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Verfahren zur Erzeugung von D-Ribose
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Die vorliegende Erfindung betrifft ein fermentatives Verfahren zur
Erzeugung von D-Ribose.
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D-Ribose in sämtlicher lebender Materie als Bestandteil der Ribonucleinsäuren
enthalten, und ihr Derivat in reduzierter Form, Ribit, kommt als Komponente des
Vitamins B2 und als Ribitteichonat vor, das eine Komponente der Zellwand ist. Dementsprechend
sind beide Substanzen von großer Bedeutung, sei es bereits allein unter physiologischen
Gesichtspunkten.
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D-Ribose wird auch als Ausgangsstoff für die Synthese von Vitamin
B2 eingesetzt, und in neuerer Zeit erregt seine Verwendung als Rohstoff für Nucleotid-Würzmittel
große Aufmerksamkeit. Unter diesen Umständen ist es industriell von hoher Bedeutung,
die Substanz zu niedrigem Preis und in großem Produktionsmaßstab zu erzeugen.
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Die bisher bekannten Verfahren zur Erzeugung von D-Ribose umfassen
das Verfahren, bei dem D-Ribose aus Naturstoffen extrahiert wird, das Verfahren,
bei dem sie aus Furan, Glucose etc. synthetisiert wird, und das Fermentationsverfahren
unter Einsatz von Mikroorganismen.
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Die vorgenannten Verfahren haben Nachteile dahingehend, daß sie eine
komplizierte Serie von Produktionsschritten oder die Verwendung teurer Materialien
erfordern oder aber nur geringe Ausbeuten an D-Ribose liefern, was zur Folge hat,
daß keines von ihnen als wirtschaftlich-technisches Verfahren zur Erzeugung von
D-Ribose voll befriedigend ist.
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Die Erfinder der vorliegenden Erfindung führten eingehende Untersuchungen
mit dem Ziel durch, ein fermentatives Verfahren zur Erzeugung von D-Ribose in guter
Ausbeute mit Hilfe eines Mikroorganismus der Gattung Bacillus zu entwickeln. Dabei
wurde gefunden, daß sich D-Ribose in großen Mengen durch Kultivieren eines Stammes
der Gattung Bacillus in einem zuckerhaltigen Fermentationsmedium erzeugen läßt,
das durch eine Substanz ergänzt ist, die die Bildung von Gluconsäure hemmt, das
Wachstum des Stammes jedoch nicht beeinflußt. Dieser Befund zog weitere Forschungen
nach sich, aus denen die Entwicklung der vorliegenden Erfindung resultiert.
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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung von
D-Ribose durch Kultivieren eines zur Gattung Bacillus gehörenden Mikroorganismus,
der zur Erzeugung von D-Ribose in einem Medium befähigt ist, das durch eine Verbindung
der Formel R-X-COOH (I)
in der R H- oder eine C1-C4-Alkyl-Gruppe
ist, die durch 1 oder 2 Gruppen der Formel HO-, HS-, CH3S-
(R' ist H- oder NH2-) substituiert sein kann, und X eine Gruppe der Formel
ist, oder ein Salz derselben ergänzt ist, und Ernten der dadurch erzeugten und angereicherten
D-Ribose aus der Kulturbrühe.
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Zu den zur Gattung Bacillus gehörenden und zur Bildung von D-Ribose
befähigten Mikroorganismen gehören beispielsweise Stämme von Bacillus pumilus und
Bacillus subtilis. Speziell seien die folgenden Stämme genannt: Bacillus pumilus
Nr. 503 (IFO 12600, ATCC 21356), Nr. 537 (IFO 12601, ATCC 21357), Nr. 558 (IFO 12602,
ATCC 21358), Nr. 716 / IFO 13322 (eingereicht am 03. Juni 1972), FERM BP-812, ATCC
21951 (eingereicht am 04.
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Juni 1973) 7, Nr. 911 (IFO 13566, FERM-P 2260, ATCC 31095), Nr. 1027
(IFO 13585, FERM-P 2466, ATCC 31098), Nr. 1083 (IFO 13620, FERM-P 2832, ATCC 31093),
Bacillus subtilis Nr. 429 (IFO 12603, ATCC 21359), Nr. 483 (IFO 12604, ATCC 21360),
Nr. 608 (IFO 13323, FERM-P 1490, ATCC 21952), Nr. 957 (IFO 13565, FERM-P 2259, ATCC
31096), Nr. 941 (IFO 13573, FERM-P 2360, ATCC 31097),
Nr. 1054 (IFO
13586, FERM-P 2467, ATCC 31091), Nr. 1067 (IFO 13588, FERM-P 2468, ATCC 31092),
Nr. 1097 (IFO 13621, FERM-P 2833, ATCC 31094).
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Die oben angegebenen IFO-Nummern sind Hinterlegungsbezeichnungen des
"Institute for Fermentation, Osaka" (IFO), Japan, die FERM-Nummern sind diejenigen
des "Fermentation Research Institute" (FRl), Agency of Industrial Science and Technology,
Japan, und die ATCC-Nummern sind diejenigen von The American Type Culture Collection
(ATCC), USA.
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Der Stamm Bacillus pumilus Nr. 716 wurde am 17. Juni 1972 bei dem
Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry
of International Trade and Industry (FRI), Japan, unter der Hinterlegungsbezeichnung
FERM P-1491 hinterlegt und wird nach der Umwandlung der Hinterlegung in eine solche
nach dem Budapester Vertrag bei dem FRI unter der Hinterlegungsbezeichnung FERM
BP-812 aufbewahrt.
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Für die im Vorstehenden angeführten Mikroorganismen sind die bakteriologischen
kennzeichnenden Eigenschaften des Bacillus pumilus und des Bacillus subtilis die
gleichen wie diejenigen, die in Bergey's "Manual of Determinative Bacteriology,
8. Auflage, Seite 529-534, beschrieben sind, mit der Maßgabe, daß Stämme, bei denen
durch mutagene Behandlung Defekte in bezug auf die Fähigkeit zur Sporenbildung (Sporulation)
erzeugt wurden, eingeschlossen sind.
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Die in der Praxis der vorliegenden Erfindung eingesetzten Mikroorganismen
sind Stämme der Gattung Bacillus,
die zum Wachstum aromatische Aminosäuren
(L-Tyrosin, L-Tryptophan und Phenylalanin) benötigen, Stämme der Gattung Bacillus,
die in bezug auf wenigstens entweder Transketolase oder D-Ribulose-5-phosphatase-3-epimerase
fehlerhaft sind, Stämme der genannten Bacillus-Organismen, die in bezug auf die
Fähigkeit zur Sporulation fehlerhaft sind, sowie diejenigen Stämme der genannten
Bacillus-Stämme oder Organismen, die eine Aktivität zur Oxidation von 2-Desoxy-D-glucose
besitzen. Wenn diese Mikroorganismen in einem die für ihr Wachstum notwendigen Nährstoffe
enthaltenden Medium kultiviert werden, erzeugen sie D-Ribose und reichern sie in
den Brühen in großen Mengen an, jedoch liefern sie gleichzeitig Gluconsäure als
Nebenprodukt. Bei der Durchführung der Kultur hemmt der Zusatz einer Verbindung
der allgemeinen Formel (I) die Erzeugung von Gluconsäure und ergibt eine höhere
Ausbeute an D-Ribose.
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Beispiele für die Cl-C4-Alkyl-Gruppe in der Verbindung (I) umfassen
Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, n-Butyl, Isobutyl, sec-Butyl und tert-Butyl.
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Zu Beispielen für die Gruppe (in der R' die im Vorstehenden angegebenen
Bedeutungen hat),
die gegebenenfalls die C1-C4-Alkyl-Gruppe substituieren kann, zählen Phenyl und
p-Aminophenyl.
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Zu Beispielen für die Verbindung (I) zählen L-Valin, L-, D- oder DL-Leucin,
L-Isoleucin, L-Methionin, L-Cystein, L-Cystin, Phenylalanin, DL-«-Amino-n-buttersäure,
p-Amino-DL-phenylalanin, DL-3-Phenylserin, Glyoxylsäure und d-Ketoisocapronsäure.
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Zu Beispielen für das Salz der Verbindung (I) zählen Natrium-, Kalium-,
Lysin-hydrochlorid- oder andere Salze der DL-e-Aminobuttersäure, Glyoxylsäure und
«-Ketoisocapronsäure.
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Die Werte der Zusätze der Verbindung (I), bezogen auf das verwendete
Medium, betragen allgemein etwa 0,2 g/l, vorzugsweise etwa 0,2 bis 2 g/l, und besonders
bevorzugt etwa 0,2 bis 0,6 g/l. Der genannte Wert des Zusatzes bezeichnet die pro
Kultur zugegebene Gesamtmenge.
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Hinsichtlich des Zeitplans der Zugabe der Verbindung (I) kann die
Verbindung dem Ausgangsmedium oder dem Medium in einem frühen Zwischenstadium der
Kultur zugesetzt werden.
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Als Kulturmethoden kommen verschiedene routinemäßig eingesetzte Kulturmethoden
für Mikroorganismen in Betracht, von denen die aerobe Submerskultur die vorteilhafteste
ist.
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Das Medium besteht aus verschiedenen Nährstoffen, darunter Kohlenstoff-
und Stickstoff-Quellen. Kohlenstoff-Quellen sind beispielsweise D-Glucose, D-Fructose,
D-Mannose, Sorbit, D-Mannit, Sucrose, Melasse, Stärke-Hydrolysat, Stärke, Essigsäure,
Ethanol etc.. Zu den Stickstoff-Quellen zählen verschiedene stickstoffhaltige organische
Quellen wie Maisquellflüssigkeit, Baumwollsamenöl, Hefeextrakt, Trockenhefe, Fischmehl,
Fleischextrakt, Pepton, Casaminosäure etc., anorganische Stickstoff-Verbindungen
wie wäßriges Ammoniak, gasförmiges Ammoniak, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat,
Ammoniumchlorid,
Ammoniumcarbonat, Ammoniumphosphat, Natriumnitrat etc. und organische Stickstoff-Verbindungen
wie Harnstoff, Aminosäuren etc.. Zusätzlich zu diesen Kohlenstoff- und Stickstoff-Quellen
kann das Medium geeignete Mengen verschiedener Metalle, Vitamine, Aminosäuren etc.
enthalten, die für das Wachstum der Mikroorganismen erforderlich sein können.
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Wenngleich die Kulturbedingungen, d.h. Inkubations-Temperatur, pH
des Mediums, Inkubations-Zeit etc. nicht besonders kritisch sind, betragen die Inkubations-Temperatur
im allgemeinen etwa 18"C bis 45"C, vorzugsweise etwa 250C bis 400C, der pH des Mediums
allgemein etwa 4,5 bis 9, vorzugsweise etwa 5,5 bis 8 und die Inkubations-Zeit allgemein
etwa 18 bis 180 h, vorzugsweise etwa 36 bis 120 h.
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Die D-Ribose kann aus der Kulturbrühe mittels der herkömmlichen Verfahren
zur Gewinnung von D-Ribose geerntet werden, d.h. durch die Schritte des Entfernens
der Zellen durch Filtration oder Zentrifugation, des Behandelns des Filtrats oder
des überstands mit Aktivkohle und Ionenaustausch-Harzen zur Entfärbung und Entsalzung,
des Einengens desselben und schließlich des Zugebens eines organischen Lösungsmittels
wie Ethylalkohol zu dem Konzentrat zum Zwecke der Kristallisation. Falls irgendein
anderes Kohlenhydrat als D-Ribose ebenfalls in der Brühe enthalten ist, läßt es
sich durch Behandeln mit Glucose-oxidase oder mit einer Hefe oder einem Bakterienstamm,
der D-Ribose nicht verwertet, das spezielle Kohlenhydrat jedoch verwertet, entfernen.
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Die Erträge an D-Ribose und Gluconsäure, die in den mit Verbindungen
gemäß der vorliegenden Erfindung ergänzten
Kulturen gewonnen wurden,
sind im Folgenden angegeben.
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In diesen Kulturen waren der Stamm und das Medium die gleichen, die
auch in dem nachfolgenden Beispiel 1 verwendet wurden, und die Kulturbedingungen
sowie die anderen Arbeitsweisen waren ebenfalls die gleichen wie in Beispiel 1.
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Die Erträge an D-Ribose und Gluconsäure in den Brühen sind in Tabelle
1 aufgeführt.
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Tabelle 1 Zusatzstoff Menge D-Ribose- Gluconsäure-Ausbeute Menge
(gil) (mg/ml) (mg/ml) Kontrolle - 65,1 40,5 L-Valin 0,25 80,5 5,1 L-, D-, DL-Leucin
0,25 82,3 4,8 Lt-Isoleucin 0,25 74,4 8,3 Lt-Methionin 0,25 73,4 15,5 Cystin 0,25
71,3 4,8 Cystein 0,25 70,2 6,2 Phenylalanin 0,25 74,5 6,0 DL-ccAmino-n-buttersäure
0,25 77,1 9,1 p-Amino-DL-phenylalanin 0,25 78,3 4,8 DL-3-Phenylserin 0,25 79,0 4,6
Glyoxylsäure 0,25 75,4 20,5 d-Ketoisocapronsäure 0,25 76,3 10,1 Es ist zu erkennen,
daß die Kultur mit dem Zusatzstoff gemäß der vorliegenden Erfindung Gluconsäure
nur in
einer Menge von 4 bis 20 mg/ml erzeugt, während die herkömmliche
Kultivierung 30 bis 50 mg/ml Gluconsäure liefert. Dementsprechend unterdrückt die
vorliegende Erfindung die Nebenprodukt ion von Gluconsäure und steigert die Ausbeute
an D-Ribose.
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Die Kultivierung eines zu der Gattung Bacillus gehörenden und zur
Erzeugung von D-Ribose in einem Medium, das durch eine Verbindung (I), einschließlich
eines Salzes derselben, gemäß der vorliegenden Erfindung ergänzt ist, befähigten
Mikroorganismus ergibt eine unterdrückte Bildung des Nebenprodukts Gluconsäure und
eine erhöhte Ausbeute an D-Ribose. Da die Menge des Nebenprodukts Gluconsäure klein
ist, wird der Arbeitsgang des Abtrennens und Entfernens der Gluconsäure erleichtert.
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Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher
erläutert, ist jedoch nicht auf diese beschränkt.
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Beispiel 1 Der Mutanten-Stamm Nr. 716 (IFO 13322, FERM P-1491, ATCC
21951) von Bacillus pumilus, die von dem Ursprungsstamm durch wiederholte Ultraviolett-Bestrahlung
abgeleitet ist, wurde in ein Medium (10 1) geimpft, das 2 % Sorbit, 2 % Maisquellflüssigkeit,
0,3 % Dikaliumphosphat und 0,1 % Monokaliumphosphat enthielt, und 24 h bei 360C
inkubiert. Mit der erhaltenen Kultur wurde ein Medium (100 1) beimpft, das 18 %
D-Glucose, 2 % Maisquellflüssigkeit, 0,5 % Ammoniumsulfat, 1,6 % Calciumcarbonat,
0,005 % L-Tryptophan und 0,025 % L-Valin enthielt; die Inkubation erfolgte mittels
aerober
Submers-Kultur 72 h bei 380C. Als Ergebnis wurde D-Ribose erzeugt und angereichert
in einer Menge von 80,1 mg/ml. Der Ertrag an D-Ribose wurde nach der Orcin-Methode
bestimmt. Diese Methode ist beschrieben in "Methods in Carbohydrate Chemistry",
Vol. 1, Seite 484 (1962).
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Aus dieser D-Ribose-Fermentationsbrühe wurden die Zellen abfiltriert,
und das Filtrat wurde auf etwa die Hälfte seines Volumens eingeengt, und anschließend
wurde etwa ein Viertel seines Volumens Ethanol zugesetzt. Nach dem Abfiltrieren
des erhaltenen Niederschlags wurde das Filtrat an einem Kationenaustausch-Harz und
einem Anionenaustausch-Harz entsalzt und an einer Aktivkohle-Säule entfärbt. Die
entfärbte Flüssigkeit wurde konzentriert und etwa mit dem 4fachen Volumen Ethanol
versetzt, wonach 7,4 kg kristalline D-Ribose erhalten wurden.
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Beispiel 2 Derselbe Mutanten-Stamm von Bacillus pumilus, wie er in
Beispiel 1 verwendet wurde, d.h. Nr. 716 (IFO 13322, FERM P-1491, ATCC 21951), wurde
in ein Medium (10 1) geimpft, das 2 % Sorbit, 2 % Maisquellflüssigkeit, 0,3 % Dikaliumphosphat
und 0,1 % Monokaliumphosphat enthielt, und 24 h bei 370C inkubiert. Mit der erhaltenen
Kultur wurde ein Medium (100 1) beimpft, das 20 t D-Glucose, 2,2 % Maisquellflüssigkeit,
0,5 % Ammoniumsulfat, 1,6 % Calciumcarbonat, 0,05 % Mangansulfat, 0,05 % Leucin
und 0,005 % L-Tryptophan enthielt; die Inkubation erfolgte mittels aerober Submers-Kultur
72 h bei 37°C. Am Ende der Inkubationszeit waren 90,6 mg/ml
D-Ribose
angereichert worden. Die Brühe wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 behandelt,
wodurch 8,3 kg kristalline D-Ribose isoliert wurden.
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Beispiel 3 Derselbe Mutanten-Stamm von Bacillus pumilus, wie er in
Beispiel 1 verwendet wurde, d.h. Nr. 716 (IFO 13322, FERM P-1491, ATCC 21951), wurde
in ein Medium (10 1) geimpft, das 2 % Sorbit, 2 % Maisquellflüssigkeit, 0,3 % Dikaliumphosphat
und 0,1 % Monokaliumphosphat enthielt, und 24 h bei 37"C inkubiert. Mit der erhaltenen
Kultur wurde ein Medium (100 1) beimpft, das 18 % D-Glucose, 2,2 % Maisquellflüssigkeit,
0,5 % Ammoniumsulfat, 1,6 % Calciumcarbonat, 0,005 % L-Tryptophan und 0,025 % «-Aminobuttersäure
enthielt; die Inkubation erfolgte mittels aerober Submers-Kultur 72 h bei 370C.
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Am Ende der Inkubationszeit waren 78,2 mg/ml D-Ribose angereichert
worden. Die Brühe wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 behandelt, wodurch
7,2 kg kristalline D-Ribose isoliert wurden.