KR850001939B1 - A-32724 항생물질의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

내용 없음.

Description

A-32724 항생물질의 제조방법
제1도 : A-32724인자 A의 KBr 펠렛법에 의한 적외부 흡수 스펙트럼.
제2도 : A-32724인자 B의 KBr 펠렛법에 의한 적외부 흡수 스펙트럼.
제3도 : A-32724인자 C의 KBr 펠렛법에 의한 적외부 흡수 스펙트럼.
본 발명은 항균제, 항진균제로서 활성을 나타낼뿐 아니라 효소억제 활성을 나타내는 신규의 A-32724항생물질의 제조방법에 관한 것이다. 또한 이들은 혈압 강하제로써도 효과를 나타낸다.
선행문헌(Kumagai et al., J. Antibiot,24(12), 870 875(1971))에 스트렙토마이세스에 의해 생성된 효소억제제인 파노시알린(panosialin)의 화학적 특징이 기술되어 있다. 그에 의하면 시알리다제, 산 포스파타제 및 폴리갈락투로나제를 억제하는 파노시알린은 5-알킬벤젠-1,3-디설페이트의 혼합물이라 한다. 세가지의 주성분의 구조는 5-이소펜타데실벤젠-1,3-디설페이트; 5-n-펜타데실벤젠-1,3-디설페이트; 및 5-이소헥사데실벤젠-1,3-디설페이트로 확인되었다. 파노시알린의 생물학적 효과, 분리 및 확인법이 Aoyagi 등의 J. Antibiot, 24(12), 860-869(1971)에 기술되어 있다.
또한 Yaginuma 등의 J. Antibiot33(3), 337-341(1980)에서는 케토멜라라피겔라 M4854의 배양여액으로부터 수득한, M4854- I 및 M4854- II로 확인된 두가지의 수용성, 산성, 황-함유물질의 분리, 물리화학적성질 및 생물학적 분석법을 기술하고 있다. 이 물질은 일부의 β-락탐아제에 대해 효소-억제효과를 나타낸다는 것이 입증되었다.
본 발명에 이르러 항생물질 A-32724인자 A,B 및 C로 이루어진 항생물질 A-32724 혼합물, 항생물질 A-32724인자 A, A-32724인자 B 및 A-32724인자 C로 이루어진 A-32724 항생물질 그룹을 발견했다.
이 항생물질 혼합물은 이제까지 기술된 바 있는 케토멜라 라피게라 스위프트(Chaetomella raphigera Swift) NRRL 12331 균주(기탁기관 : 한국과학기술원, 기탁일 : 1982년 8월 26일, 기탁번호 : 820826-05011)를 배양시켜 (이를 배양물 A-32724로 표시한다)제조한다. 이러한 A-32724 항생물질은 일부의 효소에 대해 억제효과를 나타내며, 혈압강하 작용을 나타낸다.
발효분야 및 본 명세서에서 사용된 "혼합물"이란 용어는 공동-생산된 개별적인 항생물질 인자의 혼합물을 말한다. 발효에 의한 항생물질 제조에 익숙한 전문가라면 이해하듯이, 항생물질 혼합물중의 개별적 인자의 수와 비율은 발효조건 및 사용균주에 따라 달라진다.
A-32724 미생물의 특징
A-32724는 듀테로마이세츠의 스파에롭시달레스목 중의 케토멜라속의 한 종이며, 분포자기(pycnidium) 또는 불완전 상태를 기준하여 분류한다. 완전한 상태는 알려진바 없다. 케토멜라속은 분명한 두가지 특징에 의해 아메로스포륨속과 구별한다. 케토멜라속에서는, 분생포자(conidium)는 투명하며 분포자기는 봉선(raphe)을 나타내는데 이는 상부 분포자기 벽을 따라 박-벽성 세포로 이루어진 세포선이며 후-벽성의 암갈색 세포와 인접되어 있다. 봉선은 일반적으로 각 공(Ostiole)의 역할을 하며 이를 통해 분생포자가 방출된다. 더 성숙한 분포자기에서는 봉선을 쉽게 구별할 수 없는데 분포자기 벽의 색이 어두워지기 때문이며, 따라서 봉선은 암색융선으로 보이기도 한다. 아메로스포륨의 경우에는, 봉선이 나타나지 않으며 분생포자는 녹색을 띤다.
배양물 A-32724은 케토멜라 라피게라 스위프트 균주로 분류하는데, 이는 배양물 A-32724를 직접 관찰하고 이의 특징을 케토멜라 오브론가, 케토멜라 서시노세타, 케토멜라 라피게라 및 케토멜라 아큐티세타에 관한 기술(A.C. Stolk The Genus Chaetomella Fuckel, Transactions of the British Mycological Society 46(3), 409425(1963); 및 B.C. Sutton 등, "Revision of Chaetomella, and Comments upon Vermiculariopsia and Thyriochaetum", Transactions of the British Mycological Society 66(2), 297-303(1976)과 비교한 결과를 근거로 한다.
맥아즙 한천 배지상에서 배양된 A-32724는 12일내에 직경이 50mm 까지인 콜로니를 이루는데, 이는 대상성, 연활성(velutinous)을 나타내며, 베이지색 내지 회색빛을 띤다. 분포자기는 불규칙하게 산포되거나 대사성을 나타내는 경우도 있다.
분포자기는 짧은 섬유성 균병상 표재성이며, 아구형 내지 타원형이거나 신장형이다. 분포자기는 건조해지면 붕괴되며, 처음에는 무색이다가 갈색 내지 흑색으로 변한다. 균병은 실네마틴성 또는 섬유성속(bundle)으로써 생겨나서 분포자가 생성됨에 따라 원심적으로 팽창한다. 분포자기는 구별되는 세개의 세포층으로 이루어진다 : 초기에 방사성으로 나타나는 섬유성, 무색의 외층; 시간이 지남에 따라 갈색 내지 흑색으로 변하는 위유조직(pseudoparenchyma)중간층; 분생포자병이 생성되는 무색의 위유조직내층. 각 분포자기의 외부표면은 불규칙하게 산포된 강모(setae)로 둘러싸여 있다. 성숙한 분포자기의 외관은 길이가 185 내지 335μ이며 폭이 148 내지 234μ이고, 평균크기는 266×184μ이다.
분생포자병은 불규칙하게 가지를 뻗은 무색의 모상(filiform)이며, 길이가 80μ 까지인 굴곡성 필라멘트를 이룬다. 분생포자 생성세포는 단일경자성(monophialidic), 격벽성, 행렬식이며 불규칙하게 분포되기도 하는데, 이러한 특징에서 벗어나는 경우도 많다. 분생포자는 경자(phialide, 梗子)의 끝부분에서 생성되며, 무색이고, 흔히는 무격벽성, 방추상 내지 요막상(allantoid)이거나 보트형이다. 분생포자는 길이가 5.4 내지 7.1μ이며 폭이 1.6 내지 2.0μ이며, 평균 6.0×1.7μ이다. 분생포자는 크립색 점성기질중으로 방출된다.
A-32724에서, 강모는 두가지 형태로 나타나는데, 직선형(형태 I) 및 첨단구상(鉤狀, hamate)형 (형태 II)으로 구별한다. 형태 I 강모는 다음 문헌(Sutton et al., "Revision of Chaetomella, and Comments upon Vermiculariopsia and Thyriochaetum", Transactions ofthe British Mycological Society 66(2), 297-303(1976)에, 케토멜라 선정기준인 케토멜라 오브론가 후켈을 따라 장방형으로 기술되어 있다.
A-32724 배양물에서, 일부의 강모는 직선형이며 곤봉-상을 나타내고 신장된 말단세포는 반투명하다. 위유조직중에 묻혀있는 기부세포(basal cell)는 불규칙적으로 늘어나며, 때로는 변형된 족상세표로 나타나기도 한다. 기부세포는 분포자기 표면에서 약 5.75μ의 폭을 가지며; 중간세포는 약 3.4μ 폭을 가지며; 정단세포(apical cell)의 폭은 약 5.3μ이다. 정단세포는 일반적으로 둔형(obtuse)이나 예형(acute)인 경우도 있다. 정단세포의 길이는 44.5μ 내지 66.6μ이며, 평균길이는 51.6μ이다.
A-32724에서 나타나는 강모의 두번째 형태는 첨단 구상형인데, 그 회전수는 1회 이하이다. 끝부분은 둔형이며 때로는 예형이기도 하다. 기부세포는 상술한 첫번째 형태의 강모의 그것과 유사하나, 이러한 두번째 형태의 강모에서 강모의 발육은 첫번째 형태의 경우보다 늦다. 두번째 형태의 강모의 색은 첫번째 형태와 유사하다. 두번째 형태의 강모는 길이가 58.2 내지 92μ이며, 평균길이는 77.4μ이다.
A-32724 배양물에서, 제2의 분생포자 생성구조인 분생자좌(sporodochium)가 신네마틴성 균사속(보통 중심부위에 제한되어 있다)으로부터 생겨나는데, 섬유성 사시계균병(hourglass stipe)으로 나타난다. 이의 분생포자는 분포자기의 그것과 유사하며 시간이 지남에 따라 어두워지는 크립색 점질성 포자이다. 분생자좌는 흔히 강모성이다.
오우트밀 한천 배지상에서, A-32724는 12일 내에 직경 65mm인 콜로니를 이룬다, 콜로니는 불규칙한 톱니모양이며, 분포자기가 처음 관찰되는 주름을 따라 방사상으로 주름을 이룬다. 시간이 지남에 따라, 분포자기는 전표면 전체에 걸쳐 단일로 또는 집합적으로 불규칙하게 나타난다. 콜로니의 표면은 초기에는 백색이나 베이지색으로 변하며, 평평하며 연활성을 나타낸다. 분포자기는 성장이 거의 중지될때 쯤에는 최대로 증가하여, 균사체 표면을 누르게되어 공중균사가 거의 없는 상태로 변화시킨다. 말단부위는 불규칙한 톱니모양 내지 열편상(lobate)이다. 콜로니의 뒷부분은 황백색을 나타내는데, 시간이 지남에 따라 연갈색으로 된다.
분포자기는 균병을 갖고있으며, 아구형 내지 신장형이고, 강모성이며 탄소질성이다. 이들은 처음에는 무색이나 갈색 내지 흑색으로 변한다. 세로봉선은 무색 내지 연갈색을 나타내는 어린 분포자기에서 가장 쉽게 구별되며, 여기에서 봉선의 박-벽성 무색세포는 후-벽성 암갈색 세포로 둘러싸여 있다.
성숙한 흑색 분포자기에서는, 봉선은 상부 분포자기 표면을 가로질러 예리한, 중단되지 않은 세로 융선으로 나타난다. 오래되고 건조한 분포자기의 벽은 흔히 붕괴되어, 외관상 분명한 신장형을 나타낸다. 오우트밀 한천상의 분포자기의 크기는, 길이가 233 내지 319μ이며, 폭은 156 내지 217μ이고, 평균 272×179μ이다. 맥아즙 한천배지의 경우와 같이, 강모는 연갈색이며 2내지 6개의 세포로 이루어지며 두가지 형태로 나타낸다. 두 형태 모두 맥아즙 한천배지의 경우와 동일하게 기록될 수 있다. 형태 I의 길이는 44 내지 55μ, 평균 51μ이다. 그 폭은 분포자기 표면에서 5μ이며, 중간부분에서는 3.4μ이며 정단세포에서는 5μ의 폭을 나타낸다. 형태 II인 첨단구상 강모의 길이는 42 내지 74μ, 평균 70μ이며, 폭은 3 내지 3.4μ이다. 형태 I 강모는 맥아즙 한천 배지상의 그것과 거의 동일한 디멘션을 나타낸다. 형태 II 강모는 맥아즙 한천 배지상의 그것보다 짧을수도 있으나, 그 디멘션은 문헌에 기술된 범위내에 포함된다.
감자-덱스트로스 한천상에서, A-32724는 12일내에 직경 50mm인 콜로니를 이룬다. 공중균사는 콜로니 중심에서 직경 30mm 부위에 주로 나타난다. 이 균사체 부위는 평평하며 연활성인데, 처음에는 백색이나 점차 연회색으로 변한다. 콜로니내의 선형화(扇形, sectoring)로 불규칙한 열편상 외관을 나타내며 이는 분포자기의 갈색 내지 흑색으로의 변화 및 분생자좌의 증가로 뚜렷해진다. 열편간의 균사체 부위는 눌리워져 분포자기가 거의 없으며, 제한된 수의 분생자좌가 존재한다. 균사체 가장자리의 폭 5mm 부위는 침적되어 있다.
감자-덱스트로스 한천 배지상의 분포자기의 특징은 맥아즙 및 오우트밀 한천에서 전술된 바와 같다. 감자-덱스트로스 한천상 분포자기의 완성속도는 한천배지가 건조됨에 따라 증가된다. 이들 분포자기의 길이는 218 내지 288μ이며 폭은 140내지 210μ이고 평균 265×180μ이다. 곤봉상 강모의 길이는 38내지 52μ이며 평균 길이는 42μ이다. 구상강모의 길이는 46 내지 70μ이며, 평균 58μ이다. 각 형태의 직경은 맥아즙 및 오우트밀 한천의 경우에 기술된 바와 일치한다. 오우트밀 및 감자-덱스트로스 한천 배지상의 분생포자병, 경자 및 분생포자의 형태학 및 디멘션은 맥아즙 한천배지 경우에 전술한 바와 같다.
분생자좌는 세가지 배지 모두에서 유사한 형태로 나타나며, 분생자좌의 발육은 과다한 수분에 의해 촉진된다. 이러한 이유로 맥아즙 및 오우트밀 한천보다 습윤성이 큰 감자-덱스트로스 한천 배지상의 분생포자기에 나타나는 분생자좌가 더 크다. 분생자좌는 3가지 한천배지에 따라 모든 디멘션에서 전술한 바와 같이 광범위하게 달라질 수 있다.
표면에 위치하는 상부 분생포자기는 그 가장자리가 언제나 주로 곤봉상인 강모로 둘러싸여 있다. 분생자좌의 분생포자는 분포자기의 그것과 비교할만 하다. 그러한 분생자좌가 케토멜라속의 대표적인 변태형태이나, 종 분류에 있어 중요한 인자는 아니다.
A-32724는 형태 I 및 형태 II의 강모를 무두 가지므로, 형태 I 강모만을 갖는 케토멜라 오르론가와 구별된다. A-32724의 강모는 또한 케토멜라 서시노세타의 강모와도 구별되는데, 시이. 서시노세타 역시 두가지 형태의 강모를 갖지만 그중 한 형태는 그 첨단에서 분명한 1 내지 4히의 나선형을 이루고 있으며 이러한 강모는 12개까지의 격벽을 가지며 그 길이는 900μ까지이다. 시이. 서시노세타의 강모의 두번째 형태는 첨단이 곤봉상이며 길이가 60 내지 180μ이다. 시이. 서시노세타의 강모의 두 형태는 흔히는 A-32724의 강모보다 길고 좀더 복잡하다. 또한 시이. 서시노세타의 분생포자는 A-32724의 그것보다 약 2배정도 같다. 강모 및 분생포자는 A-32724를 다른 케토멜라종과 구별하는데 도움이 된다.
세가지 배지상의 배양물 A-32724에 있어 분포자기 및 강모, 분생포자 발생세포, 및 분포자기 포자를 포함한 그의 여러요소의 형태학적 특성은 서로 일치하여 선행문헌에 기술된 바와도 일치한다.
A-32724 항생물질의 제조에 유용한 케토멜라 라피게라 스위프트 배양물은 처음에 네덜란드 안틸레스의 쿠라카오에서 수집한 토양 샘플로부터 분리하였으며, Northern Regional Research Center, U.S. Department of Agriculture, Agriciltural Research Service, Peoria, III inois, 61604)의 저항배양물 클렉션에 기탁되었으며, 그로부터 NRRL 12331이란 번호로 이용할 수 있다.
다른 세균의 경우와 마찬가지로, A-32724-생성배양물인 케토멜라 라피게라 스위프트 NRRL 12331(기탁번호 820826-05011)에도 변이(variation)가 일어난다. 예를들어 NRRL 12331 균주의 자연변종, 돌연변이체(자연적 또는 유도성), 접합기 염색체 변형체 및 조환체(recombinats)(DNA 또는 플라스미드 조환체를 포함), 또는 NRRL 12331 균주로부터 유도된 A-32724 항생물질을 생성하는 균주를 본 발명에 사용할 수 있다.
A-32724 혼합물은 몇가지의 개별적 인자를 함유한다. 분리된 인자들은 A-32724 인자 A, B 및 C로 표시한다. 유용성의 기술에서 "A-32724 항생물질"이란 용어는 편의상 A|32724 혼합물 및 A-32724 인자 A, B 및 C로 이루어진 그룹중에서 선택된 성분을 나타내는데 사용된다.
본 발명의 A-32724 인자는 구조적으로 서로 관련되어 있다. 발효로부터 3가지의 항생물질 인자가 히수되며, 혼합물인 A-32724 혼합물로써 수득한다. A-32724 혼합물중의 인자의 비는 사용한 발효조건에 따라 변화될 수 있다.
다음 단락은 이제까지 확인된 A-32724 인자의 물리적 특징 및 스펙트럼상의 특징을 설명한다.
항생물질 A-32724 인자 A는 백색의 무정형 분말인데, 융점은 약 175 내지 176℃(분해)이며, 분자량은 약 738이고 실험식은 C33H56O11S2Na2로 표시되는데 이는 핵자기공명(NMR)스펙트럼, 설페이트측정, 및 장-탈락(field-desorption) 및 전자충격질량 분광분석(electron-impact mass spectometry) 결과를 종합하여 결정되었다.
A-32724 인자 A의 제제를 0.2몰 염화암모늄 용액의 형태로 장-탈착 질량 분광분석을 시행한다. 이러한 조건하에서, 인자 A의 경우에는 694(유리산); 614(유리산-SO3); 597(유리산, -SO3, -H2O, +H+): 517(유리산, -2SO3, -H2O, +H+); 및 456 피크가 나타난다.
A-32724 인자 A의 적외부 흥수스펙드럼(KBr 펠렛)은 제1도와 같다. 관찰되는 흡수극대는 다음과 같다 : 3426(강), 2923(강), 2852(강), 1736(중), 1720(중), 1616(중), 1590(중), 1458(중), 1383(쇼울더), 1375(중내지 약), 1241(매우 강), 1123(약), 1068(강), 981(강), 884(약), 865(약), 803(중), 771(중내지 약), 722(약), 685(약), 625(약), 및 581(약)cm-1.
항생물질 A-32724 인자 A수용액의 자외부 흡수스펙드럼은 염기 또는 산 적정에 의해 변화되지 않으며, 다음 표 1과 같은 흡수극대를 보인다 :
[표 1]
항생물질 A-32724인자 A의 uv 분광광도 측정
Figure kpo00001
maxnm(ε)
265nm(333)
271nm(sh)1(252)
sh=쇼울더
100MHz에서 TMS를 내부표분으로 하여 측정한 항생물질 A-32724 인자 A의 DMSO-d6중에서의 프로톤 자기공명 스펙드럼 결과는 다음 표 2와 같다 :
[표 2]
A-32724 인자 A의 프로톤자기공명 스페드럼
Figure kpo00002
TMS를 내부표준으로 하여 DMSO-d6중에서 측정한 항생물질 A-32724인자 A의12C NMR 스펙드럼은 몇가지 특징을 보인다. ppm 단위로 나타낸 케미칼 쉬프트는 다음 표 3과 같다.
[표 3]
A-32724 인자 A의13C NMR 케미칼 쉬프트
Figure kpo00003
Figure kpo00004
1은, 두 탄소원자를 나타내며 방향족환을 통한 이-중 대칭축을 나타낸다.
2는 탄화수소쇄의 몇개(결정되지 않은 수 )의 탄소를 나타낸다.
3은 하나이상의 탄소원자를 나타낼 수 있다.
상술한 물리적/화학적 데이타를 종합하여 이로부터 추정한 항생물질 A-32724 인자 A의 구조식은 다음과 같이 나타낼 수 있다 :
Figure kpo00005
항생물질 A-32724 인자 B는 백색의 무정형 분말로서, 융점이 약 160 내지 162℃(분해)이며 분자량이 약 738이며 C33H56O11S2Na2의 실험식으로 표시하는데, 이러한 특징은 그의 NMR 스펙드럼, 설페이트 측정 및 전자-충격 및 장-탈착 질량분석 데이타를 종합하여 구한 것이다.
A-32724 인자 B의 제제를 0.2몰 염화암모늄 용액의 형태로 장-탈착 질량분광 분석한다. 이러한 조건하에서 인자 B는 동일하게 처리한 인자 A의 경우에 관찰된 바와 동일한 피크를 나타낸다.
A-32724 인자 B의 적외부 흡수스펙드럼(KBr 펠렛)은 제2도와 같다. 관찰되는 흡수극대는 다음과 같다 : 3468(강), 3452(강), 2923(강), 2853(강), 1733(중), 1616(중), 1591(중내지 약), 1455(중), 1376(약), 1242(매우 강), 1124(약), 1068(강), 1032(쇼울더), 980(강), 905(약), 795(중), 767(중내지 약), 721(약), 684(약), 670(쇼울더), 662(쇼울더), 617(중내지 약), 및 579cm-1(중).
항생물질 A-32724 인자 B수용액의 자외부 흡수스펙드럼은 중성 조건하에서 다음 표 4화 같은 흡수극대를 보인다 :
[표 4]
항생물질 A-32724 인자 B의 uv 분광 광도측정
Figure kpo00006
maxnm(ε)
265nm(321)
271nm(sh1)(249)
100MHz에서 TMS를 내부 표준으로하여 구한 DMSO-d6중 항생물질 A-32724 인자 B의 프로톤 자기공명 스펙드럼은 다음 표 5와 같다 :
[표 5]
A-32724 인자 B의 프래톤 자기공명 스펙드럼
Figure kpo00007
TMS를 내부 표준으로 사용한, DMSO-d6중 항생물질 A-32724 인자 B의13C 핵자기 공명스펙드럼은 몇가지 특징을 보인다. ppm 단위로 나타낸 케미칼 쉬프트는 다음 표 6과 같다.
[표 6]
A-32724인자 B에 대한13C NMR 케미칼 쉬프트 B
Figure kpo00008
1은 두 탄소원자를 나타내며, 방향족 환을 통한 이중 대칭축을 나타낸다.
[표 6(계속)]
A-32724인자 B의13C NMR 케미칼 쉬프트
Figure kpo00009
2는 탄화수소 쇄의 몇개(결정되지 않은수)의 탄소를 나타낸다.
NMR스펙드럼의 쉬프트 결과를 기준할때, 인자 B는 두메틴상의 키랄리티에 관해 인자 A와 구조가 다르며, 또한 아세틸그룹의 위치에 있어서도 차이가 있다.
항생물질 A-32724인자 C는 융점이 약 185 내지 186℃인 백색의 결정성 물질이다.
A-32724인자 C의 적외부 흡수 스펙트럼(KBr 펠렛법)은 제3도와 같다. 관찰되는 흡수 극대는 다음과 같다 : 3498(중), 3452(중), 2922(강), 2851(강), 1733(강), 1724(강), 1652(강), 1616(중), 1591(중)1465(중), 1455(중), 1409(약), 1378(중), 1257(매우강), 1132(약), 1065(강), 1054(쇼울더), 1025(약), 981(강), 880(약), 865(약), 795(중), 721(약), 664(약), 657(약), 620(약), 594(약), 580(약), 563(약), 및 481cm-1(약).
TMS를 내부 표준으로하여 100MHz에서 측정할때 DMSO-d6중 항생물질 A-32724인자 C의 프로톤자기공명 스펙트럼은 다음과 같다.
[표 7]
A-32724인자 C의 프로톤자기 공명스펙트럼
Figure kpo00010
항생물질 A-32724인자 C수용액의 자외부흡수 스펙트럼은 262nm에서 흡수 극대를 보이며 이때의 "T9" = 3.31이다.
인자 C는 인자 A와 밀접하게 관련되어 있으며, 일정시간 메탄올중에 정치시키거나 메탄올중에서 가온하면 인자 A로 변형된다.
세가지 인자 모두 물 및 메탄올에 용해된다.
A-32724 혼합물의 인자 A, B 및 C는 각각 실리카겔박층 크로마토그래피(TLC) 및 페이퍼크로마토 그래피에 의해 분리할수 있다. 스타필로코거스 오레우스를 이용하여 바이오오토그래피를 수행한다. 인자 A, B 및 C의 대략적인 Rf치는 다음 표 8과 같다.
[표 8]
Figure kpo00011
Figure kpo00012
2/박층 계
매질 : 머크, 다름슈타트-실리카겔 60
용매 : D=아세톤 : 물(19 : 1)
인자 A, B 및 C를 각각 전위차 적정한 결과, pKa치는 모두 3미만이다. 이와 같은 사실은 각각 인자가 암모늄 및 치환된 암모늄이온 뿐 아니라 알칼리금속 및 알칼리토금속과 염을 생성하리라는 것을 암시 해준다.
본 발명은 a) 케토멜라 라피게라 스위프트 NRRL12331(기탁번호 820826-05011), 또는 그의 A-32724 생성 변종 또는 돌연변이종을 탄소, 질소의 동화원 및 무기염을 함유하는 배양배지를 사용하여 액침 호기성 발효조건하에 배양시켜 상당량의 항생물질활량이 생성될때까지 배양시키고;
b) 임의로 항생물질 A-32724 혼합물을 배양배지로부터 분리하고;
c) 임의로 항생물질 A-32724인자 A, B 또는 C를 단리하는 것을 포함하여 항생물질 인자 A, B 및 C로 이루어진 항생물질 A-32724 혼합물, 항생물질 A-32724 인자 A, 항생물질 A-32724 인자 B 및 항생물질 A-32724 인자 C로 이루어진 그룹에서 선택된 A-32724 항생물질을 제조하는 방법을 제공한다.
발효 미생물에 의해 상당량의 항생물질활량이 생성되는 경우, 일반적으로 거의 대부분의 항생물질 활량은 육즙과 관계되나, 균사체에도 약간의 항생물질 활량이 존재한다.
A-32724 항생물질 혼합물의 가장 쉬운 분리방법은 필터에이드를 사용한 여과에 의해 발효육즙을 발효 혼합물로부터 회수하는 것이다. 필터에이드 및 균사체로 이루어진 필터케이크는 남겨둔다. 여과한 육즙을 n-부탄올 같은 적절한 용매동량으로 육즙 pH에서 추출하고, 조 A-32724 혼합물을 함유하는 추출물을 소량의 용적으로 농축시킨다. 김겨두었던 필터케이크를 메탄올로 추출한다. 추출물을 농축시켜 메탄올을 제거하고, 잔류하는 수층을 물로 포화시킨 n-부탄올로 추출하고, 수층을 버린다.
균사체의 메탄올 추출물 및 육즙의 부탄올 추출물을 각각 농축시켜 오일을 생성하고, 이를 메탄올에 가해 대량의 이소프로필 알콜에 붓는다. 생성된 활성침전을 여과한다. 균사체 및 여과육즙으로부터 수득된 조 A-32724는 크로마토 그래프적 방법에 의해 각각의 인자로 분리정제할수 있다.
여러가지의 매질을 사용하여 케토멜라 라피게라 스위프트 NRRL12331(기탁번호 8208236-05011)을 배양시켜 A-32724 혼합물을 생성한다.
그러나 제조의 경제성, 최적수율 및 생성물 분리의 용이성을 고려할때 특정한 배양배지가 바람직하다. 예를들어 바람직한 탄소원으로는 글루코스, 슈크로스, 덱스트로스, 말토스 및 글리세롤이 있다. 탄소원의 최적 농도는 약 2 내지 약 6중량퍼센트이다. 적절한 질소원에는 펩톤 및 효소-가수분해 카세인이 포함된다.
미생물의 생장 및 발육에 필요한 필수 미량원소가 배지의 다른 성분중에불순물로써, 미생물의 생장 및 생합성을 위한 요구량을 충족시킬수 있는 양만큼 존재할수도 있으나, 배지중에 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 암모늄, 클로라이드, 카보네이트, 포스페이트, 설페이트, 나이트레이트등과 같은 이온을 생성할 수 있는 용성 영양 무기염류를 추가로 혼합하는 것이 유리할수 있다.
상당량의 A-32724 항생물질 혼합물을 생성하려면, 탱크중 액침 호기성 발효가 바람직하다. 그러나 소량의 A-32724 항생물질 혼합물은 진탕-플라스크 배양법에 의해 수득할수도 있다. 탱크 발효의 경우, 증식성(vegetative) 접종물을 사용하는 것이 바람직하다. 소량의 배양배지를 포자형, 균사체 또는 동결건조 펠렛형의 미생물로 접종시켜, 새로운 왕성하게 생장하는 미생물의 배양물을 수득하여 증식성 접종물을 제조한다. 증식성 접종물을 더 큰 탱크에 옮기고, 적절한 시간동안 배양시키면 A-32724항생물질 혼합물이 최적 수율로 생성된다.
A-32724 항생물질 혼합물의 생성 최적온도는 약 25℃이다.
호기성 액침 배양법에서 통상 그렇듯이, 멸균 공기를 배지중에 통해준다. 미생물의 효과적인 생장을 위해, 탱크 발효시 사용되는 공기용적은 분당, 배양배지 용적에 대해 0.1 내지 1.5배이다. 만일 기포가 문제된다면, 대규모 발효배지에 폴리프로필렌글리콜 같은 소포제를 소량(예, 0.2ml/l)가하는 것이 필요할수도 있다.
항생물질 활량은 일반적으로 발효시킨지 24시간 후부터 나타나며 발효기간중 4일이상 유지된다. 항생물질 생성은 발효시킨지 2일로부터 4일까지 최고도를 나타낸다.
발효도중의 A-32724 혼합물의 생성은 한천 확산법 또는 혼탁도 측정법에 의해 모니터 될수 있다. 이를 위해 적절한 시험 미생물은 스타필로코커스오레우스 및 마이크로코커스 루테우스이다.
A-32724 항생물질 혼합물은 이 분야에서 사용되는 방법에 의해 발효배지로부터 회수될수 있다. 대부분의 A-32724 항생물질 혼합물은 발효육즙 중에 존재하므로 초기에 균사체를 여과(이를 남겨둔다) 하므로써 A-32724 항생물질 혼합물의 회수율을 최고로 할수 있다. 여과한 육즙을 여러가지 방법으로 정제하여 A-32724 항생물질 혼합물을 생성할 수 있다. 바람직한 방법에는 n부탄올 등의 적절한 용매로 육즙 pH에서 육즙을 추출하는 방법이 포함된다. 이 추출물을 농축시켜 용매를 제거하고 오일을 생성시키고, 이를 메탄올 같은 적절한 용매중에 수회에 걸쳐 용해시키고, 각각의 경우 진공하에 메탄올을 제거하여 오일을 잔수로 수득하고, 이를 메탄을 같은 적절한 용매에 용해시키고; 이 용액을 이소프로필알콜 같은 A-32724 항생물질이 불용성인 다량의 매중용에 붓는다. 생성된 고체 침전을 여과하여 회수하고 A-32724 혼합물임을 확인한다.
균사체 고체를 메탄올로 추출하고, 추출물을 농축시켜 메탄올을 제거한다. 잔류 수층을 물로 포화된 n-부탄올로 추출하고, 이를 농축시켜 오일로 잔사로 수득한다. 이 오일을 육즙으로부터의 오일과 동일한 방법으로 처리하여 A-32724 혼합물을 추가 생성한다.
균사체 매스 또는 여과 육즙으로부터 수득한 A-32724 혼합물에 대해 추가적인 흡착 및 추출과정을 수행하여 개별적인 A-32724인자를 분리한다. 실리카겔등과 같은 흡착성 물질을 사용하는 것이 유리할수 있다.
한가지 이상의 담체 또는 희석제와 혼합된 활성성분으로써의 A-32724 항생물질로 이루어진 항균 및 항진균제형을 제조할수 있다. A-32724 항생물질은 일부 미생물의 생장을 억제한다. 즉 A-32724 항생물질은 표준항균 디스크 시험에서 보는 바와 같이 그램양성 및 그램음성균 모두에 대해 억제효과를 나타내며, 또한 약간의 항진균 효과를 보인다. 그 결과는 다음 표 8과 같다.
[표 9]
A-32724인자의 항균 스펙트럼
Figure kpo00013
Figure kpo00014
1=스타필로코커스 오레우스 ATCC6538P(G+)
2=마이크로코커스 루테우스 ATCC9341(G+)
3=사카로마이세스 세레비시아에 ATCC2366(진균)
4=세라티아마르세슨스 NRRRL B284(G-)
5=무기염배지에서 배양한 바실러스 서브틸리스 ATCC6633(G+)
6=무기염배지에서 배양한 에스케리챠 콜리 ATCC4157(G-)
본 발명은 또한 생리학적으로 유효한 양의 A-32724 항생물질을 고혈압 포유류에 투여하여 혈압을 강하시키는 방법을 제공한다. 약학 제형은 활성성분으로써의 A-32724 항생물질 및 그를 위한 한가지 이상의 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제로 이루어진다.
세가지의 A-32724 인자는 모두 약 225mg/kg의 LD50(마우스에 복강내투여)치를 나타낸다.
A-32724인자 A, B 및 C는 혈압강하효과를 나타낸다. 예를들어, 인자 A를 특발성 고혈압 쥐에 25mg/kg의 용량으로 복강주사하면 약 15% 혈압 강하된다는 것이 확인되었으며, 인자 B 및 C를 특발성 고혈압 쥐에 50mg/kg의 용량으로 복강 주사할때 혈압이 약 15%강하된다. A-32724 인자 A, B 및 C는 또한 효소-억제 작용을 나타낸다. 즉 인자 A, B 및 C의 글루코실전이 효소에 대한 I50치는 각각 75,90 및 81μg/ml이다.
본 발명을 다음 실시예에 의해 더 상세히 설명한다.
[실시예 1]
1단계 접종물 및 A-32724 항생물질 혼합물의 제조
케토멜라 라피게라 스위프트 NRRL 12331(기탁번호 820826-05011)의 한천사면 배양에 사용되는 배지의 조성은 다음과 같다 :
Figure kpo00015
배지의 pH는 6.0이다.
케토멜라 라피게라 스위프트 NRRL 12331(기탁번호 820826-05011)의 포자를 상기 조성의 영양사면 한천상에 접종하고, 이 사면한천을 약 25℃에서 약 7일간 배양시킨다. 성숙한 사면 배양물에 멸균증류수를 가하고 멸균톨(tool)로 긁어주어 포자 및 균사체의 현탁액을 생성한다. 생성된 포자 현탁액 1ml를 사용하여 50ml의 증식성 배지를 접종한다. 증식성 배지를 위한 접종물을 제공하는 또 다른 방법은 수성 포자현탁액 대신 동결건조시킨 펠렛을 사용하는 것이다. 동결건조시킬 포자 현탁액을 제조하는 방법은 수성 포자현탁액의 제조와 유사하나, 단 멸균 증류수 대신에 멸균 송아지 혈청을 사용하는 것이다. 이어서 이 분야에 알려진 방법으로 동결건조 펠렛을 제조한다. 접종할 증식성 배지의 조성은 다음과 같다.
Figure kpo00016
1N-Z-카제(훔코 쉐필드 케미칼 캄파니, 멤피스, 테네시)
고압멸균시킨후의 배지의 pH는 6.5이다. 증식성 배지를 250ml 광구(wide-mouth) 삼각 플라스큼중에서 250RPM의 속도로 직경 2인치인 호를 그리며 회전하는 진탕기 상에서 약 25℃로 약 48시간 배양한다. 생성된 배양물을 사용하여, 소발효기를 접종(접종물은 발효기 배지 용적당 약 1%이다) 하거나, 다량의 배양물의 생성을 위한 증식성 배지로써 동일 조성을 갖는 2단계 제조용 배지를 접종한다.
배양한 2단계 배지(800tml)를 사용하여 다음 조성을 갖는 멸균제조용 배지 100l를 접종한다 :
Figure kpo00017
수도물 적당량을 가해 100.0
Figure kpo00018
로 한다.
1다우-코닝 소포제 "A"2N-Z-아민 A(훔코 쉐필드 케미칼 캄파니, 멤피스, 테네시)
고압 멸균전의 배지 pH는 6.3이고 고압멸균후의 pH는 6.5이다.
접종한 제조용 배지를 165
Figure kpo00019
용 발효탱크중에서 25℃로 약 66시간 발효시킨다. 발효 배지에 멸균 공기를 0.5v/v/m 속도로 통해주고 통상적인 진탕기로 300RPM의 속도로 교반해준다.
[실시예 2]
A-32724 항생물질의 분리
실시예 1에 기술된 대로 수득된 전발효육즙(160
Figure kpo00020
)을 필터프레스 중에서 3% 필터에이드(하이플로 슈퍼셀, 규조토, 존스-맨빌 프로덕츠 코포레이션)를 사용하여 여과한다. 균사체 고체는 보존한다. 여과한 육즙을 동용량의 n-부탄올로 추출하고 수층을 버린다. n-부탄올 추출물을 약 1
Figure kpo00021
의 용량으로 농축시키고, 500m
Figure kpo00022
의 메탄올로 희석하여 25
Figure kpo00023
(20배 용량)의 이소프로필 알콜에 붓는다. 생성된 활성침전을 여과하여 분리시켜 아세톤으로 세척하고 진공 건조시켜 91.5g을 수득한다.
상기에서 보존해온 균사체 고체를 매회 1/2 용량의 메탄올로 2회 추출하고, 추출물을 합해 농축시켜 메탄올을 제거한다. 잔류 수층을 물로 포화시킨 동량의 n-부탄올로 2회 추출하고, 수층을 버린다. n-부탄올 추출물을 합해 진공 농축시켜 약 1
Figure kpo00024
의 오일을 생성한다. 이 오일을 500ml의 메탄올에 녹이고, 완전히 혼합시킨후, 물질을 여과하고 여액을 진공에서 재농축시켜 오일을 생성하여, 이를 250ml의 메탄올에 녹여, 이 용액을 여과한다. 여액을 5
Figure kpo00025
(20배 용량)의 이소프로필알콜에 부여 침전을 유발시킨다. 생성된 활성 침전을 여과하고, 아세톤으로 세척하여 진공건조시켜 29.5g을 수득한다.
실리카겔칼럼을 사용하여 A-32724 혼합물을 추가 정제하고 인자를 분리한다. 칼럼은 실리카겔 등급 62(그레이스)를 아세톤과 함께 슬러리화 하여 제조한다. 실리카겔을 칼럼(15×150cm, 10
Figure kpo00026
용량)에 충진시키고 아세톤으로 세척한다. 상술한 바와 같이 수득한 55g의 항생물질 A-32724 혼합물을 등급 62 실리카겔상에서 탈수시켜 전술한 바와 같이 제조한 실리카겔칼럼의 최상부에 가한다. 아세톤으로 시간당 350내지 400ml의 유속으로 칼럼을 용출시킨다. 매 시간마다 700 내지 800ml의 분획을 수집한다. 분획에 대해 박층크로마토그래피(TLC)를 실시하고 바닐린-황산 분무액을 이용하에 판정한다. 분무결과 몇가지의 항생물질 A-32724 인자에 대해서는 광택성의 적색반점이 나타난다. 이 반점 시험을 근거로하여, 분획 1 내지 16을 버린다. 분획 17 내지 22를 합해인자 A 및 인자 B의 혼합물을 함유하는지를 조사한다. 더 정치시키고 완결지으면, 인자 A 및 B에 상응하는 융점 약 58℃의 탈황산화 화합물이 수득된다. 또한 인자 A 및 B에 상응하여 융점이 약 99℃인 탈황산화 및 탈아세틸화된 화합물이 수득된다.
분획 23 내지 24에서 불순한 인자 B를 수득한다. 분획 35 내지 114로부터 분해 생성물을 수득하며, 분획 115 내지 226은 버린다. 분획 227 내지 238로부터 불순한 인자 A를 수득하며 분획 239 내지 249로부터 인자 C를 수득한다.
용출제를 아세톤중 1%의 물로 바꾸면인자 C가 불순한 상태로 수득된다.
[실시예 3]
인자 A 및 B의 분리
개선된인자 A 및 B의 분리방법은 다음 과정과 같다. 상기 실시예 1로부터 수득한 건조시킨 고체 조항생물질 혼합물(43.3g)을 약 20mg/ml의 농도로 메탄올중에서 철야환류시킨다. 환류기간의 끝에, 혼합물을 여과하고 여액을 진공에서 증발 건고시킨다. 제 항생물질 혼합물을 메탄올 중에서 환류시키는 과정에 의해 인자 C가 인자 A로 변형된다. 생성된 고체를 아세톤 및 벤젠으로 세척하고 진공에서 건조시켜 42.6g의 고체를 수득한다.
상기 건조물중 1g을 약 5ml의 물에 용해하고 이 용액을 약 10 내지 15g의 실리카겔등급 62상에서 진공 건조시킨다. 이 물질을 에틸아세테이트중 300cc의 실리카겔등급 62 칼럼의 상부에 가한다. 단계적인 구배를 갖는 에틸아세테이트중 메탄올을 칼럼에 적용한다. 인자 A를 에틸아세테이트중 5% 메탄올로 용출시킨다. 용출용매의 조성을 변화시켜, 에틸아세테이트중 10% 메탄올을 사용하여 인자 B를 용출시킨다. 분획중의 인자존재여부는 박층 크로마토그래피에 이어 바닐린-황산의 분무결과로 판정한다. 2 : 1 메탄올 : 클로로포름중의 실리카겔상에서 인자 B는 인자 A보다 이동속도가 빠르므로 구별된다.
[실시예 4]
인자 C의 분리
10g의 항생물질 A-32724 혼합물(실시예 2의 방법대로 제조)을 물에 용해한다. 용액의 pH를 8.5로 맞추고 용액을 폴리아미드(칼럼 크로마토그래피용 PolyamideWoelm) 칼럼(4.7×65cm,1
Figure kpo00027
용량)상에서 크로마토그래프한다. 각 100ml 씩인 분획을 수집해, 분획의 색 및 스타필로코커스오레우스에 대한 효과로 모니터한다. 최초의 분획은 착색되어 있으며 에스. 오레우스에 대해 음성반응을 나타낸다. 분획 1 내지 20은 버린다. 그후의 분획(21 내지 29)은 착색되어 있으며 에스. 오레우스에 대해 양성을 나타낸다. 최종분획(분획 30 내지 40)은 착색되어 있지 않으며 에스. 오레우스에 대해 양성을 나타낸다.
분획 21 내지 29를 합해 진공 농축시켜 오일을 생성한다. 오일을물에 가해 20배량의 메탄올중에 붓는다. 생성된 침전을 여과하여 버린다. 여액을 진공에서 농축시켜 오일을 생성하고, 이를 물에 가해 생성된 용액을 3배량의 n-프로판올에 붓는다. 생성된 침전을 여과하여 버리고, 여액을 진공농축시켜 오일을 생성하여 이를 온(약 40℃)에탄올에 가해 실온에 얼마간 정치시킨다. 여과에 의해 융점이 185 내지 186℃인 210mg의 석출 결정을 회수하고, 이를 NMR, IR 및 UV스펙트럼에 의해 인자 C임을 확인한다.
분획 30 내지 40을 동일방법으로 처리하여 융점이 184 내지 186℃인 210mg의 생성물을 수득하여, NMR, IR 및 UV 스펙트럼 분석한 결과인자 C로 확인한다.

Claims (5)

  1. a) 케토멜라라피게라 스위프트 NRRL 12331(기탁번호 : 820826-05011), 또는 그의 A-32724-생성변종 또는 돌연변이종을 탄소, 질소 동화원, 및 무기염을 함유하는 배양배지중에서 액침 호기성 발효조건하에 상당량의 항생물질 활량이 생성될때까지 배양시키고; b) 임의로, 항생물질 A-32724 혼합물질을 배양배지로부터 분리하고; c) 임의로, 항생물질 A-32724인자 A, B 또는 C를 단리시키는 것을 포함하여, 하기의 물리적 및 화학적 특징 : (1) 약 175 내지 176℃(분해)의 융점; (2) 분자량 738(이는 핵자기 공명 스펙트럼, 설페이트 측정 및 장-탈착(field desorpton) 및 전자-충격질량 분광 분석에 의해 측정한다); (3) 흡수 극대가 265nm(ε=333), 및 271nm(Sh)(ε=252)에 나타나는 수용액 중에서의 자외부 흡수 스펙트럼; (4) 흡수 극대 피크가 다음과 같은, KBr펠렛법에 의해 측정한 적외부 흡수 스펙트럼(제1도) : 3426(강), 2923(강), 2852(강), 1736(중), 1720(중), 1616(중), 1590(중), 1458(중), 1383(쇼울더), 1375(중내지 약), 1241(매우 강), 1123(약), 1068(강), 981(강), 884(약), 865(약), 803(중), 771(중내지 약), 722(약) 685(약), 625(약), 및 581cm-1(약). (5) 100MHz에서 TMS를 내부표준으로 사용한, 다음과 같은 결과를 보이는 DMSO-d6중에서의 프로톤 자기 공명스펙트럼 :
    Figure kpo00028
    (6) TMS를 내부 표준으로 사용한, 다음과 같은 케미칼쉬프트(ppm으로 표시)를 보이는 DMSO-d6중에서의13C 핵자기 공명 스펙트럼 :
    Figure kpo00029
    Figure kpo00030
    (7) 용매용해성 : 물 및 에탄올에 용해된다 : (8) 물질의 색 및 형태 : 무정형의 백색분 말; 을 나타내는 항생물질 A-32724인자 A와 하기의 물리적 및 화학적 특징; (1) 약 160 내지 162℃(분해)의 융점; (2) 분자량 738(이는 핵자기 공명 스펙트럼, 설페이트측정, 및 장-탈착 및 전자충격 질량 분광분석에 의해 측정된다); (3) 흡수극대가 265nm(ε=321), 및 271nm(Sh) (ε=249)에 나타나는 수용액중에서의 자외부 흡수스펙트럼; (4) 흡수 극대 피크가 다음과 같은 KBr 펠렛법에 의해 측정된 적외부 흡수 스펙트럼(제2도) : 3468(강), 3452(강), 2923(강), 2853(강), 1733(중), 1616(중), 1591(중내지 약), 1455(중), 1376(약), 1242(매우 강), 1124(약), 1068(강), 1032(쇼울더), 980(강), 905(약), 795(중), 767(중내지 약), 721(약), 684(약), 670(쇼울더), 662(쇼울더), 617(중 내지 약), 및 579cm-1(중); (5) 100MHz에서 TMS를 내부 표준으로 사용한, 다음과 같은 DMSO-d6중에서의 프로톤자기 공명 스펙트럼 :
    Figure kpo00031
    (6) TMS를 내부 표준으로 사용한, 다음의 케미칼 쉬프트(ppm으로 표시)를 보이는 DMSO-d6중에서의13C 핵자기 공명 스펙트럼 :
    Figure kpo00032
    Figure kpo00033
    (7) 용매에 대한 용해성 : 물 및 메탄올에는 용해된다; (8) 물질의 색 및 형태 : 무정형의 백색 분말; 을 나타내는 항생물질 A-32724인자 B 및 하기의 물리적 화학적 특징 : (1) 약 185 내지 186℃의 융점; (2) 흡수 극대가 262nm(T-16 =3.31)에 나타나는 물중에서의 자외부 흡수 스펙트럼; (3) 흡수 극대 피크가 다음과 같은, KBr 펠렛법에 의해 측정된 적외부흡수 스펙트럼(제3도) : 3498(중), 3452(중), 2922(강), 2851(강), 1733(강), 1724(강), 1652(강), 1616(중), 1591(중), 1465(중), 1455(중), 1409(약), 1378(중), 1257(매우 강), 1132(약), 1065(강), 1054(쇼울더), 1025(약), 981(강), 880(약), 865(약), 795(중), 721(약), 664(약), 657(약), 620(약), 594(약), 580(약), 563(약), 및 481cm-1(약); (4) 100MHz에서 TMS를 내부 표준으로 사용한 다음과 같은 결과의 DMSO-d6중에서의 프로톤자기 공명 스펙트럼 :
    Figure kpo00034
    (5) 검출 미생물로써 스타필로코커스 오레우스를 사용한 다음의 페이퍼 크로마토그래프 계에서의 대략적인 Rf치 :
    용 매 계 Rf치
    메탄올 : 0.1N HCl(3 : 1) 0.79
    n-부탄올 : 아세트산 : 물(3 : 1 : 1) 0.41
    에틸 아세테이트 : 아세트산 : 물(3 : 1 : 1) 0.59
    (6) 검출 미생물로써 스타필로코커스 오레우스를 사용한 다음의 박층-크로마토그래프 계에서의 대략적 Rf치
    용 매 계 Rf치
    아세톤 : 물(19 : 1) 0.21
    (7) 용매에 대한 용해성 : 물 및 메탄올에 용해된다; (8) 물질의 색 및 형태 : 결정성 백색 물질; 을 나타내는 항생물질 A-32724인자 C로 이루어지는 항생물질 A-32724 혼합물, 항생물질 A-32724인자 A, 항생물질 A-32724인자 B 및 항생물질 A-32724인자 C로 이루어지는 그룹중에서 선택된 A-32724 항생물질을 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, a) 케토멜라 라피게라 스위프트 NRRL 12331(기탁번호 : 820826-05011) 또는 그의 A-32724-생성 변종 또는 돌연변이종을 탄소, 질소의 동화원 및 무기염을 함유하는 배지 중에서 액침 호기성 발효 조건하에 상당량의 항생물질활량이 생성될때까지 배양시키고; b) 항생물질 A-32724 혼합물을 배양배지로부터 분리하는 것을 포함하여 항생물질 A-32724 혼합물을 제조하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, a) 케토멜라 라피게라 스위프트 NRRL 12331(기탁번호 : 820826-05011) 또는 그의 A-32724-생성 변종 또는 돌연변이종을 탄소, 질소의 동화원 및 무기염을 함유하는 배지 중에서 액침 호기성 발효조건하에 상당량의 항생물질활량이 생성될때까지 배양시키고; b) 항생물질 A-32724 혼합물을 배양배지로부터 분리한다음; c) 항생물질 A-32724인자 A를 항생물질 A-32724 혼합물로부터 단리시키는 것을 포함하여 항생물질 A-32724인자 A를 제조하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, a) 케토멜라 라피게라 스위프트 NRRL 12331(기탁번호 : 820826-05011) 또는 그의 A-32724-생성 변종 또는 돌연변이종을 탄소, 질소의 동화원 및 무기염을 함유하는 배지중에서 액침 호기성 발효조건하에 상당량의 항생물질활량이 생성될때까지 배양시키고; b) 항생물질 A-32724 혼합물을 배양배지로부터 분리한다음; c) 항생물질 A-32724인자 B를 항생물질 A-32724 혼합물로부터 단리시키는 것을 포함하여 항생물질 A-32724인자 B를 제조하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, a) 케토멜라 라피게라 스위프트 NRRL 12331(기탁번호 : 820826-05011) 또는 그의 A-32724-생성 변종 또는 돌연변이종을 탄소, 질소의 동화원 및 무기염을 함유하는 배지 중에서 액침 호기성 발효조건하에 상당량의 항생물질활량이 생성될때까지 배양시키고; b) 항물질 A-32724 혼합물을 배양배지로부터 분리한다음; c)항생물질 A-32724인자 C항생물질 A-32724 혼합물로 부터 단리시키는 것을 포함하여 항생물질 A-32724인자 C 제조하는 방법.
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