DE60124790T2 - Neue substanz fki-1083 und verfahren zu deren herstellung - Google Patents

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Description

  • Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue FKI-1083 Substanz, die eine NADH-Fumaratreduktase hemmende Aktivität aufweist. Im Einzelnen betrifft die vorliegende Erfindung eine Verbindung von FKI-1083, welche für Pharmazeutika, Tierarzneimittel und Agrarchemikalien, dargestellt durch die folgende Formel:
    Figure 00010001
    und deren Produktion wirksam ist.
  • Stand der Technik
  • Parasitäre Erkrankungen sind als das Ergebnis von Verbesserung der Umwelthygiene und Fortschritt bei Anthelminthika zurückgegangen, aber in jüngerer Zeit importierte parasitäre Erkrankungen, zoonotische parasitäre Erkrankungen, opportunistische parasitäre Erkrankungen und parasitäre Erkrankungen, die aus rohen Nahrungsmitteln hervorgegangen sind, steigen an, als Ergebnis werden verschiedene parasitäre Erkrankungen wieder zu einem aktuellen Thema. In den der Viehzucht und Landwirtschaft verursachen parasitäre Erkrankungen zur Zeit eine große wirtschaftliche Belastung. Unter parasitäre Erkrankungen werden hinsichtlich Wurminfektion viele Verbindungen wie Ivermectin, Mebendazol, Praziquantel usw. verwendet.
  • Anthelminthika, wie Ivermectin, Mebendazole und Praziquantel sind jedoch nicht immer zufriedenstellend hinsichtlich ihrer Wirksamkeit und Toxizitäten, als ein Ergebnis sind neue Mittel immer noch erforderlich.
  • Wir haben uns darauf konzentriert, NADH-Fumaratreduktase im Elektronentransportsystem, einem der hoffnungsvollen Ziele für Anthelminthika, zu studieren und machten damit weiter, Hemmstoffe gegen solche Enzyme aus mikrobiell kultivierten Produkten zu erforschen, als Ergebnis befanden wir die FT-0554 Substanz (Nafuredin). Die internationale Patentanmeldung in dieser Substanz wurde als die internationale Veröffentlichungsschrift WO99/24439 veröffentlicht, welche auf die USA übertragen wurde und die AnmeldeNr. 09/509770 erhielt.
  • Der Mikroorganismus, welcher die Fähigkeit aufweist die FT-0554 Substanz (Nafuredin) zu produzieren, ist Aspergillus niger FT-0554, der zu den Pilzen gehört, dessen Stamm bei der internationalen Hinterlegungsstelle für patentierte Organismen, dem National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, hinterlegt wurde und eine dauerhafte Hinterlegungs-Nr. als FERM BP-6443 erhielt. Taxonomische Eigenschaften des Stammes werden kurz wie folgt beschrieben.
  • Kultivierungseigenschaften auf verschiedenen Agar-Medien, wie Czapek-Hefeextrakt-Agar, Malzextrakt-Agar, 20% Sucrose-Czapek-Hefeextrakt-Agar, Kartoffel-Dextrose-Agar und Miura's-Medium, sind gutes Wachstum mit samtiger und glatter Penumbra. Der Durchmesser einer Kolonie beträgt 40 mm – 85 mm. Die Farbschattierung der Oberfläche einer Kolonie ist dunkles Umbra-Braun. Die Farbschattierung der Rückseite einer Kolonie ist ein blasses Gelb oder Weiß.
  • Morphologische Eigenschaften auf Czapek-Hefeextrakt-Agar, Malzextrakt-Agar, 20% Sucrose-Czapek-Hefeextrakt-Agar und Kartoffel-Dextrose-Agar, 50% Seewasser (Salzgehalt 3,4%) enthaltend, sind gutes Wachstum, viele Conidiensporen tragend.
  • Physiologische Eigenschaften sind: optimale Wachstumsbedingung: pH 5 – 7 bei 16 – 36°C und in einer Seewasser-Konzentration von 50 – 100%. Wachstumsbereiche sind pH 3 – 10, bei 12 – 45°C und in einer Seewasser-Konzentration von 0 – 100%.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Wir haben herausgefunden, dass die neue Verbindung FKI-1083 Substanz, die durch den Pilzstamm FKI-1083 hergestellt wird, eine hemmende Aktivität gegen NADH-Fumaratreduktase zeigte.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Verbindung FKI-1083 der Formel:
    Figure 00030001
    bereit.
  • Die neue FKI-1083 Substanz hat eine wachstumshemmende Aktivität gegen Mikroorganismen, Nematoden und Arthropoden. Daher stellt die Erfindung die Verbindung der Erfindung zur Verwendung bereit, das Wachstum von Mikroorganismen zu hemmen und insbesondere das Wachstum von Nematoden oder Arthropoden zu hemmen.
  • Die Erfindung stellt außerdem die Verwendung einer Verbindung der Erfindung in der Herstellung eines Anthelminthikums zur Wachstumshemmung von Nematoden oder eines Insektizids zur Wachstumshemmung von Arthropoden bereit. Die Erfindung stellt außerdem die Verwendung einer Verbindung der Erfindung in der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in der Wachstumshemmung von Nematoden oder Arthropoden bereit.
  • Die Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zur Herstellung der Verbindung FKI-1083 bereit, umfassend die Kultivierung eines Mikroorganismus, der die Fähigkeit besitzt, die Verbindung FKI-1083 der Formel:
    Figure 00040001
    in einem Medium herzustellen, das Anreichern von FKI-1083 in einer kultivierten Masse und das Isolieren von FKI-1083 aus der kultivierten Masse, wobei der Mikroorganismus, welcher die Fähigkeit besitzt, FKI-1083 herzustellen, der Fungus Verticillium sp. FKI-1083 FERM BP-7804 oder eine Mutante davon, welche die Fähigkeit besitzt FKI-1083 herzustellen, ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem einen Mikroorganismus Verticillium sp. FKI-1083 FERM BP-7804 oder eine Mutante davon, welche die Fähigkeit besitzt FKI-1083 herzustellen, bereit.
  • Die vorliegende Erfindung stellt aber außerdem einen NADH-Fumaratreduktase-Inhibitor bereit, umfassend die Verbindung FKI-1083 der Formel:
    Figure 00050001
  • Der Mikroorganismus, welcher die Fähigkeit besitzt, die neue FKI-1083 Substanz herzustellen, welche durch die obige Formel hierin dargestellt wird (nachfolgend als "FKI-1083 Substanz herstellender Mikroorganismus" bezeichet) ist bevorzugterweise der Pilzstamm FKI-1083, welcher durch die Erfinder der vorliegenden Erfindung aus einer Erdprobe der Präfektur Kagoshima neu isoliert wurde. Taxonomische Eigenschaften des Stammes sind wie folgt:
  • (1) Morphologische Eigenschaften
  • Der Stamm zeigte ein relativ gutes Wachstum auf Kartoffel-Dextrose-Agar, Kartoffel-Karotten-Agar, Erdextrakt-Agar, Maismehl-Agar und Miura's Medium. Ein gutes Tragen von Conidiensporen wurde auf Kartoffel-Karotten-Agar, Erdextrakt-Agar, Maismehl-Agar und Miura's Medium beobachtet. Ein leicht unterdrücktes Tragen von Conidiensporen wurde auf Kartoffel-Dextrose-Agar beobachtet.
  • Eine mikroskopische Beobachtung von Kolonien, die auf Maismehl-Agar gewachsen waren, zeigte transparente Hyphen mit Septen, Conidiophoren, die von den Luftmycelien abstanden, mit manchmal Verzweigungen. Das Phialid wird im mittleren Teil oder am Rand der Conidophoren beobachtet. Das Phialid (17,0 – 34,0 × 1,5 – 2,5 μm) wird einzeln oder mit 2–4 Wirtelstellen (engl.: "verticillations") mit leichter Schwellung an der Basis und Verengung mit der pyramidalen Form des Randes. Eine Conidiophore mit fast kugelförmiger bis breiter elliptischer Form: (2,5 – 5,0 × 2,5 – 3,0 μm) wurde aus den Rändern des Phialids geformt, um viskose Kugeln zu formen.
  • (2) Kultureigenschaften auf verschiedenen Agarmedien
  • Makroskopische Beobachtungen des auf verschiedenen Agarmedien bei 25°C für 14 Tage kultivierten Stammes werden in Tabelle 1 gezeigt.
  • Tabelle 1
    Figure 00060001
  • Figure 00070001
  • (3) Physiologische Eigenschaften
    • (1) Optimale Wachstumsbedingung Die optimale Wachstumsbedingung des Stammes ist pH 5 – 8 bei 16 – 25°C.
    • (2) Wachstumsbereich Der Wachstumsbereich des Stammes ist pH 3 – 9 bei 6 – 29°C.
    • (3) Natur der Wachstumsbedingung: aerob
  • Als ein Ergebnis des Vergleichs der morphologischen Eigenschaften, Kultureigenschaften und physiologischen Eigenschaften des Stammes FKI-1083 mit bekannten Stämmen, wurde der vorliegende Stamm als ein Stamm identifiziert, der zum Genus Verticillium gehört, und wurde als Verticillium sp. FKI-1083 bezeichnet. Der Stamm wurde als Verticillium sp. FKI-1083 bei der internationalen Hinterlegungsstelle für patentierte Organismen, dem National Institute of Advanced Industrial Science and Technology in AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566 Japan, hinterlegt. Datum der Hinterlegung war der 19. November 2001 als Hinterlegungs-Nr. FERM BP-7804.
  • Eine Herstellung der FKI-1083 Substanz der vorliegenden Erfindung kann durch Kultivieren von FKI-1083 Substanz herstellenden Mikroorganismen, die zu den Pilzen gehören, in einem Medium, Isolieren aus der kultivierten Masse und Aufreinigen derselben durchgeführt werden. Der in dieser Erfindung verwendete Stamm kann der hierin oben beschriebene Stamm, eine Mutante davon oder jeder FKI-1083 Substanz herstellende, zu den Pilzen gehörende, Mikroorganismus sein.
  • Nahrungsquellen, die zur Herstellung der FKI-1083 Substanz geeignet sind, können Nahrungsquellen für Pilze sein. Beispielsweise kommerziell erhältliche Stickstoffquellen wie Pepton, Fleisch-Extrakt, Mais-Einweichwasser, Baumwollsamenpulver, Erdnusspulver, Sojabohnenmehl, Hefe-Extrakt, NZ-Amin, Caseinhydrolysat, Natriumnitrat, Ammoniumnitrat und Ammoniumsulfat, Kohlenhydrate wie Glycerin, Stärke, Glucose, Galactose und Mannose, oder Kohlenstoffquellen wie Fettsäuren, und anorganische Salze wie Natriumchlorid, Phosphat, Calciumcarbonat und Magnesiumsulfat, allein oder in einer Kombination davon.
  • Falls notwendig können Spurenmetall-Salze, tierisches, pflanzliches oder mineralisches Öl als ein Antischaummittel zugegeben werden. Diese sind bevorzugte Substanzen, welche durch den herstellenden Mikroorganismus verwendet werden können und sind nützlich für die Herstellung der FKI-1083 Substanz, und alle bekannten Materialien zur Kultivierung von Pilzen können verwendet werden. In einer Massenproduktion der FKI-1083 Substanz wird die Flüssigkultur bevorzugt angewendet. Eine Kultivierungstemperatur kann innerhalb eines Bereichs für die Herstellung der FKI-1083 Substanz angewendet werden. Hierin oben beschriebene Kultivierungsbedingungen können wahlweise abhängig von Eigenschaften des die FKI-1083 Substanz herstellenden Mikroorganismus ausgewählt werden.
  • Die FKI-1083 Substanz kann unter Verwendung von nicht mit Wasser mischbaren, organischen Lösungsmitteln wie Chloroform und Ethylacetat aus der Kulturflüssigkeit extrahiert werden.
  • Zusätzlich zur obigen Extraktion können bekannte Isolierungsverfahren, die für die Aufreinigung einer Fettlöslichen Substanz verwendet werden, wie Adsorptions-Chromatographie, Gelfiltrations-Chromatographie, Abkratzen von Dünnschicht-Chromatographie, zentrifugale Gegenstrom-Chromatographie und Hochleistungsflüssig-Chromatographie in Kombination oder wiederholt angewendet werden, um gereinigte Substanz zu erhalten.
  • Die physikalisch chemischen Eigenschaften der FKI-1083 Substanz der vorliegenden Erfindung sind wie folgt.
    • (1) Natur: farbloses Öl
    • (2) Molekulargewicht: 343,2247 (M+Na, hoch auflösende FAB-Ionisierungs-Massenspektrometrie)
    • (3) Molekülformel: C20OH32O3
    • (4) Ultraviolettes Absorptionsspektrum (in Methanol): maximale Absorption bei 204 nm (ε = 20500), 215 nm (Bandenschulter, ε = 13720), 250 nm (ε = 10460)
    • (5) Infrarotes Absorptionsspektrum (KBr): maximale Absorption bei 2927, 2854, 1732, 1670, 1605, 1464, 1408, 1379, 1325, 1250, 1165, 985, 768 cm–1
    • (6) 1H NMR: die chemische Verschiebung in deuteriertem Chloroform (ppm) und die Kopplungskonstante (Hz) werden in Tabelle 2 gezeigt.
    • (7) 13C NMR: die chemische Verschiebung in deuteriertem Chloroform (ppm) wird in Tabelle 2 gezeigt.
    • (8) Löslichkeit in Lösungsmittel: Löslich in Chloroform und Ethylacetat, Methanol. Schwer löslich in n-Hexan.
    • (9) Farbreaktion: positiv für Schwefelsäure und Jodreaktionen.
  • Tabelle 2
    Figure 00100001
  • In der Tabelle zeigt jedes Symbol: s, Singulett; d, Dublett; t, Triplett; q, Quadruplett; m, Multiplett; H, Zahl der Protonen; J, Kopplungskonstante (Hz).
  • Als ein Ergebnis der detaillierten Diskussion und Untersuchung der verschiedenen physikalisch chemischen Eigenschaften und der Spektraldaten der FKI-1083 Substanz wurde bestimmt, dass die chemische Struktur der FKI-1083 Substanz durch die folgende Formel dargestellt ist:
    Figure 00110001
  • Wie hierin oben beschrieben, werden verschiedene physikalisch chemische Eigenschaften der FKI-1083 Substanz der vorliegenden Erfindung im Detail beschrieben und keine Verbindung, die mit diesen Eigenschaften identisch ist, wurde bekannt gegeben, folglich wurde die FKI-1083 Substanz der vorliegenden Erfindung als eine neue Substanz bestimmt.
  • Die NADH-Fumaratreduktase hemmende Aktivität der FKI-1083 Substanz der vorliegenden Erfindung wird im Detail wie folgt erklärt.
  • Muskel von Ascaris suum wurde in 120 mM Natriumphosphat-Lösung (pH 7,0) homogenisiert und bei 3000 × g für 10 Minuten zentrifugiert, um die Überstandsflüssigkeit zu gewinnen. Die Lösung wurde weiter bei 10000 × g für 20 Minuten zentrifugiert, um das Präzipitat zu gewinnen. Das Präzipitat wurde in 120 mM Natriumphosphat-Lösung (pH 7,0) suspendiert, um die Mitochondrien-Fraktion zu präparieren. 10 μl 50% Dimethylsulfoxid-Lösung der FKI-1083 Substanz wurden in eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen gefüllt. 80 μl 120 mM Natriumphosphat-Lösung (pH 7,0), enthaltend 0,35 mM NADH und 7,2 mM Dinatriumfumarat wurden dazu hinzugegeben und bei 37°C für 5 Minuten im Mikrotiterplatten-Ablesegerät ELX808 (Bio-Tek Industries Inc., die U.S.A.) vorinkubiert.
  • 10μl der Mitochondrien-Fraktion des Ascaris suum Muskels (0,3 mg Protein) wurden dazu hinzugegeben, bei 37°C für 10 Minuten inkubiert und die Absorption von NADH bei 340 nm alle 15 Sekunden gemessen. Ein Gradient der Abnahme der Absorption bei 340 nm wurde als NADH-Fumaratreduktase-Aktivität gemessen. 4,1 nM der FKI-1083 Substanz zeigten eine 50% Inhibition der NADH-Fumaratreduktase-Aktivität. Folglich kann von der FKI-1083 Substanz erwartet werden, eine Zusammensetzung zur Behandlung oder Verhinderung einer Wurmerkrankung zu sein.
  • Die minimale hemmende Konzentration (MIC) der FKI-1083 Substanz der vorliegenden Erfindung gegenüber verschiedenen Mikroorganismen auf Nährstoffagar-Medium durch ein Plattenverdünnungsverfahren auf Agar wird in Tabelle 3 gezeigt.
  • Tabelle 3
    Figure 00120001
  • Figure 00130001
  • Wie aus Tabelle 3 hierin oben ersichtlich wird, zeigte die FKI-1083 Substanz der vorliegenden Erfindung eine hemmende Aktivität gegen verschiedene Mikroorganismen.
  • Als nächstes wird hierin unten die Nematoden-tötende Aktivität und die Arthropoden-tötende Aktivität der FKI-1083 Substanz der vorliegenden Erfindung im Detail erklärt.
  • Eine Methanol-Lösung der FKI-1083 Substanz der vorliegenden Erfindung wurde in eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen (Corning Inc., die U.S.A.) gefüllt. Methanol wurde in vacuo entfernt. 250 μl eines Testmediums (Lecithin 0,01%, Natriumhydrogen-carbonat 7,5 mM, Kaliumchlorid 7,5 mM, Calciumchlorid-dihydrat 7,5 mM und Magnesiumsulfat-heptahydrat 7,5 mM) wurden dazu hinzugegeben und für 15 Minuten geschüttelt.
  • Ungefähr 10 auf dem Agarmedium für Nematodenwachstum kultivierte Caenorhabditis elegans [Ein Medium in dem E. coli kultiviert worden war, auf einem Medium bestehend aus Bactoagar (DIFCO Inc., die U.S.A.) 1,7%, Bactopepton (DIFCO Inc., die U.S.A.) 0,5%, Hefeextrakt (DIFCO Inc., die U.S.A.) 1,0%, Natriumchlorid 0,3%, Cholesterol 0,0005%, Calciumchlorid 0,007, Magnesium-sulfat 0,03%, Dikaliumhydrogen-phosphat 0,34 und Kaliumdihydrogen-phosphat 0,11%] wurden dazu hinzugegeben. Eine 50 μl Pufferlösung, die einige im Puffer (Tris 0,24%, Natriumchlorid 2,57%, Magnesiumchlorid 0,47%, Kaliumchlorid 0,07, Natriumcarbonat 0,02%, Magnesiumsulfat 0,64% und Calciumchlorid 0,11%, pH 7,1) geschlüpfte Naupliuslarven von Artemia salina enthielt, wurde getrennt hinzugegeben.
  • Der Zustand dieser Nematoden und Arthropoden wurde unter dem Mikroskop beobachtet. Bewegung von Caenorhabditis elegans und Artemia salina wurde bei der Konzentration von 20 μg/ml beziehungsweise 2 μg/ml gehemmt. Folglich ist die FKI-1083 Substanz der vorliegenden Erfindung als Anthelmintikum und Insektizid verwendbar.
  • Bevorzugte Ausführungsform der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung wird mit einem Beispiel erklärt, aber sollte nicht so verstanden werden, dass sie innerhalb des Beispiels beschränkt ist.
  • Jeweils eine Impföse voll an Verticillium sp. FKI-1083 FERM BP-7804 Stamm, kultiviert auf dem Schrägagarmedium, wurde in einen 500 ml Erlenmeyerkolben geimpft, welcher 100 ml flüssiges Medium (pH 5,7) bestehend aus Glucose 2,0%, Polypepton (Nikon Pharmaceutical Co, Japan) 0,5%, Hefe-Extrakt (Oriental Yeast Co, Japan) 0,2%, Agar 0,1%, Kaliumdihydrogenphosphat 0,1%, Magnesiumsulfat-heptahydrat 0,05% und Wasser enthielt und bei 27°C für 3 Tage schüttelkultiviert. Jeweils ein Milliliter dieser Animpf-kulturflüssigkeit wurde in jeweils eine von 20 Kolben von 500 ml Erlenmeyerkolben, die jeweils 100 ml flüssiges Medium (pH 6,0) enthielten, welches aus Kartoffel-Dextrose-Nährlösung (DIFCO, die U.S.A.) 2,4%, Malz-Extrakt (DIFCO, die U.S.A.) 1,5%, Magnesiumphosphatoctahydrat 0,5%, Agar 0,1% und Wasser bestand, geimpft und bei 27°C für 7 Tage schüttelkultiviert.
  • Die kultivierte Flüssigkeit wurde zentrifugiert. Die erhaltenen Pilzgeflechte wurden mit Methanol extrahiert, in vacuo konzentriert, um Methanol zu entfernen, und der Rückstand wurde mit Ethylacetat extrahiert, um 1,21 g der rohen Substanz I zu erhalten. Die rohe Substanz I wurde auf eine mit Hexanethylacetat (10 : 1) gepackte Kieselsäuregel-Säule (Art. 7734, Merck Co. die U.S.A.) geladen, die Säule wurde mit Hexanethylacetat (3 : 1) gewaschen und mit Hexanethylacetat (1 : 1) eluiert. Das Eluat wurde in vacuo konzentriert, um 81,0 mg der rohen Substanz II zu erhalten. Die rohe Substanz II wurde auf eine mit Hexanethylacetat (2 1) gepackte Kieselsäuregel-Säule (Art. 7734, Merck Co. die U.S.A.) geladen und mit Hexanethylacetat (2 : 1) eluiert. Das Eluat wurde in vacuo konzentriert, um 61,1 mg der FKI-1083 Substanz, farbloses Öl, zu erhalten.
  • Industrielle Anwendbarkeit
  • Wie hierin oben erklärt, hat die FKI-1083 Substanz, welche durch die Kultivierung des Mikroorganismus, der die Fähigkeit besitzt, die FKI-1083 Substanz in einem Medium herzustellen, Anreichern der FKI-1083 Substanz in dem Medium und Isolieren der FKI-1083 Substanz aus der kultivierten Masse, hergestellt wurde, wachstumshemmende Aktivitäten gegen Mikroorganismen, Nematoden und Arthropoden, und von ihr wird erwartet, dass sie eine nützliche Substanz für Medikamente, Tierarzneimittel und Agrarchemikalien ist.

Claims (8)

  1. Verbindung FKI-1083 der Formel:
    Figure 00160001
  2. Verbindung nach Anspruch 1 zur Verwendung, um Wachstum von Mikroorganismen zu hemmen.
  3. Verbindung nach Anspruch 1 zur Verwendung, um Wachstum von Nematoden oder Arthropoden zu hemmen.
  4. Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 bei der Herstellung eines Anthelminthikums zur Wachstumshemmung von Nematoden oder eines Insektizids zur Wachstumshemmung von Arthropoden.
  5. Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung zum Hemmen des Wachstums von Nematoden oder Arthropoden.
  6. Verfahren zur Herstellung der Verbindung FKI-1083 nach Anspruch 1, umfassend Kultivieren eines Mikroorganismus, der die Fähigkeit besitzt, die Verbindung FKI-1083 der Formel:
    Figure 00170001
    in einem Medium herzustellen, Anreichern von FKI-1083 in einer kultivierten Masse und Isolieren von FKI-1083 aus der kultivierten Masse, wobei der Mikroorganismus, welcher die Fähigkeit besitzt, FKI-1083 herzustellen, Fungus Verticillium sp. FKI-1083 FERM BP-7804 oder eine Mutante davon, welche die Fähigkeit besitzt FKI-1083 herzustellen, ist.
  7. Mikroorganismus Verticillium sp. FKI-1083 FERM BP-7804 oder eine Mutante davon, welche die Fähigkeit besitzt FKI-1083 nach Anspruch 1 herzustellen.
  8. NADH-Fumaratreduktase-Inhibitor, umfassend die Verbindung FKI-1083 der Formel:
    Figure 00170002
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