AT246333B

AT246333B - Verfahren zur Herstellung des neuen fungiziden Antibiotikums Phytoactin (Polyamidohygrostreptin)

Info

Publication number: AT246333B
Application number: AT884261A
Authority: AT
Original assignee: Pabst Brewing Co
Priority date: 1961-11-22
Filing date: 1961-11-22
Publication date: 1966-04-12

Description


   <Desc/Clms Page number 1> 
 



  Verfahren zur Herstellung des neuen fungiziden Antibiotikums
Phytoa ctin (P olyamidohygrostreptin) 
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung des neuen fungiziden Antibiotikums Phytoactin   (Polyamidohygrostreptin),   welches darin besteht, dass man ein übliches Nährmedium mit dem Stamm NRRL 2752 von Streptomyces hygroscopicus fermentiert und das erhaltene Antibiotikum durch eine an sich bekannte Methode, beispielsweise durch Ausfällen oder   Lösungsmittelextraktion,   aus der   Garflüssigkeit   gewinnt. 



   Dem neuen fungiziden Antibiotikum wurde der willkürliche Name Phytoactin gegeben. 



   Phytoactin ist ein Polypeptid, das keine endständige freie Aminogruppe besitzt, wie durch seine chemischen und physikalischen Eigenschaften unten gezeigt wird. Es ist ein hellbrauner Feststoff und ist löslich in   Methanol, Äthanol, Isopropanol, n-Butanol,   Chloroform, Aceton, Methylisobutylketon, Di- 
 EMI1.1 
 Ninhydrinteste. Mit kalter konzentrierter Schwefelsäure gibt es keine Farbe. Aus wässerig-methanolischen Lösungen wird es durch Ammonsulfat, Kalziumchlorid, Kuprichlorid, Bleiacetat, Quecksilberchlorid, Natriumchlorid, Zinkchlorid, Pikrinsäure, Salicylsäure, Phosphorwolframsäure, Trichloressigsäure, Methylorange und Reineckesalz ausgefällt. 



   Weiter gibt Phytoactin einen positiven Biurettest und negative Millon-, Liebermann-Buchard-, Maltol-, Pauly-,   Ehrlich (Dimethylaminobenzaldehyd) - und Sakaguchiteste.   



   Dass dieses Antibiotikum ein Polypeptid ist, wurde durch Hydrolyse mit 6 n HC1 gezeigt. Das nunmehr ninhydrinpositive Hydrolysat wurde unter Verwendung zweidimensionaler Papierchromatographie analysiert. Hiebei wurde das Vorhandensein von mindestens acht ninhydrinpositiven Komponenten entdeckt, von denen die Aminosäuren Valin,   a-Alanin,   Prolin, Leucin (oder Isoleucin), Arginin, Glycin und Serin identifiziert wurden. 



   Phytoactin (in methanolischer Lösung) ist hitzestabil, und nach siebentätigem Erhitzen auf   400C   oder dreistündigem auf   650C   unverändert. Es ist dialysierbar durch eine Cellophanmembrane   (300/0   wässeriges Methanol). Durch   Pepsin, Trypsin, gereinigte Bacillus sUbti1is-Bakterienprotease   von Pabst oder gereinigte Aspergillus oryzae-Pilzprotease von   Pabst   wird es nicht verdaut. Phytoactin zeigt eine starke Endabsorption in den niedrigen   UV-Bereichen   ohne besondere Maxima im Bereich 230-410 230-410   mfl.   Die Bestimmungen wurden in Methanol (100   /mol)   mit einem Beckman DU Spektrophotometer gemacht. 



   Wenn Phytoactin in Chloroform gelöst ist, zeigt es eine Anzahl charakteristischer Absorptionsbanden 
 EMI1.2 
 :Das Spektrum wurde mit einem Perkin-Elmer Modell 21   Doppelstrahl-Infrarotspektrophctometer,   Serien No. 760, erhalten (Verstärkung 5, 0, Auflösung   l,   0, Geschwindigkeit 5,0, Dämpfung   3.   0). 



   Um die Absorption des   Lösungsmittels   Chloroform zu eliminieren, wurde das Infrarotabsorptionsspektrum von Phytoactin auch in einem Kaliumbromidpressling auf einen Baird Modell 455 I.   R. -Spektro-   photometer aufgenommen. Hiebei zeigt sich eine verhältnismässig geringe Veränderung gegenüber der 

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 Bestimmung in   Chloroformlosung.   Phytoactin zeigt starke Absorptionsbanden an den folgenden für Peptidbindungen charakteristischen Stellen, ausgedrückt in li und daneben in Wellenzahlen in reziproken Zen- 
 EMI2.1 
 
 EMI2.2 
 
<tb> 
<tb> 2, <SEP> 77-3,Lösungsmittel <SEP> pK <SEP> Äquivalentgewicht <SEP> Anmerkungen
<tb> Wasser <SEP> 2,4 <SEP> 400 <SEP> - <SEP> 500 <SEP> g/Mol <SEP> keine <SEP> freie <SEP> Aminogruppe
<tb> 70) <SEP> Methanol <SEP> 3,

   <SEP> 4 <SEP> 3000 <SEP> g/Mol <SEP> keine <SEP> freie <SEP> Aminogruppe
<tb> 
 
Phytoactin zeigt einen unscharfen Schmelzpunkt, beginnend etwa bei   150 C,   und es schmilzt offenbar unter Zersetzung. Die Schmelzbereiche wurden in einer zugeschmolzenen Kapillare im Ölbad wie   folgt bestimmt : 154-162, 148-168   und   148-171 C.   
 EMI2.3 
 
 EMI2.4 
 
<tb> 
<tb> :C <SEP> H <SEP> N
<tb> 56,48 <SEP> 8,28 <SEP> 12,46
<tb> 56,71 <SEP> 8,28 <SEP> 12,24
<tb> 57,12 <SEP> 8,11 <SEP> 12,57
<tb> 57,14 <SEP> 8, <SEP> 34 <SEP> 12,57
<tb> Mittelwert <SEP> : <SEP> 56, <SEP> 86 <SEP> 8, <SEP> 25 <SEP> 12,46
<tb> 
 
Es wurden 0, Wo Amidstickstoff gefunden ; Schwefel und Halogen sind nicht vorhanden. 



   Als Molekulargewicht von Phytoactin wurde 46, 000 (plus oder minus   lOgo) mit   der Ehrenberg'schen Modifikation der Archibald-Methode für die Einstellung des Sedimentationsgleichgewichtes bestimmt. 



  Es wurden zwei Bestimmungen in der Ultrazentrifuge gemacht, in 0, 01 molaren "Tris" Puffer PH 7. 2 unter Zusatz von 0, 05 molar   NaCl   als Trägerelektrolyt. 



   Phytoactin, das wie hier beschrieben, erhalten wurde, erfüllt das erste Kriterium für Homogenität in der Ultrazentrifuge in "Ultrazentrifugengeschwindigkeits"-Experimenten. Das Material zeigte hiebei nur eine sedimentierende Grenzlinie, die während der ganzen Experimente symmetrisch blieb. Phytoactin wurde durch eindimensionale Papierchromatographie unter Verwendung von Whatmanpapier No. 1 und den in Tabelle I angegebenen Lösungsmittelsystemen untersucht. Die entwickelten Chromatogramme wurden bei Zimmertemperatur an der Luft getrocknet und auf mit Glomerella cingulata angeimpften Agarplatten bioautographiert. 



   Tabelle I : 
Chromatographische Daten für Phytoactin 
 EMI2.5 
 
<tb> 
<tb> System <SEP> rip <SEP> Bemerkungen <SEP> Laufzeit, <SEP> Stunden
<tb> Wassergesättigter <SEP> n-Butanol <SEP> 0, <SEP> 96 <SEP> gut <SEP> ausgeprägter <SEP> Fleck <SEP> 16
<tb> n-Butanol-EssigsäureWasser <SEP> (2-1-1) <SEP> 0,94 <SEP> gut <SEP> ausgeprägter <SEP> Fleck <SEP> 16
<tb> n-Butanol-PyridinWasser <SEP> (1-0, <SEP> 6-1) <SEP> 0,97 <SEP> gut <SEP> ausgeprägter <SEP> Fleck <SEP> 16
<tb> 3% <SEP> wässeriges <SEP> NH4Cl <SEP> 0,02 <SEP> gut <SEP> ausgeprägter <SEP> Fleck <SEP> 4
<tb> 50P/o <SEP> wässeriges <SEP> Aceton <SEP> {0. <SEP> 52 <SEP> Schwanzbildung
<tb> 0,94 <SEP> gut <SEP> ausgeprägter <SEP> Fleck <SEP> 6
<tb> Benzol-EssigsäureWasser <SEP> (2-2-1, <SEP> organische <SEP> Phase) <SEP> 0, <SEP> 18 <SEP> Schwanzbildung <SEP> 16
<tb> tert.

   <SEP> Butanol-EssigsäureWasser <SEP> (74-3-25) <SEP> 0,89 <SEP> gut <SEP> ausgeprägter <SEP> Fleck <SEP> 28
<tb> 
 

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Die chromatographischen Daten für Phytoactin stehen in Übereinstimmung mit der ungewöhnlichen Löslichkeit dieses Polypeptids in Fettlösungsmitteln wie Aceton, Methylisobutylketon und Chloroform. 



   Phytoactin ist besonders wirksam gegen Pilze. Es besitzt aber auch antibakterielle Wirkungen. Sein in vitro Wirkungsspektrum gegen eine Anzahl von Pilzen und Bakterien wird in Tabelle n gezeigt. Diese Tests liefen in schrägen Kulturröhrchen unter Verwendung eines Agarmediums, das verschiedene Konzen- 
 EMI3.1 
 toffeldextroseagar verwendet. Für Candida albicans und die Bakterienkulturen wurde Penassaysamenagar verwendet. Für die Dermatophyten Epidermophyton Floccosum, Microsporum gypseum und Trichophyton mentagrophytes wurde Sabouraudmaltoseagar verwendet. Die Agarmedien wurden mit den jeweiligen Testorganismen angeimpft und bei   280C   inkubiert, bis das   Kontrollröhrchen,   welches kein Antibiotikum enthielt, gutes Wachstum anzeigte (ungefähr 2-4 Tage für die Pilzkulturen und 1 Tag für C albicans und die Bakterienkulturen).

   Dann wurde für jeden dieser Organismen die Hemmkonzentration von Phytoactin festgestellt. Dann wurde weitere 4 Tage inkubiert und zwei weitere Hemmungsablesungen vorgenommen ; u. zw. 2 bzw. 4 Tage nach der ersten Ablesung. Eine Kultur, Endoconidiophora fagacearum (Ceratocystis fagacearum), der das Verwelken von Eichen verursacht, wurde weitere 4 Wochen inkubiert, ohne dass sich eine Änderung der zur Hemmung erforderlichen Phytoactinkonzentration (0,   3/l/ml)   ergab. Versuche, E. fagacearum (C. fagacearum) aus den gehemmten Ansätzen zu isolieren, hatten keinen Erfolg.

   Eine andere Kultur, Ceratostomella ulmi (Ceratosystis   ulmi),   der Verursacher der Holländischen Ulmenkrankkeit, wurde ebenfalls weitere 4 Wochen inkubiert, ohne dass eine Änderung in der zur Hemmung erforderlichen Phytoactinkonzentration   (0,     8/l/ml)   eintrat. Versuche, C. ulmi aus den gehemmten Ansätzen zu isolieren, hatten keinen Erfolg. 



   Tabelle II : 
In-vitro-antimikrobielles Wirkungsspektrum von Phytoactin 
 EMI3.2 
 
<tb> 
<tb> Hemmung <SEP> der <SEP> Kultur <SEP> bei <SEP> der <SEP> angegebenen <SEP> Konzentration <SEP> (wol)
<tb> Kultur <SEP> Nach <SEP> anfänglichem <SEP> 2 <SEP> Tage <SEP> später <SEP> 4 <SEP> Tage <SEP> später
<tb> Wachstum <SEP> +fi <SEP> 
<tb> Alternaria <SEP> dianthi <SEP> 0,8 <SEP> 2,4 <SEP> 7, <SEP> 3
<tb> Alternaria <SEP> solani <SEP> 0,8 <SEP> 0,8 <SEP> 0,8
<tb> Botrytis <SEP> gladiolorum <SEP> 2,4 <SEP> 2,4 <SEP> 2,4
<tb> Botrytis <SEP> cinerea <SEP> 0,8 <SEP> 2,4 <SEP> 2,4
<tb> Ceratostomelle <SEP> ulmi
<tb> (Ceratocystis <SEP> ulmi) <SEP> 0,8 <SEP> 0,8 <SEP> 0, <SEP> 8
<tb> Cellectotrichum <SEP> circinans <SEP> 0,8 <SEP> 0,8 <SEP> 0, <SEP> 8
<tb> Diplodia <SEP> zeae <SEP> 0,8 <SEP> 2,4 <SEP> 7, <SEP> 3
<tb> Endoconidiophora <SEP> fagacearum
<tb> (Ceratocystis <SEP> fagacearum)

   <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP> 0,3 <SEP> 0. <SEP> 3
<tb> Endoconidiophora <SEP> fimbriata
<tb> (Ceratocystis <SEP> fimbriata) <SEP> 0,8 <SEP> 0,8 <SEP> 0, <SEP> 8
<tb> Endothia <SEP> parastica <SEP> 0. <SEP> 8 <SEP> 0, <SEP> 8 <SEP> 2. <SEP> 4
<tb> Fusarium <SEP> oxy. <SEP> f. <SEP> dianthi <SEP> 5a <SEP> 2, <SEP> 4 <SEP> 2, <SEP> 4- <SEP> 197+ <SEP> 2, <SEP> 4- <SEP> 197+ <SEP> 
<tb> Fusarium <SEP> oxy. <SEP> f. <SEP> gladioli <SEP> 0. <SEP> 8 <SEP> 7, <SEP> 3 <SEP> 2. <SEP> 4-197+
<tb> Fusarium <SEP> roseum <SEP> 2, <SEP> 4 <SEP> 7, <SEP> 3 <SEP> 7, <SEP> 3
<tb> Gibberella <SEP> zeae <SEP> 7, <SEP> 3 <SEP> 22-197+ <SEP> 197.. <SEP> 
<tb> 



  Glomerella <SEP> cingulata <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP> 0, <SEP> 8 <SEP> 0,8
<tb> Helminthosporium <SEP> sativum <SEP> 0, <SEP> 8 <SEP> 0,8 <SEP> 0, <SEP> 8
<tb> 
 

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 TabelleII (Fortsetzung): 
 EMI4.1 
 
 EMI4.2 
 
<tb> 
<tb> Hemmung <SEP> der <SEP> Kultur <SEP> bei <SEP> der <SEP> angegebenen <SEP> Konzentration <SEP> ( <SEP> /ml)
<tb> Kultur <SEP> Nach <SEP> anfänglichem <SEP> 2 <SEP> Tage <SEP> später <SEP> 4 <SEP> Tage <SEP> später
<tb> Wachstum <SEP> * <SEP> 
<tb> Helminthosporium <SEP> victoria <SEP> 0, <SEP> 8 <SEP> 0, <SEP> 8 <SEP> 0, <SEP> 8
<tb> Macrophominia <SEP> phaseoli <SEP> 2,4 <SEP> 2,4 <SEP> 2,4
<tb> Phytophthoracumomomi <SEP> 7, <SEP> 3 <SEP> 22 <SEP> - <SEP> 197+ <SEP> 22 <SEP> - <SEP> 197+
<tb> Pytbiumsp. <SEP> No.

   <SEP> 389 <SEP> 2, <SEP> 4 <SEP> 22 <SEP> 22
<tb> Rhizoctonia <SEP> solani <SEP> 2,4 <SEP> 2,4 <SEP> 2,4
<tb> Sclerotina <SEP> fructicola <SEP> 0, <SEP> 8 <SEP> 0, <SEP> 8 <SEP> 0, <SEP> 8 <SEP> 
<tb> Ustilago <SEP> sphaerogena <SEP> 2,4 <SEP> 2,4 <SEP> 2,4
<tb> Verticillium <SEP> albo <SEP> atrum <SEP> 0, <SEP> 8 <SEP> 2, <SEP> 4 <SEP> 2, <SEP> 4 <SEP> 
<tb> Candida <SEP> albicans <SEP> 2,4 <SEP> 2,4 <SEP> 2,4
<tb> Epidermophyton <SEP> floccosum <SEP> 0, <SEP> 8 <SEP> 0, <SEP> 8 <SEP> 0, <SEP> 8
<tb> Microsporum <SEP> gypseum <SEP> 2, <SEP> 4 <SEP> 2, <SEP> 4 <SEP> 2, <SEP> 4 <SEP> 
<tb> Trichophyton <SEP> mentagrophytes <SEP> 0, <SEP> 8 <SEP> 0, <SEP> 8 <SEP> 0, <SEP> 8 <SEP> 
<tb> Bacillus <SEP> cereus <SEP> 7,3 <SEP> 22 <SEP> 22
<tb> Bacillus <SEP> cereus <SEP> var.mycoides <SEP> 7,3 <SEP> 22 <SEP> 22
<tb> Bacillus <SEP> megatherium <SEP> 7, <SEP> 3 <SEP> 7, <SEP> 3 <SEP> 7,

   <SEP> 3
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> 22 <SEP> 22 <SEP> 22
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> > 197- <SEP> > 197 <SEP> > 197
<tb> Micrococcus <SEP> flavus <SEP> 2,4 <SEP> 2,4 <SEP> 2,4
<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes
<tb> var. <SEP> aureus <SEP> 7, <SEP> 3 <SEP> 22 <SEP> 22
<tb> Mycobacterium <SEP> tuberculosis
<tb> No. <SEP> 607 <SEP> > 197+++ <SEP> > 197 <SEP> > 197
<tb> Sarcinalutea <SEP> 7, <SEP> 3 <SEP> 22 <SEP> 22
<tb> Fomes <SEP> igniarius <SEP> var. <SEP> populinus <SEP> 0, <SEP> 03 <SEP> 0,03 <SEP> 0,03
<tb> Fomes <SEP> igniarius <SEP> 0,03 <SEP> 0,09 <SEP> 0,09
<tb> Fomes <SEP> everhartii <SEP> 0,27 <SEP> 0, <SEP> 27 <SEP> 0, <SEP> 27
<tb> Poria <SEP> obligua <SEP> 0, <SEP> 09 <SEP> 0, <SEP> 27 <SEP> 0, <SEP> 27
<tb> Polyporus <SEP> glomeratus <SEP> 0,03 <SEP> 0,09 <SEP> 0,27
<tb> 
 + Teilweise Hemmung der Kultur. 



   ++ Ablesung der Hemmung, sobald das Kontrollröhrchen gutes Wachstum zeigt, gewöhnlich
2 - 4 Tage. 



     +-H-Bei   dieser Konzentration keine Hemmung. 



   In Gewächshausversuchen zeigte Phytoactin, dass es ein wirksames Fungizid für die Eindämmung von Pflanzenkrankheiten, wie früher   Tomatenmehltaublüte,   später Tomatenmehltau, Bohnenrostpilz und 

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 Weizenblattrostpilz ist. Diese Krankheiten werden verursacht durch Alternaria solani (Ell. & Mort.) Tones & Grout, Phytophthora infestens (Mont. ) de   Bary,   Uromyces   phaseoli     (Pers.)   Wint. und Puccinia rubigo-vera   (DC.)   Wint. 



   Phytoactin wird während der Kultivierung eines Mikroorganismus der Familie Streptomycetaceae gebildet, besonders von einer Art der Spezies Streptomyces hygroscopicus. Eine Kultur einer Mikroorganismenart, die aus einheimischer Erde der Vereinigten Staaten isoliert wurde und die Phytoactin produziert, wurde in der Kulturensammlung des United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Northern Utilization Research and   Development Division, Peoria, Hlinois, U. S. A.,   deponiert und diese Kultur erhielt in der Sammlung die Nummer NRRL 2752. Diese Art wird hier als Streptomyces hygroscopicus NRRL 2752 oder zur Abkürzung NRRL 2752 bezeichnet. In der folgenden Beschreibung werden die charakteristischen Eigenschaften dieses Organismus angegeben. 



   Der Organismus NRRL 2752 bildet spiralige Sporophoren, und die leicht oval bis kugelförmigen Sporen haben einen Durchmesser von   1 - 1,   5   Il.   Die Wachstumseigenschaften des Organismus wurden beobachtet, nachdem die unten angegebenen diagnostischen Medien 23 Tage bei   280C   inkubiert wurden und alle Änderungen in den Wachstumseigenschaften, die nach 23 Tagen und bis zu 44 Tagen bei   280C   auftraten, notiert wurden. Hiebei wurden die im folgenden angegebenen Wachstumseigenschaften beobachtet, wobei die Luftmycelfarben nach Ridgeway, Color Standards and Color Nomenclature (Washington,   D.

   C.,   1912) beschrieben wurden : 
 EMI5.1 
 
<tb> 
<tb> Asparagin-Glukose-FIcischextraktagar <SEP> Ausgezeichnetes <SEP> Wachstum <SEP> mit <SEP> blassneutral-bis
<tb> hellneutral-grauem <SEP> Luftmycel. <SEP> Nach <SEP> 14 <SEP> Tagen
<tb> Bildung <SEP> schwarzer <SEP> Bereiche, <SEP> die <SEP> nach <SEP> 30 <SEP> Tagen
<tb> nass <SEP> werden. <SEP> Hellgelbbraune <SEP> Unterseite <SEP> und <SEP> hellbraunes <SEP> lösliches <SEP> Pigment.
<tb> 



  Bennett's <SEP> Agar <SEP> Ausgezeichnetes <SEP> Wachstum <SEP> mit <SEP> farblosem, <SEP> feuchtem
<tb> Vegetativmycel. <SEP> Hellgelbbraune <SEP> Unterseite <SEP> und <SEP> hellbraunes <SEP> lösliches <SEP> Pigment.
<tb> 



  Maismaischwasseragar <SEP> (Waksman) <SEP> Mässiges <SEP> Wachstum <SEP> mit <SEP> farblosem, <SEP> feuchtem <SEP> Vegetativmycel. <SEP> Hellgelbbraune <SEP> Unterseite <SEP> mit <SEP> schönem,
<tb> starkbraunem, <SEP> löslichem <SEP> Pigment.
<tb> 



  Czapekagar <SEP> (Difco) <SEP> Ausgezeichnetes <SEP> Wachstum <SEP> mit <SEP> blassem <SEP> bis <SEP> neutralgrauem <SEP> Luftmycel. <SEP> Nach <SEP> 23 <SEP> Tagen <SEP> Bildung <SEP> schwarzer
<tb> Bereiche, <SEP> die <SEP> nach <SEP> 44 <SEP> Tagen <SEP> nicht <SEP> feucht <SEP> wurden.
<tb> 



  Hellgelbe <SEP> Unterseite <SEP> und <SEP> hellbraunes <SEP> lösliches <SEP> Pigment. <SEP> 
<tb> 



  Gelatine <SEP> (Waksman) <SEP> Nach <SEP> 9 <SEP> Tagen <SEP> nicht <SEP> verflüssigt <SEP> ; <SEP> verflüssigt <SEP> nach
<tb> 16 <SEP> Tagen
<tb> Lackmusmilch <SEP> Weisser <SEP> Wachstumring <SEP> mit <SEP> leichter <SEP> Koagulation. <SEP> 251o
<tb> Peptonisierung <SEP> nach <SEP> 7 <SEP> Tagen, <SEP> 6rP/o <SEP> nach <SEP> 14 <SEP> Tagen,
<tb> 700lu <SEP> nach <SEP> 23 <SEP> Tagen, <SEP> 90plu <SEP> nach <SEP> 30 <SEP> Tagen <SEP> und <SEP> 100%
<tb> nach <SEP> 44 <SEP> Tagen. <SEP> PH <SEP> der <SEP> Milch <SEP> nach <SEP> 23 <SEP> Tagen <SEP> 6, <SEP> 55.
<tb> 



  Nitratbrühe <SEP> (Difco) <SEP> Reduziertes <SEP> Wachstum
<tb> Hafermehl-Hefeextraktagar <SEP> Mässiges <SEP> Wachstum <SEP> mit <SEP> blassmaus- <SEP> bis <SEP> hellmaus-grauem <SEP> 
<tb> Luftmycel. <SEP> Schwarze <SEP> Bereiche <SEP> bilden <SEP> sich <SEP> nach <SEP> 23 <SEP> Tagen <SEP> und <SEP> werden <SEP> nach <SEP> 30 <SEP> Tagen <SEP> feucht.
<tb> 



  Kartoffeldextroseagar <SEP> Ausgezeichnetes <SEP> Wachstum <SEP> mit <SEP> blassneutral-bis
<tb> hellneutral-grauem <SEP> Luftmycel. <SEP> Bildung <SEP> schwarzer <SEP> Bereiche <SEP> nach <SEP> 30 <SEP> Tagen, <SEP> die <SEP> nach <SEP> 44 <SEP> Tagen <SEP> nicht <SEP> feucht
<tb> werden. <SEP> Gelbe <SEP> Unterseite <SEP> und <SEP> hellbraunes <SEP> lösliches
<tb> Pigment.
<tb> 



  Kartoffelkeile <SEP> Geringes <SEP> Wachstum <SEP> mit <SEP> bräunlichem <SEP> Vegetativmycel.
<tb> 



  An <SEP> der <SEP> trocknenden <SEP> Spitze <SEP> weiss <SEP> bis <SEP> hellgrau.
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 6> 

 
 EMI6.1 
 
<tb> 
<tb> 



  Stärkeagar <SEP> (Difco) <SEP> Mässiges <SEP> Wachstum <SEP> mit <SEP> blassmaus-grauem <SEP> Luftmycel.
<tb> 



  Bildung <SEP> schwarzer <SEP> Bereiche <SEP> nach <SEP> 14 <SEP> Tagen, <SEP> die <SEP> nach
<tb> 23 <SEP> Tagen <SEP> feucht <SEP> werden. <SEP> Hellgelbbraune <SEP> Unterseite <SEP> und
<tb> hellbraunes <SEP> lösliches <SEP> Pigment.
<tb> 



  Hefeextraktagar <SEP> (Waksman) <SEP> Ausgezeichnetes <SEP> Wachstum <SEP> mit <SEP> farblosem <SEP> Vegetativmycel <SEP> und <SEP> wenigen <SEP> weissen <SEP> Bereichen. <SEP> Hellgelbbraune
<tb> Unterseite <SEP> und <SEP> hellbraunes <SEP> lösliches <SEP> Pigment.
<tb> 
 



   Zu den obigen Ergebnissen gehört die   Dunkelfeldeigenschaft   von S. hygroscopicus, die sich auf Asparagin-Glukose-Fleischextraktagar, Czapekagar, Hafermehl-Hefeextraktagar, Kartoffeldextroseagar und Stärkeagar zeigten. Auf einer Anzahl von Medien produzierte der Organismus auch die charakteristischen graufarbigen Lufunycele. Die charakteristischen kompakten, sporentragenden Hyphen wurden auf Agarmedien, wie   Asparagin-Glukose-Fleichextraktagar,   Kartoffeldextroseagar und Hafermehl-Hefcextraktagar, gebildet. 



   Morphologische Eigenschaften :
1. Morphologie von sporentragenden Hyphen : Sporophoren werden am Endteil von kurzen monopodisch verzweigten Hyphen gebildet. Die Sporophoren liegen in engen, kompakten Spiralen vor. Die Spiralen drehen sich in zwei bis mehreren Windungen nach oben um eine Achse von rechts nach links und liegen als dichte Nester auf den Hauptstämmen der Sporophoren. 



   2. Anzahl der Sporen   : Der   grösste Teil der Sporen steht einzeln. Die ovalen bis sphärischen Sporen haben einen Durchmesser von 1 bis   l,   5   li.   



   3. Gegenwart von kugelförmigen   Sporangien :   Nicht beobachtet. 



   -4. Gegenwart von Geisselsporen : Nicht beobachtet. 



   5.   Luftmycelbildungsfähigkeit : Der Stamm   NRRL 2752 bildet ein gut entwickeltes, graufarbiges Mycel auf bestimmten Medien unter Bildung schwarzer, feuchter, perlender Flecke, wobei das Ganze schliesslich schwarz wird. 



   6. Bildung von Conodiophoren und Conidien : Sporen werden in besonderen sporenhaltigen Hyphen 
 EMI6.2 
 



   8. Auftreten von Sclerotien : Es wurden keine Sclerotien beobachtet. 



   Farbe : Die Beschreibung der Farbe des Stammes auf bestimmten chemischen Medien, wie z. B. auf   Glukoseasparagin- und   Czapekagar bei   280C   während 14 Tagen ist der USA-Patentschrift Nr. 3, 032, 471 zu entnehmen. 



   Glukoseasparaginagar : Mässiges   Wachstum ; lichtgraues Luftmycel ; schwachbraunes lösliches Pigment.   



   Czapekagar : Mässiges Wachstum ; weisses bis lichtgraues Luftmycel ; schwachbraunes lösliches Mycel. 



   Physiologische Eigenschaften :
1. Melaninproduktion   : Der   Stamm NRRL 2752 ist melaninnegativ. 



   2. Verwertung der folgenden Kohlehydrate : 
 EMI6.3 
 
<tb> 
<tb> Vergleich <SEP> ohne <SEP> Kohlehydrate <SEP> - <SEP> positiv <SEP> 
<tb> d-Glukose-positiv
<tb> 1-Arabinose-positiv
<tb> Saccharose <SEP> - <SEP> positiv <SEP> 
<tb> d-Xylose-positiv
<tb> i-Inositol-positiv
<tb> d-Mannitol-positiv
<tb> d-Lävulose-positiv
<tb> Temperatur <SEP> :

   <SEP> 
<tb> 280C <SEP> - <SEP> positiv. <SEP> gutes <SEP> Wachstum
<tb> 340C-positiv, <SEP> gutes <SEP> Wachstum
<tb> 370C <SEP> - <SEP> positiv, <SEP> gutes <SEP> Wachstum
<tb> 400C <SEP> - <SEP> positiv, <SEP> mässiges <SEP> Wachstum
<tb> 500C <SEP> - <SEP> negativ <SEP> 
<tb> 
 
Microaerophiles Wachstum :
Unter Verwendung der Definition   für"Microaerophiles Wachstum"gemäss dem"Manual   of Microbiological Methods", Society of American Bacteriologists, als "Wachstum nur unter geringer Sauerstoff- 

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 spannung", muss der Stamm NRRL 2752 als aerober Organismus betrachtet werden. 



   Ein sorgfältiges Studium des verfügbaren Materials über die Kennzeichnung dieses Streptomyceten-
Stammes zeigt, dass der Stamm NRRL 2752 zur Art Streptomyces   hygrosccpicus   gehört. 



   Das neue fungizide Antibiotikum kann durch Fermentierung eines Nährmediums mit dem Phytoactin produzierenden Mikroorganismus Streptomyces hygroscopicus NRRL 2752 hergestellt werden. Vorzugsweise wird ein wässeriges Nährmedium so lange aerob und unter Rühren und Wasserüberflutung fermentiert, bis eine beträchtliche fungizide Aktivität gebildet ist. Die Fungizide können routinemässig mit der Agarplat- tenanalysenmethode unter Verwendung von Glomerella cingulata oder Candida albicans als Testorganis- men bestimmt werden. 



     Nährmedien,   die zur Herstellung der Fungizide geeignet sind, enthalten eine geeignete Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff, vorzugsweise einen Kohlenwasserstoff wie Glukose, eine Quelle für assimi- lierbaren Stickstoff, wie SojamehL Maismaischwasser, Hefe u. ähnl., und Mineralsalze, die zusam- men mit den andern Ingredienzien, wie Maismaischwasser, vorhanden sein können. Eine Impfmenge des
Organismus wird hergestellt, indem man ihn auf Agarschrägmedien, wie Hafermehl oder Pepton-Hefe- extrakt, wachsen lässt. Diese Agarschrägkulturen lassen sich dann dazu verwenden, grössere Impfmengen durch Besäen von Schüttelflaschen, die Medien, wie Sojamehl und Maismaischwasser, enthalten, her- stellen. Diese Flaschen werden dann unter Bedingungen geschüttelt, die für das Wachstum des Organs- mus geeignet sind.

   Die Schüttelflaschenkulturen können dann zur Herstellung noch grösserer Impfmengen oder zum direkten Besäen der Gärbottiche verwendet werden. Während der Herstellung der Impfmenge und während der darauffolgenden Vergärung müssen aseptische Bedingungen aufrechterhalten werden. 



   Für die Gärung wird das gewünschte Medium hergestellt und sein PH auf etwa 6,   3 - 7,   5, vorzugsweise 6, 7-7, 2, eingestellt. Im bevorzugten Medium ist Kalziumkarbonat enthalten. Das so hergestellte Medium wird durch Erhitzen auf etwa 1200C unter Druck sterilisiert. Dann wird es auf ungefähr   24-36 C,   vorzugsweise 27-24 C, abgekühlt. Das sterile Medium wird dann aseptisch beimpft mit dem wie oben beschrieben hergestellten Impfstoff. 



   Die Gärung schreitet dann unter Rühren und Beatmung unter Verwendung steriler Luft bei einer Temperatur im oben angegebenen Bereich fort. Die Gärungsdauer kann bei verschiedenen Medien und verschiedenen Arbeitsbedingungen variieren. Die Luft wird gewöhnlich mit einer Geschwindigkeit von etwa 0, 25 bis   l,   5 Volumen Frischluft je Volumen Medium pro Minute angeboten. Die Gärung wird dann genügend lange fortgesetzt, um optimale und vorzugsweise maximale Produktion von Phytostreptin oder Phytoactin, je nachdem, zu erhalten. Gewöhnlich ist eine Fermentationsdauer von 48 bis 96 h ausreichend. 



   Das Fungizid lässt sich nach einer Anzahl von Verfahren gewinnen, oder man verwendet die ganze Kultur oder die ganze Brühe als solche oder konzentriert oder trocknet sie auf geeignete Weise. Normalerweise wird es vorgezogen, das Fungizid durch Ausfällung oder Lösungsmittelextraktion aus der Gesamtkultur oder Brühe zu gewinnen. Beim Gewinnungsverfahren durch Ausfällen wird die ganze Kultur gewöhnlich filtriert oder in einem bevorzugten PH- Bereich von 7 bis 8 zentrifugiert und das Filtrat auf einen bevorzugten PH-Bereich von 3 bis 5 zur Ausfällung des Fungizids angesäuert. Als Säure wird für diesen   Fällungsschritt   Salzsäure bevorzugt, obwohl auch andere Säuren verwendet werden können. Da das Kulturmycel beträchtliche Mengen Fungizid enthält, kann man auch die ganze Kultur (ohne Filtration) zum Ausfällen auf PH 3-5 einstellen. 



   Aus dem Niederschlag oder Sediment lässt sich die Aktivität durch Extraktion mit einer geeigneten organischen Flüssigkeit, in der sie löslich ist, gewinnen, wie MethanoL   Äthanol,   Isopropanol, Butanol, Aceton oder Methylisobutylketon. Diese Lösungsmittellösung kann dann im Vakuum eingeengt werden und der erhaltene Rückstand mit organischen Lösungsmitteln weiter extrahiert werden. Beider bevorzugten Gewinnungsmethode wird letzterer Rückstand nach dem Eindampfen erschöpfend mit Methylisobutylketon extrahiert und die Lösung in diesem Lösungsmittel im Vakuum auf ein kleines Volumen konzentriert. Durch Zugabe von 5 Volumen Diäthyläther kann das Fungizid dann ausgefällt werden.

   Das in der Me-   thylisobutylketon-Äther-Mutterlauge     zurückbleibende Fungizid lässt   sich durch Konzentrieren der Mutterlauge im Vakuum auf ein kleines Volumen und Zugabe von 5 Volumen Petroläther   (30-600C)   zum Ausfällen der Aktivität gewinnen. Wahlweise kann auch ein Lösungsmittelextrakt der Gesamtkultur, Gesamtbrühe oder des aktiven ausgefällten Sediments als solches oder nach der Konzentrierung im Vakuum ohne weitere Reinigung verwendet werden.

Claims

PATENTANSPRUCH : Verfahren zur Herstellung des neuen fungiziden Antibiotikums Phytoactin (Polyamidohygrostreptin), dadurch gekennzeichnet, dass man ein übliches Nährmedium mit dem Stamm NRRL 2752 von Streptomyces hygroscopicus fermentiert und das erhaltene Antibiotikum durch eine an sich bekannte Methode, beispielsweise durch Ausfällung oder Lösungsmittelextraktion. aus der Gärflüssigkeit gewinnt.