CN118160871A - 红法夫酵母与枯草芽孢杆菌协同发酵家禽配合饲料的方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种红法夫酵母与枯草芽孢杆菌协同发酵家禽配合饲料的方法及应用，该方法主要通过以下步骤实现：(1)红法夫酵母斜面培养；(2)红法夫酵母种子培养；(3)枯草芽孢杆菌斜面培养；(4)枯草芽孢杆菌种子培养；(5)红法夫酵母和枯草芽孢杆菌协同固态发酵培养。本发明充分发挥两菌株产物和代谢优势，获得的家禽配合饲料直接含有天然虾青素，改善了发酵物料的营养价值，产生更多的活性物质，增强动物的抗病能力，实现蛋鸡的全程无抗养殖，并提高蛋品品质。

Description

红法夫酵母与枯草芽孢杆菌协同发酵家禽配合饲料的方法及 应用

技术领域

本发明涉及微生物发酵工程技术领域，具体涉及一种红法夫酵母与枯草芽孢杆菌协同发酵家禽配合饲料的方法及应用。

背景技术

2019年7月农业农村部发布了第194号公告，促生长药物饲料添加剂在2020年7月1日后全部退出。饲料端“禁抗”，养殖端“减抗、限抗”，产品端“无抗”已成为饲料与养殖业发展的必然趋势。虾青素在禽畜业中，作为蛋禽和家畜的饲料添加剂, 是我国《饲料添加剂品种目录（2013）》中被允许使用的安全菌种。

然而，现有虾青素饲料主要是通过在饲料中添加虾青素来饲喂家禽以提高家禽养殖效率。这种方式存在如下缺陷：

一是由于家禽自身酶系不全， 酶量不足且现在使用的虾青素配合饲料通常以玉米、糠麸、饼粕、 作物秸秆等不能消化吸收的植物性原料为主，导致其对现有饲粮中粗蛋白质和能量利用率较低。此外，沙门氏菌和大肠杆菌等致病菌还会影响家禽机体肠道微环境，破坏肠道结构完整性，降低其生产性能和产品品质。

二是天然虾青素获取困难，提取工艺繁琐，生产成本较高，而且提取加工过程中可能存在污染物的残留、浓缩等问题。

我国天然虾青素的生产目前还处于初级阶段，大量工作目前主要集中在实验室研究水平，如果购买，国内天然虾青素粉的市场价格为7900 元/千克，成本较高。而如果用微生物制备，工艺较繁琐。以红法夫酵母为例，一般需先对红法夫酵母进行液体发酵，然后再进行虾青素的提取，如中国专利CN103820520A “一种高产天然虾青素的发酵方法”，中国专利CN102864087 A“一株高产天然虾青素的红法夫酵母菌株及其选育方法和应用”以及中国专利CN106701880 A“提高红法夫酵母菌株高产虾青素的方法”，其工艺流程均包括红法夫酵母菌体活化、接种、发酵、离心收集菌体、烘干、破壁处理、浸提、浓缩、分析提取虾青素等。

三是虾青素为人工添加，整个工艺过程不但复杂，而且还会导致饲料味道欠佳，从而影响摄食量和虾青素的摄入量，导致家禽以及生产的蛋中虾青素含量不高。

如中国专利CN109258966A公开了“一种提高鸡蛋天然虾青素含量的方法”，其饲料由基础饲料和混有天然虾青素的预混料组成，饲料制备过程即为将基础饲料与预混料通过人工或机械搅拌混合均匀。这种简单混合的方式，虾青素容易分解，最终不能被有效摄入。中国专利CN115606707A公开了“一种富含天然虾青素的家禽饲料及其制备方法”，其对饲料的制备方法进行了改进，提高了饲料中虾青素的保存时间，促进了家禽对虾青素的摄食量等，但整个工艺过程相对复杂，同时为改善适口性还需添加诱食剂。

发明内容

本发明的目的在于解决上述问题而提供一种红法夫酵母与枯草芽孢杆菌协同发酵家禽配合饲料的方法与应用。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：

一种利用红法夫酵母固态发酵生产天然虾青素家禽配合饲料的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）红法夫酵母菌斜面培养：将红法夫酵母菌株接种于斜面培养基上培养；

（2）红法夫酵母菌种子培养：将步骤（1）获得的斜面菌种接种到种子培养基中培养；

（3）枯草芽孢杆菌斜面培养：将枯草芽孢杆菌菌株接种于斜面培养基上培养；

（4）枯草芽孢杆菌种子培养：将步骤（3）获得的斜面菌种接种到种子培养基中培养；

（5）协同固态发酵培养：将步骤(2)和步骤(4)培养好的种子液按1：(1-10)的配比接种到发酵基料中，在发酵初始pH为6.2-6.6，20-26℃条件下培养6-12天。

进一步地，所述红法夫酵母斜面培养基为PDA培养基，以1L计含有以下组分：6g 马铃薯浸出粉，20g 葡萄糖，20g 琼脂。

进一步地，所述红法夫酵母斜面培养的培养条件为在22-26℃条件下培养3-4天。

进一步地，所述枯草芽孢杆菌斜面培养基为NA培养基，以1L计含有以下组分：3.0g牛肉膏，10.0g 蛋白胨，5.0g NaCl，20.0g 琼脂，pH 7.2-7.4。

进一步地，所述枯草芽孢杆菌斜面培养条件为在28-30℃培养2-3天。

进一步地，所述红法夫酵母种子培养基为YM培养基，以1L计含有以下组分：10.0 g葡萄糖，5.0g 蛋白胨，3.0g 酵母膏，3.0g 麦芽浸提物。

进一步地，所述红法夫酵母种子培养的培养条件为在恒温振荡器中于180-200 r/min、22-26℃条件下培养3-4天。

进一步地，所述枯草芽孢杆菌种子培养基为NB培养基，以1L计含有以下组分：3.0g牛肉膏，10.0g 蛋白胨，5.0g NaCl，pH 7.2-7.4。

进一步地，所述枯草芽孢杆菌种子培养的条件为在恒温振荡器中于180-200 r/min，28-30℃条件下培养2-3天。

进一步地，所述发酵基料按质量百分比由以下的组分构成：玉米粉60%，豆粕25%，麸皮15%，其中，玉米粉、豆粕和麸皮中均含水，水的含量为发酵基料总质量的35%-45%。

优选地，所述红法夫酵母种子液和枯草芽孢杆菌种子液以1：5的配比接种到含水量为40%的发酵基料中，在pH为6.5，24℃条件下培养12天。

进一步地，上述方法中，所述红法夫酵母为红法夫酵母（Phaffia rhodozyma）P406。所述红法夫酵母P406，保藏编号为GDMCC No.63339，已于2023年4月保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

进一步地，上述方法中，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）B24。所述枯草芽孢杆菌B24，保藏编号为GDMCC No.63457，已于2023年5月保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

本发明还提供按照上述方法生产的家禽配合饲料的应用，将发酵饲料与普通饲料混合可得到生物饲料。其中，当生物饲料用于育蛋鸡时，发酵饲料占生物饲料的10%-30%，优选30%，每天喂食2次。

优选地，所述普通饲料成分为：玉米60%，豆粕22%，麦麸8%，石粉 8%，磷酸氢钙1%，预混料（提供无机盐及维生素）1%。

本发明的有益效果如下：

本发明提供了一种红法夫酵母与枯草芽孢杆菌协同发酵家禽配合饲料的方法，采用虾青素生产菌株红法夫酵母与枯草芽孢杆菌功能菌株为发酵菌株，对家禽配合饲料基础料进行固态发酵，两菌株协同作用，互为增效，充分发挥两菌株产物和代谢优势。

红法夫酵母发酵的配合饲料直接含有天然虾青素，枯草芽孢杆菌可以产生更多的消化酶、有机酸以及抗菌蛋白、脂肽等物质来抑制肠道内的致病微生物，使机体处于无炎症的健康状态，促使饲料中虾青素对机体产生更大的作用，提高机体的抗氧化性能、鸡蛋新鲜度以及蛋黄色度。并且两者协同增效，所得发酵饲料虾青素、酸溶蛋白等营养价值更高，色泽均一，呈淡红色，具有酸香味，动物适口性好，能够产生更多的活性物质和有益活性菌，既能提高饲料的消化吸收率和降解抗营养因子，还能拮抗肠道有害病原菌生长，增强动物的抗病能力，实现蛋鸡的全程无抗养殖，并提高蛋品品质。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。

红法夫酵母（Phaffia rhodozyma）P406于2020年分离自采集于白洋淀水域的水样，可利用多种碳源，生长条件简单，能够生产虾青素。

枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）B24于2020年分离自采集于保定清苑区的土壤样品，可高产抑菌活性物质和蛋白酶、淀粉酶。

具体分离方法如下：

红法夫酵母的分离：取10mL水样加入到90mL酵母浸出粉蛋白胨葡萄糖液体培养基（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，YPD）：酵母膏 10.0 g、蛋白胨 20.0 g、葡萄糖 20.0 g、水 1L，进行富集培养，然后通过梯度稀释，涂布于加0.1 mg/mL氯霉素的YPD固体培养基上，通过常规分离方法进行分离。

枯草芽孢杆菌的分离：取土壤样品1g，加到 99mL 无菌水中，摇床振荡 20-30min，梯度稀释，于85℃下水浴 20-30min，取100μL 稀释后的样品，涂布到NA培养基平板上，分离单菌落。

培养基的配置：

红法夫酵母斜面培养基（PDA培养基）：马铃薯浸出粉 6g，葡萄糖 20g，水1000mL,pH 6.5,121℃灭菌20分钟。

枯草芽胞杆菌斜面培养基（NA培养基）：牛肉膏 3.0g，蛋白胨 10.0g，NaCl 5.0g，琼脂 20.0g、水1000 mL，pH 7.2-7.4，121℃灭菌30分钟。

红法夫酵母种子培养基（YM培养基）：10.0 g 葡萄糖，5.0g 蛋白胨，3.0g 酵母膏，3.0g 麦芽浸提物，水1000mL，pH 6.0-6.4，121℃灭菌20分钟。

枯草芽孢杆菌种子培养基（NB培养基），3.0g 牛肉膏，10.0g 蛋白胨，5.0g NaCl，水1000mL，pH 7.2-7.4，121℃灭菌30分钟。

发酵基料组成：玉米粉60%，豆粕25%，麸皮15%，潮料水分达到40%，不进行灭菌。

实施例1

（1）红法夫酵母斜面培养：将红法夫酵母P406菌株接种于斜面培养基上培养，22℃培养3天；

（2）红法夫酵母种子培养：将步骤（1）获得的斜面菌种接种到种子培养基中培养；置于恒温振荡器中于200 r/min、22℃培养3天；

（3）枯草芽孢杆菌斜面培养：将枯草芽孢杆菌B24菌株接种于斜面培养基上培养，28℃培养2天；

（4）枯草芽孢杆菌种子培养：将步骤（3）获得的斜面菌种接种到种子培养基中培养；置于恒温振荡器中于200 r/min、28℃培养2天；

（5）协同固态发酵培养：将步骤(2)和步骤(4)培养好的种子液按1：5的配比接种到发酵基料中，在发酵初始pH为6.5，24℃条件下培养12天。

对比例1

（1）红法夫酵母斜面培养：将购买自菌种保藏中心的红法夫酵母菌株CGMCC2.1557接种于斜面培养基上培养，22℃培养3天；

（2）红法夫酵母种子培养：将步骤（1）获得的斜面菌种分别接种到种子培养基中培养；置于恒温振荡器中于200 r/min、22℃培养3天；

（3）枯草芽孢杆菌斜面培养：将枯草芽孢杆菌B24接种于斜面培养基上培养，28℃培养2天；

（4）枯草芽孢杆菌种子培养：将步骤（3）获得的斜面菌种接种到种子培养基中培养；置于恒温振荡器中于200 r/min、28℃培养2天；

（5）协同固态发酵培养：将步骤(2)和步骤(4)培养好的种子液按1：5的配比接种到发酵基料中，在发酵初始pH为6.5，24℃条件下培养12天得发酵饲料。

对比例2

（1）斜面培养：将红法夫酵母菌株P406接种于斜面培养基上培养，22℃培养3天；

（2）种子培养：将步骤（1）获得的斜面菌种接种到种子培养基中培养，置于恒温振荡器中于200 r/min、22℃培养3天；

（3）固态发酵培养：将培养好的种子液以1.5×10⁹CFU/kg的接种量接种到固态发酵培养基中，在pH为6.5，24℃条件下培养12天得发酵饲料。

发酵结束后，分别对上述实施例1以及对比例1和对比例2的发酵饲料样品中虾青素含量进行测定，实施例1所述红法夫酵母菌株P406和枯草芽孢杆菌B24协同发酵饲料中的虾青素含量与对比例2所述红法夫酵母菌株P406单独固态发酵饲料中的虾青素含量相差不多，分别为17.08mg/kg和17.19 mg/kg；而对比例1所述红法夫酵母菌株CGMCC2.1557和枯草芽孢杆菌B24协同发酵饲料中的虾青素含量仅为0.78±0.29 mg/kg。

实施例2

进一步对蛋鸡对实施例1和对比例2所述发酵饲料以及普通虾青素添加剂的消化吸收情况进行检测。

选取体质健康、体重和产蛋率相似的40周龄蛋鸡150只，随机分为4个组，每组5个重复，每个重复10只鸡。对4个组做如下处理：

对照组（Ⅰ）：饲喂基础日粮；

试验组（Ⅱ）：在基础日粮中添加虾青素添加剂（虾青素添加剂经液态发酵提取，购自济南德闻化工有限公司）至日粮中虾青素含量与30%实施例1发酵饲料中的虾青素含量相同；

试验组（Ⅲ）：饲喂基础日粮+30%对比例2发酵饲料；

试验组（Ⅳ）：饲喂基础日粮+30%实施例1发酵饲料。

经过4周饲喂后，从每组随机选取20枚鸡蛋，测定蛋黄中的虾青素含量（表1）。

表1 蛋黄中的虾青素含量

可以看出，即使实施例1红法夫酵母菌株P406和枯草芽孢杆菌B24协同发酵饲料中的虾青素含量与对比例2红法夫酵母菌株P406单独固态发酵饲料中的虾青素含量相差不多，但是蛋鸡对实施例1发酵饲料中虾青素的消化吸收要高于对对比例2发酵饲料中虾青素的消化吸收。

在蛋鸡摄取虾青素含量相同的条件下，最终蛋鸡对实施例1发酵饲料中虾青素的消化吸收也要高于虾青素添加剂。

实施例3

进一步对红法夫酵母菌株P406固态发酵饲料以及红法夫酵母菌株P406和枯草芽孢杆菌B24协同发酵饲料进行相关指标测定(表2)，与红法夫酵母发酵饲料相比，协同发酵饲料中的酸溶蛋白/粗蛋白含量提高，差异极显著（P<0.01）；肽含量、可溶性多糖含量均有所提高，差异显著；有机酸中乙酸、己酸、乳酸含量均有显著提升。协同发酵饲料中的大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白大部分发生降解，相比红法夫酵母发酵饲料，差异显著（P<0.05）；玉米赤霉烯酮含量有一定降低。

表2 相关指标测定结果

注：同行肩标不同小写字母表示差异显著（P＜0.05），肩标不同大写字母表示差异极显著（P＜0.01）；“-”表示检测结果为阴性，“+”表示检测结果为阳性。

实施例4 蛋鸡饲喂试验

选取体质健康、体重和产蛋率相似的40周龄蛋鸡100只，随机分为2个组，每组5个重复，每个重复10只鸡。对2个组做如下处理：基础日粮+30%红法夫酵母发酵饲料组和基础日粮+30%协同发酵饲料组。预试期1周，饲喂基础日粮。正试期6周。对蛋鸡进行生产性能检测和蛋品质检测。

蛋鸡生产性能检测：以组为单位计算产蛋率、平均日采食量和料蛋比。

蛋品质检测：试验结束(6周)时分别从每重复选取接近平均蛋重的鸡蛋3枚，用于测定蛋黄颜色和哈氏单位。

试验期结束时进行翅静脉采血，每只鸡采血5mL。随后静置采血管,待血清自然析出，并做好标号，分别采用试剂盒测定谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Pxg)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶（CAT）、 血清总抗氧化能力 （T-AOC）、 丙二醛（MDA）含量等血清抗氧化能力。

由表3可以看出，饲喂6周后，基础日粮+30%协同发酵饲料组相对于基础日粮+30%红法夫酵母发酵饲料组，产蛋率有一定提高；日均采食量和料蛋比差异不大；而哈氏单位和蛋黄色度值均有所提高。

表3 蛋鸡生产性能和蛋品品质

与基础日粮+30%红法夫酵母发酵饲料组相比，饲喂基础日粮+30%协同发酵饲料组蛋鸡抗氧化水平均有不同程度提高（表4），蛋鸡血清中T-AOC 、CAT、 SOD、GSH-PX含量分别提高12.07、12.05%、10.79%、7.28%，MDA含量降低6.27%。

表4 血清抗氧化能力

上述实验表明，经过枯草芽孢杆菌和红法夫酵母协同发酵的饲料，在饲料品质和蛋鸡饲喂中均表现出更优的效果。在基础饲料中添加一定比例的协同发酵饲料，相比于添加红法夫酵母发酵饲料，可进一步提高蛋鸡产蛋率，增加蛋黄色度及哈氏单位。同时，还可提高蛋鸡的抗氧化能力。

Claims (9)

1.一种红法夫酵母与枯草芽孢杆菌协同发酵家禽配合饲料的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）红法夫酵母斜面培养：将红法夫酵母菌株接种于斜面培养基上培养；

（2）红法夫酵母种子培养：将步骤（1）获得的斜面菌种接种到种子培养基中培养；

（3）枯草芽孢杆菌斜面培养：将枯草芽孢杆菌菌株接种于斜面培养基上培养；

（4）枯草芽孢杆菌种子培养：将步骤（3）获得的斜面菌种接种到种子培养基中培养；

（5）协同固态发酵培养：将步骤(2)和步骤(4)培养好的种子液按1：(1-10)的配比接种到发酵基料中，在发酵初始pH 6.2-6.6，20-26℃条件下培养6-12天。

2.如权利要求1所述的一种红法夫酵母与枯草芽孢杆菌协同发酵家禽配合饲料的方法，其特征在于，所述红法夫酵母斜面培养基为PDA培养基，以1L计含有以下组分：6g 马铃薯浸出粉，20g 葡萄糖，20g 琼脂；所述红法夫酵母斜面培养条件为22-26℃培养3-4天。

3.如权利要求1所述的一种红法夫酵母与枯草芽孢杆菌协同发酵家禽配合饲料的方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌斜面培养基为NA培养基，以1L计含有以下组分：3.0g 牛肉膏，10.0g 蛋白胨，5.0g NaCl，20.0g 琼脂，pH 7.2-7.4；所述枯草芽孢杆菌斜面培养条件为28-30℃培养2-3天。

4.如权利要求1所述的一种红法夫酵母与枯草芽孢杆菌协同发酵家禽配合饲料的方法，其特征在于，所述红法夫酵母种子培养基为YM培养基，以1L计含有以下组分：10.0 g 葡萄糖，5.0g 蛋白胨，3.0g 酵母膏，3.0g 麦芽浸提物；所述红法夫酵母种子培养的条件为在22-26℃，180-220 r/min条件下培养3-4天。

5.如权利要求1所述的一种红法夫酵母与枯草芽孢杆菌协同发酵家禽配合饲料的方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌种子培养基为NB培养基，以1L计含有以下组分：3.0g 牛肉膏，10.0g 蛋白胨，5.0g NaCl，pH 7.2-7.4；所述枯草芽孢杆菌种子培养的条件为在28-30℃，180-200 r/min条件下培养2-3天。

6.如权利要求1所述的一种红法夫酵母与枯草芽孢杆菌协同发酵家禽配合饲料的方法，其特征在于，所述发酵基料按质量百分比由以下的组分构成：玉米粉60%，豆粕25%，麸皮15%。

7.如权利要求1所述的一种利红法夫酵母与枯草芽孢杆菌协同发酵家禽配合饲料的方法，其特征在于，所述红法夫酵母种子液和枯草芽孢杆菌种子液以1：5的配比接种到发酵基料中，在pH为6.5，24℃条件下培养12天。

8.如权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于，所述红法夫酵母为红法夫酵母（Phaffia rhodozyma）P406，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌名称（Bacillus subtilis）B24。

9.如权利要求1-7任一所述的方法制备的发酵饲料在制备生物饲料中的应用，其特征在于，发酵饲料占生物饲料的10%-30%。