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Verfahren zur Herstellung des neuen fungiziden
Antibiotikums Phytostreptin
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines neuen fungiziden Antibiotikums bzw. von dessen Salzen, welches darin besteht, dass man ein übliches Nährmedium mit dem Stamm NRRL 2751 von Streptomyces hygroscopicus fermentiert und das erhaltene Antibiotikum nach einer an sich bekannten Methode, beispielsweise durch Ausfällen oder Lösungsmittelextraktion, aus der Gärflüssigkeit gewinnt.
Dem neuen fungiziden Antibiotikum wurde der willkürliche Name Phytostreptin gegeben. Phytostreptin ist ein Polypeptid, dessen unten angegebene chemische und physikalische Eigenschaften das Vorhandensein einer freien Aminogruppe zeigen. Es stellt einen hellbraunen Feststoff dar und ist löslich in
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Molisch-, Ninhydrin-, Millon-, Liebermann Buchard-, Maltol-, Pauly-, Ehrlich (Dimethylaminobenz- aldehyd)-,'Sakaguchi-und Fehling-Teste. Mit kalter konzentrierter Schwefelsäure bildet es keine Farbe.
Aus wässeriger Lösung wird es durch Ammoniumsulfat, Kaliumchlorid, Bariumchlorid, Kuprichlorid, Natriumchlorid, Zinkchlorid, Pikrinsäure, Phosphorwolframsäure, Trichloressigsäure, Methylorange und Reineckesalz ausgefällt. Dass dieses Antibiotikum ein Polypeptid ist, wurde durch Hydrolyse mit 6n-HCI gezeigt. Das nunmehr ninhydrinpositive Hydrolysat wurde unter Verwendung der zweidimensionalen Papierchromatographie analysiert. Hiebei wurde das Vorhandensein von mindestens acht ninhydrin-positiven Komponenten gefunden, von denen die Aminosäuren Valin, < x-Alanin, Prolin, Leucin (oder Isoleucin), Arginin, Glycin und Serin identifiziert wurden.
Phytostreptin ist hitzestabil. Wenn eine methanolische Lösung am Rückfluss (65 C) 6 h gekocht wur-
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oder gereinigte Aspergillus oryzae-Pilzprotease von Pabst wird es nicht verdaut.
In den niederen Bereichen des Ultravioletts zeigt Phytostreptin eine starke Endabsorption ohne bemerkenswerte Maxima im Bereich 230 -410 mol . Die Bestimmungen wurden in Methanol (100 111m !) mit einem Beckman DU-Spektrophotometer ausgeführt.
Phytostreptin zeigt im Infrarot eine Anzahl charakteristischer Absorptionsbanden in Chloroformlösung, deren wichtigere bei folgenden Frequenzen (ausgedrückt in li) liegen :
2, 93, 3,08, 3,20, 3,33, 3,45, 3,52, 4,12, 5, 71, 5. 74,6, 05,6, 15,6, 56, 6, 70, 6,95, 7, 12, 7, 60, 7, 76, 7, 86, 8, 12, 8, 86, 9, 05, 9, 42, 10, 06, 10, 34, 10, 80. 11, 00, 11, 46, 11, 70 und 13, 30.
Das Spektrum wurde auf einem Perkin-Elmer-Modell 21, Doppelstrahl-Infrarotspektrophotometer, Serien Nr. 760 (Verstärkung 5,0, Auflösung 1, 0, Geschwindigkeit 6,0 und Dämpfung 3,0) erhalten.
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Um die Absorption des Lösungsmittels Chloroform zu eliminieren, wurde auch ein Infrarotabsorptionsspektrum des Phytostreptins in einem Kaliumbromidpressling auf einem Baird Modell 455 I. R. Spektrophotometer aufgenommen. Gegenüber der Bestimmung in Chloroformlösung tritt hiebei eine verhältnismässig geringe Änderung auf.
In den folgenden für die Peptidbindung charakteristischen Stellen zeigt Phytostreptin starke Absorptionsbanden, ausgedrückt in li und daneben in Wellenzahlen in reziproken Zentimetern :
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trischen Titration wurden folgende Daten erhalten (Titrationsbeginn im sauren Bereich) :
EMI2.2
<tb>
<tb> Lösungsmittel <SEP> pK <SEP> Äquivalentgewicht <SEP> Bemerkungen
<tb> Wasser <SEP> 2,4 <SEP> 1000 <SEP> Gramm/Mol <SEP> offenbar <SEP> freie
<tb> Carboxylgruppe
<tb> 9,6 <SEP> 3500 <SEP> Gramm/Mol <SEP> offenbar <SEP> freie
<tb> Aminogruppe
<tb> 70ça <SEP> 3,4 <SEP> 3300 <SEP> Gramm/Mol <SEP> offenbar <SEP> freie
<tb> Carboxylgruppe
<tb> Methanol <SEP> 9,4 <SEP> 3300 <SEP> Gramm/Mol <SEP> offenbar <SEP> freie
<tb> Aminogruppe
<tb>
Phytostreptin zeigt, offenbar unter Zersetzung, einen ungenauen Schmelzpunkt, der etwa bei 165 C beginnt.
Die Schmelzbereiche wurden in einer zugeschmolzenen Kapillare im Ölbad wie folgt bestimmt : 168 - 1780C, 166 - 1720C und 166 - 1730C.
Die Verbrennungsanalyse von Phytostreptin lieferte folgende Werte :
EMI2.3
<tb>
<tb> C <SEP> H <SEP> N
<tb> 52,56 <SEP> 7,93 <SEP> 13,53
<tb> 52,44 <SEP> 7,66 <SEP> 13,26
<tb> 53, <SEP> 70 <SEP> 8,44 <SEP> 13,38
<tb> 53, <SEP> 45 <SEP> 8, <SEP> 29 <SEP> 13, <SEP> 48 <SEP>
<tb> Mittelwert <SEP> 53,04 <SEP> 8,08 <SEP> 13, <SEP> 41 <SEP>
<tb>
Amidstickstoff : l, 5%. Kein Schwefel und Halogen.
Das Molekulargewicht von Phytostreptin wurde mit 28,600 (plus oder minus 100/0) bestimmt, mittels
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unter Zusatz von 0, 05 molarem NaCl als Trägerelektrolyt gemacht. Phytostreptin, das wie hier beschrieben erhalten wurde, erfüllt das erste Kriterium für Homogenität in der Ultrazentrifuge bei"Ultrazentri- fugengeschwindigkeits"-Experimenten. Das Material zeigte nur eine sedementierende Grenzlinie, die während des ganzen Experimentes symmetrisch blieb.
Phytostreptin wurde durch aufsteigende eindimensionale Papierchromatographie unter Verwendung von Whatman-Papier Nr. 1 in den in Tabelle I angegebenen Lösungsmittelsystemen untersucht. Die entwickelten Chromatogramme wurden an der Luft bei Zimmertemperatur getrocknet und auf Agarplatten, die mit Glomerella cingulate beimpft waren, eine Bioautographie gemacht.
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Tabelle I Chromatographische Daten für Phytostreptin
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<tb>
<tb> System <SEP> Rt <SEP> Bemerkungen <SEP> Laufzeit
<tb> Stunden
<tb> Wasser <SEP> mit <SEP> 0,00 <SEP> gut <SEP> ausgeprägter <SEP> Fleck <SEP> 7
<tb> n-Butanol <SEP> gesättigt
<tb> n-Butanol <SEP> gesättigt <SEP> 0,91 <SEP> gut <SEP> ausgeprägter <SEP> Fleck <SEP> 16
<tb> mit <SEP> Wasser
<tb> n-Butanol-Essigsäure-0, <SEP> 93 <SEP> gut <SEP> ausgeprägter <SEP> Fleck <SEP> 16
<tb> Wasser <SEP> (2-1-1)
<tb> n-Butanol-Pyridin- <SEP> 0, <SEP> 92 <SEP> gut <SEP> ausgeprägter <SEP> Fleck <SEP> 16
<tb> Wasser <SEP> (1 <SEP> - <SEP> 0, <SEP> 7 <SEP> - <SEP> 1) <SEP>
<tb> 30/0 <SEP> wässeriges <SEP> NU <SEP> CL <SEP> 0,00 <SEP> gut <SEP> ausgeprägter <SEP> Fleck <SEP> 4
<tb> 5 <SEP> rP/o <SEP> wässeriges <SEP> Aceton <SEP> 0,53 <SEP> Schwanzbildung <SEP> 6
<tb> 0,
93 <SEP> gut <SEP> ausgeprägter <SEP> Fleck
<tb> tert. <SEP> Butanol-Essig- <SEP> 0,91 <SEP> gut <SEP> ausgeprägter <SEP> Fleck <SEP> 28
<tb> säure-Wasser
<tb> (74 <SEP> - <SEP> 3 <SEP> - <SEP> 25)
<tb> n-Butanol-Methanol-0, <SEP> 98 <SEP> gut <SEP> ausgeprägter <SEP> Fleck <SEP> 8
<tb> Wasser <SEP> (4 <SEP> - <SEP> 1 <SEP> - <SEP> 2)
<tb> Benzol-Methanol <SEP> 0,98 <SEP> gut <SEP> ausgeprägter <SEP> Fleck <SEP> 5
<tb> (4-1)
<tb>
Die chromatographischen Werte für Phytostreptin stehen in Übereinstimmung mit der ungewöhnlichen Löslichkeit dieses Polypeptids in Fettlösungsmitteln wie Aceton, Methylisobutylketon und Chloroform.
Mit Alkalimetallbasen bildet Phytostreptin Alkalimetallsalze wie das Natriumsalz. Auch andere einfache und komplexe Salze von Phytostreptin sind leicht herstellbar. Zu ihnen gehören die Kupfer-, Zink- und Mangansalze und die Molybdat-Pikrat-, Helianthat- und Reineckatkomplexsalze. Diese Salze sind wenig löslich oder löslich in Wasser, In-Natriumhydroxyd und Chloroform. In In-HCl sind sie wenig löslich und in Methanol und Aceton löslich. Die Salze sind gegen den Testorganismus Glomerella cingulata aktiv.
Besonders wirksam ist Phytostreptin gegen Pilze. Ausserdem besitzt es antibakterielle Eigenschaften.
Sein in vitro Wirkungsspektrum gegen eine Anzahl von Pilzen und Bakterien wird in Tabelle Il gezeigt.
Ausserdem entwickelt es in einem Papierrundfilter-Agarplatten-Analysentest unter Verwendung von Kartoffeldextroseagar Hemmzonen gegen Ceratostomella ulmi (Ceratocystis ulmi), den Verursacher der Holländischen Ulmenkrankheit, bei etwa 40 /ml.
Die in Tabelle II mitgeteilten Tests wurden in Schrägagarröhrchen unter Verwendung von Agarmedien, die verschiedene Konzentrationen von Phytostreptin im Bereich von 0,01 bis 197 11/mol enthielten, gemacht. Hiezu wurde folgendes Verfahren verwendet : Die Tests liefen in schrägen Kulturröhrchen unter Verwendung eines Agarmediums, das verschiedene Konzentrationen des Antibiotikums im Bereich von 0,01 bis 197 u/ml enthielten. Für alle Pilzkulturen wurde Kartoffeldextroseagar verwendet. FürCandida albicans und die Bakterienkulturen wurde Penassaysamenagar verwendet. Für die Dermatophyten Epidermophyton floccosum, Microsporum gypseum und Trichophyton mentagrophytes wurde Sabouraudmaltoseagar verwendet.
Die Agarmedien wurden mit den jeweiligen Testorganismen angeimpft und bei 280C inkubiert, bis das Kontrollröhrchen, welches kein Antibiotikum enthielt, gutes Wachstum anzeigte (ungefähr 2 - 4 Tage für die Pilzkulturen und 1 Tag für C albicans und die Bakterienkulturen). Dann wurde für jeden dieser Organismen die Hemmkonzentration festgestellt. Eine Kultur, Endoconidiophora fagacearum (Ceratocystis fagacearum), der Verursacher des Eichenwelkens, wurde weitere 4 Wochen inku-
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biert, ohne die Änderung der hemmenden Konzentration von Phytostreptin (0,3 J1./ml) zu zeigen. Versuche, aus den gehemmten Ansätzen E. fagacearum (C. fagacearum) zu isolieren, hatten keinen Erfolg.
Tabelle II
In vitro antimikrobielles Wirkungsspektrum von Phytostreptin
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<tb>
<tb> Hemmung <SEP> der <SEP> Kultur <SEP> bei <SEP> der <SEP> angegebenen
<tb> Konzentration <SEP> (p/ml)
<tb> Kultur <SEP> Nach <SEP> anfänglichem <SEP> 2 <SEP> Tage <SEP> später <SEP> 4 <SEP> Tage <SEP> später
<tb> Wachstum
<tb> Alternaria <SEP> dianthi <SEP> 2,4 <SEP> 2,4 <SEP> 2,4
<tb> Alternaria <SEP> solani <SEP> 0,8 <SEP> 0,8 <SEP> 0,8
<tb> Botrytis <SEP> gladiolorum <SEP> 0,8 <SEP> 0,8 <SEP> 2,4
<tb> Botrytis <SEP> cimerea <SEP> 2,4 <SEP> 2,4 <SEP> 2,4
<tb> Collectotrichum <SEP> circinans <SEP> 0,8 <SEP> 2,4 <SEP> 2,4
<tb> Diplodia <SEP> zeae <SEP> 2,4 <SEP> 2,4 <SEP> 2,4
<tb> Endoconidiophera <SEP> fagacearum <SEP> 0,3 <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP>
<tb> (Ceradocystis <SEP> fagacearum)
<tb> Endoconidiophora <SEP> fimbriata <SEP> 0,8 <SEP> 0, <SEP> 8 <SEP> 0,
8
<tb> (Ceratocystis <SEP> fimbriata)
<tb> Endothia <SEP> parasitica <SEP> 0,8 <SEP> 2,4 <SEP> 2,4
<tb> Fusarium <SEP> oxy. <SEP> f. <SEP> dianthi <SEP> 5A <SEP> 7,3 <SEP> 7, <SEP> 3 <SEP> - <SEP> 197+ <SEP> 7, <SEP> 3 <SEP> - <SEP> 197+ <SEP>
<tb> Fusarium <SEP> oxy. <SEP> f. <SEP> gladioli <SEP> 2,4 <SEP> 2, <SEP> 4 <SEP> - <SEP> 197+ <SEP> 2, <SEP> 4 <SEP> - <SEP> 197+ <SEP>
<tb> Fusarium <SEP> roseum <SEP> 2,4 <SEP> 7,3 <SEP> 22
<tb> Giberella <SEP> zeae <SEP> 7, <SEP> 3 <SEP> 7, <SEP> 3 <SEP> -197+ <SEP> 22 <SEP> - <SEP> 197+ <SEP>
<tb> Glomerella <SEP> cingulata <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP> 0,8 <SEP> 2,4
<tb> Helminthosporium <SEP> sativum <SEP> 0,8 <SEP> 2,4 <SEP> 2,4
<tb> Helminthosporium <SEP> victoria <SEP> 0,8 <SEP> 0,8 <SEP> 0,8
<tb> Macrophominia <SEP> phaseoli <SEP> 2,4 <SEP> 2,4 <SEP> 2,4
<tb> Phytophthora <SEP> cinnamom1 <SEP> 7,3 <SEP> 7,
<SEP> 3 <SEP> - <SEP> 197+ <SEP> 7, <SEP> 3 <SEP> - <SEP> 197+ <SEP>
<tb> Pythium <SEP> sp. <SEP> Nr. <SEP> 389 <SEP> 7, <SEP> 3 <SEP> 22 <SEP> 22
<tb> Selerotina <SEP> fructicola <SEP> 0,8 <SEP> 0,8 <SEP> 2,4
<tb> Rhizoctonia <SEP> solani <SEP> 2,4 <SEP> 2,4 <SEP> 2, <SEP> 4 <SEP> - <SEP> 197+ <SEP>
<tb> Verticillium <SEP> albo-atrum <SEP> 0,8 <SEP> 2,4 <SEP> 2,4
<tb> Candida <SEP> albicans <SEP> 2,4 <SEP> 2,4 <SEP> 2,4
<tb> Epidermop1iyton <SEP> floccosum <SEP> 0,8 <SEP> 0, <SEP> 8 <SEP> 2,4
<tb> Microsporum <SEP> gypseum <SEP> 2,4 <SEP> 2,4 <SEP> 2,4
<tb> Trichophyton <SEP> mengagrophytes <SEP> 0,8 <SEP> 2, <SEP> 4 <SEP> 2,4
<tb> Bacillus <SEP> cereus <SEP> 7,3 <SEP> 22 <SEP> 22
<tb> Bacillus <SEP> cereus <SEP> var.
<SEP> mycoides <SEP> 7, <SEP> 3 <SEP> 22 <SEP> 22
<tb> Bacillus <SEP> megatherium <SEP> 7,3 <SEP> 7,3 <SEP> 7, <SEP> 3 <SEP>
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> 7, <SEP> 3 <SEP> 22 <SEP> 22
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> > <SEP> 197+++ <SEP> > 197 <SEP> > 197 <SEP>
<tb> Micrococcus <SEP> flavus <SEP> 0,3 <SEP> 2,4 <SEP> 2,4
<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes <SEP> var. <SEP> 2,4 <SEP> 7,3 <SEP> 7,3
<tb> aureus
<tb> Mycobacterium <SEP> tubercu- <SEP> > 197+++ <SEP> > <SEP> 197 <SEP> > 197
<tb> losis <SEP> Nr. <SEP> 607 <SEP>
<tb> Sacina <SEP> lutea <SEP> 2,4 <SEP> 2, <SEP> 4 <SEP> 2,4
<tb> Fomes <SEP> igniarius <SEP> var.
<SEP> 0, <SEP> 03 <SEP> 0, <SEP> 09 <SEP> 0,09
<tb> populinus
<tb> Fomes <SEP> igniarius <SEP> 0,09 <SEP> 0,27 <SEP> 0,81
<tb>
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Tabelle II (Fortsetzung)
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<tb>
<tb> Hemmung <SEP> der <SEP> Kultur <SEP> bei <SEP> der <SEP> angegebenen
<tb> Konzentration <SEP> (j-t/ml)
<tb> Kultur <SEP> Nach <SEP> anfänglichem <SEP> 2 <SEP> Tage <SEP> später <SEP> 4 <SEP> Tage <SEP> später
<tb> Wachstum <SEP> ++
<tb> Fomes <SEP> everhartii <SEP> 0,09 <SEP> 0, <SEP> 27 <SEP> 0, <SEP> 27
<tb> Poria <SEP> obligua <SEP> 2,4 <SEP> 2,4 <SEP> 2,4
<tb> Polyporus <SEP> glomeratus <SEP> 0,27 <SEP> 0,81 <SEP> 0, <SEP> 81 <SEP>
<tb>
+ Teilhemmung der Kultur ++ Hemmungsbestimmungen wurden gemacht, wenn das Kontrollröhrchen gutes Wachstum zeigte,
gewöhnlich 1 - 4 Tage *+ Bei dieser Konzentration keine Hemmung
Phytostreptin und seine oben angeführten einfachen und komplexen Salze erwiesen sich bei Gewächshausversuchen als wirksame Fungizide für die Kontrolle von Pflanzenkrankheiten, wie früher Tomatenmehltau, später Tomatenmehltau und Bohnenrostpilz. Diese Krankheiten werden durch Alternaria solani (Ell. & Mort.) Jenes & Grout bzw. Phytophthora infestans (Mont. ) de Bary und Uromyces phaseoli (Pers.) Wint. verursacht.
Phytostreptin wird durch Kultivierung eines Gliedes der Familie Streptomycetaceae, insbesondere eines Stammes der Art Streptomyces hygroscopicus, gewonnen. Eine Kultur von einem Stamm eines Mikroorganismus, der aus heimischer US-Erde isoliert wurde und der Phytostreptin herstellt, wurde in der oben angeführten Kulturensammlung aufbewahrt und mit der Nummer NRRL 2751 bezeichnet.
Der Organismus NRRL 2751 bildet spiralförmige Sporenträger und die leicht ovalen bis kugelförmigen Sporen haben einen Durchmesser von 1 bis 1, 3 u. Die Wachstumseigenschaften des Organismus wurden
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Hiebei wurden folgende Wachstumseigenschaften beobachtet, wobei die Luftmycelfarben nach Ridgeway (oben angegeben) beschrieben werden.
Asparagin-Glukose-Fleischextraktagar Ausgezeichnetes Wachstum mit neutralgrauem
Luftmycel. Hellgelbbraune Unterseite und hell- braun lösliches Pigment.
Bennett's Agar Ausgezeichnetes Wachstum mit farblosem trockenem Vegetativmycel. Hellgelbbraune Unter- seite und hellbraun lösliches Pigment.
Maismaischwasseragar (Waksman) Ausgezeichnetes Wachstum mit farblosem trockenem (nach 7 Tagen feuchtem) gefal- tetem Vegetativmycel. Bildung eines spärli- chen weissen Luftmycels nach 30 Tagen.
Hellgelbbraune Unterseite mit schönem starkbraun löslichem Pigment.
Czapek Agar (Difco) Ausgezeichnetes Wachstum mit blass- bis hellneutralgrauem Luftmycel. Nach 30 Tagen
Bildung schwarzer Bereiche, die nach 44 Tagen nicht feucht werden. Hellgelbbraune Unter- seite und hellbraun lösliches Pigment.
Gelatine (Waksman) Nach 9 Tagen verflüssigt.
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HafermehI-Hefeextraktagar Ausgezeichnetes Wachstum mit neutralgrauem
Luftmycel. Nach 30 Tagen Bildung schwarzer
Bereiche, die nach 44 Tagen nicht feucht werden.
Kartoffeldextroseagar Ausgezeichnetes Wachstum mit hellneutral-bis neutralgrauem Luftmycel. Gelbbraune Unterseite und hellbraun lösliches Pigment.
Kartoffelkeile Geringes Wachstum mit farblosem Vegetativ- mycel. Weiss- bis hellgrau an den trocknenden
Spitzen. Nach 44 Tagen Bildung schwarzer
Bereiche am unteren Ende.
Stärkeagar (Difco) Ausgezeichnetes Wachstum mit mausgrauem
Luftmycel. Hellgelbbraune Unterseite und schwachbraun lösliches Pigment.
Hefeextraktagar (Waksman) Ausgezeichnetes Wachstum mit hellrauchgrauem
Luftmycel. Bildung dunkelgrauer Bereiche nach
30 Tagen, kein Feuchtwerden nach 44 Tagen, hellgelbbraune Unterseite und hellbraun lösliches
Pigment.
Zu den obigen Ergebnissen gehören die charakteristischen dunklen Bereiche von S. hygroscopicus, die sich auf Czapek-Agar, Hafermehl-Hefeextraktagar, Kartoffelkeilen und Hefeextraktagar zeigten. Ausserdem zeigte der Organismus feuchte schwarze Bereiche auf jahrelang eingefrorenem Hefeschrägagar. Auf einer Anzahl Medien bildete der Organismus auch das charakteristische graufarbige Luftmycel und die charakteristischen kompakten sporentragenden Hyphen wurden auf Agarmedien wie Asparagin-GlukoseFleischextraktagar, Kartoffeldextroseagar und Hafermehl-Hefeextraktagar gebildet.
Zur Vervollständigung der Beschreibung des neuen Mikroorganismus seien noch die folgenden Merkmale entsprechend den Richtlinien in "International Bulletin of Bacteriological Nomenclature and Taxonomy", Vol. 13, Nr. 3, 15.7. 1963, S. 169-170, angeführt : a) Morphologische Beobachtungen.
1. Morphologie der sporentragenden Hyphen : Sporenbildende Hyphen, die monopodial verzweigt sind, zahlreiche kurze, enge, kompakte, linksgewundene Spiralen erzeugen und als dichte Klümpchen an den Hauptstämmen der Lufthyphen sitzen.
2. Sporenzahl : Die Mehrzahl der Sporen scheint einzeln aufzutreten. Die leicht ovalen bis kugelförmigen Sporen haben einen Durchmesser von 1 bis l, 3 p.
3. Globulare Sporangien und
4. mit Geisseln versehene Sporen wurden nicht beobachtet.
5. Neigung zur Bildung eines Luftmycels : Der Stamm NRRL 2751 bildet ein gut entwickeltes, grau gefärbtes Mycel auf gewissen Medien, das schwarze, feuchte, glitzernde glänzende Flecke bildet und schliesslich ganz schwarz wird.
6. Bildung von Conodiophoren und Conidien : Sporen werden in speziellen sporentragenden Hyphen oder Sporophoren (Sporenträgern) gebildet, die aus dem Luftmycel herauswachsen (s. 1).
7. Keine Tendenz des Mycels zum Zerfallen in Fragmente. b) Farbe : Die Farben von Kulturen auf verschiedenen Medien wurden weiter oben angegeben (s. auch USA-Patentschrift Nr. 3, 032,470). c) Physiologische Merkmale.
1. Melaminerzeugung : Der Stamm NRRL 2751 ist melamin-negativ.
2. Verwertung der folgenden Kohlehydrate : d-Glucose, 1-Arabinose, Sucrose, d-Xylose, 1-Inosit, d-Mannit, d-Lävulose (Fructose) sowie Kontrolle ohne Kohlehydrate alle positiv.
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d) Temperatur : bei 28,34, 37 C positiv, gutes Wachstum, bei 400C sehr spärliches Wachstum, bei 500C negativ. e) Mikroaerophiles Wachstum : Gemäss der Definition des "Manual of Microbiological Methods" der
Society of American Bacteriologists ("Wachstum nur unter niedriger Sauerstoffspannung") lässt sich der
Stamm NRRL 2751 als obligater aerober Organismus klassifizieren.
Das neue fungizide Antibiotikum kann durch Fermentierung eines Nährmediums mit dem Phytostrep- tin produzierenden Mikroorganismus Streptomyces hygroscopicus NRRL 2751 hergestellt werden. Vorzugs- weise wird ein wässeriges Nährmedium so lange aerob und unter Rühren und Wasserüberflutung fermen- tieit, bis eine beträchtliche fungizide Aktivität gebildet ist. Die Fungizide können routinemässig mit der
Agarplattenanalysenmethode unter Verwendung von Glomerella cingulata oder Candida albicans als Test- organismen bestimmt werden.
Nährmedien, die zur Herstellung der Fungizide geeignet sind, enthalten eine geeignete Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff, vorzugsweise einen Kohlenwasserstoff wie Glukose, eine Quelle für assimi- lierbaren Stickstoff wie Soyamehl, Maismaischwasser, Hefe u. ähnl. und Mineralsalze, die zusammen mit den andern Ingredienzien wie Maismaischwasser vorhanden sein können. Eine Impfmenge des Orga- nismus wird hergestellt, indem man ihn auf Agarschrägmedien wie Hafermehl oder Pepton-Hefeextrakt wachsen lässt. Diese Agarschrägkulturen lassen sich dann dazu verwenden, grössere Impfmengen durch
Besäen von Schüttelflaschen, die Medien wie Soyamehl und Maismaischwasser enthalten, herstellen.
Diese Flaschen werden dann unter Bedingungen geschüttelt, die für das Wachstum des Organismus geeignet sind. Die Schüttelflaschenkulturen können dann zur Herstellung noch grösserer Impfmengen oder zum direkten Besäen der Gärbottiche verwendet werden. Während der Herstellung der Impfmenge und während der darauffolgenden Vergärung müssen aseptische Bedingungen aufrechterhalten werden.
Für die Gärung wird das gewünschte Medium hergestellt und sein PH auf etwa 6, 3-7, 5, vorzugsweise 6, 7-7, 2, eingestellt. Im bevorzugten Medium ist Kalziumkarbonat enthalten. Das so hergestellte Medium wird durch Erhitzen auf etwa 120 C unter Druck sterilisiert. Dann wird es auf ungefähr 24-36 C, vorzugsweise 27-24 C, abgekühlt. Das sterile Medium wird dann aseptisch beimpft mit dem wie oben beschrieben hergestellten Impfstoff.
Die Gärung schreitet dann unter Rühren und Beatmung unter Verwendung steriler Luft bei einer Temperatur im oben angegebenen Bereich fort. Die Gärungsdauer kann bei verschiedenen Medien und verschiedenen Arbeitsbedingungen variieren. Die Luft wird gewöhnlich mit einer Geschwindigkeit von etwa 0, 25 bis 1, 5 Volumen Frischluft je Volumen Medium pro Minute angeboten. Die Gärung wird dann genügend lange fortgesetzt, um optimale und vorzugsweise maximale Produktion von Phytostreptin oder Phytoactin, je nachdem, zu erhalten. Gewöhnlich ist eine Fermentationsdauer von 48 bis 96 h ausreichend.
Das Fungizid lässt sich nach einer Anzahl von Verfahren gewinnen oder man verwendet die ganze Kultur oder die ganze Brühe als solche oder konzentriert oder trocknet sie auf geeignete Weise. Normalerweise wird es vorgezogen, das Fungizid durch Ausfällung oder Lösungsmittelextraktion aus der Gesamtkultur oder Brühe zu gewinnen. Beim Gewinnungsverfahren durch Ausfällen wird die ganze Kultur gewöhnlich filtriert oder in einem bevorzugten pH-Bereich von 7 bis 8 zentrifugiert und das Filtrat auf einen bevorzugten PH-Bereich von 3 bis 5 zur Ausfällung des Fungizids angesäuert. Als Säure wird für diesen Fällungsschritt Salzsäure bevorzugt, obwohl auch andere Säuren verwendet werden können. Da das Kulturmycel beträchtliche Mengen Fungizid enthält, kann man auch die ganze Kultur (ohne Filtration) zum Ausfällen auf PH 3 - 5 einstellen.
Aus dem Niederschlag oder Sediment lässt sich die Aktivität durch Extraktion mit einer geeigneten organischen Flüssigkeit, in der sie löslich ist, gewinnen, wie Methanol, Äthanol, Isopropanol, Butanol, Aceton oder Methylisobutylketon. Diese Lösungsmittellösung kann dann im Vakuum eingeengt werden und der erhaltene Rückstand mit organischen Lösungsmitteln weiter extrahiert werden. Bei der bevorzugten Gewinnungsmethode wird letzterer Rückstand nach dem Eindampfen erschöpfend mit Methylisobutylketon extrahiert und die Lösung in diesem Lösungsmittel im Vakuum auf ein kleines Volumen konzentriert.
Durch Zugabe von 5 Volumen Diäthyläther kann das Fungizid dann ausgefällt werden. Das in der Methylisobutylketon-Äther-Mutterlauge zurückbleibende Fungizid lässt sich durch Konzentrieren der Mutterlauge im Vakuum auf ein kleines Volumen und Zugabe von 5 Volumen Petroläther (, 30-600C) zum Ausfällen der Aktivität gewinnen. Wahlweise kann auch ein Lösungsmittelextrakt der Gesamtkultur, Gesamtbrühe oder des aktiven ausgefällten Sediments als solches oder nach der Konzentrierung im Vakuum ohne weitere Reinigung verwendet werden.