WO2003050104A1

WO2003050104A1 - Nouvelle substance fki-1083 et son procede de production

Info

Publication number: WO2003050104A1
Application number: PCT/JP2001/010843
Authority: WO
Inventors: Satoshi Omura; Kazuro Shiomi; Rokuro Masuma
Original assignee: The Kitasato Institute
Priority date: 2001-12-11
Filing date: 2001-12-11
Publication date: 2003-06-19
Also published as: US7132447B2; DE60124790T2; JP3897757B2; EP1454905B1; US20050032883A1; AU2002216364A1; DE60124790D1; JPWO2003050104A1; EP1454905A1; EP1454905A4

Description

明細新規 F K I - 1 0 8 3物質およびその製造法技術分野

本発明は、 N A D H—フマル酸レダクタ一ゼ阻害活性を有する物質であり . 医薬品、動物薬、農薬に有効な下記式

で表される化合物である新規 F K 1 - 1 0 8 3物質およびその製造法に関する。背景技術

寄生虫症は、衛生環境の改善、駆虫薬の進歩などにより減少してきたが、近年になって輸入寄生虫症、人獣共通寄生虫症、日和見寄生虫症、生鮮食品に由来する寄生虫症などが目立つようになり、改めて多種にわたる寄生虫症が問題となつている。また、牧畜や農業においても、寄生虫症は多大な経済的負担をもたらしているのが現状である。寄生虫の中で蠕虫の感染症については、現在、例えばィベルメクチン、メベンダゾール、プラジカンテルなど多くの化合物が使用されている。

しかしながら、現在使用されているィベルメクチン、メベンダブール、ブラジカンテルなどの抗蠕虫剤がその有効性、毒性などの面ですベて満足できるとはいい難く、新しい薬剤が求められている。本発明者らは、抗蠕虫剤の有望な標的のひとつである電子伝達系の中の N A DH—フマル酸レダクターゼに注目し、本酵素の阻害物質について微生物培養物中からの探索を続けた結果、 FT— 0 5 54物質（ナフレジン）を見いだし、既に国際出願を行った（国際公開番号 W〇 9 9 / 244 3 9 ) 。そして、この国際出願は米国へ移行され、 No. 0 9 / 5 0 9 7 7 0の出願番号が付与された。

この FT— 0 5 54物質（ナフレジン）を生産する能力を有する微生物は糸状菌に属するァスペルギルス二ガー（A s p e r g i 1_J u— s n i g e r ) FT 0 5 5 4であり、この菌株は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（新名称；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター）に寄託され、受託番号 FERM BP- 6 44 3が付与された。本菌株の菌学的性状の概要は下記の通りである。各種寒天培地上での培養性状については、ッァペック ·イーストエキストラクト寒天培地、麦芽汁寒天培地、 2 0 %ショ糖を含むッァペック ·イーストヱキストラクト寒天培地、バレイショ ·ブドウ糖寒天培地、三浦寒天培地において生育は良好で、ビロード状で周辺平滑である。コロニー直径は、 4 0mm〜8 5m mである。コロニー表面の色調は黒褐色であり、コロニー裏面の色調は薄黄色、白色である。形態的特徴については、海水（塩分濃度 3. 4%) を 5 0 %含むッァペック •イーストエキストラクト寒天培地、麦芽汁寒天培地、ショ糖 20%を含むッァペック ■イーストエキストラクト寒天培地、バレイショ ■ブドウ糖寒天培地などで良好に生育し、分生子も豊富に着生した。生理学的性状については、最適生育条件は pH5〜7、温度 1 6〜3 6°C、海水濃度 5 0〜1 0 0%である。生育範囲は pH 3〜l 0、温度は 1 2〜4 5 °C 、海水濃度は 0〜1 0 0%である。発明の開示

本発明者らはその後も微生物培養物中からの探索を続けた結果、糸状菌 FK 1 - 1 0 83株の生産する新規化合物の FK 1 - 1 083物質が NADH—フマル酸レダクタ一ゼ阻害活性を有することを見出し、この知見に基づいて本発明を完成するに至った。

本発明は、 N A D H—フマル酸レダクタ一ゼ阻害活性を有する物質であり、有効性、毒性などの面で満足し得る医薬品、動物薬、農薬として有効な新規 FK 1 - 1 083物質を提供することを目的とするものである。

すなわち、下記式

で表される化合物である新規 FK 1 - 1 083物質を提供するものであり、新規 FK I— 1 083物質は微生物、線虫、および節足動物に対してそれぞれ発育阻害活性を有するものである。

更に本発明は、 N A D H—フマル酸レダクタ一ゼ阻害活性を有する新規 F K 1 - 1 0 83物質の製造法を提供することを目的とするものである。

すなわち、糸状菌に属し、下記式

で表される FK 1 - 1 083物質を生産する能力を有する微生物を培地で培養し、培養物中に FK 1 - 1 083物質を蓄積せしめ、該培養物から FK 1- 1 08 3物質を採取する製造法を提供するものである。

更に、本発明は FK 1 - 1 083物質を生産する能力を有する微生物が、糸状菌に属するバーチシリゥム 'エスピー（Ve r t i c i 1 1 i urn s p. ) FK I - 1 083 (FERM BP— 7804)である FKI— 1 083物質の製造法を提供するものである。

更にまた本発明は、糸状華に属し、 FK I— 1083物質を生産する能力を有する微生物自体を提供するものである。更に本発明は微生物としてバーチシリゥム 'エスピー（V e r 1; i c i_J l_i urn s p. ) FK I - 1 083 (FE RM BP- 7804 ) を提供するものである。

更にまた本発明は、下記式

で表される FK I— 1083物質からなる NAD H—フマル酸レダクタ一ゼ阻害剤を提供するものである。前記の式で表される新規 FK 1 - 1083物質を生産する能力を有する微生物（以下「FK I— 1083物質生産菌」と称する) は糸状菌であるが、本発明の FK I - 1 083物質生産能を有するものであればよく、特に制限されることはない。本発明の FK 1— 1083物質を生産するために使用される菌株の好ましい一例としては、例えば本発明者らによって鹿児島県の土壌より新たに分離された糸状菌 FK 1 - 1083株が挙げられる。本菌株の菌学的性状を示すと以卞の通りである。 ( 1 ) 形態的特徴

本菌株は、バレイショ ·ブドウ糖寒天培地、ジャガイモ 'ニンジン寒天培地、土壌抽出液寒天培地、コーン ' ミール寒天培地、三浦寒天培地などで比較的良好に生育した。分生子の着生はジャガイモ 'ニンジン寒天培地、土壌抽出液寒天培地、コーン ' ミール寒天培地、三浦寒天培地において良好で、バレイショ ·ブドウ糖寒天培地ではやや抑制的であつた。

コーン . ミール寒天培地に生育したコロニーを顕微鏡で観察すると、菌糸は無色で隔壁を有しており、分生子柄は気生菌糸より直立し、ときに分岐することがある。分生子柄の途中もしくは先端にフィアラィドを生じる。このフィアラィド（ 1 7. 0〜34. 0 X 1. 5〜2. 5〃m) は、単独あるいは 2〜 4輪生して生じ、基部はわずかに膨らみ、先端は細まる錐形である。フィアライドの先端からは亜球形から広楕円形（2. 5〜5. 0 X 2. 5〜3. 0〃m) の分生子が生じ、粘性球形を形成する。

( 2 ) 各種寒天培地上での培養性状

本菌株を各種寒天培地上で 25で、 1 4日間培養した場合の肉眼的観察結果を下記の第 1表に示した。

第 1表培地培地上の生育状態コロニー表面コロニー裏面可溶性色素 (コロニーの直径）の色調の色調バレイショ ·ブドウ糖寒天培地

良好（52〜5 3mm) 白色クリーム色〜無し羊毛状、隆起薄黄褐色

周辺平滑ジャガイモ ·ニンジン寒天培地

良好（5 7〜5 8mm) 白色白色〜無し羊毛状、隆起薄黄褐色

周辺平滑土壌抽出液寒天培地

良好（ 3 9〜4 0 mm) 白色白色黄色羊毛状、隆起

周辺平滑コーン . ミール寒天培地

良好（4 3〜4 6 mm) 白色白色 ^し羊毛状〜ビロード状

周辺平滑三浦寒天培地

良好（5 0 5 2 mm) 白色白色無し羊毛状

周辺平滑

(3) 生理的性状

( 1 ) 最適生育条件

本菌株の最適生育条件は、 pH 5〜8、温度 1 6〜25°Cである,

( 2 ) 生育範囲

本菌株の生育範囲は、 pH3〜l 0、温度 6〜29°Cである。

( 3 ) 好気性、嫌気性の区別

好気性上記 FK I - 1 083株の形態的特徴、培養性状および生理的性状に基づき、既知菌種との比較を試みた結果、本菌株をバーチシリウム (Ve r t i c i l 1 i urn) 属に属するー菌株と同定し、バ一チシリゥム■エスピー FK I— 1

083と命名した。なお、本菌株は、バーチシリウム 'エスピー FK I— 1 0 83 (V e r t i c i I l i um s p. FK I - 1 083 ) として、日本国茨城県つくぱ巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305— 8566 ) [A I ST Ts ukub a Cen t r a l 6, 1 - 1, Hi ga sh i 1 - C home Ts ukub a - s h i, I b a r ak i -ken 305-856 6 Jap an] に所在する独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託セン夕一 (I n t e r na t i ona l Pa t en t Or gan i sm D e P o s i t a r y Na t i ona l I n s t i t u t e o f A d v a n c e d I n du s t r i a l Sc i en c e and Te chno 1 og y) に国際寄託されている。寄託日は平成 1 3年（200 1) 1 1月 1 9曰、受託番号は FERM BP- 7804である。本発明の FK I - 1 083物質を製造するに当たっては、先ず糸状菌に属する FK I _ 1 083物質生産菌を培地で培養し、その培養物から分離 ·精製すればよい。本発明に用いることのできる菌株は上記菌株、その変異株をはじめ、糸状菌に属する FK 1 - 1 083物質生産菌のすべてが使用できる。

上記 FK 1 - 1 083物質生産に適した栄養源としては、糸状菌の栄養源として使用し得るものであればよい。例えば、市販のペプトン、肉エキス、コーン 'スティープ ' リカー、綿実粉、落花生粉、大豆粉、酵母エキス、 NZ—ァミン、カゼィンの水和物、硝酸ソーダ、硝酸アン乇ニゥム、硫酸アンモニゥム等の窒素源、グリセリン、澱粉、グルコース、ガラクトース、マンノース等の炭水化物、あるいは脂肪等の炭素源、及び食塩、リン酸塩、炭酸カルシウム、硫酸マグネシゥム等の無機塩を単独あるいは組み合わせて使用できる。

その他必要に応じて微量の金属塩、消泡剤として動 ·植■鉱物油等を添加することもできる。これらのものは生産菌が利用し FK 1 - 1 083物質の生産に役だつものであればよく、公知の糸状菌の培養材料は、すべて用いることができる。 FK I— 1 0 8 3物質の大量培養には液体培養が好ましく、培養温度は生産菌が発育し、 FK I— 1 0 8 3物質を生産できる範囲で適用できる。培養は以上に述べた条件を使用する FK 1 - 1 0 8 3物質生産菌の性質に応じて適宜選択して行なうことができる。

FK I - 1 0 8 3物質は、培養液よりクロ口ホルム、酢酸ェチル等の水不混和性の有機溶媒で抽出することができる。上述の抽出法に加え、脂溶性物質の採取に用いられる公知の方法、例えば吸着クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィ一、薄層クロマトグラフィーよりのかき取り、遠心向流分配クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィ一等を適宜組合わせあるレ、は繰返すことによって純粋に採取することができる。本発明による FK 1 - 1 0 8 3物質の理化学的性状については次の通りである

( 1 ) 性状：無色油状

(2) 分子量： 3 4 3. 2247 ( + Na, 高分解能高速原子衝撃質量分析による）、

(3) 分子式： C₂₀H₃₂〇₃ 、

(4) 紫外部吸収スぺクトル：メタノール中で測定した紫外部吸収スぺクトルは、 204 nm (ε = 205 0 0) 、 2 1 5 nm (ショルダー、 s = 1 3 7 20) 、 2 5 0 nm (e = 1 0 4 6 0) に極大吸収を有する、

( 5 ) 赤外部吸収スぺクトル：臭化力リウム錠剤法で測定した赤外部吸収スぺクトルは、 2 9 27、 28 54、 1 732、 1 6 7 0、 1 6 0 5、 1 4 6 4、 1 4 0 8、 1 379、 1 3 2 5, 1 2 5 0、 1 1 65、 9 8 5、 7 6 8 cm ¹に極大吸収を有する、

(6) ¹Hプロトン核磁気共鳴スペクトル：重メタノール中の化学シフト（p pm) およびスピン結合定数（Hz) を第 2表に示す、 (7) ¹³C核磁気共鳴スペクトル：重メタノール中の化学シフト（p pm) を第 2表に示す、

(8) 溶剤に対する溶解性：クロ口ホルム、酢酸ェチル、メタノールに可溶、水、 n—へキサンに難溶、

( 9 ) 呈色反応：硫酸、ョゥ素に陽性。

第 2表

13 C H

1 8 3. 1 s

1 6 4. 5 s

1 6 0. 1 S

1 4 0. 7 S

1 1 8. 7 S

1 1 8. 2 d 5. 26 t ( 1 H, J = 7. 2)

1 0 0. 1 S

5 6. 4 q 00 s ( 3 H)

4 0. 5 t 0 6 t (2H, J 7. 6)

3 3. 0 26 m ( 2 H)

3 0. 8 40 d (2H， J = 7. 2)

3 0. 5 26 m (2H)

3 0. 4 26 m ( 2 H)

3 0. 2 26 m (2H)

2 8. 8 43 m (2H)

2 3. 7 28 m ( 2 H)

1 6. 3 q 76 s ( 3 H)

1 4. 4 q 88 t (3H, J 7. 2)

1 0. 0 q 94 s ( 3 H) 7. 0 q 1. 80 s ( 3 H) 但し、表中の記号、 sは一重線、 dは二重線、 tは三重線、 qは四重線、 m は多重線、 Hはプロトンの数、 Jはスピン結合定数（Hz) を示す。以上、本発明の FK 1 - 1 083物質の各種理化学的性状やスぺクトルデー夕を詳細に検討した結果、本 FK I— 1 083物質は下記式で表される化学構造であることが決定された。

以上のとおり、本発明 FK 1 - 1 083物質の各種理化学的性状について詳述したが、このような性質に一致する化合物はこれまで報告されておらず、本 F K I - 1 0 8 3物質は新規物質であると決定した。次に、本発明 FK 1 - 1 083物質の NADH—フマル酸レダクターゼ阻害活性について詳しく説明する。

豚回虫筋肉を 1 2 OmMリン酸ナトリウム溶液（pH 7. 0) 中でホモジナィズ後、 3000 X g、 1 0分間遠心して上清を集めた。それをさらに 1 0 00 0 X g、 20分間遠心して沈殿を集めた。その沈殿を 1 2 OmMリン酸ナトリウム溶液（pH7. 0) に懸濁することにより、ミトコンドリア画分とした。 9 6 穴マイクロプレートに本 FK 1 - 1083物質の 50 %ジメチルスルホキシド溶液 1 0 1を添加後、 0. 351111^の入0^^ 7. 2 mMのフマル酸ニナトリゥムを含んだ 1 2 OmMリン酸ナトリウム溶液（PH7. 0) 80 1を加えて、マイクロプレートリーダー ELX 808 (B i o— Tek I ndu s t r i l o e s社製、米国）にて 37°C、 5分間プレインキュベーションを行った。

そこに豚回虫ミトコンドリア画分を 1 0 1 (蛋白量 0. 3mg) 添加して、 37°C、 1 0分間インキュベーションを行い、 340 nmの NADHの吸収を 1 5秒ごとに測定した。 340 nmの吸光度の減少の傾きを NADH—フマル酸レダクターゼ酵素活性として定量した結果、 FK I— 1 083物質は 4. 1 nM の濃度で NADH—フマル酸レダクターゼ活性を 50%阻害した。したがって、 FK I - 1 083物質は蠕虫感染症の治療用あるいは予防用組成物として使用し得ることが期待される。また、本発明 FK 1 - 1 083物質の栄養寒天培地上での各種微生物に対する最小発育阻止濃度（寒天平板希釈法による）を下記の第 3表に示した。

第 3表試験菌最小発育阻止濃度

( g/m 1 ) ス夕フイロコッカス .ァウレウス（Staphylococcus aureus)ATCC6538p

6. 25 バチルス ·サブチリス（Bacillus subtilis)ATCC6633 6. 25 ミクロコッカス■ルテウス（Micrococcus luteus)ATCC9341 6. 25 ミコバクテリゥム■スメグマチス（Mycobacterium smegmatis)ATCC607

1 2. 5 ェシエリヒア ' コリ（Escherichia coli)NIHJ > 1 00

ェシエリヒア ' コリ（Escherichia col NIHJ JC-2 (IF012734)

> 1 00

シユード乇ナス ·エルギノ一ザ（Pseudomonas aeruginosa) IF03080

> 1 00 キサントモナス ·カンペストリス p v. ォリゼ

(Xanthomonas campestris pv. oryzae)KB88

> 1 0 0

カンジダ 'アルビカンス（Candida albicans)KFl > 1 0 0

サッカロミセス ·セレビジァェ (Saccharomyces cerevisiae) F26

> 1 0 0

ァスペルギルス ·ニガ一（Aspergillus niger)ATCC6275 1 0 0

ムコール · ラセモサス（Mucor racemo_sus)IF04581 1 0 0 上記の第 3表から明らかなように、本発明 FK 1 - 1 0 8 3物質はいくつかの微生物に対して発育阻害活性を示した。次に、本発明の FK 1 - 1 0 83物質の抗線虫及び抗節足動物活性について以下に詳しく説明する。

9 6穴プレート（コ一二ング社製、米国）に本発明 FK 1 - 1 08 3物質のメタノール溶液を加え、真空ポンプ下でメタノールを留去した後、検定用培地（レシチン 0. 0 1 %、炭酸水素ナトリウム 7. 5mM、塩化カリウム 7. 5 mM 、塩化カルシウム二水和物 7. 5mM、硫酸マグネシウム七水和物 7. 5mM) 250 / 1を加え、 1 5分間振とうした。

そこに、線虫増殖用寒天培地 [バクトァガー（ディフコ社製、米国） 1. 7 %、パクトペプトン（ディフコ社製、米国） 0. 5%、酵母エキス（ディフコ社製、米国） 1. 0%、塩化ナトリウム 0. 3%、コレステロール 0 0 0 5 % 、塩化カルシウム 0. 0 0 7 %、硫酸マグネシウム 0. 0 3%、リン酸水素カリゥム 0. 34%、リン酸水素二カリウム 0. 1 1 %からなる培地で大腸菌を生育させたもの] 上で飼育した線虫 C a e n o r h a b d i t i s e 1 e g a n s を 1 0匹程度加え、また、緩衝液（トリス 0. 24 %、塩化ナトリウム 2. 5 7 %、塩化マグネシウム 0. 4 7%、塩化カリゥム0. 0 7%、炭酸ナトリウム 0 . 02 %、硫酸マグネシウム 0. 64 %、塩化カルシウム 0. 1 1 %、 ρΗ 7. 1に調整）中で孵化させた節足動物 A r t em i a s a 1 i n aのノープリゥス幼生を数匹含む緩衝液を 50 1加えた。

これらの生物の様子を 2日後に顕微鏡下で観察したところ、線虫 C a e n o r habd i t i s e 1 egan sに対しては 20〃 gZm 1の濃度で生育を阻害した。また、節足動物 A r t em i a s a 1 i n aに対しては 2 /gZm 1の濃度で生育を阻害した。したがって、本発明の FK 1 - 1 083物質は抗蠕虫剤や殺虫剤などの薬剤として有効である。発明を実施するための最良の形態

次に、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれのみに限定されるものではない。

寒天斜面培地で培養したバーチシリウム 'エスピー (Ve r t i c i 1 1 i urn s p. ) FK I— 1 083株（FERM BP— 7804) より、グルコース 2. 0%、ポリペプトン（日本製薬社製、日本国） 0. 5%、酵母エキス（オリエンタル酵母工業社製、日本国） 0. 2%、寒天 0. 1 %、リン酸二水素力リウ厶 0. 1 %、硫酸マグネシウム七水和物 0. 05 %からなる液体培地（pH 5. 7) 力 1 00ml入った 500 ml容三角フラスコに 1白金耳接種し、 27 °Cで 3日間振盪培養した。それを種培養液として、ポテト 'デキストロース 'ブロス（ディフコ社製、米国） 2. 4%、マルト ·ェクストラクト（ディフコ社製、米国） 1. 5%、リン酸マグネシウム八水和物 0. 5%、寒天 0. 1%からなる液体培地（pH6. 0) を 1 00mlずつ分注した 500 ml容三角フラスコ 20本に 1 m 1ずつ接種し、 27 °Cで 7日間振盪培養した。

培養液は遠心分離し、得られた菌体をメタノールで抽出し、減圧濃縮してメ夕ノールを留去後、更に酢酸ェチルで抽出して減圧濃縮し、 1. 21 gの粗物質 Iを得た。これをへキサン—酢酸ェチル（1 0 : 1) で充塡したシリカゲルカラム（Ar t. 7734、メルク社製、米国）にのせ、へキサン—酢酸ェチル（3 ： 1)で洗浄後、へキサン—酢酸ェチル（1 : 1) で溶出し、減圧濃縮により 8 1. Omgの粗物質 I Iを得た。これをさらに、へキサン—酢酸ェチル（2 ： 1 ) で充填したシリカゲルカラム（Ar t. 7734、メルク社製、米国）にのせ、へキサン一酢酸ェチル（2 ： 1) で溶出し、減圧濃縮することによって、無色油状の FK I— 1 083物質を 6 1. lmg得た。産業上の利用分野

以上説明したように、糸状菌に属する FK 1— 1 083物質を生産する能力を有する微生物を培地で培養し、培養物中に FK 1 - 1 083物質を蓄積せしめ、該培養物から本 FK 1 - 1 083物質を単離することにより製造され、得られた FK I 1 083物質は微生物、線虫および節足動物に対して生育阻害活性を有するため、医薬品、動物薬、農薬として有効な物質であると期待される。

Claims

請求の範囲

1. 下記式

で表される化合物であることを特徵とする新規 FK 1 - 1 0 8 3物質。

2. 請求の範囲 1に記載の化合物が微生物に対して発育阻害活性を有することを特徴とする新規 FK 1 - 1 0 8 3物質。

3. 請求の範囲 1に記載の化合物が線虫に対して発育阻害活性を有することを特徴とする新規 FK 1 - 1 08 3物質。

4. 請求の範囲 1に記載の化合物が節足動物に対して発育阻害活性を有することを特徴とする新規 FK 1 - 1 0 8 3物質。

5. 上記の線虫の生育阻害により抗蠕虫剤として用いられることを特徵とする請求の範囲 3に記載の新規 F K 1 - 1 0 8 3物質。

6. 上記の節足動物の生育阻害により殺虫剤として用いられることを特徵とする請求の範囲 4に記載の新規 FK 1 - 1 0 8 3物質。

7. 糸状菌に属し、下記式

で表される FK 1 - 1 0 8 3物質を生産する能力を有する微生物を培地で培養し、培養物中に FK 1 - 1 0 8 3物質を蓄積せしめ、該培養物から FK 1 - 1 0 8 3物質を探取することを特徵とする新規 FK I - 1 0 8 3物質の製造法。

8. FK I - 1 0 8 3物質を生産する能力を有する微生物が、糸状菌に属するパーチシリゥム ·エスピー (Ve r t i c i 1 1 i urn s p. ) FK I - 1 08 3 (FERM B P— 78 04) であることを特徴する請求の範囲 7に記載の製造法。

9. FK I - 1 0 8 3物質を生産する能力を有する微生物が、パーチシリウム ·エスピー（Ve r t i c i l l i um s p. ) FK I - 1 0 8 3である微生物。

1 0. 微生物が、バ一チシリウム 'エスピー（V e r t i c i 1 1 u m s p. ) FK I - 1 0 8 3 (FERM BP— 78 0 4) である請求の範囲 9 に記載の微生物。

1 1. 下記式

で表される FK 1 - 1 083物質からなる NADH—フマル酸レダクタ一ゼ阻害剤。