DK143608B - Fremgangsmaade til fremstilling af antibiotikum a-30912 eller dets komponenter,benaevnt a,b,c,d,e,f og g - Google Patents

Description

(19) DANMARK

fj| Π2) FREMLÆGGELSESSKRIFT nu 143608 B

DIREKTORATET FOR PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Ansøgning nr. 4402/76 (51) lntC|3 β ^ ρ 21/00 (22) Indleveringsdag 30. s ep. 1976 C 07 0 11/00 (24) Løbedag 30· sep· 1976 (41) Aim. tilgængelig 3· apr. 1977 (44) Fremlagt 14. S ep. 1981 (86) International ansøgning nr. - (86) International indleveringedag - (85) Videreførelsesdag - (62) Stamansøgning nr. -

(30) Prioritet 2. okt. 1975, 619107, US

(71) Ansøger ELI LILLY AND COMPANY, Indianapolis, US.

(72) Opfinder Marvin Martin Hoehn, US: Karl Heinz Michel, US.

(74) Fuldmægtig Ingeniørfirmaet Hofman-Bang & Boutard.

(54) Fremgangsmåde til fremstilling af antibiotikum A-3091 2 eller dets komponenter, benævnt A, B, C, I), E, F og G.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af en hidtil ukendt antibiotisk blanding benævnt antibiotikum A-30912 indeholdende mindst syv individuelle komponenter A, B, C, D, E, F og G eller disse enkelte komponenter og fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i kravets kende-® tegnende del anførte.

00 o UO Betegnelsen antibiotisk blanding som anvendt i nærværende beskri- ^ velse refererer til en blanding af samtidigt fremstillede indivi- duelle antibiotiske komponenter. Som det er kendt for fagmanden ^ vil forholdet mellem de individuelle komponenter, der dannes i □ en antibiotisk blanding, variere, afhængigt af de anvendte fer menteringsbetingelser.

2 143608

Den omhandlede antibiotiske blanding extraheres fra fermenteringsmediet ved hjælp af polære organiske opløsningsmidler.

Den kendte forbindelse Sterigmatocystin produceres også af Aspergillus rugulosus NRRL 8113. Sterigmatocystin ekstraheres enten separat med et ikke-polært organisk opløsningsmiddel eller sammen med den omhandlede antibiotiske blanding med polære organiske opløsningsmidler, I sidstnævnte tilfælde adskilles den omhandlede antibiotiske blanding fra Sterigmatocystin ved at koncentrere ekstraktionsopløsningsmidlet, sætte koncentratet til overskud af ikke-polært organisk opløsningsmiddel, såsom diethylether, og fraseparere den omhandlede antibiotiske blanding som et bundfald. Sterigmatocystin udvindes fra filtratet.

Den antibiotiske blanding oprenses yderligere ved kolonnekromatografi .

Den omhandlede antibiotiske blanding A-30912 og de individuelle komponenter er antifungale midler.

De infrarøde absorptionsspektre af følgende komponenter i KBr-tabletter er vist i vedlagte tegninger:

Tigur 1 - antibiotieum A-30912, komponent A iigur 2 - antibiotieum A-30912, komponent D rigur 3 - antibiotieum A-30912, komponent B rigur 4 - antibiotieum A-30912, komponent C

Antibiotieum A-30912^_komgonent A

Denne komponent minder om det polypeptide antibiotieum Echino-candin B, der for nylig er rapporteret af r. Benz et al., Helv.

Chim. Acta 57, 2459-2477 (1974).

Antibiotieum A-30912, komponent A er et hvidt amorft fast stof.

En grundstofanalyse af komponent A viser følgende procentvise sammensætning:

Carbon 56,52 %, hydrogen 6,29 %, nitrogen 8,68 % og oxygen 27,09 %· 3 143608

Den tilnærmede empiriske formel, der foreslås for komponent A > er G-rundstofanalysen af komponent A sva rer særlig godt til den empiriske formel C52H81N7°18'H2° (fcereS“ net: C 56,24 - H 7,54 - N 8,84 - 0 27,59).

Den omhandlede komponent A har en molekylvægt på 1100, bestemt ved massespektrometri og titrering.

Det infrarøde absorptionsspektrum af komponent A i en KBr-tablet er vist på figur 1 i vedlagte tegninger. Følgende karakteriske absorptionsmaksima observeres: 2,97 (stærk), 5,59 (medium), 5,47 (svag), 5,99 (stærk), 6,10 (stærk), 6,49 (medium), 6,56 (medium), 6,90 (medium), 8,00 (svag), 9,15 (svag) og 11,77 (svag) pm.

Det ultraviolette absorptionsspektrum af komponent A i både neutral og sur methanol viser absorptionsmaksima ved 225 nm (ε 5.000) og 284 nm (skulder ε 2.500). Det ultraviolette spektrum af komponent A i basisk methanol viser absorptionsmaksima ved 245 nm (e 16.000) og 290 nm (ε 3.000) og også endeabsorption.

1 ^ C NMR-spektret af komponent A i perdeuteromethanol viser følgende karakteristika: 4 143608 δ 176,1, 174,3, 173,4, 172,7, 172,4, 169,8, 158,4, 132,8, 130,9, 129.6, 129,0, 116,2, 77,0, 75,7, 74,4, 71,3, 70,9, 69,6, 68,3, 62,4, 58,7, 56,9, 56,1, 52,9, 39,0, 38,5, 36,8, 35,2, 33,9, 32,9, 32.6, 30,7, 30,4, 30,2, 28,2, 27,0, 26,5, 23,6, 20,1, 19,6, 14,4 og 11,3 ppm.

Komponent A har følgende specifikke rotationer: [a]25 = -44° (c 0,5, CH^OH) [a]|5 = -156° (c 0,5, CH^OH).

Elektrometrisk titrering af komponent A i 66 ft vandig dimethyl-formamid indikerer nærværelsen af en titrerbar gruppe med en pKa-værdi på 12,8 (begyndelses-pH 6,9).

Aminosyreanalyse af komponent A indikerer nærværelse efter hydrolyse af threonin, hydroxyprolin og tre andre indtil videre uidentificerede aminosyrer.

Een antibiotiske komponent A er opløselig i en lang række organiske opløsningsmidler, såsom methanol, ethanol, dimethyIformamid, dimethylsulfoxid og ethylacetat, men er uopløselig i ikke-polære organiske opløsningsmidler, såsom diethylether og petroleums-ether. Komponent A er også opløselig i vandige opløsninger, især de opløsninger, der har en pH-værdi større end 7,0.

Antibioticum A-50912, komponent E

Een omhandlede komponent E er et hvidt amorft fast stof. Grund-stofanalyse af komponent E gav følgende procentvise sammensætning: carbon 56,37 ft, hydrogen 8,17 ft, nitrogen 8,54 ft, oxygen (ved differens) 26,92 ft.

Komponent E har en tilnærmet molekylvægt på 1100, baseret på aminosyreanalyse og dens nære forbindelse til komponent A i strukturel henseende.

5 143608

Det infrarøde absorptionsspektrum af komponent D optaget i en KBr-tablet er vist på figur 2. Følgende karakteristiske absorp-tionsmeksima observeres: 2,98 (stærk), 3,31 (svag), 3,36 (skulder), 3,40 (medium), 3,48 (svag), 5,76 (svag), 6,01 (stærk), 6,10 (skulder), 6,49 (medium), 6,57 (medium), 6,90 (medium), 7,81 (svag), 8,07 (svag) og 9,16 (svag) pn.

Det ultraviolette (UV) spektrum af komponent D i neutral og sur methanol viser absorptionsmaksima ved 225 nm (ε 18.000) og 275 nm (£ 2.500). UV-spektret af komponent D i basisk methanol viser absorptionsmaksima ved 240 nm (ε 11.000) og 290 nm (S 3.000).

Komponent D har følgende specifikke rotation: [oc]£5=-50° (c 0,34, CH30H).

Aminosyreanalyse af komponent D efter hydrolyse indikerer nærværelsen af threonin, hydroxyprolin, histidin og tre andre indtil videre uidentificerede aminosyrer. In af de uidentificerede aminosyrer er identisk med en af de uidentificerede aminosyrer i komponent A.

Den omhandlede komponent D er opløselig i en lang række organiske opløsningsmidler, såsom methanol, ethanol, dimethylformamid, di-methylsulfoxid og ethylacetat, men er uopløselig i ikke-polære organiske opløsningsmidler, såsom diethylether og petroleums-ether. Den omhandlede komponent D er opløselig i vandige opløsninger, især når pH er større end 7,0.

itotibioticum A 30^12, komponent B__

Den omhandlede komponent B er et hvidt amorft fast stof. Grundstofanalyse af komponent B gav følgende tilnærmede procentvise sammensætning: carbon 57,36 hydrogen 5,92 nitrogen 8,75 /6, oxygen 26,19

Det infrarøde absorptionsspektrum af komponent B optaget i en KBr-tablet er vist på figur 3. Følgende karakteristiske absorptionsmaksima observeredes: 6 143608 2,99, 3,41, 3,49, 6,06, 6,15, 6,54, 6,61, 6,94, 7,62, 8,07, 9,26 og 9,39 V™·

Det ultraviolette absorptionsspektrum af komponent B i både neutral og sur methanol viser absorptionsmaksima ved 223 nm (skulder, ε 16.000) og 278 nm (ε 2.400). Det ultraviolette spektrum af komponent B i basisk methanol viser absorptionsmaksima ved 242 nm (£ 13.900) og 292 nm (G 2.800).

Komponent B har følgende tilnærmede specifikke rotationer: j>]£5= -47° (c 0,5, CH30H) [a]p5=-170° (c 0,5, OH^OH).

Elektrometrisk titrering af komponent B i 66$ vandig dimethyl-formamid indikerer nærværelsen af en titrerbar gruppe med en pK -værdi på 13,0 (begyndelses-pH 7,91).

Or

En aminosyreanalyse af komponent B efter en sur hydrolyse angivernærværelsen af threonin, hydroxyprolin og adskillige hidtil uidentificerede aminosyrer.

Komponent B er opløselig i en lang række organiske opløsningsmidler, såsom methanol, ethanol, dimethylformamid, dimethylsulfoxid og ethylacetat. Komponenten er uopløselig i ikke-polære organiske opløsningsmidler, såsom diethylether og petroleumsether.

Komponent B er også opløselig i vandige opløsninger, især de, der har en pH-værdi større end 7,0.

Antibioticum A-30912, komponent C

Den omhandlede komponent C er et hvidt amorft fast stof. Grundstof analyse af komponent C gav følgende tilnærmede procentvise sammensætning: carbon 56,76 $, hydrogen 7,88 $, nitrogen 10,61 $, oxygen 25,09 $.

Det infrarøde absorptionsspektrum af komponent C i en KBr-tablet er 7 143608 vist på figur 4. Følgende karakteristiske absorptionsmaksima observeres: 2,98, 3,39, 3,43, 3,51, 6,01, 6,12, 6,47, 6,90, 7,04, 7,22, 7,38, 8,00, 8,30 og 9,13 pm.

Det ultraviolette absorptionsspektrum af komponent C i både neutral og sur methanol viser absorptionsmaksima ved 223 nm (skulder, g 7.300) og 275 nm (g 1.350). Det ultraviolette spektrum af komponent C i basisk methanol viser absorptionsmaksima ved 240 nm (g 12.400) og 290 nm (e 5.200).

Komponent C har følgende tilnærmede specifikke rotationer: [a]£5 = -33° (c 0,5, CH30H) 0]¾ = -119° (c 0,5, CH30H).

Elektrometrisk titrering af komponent C i 66 % vandig dimethyl-formamid indikerer nærværelsen af en titrerbar gruppe med en pK - cl værdi på cirka 11,08 (begyndelses-pH 7,93).

Aminosyreanalyse af komponent C efter en sur hydrolyse angiver nærværelsen af threonin, hydroxyprolin og adskillige Indtil videre uidentificerede aminosyrer.

Den omhandlede komponent C er opløselig i en lang række organiske opløsningsmidler, såsom methanol, ethanol, dimethyIformamid, dimethylsulfoxid og ethylacetat, men er uopløselige i ikke-polæ-re organiske opløsningsmidler, såsom diethyleiher og petroleums-ether. Komponent C er også opløselig i vandige opløsninger, især sådanne, der har en pH-værdi større end 7,0.

De syv individuelle komponenter i den antibiotiske blanding A-30912 kan separeres og identificeres ved anvendelse af tyndtlags-kromatografi (TIC). Silicagel er en foretrukken adsorbent, og benzen:methanol (7:3, V:V) er et foretrukkent opløsningsmiddelsystem.

R^-værdierne af antibioticum A-30912, komponent A-G, under anvendelse af silicagel (Merck, Darmstadt), benzen:methanol (7:3) som op- 8 143608 løsningsmiddelsystem og Candida albicans bioautografi er anført i tabel I.

TABEL I

Antibiotisk A-30912 komponent R^-værdi A 0,35 B 0,45 C 0,54 B 0,59 E 0,27 E 0,18 G- 0,13 R^-værdieme for den omhandlede komponent A i forskellige papir-kromatografisystemer, hvor der igen anvendes Candida albicans som detektionsorganisme, er anført i tabel II.

TABEL II

A-30912 komponent A

R^-værdi Opløsningsmiddelsystem 0,76 Butanol mættet med vand.

0,69 Butanol mættet med vand + 2 f> p-toluensul- fonsyre.

0,75 MethanolrO, 1 N HC1 (3:1).

0,17 Butanol:ethanol:vand (13,5:15:150) 0,78 Methanol:0,05 M natriumcitrat ved pH 5,7 (7:3); papirpuffer af 0,05M natriumcitrat ved pH 5,7.

Organismen, der er nyttig ved fremstilling af den omhandlede antibiotiske blanding, isoleredes fra en jordprøve fra ruinerne i Pompeji i Italien. Ben antibioticum A-30912-producerende organisme'klassificeres som- en stamme af Aspergillus rugulosus, der hører til Aspergillus nidulans-gruppen. Denne klassificering 9 143808 er baseret på beskrivelser af K.B. Raper og D.I. Fenne! i "The .

Genus Aspergillus", The Williams and Wilkins Company, Baltimore,

Mi., 1965.

Farvenavnene er givet i overensstemmelse med ISCC-NBS-metoden (K.L. Kelly og D.B. Judd, "The ISCC-NBS Method of Designating Color and a Dictionary of Color Names," U.S. Dept, of Commerce,

Circ. 553, Washington, D.C., 1955). Maerz- og Paul-farveblokkene er beskrevet af A. Maerz og M.R. Paul i "Dictionary of Color," McGraw-Hill Book Company, New York, N.Y., 1950.

Kulturerne dyrkedes ved 25°C, medmindre andet er angivet.

Kulturelle karakteristika af Aspergillus rugulosus NRRl· 8115 Czanek's o-pløsningsagar

Kulturen vokser langsomt, og når en diameter på 1,5 - 2 cm på 15 dage ved 25°C. Koloniens overflade er konveks og fløjlsagtig og bliver rynket med alderen nær ved centrum og herefter knoppet. Mycelieperiferien er et 2 mm bredt bånd af dybt neddykkede farveløse hyfer og er endvidere bølgeformet. In lyserød-brun udsondring dannes på de marginale lufthyfer. På fra 7 til 14 dage produceres et blegt violet opløseligt pigment i agaren, der omkranser kolonien. Pigmentet diffunderer ud over hele kolonien i løbet af 15 dage.

Efter 5 dage er koloniens overflade hvid til brungul, og koloniens bagside er brunligorange i midten og brunlig til brunligviolet i de ydreliggende regioner. På 10 dage er kolonien blevet moderat gullig til lyserød (ISCC-NBS 29 og Maerz and Paul 11-A-7). Efter 14 dage er kolonien blevet gråligrød (ISCC-NBS 18 og Maerz and Paul 4-G-7). De marginale områder bliver vortede og stærkt gule (ISCC-NBS 84 og Maerz and Paul 10-L-5) på grund af conidiedannelse. Spredte mørkegule klaser af htilleceller findes spredt tilfældigt over hele overfladen og langs yderkanten af kolonien. Med alderen bliver de stærkt gule pletter over marginale områder gulliggrønne. Efter 3 ugers forløb kan en orange-purpur-farvet farvetone observeres i de nye luft-legemer i yderområdet.

10 143608 I begyndelsen er koloniens bagside en smule konkav. Når den modner, bliver kolonien flad som agarens overflade, og bagsiden bliver noget bølgeformet. På 10. dagen er bagsiden lysebrun (ISCC-NBS 57 og Maerz and Paul 5-A-10). På 15. dagen er den gråligrød (ISCC-NBS 19 og Maerz and Paul 6-J-3).

Det conidiedannende stadium er sparsomt, og conidiophorer er spredte over overfladen, undertiden forekommer de som pletter eller som submarginale bånd. Conidiehovederne er først kugleformede med stråleformet anbragte sterigmer. Med alderen kan de udvikles som korte cylindriske former, der er mere kompakte. De kugleformede legemer har en diameter på 70-80 pm og i gennemsnit 50 pm.

De cylinderformede legemer kan være op til 140 pm lange og 70 pm brede.

Conidierne er kugleformede til sub-kugleformede, rynkede og gulgrønne. De har en diameter på mellem 2,8 og 3,9 pm med et gennemsnit på 3,2 pm.

Sterigmata sidder ved siden af hinanden og er farveløse. Primære sterigmata har en længde fra 4,7 til 11,0 pm med et gennemsnit på 7,9 pm. På deres bredeste punkt er de 2,4 pm og snævrer ind til 1,6 pm. Sekundære sterigmata kan forekomme enkeltvis eller i par ud fra de primære sterigmata, og disse er kolbeformede. På deres bredeste punkt måler de 3 pm og snævres ind til 0,4 pm, hvor de bliver ringformede. Den ringformede åbning er 1,2 pm lang. Den totale længde er 5,5 - 12,6 pm med et gennemsnit på 9,2 pm.

Vesiclerne er kugleformede til sub-kugleformede eller hemisfæriske og kan være udfladet til en top, og de bliver brunlige med alderen. De har en diameter fra 7,4 til 11,2 pm og et gennemsnit på 9,4 pm.

Conidiophorer er glatte, relativt tykvæggede og er først gennemsigtige, hvorefter de udvikler en farve, der er lys kanelbrun. De er lidt bredere ved vesiclerne og kan indsnævres en lille smule nær ved fodcellen. Gennemsnitsbredden er 5,9 pm. Conidiophorer har en længde på 47,7 - 166,6 pm med et gennemsnit på 106 pm. De kommer fra neddykkede hyfer eller lateralt fra lufthyfefilamenter.

11 143608

Den ascogene tilstand kommer omkring ved 20. dagen. Små gullige blærer af Mile celler, der forekommer på overfladen, kan nu findes ethvert sted i myceliet. De “består af Mile-celler, der omvikler en eller flere cleistothecia. Httlle-cellerne er kugleformede til suh-kugleformede eller ovale til aflange og er tykvæg-gede og gennemsigtige. Kugleformede httlle-celler har en diameter på 18 - 24 jim og et gennemsnit på 21,8 jim.

Cleistothecia er kugleformede til sub-kugleformede, tykvæggede og relativt sejge og fibrøse. Pørst er de farveløse, hvorefter de bliver rødligviolette og bliver mørkere med alderen. De. har en diameter på 165 - 470 pm og et gennemsnit på 275 pm.

Kolonier dyrket ved 25°C vokser hurtigt og når en diameter på 4-5 cm på 10-12 dage. Pørst er de grålighvide, derefter bliver kolonierne moderat olivengrønne (ISCC-NBS 90 og Maerz and Paul 23-E-6) på 4 dage. Den bølgeformede periferi består af tætpakkede, korte, hvide lufthyfer. Små gullige klynger af Mile-celler sidder som små prikker på yderområdet og er tilfældigt fordelt udover agaroverfladen. Efter 20 dage har disse Mlle-celle-klynger tendens til at omhylle det meste af overfladen. Koloniens bagside er gråliggul (ISCC-NBS 90 og Maerz and Paul 11-B-1).

Den ascpgene tilstand fremkommer på 15. dagen. Små gullige klynger af httlle-celler kan nu findes overalt i myceliet. De består af Mile-celler, der indkapsler en eller flere cleistothecia. Httlle-cellerne kan indhylle store områder over conidie-hovederne. Httlle-cellerne er kugleformede til sub-kiigleformedé eller ovale til aflange og er tykvæggede og gennemsigtige. Kugleformede httlle-celler har en diameter på 18-24 pm med et gennemsnit på 21,8 pm.

Clestothecia er kugleformede til sub-kugleformede og er mørkt rødligbrune. De ligger på 389 - 700 jim i diameter med et gennemsnit på 506 pm.

Asci er skøre, gennemsigtige og sub-kugleformede til ovale.

12 143608

Sub-kugleformede asci er 8,7 - 11,9 pm i diameter med et gennemsnit på 10,5 pm. Ovale asci er 10,3 - 14,2 pm x 8,7 - 10,3 pm med et gennemsnit på 12,2 x 9,1 pm.

Ascosporeme er rød-orange, rynkede med to parallelle, forsigtigt foldede ækvatoriale tråde, der er op til 0,8 pm brede og ubrudte. Ascosporeme forekommer linseformede gennem den lange akse. Når tråden er omkransende, er ascosporen kugleformet.

Eet, kugleformede” legeme er '4,9 - 6,3 pm i diameter med et gennemsnit på 5,4 pm.

To karakteristika for den antibioticum A-30912-producerende stamme af Aspergillus rugulosus adskiller sig fra karakteristika for Aspergillus rugulosus beskrevet af Raper og Fennel..Den A-30912-producerende stamme har større conidielegemer· og ascosporer.

Aspergillus rugulosus-kulturen, der er nyttig til fremstilling af det omhandlede antibioticum, er deponeret og gjort til en del af stamkultursamlingen i Northern Regional Research laboratory, U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Peoria, Illinois 61604, hvorfra den er tilgængelig for offentligheden under nummeret NRRI 8113.

En lang række kulturmedier kan anvendes til at dyrke Aspergillus rugulosus NRRI 8113. Ror at opnå en økonomisk produktion, optimalt udbytte og let produktisolering foretrækkes visse kulturmedier imidlertid. For eksempel foretrækkes en carbonhydratkilde som glucose til'fermentering i stor skala, selv om melasse, stivelse, lactose, saccharose, maltose,' glycerol og andre kan anven des. En foretrukken nitrogenkilde er enzymhydrolyseret kasein og opløseligt kødpepton, selv om destilleriaffald, mononatrium-glutamat og andet kan anvendes. Uorganiske næringssalte kan også inkorporeres i kulturmediet. Disse omfatter sædvanligt opløselige salte, der kan give natrium, magnesium, calcium, ammonium, chlorid, carbonat, sulfat, nitrat og andre ioner.

Væsentlige sporelementer, der er nyttige for væksten og udviklingen af organismen, skal også være til stede i kulturmediet.

13 143608 Sådanne sporelementer findes sædvanligvis som urenheder i de andre konstituenter i mængder, der er tilstrækkelige til at give den påkrævede vækst af organismen.

Det kan være nødvendigt at tilsætte små mængder (dvs. 0,2 ml/g) af et antiskumningsmiddel, såsom polypropylenglycol, hvis skumning bliver et problem.

Til fremstilling af en væsentlig mængde antibioticum A-30912 foretrækkes neddykket aerob fermentering i tanke. Små mængder af antibioticum kan fremstilles ved rysteflaskedyrkning. På grund af tidsforsinkelsen i den antibiotiske produktion, der sædvanligvis er forbundet med podning af store tanke med sporeformen af organismen, foretrækkes det at anvende et vegetativt podemedium. Dette fremstilles ved podning af et lille volumen kulturmedium med sporer fra myceliefragmenter eller organismen til opnåelse af en frisk, aktivt voksende kultur af organismen. Det vegetative podemedium overføres til en større beholder. Mediet anvendt til dyrkning af det vegetative podemedium kan være det samme som det, der anvendes ved fermentering i større målestok, men andre medier kan også anvendes. Den antibioticum A-30912-producerende organisme kan dyrkes ved temperaturer mellem 20 og 43°C, fortrinsvis 25-30°C. Optimal produktion af den omhandlede antibiotiske blanding synes at forekomme ved en temperatur på cirka 25°C.

Som det er sædvane ved aerobe neddykkede fermenteringsprocesser blæses steril luft igennem dyrkningsmediet. Por at opnå en effektiv antibiotisk produktion anvendes fortrinsvis cirka 0,4 volumen luft pr. volumen dyrkningsmedium pr. minut.

Produktionen af den omhandlede antibiotiske blanding kan følges under fermenteringen ved at analysere prøver af alkoholekstrakter af fermenteringsvæsken for antibiotisk aktivitet over for en organisme, der vides at være følsom over for A-30912. En sådan organisme er Candida albicans. Bioforsøget udføres bekvemt som et papirpladeforsøg på inficerede agarplader.

Generelt kan den antibiotiske virkning bestemmes på fermenteringens anden dag. Maksimal produktion af antibioticum sker sædvanligvis mellem 3. og 6. dag.

Η 143808

Det omhandlede antihiotieum og dets komponenter er antifungale midler. Den antifungale virkning af de omhandlede komponenter kan illustreres ved in vitro-forsøg med komponenter A og D. Disse forsøg er anført i tahel III nedenfor. Den antifungale virkning måltes ved en konventionel plade-diffusionsmetode (6 mm strimler dyppedes i opløsninger indeholdende forsøgsforbindelsen. Strimmelen anbragtes på agarplader inficeret med forsøgsorganismen). Resultatet er angivet som den minimale hæmningskoncentration pr. plade, hvor forsøgsforbindelsen hæmmer udviklingen af forsøgsorganismen.

TABEL· III

Minimal hæmningskoncentration Forsøgsorganisme _(ug/plade)_

Antihiotieum A-30912 Komponent A Komponent D

Candida albicans 0,625 0,5

Trichophyton mentagrophytes 0,078 0,07

Komponenten A er meget aktiv i in vitro-pladediffusionsforsøg over for dermatophyter. Resultatet af disse forsøg er anført i tabel IV.

15 143608 MEL 17 A-50912, komponent A over for dermatophyter

Antal Minimal hæmningskoncen-Dermatophyte isolater tration (ug/plade)

Trichophyton mentagrophytes 13 1,25 - 0,039

Trichophyton gallinae 1 >1,25

Trichophyton meginini 1 0,0195

Trichophyton quinckeanum 1 >1,25

Trichophyton rubrum 1 <0,0098

Trichophyton scoenceinii 1 0,0195

Trichophyton terrestre 1 0,0195

Trichophyton tonsurans 9 >1,25-0,156

Microsporium gypseum 5 0,156 - 0,038

Microsporium audounii 4 1,25-0,156

Microsporium canis 6 1,25 - 0,0098

Microsporium cookei 2 1,25 - 0,0195

Nannizgia incurvata 1 0,312

Phalaphere"jean salemi 1 >1,25

Epidermatophyton floccosum 1 1,25

Geotrichum candidum 4 >1,25 - 0,156

Keratinomyces ajellio 1 0,156

Ben antifungale virkning af de omhandlede antibiotiske komponenter blev endvidere vist ved in vivo-forsøg. In vivo-forsøgene udførtes på følgende måde: Tre doser af forsøgsforbindelsen blev givet til Candida albicans-inficerede mus på tidspunktet 0, 4 og 24 timer efter infektionen. Den beskyttelse, som forsøgsforbindelsen giver, måles som en ED^0-værdi (den effektive dosis i mg/kg, der beskytter 50 $ af musene, se W. Wick et al., J. Bacteriol.

81 , 233-235 (1961)). ED^-værdierne for komponent A over for Candida albicans i mus var 30 mg/kg (intraperitoneal indgivelse) 16 143608 og 50 mg/kg (subcutan indgivelse). ED^Q-værdien for komponent D over for Candida alMcans i mus var 53 mg/kg (subcutan indgivelse).

Der var ingen tegn på akut toxicitet, når den omhandlede komponent D blev indgivet intraperitonealt eller subcutant i mus i en mængde på 100 mg/kg to gange pr. dag i 3 dage (i alt 600 mg/kg).

Der var heller ingen tegn på akut toxicitet, når komponent A "blev indgivet intraperitonealt i mus i en mængde på 200 mg/kg tre gange pr. dag (i alt 600 mg/kg).

Der var ingen tegn på akut toxicitet, når komponent D "blev indgivet subcutant i mus tre gange pr. dag i en mængde på 14 mg/kg (i alt 42 mg/kg).

Når de anvendes som antifungale midler, indgives de omhandlede antibiotiske komponenter parenteralt og indgives sædvanligvis sammen med et farmaceutisk acceptabelt bærestof eller fortyndingsmiddel. Doseringen af antibiotiket afhænger af en lang række betingelser, såsom arten og sværhedsgraden for den omhandlede infektion.

Eølgende eksempler illustrerer nærmere opfindelsen: EKSEMPEL· 1 A. Rystekolbe-fermentering

En kultur af Aspergillus rugulosus NRB.L· 8113 fremstilledes og blev holdt på en 18 x 150 ml agarskråflade med følgende sammensætning:

Ingrediens Mængde (fa)

Dextrin 1,000

Enzymatisk hydrolysat af casein* 0,2000 Gærekstrakt 0,1000 Kødekstrakt 0,1000 KOI 0,0200 17 143608

Ingrediens Mængde ($)

MgS04*7H20 0,0200 :FeS04‘7H20 0,0004

Vand 98,5596 *N-Z-Amin A, Sheffield Chemical Co., Norwich, N.Y.

Skråfladen blev podet med Aspergillus rugulosus NKRL 8113, og den podede skråflade hlev inkuberet ved 25°C i cirka 7 dage. Den modne skråkultur hlev dækket med okseserum og afskrabet med sterile løkker for at løsne sporerne. Halvdelen af den fremkomne suspension hlev anvendt til at pode 50 ml af et vegetativt medium med følgende sammensætning:

Ingrediens Mængde ($)

Saccharose 2,5

Melasse 3,6

Majsstøbevand 0,6

Enzymatisk hydrolysat af casein 1,0 E2HP04 0,2

Vand 92,1 *N-Z-Case, Sheffield Chemical Co., Norwich, N.Y.

Det podede vegetative medium inkuberedes i en 250 ml Erlenmeyer-kolbe ved 25°C i 24 timer på en roterende rystemaskine med en slaglængde på 50 mm og med en rotationshastighed på 250 omdrejninger pr. minut.

Dette vegetative medium kan anvendes direkte til at pode andet-trins-mediet. Alternativt og fortrinsvis kan det oplagres til senere brug ved at holde kulturen under et nitrogendække. Kulturen fremstilles til en sådan oplagring i mange små prøver som følger: I hver prøve anbringes 2 ml podet vegetativt medium og 18 1A3608 2 ml af en glycerol-lactose-opløsning med følgende sammensætning:

Ingrediens Mængde

Glycerol 20 $ lactose 10 $

Afioniseret vand 70 $

De fremstillede suspensioner oplagres i en nitrogenatmosfære,

En oplagret suspension (1 ml), der blev fremstillet som ovenfor» anvendtes til at pode 50 ml af et førstetrins vegetativt medium med samme sammensætning som beskrevet ovenfor. Det podede førstetrins vegetative medium inkuberedes i en 250 ml bredhalset Erlenmeyer-kolbe ved 25°C i 22 timer i en rystemaskine som beskrevet ovenfor.

B, lank-fermenterlng

Eor at fremstillet et stort volumen podemedium anvendtes 10 ml af ovenfor beskrevne inkuberede første trins vegetative medium til at pode 400 ml af et andet trins vegetativt vækstmedium med samme sammensætning som det vegetative medium. Andet trinsmediet inkuberedes i en 2 liter Erlenmeyer-kolbe ved 25°C i 25 timer på en rystemaskine som ovenfor.

Det inkuberede andet trins vegetative medium (800 ml) fremstillet ovenfor anvendtes til at pode 100 liter sterilt produktionsmedium med følgende sammensætning:

Ingrediens Mængde

Glucose '25 g/liter

Stivelse 10 g/liter

Pepton*· 10 g/liter

Melasse 5 g/liter

Enzymatisk hydrolysat af casein## 4 g/liter

MgS0^*7H20 0,5 g/liter 19 143608

Ingrediens Mængde

Czapek’s mineral-stamopløsning 2,0 ml/liter

CaC05 2,0 g /liter lonbyttet vand op til 1 liter P. No. 159, Index biomedical Corp., Glenwood, 111.

N-Z-Amin A, Sheffield Chemical Co., Norwich, N.Y.

**#Czapek’s mineral-stamopløsning har følgende sammensætning:

Ingrediens Mængde

EeS0^*7H20 (opløst i 2 ml kone. HCl) 2 g EC1 100 g

MgS04-7H20 100 g

Ionbyttet vand svarende til 1 liter

Mediets pH-værdi var 6,8 efter sterilisering ved autoklavering ved 121°C i 30 minutter ved et tryk på 35-40 kg. Det podede produktionsmedium fik lov at fermentere i en 165 liter fermenterings-tahk ved en temperatur på 250C i 4 dage. Fermenteringsmediet blev gennemluftet med steril luft ved en hastighed på 0,5 volumen/vo-lumen/minut. Fermenteringsmediet omrørtes med konventionelle om-rørere ved 300 omdrejninger pr. minut.

M§^411else_af_den_antibiotiske_blanding_A-30912

Hele fermenteringsmediet (200 liter), opnået ved fremgangsmåden beskrevet i eksempel 1, omrørtes grundigt med 200 liter methanol i en time og filtreredes herefter, idet der anvendtes filterhjælp (Hyflo Super-cel, en diatoméjord, Johns-Manville Products Corp.). Filtratets pH-værdi indstilledes til 4,0 ved tilsætning af 5N saltsyre. Det sure filtrat ekstraheredes to gange med lige store 143608 - - 20 mængder chloroform. Chloroformekstrakterne blandedes og koncentreredes under vakuum til et volumen på cirka 4 liter. Dette koncentrat sattes til 60 liter diethylether til udfældning af blandingen af de antibiotiske komponenter. Bundfaldet adskiltes ved filtrering og tørredes til opnåelse af 38 g af den omhandlede antibiotiske blanding som et gråt pulver. Filtratet koncentreredes under vakuum til opnåelse af en olie. Denne opløstes i 500 ml methanol. Methanolopløsningen sattes til diethyletheren (7,5 liter) til udfældning af en yderligere mængde antibiotisk blanding. Dette bundfald separeredes også fra ved filtrering og tørredes til opnåelse af yderligere 3,5 g af den antibiotiske blanding.

EKSEMPEL 2

Isolering af den antihiotiske_komponent_A

Den antibiotiske blanding A-30912 (20 g) opnået som beskrevet i eksempel 1 anbragtes i en silicagelkolonne (4 x 107 cm) i aceto-nitril:vand (95*5). Kolonnen elueredes med acetonitril:vand (95:5) med en hastighed på 1-2 ml pr. minut, og der opsamledes fraktio ner. med et volumen på cirka 20 ml. Eraktioneme blev analyseret ved hjælp af tyndtlagschromatografi på silicagel, idet der som opløsningsmiddel anvendtes acétonitril:vand (95:5) og Candida albi-Cans-bioautografi.

Fraktionerne 74 - 125 kombineredes og koncentreredes. Den koncentrerede opløsning krystalliserede ved henstand til opnåelse af yderligere 124 mg sterigmatocystin. Fraktionerne 212-273 blandedes og koneentreredes under vakuum til opnåelse af en olie. Denne opløstes i et lille volumen methanol. Methanolopløsningen sattes til 15 volumen diethylether. Bundfaldet, der dannedes, frasepareredes og tørredes til opnåelse af 23 mg antibiotieum A-30912, komponent D. Fraktionerne 274-437 indeholdt komponenterne A, B, C og D. Fraktionerne 482-900 indeholdt komponenterne A, E, F og G·. Fraktionerne 438 - 481 kombineredes og koncentreredes under vakuum til opnåelse af en olie. Denne opløstes i en lille mængde methanol, og methanolopløsningen sattes til 15 volumen diethylether. Bundfaldet, der dannedes, frasepareredes og tørredes til opnåelse af 2,17 g af den omhandlede komponent A.

21 143608

EKSEMPEL

iS2lS£iSS_S£-!ilii5i2ii£HS_^:z222i2i komponentJD

En særlig oprenset antibiotisk blanding indeholdende de omhandlede komponenter B, C og B blev opnået som beskrevet i eksempel 2 fra fraktionerne 274-437<> 750 mg af dette materiale kromato- graferedes på en silicagelkolonne (2,2 x 51 cm, Woelm silicagel), og der opsamledes fraktioner, der havde et volumen på ca. 15 ml, idet der elueredes-med følgende opløsningsmidler:

Eraktioner Opløsningsmiddel 1-25 acetonitril 26-62 acetonitril + 1 $ vand 65-700 acetonitril + 1,5 1° vand

Portionerne måltes ved hjælp af silicatyndtlagskromatografi, idet der anvendtes acetonitril:vand (95:5) og benzen:methanol (7:5) som opløsningsmiddelsystemer og Candida albicans-bioauto-grafi. .Fraktionerne 535 - 685* der indeholdt den omhandlede komponent D, blandedes og koncentreredes under vakuum til opnåelse af en olie. Denne opløstes i en lille mængde methanol og sattes til diethylether (15 volumen), og bundfaldet, der dannedes, frasepareredes ved filtrering og tørredes til opnåelse af 69 mg af den antibiotiske komponent D.

EKSEMPEL 4

Isolering af A-30912, komponenterne B og C

En delvis oprenset antibiotisk blanding indeholdende komponenterne A, B, C og D opnåedes som beskrevet i eksempel 2 fra fraktionerne 212-457. 18 gram af dette materiale opløstes i en minimal mængde acetonitril:vand (4:1) og kromatograferedes på en alumi-niumoxidkolonne (5,8 x 56 cm), og der opsamledes fraktioner med et volumen på cirka 20 ml. Kolonnen elueredes med følgende opløsningsmidler :

22 1A36OB

Praktioner Opløsningsmiddel 1-300 acetonitril:vand (4:1) 301-509 acetonitril:vand (7:3).

Kolonnefraktionerne blev analyseret ved tyndtlagschromatografi på silicagel som beskrevet"! eksempel 3· På basis af disse resultater kombineredes fraktionerne og konoentreredes til olier. De olieagtige remanenser opløstes i en lille mængde methanol, og methanolopløsningeme udfældedes med 10-15 volumen die thy le ther.

Den måde, fraktionerne dannedes på, vægten af det fremstillede stof samt indholdet af komponenter er anført nedenfor.

Praktion 7ægt (g) Komponent 6-28 0,23*

6-28 5,80 A-30912, 0, D

34-114 2,90 A-30912, B

115-164 1,20 A-30912, A, B

165-509 1,90 A-30912, A

w uopløseligt materiale opnået før etherudfældningen.

Por at oprense komponent C opløstes 2 gram af fraktionerne 6-28 1 methanol, der adsorberedes på en tilstrækkelig mængde silicagel (kvalitet 62), der tørredes, og produktet sattes til toppen af en silicagelkolonne (1,9 x 80 cm, kvalitet 62) pakket i acetonitril. Kolonnen elueredes med acetonitril med en strømningshastighed på 2 ml/minut, idet der opsamledes fraktioner med et volumen på cirka 10 ml. Yed fraktion 117 skiftedes opløsningsmidlet til acetonitril:vand (99:1). Kolonnefraktionerne måltes igen ved hjælp af tyndtlagskromatografi. På basis af TIO-resultaterne kombineredes fraktionerne og koncentreredes til opnåelse af olieagtige remanenser« Disse opløstes i en lille volumen methanol, og methanolopløsningeme udfældedes med 10-15 volumen diethylether. Komponentindholdet og vægten af fraktionerne af interesse er anført nedenfor;