JPH04154778A

JPH04154778A - 新規物質ｕｃｆ１３

Info

Publication number: JPH04154778A
Application number: JP2277199A
Authority: JP
Inventors: Hirofumi Nakano; 洋文中野; Mitsunobu Hara; 光信原; Yutaka Saito; 裕斉藤; Yoji Inata; 生稲　洋二; Shozo Kawada; 河田　省三; Masami Okabe; 岡部　正美
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1990-10-15
Filing date: 1990-10-15
Publication date: 1992-05-27

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、新規物質ＵＣＦＩ３に関する。

ＵＣＦ　Ｉ　３は抗菌作用および抗腫瘍作用を有し、抗
菌剤および抗腫瘍剤として有用である。

従来の技術本発明の化合物に類似の化合物としては、下記式で示さ
れる化合物が知られている。

■　フレノリシン〔ジャーナル・オブ・アメリカン・ケ
ミカルソサエティ（Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、
）９０、　１３２５（＋９６８）コ ■　フレノリシンＢ〔ジャーナル・オブ・アンチヒ゛オ
ティクス（Ｊ、八ｎｔｉｂｉｏＬｉｃｓ）３１．９５９
（１９７８）　］本発明の目的は、優れた抗菌作用およ
び抗腫瘍作用を有する化合物を提供することにある。

本発明者らは、宮城県牡鹿郡の土壌から分離した微生物
を培地に培養して得られる培養物中に抗菌および抗腫瘍
作用を有する物質が生産されることを見出した。この物
質を単離、精製し、その理化学的性質を調べた結果、新
規物質であることが判明し、ＵＣＦ１３と命名した。

本発明によれば、下記式（１）で表わされる新規物質ＵＣＦ１３が提供される。

ＵＣＦ　１３の理化学的性質は以下の通りである。

ＣＦ１３ ■、性　　　状：淡黄色粉末２、分　子穴：Ｃ，，Ｈ２，０゜３、元素分析　：Ｃ６２，０７％、８５．７５％４、質
量分析ｍ／ｚ　：　　３４９（Ｍ＋１）”５、高分解能
質量分析ｍ／ｚ（ＳＩＭＳ）　　：実測値３３０．１１
２９、Ｃ、、Ｈ、，０６としての計算値３３０．１１０
３６、旋光度　：　　〔αｉ：　−＋　１１４°　（Ｃ
・０．１．　クロロホルム）７、紫外部吸収スペクトル
（メタノール溶液）λｍａｘ　　ｎｍ　　（Ｅ）　　　
：　　　２３０（２１９００）、　　　２６６（５１０
０）。

８、光外部吸収スペクトル（ＫＢｒ打錠）ｃ＋ａ−’：
３４２７、３３００−２５００．１７０５．１６５１９
、核磁気共鳴スペクトル（ＣＤ３０１３中）　：第１表
に示す。

第　　　１　　　表 ”Ｃ−ＮＭＲ（ｌｏｏｍＨ２）　　’Ｈ−ＮＭＲ（４０
０ｍＨｚ）６６．４ｄ４８．４ｄ４２．４ｔ２９．７ｔ２７．０ｔ１９．６ｔ１４．１ｑ１０、呈色反応：エタノール硫酸、ヨウ素、塩化第二鉄
、ＢＣＧに陽性。

１１、溶解性：アルコール、アセトン、酢酸エチル、ク
ロロホルム、水に可溶、ヘキサンに不溶。

ＵＣＦ　１３のシリカゲル薄層クロマトグラフィー　（
ＴＬＣ）でのＲｆ値および高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）の保持時間を第２表に示す。

第　　　２　　　表ＵＣＦ１３　０．０５　５．６３次にＵＣＦ　ｌ　３の生物活性について説明する。

（Ａ）各種細菌に対する抗菌作用抗菌作用はバクト・トリプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）３ｇ
、肉エキス３ｇ、酵母エキス１ｇ、グルコース１ｇ、寒
天１６ｇを１１の水に溶解して作成した培地（ｐｌ＋７
）を用いて寒天希釈法で測定した。

第３表に抗菌活性を最少生育阻止濃度（ＭＩＣ）で示し
た。

第　　　３　　　表スタフィロコッカス・　　　　　ＩＯ＾ＴＣＣ６５３８Ｐエンテロコツカス・　　　　　　４２八ＴＣＣ１０５Ｎα１０７０１０７０７（Ｂ）細胞に対する生育阻害９６穴マイクロタイタープレートにＲＰＭＩ−１６４０
培地（Ｇｉｂｃｏ社製）、ｌＯ％牛脂児血清、１０．／
ｄインシュリン及び１０−１１Ｍエストラジオールから
なる培地（以下、培地へと称す）で４．５Ｘ　１０’個
／ｌｎ１にｆＡ製したＭＣＦ？細胞（ＡＴＣＣＨＴｆ１
２２）を０．　ｌｄずつ該プレートの各式に分注した。

該プレートを炭酸ガスインキュベータ内で３７℃、２０
時間培養後、これに培地へにより適宜希釈した試験化合
物０．０５ｄずつ加え、炭酸ガスインキュベーター内で
３７℃、７２時間培養した。培養上清を除去後、残査に
培地へ及び０．０２％ニュートラルレッドからなる培地
を０．１＋ｊ！ずつ加え、３７℃で１時間炭酸ガスイン
キュベータ内で培養し、細胞を染色した。培養土〆＾を
除去後、残査を生理食塩水で１回洗浄した。ついで０．
００１規定塩酸／３０％エタノールで色素を抽出後、マ
イクロプレートリーダーにより５５０ｎｍの吸光度を測
定した。無処理細胞と既知１度の試験化合物で処理した
細胞の吸光度を比較することにより細胞の増殖を５０％
阻害する試験化合物濃度（ＩＣ，。）を算出した。

その結果を第４表に示す。

第　　　４　　　表次にＵＣＦ１３の製造法について説明する。

ＵＣＦ１３はストレプトマイセス属に属し、ＵＣＦ１３
を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物
中にＵＣＦ１３を生成蓄積させ、該培養物からＵＣＦ１
３を採取することによって得ることができる。

ＵＣＦ１３生産菌株としてはストレプトマイセス属に属
し、ＵＣＦ１３生産能を有する菌株であればいずれの菌
株でも用いることができる。またこれらの菌株の人工的
変異方法、例えば紫外線照射、Ｘ線照射、変異誘起剤処
理などによって変異させた変異株あるいは自然的に変異
した変異株でもＵＣＦ１３を生産するものであれば本発
明に用いることができる。代表的菌株としてはストレプ
トマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓ
ｐ、　）Ｕ　ＯＦ１ａ株（以下ＵＯＦ　１３株と略記す
る。）があげられる。

以下に、ＵＯＦ　１３株の菌学的性質について説明する
。

該性質の決定は、国際ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ）プロジェクト　（ＩＳＰ）がストレプ
トマイセス種の特性決定のために推奨する方法〔イー・
ビー・シェリング（Ｂ、Ｂ、Ｓｈｉｒｌｉｎｇ）および
デイ−・ゴツトリーブ（Ｑ、Ｇｏｔｔｌｉｅｂ）　、イ
ンターナショナル・ジャーナル・システマティック、バ
クテリオロジー（Ｉｎｔ、Ｊ、　５ｙｓｔ、　Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ、）１６、３１３−３４０（１９６６）　］
に従った。全細胞の加水分解物中のジアミノピメリン酸
の異性体はビー・ベッカ−（口、　Ｂｅｃｋｅｒ）らの
方式〔アプライド・ミクロバイオロジー（＾ｐｐｌ、Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ、）　１２．４２１−４２３（１９６
４）　）によって確認した。形態学的検討は、光学顕微
鏡を用いて行い、とくに胞子表面の形態については走査
型電子顕微鏡を用いて行った。色の名称の割当てには、
カラー・ハーモニー・マニュアル（Ｃｏｌ−ｏｒ　Ｈａ
ｒｍｏｎｙ　Ｍａｎｕａｌ）　［コンテイナー・コーポ
レーション−才ブ・アメリカ（Ｃｏｎｔａｉｎｅｒ　Ｃ
ｏｒｐｏｒａｔｉｏｎｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａ）　、第４
版（１９５８）　］を使用した。

ＵＯＦ１３株の菌学的性質は次の通りである。

■形態気菌糸：分枝する。

基生菌糸二分枝するが、分断はない。

胞　子：気菌糸上に分節胞子（１０個から３０個もしく
はさらに多数）の長い連鎖として着生する。連鎖の形態
は直鎖状。

胞子の表面：平滑（Ｓｍｏｏｔｈ）抱子の運動性：なし胞子の形・大きさ：楕円形（０，５ＸＯゴμｍ）なお、
菌核、抱子のうは観察されない。

■色調気菌糸：灰色〜白色基生菌糸：淡黄色可溶性色素：淡黄色メラニン色素：あり、茶色 ■　細胞壁の化学組成ジアミノピメリン酸の立体型：ＬＬ型 ■　生理的性質炭素源の同化性：同化’ｔ６：グルコース、マンニトールフラクトース、
ラムノースラフィノース、ガラクトースサリシン同化しない：アラビノース、キシロース、イノシトールゼラチンの液化：陰性スターチの加水分解：陽性脱脂粉乳の凝固：陰性脱脂粉乳のペプトン化：陽性繊維素の分解：陽性生育温度範囲＝１６〜３７℃（至適２８〜３２℃）なお
、生育温度範囲については２日後、ゼラチン、脱脂粉乳
および繊維素に対する作用については、２８℃、１か月
後の結果を、そのほかの性質は２８℃、２週間後の結果
を示した。

■　各種寒天培地における生育状態各種寒天培地で２８℃、２８日間、ＵＯＦ１３株を培養
した結果を第５表に示す。

第　　　５　　　表なお、略号は次のとおりである。

Ｇ：生育の程度ＡＭ＝気菌糸の着生度および色調８Ｍ二基生菌糸の色調Ｐ：可溶性色素の色調 ■　［ＪＯＦ１３株の同定ＵＯＦ　１３株はＬＬ型のジアミノピメリン酸が検出さ
れることから、エム・ピー・レチェバリエとエイチ・ニ
ー・レチェバリエ（Ｍ、　Ｐ、　Ｌｅｃｈｅｖａ　ｌ　
１ｅｒａｎｄ　Ｉｔ、　Ａ、　Ｌｅｃｈｅｖａ　Ｉ　１
ｅｒ）による放線菌の分類〔インターナショナル・ジャ
ーナル・システマティック・バクテリオロジ−（ｌ　ｎ
ｔ、Ｊ、　５ｙｓｔ、　Ｂａｃｔｅｒ　ｉｏｌ、　）興
、　４３５−４４３（１９７０）　］によると細飽壁Ｉ
型と分類される。

さらに該菌株の形態学的特徴を組み合わせると、この菌
株をストレプトマイセス属に帰属させるのが適当である
。

木屑における種の同定においては、灰色〜白色の気菌糸
、屈曲状もしくはループ状の胞子連鎖、平滑な胞子表面
、メラニン様色素産生、可溶性色素の産生および炭素源
の資化パターンなどの特徴をもとに、細菌学名承認リス
ト〔ヴイー・ビー・テ′イー・スカーマン（Ｖ、８０口
、　Ｓｋｅｒｍａｎ）らの、Ｉｎｔ。

Ｊ、　５ｙｓｔ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、３０．２２
５−４２０（１９８０）　］で承認されている種名より
、分類的特徴が類似している種をＩＳＰの記載［１ｎｔ
、　Ｊ、　５ｙｓｔ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。

（１９７２）およびアール・イー・ブカナン（Ｒ，Ｅ、
Ｂｕｃｈａｎａｎ）とエヌ・イー・ギボンズ（Ｎ、Ｂ、
Ｇｉｂｂｏｎｓ）　ｍ、バーシーズ・マニュアル・オブ
・デターミネイティブ０バクテリオロジイ（Ｂｅｒｇｅ
ｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒ−ｍｉｎａｔ
ｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第８版〕をもとに
検索した。

検索の結果、ストレプトマイセス・アウレオシルクラタ
ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｕｒｅｏｃｉｒｃｕ
ｌａｔｕｓ）がＵＯＦ　１３株の近縁の種として挙げら
れるが、ＵＯＦ　１３株の種を特定することはできない
。従って、本菌種をストレプトマイセス・エスピー（Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ、）に属するものとする
。

該菌株はブダペスト条約に基づき、平成２年ｌＯ月３日
付けで工業技術院微生物工業技術研究所に微工研条寄第
３１２２号（ＦＥＲＭ　　Ｂｌ’−３１２２）として寄
託されている。

本発明のＵＣＦ１３生産菌株の培養においては通常の放
線菌の培養法が一般に用いられる。培地としては菌が資
化可能な炭素源、窒素源、無機物などを程よく含有する
培地であれば合成培地、天然培地いずれでも使用可能で
ある。

炭素源としてはグルコース、澱粉、デキストリン、マン
ノース、フラクトース、シュークロース、ラクトース、
キシロース、アラビノース、マンニトール、糖蜜などが
単独または組み合わせて用いられる。さらに、菌の資化
能によっては炭化水素、アルコール類、有機酸なども用
いられる。窒素源としては塩化アンモニウム、硫酸アン
モニウム、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿素、
ペプトン、肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、コーン・
スチープ・リカー、大豆粉、カザミノ酸などが単独また
は組み合わせて用いられる。そのほか、必要に応じて食
塩、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム
、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸
第一鉄、塩化カルシウム、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫
酸銅などの無機塩類を加える。さらに使用する菌の生育
やＵＣＦ１３の生産を促進する物質、例えばビタミンＢ
９、ビオチンなどを適当に添加することができる。

培養法としては、液体培養法、特に深部攪拌培養法が適
している。培養は温度１６〜３７℃、好ましくは２５〜
３２℃でｐ１１４〜１０、好ましくは６〜８で行われる
。通常１〜７日間培養を行うと目的物質ＵＣＦ１３が培
養液中および菌体中に生成蓄積される。培養中、培地の
ｐＨ調整にはアンモニア水や炭酸アンモニウム溶液など
が用いられる。

培養物中の生成量が最大に達したときに培養を停止し、
培養物中よりＵＣＦ１３を単離精製する。

培養物からのＵＣＦ１３の単離精製は、微生物代謝生産
物をその培養物から単離精製するために常用される方法
に従って行なわれる。例えば培養物をｐ過により培養ｐ
液と菌体に分け、菌体をクロロホルム、アセトンなどで
抽出する。ついで、抽出液と培養Ｐ液とを合わせて、ポ
リスチレン系吸着剤例えばダイヤイオンＨＰ２０（三菱
化成社！！りなどに通塔して活性成分を吸着させ、酢酸
エチル、アセトンなどで溶出する。溶出液を濃縮し、シ
リカゲルによるカラムクロマトグラフィー、高速液体ク
ロマトグラフィーなどにより、ＵＣＦ１３の淡黄色粉末
を得る。なお、培養、精製工程中のＵＣＦ１３の動向は
バチルス・ズブチリスＮｕ１０７０ｉを用いるパイオア
フセイ、または薄層クロマトグラフィーによるＵＣＦ１
３の紫外部吸収あるいは他の呈色反応を目安として追跡
することができる。

以下に本発明の実施例を示す。

実施例１゜種菌としてストレプトマイセス・エスピーｕｏｐｘ：株
（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−３１２２）を用いた。該菌株を２
１容量の三角フラスコ中の下記組成の種培地（殺菌前ｐ
Ｈ７，２）３００ｒｄに植菌し、３０℃で４８時間振盪
（２００ｒｐｍ）培養した。

種培地組成：バクト・トリプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）５ｇ／ｊｌ！、
酵母エキス５ｇ／Ｉ！、肉エキス３ｇ／Ａ、可溶性澱粉
１０ｇ／ｉ’、グルコースｌＯｇｚ＃！、炭酸カルシウ
ム５ｇ／β（殺菌前ｐ　Ｈ７，２＞得られた種培養液を３０ｆ容量のジャーファーメンタ−
中の下記組成の発酵培地１５１に１０％（容量）の割合
で移し、２８℃で通気攪拌（回転数２０　Ｏｒｐｍ、通
気１１５Ｒ／分）方式により培養′　　を行った。

発酵培地組成：可溶性デンプン５０ｇ／ｊ！、コーン・スチーブ・リカ
ー３０ｇ／ｌ、ＸＨ２ＰＯ−０，５ｇ／　ｉ　、　Ｍｇ
５Ｏ，・７Ｌ０　０．５　ｇ　／　ｌ、炭酸カルシウム
５ｇ／ｆ＜殺菌前ＰＨ７，０、ＮａＯＨで調整）培養中、培地のｐＨはとくに制御しないで、８０時間培
養した。培養液にｎ−プロパツール１５１を添加し攪拌
した後、培養物から菌体および沈澱物を戸別し、戸液２
８ｉ！を得た。

ρ液を濃縮後、水で希釈し、ポリスチレン系吸着樹脂ダ
イヤイオンＨＰ２０（三菱化成社製）１０１を充填した
カラムに通塔して活性物質を吸着させた。脱イオン水お
よび５０％メタノールで不純物を溶出後、メタノールお
よび酢酸エチルで溶出した。溶出液を濃縮し、残査に水
を加えた後、酢酸エチルで抽出を行った。抽出液を無水
硫酸ナトリウムで脱水した後濃縮し、シリカゲルカラム
（ＢＷ３００；富士デヴイソン化学社製）にかけ、クロ
ロホルム：メタノール（１００：１；ν／Ｖ）で展開し
た。溶出された活性画分を濃縮し、逆相系シリカゲル（
ＹＭＣＲ３３５−２０、ワイエムシー社製）カラムにか
けメタノール：　５０ｍＭ　ＸＨ２ＰＯ。

（ｐＨ？）　　（８：２）を溶媒として高速液体クロマ
トグラフィーを行い、ＵＣＦ１３を含む両分を集めた。

さらにＨＰ２０カラムに吸着させ、水洗後メタノールで
溶出した。溶出液を濃縮することによりＵＣＦ１３の淡
黄色粉末７６■が得られた。

発明の効果本発明により抗菌および抗腫瘍作用を有する新規物質Ｕ
ＣＦ１３が提供される。

手続補正書（自発）１、事件の表示平成２年特許願第２７７１９９号２、発明の名称郵便番号　１００住　所　　東京都千代田区大手町−丁目６番１号名称　
（１（１２）協和＃８酵工業株式会社明細書の発明の詳
細な説明の欄５、補正の内容（１）　　明細書第３頁最下行の「質量分析ｍ／ｚ　Ｊ
の後にｒ　（ＳＩＭＳ）　Ｊを加入する。

（２）同書′Ｍ４頁１行のｒ　ｍ／ｚ　（ＳＩＭＳ）　
Ｊをｒｍ／ｚ（ＢＩＭＳ）　Ｊ　ｌ：訂正ｔ６゜（３）
同書第５頁第１表のｒ　”　Ｃ−ＮＭＲ（１００ｍ）Ｉ
Ｚ）　Ｊおよびｒ　’）Ｉ−ＮＭＲ（４００ｍＨｚ）Ｊ
をそれぞれｒ　”　Ｃ−ＮＭＲ（１００Ｍ）Ｉｚ）　Ｊ
およびｒ　’　）Ｉ−ＮＭＲ（４００Ｍｔｌｚ）　Ｊに
訂正する。

（４）同書第６頁第２表の「＊：メルク社製、＾［［。

５７１５Ｊの後に［；クロロホルム：メタノール（２０
：１）　Ｊを加入する。

Claims

【特許請求の範囲】式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で表わされる新規物質ＵＣＦ１３。