CH622823A5 - Process for the preparation of antibiotics, namely mimosamycin and chlorcarcins A, B and C - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von neuen Antibiotika, nämlich Mimosamycin und Chlorcarcine A, B und C.

Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung von neuen Antibiotika, nämlich Mimosamycin, welchem antibakterielle Eigenschaften gegen grampositive Bakterien und insbesondere gegen säurebeständigen Bakterien eigen ist, und von drei neuen Antibiotika, nämlich die Chlorcarcine A, B und C, und deren Säureadditionssalze, welche Antitumorwirkungen aufweisen. Dieses Verfahren besteht darin, dass man Streptomyces lavendulae Stamm Nr. 314 (NRRL 11002) züchtet, aus einer Kulturbrühe ein Komplex der Chlorcarcine und Mimosamycin gewinnt und aus diesem Komplex von Chlorcarcinen Mimosamycin und die Chlorcarcine A, B und C isoliert.

Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung von Mimosamycin, welches darin besteht, dass man Streptomyces lavendulae Stamm Nr. 314 züchtet und aus der Kulturbrühe Mimosamycin gewinnt, sowie auf ein Verfahren für die Herstellung der Chlorcarcine A, B und C und von Säureadditionssalzen davon, welches darin besteht, dass man Streptomyces lavendulae Stamm Nr. 314 züchtet, ein Komplex der Chlorcarcine aus einer Kulturbrühe gewinnt und hierauf aus diesem Komplex der Chlorcarcine die Chlorcarcine

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A, B und C isoliert.

Die Isolierung von ungefähr 2000 verschiedenen Arten von antibiotischen Substanzen wurde bisher geoffenbart, wobei es immer schwieriger wurde, eine neue antibiotische Substanz zu finden. Da die üblichen Antibiotika gegen gewisse Mikroorganismen resistent sind, ist es m vermehrtem Ausmass erforderlich, zu einer neuen antibiotischen Substanz zu gelangen. Auch das Auftreten von neuen infektiösen Erkrankungen, welche durch eine allgemeine Anwendung von Antibiotika mit breitem antibakteriellem Spektrum, von Steroidhormonen, von Antitu-mormitteln oder Antiimmunsubstanzen auftreten, erheischt die Entwicklung bzw. die Erforschung von neuen antibiotischen Substanzen.

Es wurden nun Forschungen für ein neues Verfahren für eine bedeutende Herstellungsmethode von antibiotischen Substanzen durchgeführt, welche durch Verbesserung der Züchtungsbedingungen mit Hilfe eines bekannten, antibiotische Substanzen erzeugenden Mikroorganismen erhalten werden. Aufgrund dieser Forschungen wurde festgestellt, dass ein das bekannte Antibiotikum Streptothricin zu erzeugen vermögender Streptomyces lavendulae Microorganismus auch zu neuen und wertvollen antibiotischen Substanzen, nämlich Chlorcarcine A, B und C und Mimosamycin führen, wobei man ferner festgestellt hat, dass Streptomyces lavendulae Stamm Nr. 314 hohe Wirkungseinheiten dieser neuen antibiotischen Substanzen zu erzeugen vermögen.

Ziel der vorliegenden Erfindung ist daher die Schaffung eines Verfahrens zur Herstellung der besagten neuen Antibiotika, nämlich Mimosamycin und der Chlorcarcine A, B und C, welche hervorragende biologische Eigenschaften aufweisen.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf ein Verfahren für die fermentative Erzeugung dieser neuen Antibiotika.

Streptomyces lavendulae Stamm Nr. 314 lässt sich aus einer Bodenprobe isolieren, welche man bei Kyoto findet und zur Gattung Streptomyces gehört. Dieser Stamm ist unter der Nr. 3218 bei Technical Research Institute of Microbial Indu-stry, Agency of Industriai Science & Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan, und auch unter der Nummer NRRL-11002 im Northern Regional Research Laboratori Northern Central Region, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois, USA, zugänglich. Er wurde hierin am 10. August 1976 hinterlegt.

Die Beobachtung des Luftmycels und der Sporen von Streptomyces lavendulae Stamm Nr. 314 wird durch Züchtung des Stammes auf Medien gemäss Angaben von International Streptomyces Project (ISP) (Shirling. E.B. & D. Gottlieb; International J. Systematic Bacteriol. 16,313-340,1966) durchgeführt. Dies geschieht, indem man auf Agarplatten ein Hefe-Stärke-Agarmedium, ein anorganische Salze und Stärke enthaltendes Agarmedium und/oder ein Maltose enthaltendes basales Medium unter Verwendung eines eine Kohlenstoffquelle verwendenden Musters (Pridham-Gottlieb-Agar-Medium) während 1 bis 2 Wochen bei 27 °C züchtet. Die Farben des Mycels mit reifen Sporen, das vegetative Mycel und so weiter wurden nach der in «Descriptive Color Name Dictionary», Container's Corporation of America, 1950, und «Color Harmony Manual», Container Corporation of America, 1958, beschriebenen Farbskala bestimmt.

Der Stamm Nr. 314 entwickelt ein wellenförmiges, faltiges Luftmycel, welches lange Verzweigungen mit einem Durch622823

messer von ungefähr 0,6 bis 1,0 n aufweist und manche zylindrische Sporen zeigt. Die Sporen haben eine Grösse von 0,6 bis 1,0 u*0,8 bis 2,0 (j,. Gemäss Standardangaben in ISP darf man annehmen, dass der den obgenannten morphologischen Eigenschaften entsprechende Stamm der Untergruppe Rectiflexibi-les angehört. Indessen besitzen die Lufthyphen Ösen oder unvollständige oder verlängerte Spiralen mit 1 bis 2 Windungen. Daher wird der Stamm Nr. 314 morphologisch als zur Untergruppe Retinaculiaperti gehörend definiert. Wird die Sporenoberfläche auf diesen Medien unter dem Elektronenmikroskop beobachtet, so stellt man fest, dass die Sporen dieses Stammes eine glatte Oberfläche aufweisen. Der Stamm Nr. 314 besitzt besondere Eigenschaften insofern, als die Lufthyphen morphologisch der Untergruppe Retinaculiaperti zuzuschreiben sind, die Farbe der Lufthyphen mit reifen Sporen auf verschiedenen Medien rosa- bis lavendelfarben ist, die Farbe des vegetativen Mycels auf einem synthetischen Medium hin und wieder blau bis bläulichbraun ist und die Erzeugung von Melaninpigment positiv verläuft. Bei der Erforschung von Stämmen der Gattung Streptomyces, welche in «The Actinomycetes», S.A. Waksman, Band 2,1959 und «Bergey's Determinative Bac-teriology», 8. Ausgabe, 1974, beschrieben sind, darf vermutet werden, dass dieser Stamm eine starke Ähnlichkeit zu Streptomyces lavendulae hat. Der Stamm Nr. 314 wird in einem für die Herstellung einer antibiotischen Substanz üblichen Medium geimpft und das Kulturmedium während einer Züchtungsperiode von 18 bis 72 Stunden bei 27 °C geschüttelt, um zu einem Kulturfiltrat zu gelangen, welches gegen coliforme Bazillen eine hohe Wirksamkeit aufweist. Das so erhaltene Filtrat wird hierauf mit Aktivkohle unter alkalischen Bedingungen behandelt, mit mit einer Säure angesäuertem Aceton eluiert oder über einem schwachen Kationenaustauschharz, z. B. Amberlite IRC-50 (Warenzeichen der Firma Rohm & Haas Co., USA) adsorbiert und mittels 0,ln-Salzsäure einer Desorption unterworfen, um zu einer gegen coliforme Bazillen antiakteriellen Substanz zu gelangen. Hierauf wird die so erhaltene Substanz durch Chromatographie über beispielsweise Amberlite CG-50 (Warenzeichen der Firma Rohm & Haas Co.) gereinigt und in Form des entsprechenden Reinecke-Salzes oder in Form des Pikrats zum Auskristallisieren gebracht, worauf man diese Substanz als Streptothricin identifiziert.

Ferner wurden unter Verwendung von Streptomyces lavendulae IFM 1031, welches ein Streptothricin erzeugender Stamm ist, von Streptomyces racemochromogenes IFM 1081, welches mit Streptomyces lavendulae identisch zu sein scheint und Streptothricin zu erzeugen vermag und zur letztendlichen Identifikation unter Verwendung des gemäss vorliegender Erfindung in Frage kommenden Stammes Vergleiche mit den Züchtungseigenschaften und den physiologischen Eigenschaften durchgeführt. Die Resultate finden sich in den Tabellen 1,2 und 3. Dabei wurde spezifisch festgestellt, dass der Stamm Nr. 314 mit Streptomyces lavendulae bezüglich jeglicher charakteristischer Eigenschaften identisch ist, die man gegenwärtig für die Identifizierung des Stammes in der Gattung Streptomyces anwendet, obgleich in gewisser Hinsicht, beispielsweise bezüglich der Verwertung von L-Arabinose usw., geringfügige Unterschiede festgestellt worden sind. Aufgrund dieser Feststellungen wurde dieser Stamm als Streptomyces lavendulae identifiziert. Streptomyces racemochromogenes kann ebenfalls Streptothricin erzeugen, doch ist dieser Stamm offensichtlich aufgrund der oben erwähnten Vergleichsresultate verschieden, verglichen mit dem Stamm Nr. 314.

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Tabelle I

Vergleich des Streptomyces-Stammes Nr. 314 mit bekannten Stämmen

Medium

Stamm Nr. 314

S. lavendulae IFM 1031

S. racemochromogenes IFM 1081

Saccharose-

VM

reichlich, sich ausbrei reichlich, sich ausbrei

«faint brown» bis

Nitrat-

tend, «light olive»

tend, farblos bis «faint

«purple brown» (11 nl)

Agar

(1 Vi ie)*

brown»

(Czapek-

AM

reichlich, «white» bis reichlich, «white» bis reichlich, «ivory»

Medium)

«ivory» (2 db) mit

«ivory» (2 db) mit

(2 de) bis «gray»

Lavendelfarbton

Lavendelfarbton (5 ge bis

(5 de)

(5 ge-4 ig)

4 ig)

SP

keines bis «faint brown»

«faint brown»

«faint brown»

Glucose-

VM

reichlich, sich ausbrei reichlich, sich ausbrei reichlich, sich aus

Asparagin-

tend, farblos bis «light tend, «grayish blue»

breitend «brown» bis

Agar

olive» (l'Aie)

(10 pn)

«blue» (10 pn)

AM

reichlich, «grayish reichlich, «white» spä

reichlich, «reddish

pink» (5 ec) mit lavendel-

ter in «reddish gray»

gray» mit Lavendel

farbton (5 ge-4 ig)

mit Lavendelfarbton (5 ge) übergehend farbton (5 ge)

SP

keines bis «faint brown»

keines bis «faint brown»

keines bis «faint brown»

Glycerin-

VM

reichlich, sich ausbrei reichlich, sich ausbrei dunkeloliv (lVipn)

Asparagin-

tend, farblos tend, dunkeloliv

Agar

(l'/2 pn)

AM

mässig, «faint brownish mässig, «faint brownish mässig, «silver gray»

gray» (2 fe) bis «silver gray (2 fe) bis «silver

(3fe)

gray (3 fe)

gray (3 fe)

(ISP)

SP

keines hellbraun

«faint olive brown»

Tyrosin-Agar

VM

reichlich, sich ausbrei reichlich, sich ausbrei reichlich, sich aus

tend, «faint brown» bis tend, «faint brown» bis breitend, «mustard

«mustard brown» (2 ni)

«mustard brown» (2 ni)

brown» (2 ni)

AM

reichlich, «reddish abundant, reddish reichlich, «reddish

gray» (7 ge) mit La

«gray» (7 ge) mit gray» (7 ge)

vendelfarbton (5 ge bis

Lavendelfarbton

4 ig)

5 ge-4 ig)

SP

keines bis «faint brown»

keines bis «faint brown»

keines bis «faint brown»

Calciumhy-

VM

reichlich, sich ausbrei reichlich, sich ausbrei reichlich, sich ausbrei droxy-

succinat-Agar

tend, «faint brown»

tend, «bluish brown»

tend, «bluish brown»

bis «dark olive» (1 ni)

(3pn)

(3pn)

AM

mässig, dünn, pulverig, «white» in «shell tint» (3 ba) übergehend keines keines

SP

keines bis «faint brown»

«faint olive brown»

«faint olive brown»

anorganische

VM

mässig, farblos mässig, farblos bis

«dark olive» (2 po)

Salze und Stärke enthaltendes Agar

(ISP) Nähragar

AM

SP VM

AM SP

reichlich, sich ausbreitend, «yellowish gray» (3 de)

keines reichlich, sich ausbreitend, glitzernde Oberfläche, «camel» (3 ie) keines «brown»

«black olive» (2 pn)

reichlich, sich ausbreitend, «yellowish gray» (3 de)

keines reichlich, sich ausbreitend, glitzernde Oberfläche, «camel» (3 ie) keines «brown»

reichlich, «gray» (3 de), «bluish gray» (13 ee)

«faint brown» reichlich, sich ausbreitend, glitzernde Oberfläche, «camel» (3 ie) keines

«faint brown»

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Medium Stamm Nr. 314 S. lavendulae S. racemochromogenes

IFM 1031 IFM 1081

Hefeextrakt

VM

reichlich, sich ausbrei reichlich, sich ausbrei faltig, «faint brown»

Malzextrakt-

tend, stark gefalzt,

tend, farblos bis

Agar

farblos bis «faint brown»

«faint brown»

AM

reichlich, «grayish reichlich, «grayish reichlich, «reddish

pink» (5 ec) mit Laven pink» (5 ec) mit Laven gray» (5 ge)

delfarbton (5 ge-4 ig)

delfarbton (5 ge-4 ig)

(ISP)

SP

«oak brown» (4 pi)

«oak brown» (4 pi)

«dark brown» (4 pi)

Hafermehl-

VM

mässig, farblos mässig, «dusty blue»

«bluish brown» (15 ni)

Agar

(15 ni)

AM

mässig, «grayish pink»

mässig, «rose wood» mit mässig, «rose wood»

(5 ec) mit Lavendel

Lavendelfarbton

(3 ca)

farbton (5 ge-4 ig)

(5 ge-4 ig)

(ISP)

SP

keines keines bis «bluish brown»

keines bis «faint brown»

Ei-Medium

VM

sich ausbreitend, stark sich ausbreitend, stark stark faltig

faltig, «chocolaté

faltig, -chocolaté

«chocolaté» (4 pl)

brown» (4 pn)

brown» (5 pn)

AM

keines keines wenig bis keines

SP

«faint brown» bis

«faint brown» bis

«chocolaté»

«chocolaté brown»

«chocolaté brown»

(4 pl)

(4 pl)

VM: vegetatives Mycel; AM: Luftmycel; SP: lösliches Pigment * «Color Harmony manual code»

Tabelle 2 Tabelle 3

Vergleich der physiologischen Eigenschaften von Vergleich eines Kohlenstoffquellen verwertenden Musters von

Streptomyces Stamm Nr. 314 und bekannten Stämmen «° Streptomyces lavendulae Stamm Nr. 314 und von bekannten

Stämmen

Physiologische Stamm S. lavendulae S. racemo- Kohlenstoffquelle Stamm S. lavendulae S.racemo-

Eigenschaft Nr. 314 IFM 1031 chromogenes 45 Nr. 314 IFM 1031 chromogenes

IFM 1081 IFM 1081

Nitrat

D-Xylose*

-

±

-

reduktion

L-Arabinose*

+

-

-

(14 Tage)

+

+

+

so L-Rhamnose*

-

-

-

Verflüssigung

D-Glucose*

+

+

+

von Gelatine

D-Fructose*

±

±

-

(18 °C,

Saccharose*

+

+

+

21 Tage)

+

+

+

Lactose

-

-

+

lösliches Pigment braun braun braun

55 Maltose

+

+

+

Hydrolyse von Cellulose

-

Raffinose* Mannitol*

_

_

(21 Tage)

-

-

i-Inositol*

-

-

-

Lackmusmilch

Natriumacetat

+

+

+

Koagulation

+ +

+ +

+ +

60 Natriumeitrat

+

+

+

Peptonisierung

+ +

+ +

+ +

Natriumsuccinat

+

+

+

pH

8,0

7,8

7,8

Blindversuch

-

-

-

Melanin

bildung

+

+

+

ss * in ISP beschriebene Kohlenstoffquelle

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Die Chlorcarcinkomplexverbindung und das Mimosamy- zur Trockne eingeengt, das Konzentrat in wenig Äthylacetat ein, welche erfindungsgemäss erhalten werden, sind bisher gelöst, die Lösung nacheinander mit einer wässrigen Natrium-

noch nicht aus einer Kulturbrühe der obgenannten, bestens hydrogencarbonatlösung, Natriumcarbonatlösung und bekannten Mikroorganismen, welche zu Streptomyces laven- schliesslich Natriumhydroxydlösung geschüttelt und abge-

dulae gehören, isoliert worden. 5 trennt, worauf die sauren Substanzen in die wässrige Phase

Erfindungsgemäss erhält man die Chlorcarcinkomplexver- übergeführt werden. Die Lösungsmittelphase wird mit ln-Salz-

bindung und das Mimosamycin durch Züchtung von Strepto- säure extrahiert, mit einer wässrigen Ammoniaklösung auf myces lavendulae Stamm Nr. 314. einen pH-Wert von 9 bis 10 eingestellt und mit Chloroform

Die Züchtung kann zur Hauptsache nach an sich für die extrahiert. Dieser Arbeitsvorgang wird mehrere Male wiederZüchtung von Mikroorganismen bekannten Methoden gesche- 10 holt, worauf man die Lösungsmittelphase unter vermindertem hen, wobei man aber gewöhnlich zu submersen Kulturen in Druck zur Trockne einengt, um auf diese Weise eine rohe basi-einem flüssigen Medium greift. Als erfindungsgemäss verwend- sehe Komponente, welche den Chlorcarcinkomplex und Mimo-bares Medium kann man ein beliebiges Nährmittel enthalten- samyein enthält, zu gewinnen. Diese Komponente wird über des Medium verwenden, welches den StammNr. 314 der Gat- Kieselgel mit einer Mischung von Benzol und Äthylacetat der tung Streptomyces verwerten kann. Insbesondere lassen sich 15 Säulenchromatographie unterworfen, wobei man zu einer synthetische, semisynthetische oder natürliche Medien verwen- Fraktion gelangt, welche zur Hauptsache Chlorcarcin A und den, wobei man als Beispiele von Mediumkomponenten Koh- nach dem Entwickeln mit Äthylacetat eine Fraktion, welche lenstoffquellen, wie z. B. Glucose, Maltose, Fructose, Xylose, vorwiegend Mimosamycin enthält, liefert. Diese Fraktionen Stärke, Glycerin usw., als Stickstoffquellen beispielsweise werden mehrere Male durch Kieselgelchromatographie gerei-Fleischextrakte, Pepton, Glutenmehl, Baumwollsamenöl, Soja- 20 nigt, wobei man zum Chlorcarcin A und Mimosamycin in Form bohnenmehl, Maisquellflüssigkeit, trockene Hefe, Hefeextrakt, eines gelben Sirups bzw. gelben Kristallen gelangt. Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Harnstoff und andere Die zuvor eluierte Chromatographiesäule wird hierauf mit organische oder anorganische Stickstoffquellen, nennen kann. einer Mischung von Äthylacetat und Aceton eluiert, wobei man Zusätzlich kann man dem Medium Carbonate, Phosphate oder zu einer Fraktion gelangt, welche zur Hauptsache die Chlorcar-andere Metallsalze zusetzen. Sofern bei der Züchtung ein über- 25 cine B und C enthält, worauf man die Fraktion zur Trockne ein-mässiges Schäumen auftreten sollte, ist es üblich und vorteil- engt und das Konzentrat, nämlich eine Mischung der Chlorcar-haft, dem Medium ein Antischäummittel, z. B. ein vegetabili- cine B und C, nochmals einer Kieselgelchromatographie unter-sches öl, wie Sojabohnenöl, Silikonöl, polyoxyalkylenartige wirft, um auf diese Weise das Chlorcarcin B und das Chlorcar-Mittel, Mineralöle usw., zuzusetzen. ein C als gelbe Pulver zu erhalten.

Die Züchtungstemperatur liegt im allgemeinen in einem 30

Bereiche von ungefähr 27 bis 30 °C. Da das Volumen des Medi- Mimosamycin ums zunimmt, ist es vorteilhaft, eine Samenkultur zu verwen- Rohes Mimosamycin wird aus einer Mischung von Äthyladen und hierauf diese Samenkultur zur Beimpfung einem cetat und Äthyläther umkristallisiert, um zu reinen gelben Kri-Medium zuzugeben. Die Züchtungsperiode dauert gewöhnlich stallen zu gelangen.

ungefähr 18 Stunden bis ungefähr 24 Stunden. 35 Die nach der Extraktion mit ln-Salzsäure erhaltene Äthyla-

Je nachdem für die Herstellung der erfindungsgemäss cetatschicht wird zur Trockne eingeengt und der Rückstand in erhältlichen Antibiotika verwendeten Mikroorganismus wird einer geeigneten Methanolmenge gelöst. Zu dieser Lösung gibt man die Kulturbedingungen festlegen. man in ausreichender Menge Wasser hinzu, um einen Wasser-

Die auf diese Weise in Kulturbrühe angereicherten, antibio- gehalt von 10 Volumen-% zu erhalten. Dann wird die wässrige tischen Substanzen finden sich gewöhnlich innerhalb der 40 Lösung mit n-Hexan extrahiert, um die Verunreinigungen einer

Mycelien und der Kulturflüssigkeit und werden aus den durch niedrigeren Polarität zu entfernen. Der Extrakt wird hierauf

Zentrifugieren oder Filtrieren gesammelten Mycelien extra- zur Trockne eingeengt und der Rückstand in Äthylacetat hiert und das Filtrat gewonnen. So lassen sich die erfindungsge- gelöst. Die so erhaltene Lösung wird nacheinander mit ln-Salz-

mäss erhältlichen antibiotischen Substanzen durch an sich säure und ln-Natriumhydroxydlösung gewaschen und hierauf

üblicherweise für die Herstellung eines natürlichen Produktes 45 zur Trockne eingeengt, wobei man zu einem Rückstand verwendeten Massnahmen gewinnen und reinigen, beispiels- gelangt, welcher die rohen neutralen Komponenten enthält,

weise indem man sich die Löslichkeit und die Löslichkeitsunter- Das Mimosamycin wird ebenfalls isoliert und in der oben schiede in geeigneten Lösungsmitteln, die Trennbarkeit und beschriebenen Weise von den Komponenten gereinigt, den Unterschied in einem verschieden schnell verlaufenden

Ablauf aus einer Lösung, den Unterschied in der Absorptions- 50 A. Physikochemische Eigenschaften von Mimosamycin möglichkeit und in der Affinität auf verschiedenen Absorp- 1. Farbe und Zustand: gelbe Prismen tionsmitteln, den Unterschied der Verteilung zwischen zwei 2. Schmelzpunkt 227 bis 231 °C

flüssigen Phasen usw., zu Nutze macht. Diese Massnahmen las- 3. Elementaranalyse:

sen sich gewünschtenfalls allein oder gegebenenfalls unter ge- C = 61,51%, H = 4,79%, N = 5,87%

eigneten Kombinationen oder wiederholt durchführen. Eine 55 4. Molekulargewicht (Massenspektrum): 233

geeignete Methode wird nachstehend näher erläutert. 5. Empirische Formel: C12H11NO4

Nach beendeter Züchtung wird die Kulturbrühe filtriert, 6. Ultraviolettabsorptionsspektrum (gemäss Fig. 1):

um die Mycelien vom Filtrat abzutrennen. Das Filtrat wird UV A.N?ghano1 nm Q0g e). 230 (Schulter) (4,16), 317 (4,14), 396 (3,56)

durch Zugabe von 10n-Natriumhydroxyd auf einen pH-Wert UV A.^thano1 nm (log e): 277 (3,78), 370 (3,53)

von 8,0 eingestellt. Das Filtrat kann zur Erzielung einer besse- 6o 7. Infrarotabsorptionsspektrum (gemäss Fig. 2):

ren Extraktionswirkung mit einem Lösungsmittel zuvor auf die IR vgjgï enr1 :1685,1655,1635,1585 Hälfte oder einen Drittel des Volumens eingeengt werden. Bei 8. NMR-Spektrum (CDCb) (gemäss Fig. 3):

der oben erwähnten Lösungsmittelextraktion verbleiben die 5:2,10 (3H, s.), 3,69 (3H, s.), 4,20 (3H, s.), 7,12 (1H, s.), 8,28 (1H, s.)

basischen, wasserlöslichen Antibiotika, z. B. Streptothricin, 9. Rotationsdispersionsspektrum (C = 4,37 • 10~7, MeOH):

welche gleichzeitig mit dem Stamm Nr. 314 erzeugt werden, im 65 [0]20 (nm): -1601 (500), -1373 (490), -1373 (480), -1144 (470),

Filtrat zurück, während die Chlorcarcinkomplexverbindung, -1144 (460), -1144 (450-390), -1373 (380), -1144 (370-350),

das Mimosamycin usw. in die Lösungsphase übergehen. Die -1373 (340), -1831 (330), -2288 (320), -2288 (310), -1831 (300),

Lösungsmittelphase wird hierauf unter vermindertem Druck -1601 (290), -2059 (280), -2517 (270), -3661 (260), -5492 (250)

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10. Löslichkeit:

Leicht löslich in Methanol, Äthanol, Chlorform, Estern und Aceton; spärlich löslich in Äthyläther und n-Hexan; unlöslich in Wasser

11. Farbreaktion:

Ehrlichreaktion: positiv (orange)

Ninhydrin- und Dragendorff-Reaktion: negativ

Diese Substanz hat bis zu einem gewissen Ausmass biologische Eigenschaften gegen grampositiven Bakterien, ist aber gegenüber gramnegativen Bakterien und Fungi bei Konzentrationen von 50 (ig/ml nicht wirksam.

Die Substanz ist insbesondere wirksam gegen säurewiderstandsfähige Bakterien und gegen in Bezug auf Streptomycin stark resistenten Stämmen bei menschlichen Tuberkelbazillen und gegenüber normalen Stämmen von Tuberkelbazillen. Die minimalen Hemmkonzentrationen für Mycobacterium tuber-culosis werden nach 4wöchiger Inkubation bei 37 °C in einem Sauton-Medium bestimmt. Die Resultate finden sich in der folgenden Tabelle 4.

Tabelle 4

Antimikrobielle Wirkung von Mimosamycin gegen Tuberkelbazillen

Testorganismus

MIC (|ig/ml)

Mycobacterium tuberculosis

H37RV

1,56

Mycobacterium bovis Nr. 10

6,25

Mycobacterium tuberculosis SMR

1,56

Mycobacterium smegmatis

ATCC607

25,0

Bemerkungen:

Nährmedium, 37 °C, 48 Stunden für M. smegmatis. Flüssiges Sauton-Medium, 37 °C, 4 Wochen für andere drei Stämme. Die Stämme SMR und Matsudo sind widerstandsfähig gegen Streptomycin bei 1000 ng/ml und mehr.

Mäuse (18 bis 20 g) vertragen intravenöse Injektionen von 50 mg/kg Mimosamycin.

Die obigen physikochemischen und biologischen Eigenschaften lassen erkennen, dass die Substanz eine neue antibiotische Substanz ist, welche insbesondere gegen Tuberkelbazillen wirksam ist.

Mimosamycin kann für therapeutische Zwecke als antimi-krobielles oder antituberkuloses Mittel in Form von verschiedenen pharmazeutischen Präparaten, z. B. in Form von Tabletten, Pulvern, oralen Suspensionen, Sirupen, Kapseln, Lösungen oder Suspensionen für die Injektion usw., verwendet werden. Diese Präparate lassen sich leicht durch Verwendung des Antibiotikums in bekannter Weise herstellen. Das Antibiotikum Iässt sich oral oder parenteral und noch lieber intramuskulär oder intravenös verabreichen. Die zu verabreichende Dosierung schwankt je nach den gegebenen Bedingungen, hängt aber im allgemeinen vom Ausmass der Erkrankung, vom Alter und vom Körpergewicht des Patienten usw. ab. Im allgemeinen wird man bei Erwachsenen eine tägliche Dosierung im Bereiche von zwischen 200 mg und 2 g anwenden, wobei man dies in einem Schub oder in Form von verschiedenen Dosierungsmengen tun kann.

Chlorcarcine A, B und C

Die Chlorcarcine A, B und C sind basische, antibiotische Substanzen und können die entsprechenden Säureadditionssalze bilden. Typische Beispiele solcher Salze sind solche mit anorganischen oder organischen Säuren, wie z. B. Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Stearinsäure, Propionsäure, Weinsäure, Maleinsäure usw. Wie zu erwarten war, besitzen diese Arten von Salzen die gleiche antibiotische Wirkung wie die freien antibiotischen Substanzen, obgleich man gewisse Unterschiede im Wirkungsbereich und im Löslichkeitsbereich feststellen kann.

Die physikochemischen Eigenschaften der Chlorcarcine A, B und C finden sich nachstehend:

B. Physikochemische Eigenschaften von Chlorcarcin A

1. Farbe und Zustand: gelber Sirup (freie Base)

2. Schmelzpunkt: 140 bis 144 °C(HC1-Salz, Zersetzung)

3. Elementaranalyse (als HCl-Salz):

C = 45,74%; H = 4,73%; N = 6,94%; Cl = 16,14%

4. Molekulargewicht (Massenspektrum): 535

5. Empirische Formel: C24H26N309C1-2HCI- H2O

6. Spezifische Drehung:

[aï? = -4° (C = 1,0, Methanol)

7. Ultraviolettabsorptionsspektrum (gemäss Fig. 4, worin die ausgezogenen und die gestrichelten Linien die UV-Spektren in MeOH bzw. O.ln-HCl-MeOH zeigen)

UV >Ähano1 nm (log e) = 268 (3,83)

^Methanol nm (lQg e) = 238 (3,68)

^ain-HCl-MeOH nm (log £) = 263 (3,85)

^-mïnn HC' MeOH nm (log e) = 234 (3,68)

8. Infrarotabsorptionsspektrum (gemäss Fig. 5):

IRv£axCh cm-1:1685,1665,1610

9. NMR-Spektrum (CDCb) (gemäss Fig. 6):

8:1,23 (3H, s.)

I,95 (3H, s., J = 7 Hz)

2,26 (3H, d., J = 7 Hz)

4,05 (3H,s.)

6,70 (IN, s.)

10. Löslichkeit:

Leicht löslich in Äthyläther, Estern, Chloroform, Aceton, Alkoholen, 0,ln-HCl; spärlich löslich in n-Hexan und O.ln-NaOH; unlöslich in Wasser

II. Farbreaktion:

Dragendorffreaktion: positiv

Ninhydrin-, FeCb- und Anthronreaktion: negativ

C. Physikochemische Eigenschaften von Chlorcarcin B (freie Base)

1. Farbe und Zustand: gelbes Pulver

2. Schmelzpunkt: 78 bis 81 °C

3. Elementaranalyse:

C = 60,89%; H = 6,20%; N = 6,71%; Cl = 5,20%

4. Molekulargewicht (Massenspektrum): 553

5. Empirische Formel: C29Hî206N3C1* 5/4H2O

6. Ultraviolettabsorptionsspektrum (siehe Fig. 7), worin die ausgezogenen und die gestrichelten Linien die UV-Spektren in MeOH bzw. O.ln-HCl-MeOH wiedergeben)

UV ^hano1 nm (log e): 268,5 (4,25), 370 (3,38)

?Äthano1 nm (log e): 234 (3,99), 338 (3,34)

>^anx"HCI"Me0H nm (log e): 262 (4,18), 380 (3,34)

^ojn-HCi-MeOH nm (iog e). 23l (3,95), 354 (3,32)

7. Infrarotabsorptionsspektrum (gemäss Fig. 8):

IRv£gFJ cm-1:1715,1683,1655,1612

8. NMR-Spektrum (CDCb) (gemäss Fig. 9):

8:1,28 (3H, m.), 1,92 (3H, s.),

2,04 (3H,s.), 2,27 (3H,s.),

2,50 (3H,s.), 4,04 (3H,s.),

4,08 (3H,s.), 4,42 (lH,s.),

6,84 (1 H, d., J = 8 Hz)

9. Zirkulardichroismusspektrum:

(C = 8,63-10"5, Methanol): Ae(nm):

-2,45 (360) (negatives Maximum)

-0,352 (320) (positives Maximum)

-13,0 (2,78) (negatives Maximum)

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8

10. Löslichkeit:

Leicht löslich in niederen Alkoholen, Chloroform, Estern, Aceton, Benzol und Äthyläther; spärlich löslich in n-Hexan; unlöslich in Wasser

11. Farbreaktion:

Dragendorff- und Meyer-Reaktionen: positiv Ninhydrin- und Ehrlich-Reaktionen: negativ

D. Physikochemische Eigenschaften von Chlorcarcin C

1. Farbe und Zustand: gelbes Pulver

2. Schmelzpunkt: 79 bis 84 °C ' 3. Elementaranalyse:

C = 60,88%; H = 6,11%; N = 6,54%; Cl = 6,71% '4. Molekulargewicht (Massenspektrum): 567

5. Empirische Formel: C3oH3406N3C1« 3/2H2O

6. Ultraviolettabsorptionsspektrum (gemäss Fig. 10, worin die ausgezogenen und gestrichelten Linien die UV-Spektren in MeOH bzw. O.ln-HCl-MeOH wiedergeben)

UV >Ähano1 nm (log e): 268 (4,26), 368 (3,34)

^Methanol nm (lQg 8): 231 (3,91)

^n-HCi-MeOH nm (log e): 262,5 (4,22), 380 (3,40)

^Mn-HCi-MeOH nm (log e); 228,5 (3,87), 351 (3,36)

7. Infrarotabsorptionsspektrum (gemäss Fig. 11):

IRv£Sp cm-1:1718,1683,1655,1618

8. NMR-Spektrum (Fig. 12):

8:1,42 (3H,s.), 2,01 (3H,s.),

2,15 (3H,s.), 2,35 (3H,s.),

2,59 (3H,s.), 3,59 (3H,s.),

4,05 (3H,s.), 4,07 (3H,s.),

6,71 (lH,d.,j = 8Hz)

9. Zirkulardichroismusspektrum:

(C = 9,38xl0"5, Methanol); Ae(nm):

-3,88 (360) (negatives Maximum)

-2,26 (310) (positives Maximum)

-24,5 (273) (negatives Maximum)

10. Löslichkeit:

Leicht löslich in niederen Alkoholen, Chloroform, Estern, Aceton, Benzol und Äthyläther; spärlich löslich in n-Hexan; unlöslich in Wasser

11. Farbreaktion:

Dragendorff-und Meyer-Reaktionen: positiv Ninhydrin- und Ehrlich-Reaktionen: negativ

Die Chlorcarcine A, B und C besitzen eine antibakterielle Wirkung und eine Antitumorwirkung und sind auch verwendbar als Arzneimittel. Die antimikrobiellen Spektren von Chlorcarcin A, Chlorcarcin B und Chlorcarcin C finden sich in Tabelle 5, worin die Antibiotika zur Hauptsache eine antibakterielle Wirkung gegen grampositive Bakterien zeigen, aber gegen die meisten gramnegativen Bakterien eine geringe antibakterielle Wirkung ausüben. Die Chlorcarcine A, B und C besitzen cytostatische Wirkungen gegen L 1210-Leukämie bei Mäusen, wobei sie eine 100%ige Zellentötung in einer Suspensionskultur von 0,05 (ig/ml, 10 jig/ml bzw. 10 ng/ml bewirken.

Tabelle 5

Antimikrobielle Spektren der Chlorcarcine A, B und C

Testorganismus Chlorcarcin Chlorcarcin Chlorcarcin

ABC

Staphylococcus aureus 209 P

0,1

12,5

12,5

Staphylococcus

aureus Smith

0,02

12,5

12,5

Staphylococcus

albus

0,1

50

50

Staphylococcus

citreus

0,1

25

25

Testorganismus

Chlorcarcin

. Chlorcarcin

Chlore

A

B

C

Streptococcus

hemolyticus

Coock

6,25

6,25

6,25

Streptococcus

hemolyticus

090R

50

100

100

Streptococcus

salivarius

6,25

50

50

Streptococcus

faecalis

25

>100

>100

Bacillus

substilis PCI 219

0,2

25

25

Bacillus

cereus

50

50

50

Corynebacterium

diphtheriae

0,003

0,05

0,05

Corynebacterium

xerosis

0,003

0,39

0,39

Lactobacillus

arabinosus

12,5

50

50

Nocardia

asteoides

25

50

50

Mycobacterium

smegmatis

ATCC607

100

>100

>100

Mycobacterium

phlei

100

>100

>100

Mycobacterium

avium

100

>100

>100

Escherichia

coli

>100

>100

>100

Shigella

dysenteriae

>100

>100

>100

Salmonella

typhimurium

>100

>100

>100

Klebsiella

pneumoniae

100

50

50

Serratia

marcescens

>100

>100

>100

Pseudomonas

aeruginosa

>100

>100

>100

Brucella

abortus

>100

>100

>100

Candida

albicans

>100

>100

>100

Saccharomyces

cerevisiae

>100

>100

>100

Tolura rubra

>100

>100

>100

Pénicillium

glaucum

>100

>100

>100

Aspergillus

-

niger

>100

>100

>100

Aspergillus

oryzae

>100

>100

>100

Mucormucedo

>100

>100

>100

Trichophyton

mentagrophytes

100

>100

>100

Medium- und Züchtungsbedingungen:

l%iges Glucosenähragar (3% Glycerinnähragar für säurewiderstandsfähige Bakterien, Blutagar für Streptococcus hae-molyticus und Brucella abortus) 37 °C, 24 oder 48 Stunden.

Sabouraud-Dextrose-Agar für Fungi, 27 °C, 48 Stunden (72 Stunden für Trichophyton mentagrophytes).

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Die Chlorcarcine A, B und C sind bei Mäusen mit einem durchschnittlichen Körpergewicht von 18 bis 20 g bei intravenöser Verabreichung bei 25 mg/kg (A) und 250 mg/kg (B bzw. C) relativ wenig toxisch und verträglich.

Das Chlorcarcin A wurde in Bezug auf die Antitumorwir-kung durch intraperitoneale Verabreichung unter Verwendung eines Ehrlich-Karzinoms getestet. Bei sämtlichen Mäusen konnte bei Verabreichung von 80 (ig/Maus während 1 Woche eine verlängerte Lebensdauer von 30 Tagen oder mehr festgestellt werden, während bei täglichen Dosierungen von nur 60 (ig/Maus während 1 Woche bei 60% der Mäuse eine verlängerte Lebensdauer beobachtet werden konnte.

Test

Die antibakteriellen Wirkungen während der Züchtung und der Extraktionsmassnahmen wurden unter Verwendung von Bacillus subtilis PCI 219 nach der Agarplattenmethode getestet. Der Test von Streptothricin wurde unter Verwendung von Escherichia coli Stamm Fi durchgeführt, weil der Stamm Nr. 314 dieses Antibiotikum in einer grösseren Menge produzieren kann. Die Koexistenz von Streptothricin kann leicht durch Bestimmung einer antibakteriellen Wirkung gegenüber E. coli festgestellt werden, weil das Chlorcarcinkomplex, nämlich die in ein Lösungsmittel extrahierte Fraktion, gegen E. coli keine Wirkung ausübt. Das Mimosamycin wurde in ähnlicher Weise unter Verwendung von Mycobacterium smegmatis ATCC 607 als Testorganismus getestet.

Wie oben erwähnt, besitzen die Chlorcarcine A, B und C eine Antitumorwirkung und lassen sich für die Behandlung von Neoplasmen bei Warmblütern anwenden. Man darf auch annehmen, dass sie verwendbar sind als Antineoplasmamittel. Die geschätzte, wirksame Dosierung für Chlorcarcin A dürfte innerhalb 10 mg bis 1 g täglich bei Erwachsenen liegen. Für die Chlorcarcine B und C kann man mit täglichen Dosierungsmengen von 100 mg bis 10 g rechnen. Die Chlorcarcine können in Form ähnlicher pharmazeutischer Präparate verabreicht werden, wie dies für Mimosamycin der Fall ist, wobei man mit Vorteil eine parenterale und in gewissen Fällen eine orale Verabreichung vornimmt. Gewöhnlich wird man allerdings intramuskulär oder intravenös arbeiten.

Eine besondere Ausführungsform für die Herstellung der besagten antibiotischen Substanzen wird in den folgenden Beispielen beschrieben.

Beispiel 1

Schüttelkultur in Kolben A. Samenkultur

Eine Suspension eines gefriergetrockneten Präparates von Streptomyces lavendulae Stamm Nr. 314 in physiologischer Kochsalzlösung wurde hergestellt und auf einer Agarschräg-kultur folgender Zusammensetzung inokuliert.

Glucose 10 g L-Asparagin 5 g KH2PO4 5 g

Agar 15 g

Leitungswasser 1000 ml pH 6,8-7,0

Die Züchtung wurde während 1 Woche bei 27 °C durchgeführt, wobei man eine Samenkultur mit reichlichem Wachstum und manchen Sporen erhielt.

B. Kulturmedium

100 Schüttelkolben mit einem jeweiligen Volumen von 500 ml, welche 100 ml des oben definierten Kulturmediums enthielten, wurden mit aus dem oben erwähnten Samenkulturmedium gesammelten Sporen in Mengen von jeweils zwei Ösen pro Kolben geimpft.

622823

Glucose

1,0 g

Stärke

10,0 g

Polypepton (erhältlich bei Wako Pure

10,0 g

Chemical Industries, Ltd., Japan)

Fleischextrakt (dto.)

5,0 g

NaCl

3,0 g

Silikon KM 72

(Shin-Etsu Chemical Co., Ltd., Japan)

10 ml

Leitungswasser

1000 ml pH 7,0

Die Züchtung erfolgte während 40 Stunden bei 27 °C unter Verwendung einer Schüttelvorrichtung (125 Stösse pro Minute, 8 cm Vibration).

Nach beendeter Züchtung wurden die Kolbeninhalte miteinander vereinigt und die Mycelien mit Hilfe einer kontinuierlichen Zentrifugalabscheidevorrichtung isoliert. Der so erhaltene, obenauf schwimmende Teil (10 Liter) wurde auf einen pH von 8,0 eingestellt und hierauf dreimal mit jeweils ein Drittel Volumen Chloroform extrahiert.

Die Extrakte wurden vereinigt, durch Filterpapier filtriert und hierauf unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, wobei man 2,8 g einer dunkelbraunen, festen Substanz erhielt. Eine Lösung dieser Substanz in 50 ml Äthylacetat wurde nacheinander mit einer 5%igen wässrigen Natriumhydrogencarbo-natlösung, einer ln-Natriumcarbonatlösungund schliesslich einer ln-Natriumhydroxydlösung in jeweiligen Portionen von 25 ml geschüttelt, um die sauren Substanzen zu beseitigen. Die organische Schicht wurde fünfmal mit jeweils 25 ml ln-Salz-säure extrahiert. Die Extrakte wurden mit der wässrigen Schicht vereinigt, worauf man das Gemisch durch Zugabe von wässrigem Ammoniak auf einen pH-Wert von 9 bis 10 einstellte und fünfmal mit dem gleichen Volumen an Chloroform extrahierte. Die Extrakte wurden vereinigt und zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde in 50 ml einer 10%igen wässrigen Essigsäurelösung gelöst und der pH-Wert dieser Lösung durch Zugabe von wässrigem Ammoniak auf 9 bis 10 erhöht, worauf man fünfmal mit gleichen Mengen Chloroform extrahierte. Der Extrakt wurde unter vermindertem Druck eingeengt, wobei man 200 mg eines rohen Extraktes erhielt, welcher das Chlorcarcinkomplex und Mimosamycin enthielt.

Der so erhaltene rohe Extrakt wurde in eine Glassäule, welche einen Durchmesser von 1,0 cm und eine Länge von 50 cm aufwies und mit Kieselgel [70 bis 230 Maschen (mses), erhältlich bei Merck & Co., USA] beschickt war, eingetragen. Diese Säule wurde mit Mischungen von Benzol und Acetat im Mischungsverhältnis 2:1,1:1 und 1 :2 entwickelt, wobei man zu Fraktionen gelangte, welche vorwiegend Chlorcarcin A und Mimosamycin enthielten. Jede Fraktion wurde hierauf in einer Kieselgelsäule (230 Maschen, erhältlich bei der Firma Merck & Co.) chromatographiert, wobei man 5,2 mg Chlorcarcin A als gelbes Pulver und 2,8 mg Mimosamycin als gelbe Kristalle erhielt.

Die ursprüngliche Säule wurde hierauf mit einer Mischung von Äthylacetat und Aceton (Mischungsverhältnis 1:1) weiter entwickelt, wobei man zu Fraktionen (73 mg) gelangte, welche die Chlorcarcine B und C enthielten. Die so erhaltene Fraktion wurde wiederholt mit einer Kieselgelsäule (230 Maschen, erhältlich bei der Firma Merck & Co.) unter Verwendung von Aceton als Entwicklerlösungsmittel chromatographiert, wobei man 28 mg Chlorcarcin B und 37,3 mg Chlorcarcin C erhielt.

Beispiel 2

Züchtung in Fermentiergefässen

A. Die Samenkultur wurde in der gleichen Weise hergestellt wie in Beispiel 1, wobei man aber die Züchtung während 24 Stunden durchführte.

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10

B. 4 Fermentiergefässe mit einem jeweiligen Volumen von 20 Liter, welche jeweils 15 Liter des nachstehend erwähnten Kulturmediums enthielten, wurden unter Druck in üblicher Weise sterilisiert.

Glucose 5,0 g

Stärke 5,0 g

Polypepton (erhältlich bei Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Japan) 10,0 g

Fleischextrakt (dto.) 5,0 g

NaCl 3,0 g

Leitungswasser 1000 ml pH 7,0-7,2

10

Die Züchtung erfolgte während 18 Stunden unter den fol- 15 genden Bedingungen:

Samenkultur 1%

Züchtungstemperatur 27 °C

Rührgeschwindigkeit 550 rpm

Durchströmungsgeschwindigkeit von 1 Vol-Medium 20

aseptischer Luft pro Min.

Antischaummittel (Silikon KM 72)

nötigenfalls zugegeben

25

Nach Ablauf der oben erwähnten Zeitdauer wurden die maximalen Titer des erzeugten Chlorcarcinkomplexes und Mimosamycins erhalten, worauf die Titer rasch abnahmen. Der pH-Wert der Züchtungsbrühe fiel auf unter 6,0 und stieg hierauf wiederum auf ungefähr 6,8 an. Das Mycelvolumen 30 nahm rasch zu und die Glucose war in jenem Zeitpunkt praktisch erschöpft. Beim maximalen Titer von Chlorcarcin ergab eine Verdünnungsmethode unter Verwendung von Bacillus subtilis PCI 219 als Testorganismus 512 Verdünnungseinheiten, während eine Agarplattendiffusionsmethode eine Inhibitions- 35 zone von ungefähr 40 mm ergab. Die maximale Erzeugung von Streptothricin war nach ungefähr 30 Stunden erreicht. Aus der Kulturbrühe (ungefähr 60 Liter) Hessen sich mit Hilfe éiner kontinuierlich arbeitenden Zentrifugiervorrichtung Mycelien abtrennen. Die Kulturflüssigkeit wurde auf ein Drittel des Volu- 40 mens eingeengt.

Das Konzentrat wurde durch Zugabe von ln-Natriumhy-droxydlösung auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und dreimal mit gleichen Volumina Chloroform extrahiert. Die Extrakte wurden vereinigt und unter vermindertem Druck ein- 45 geengt, wobei man 16,4 g einer Mischung von rohem Chlorcar-cinkomplex und Mimosamycin erhielt. Das Gemisch wurde in 10 ml Äthylacetat gelöst und die so erhaltene Lösung mit 50 ml einer 5%igen wässrigen Natriumhydrogencarbonatlösung, hierauf mit einer ln-Natriumcarbonatlösung und anschliessend viermal mit jeweils einer ln-Natriumhydroxydlösung unter Rühren gewaschen. Die Natriumhydroxydschicht enthielt saure, unwirksame Komponenten, insbesondere Stearinsäure. Die Äthylacetatschicht wurde fünfmal mit jeweils 60 ml einer ln-Salzsäurelösung geschüttelt, worauf man basische Substanzen in die Säure extrahierte. Die sauren Extrakte wurden vereinigt, durch Zugabe von wässrigem Ammoniak auf einen pH-Wert von 9 bis 10 eingestellt, fünfmal mit jeweils gleichen Volumina Chloroform extrahiert und die organische Schicht abgetrennt und unter vermindertem Druck eingeengt, wobei man zu rohen, basischen Substanzen gelangte. Diese Substanzen wurden in 60 ml einer 10%igen wässrigen Essigsäurelösung gelöst und die Lösung hierauf durch Zugabe von wässrigem Ammoniak erneut auf einen pH-Wert von 9 bis 10 eingestellt und hierauf fünfmal mit jeweils dem gleichen Volumen an Chloroform extrahiert. Die Extrakte wurden vereinigt und unter vermindertem Druck eingeengt, wobei man ungefähr 0,98 g rohes Produkt erhielt, welches Chlorcarcinkomplex und Mimosamycin enthielt. .

Aus den vier Fermentiergefässen erhielt man insgesamt ungefähr 0,2 bis 1,5 g rohes Produkt.

Die Züchtung wurde 140mal unter Verwendung von vier Fermentiergefässen wiederholt, wobei man insgesamt 840 Liter Kulturbrühe verwendete. Auf diese Weise gelangte man zu 8,67 g rohem Produkt.

Das in wenig Benzol gelöste, rohe Produkt wurde in eine Glassäule, welche einen Durchmesser von 5 cm aufwies und mit mittels Benzol getränktem Kieselgel (70 bis 230 Maschen [mesh], erhältlich bei der Firma Merck & Co.) beschickt war, eingetragen. Die Säule wurde mit einer Mischung von Benzol und Äthylacetat (Mischungsverhältnis 2 :1) entwickelt. Nach dem Eluieren der Verunreinigungen wurden die zur Hauptsache Chlorcarcin A enthaltende Fraktion und die zur Hauptsache Mimosamycin enthaltende Fraktion nacheinander mit dem gleichen Entwicklerlösungsmittel eluiert. Diese Fraktionen wurden eingeengt und über Kieselgel (230 Maschen, Firma Merck & Co.) chromatographiert, wobei man 42 mg Mimosamycin und 85 mg Chlorcarcin A erhielt.

Die ursprüngliche Säule wurde mit einer Mischung von Äthylacetat und Aceton im Mischungsverhältnis 1:1 eluiert, wobei man zu einer Mischung gelangte, welche die Chlorcarcine B und C enthielt. Dieses Gemisch wurde wiederholt unter Verwendung von Kieselgel (230 Maschen, Firma Merck & Co.) chromatographiert und mit dem gleichen Lösungsmittel behandelt, wobei man 215 mg Chlorcarcin B und 52 mg Chlorcarcin C in reinem Zustand erhielt.

g

6 Blatt Zeichnungen

Claims (4)

622823 PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung der neuen antibiotischen Substanz Mimosamycin in Form neutraler, gelber Prismen, wobei diese Substanz die folgenden physikalischen Werte besitzt: Schmelzpunkt 227 bis 231 °C; Zusammensetzung 61,51% Kohlenstoff, 4,79% Wasserstoff und 5,87% Stickstoff; Molekulargewicht 233 gemäss Massenspektrum; empirische Formel C12H11NO4; Ultraviolettabsorptionsspektrum gemäss Fig. 1, UV/MjPh nm (log e): 230 (Schulter) (4,16), 317 (4,14), 396 (3,56), UV > nm (log e): 277 (3,78), 370 (3,53); Infrarotabsorptionsspektrum gemäss Fig. 2, IR v {£!£ cm-1:1685,1655,1635,1585; NMR-Spektrum (CDCb) gemäss Fig. 3,8:2,10 (3H, s.), 3,69 (3H, s.) 4,20 (3H, s.), 7,12 (1H, s.), 8,28 (1H, s.); Rotationsdispersions-spektrum (C = 4,37 • 10-7, MeOH) of [0]20 (nm): -1601 (500), -1373 (490), -1373 (480), -1144 (470), -1144 (460), -1144 (450-390), -1373 (380), -1144 (370-350),-1373 (340), -1831 (330), -2288 (320), -2288 (310), -1831 (300), -1601 (290), -2059 (280), -2517 (270), -3661 (260), -5492 (250); wobei die Substanz ferner in Methanol, Äthanol, Chloroform, einem Ester und Aceton leicht löslich, in Äthyläther und n-Hexan spärlich löslich und in Wasser unlöslich ist und auf Ehrlich-Reagens positiv und auf Ninhydrin-und Dragendorff-Reagens negativ anspricht, sowie von Säureadditionssalzen davon, dadurch gekennzeichnet, dass man Streptomyces lavendulae Stamm Nr. 314 (NRRL11002) züchtet, aus der Kulturbrühe einen Komplex von Chlorcarci-nen und Mimosamycin gewinnt und hierauf Mimosamycin als solches oder in Form eines Säureadditionssalzes davon aus diesem Komplex isoliert.

2. Verfahren zur Herstellung der neuen antibiotischen Substanz Chlorcarcin A in Form eines basischen, gelben Sirups, wobei diese Substanz die folgenden physikalischen Daten aufweist: Schmelzpunkt 140 bis 144 °C (unter Zersetzung als Chlorhydratsalz); Zusammensetzung (als Chlorhydratsalz): 45,74% Kohlenstoff, 4,73% Wasserstoff, 6,94% Stickstoff und 16,14% Chlor; Molekulargewicht 535 gemäss Massenspektrum; empirische Formel Cî^ôNaOsCl- 2HC1» H2O; spezifische Drehung [a]ff = -4°(C = 1,0, Methanol); Ultra violettabsorptions-spektrum gemäss Fig. 4, UV nm (log e): 268 (3,83), UV XMeOH nm (log e). 238 (3,68), UVXfeHCl-MeOH nm (log e):263, (3,85), UV Âmn0H"°'ln"HC1 nm (log e): 234 (3,68); Infrarotabsorptionsspektrum gemäss Fig. 5, IR v^SF' cm-1:1685,1665,1610; NMR-Spektrum (CDCb) gemäss Fig. 6,5:1,23 (3H, s.), 1,95 (3H, s, J = 7 Hz), 2,26 (3H, s., J = 7 Hz), 4,05 (3H, s.), 6,70 (1H, s.), wobei diese Substanz ferner in Äthyläther, einem Ester, Chloroform, Aceton, einem Alkohol und 0,ln-SaIzsäure leicht löslich, in n-Hexan und einer 0,1 n-Natriumhydroxydlösung spärlich löslich und in Wasser unlöslich ist und auf Dragendorff-Reagens positiv und auf Ninhydrin-, FeCb- und Anthron-Reagens negativ reagiert, sowie von Säureadditionssalzen davon, dadurch gekennzeichnet, dass man Streptomyces lavendulae Stamm Nr. 314 (NRRL 11002) züchtet, aus der Kulturbrühe einen Komplex von Chlorcarcinen und Mimosamycin gewinnt und hierauf Chlorcarcin A als solches oder in Form eines Säureadditionssalzes davon aus diesem Komplex isoliert.

3. Verfahren zur Herstellung der neuen antibiotischen Substanz Chlorcarcin B in Form eines basischen, gelben Pulvers, wobei diese Substanz die folgenden physikalischen Daten aufweist: Schmelzpunkt 78 bis 81 °C; Zusammensetzung 60,89% Kohlenstoff, 6,20% Wasserstoff, 6,71% Stickstoff und 5,20% Chlor; Molekulargewicht 553 gemäss Massenspektrum; empirische Formel C29H32O6N3CI-5/4^0; Ultraviolettabsorptionsspektrum gemäss Fig. 7, UV nm (log e): 268,5 (4,25), 370 (3,38), UV /^eOH nm ^ e): 234 (3,99), 338 (3,34), UV ^HC|-Me0H nm (log e): 262 (4,18), 380 (3,34), UV ^J"-HC1-MeOH nm (log e): 231 (3,95), 354 (3,32); Infrarotabsorptionsspektrum gemäss Fig. 8, IR v&ajF1 cm-1:1715,1683,1655,1612; NMR-Spektrum (CDCb) gemäss Fig. 9 Ô: 1,28 (3H, m.), 1,92 (3H, s.), 2,04 (3H, s.), 2,27 (3H, s.), 2,50 (3H, s.), 4,04 (3H, s.), 4,08 (3H, s.), 4,42 (1H, s.),

6,84 (1H, d., J = 8Hz); Circulardichroismusspektrum (C = 8,63-10"5, Methanol), As (nm): -2,45 (360) negatives Maximum): -0,352 (320) (positives Maximum); -13,0 (2,78) (negatives Maximum); wobei diese Substanz in einem Alkohol, Chloroform, einem Ester, Aceton, Benzol und Äthyläther leicht löslich, in n-Hexan spärlich löslich und in Wasser unlöslich ist und auf Dragendorff-und Meyer-Reagens positiv und auf Ninhydrin-und Ehrlich-Reagens negativ reagiert, sowie von Säureadditionssalzen davon, dadurch gekennzeichnet, dass man Streptomyces lavendulae Stamm Nr. 314 (NRRL 11002) züchtet, aus der Kulturbrühe einen Komplex von Chlorcarcinen und Mimosamycin gewinnt und hierauf Chlorcarcin B als solches oder in Form eines Säureadditionssalzes davon aus diesem Komplex isoliert.

4. Verfahren zur Herstellung der neuen antibiotischen Substanz Chlorcarcin C in Form eines basischen, gelben Pulvers, wobei diese Substanz die folgenden physikalischen Daten aufweist: Schmelzpunkt 79 bis 84 °C; Zusammensetzung 60,88% Kohlenstoff, 6,11% Wasserstoff, 6,54% Stickstoff und 6,71% Chlor; Molekulargewicht 567 gemäss Massenspektrum; empirische Formel C3oH340eN3Cl'3/2H20; Ultraviolettabsorptionsspektrum gemäss Fig. 10, UVAJ#|PH nm (log e): 268 (4,26), 368 (3,34), UV ^oh nm (log e): 231 (3,91), UV ^Wn-fra-MeOH nm (log e): 262,5 (4,22), 380 (3,40), UV ^nn-HC|-Me0H nm (log e): 228,5 (3,87), 351 (3,36); Infrarotabsorptionsspektrum gemäss Fig. 11, IRv£äclj cm-1:1718,1683,1655,1618; NMR-Spektrum gemäss Fig. 12,5:1,42 (3H, s.), 2,01 (3H, s.), 2,15 (3H, s.), 2,35 (3H, s.), 2,59 (3H, s.), 3,59 (3H, s.), 4,05 (3H, s.), 4,07 (3H, s.), 6,71 (1H, d., J = 8 Hz); Circulardichroismusspektrum (C = 9,38-10-5, Methanol), As (nm): -3,88 (360) (negatives Maximum): -2,26 (310) (positives Maximum); -24,5 (273) (negatives Maximum); wobei diese Substanz in einem Alkohol, Chloroform, einem Ester, Aceton, Benzol und Äthyläther leicht löslich, in n-Hexan spärlich löslich und in Wasser unlöslich ist, sowie von Säureadditionssalzen davon, dadurch gekennzeichnet, dass man Streptomyces lavendulae Stamm Nr. 314 (NRRL 11002) züchtet, aus der Kulturbrühe einen Komplex von Chlorcarcinen und Mimosamycin gewinnt und hierauf Chlorcarcin C als solches oder in Form eines Säureadditionssalzes davon aus diesem Komplex isoliert.