellules microbiennes nécessaires. Il est conseillé d'administrer des cellules en une quantité convenable pour fournir 5.10o2 à 5.107 microorganismes cultivés par

ml de liqueur de rumen.

Exemple 6

Administration de souches Hh-GYOKI-48a et Hh-GYOKI-1-123Sz à des-moutons La souche Hh-GYOKI-48a est cultivée sur des milieus RGCA+CG (exemple 4) dans des fermenteurs de litres (volume utile) à 37 C, dans des conditions améliorées. On commence la fermentation en inoculant m2 de culture de composition analogue. Après 48 heures de culture, on sépare les cellules en les centrifugeant (5000 tpm) et l'on mélange soigneusement le sédiment humide pesant 58 g, avec 4 kg de farine de mais. Le mélange est divisé en huit parties égales et administré par voie orale à huit moutons privés de nourriture pendant les 24 heures précédentes. On peut utiliser de même, la souche Hh-GYOKI-1-123Sz, avec une

récolte bactérienne de 53 g.

On réalise une expérience de croissance-

engraissage en donnant ad libitum du fourrage pauvre en vert à 23 moutons et l'on pèse ces animaux chaque semaine pendant 5 semaines. Les groupes expérimentaux

comprenant 8 animaux reçoivent chacun l'une des prépara-

tions bactériennes en une seule prise et sept moutons

constituent les témoins, Chaque animal consomme quoti-

diennement 600 à 900 g de foin, plus un prémélange de substances minérales et de vitamines mélangées à de la farine de maïs (100 g). Les résultats sont donnés dans

le Tableau IX.

Tableau IX

Prise de poids chez des moutons nourris de fourrage au vert ad libitum N de Poids 1ère 2ème 3ème 4ème 5ème série initial semaine Témoins 1 u 29;5 3010 2915 29,5 2915

2 27,0 2715 2825 27,0 26,5 281 0

3 2815 2710 27,0 2715 2675 2615

4 3020 30;5 30,0 30,5 30,0 2910

5.29r5 30,0 2970 3015 29,5 3070

6 2570 2515 26,5 2620 26,0 27.5

7 2770 270 2715 2810 28 0 28,0

Traités avec la souche 'Hh-GYQKI-''1123Sz

8 29;5 32 0 3215 3320 33,5 3410

9 2515 26t5 27,0 2825 29,5 29,0 25)0 25,5 250 2870 29t0 28;5

11 2575 2475.25,5 275 27,5 2780

12 29r0 28,0 2920 28,5 29,0 30,0

13 2925 30;0 3055 2955 3025

14 29,5 2875 29,5 3010 30,5 3110

2825 2970 30;5 30;0 30,5 3210

Traités avec i.a.'oudhe 'h-GYOKI-;48a 3016 2915 30r0 30;5 31,0 3270 33f5

17 26>5 25;0 26;5 27 0 2970 30;0

18 27,0 2775 28)5 29,5 30,5 31,0

19 26,0 26,0 27,0 28,0 29,0 30;5

29,5 30,5 31,0 31,5 32,5 33;0

Tableau IX (suite) N de Poids 1ère 2ème 3ème 4ème 5ème série initial

21 28,0 28,0 28,0 29,0 29,0 30,0

22 29,0 30,5 33,2 30,0 32,8 33,5

23 27,0 26,0 27,5 29,0 31,0 32,0

La prise de poids moyenne quotidienne est calculée à partir des données du Tableau IX et elle est indiquée dans

le Tableau X.

Tableau X

Poids moyen et prise de poids quotidienne des moutons expérimentaux et des moutons servant de témoins Poids initital lère 2e 3ème 4ème 5ème semaine Témoin Poids moyen du corps (kg) 28,0 28,14 28,36 28,43 28,00 28, 36 Prise de poids moyenne quotidienne (g) +20 +31 +10 -61 +51 Traités avec la souche Hh-GYOKI-1-123Sz Poids moyen du corps (kg) 27,75 28,00 28, 69 29,31 29,81 30,3, Prise de poids moyenne quotidienne (g) +31 +86 +77 + 62 +70 Traités avec la souche Hh-GYOKI-48a Poids moyen du corps (kg) 27, 81 27,94 29,02 29,37 30,73 31,6' Prise de poids moyenne quotidienne +16 + 135 +44 +170 +120

Des moutons traités avec les souches Hh-GYOKI-

1-123Sz et Hh-GYOKI-48a et ceux du groupe témoin gagnent avec une ration maigre, une moyenne de 2620, 3875 et 360 g

respectivement pendant la période d'expérience de 35 jours.

Les poids corporels de départ ne diffèrent pas

notablement entre les groupes, mais l'on obtient des diffé-

rences significatives entre les poids corporels à la fin de l'expérience (Tableau XI) et entre les gains quotidiens

(Tableau XII).

Tableau XI Evaluation statistique des poids corporels finaux Témoin HhGYOKI-1-123Sz Hh-GYOKI-48a Moyen (kg) 28,357 30,375 31,6875 Carré corrigé de l'écart type 1,476 3,910 2,281 p (%) <5,0 <0,1

Tableau XII

Evaluation statistique des prises de poids corporels (5 semaines) Témoin Hh-GYOKI-1-123Sz Hh-GYOKI-48a Nombre d'animaux 7 8 8 Prise de poids totale du groupe (kg) 2,5 21,0 31,0 Gain maximum (kg) 2,5 4,5 5,0 Gain minimum (kg) -2,0 1,0 2,0 Gain moyen par mouton (kg) 0,3571 2,6250 3,8750 Carré corrigé de l'écart type 2,143 1,768 0,839 Ecart type +1,355 +1,244 + 0,857 a569085 Les données indiquent que des préparations faites conformément à la présente invention peuvent stimuler remarquablement la prise de poids chez le mouton.

Exemple 9

Persistance de bactéries marquées génétiquement dans le rumen de bovin La procédure qui est décrite dans le point C) de l'exemple 1 est répétée, sauf que la souche Hh-GYOKI-1-123Sz résistant à 10 000 gg/ml de kanamycine est cultivée dans 4 litres de milieu RGCFa. Lorsque la phase stationnaire est atteinte (38e heure), la culture

est récoltée par centrifugation (5000 tpm) et les cellu-

les sont complètement mélangées avec 500 g de farine de mais et données à une vache. On prélève chaque semaine des échantillons par l'intermédiaire d'une fistule et l'on détermine la persistance dans le rumen de la souche administrée, selon la procédure décrite dans le point C)

de l'exemple 1.

Les résultats indiquent que la souche Hh-GYOKI- 1-123Sz se développe dans le rumen du bovin et qu'elle

peut y persister pendant au moins 40 jours.

Claims (10)

REVENDICATIONS

1. Composition améliorant l'efficacité de

l'utilisation des aliments par des ruminants, caracté-

risée en ce qu'elle comprend comme composant actif, une ou plusieurs cultures microbiennes capables d'ajuster

le rapport pondéral d'acide acétique à acide propioni-

que à une valeur optimale de 1,5 à 4,0:1 et de se développer dans le rumen et d'y persister pendant au moins 60 jours, éventuellement en mélange avec des supports, des diluants, des conservateurs utilisés

habituellement dans l'élevage des animaux et des subs-

tances nutritives et/ou d'autres substances adminis-

trées classiquement aux ruminants.

2. Composition suivant la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend en plus 95% en poids

de composant actif.

3. Composition suivant la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle comprend une culture microbienne capable d'ajuster le rapport d'acide acétique à acide propionique dans le rumen à

2,0-3,5:1.

4. Composition suivant l'une quelconque des

revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle comprend

comme culture microbienne, un ou plusieurs membres choi-

sis dans le groupe comprenant les souches de micro-

organisme déposées à la Hungarian National Collection of Medical Bacteria of the National Institute of Hydiene

sous les numéros 00287, 00288 et 00289.

5. Composition suivant l'une quelconque des

revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle est

sous forme d'une pâte de microorganismes, de hyophilisat

ou d'une suspension de ceux-ci.

6. Procédé de préparation des cultures micro-

biennes utilisées comme composant actif dans une compo-

sition suivant l'une quelconque des revendications 1 à 5,

O2569085

caractérisé en ce que: on prélève des échantillons à partir du rumen d'animaux recevant une ration ou des aliments donnés,

on examine in vitro et/ou in vivo le métabo-

lisme des microorganismes isolés à partir de l'échan- tillon et l'on cultive des microorganismes dont le métabolisme est pourvu d'avantageuses caractéristiques dans des milieux contenant la même ration ou les mêmes aliments comme source de carbone ou d'azote, on introduit un marqueur génétique qui permet

une sélection, dans les microorganismes qui se dévelop-

pent, on cultive les souches marquées génétiquement, on introduit les cultures dans le rumen des animaux nourris avec la même ration ou les mêmes aliments, on prélève des échantillons du rumen, on dénombre les cellules de la souche marquée génétiquement, on sépare des souches persistant pendant au moins 60 jours en ajustant le rapport d'acide acétique à acide propionique à une valeur optimale de 1,5-4,0:1, et si cela est désiré, on formule ces souches sous une forme acceptable pour être utilisée dans la

nutrition et l'élevage des animaux.

7. Procédé suivant la revendication 6, carac-

térisé en ce qu'une résistance à un antibiotique est

utilisée comme marqueur génétique.

8. Procédé suivant la revendication 6 ou 7, caractérisé en ce que l'on isole des microorganismes du rumen d'animaux recevant une alimentation contenant de la cellulose, de préférence du foin, une alimentation contenant de l'amidon, de préférence du fourrage ou une alimentation contenant un mono- et/ou disaccharide, de préférence des mélasses, et que l'on réintroduit les souches marquées génétiquement dans le rumen d'animaux recevant l'une des alimentations ci-dessus pour les

tester, l'on cultive les cultures microbiennes conve-

nables, puis on les isole, et si cela est désiré, on

formule les cultures obtenues sous une forme convenable.

9. Procédé suivant l'une quelconque des reven- dications 6 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend la séparation des cellules du microorganisme sous une forme hyophilisée.

10. Procédé pour améliorer l'efficacité de l'utilisation des aliments par un ruminant, caractérisé en ce qu'on administre à ces animaux par voie orale, une quantité efficace d'une ou de plusieurs cultures microbiennes capables d'ajuster le rapport d'acide acétique à acide propionique A une valeur optimale de 1,5-4,0:1 et de se développer dans le rumen et d'y

persister pendant au moins 60 jours.