PL205622B1 - Ciągły sposób wytwarzania etanolu w beztlenowej fermentacji bakteryjnej - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest ciągły sposób wytwarzania etanolu w beztlenowej fermentacji bakteryjnej.

Niniejszy wynalazek dotyczy udoskonaleń w sposobach wytwarzania etanolu przez fermentację mikrobiologiczną gazowego substratu zawierającego przynajmniej jeden gaz redukujący, z zastosowaniem beztlenowych bakterii acetogennych.

Wynalazku niniejszego dokonano przy wsparciu rządu USA w ramach grantów nr DE-FC0494AL98770, 85XTA046V i 85X-SX613V, przyznanych przez Departament Energii USA oraz grantu nr 96-AARC-1-077, przyznanego przez Departament Rolnictwa USA. Rząd Stanów Zjednoczonych posiada pewne prawa do tego wynalazku.

Twórcy obecnego wynalazku ujawnili sposoby wytwarzania etanolu, kwasów organicznych, alkoholi, wodoru i soli kwasów organicznych na drodze fermentacji mikrobiologicznej substratów gazowych, zachodzącej w pożywkach zawierających odpowiednie składniki odżywcze i mikroelementy, z użyciem pewnych bakterii beztlenowych. Na przykład, twórcy uprzednio ujawnili, że rozcieńczone mieszaniny gazowe wprowadza się do bioreaktora zawierającego jeden lub więcej szczepów bakterii beztlenowych, które wykorzystują odpadowe składniki gazowe bezpośrednio do wytwarzania pożądanego związku. Związek ten następnie odzyskuje się z fazy wodnej w osobnym naczyniu lub naczyniach, z wykorzystaniem sposobu odzyskiwania odpowiedniego do wytworzonego związku. Do przykładowych sposobów odzyskiwania należy ekstrakcja, destylacja, kombinacja ekstrakcji i destylacji, albo też inne wydajne sposoby odzyskiwania. Bakterie mogą być usuwane z fazy wodnej i zawracane do bioreaktora w celu utrzymania wysokiego stężenia komórek i tym samym, maksymalizowania wydajności. Oddzielanie komórek, jeśli jest pożądane, dokonywane jest za pomocą odwirowania, filtracji membranowej albo innych technik; zobacz, na przykład, międzynarodowe zgłoszenie patentowe WO98/00558, opublikowane 8 stycznia 1998 r. oraz patenty Stanów Zjednoczonych Ameryki: US-5807722, US-5593886 i US-5821111.

Szczepy bakterii beztlenowej Clostridium Ijungdahlii oprócz ich głównego produktu - kwasu octowego - są również zdolne do wytwarzania etanolu jako produktu konwersji monotlenku węgla (CO), wodoru (H2) i ditlenku węgla (CO2). Wytwarzanie kwasu octowego (CH3COOH) i etanolu (C2H5OH) z CO,

CO2 i H2 przedstawiono w następujących sumarycznych równaniach stechiometrycznych:

CO + 2 H₂O CH₃COOH + 2 CO₂ (1)

H₂ + 2 CO₂ CH₃COOH + 2 H₂O (2)

CO + 3 H₂O C₂H₅OH + 4 CO₂ (3)

6H₂ + 2 CO₂ C₂H₅OH + 3 H₂O (4)

Do kilku przykładowych szczepów C. Ijungdahlii należą: szczep PETC (patent Stanów Zjednoczonych Ameryki US-5173429), szczep ERI2 (patent Stanów Zjednoczonych Ameryki US-5593886) oraz szczepy C-01 i O-52 (patent Stanów Zjednoczonych Ameryki US-6136577). Każdy z tych szczepów zdeponowano w American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, z numerami dostępu (Accession No.) odpowiednio: 55383 (uprzednio ATCC No. 49587), 55380, 55988 i 55989. Każdy ze szczepów C. Ijungdahlii jest szczepem bakterii beztlenowych gramdodatnich, z zawartością nukleotydów guaninowych i cytozynowych (G+C) około 22% molowych. Bakterie te do wzrostu potrzebują szeregu substratów, ale nie potrzebują metanolu lub mleczanu. Szczepy te różnią się ich tolerancją na CO, szybkościami właściwymi pochłaniania gazu i produktywnością.

W przypadku szczepów „dzikich występujących w przyrodzie, obserwuje się tylko bardzo małą produkcję etanolu. Szczepy C. Ijungdahlii działają najlepiej w temperaturze 37°C, przy czym w typowych przypadkach szczepy „dzikie wytwarzają produkty o stosunku etanol/acetyl (gdzie acetyl oznacza zarówno wolny, czyli cząsteczkowy, kwas octowy jak i sole kwasu octowego) równym około 1:20 (1 część etanolu na 20 części acetylu). Stężenia etanolu zazwyczaj wynoszą tylko 1-2 g/l. Chociaż ta zdolność wytwarzania etanolu jest interesująca, jednakże z uwagi na niską wydajność etanolu „dzikie bakterie nie mogą być zastosowane do opłacalnego wytwarzania etanolu w skali przemysłowej.

Po wprowadzeniu niewielkich zmian w składzie pożywki, wyżej wymienione szczepy C. Ijungdahlii stosowano do wytwarzania etanolu i acetylu o stosunku w produkcie równym 1:1 (równa zawartość etanolu i acetylu), ale stężenie etanolu jest wówczas poniżej 10 g/l, co jest poziomem dającym w wyniku niską produktywność poniżej 10 g/Ldoba. W dodatku problematyczna jest stabilność kultury bakteryjnej, głównie z uwagi na stosunkowo wysokie (8-10 g/l) stężenie acetylu (2,5-3 g/l cząsteczkowego kwasu octowego) występującego w obecności etanolu. Ponadto, wraz ze zwiększeniem szybkości przepływu gazu stosowanym w celu zwiększenia wytwarzania etanolu następuje spowolnienie rozwoju kultury bakteryjnej, po pierwsze przez cząsteczkowy kwas octowy, a następnie przez CO.

PL 205 622 B1

W rezultacie kultura bakteryjna staje się niestabilna, nie poch ł ania gazu i nie wytwarza dalszych iloś ci produktu. Również, początkowe badania twórców wykazały trudność w osiągnięciu większego stosunku etanol/acetyl niż 2:1, przy pracy instalacji w stanie ustalonym - patrz np. Klasson et al, 1990 Applied Biochemistry and Biotechnology, Materiały 11^th Symposium on Biotechnology for Fuels and Chemicals, 24/25: 857; Philips et al, 1993 Applied Biochemistry and Biotechnology, Materiały 14^th Symposium on Biotechnology for Fuels and Chemicals, 39/40: 559, i inne.

W wielu dokumentach opisano zastosowanie bakterii beztlenowych innych niż C. Ijungdahlii do wytwarzania rozpuszczalników przez fermentację cukrów, w której nie następuje zużycie CO, CO2 i H2. Usiłowano uzyskać wysokie wydajnoś ci etanolu przez zmienianie szeregu parametrów, takich jak: rodzaj pożywki, mikroorganizm, rodzaj dodawanego czynnika redukującego, zmiany pH oraz dodawanie gazu egzogennego - patrz np. Rothstein et al, 1986 J. Bacteriol, 165(1): 319-320; Lovitt et al, 1988 J. Bacteriol, 170(6): 2809; Taherzadeh et al, 1996 Appl Microbiol. Biotechnol, 46: 176.

W stanie techniki nadal istnieje zapotrzebowanie na sposoby operowania przemysłowymi substratami gazowymi, na zdolność wyodrębniania cennych surowców z takich gazów, szczególnie gazów odpadowych, takich jak H2, CO i CO2. Istnieje potrzeba zwiększenia produkcji etanolu w stosunku do wytwarzania innych produktów zazwyczaj wytwarzanych w fermentacji takich gazów przez bakterie acetogenne.

Odpowiadając na zapotrzebowanie istniejące w stanie techniki obecny wynalazek dostarcza nowego sposobu wytwarzania etanolu, który jest sposobem ciągłym, w stanie ustalonym i w którym uzyskuje się stężenia etanolu przewyższające 10 g/l oraz stężenia octanu niższe niż około 8-10 g/l, jednocześnie umożliwiając wzrost kultury bakteryjnej i jej dobrą stabilność.

Niniejszy wynalazek dotyczy ciągłego sposobu wytwarzania etanolu w beztlenowej fermentacji bakteryjnej z substratu gazowego zawierającego monotlenek węgla, który polega na hodowaniu w bioreaktorze fermentacyjnym bakterii Clostridium Ijungdahlii, zdolnej do wytwarzania etanolu w ciekłej pożywce, zawierającej pantotenian wapnia, przy pH poniżej 5,5, przy czym stężenie wolnego kwasu octowego w bioreaktorze jest mniejsze niż 5 g/l, a stosunek etanolu do octanu w beczce fermentacyjnej w bioreaktorze jest w zakresie od 1:1 do 20:1 i który charakteryzuje się tym, że pantotenian wapnia podaje się do bioreaktora fermentacyjnego w ilości 0,5 do 50 μg/g suchej masy komórek bakterii i w bioreaktorze utrzymuje się szybkość wychwytu monotlenku węgla co najmniej 0,5 mmola CO/g suchej masy komórek bakterii/minutę, uzyskując w ten sposób stabilny stan produkcji etanolu z wydajnością większą niż 10 g/Ldoba. W sposobie tym uzyskuje się wydajności etanolu większe niż 10g/l/doba przez regulowanie szlaków przemian biologicznych w danych bakteriach.

Korzystnie bioreaktor fermentacyjny obejmuje reaktor wzrostu, który podaje wytworzoną brzeczkę fermentacyjną do drugiego bioreaktora, w którym wytwarzana jest większość etanolu.

Korzystnie sposób według wynalazku dodatkowo obejmuje etapy usuwania brzeczki fermentacyjnej z bioreaktora, destylacji etanolu z brzeczki oraz odzyskiwania etanolu oraz dodatkowo obejmuje etap zawracania wody zawierającej octan z etapu destylacji na powrót do bioreaktora.

Korzystnie bakterie Clostridium Ijungdahlii są wybrane ze szczepów PETC, ERI2, O-52 i C-01.

Korzystnie substrat gazowy jest wybrany z (a) monotlenku węgla, (b) monotlenku węgla i wodoru, (c) monotlenku węgla, ditlenku węgla i wodoru oraz (d) któregokolwiek ze składników (a) do (c) z azotem lub metanem.

Określony jak wyżej sposób według wynalazku dodatkowo obejmuje etap wybrany spośród następujących:

(a) zmienianie co najmniej jednego parametru wybranego z grupy obejmującej: skład pożywki, szybkość podawania pożywki, szybkość podawania wody, ciśnienie robocze, robocze pH, skład substratu gazowego, szybkość podawania gazu, szybkość mieszania brzeczki fermentacyjnej, stężenie produktu, gęstość komórek, inhibicja przez substrat oraz ich kombinacje;

(b) okresowe usuwanie komórek bakteryjnych z bioreaktora do uzyskania stężenia komórek mniejszego niż stężenie stabilne, przy którym bakterie zużywają całość gazu redukującego albo substratów odżywczych w bioreaktorze;

(c) zwiększanie szybkości podawania wody, gdy część obecnego w brzeczce fermentacyjnej octanu przypadająca na wolny kwas octowy przewyższa 2 g/l, zwiększając w ten sposób wszystkie niepożądane wzrosty stężenia wolnego kwasu octowego;

(d) zmniejszanie szybkości podawania substratu gazowego w celu zlikwidowania inhibicji przez substrat oraz utrzymania wydajności;

(e) zmniejszanie szybkości mieszania w celu zlikwidowania inhibicji przez substrat oraz utrzymania wydajności;

PL 205 622 B1 (f) dostarczanie do bioreaktora fermentacyjnego substratu gazowego z szybkością od 0,3 do 2 mmoli CO /gram suchych komórek bakteryjnych w bioreaktorze/minutę ;

(g) zwiększanie ilości CO obecnej w bioreaktorze, tak że ilość CO jest większa od ilości wymaganej do utrzymania bakterii w stabilnym stężeniu komórek bakteryjnych, przy którym zużywałyby one całość dostarczonego CO;

(h) utrzymanie CO obecnego w bioreaktorze w ilości, która utrzymuje wytwarzanie etanolu w przewadze nad wytwarzaniem octanu;

(i) podawanie do bioreaktora fermentacyjnego pożywki zawierającej dodatkowo kobalt, którego ilość w bioreaktorze jest utrzymywana w zakresie od 5 do 100 μg kobaltu/gram suchych komórek bakterii i (j) podnoszenie pH hodowli powyżej 4,5. Korzystnie przeprowadza się etap (i) i zapobiega się przystosowaniu się bakterii w bioreaktorze do ilości kobaltu przez utrzymywanie stałego stężenia kobaltu i dostosowanie parametrów wybranych z grupy obejmującej szybkość podawania gazu, szybkość podawania cieczy, szybkość mieszania, szybkość podawania pożywki i ciśnienie cząstkowe wodoru.

Korzystnie sposób również dodatkowo obejmuje etap zapobiegania przystosowaniu się bakterii w bioreaktorze fermentacyjnym do ilości pantotenianu wapnia przez dostosowanie parametrów wybranych z grupy obejmującej szybkość podawania gazu, szybkość podawania cieczy, szybkość mieszania, szybkość podawania pożywki i ciśnienie cząstkowe wodoru.

Korzystnie, w powyższym przypadku sposób dodatkowo obejmuje dostarczanie nadmiaru redukującego gazu, którym jest wodór, do bioreaktora fermentacyjnego.

Bakterie w bioreaktorze są regulowane przez zmniejszanie potencjału redoks albo zwiększanie stosunku NAD(P)H do NAD(P) w brzeczce fermentacyjnej, po uzyskaniu przez bakterie stanu ustalonego - na przykład stałego stężenia komórek w bioreaktorze. Stężenie wolnego kwasu octowego w bioreaktorze jest utrzymywane poniżej 5 g/l. Etapy wzrostu i regulowania hodowli bakteryjnej powodują, że bakterie w bioreaktorze wytwarzają etanol w brzeczce fermentacyjnej z produktywnością przewyższającą 10 g/l na dobę. Zarówno etanol jak i octany są wytwarzane w brzeczce fermentacyjnej w takiej ilości, że stosunek etanol/octan jest w zakresie od 1:1 do 20:1.

W jednym wykonaniu tego sposobu, etap regulowania obejmuje jeden albo więcej spośród etapów takich jak: zmienianie przynajmniej jednego parametru, wybranego spośród następujących: skład pożywki, szybkość podawania pożywki, szybkość podawania wody, ciśnienie robocze, robocze pH, skład substratu gazowego, szybkość podawania gazów, szybkość mieszania brzeczki fermentacyjnej, etap hamowania produktu, gęstość komórek oraz hamowanie (inhibicja) substratu.

W innym wykonaniu tego sposobu, etap regulowania obejmuje dostarczanie do bioreaktora substratu gazowego zawierającego gaz redukujący, CO, z szybkością odpowiadającą żądanej szybkości pochłaniania. Szybkość ta korzystnie jest w zakresie 0,3 do 2 mmole CO/gram suchej masy komórek bakteryjnych, w reaktorze/minutę.

W jeszcze innym wykonaniu wynalazku, przed podaniem ograniczającej ilości pantotenianu wapnia do bioreaktora wprowadza się nadmiar gazu redukującego H2.

W jeszcze innym wykonaniu sposobu według wynalazku etap regulowania fermentacji obejmuje podawanie do bioreaktora fermentacyjnego pożywki, zawierającej ograniczającą ilość kobaltu, która jest w zakresie od 5 do 100 μg kobaltu/gram suchej masy komórek bakteryjnych wytworzonych w bioreaktorze.

Według innego wykonania, sposób według wynalazku obejmuje zapobieganie przystosowaniu się bakterii w bioreaktorze do wskazanej ilości kobaltu przez utrzymywanie stałego stężenia kobaltu oraz odpowiednie dostosowanie jednego lub większej liczby parametrów, takich jak szybkość podawania gazów, szybkość podawania cieczy, szybkość mieszania i ciśnienie cząstkowe gazu H2.

Dodatkowe ewentualne etapy tych sposobów obejmują poddawanie próbki brzeczki odwirowaniu w celu usunięcia komórek oraz stosowanie chromatografii gazowej w celu monitorowania wartości stosunku i/albo wydajności produktów.

Według innego wykonania w sposobie według wynalazku podaje się w charakterze substratu gazowego pewną ilość H2 przewyższającą w niewielkim stopniu ilość stechiometryczną. Według jeszcze innego wykonania, substrat gazowy dodatkowo zawiera pewną ilość CO przewyższającą w niewielkim stopniu ilości potrzebne bakteriom, gdzie pochłanianie H2 przez bakterie jest hamowane i stosunek NAD(P)H do NAD(P) w brzeczce jest zwiększony.

Według jeszcze innego wykonania sposobu według wynalazku, wprowadza się etap, w którym inhibicja przez cząsteczkowy kwas octowy jest zmniejszana przez zwiększanie szybkości podawania

PL 205 622 B1 strumienia wodnego, kiedy zawartość cząsteczkowego kwasu octowego w brzeczce fermentacyjnej zbliża się do wartości 2 g/l lub tę wartość przekracza.

Według innego wykonania sposobu według wynalazku, etap regulowania procesu może obejmować mieszanie pożywki, bakterii i substratu gazowego w bioreaktorze przy wybranej szybkości mieszania. Na przykład, zmniejszenie szybkości mieszania zmniejsza ilość CO przenoszoną do brzeczki fermentacyjnej. To zmniejszenie szybkości przenoszenia CO powoduje wzrost konwersji H2, tak że gaz redukujący, H2, jest obecny w bioreaktorze w ilości przewyższającej wymagania wzrostowe bakterii. Podobnie, szybkość podawania gazów może być też zmniejszona w celu zmniejszenia ilości przenoszonego do brzeczki CO, w ten sposób zwiększając konwersję H2, tak że gaz redukujący, H2, jest obecny w bioreaktorze fermentacyjnym w ilości przewyższającej wymagania wzrostowe bakterii.

Według jeszcze innego wykonania sposobu według wynalazku, kulturę bakteryjną początkowo można doprowadzić do korzystnego stężenia komórek, po czym ogranicza się stężenie kobaltu albo pantotenianu wapnia w pożywce.

W innym wykonaniu sposobu wedł ug obecnego wynalazku, stosuje się dwustopniowy bioreaktor (CSTR) zawierający reaktor wzrostu, z którego brzeczka fermentacyjna jest podawana do reaktora produkcyjnego, w którym wytwarzana jest większość etanolu.

W innym wykonaniu wynalazku, powyżej opisany sposób obejmuje następujące ewentualne etapy: odzyskiwanie etanolu na drodze usuwania brzeczki fermentacyjnej z bioreaktora; destylowanie etanolu z brzeczki; oraz odzyskiwanie etanolu. Dodatkowo, albo korzystnie, próbkę brzeczki poddaje się odwirowaniu w celu usunięcia komórek; natomiast utrzymanie odpowiedniego stosunku monitoruje się z zastosowaniem chromatografii gazowej.

Według jeszcze innego wykonania, sposób według wynalazku może ponadto obejmować dodatkowy etap zawracania wody (zawierającej do 5 g/l acetylu) z produkcji etanolu na powrót do reaktora, tak że ustala się równowaga pomiędzy zawartością etanolu i acetylu w reaktorze. W rezultacie, większa ilość CO, CO2 i H2 podanych do reaktora i przekształconych w produkty daje w wyniku etanol.

Krótki opis rysunków

Fig. 1 przedstawia schemat ilustrujący ciągły sposób fermentacji z odzyskiwaniem produktu według niniejszego wynalazku. Gazowy substrat 1 i ciekłe medium pożywkowe 2 są podawane do bioreaktora 3, zawierającego odpowiednią kulturę bakteryjną. Konwersja substratu gazowego do etanolu i kwasu octowego zachodzi w bioreaktorze 3. Gazy wyczerpane 4 zawierają ce gazy inne niż CO, CO2 i H2 oraz CO, CO2 i H2, które nie uległy konwersji, z bioreaktora 3 są usuwane do atmosfery, spalane jako paliwo opałowe albo spalane w pochodni. Przy zastosowaniu zawracania komórek bakteryjnych, odciek 5 jest przesyłany do separatora komórek 6, gdzie komórki 7 i pozbawiony komórek przesącz 8 ulegają rozdzieleniu. Komórki 7 są przesyłane z powrotem do bioreaktora 3, a przesącz 8 jest przesyłany do odzysku produktu. Etanol może być odzyskiwany z przesączu 8 (albo, alternatywnie, z odcieku 5, jeśli nie stosuje się separacji komórek). Przesącz 8 rozdzielany jest na kolumnie destylacyjnej 9, co prowadzi do wytworzenia 95%-owego etanolu jako frakcji szczytowej z kolumny 10 oraz wody 11, która jest zawracana do bioreaktora 3. 95%-owy etanol ze szczytu kolumny 10 jest przesyłany do sit molekularnych 12, gdzie bezwodny etanol 13, będący żądanym produktem finalnym, jest oddzielany od rozcieńczonego etanolu 14, który przesyłany jest z powrotem do kolumny destylacyjnej 9.

Fig. 2 to schemat dwustopniowego układu reaktorów z mieszaniem ciągłym (CSTR) w celu zwiększenia stabilności kultury bakteryjnej. Do Strefy Wzrostu CSTR 1 podawane jest ciekłe medium 2. Niezużyty gaz 3 ze Strefy Produkcyjnej CSTR 4 jest podawany także do Strefy Wzrostu 1. Surówka świeżych gazów 5, strumień świeżej pożywki 6 oraz strumień kultury bakteryjnej 7 ze Strefy Wzrostu CSTR 1 są podawane do Strefy Produkcyjnej CSTR 4. Zawracacz komórek 8 jest stosowany w celu uzyskania maksymalnej produktywności komórek 9 przesłanych do Strefy Produkcyjnej CSTR 4. Komórek 9 nie zawraca się do Strefy Wzrostu CSTR. Jako ostateczny produkt destylacji wytwarzany jest ciekły produkt 10, na który składa się rozcieńczony etanol w brzeczce fermentacyjnej, który jest odzyskiwany w formie bezwodnego etanolu, jak na Fig. 1.

W sposobie według wynalazku uzyskuje się nadmiar NAD(P)H w stosunku do NAD(P). Utlenienie NADP(H) do NAD(P) powoduje, że kwas octowy wytworzony przez kulturę bakteryjną jest redukowany do etanolu. Alternatywnie, inne sposoby wytwarzania wysokich stężeń etanolu w beztlenowej fermentacji według niniejszego wynalazku obejmują zmniejszenie potencjału redoks w brzeczce fermentacyjnej i, w ten sposób, redukowanie kwasu octowego do etanolu. Sposoby według niniejszego wynalazku prowadzą do wytwarzania wysokich stężeń etanolu (to znaczy większych niż około 10 g/l, korzystnie większych niż 15 g/l) oraz niskich stężeń octanów (to znaczy mniejszych niż około 5 g/l

PL 205 622 B1 wolnego kwasu octowego w bioreaktorze). Sposoby te obejmują również utrzymanie warunków procesu na odpowiednim poziomie oraz ich kontrolę przy ciągłym wytwarzaniu etanolu i kwasu octowego, w celu uł atwienia powrotu ukł adu do stanu normalnego w przypadku zaistnienia zaburzeń procesu. Ponadto, sposoby według niniejszego wynalazku umożliwiają uniknięcie przystosowania się kultury bakteryjnej do niskiego stężenia pożywki, co mogłoby mieć szkodliwy wpływ na wydajność kultury. Obecny wynalazek dotyczy praktycznego przemysłowego sposobu wytwarzania etanolu.

O ile nie zdefiniowano inaczej, poniż ej przytoczone terminy uż ywane w niniejszym opisie mają następujące znaczenia.

Termin „sposób ciągły odnosi się do sposobu fermentacji, który obejmuje ciągłe podawanie pożywki, podawanie substratu, wytwarzanie komórek w bioreaktorze, usuwanie komórek z bioreaktora oraz usuwanie produktu. Te ciągłe podawania, usuwania albo wytwarzanie komórek mogą występować w tych samych albo w innych strumieniach. W wyniku procesu ciągłego uzyskuje się stan ustalony w obrębie bioreaktora. Przez „stan ustalony rozumie się, że każda z tych mierzalnych wartości (to znaczy szybkość podawania, stężenie substratu i pożywki utrzymywane w bioreaktorze, stężenia komórek w bioreaktorze i usuwanie komórek z bioreaktora, usuwanie produktu z bioreaktora, a także zmienne opisujące warunki, takie jak temperatury i ciśnienia) są stałe w czasie.

Termin „substraty gazowe oznacza albo tylko CO, albo CO i H2, albo CO, CO2 i H2, ewentualnie zmieszane z azotem lub metanem w stanie gazowym. Takie substraty gazowe zawierają gazy lub strumienie gazowe, które zazwyczaj są uwalniane lub usuwane do atmosfery po użyciu, albo bezpośrednio albo w wyniku spalania. W szczególnie korzystnym wykonaniu, substrat gazowy zawiera CO, CO2 i H2. Tak więc takie substraty gazowe zawierają to, co zazwyczaj oznacza „gaz syntezowy albo „syngaz, pochodzący z gazyfikacji produktów węglowych (włączając metan), jak również gazy odpadowe z rozmaitych procesów przemysłowych.

Termin „gaz redukujący oznacza CO i H2, razem albo osobno. Przez frazę „ilość gazu redukującego większa niż ta, która jest potrzebna do wzrostu bakterii rozumie się taką ilość gazu redukującego, która przewyższa ilość, którą bakterie mogą zużyć do wzrostu i metabolizmu, przy danych składnikach pożywki. Ilość taka może być uzyskana albo przez zwiększanie ilości netto gazu redukującego, albo przez zmniejszenie ilości kluczowych składników odżywczych, tak że nadmiarową ilość gazu uzyska się bez zwiększania ilości gazu, albo przez zwiększanie szybkości dostarczania gazu do bakterii. Kiedy bakterie wystawione są na działanie większej ilości gazu redukującego niż ilość konieczna do wzrostu, odpowiadają one zwiększając wytwarzanie etanolu.

„Przedmiotowe bakterie to acetogenne bakterie beztlenowe zdolne do przetwarzania CO i wody, albo H2 i CO2, do etanolu i kwasu octowego Clostridium Ijungdahlii, korzystnie wybrane spośród C. Ijungdahlii PETC, C. Ijungdahlii ERI2, C. Ijungdahlii C-01 i C. Ijungdahlii O-52.

Przez termin „mieszane szczepy rozumie się mieszaną kulturę bakteryjną dwóch lub większej liczby bakterii przedmiotowych. Takie „mieszane szczepy bakterii wyszczególnionych powyżej wykorzystywane są w sposobach według niniejszego wynalazku.

Terminy „bioreaktor, „reaktor albo „bioreaktor fermentacyjny obejmują urządzenie fermentacyjne składające się z jednego albo większej liczby naczyń i/albo wież albo układów rur, które obejmują ciągły reaktor zbiornikowy z mieszadłem (CSTR), reaktor z unieruchomionym złożem komórkowym (ICR), reaktor ze złożem zraszanym (TBR), kolumna barbotująca, fermentor mieszany gazem, mieszalnik statyczny albo inne urządzenie odpowiednie do kontaktowania gazu z cieczą. Korzystnie dla sposobu według wynalazku, bioreaktor fermentacyjny obejmuje reaktor wzrostu, który podaje brzeczkę fermentacyjną do drugiego bioreaktora fermentacyjnego, w którym wytwarzana jest większość produktu - etanolu.

Termin „pożywka stosuje się ogólnie w celu opisania konwencjonalnych pożywek wzrostu bakterii, które zawierają witaminy i minerały wystarczające do zapewnienia wzrostu wybranych przedmiotowych bakterii. Pożywki te nie zawierają cukrów. Składniki różnorodnych pożywek odpowiednich do zastosowania w sposobie według niniejszego wynalazku są znane i były opisane we wcześniejszych publikacjach, włączając w to prace obecnych autorów, patrz, na przykład, formuła pożywki opisana w mię dzynarodowym zgł oszeniu patentowym WO 98/00558; w patentach US-5807722, US-5593886 i US-5821111, jak również w publikacjach wymienionych powyż ej. Zgodnie z niniejszym wynalazkiem typowa laboratoryjna pożywka służąca do wytwarzania octanów z CO, CO2 i H2 zawiera 0,9 mg/l pantotenianu wapnia. Jednakże typowa laboratoryjna pożywka służąca do wytwarzania etanolu z CO, CO2 i H2 zawiera 0,02 mg/l pantotenianu wapnia.

PL 205 622 B1

Terminy „ograniczający substrat albo „ograniczający składnik odżywczy oznaczają substancję w pożywce albo substrat gazowy, które w czasie wzrostu kultury bakteryjnej w bioreaktorze zostają zużyte przez kulturę bakteryjną do poziomu, który nie jest już wystarczający do dalszego utrzymania stanu stałego albo stabilnego wzrostu bakterii w bioreaktorze. Tak więc wszystkie pozostałe substancje w pożywce lub w substracie gazowym są obecne w nadmiarze, czyli są „nieograniczające. Dowodem na wystąpienie jest fakt, że ograniczenia, tj. wzrost szybkości dodawania ograniczającego substratu, tj. wzrost szybkości podawania pożywki albo szybkości podawania gazu, do kultury bakteryjnej powoduje odpowiadający wzrost szybkości pochłaniania gazu (mmol gazu/min) wywołany wzrostem gęstości komórek.

O ile nie stwierdzono inaczej, termin „octan (albo „octanowy) jest stosowany w celu opisania mieszaniny cząsteczkowego czyli wolnego kwasu octowego i soli octanowych obecnych w brzeczce fermentacyjnej. Stosunek cząsteczkowego kwasu octowego do octanu zależy od pH układu, to znaczy, przy stałym stężeniu „octanu, im niższe pH tym wyższe jest stężenie cząsteczkowego kwasu octowego w stosunku do soli octanowej.

„Stężenie komórek w obecnym opisie opiera się na suchej masie bakterii w litrze próbki. Stężenie komórek jest mierzone bezpośrednio albo przez kalibrację i korelację z gęstością optyczną.

Termin „stan naturalny opisuje dowolny związek, pierwiastek albo szlak przemiany niemające dodatkowych elektronów albo protonów, które zwykle są obecne. Przeciwnie, termin „stan redukcji opisuje dowolny związek, pierwiastek albo szlak przemiany mające nadmiar jednego lub więcej elektronów. „Stan redukcji jest osiągany przez dodanie jednego lub więcej elektronów do „stanu naturalnego, to znaczy przez obniżenie potencjału redoks brzeczki fermentacyjnej.

„Produktywność etanolu jest to objętościowa produktywność etanolu obliczana jako stosunek stężenia etanolu w stanie ustalonym do czasu retencji cieczy (LRT) w układach ciągłych, albo stosunek stężenia etanolu do czasu koniecznego do wytworzenia tego stężenia w układach szarżowych (periodycznych). Fraza „wysoka produktywność etanolu oznacza objętościową produktywność etanolu większą niż 10 g/Ldoba.

Fraza „wysokie stężenie etanolu oznacza więcej niż około 10 g/l, korzystnie więcej niż 15 g/l etanolu w brzeczce fermentacyjnej albo stosunek produktów etanol/octan równy 5:1 lub więcej.

W wytwarzaniu etanolu występuje „nadmiar H2 gdy stosunek liczby moli H2 w gazie podawanym do sumy podwojonej liczby moli przetworzonego CO i potrojonej liczby moli przetworzonego CO2 jest większy od 1,0. Jeśli ten stosunek jest mniejszy od 1,0, wówczas nadmiar H2 nie występuje i etanol może być wytworzony tylko z udziałem innego mechanizmu kontrolnego.

Szlaki przemian biologicznych wykorzystane w sposobie według niniejszego wynalazku.

Nie wiążąc się żadną teorią, autorzy wynalazku uważają, że sposoby zwiększenia produkcji etanolu w fermentacji beztlenowej, przedstawione w niniejszym opisie, opierają się na szlakach przemian biologicznych obejmujących konwersję NAD(P)H do NAD(P) w podstawowych cyklach acetogennego szlaku dla wzrostu autotroficznego. Wynalazek obejmuje regulowanie tych szlaków w celu umożliwienia ciągłego wytwarzania etanolu i utrzymywania jego wysokich stężeń, przy niskich stężeniach octanu, w stabilnych warunkach roboczych. W następstwie tego uzyskuje się sposoby użyteczne w przemyśle, służące do wytwarzania etanolu z gazów przemysłowych.

Istotny udział konwersji NAD(P)H do NAD(P) w szlakach biologicznych opisuje się w sposób następujący: Wytwarzanie etanolu ze składników gazowych, takich jak CO, CO2 i H2 zachodzi w trzyetapowym sposobie biologicznym. W pierwszym etapie substraty CO i H2 ulegają utlenieniu i w ten sposób uwalniają NAD(P)H:

NAD(P) NAD(P)H CO + H₂ + H₂O CO₂ + 4H+

Produkty etapu 1 ulegają następnie przemianie do kwasu octowego.

Ten etap wymaga

NAD(P)H:

NAD(P)H NAD(P)

CO + CO₂ + 6H+ CH₃COOH + H₂O

Na koniec, jeśli istnieje nadmiar NAD(P)H, ponieważ reakcja według etapu 1 zachodzi z większą szybkością niż reakcja według etapu 2, wówczas kwas octowy ulega redukcji do etanolu.

NAD(P)H NAD(P)

CH₃COOH + 4H+ C₂H₅OH + H₂O

Tak więc nadmiar NAD(P)H (pochodzącego z utleniania substratu) prowadzi do wytwarzania etanolu z kwasu octowego.

PL 205 622 B1

Znane są dwa podstawowe cykle szlaków występujące w szlaku acetogennym: (1) cykl AcetyloCoA i (2) Cykl THF, w którym CO2 jest redukowany do grupy metylowej. Sekwencja tworzenia etanolu i kwasu octowego według powyż szej drogi została zilustrowana w: J.R. Phillips et al., 1994 Applied Biochemistry and Biotechnology, 45/46:145. Cykl Acetylo-CoA posiada cykl wewnętrzny, który określony jest tutaj jako cykl CO. Gdy cykl CO normalnie przebiega zgodnie z kierunkiem wskazówek zegara - zachodzi redukcja ferredoksyny. Ferredoksyna może też być redukowana przez H2 w czasie, gdy H2 jest utleniany przez enzym hydrogenazę. W rezultacie cykl Acetylo-CoA również przebiega w kierunku zgodnym z kierunkiem ruchu wskazówek zegara i ferredoksyna ulega utlenieniu. Jeś li wewnętrzny cykl CO i cykl Acetylo-CoA zachodzą z takimi samymi szybkościami, wówczas ferredoksyna znajduje się w stanie równowagi redoks. Jeśli jednakże te dwa cykle przemian nie zachodzą z taką samą szybkością, to znaczy, cykl CO przebiega z większą szybkością niż cykl Acetylo-CoA, wówczas następuje nagromadzenie zredukowanej ferredoksyny. Również wraz z nadmiarem H2 zredukowana ferredoksyna może być wytworzona w nadmiarze. Ta nadmiarowa ferredoksyna w formie zredukowanej powoduje, że NAD(P) jest redukowany (regenerowany) do NAD(P)H, który zaczyna występować w nadmiarze. Nadmiar NADP(H) musi zostać uwolniony z uwagi na dążenie do przywrócenia równowagi, a to następuje przez redukcję kwasu octowego do etanolu.

Cykl THF występuje w procesach wzrostu komórki i jest konieczny do utrzymania ciągłości hodowli bakteryjnej; dlatego też nie może ulec zupełnemu zatrzymaniu. Zmniejszenie szybkości cyklu THF również służy uzyskaniu większego stosunku NAD(P)H do NAD(P). NADP(H) ulega utlenieniu w dwóch miejscach. Przez ograniczenie tego utleniania, które utrzymywałoby w równowadze całkowity komórkowy stosunek NAD(P)H do NAD(P), NAD(P)H zostaje zużyty w redukcji kwasu octowego do etanolu.

Drugim podstawowym sposobem powodowania redukcji kwasu octowego do etanolu jest bezpośrednie obniżenie potencjału redoks brzeczki fermentacyjnej. Stan redukujący wystarczająco niższy od stanu naturalnego kultury bakteryjnej powoduje, że NAD(P)H występuje obficie, co ułatwia redukcję kwasu octowego do etanolu.

Podstawowe etapy sposobu według wynalazku obejmują: ciągły sposób fermentacji z odzyskiwaniem produktu, który jest opisany w odniesieniu do Fig. 1 i przedstawiony w Przykładzie 1 poniżej. Ciągły strumień gazowego substratu 1 zawierającego co najmniej jeden gaz redukujący (na przykład CO albo H2) dostarczany z wybraną szybkością podawania gazu oraz ciągły strumień ciekłej pożywki 2, dostarczany z wybraną szybkością podawania pożywki, są dostarczane do bioreaktora fermentacyjnego 3 zawierającego przedmiotowe bakterie. W bioreaktorze 3, z pożywki oraz substratów gazowych w wyniku fermentacji bakteryjnej zachodzi wytworzenie etanolu i kwasu octowego. Z chwilą uzyskania stabilnego stężenia komórek w warunkach stanu ustalonego, składniki układu ciągłego są regulowane w kierunku zmniejszenia potencjału redoks albo w kierunku zwiększenia stosunku NAD(P)H do NAD(P) w brzeczce fermentacyjnej, podczas gdy stężenie wolnego kwasu octowego w bioreaktorze jest utrzymywane na poziomie poniżej 5 g/l. Sposób według obecnego wynalazku jest zaprojektowany w celu umożliwienia i utrzymania na stałym poziomie produkcji etanolu i octanu w brzeczce fermentacyjnej, tak że produktywność etanolu przewyższa 10 g/Ldoba, przy stosunku etanolu do octanu pomiędzy 1:1 i 20:1. Według jednego wykonania, stosunek ten jest większy niż 3:1, według innego, stosunek ten jest większy niż 5:1. Według jeszcze innego wykonania, stosunek przewyższa 10:1, a nawet przewyższa 15:1. Alternatywnie, sposób według niniejszego wynalazku umożliwia zwiększenie stabilnej, ciągłej (w stanie ustalonym) produkcji wysokich stężeń etanolu (15-35 g/l) i niskich stężeń octanu (0-5 g/l), to znaczy przy stosunku etanolu do produktu octanowego 3:1 lub większym, z CO, CO2 i H2 oraz przy dobrej stabilności sposobu.

Co pewien czas, w trakcie sposobu według wynalazku, pobiera się próbki brzeczki w celu oznaczenia stosunku za pomocą konwencjonalnego sposobu oznaczania. Na przykład, z próbki wydziela się komórki (na przykład przez odwirowanie) i pozbawioną komórek próbkę następnie poddaje się oznaczeniu według sposobu, takiego jak korzystny sposób chromatografii gazowej. Jednakże istnieją inne konwencjonalne sposoby oznaczania do wyboru przez specjalistę. Ewentualne dodatkowe etapy sposobu są dodawane w celu osiągnięcia i/albo utrzymania stosunku. Przykład 2 ilustruje taki sposób oznaczania.

W celu regulowania składników układu i utrzymania i/lub osiągania żądanej produktywności etanolu i odpowiedniego stosunku etanolu do octanu, podejmowane są kroki, które obejmują przynajmniej jeden z, a korzystnie kombinację, następujących etapów: zmienianie składu pożywki, szybkości podawania pożywki, szybkości podawania strumienia wodnego, zmienianie ciśnienia roboczego, roboczego pH, składu substratu gazowego, szybkości podawania gazu, szybkości mieszania brzeczki

PL 205 622 B1 fermentacyjnej, unikanie etapu inhibicji produktu, zmniejszanie gęstości komórek w bioreaktorze albo zapobieganie inhibicji substratu. Niektóre korzystne sposoby regulowania hodowli bakteryjnej obejmują dostarczanie do bioreaktora ciekłej ograniczającej substancji odżywczej (pantotenianu lub kobaltu), niewielki nadmiar CO i H2 w gazie zasilającym, minimalizowanie stężenia octanów, unikanie przystosowania się kultury bakteryjnej do niskiego stężenia składników odżywczych w fazie ciekłej, stosunkowo szybkie dostosowanie stężenia komórek w kulturze bakteryjnej do odpowiedniego poziomu, podnoszenie wartości pH kultury bakteryjnej powyżej 4,5, upust komórek bakteryjnych z bioreaktora do uzyskania stężenia komórek poniżej stężenia stanu ustalonego, w którym wykorzystywany jest cały gaz redukujący albo składniki pożywki w bioreaktorze, a także zwiększanie podawanego strumienia wodnego, kiedy zawartość tej części octanów obecnych w bioreaktorze, która odpowiada wolnemu kwasowi octowemu, przewyższa 2 g/l, przez co zahamowuje się jakikolwiek niepożądany wzrost stężenia wolnego kwasu octowego. Wszystkie te etapy opisano ze szczegółami poniżej.

Gaz wyczerpany 4 zawierający gazy inne niż CO, CO2 i H2 oraz niezużyty CO, CO2 i H2 z reaktora, są usuwane z reaktora i znajdują zastosowanie związane z ich wartością opałową. Jeśli jako mechanizm kontrolowania stosunku etanolu do octanu stosuje się nadmiar H2, wówczas w celu określenia stopnia kontroli w tym etapie stosuje się ciśnienie cząstkowe H2 w gazach wylotowych i stosunek ciśnienia cząstkowego H2 do ciśnienia cząstkowego CO2 w gazach opuszczających reaktor. W celu zwiększenia stężenia komórek w bioreaktorze stosuje się zawracanie komórek (chociaż nie jest ono wymogiem niezbędnym) i w ten sposób dostarcza się więcej biokatalizatora konwersji CO, CO2 i H2. Przy zawracaniu komórek odciek z reaktora 5 jest przesyłany do separatora komórek 6, gdzie komórki 7 oraz przesącz (ciecz pozbawiona komórek) 8 są rozdzielane. Komórki 7 przesyłane są na powrót do bioreaktora, natomiast przesącz 8 jest przesyłany do odzyskiwania produktu.

Oddzielanie komórek jest dokonywane z zastosowaniem wirówki pracującej w trybie ciągłym, układu filtracyjnego z pustych włókien albo spiralnego układu filtracyjnego, układu filtrów ceramicznych albo innego separatora ciało stałe/ciecz. Etanol może być odzyskiwany z przesączu (albo, alternatywnie, z odcieku z reaktora 5, jeśli nie stosuje się oddzielania komórek) za pomocą różnych sposobów obejmujących destylację i adsorpcję. Przesącz 8 jest rozdzielany na kolumnie destylacyjnej z wytworzeniem 95% etanolu 10 jako frakcji szczytowej z kolumny oraz wody 11, którą zawraca się na powrót do reaktora 3. Zawracana woda 11 zawiera nadmiarowe składniki odżywcze niezużyte w fermentacji, ale wszelkie nadmiarowe witaminy pochodzące z fermentacji albo produkty rozpadu komórek ulegają zniszczeniu w trakcie destylacji termicznej. 95% etanol ze szczytu kolumny 10 jest przesyłany do sit molekularnych 12, gdzie bezwodny etanol 13, będący żądanym produktem finalnym, jest oddzielany od rozcieńczonego etanolu 14, który jest przesyłany na powrót do kolumny destylacyjnej 9.

Ciągła kombinacja wzrostu, obumierania i usuwania komórek utrzymuje stałe stężenie komórek, tak, że ciągły sposób stosowany do wytwarzania etanolu (i małych ilości kwasu octowego) może pracować przez wiele miesięcy przy zasilaniu CO, CO2 i H2 oraz składnikami odżywczymi, bez dodatkowego uzupełniania kultury bakteryjnej. Sposób według obecnego wynalazku utrzymuje na stałym poziomie i kontroluje warunki do ciągłego wytwarzania etanolu i kwasu octowego oraz zapobiega zaburzeniom w przebiegu sposobu według wynalazku albo szybko je koryguje. Sposób według obecnego wynalazku również pomaga w zapobieganiu przystosowaniu się kultury do niskiego stężenia składników odżywczych, które może mieć szkodliwy wpływ na funkcjonowanie kultury bakteryjnej. W poniższym opisie oraz w przykładach, o ile nie stwierdzono inaczej, stosowane jest ciśnienie 1 atmosfery i stosowana jest temperatura w zakresie 36-41°C. Korzystne wartości temperatury i ciśnienia mogą być wyznaczone przez specjalistę, w zależności od mikroorganizmu wybranego do zastosowania w bioreaktorze.

Rozmaite sposoby regulowania procesu opisane szczegółowo poniżej, wraz z podstawowymi sposobami według obecnego wynalazku umożliwiają zwiększone wytwarzanie etanolu. Korzystnie, ograniczanie za pomocą składników odżywczych w fazie ciekłej (pantotenian albo kobalt), albo zastosowanie nadmiaru H2 albo CO, są podstawowymi sposobami według wynalazku opisanymi szczegółowo poniżej, stosowanymi do osiągania i utrzymania na odpowiednim poziomie żądanej produktywności etanolu oraz umożliwiającym wytwarzanie stabilnych stężeń i stosunków etanolu do octanów w brzeczce fermentacyjnej. Warunki te umożliwiają wytwarzanie stałych stężeń etanolu i octanów w brzeczce fermentacyjnej. W korzystnym wykonaniu, stosunek etanolu do produktu octanowego w brzeczce fermentacyjnej jest większy niż 10:1, a stężenie etanolu jest wyższe niż 15 g/l.

PL 205 622 B1

A. Ograniczanie pantotenianem wapnia

Według jednego szczegółowego wykonania obecnego wynalazku, sposób regulowania szlaków biologicznych w kierunku sprzyjającym wytwarzaniu etanolu i ograniczeniu wytwarzania kwasu octowego obejmuje ograniczenie ilości pantotenianu wapnia w pożywce do ilości mniejszej niż wymagana do utrzymania bakterii w stabilnym, ustalonym stężeniu, przy którym bakterie całkowicie zużywałyby dostarczony pantotenian wapnia. Pantotenian jest składnikiem Acetylo-CoA i dlatego przez ograniczanie ilości pantotenianu wapnia w pożywce szybkość przemian w cyklu Acetylo-CoA zostaje zmniejszona w porównaniu z szybkością przemian w cyklu CO. Powoduje to wzrost ilości zredukowanej ferredoksyny i redukcję NAD(P) do NAD(P)H, a zatem zwiększane jest wytwarzanie etanolu jako produktu końcowego.

Ograniczenie pantotenianowe obserwuje się, gdy ilość mikrogramów ^g) pantotenianu wapnia podawanych do reaktora na gram (g) komórek (w suchej masie) wytworzonych w reaktorze jest w zakresie od 0,5 do 50 μg pantotenianu wapnia na gram (g) komórek wytworzonych w reaktorze. Inne wykonanie tego ograniczenia ma miejsce przy około 1-25 μg pantotenianu wapnia na gram (g) komórek wytworzonych w reaktorze. Jeszcze inne wykonanie tego ograniczenia ma miejsce przy około 10-30 μg pantotenianu wapnia na gram (g) komórek wytworzonych w reaktorze. Taka ilość tego składnika odżywczego utrzymuje wytwarzanie etanolu w przewadze w stosunku do wytwarzania octanów. Jedno wykonanie tego sposobu jest zilustrowane w Przykładzie 4.

W innym wykonaniu obecnego sposobu unika się przystosowania się bakterii w bioreaktorze fermentacyjnym do niskiego ograniczającego stężenia pantotenianu wapnia na drodze regulowania (albo ustawiania) parametrów fermentacji w taki sposób, aby utrzymane było stałe stężenie pantotenianu wapnia, podczas gdy odpowiednio reguluje się przynajmniej jeden, a czasem więcej niż jeden, parametr spośród szybkości podawania gazu, szybkości podawania cieczy, szybkości mieszania albo cząstkowego ciśnienia H2. Unika się zasadniczych zmian w składnikach odżywczych, lecz utrzymuje się stosunkowo stałe stężenie podawanego składnika odżywczego. Jeśli zezwala się na przystosowanie się kultury do niskiego stężenia ograniczających składników w fazie ciekłej, wówczas występują niekorzystne stosunki produktów - 1,0 g etanolu/g octanu lub mniej, w sposób nieodwracalny. Wtedy konieczne jest przerwanie pracy reaktora i ponowne jego zaszczepienie. Korzystnie, szlak biologiczny jest kontrolowany w taki sposób, że preferowane jest wytwarzanie etanolu i ograniczane jest wytwarzanie kwasu octowego, najpierw przez dostarczenie nadmiaru H2 w gazie zasilającym bioreaktor, a następnie przez ograniczenie pantotenianu wapnia w pożywce, jak to opisano powyżej.

Faktycznie, w początkowym okresie pracy bioreaktora normalnie ograniczający składnik pożywki ciekłej, jakim jest pantotenian wapnia, utrzymywany jest w nadmiarze, w celu uniknięcia przystosowania się bakterii do niskich stężeń pożywki, co mogłoby w rezultacie dać bardzo słabe funkcjonowanie kultury i zanik jej zdolności do osiągania wysokiej produktywności etanolu, większej niż 10 g/Ldoba, jeśli dodatkowo nie zastosuje się nadmiaru H2. Przykład takiego regulowania parametrów fermentacji dla określonej kultury bakteryjnej zilustrowano w Przykładzie 17.

B. Ograniczanie kobaltem

Według innego wykonania obecnego wynalazku sposób regulowania szlaków biologicznych w kierunku uprzywilejowania wytwarzania etanolu i ograniczenia wytwarzania kwasu octowego obejmuje ograniczanie ilości kobaltu w pożywce do ilości, która jest mniejsza niż ilość wymagana do utrzymania bakterii w stabilnym stężeniu stanu ustalonego, przy którym to stężeniu dostarczany kobalt jest całkowicie wykorzystywany. Ograniczanie kobaltem obserwuje się, gdy liczba mikrogramów ^g) kobaltu podawanego do reaktora na gram (g) komórek (w suchej masie) wytworzonych w reaktorze jest w zakresie od 5 do 100. Korzystnie, ograniczanie kobaltu obejmuje dostarczanie do reaktora pomiędzy około 20 do 50 μg kobaltu na gram komórek wytworzonych w reaktorze. Taka ilość kobaltu zapewnia utrzymanie przewagi wytwarzania etanolu nad wytwarzaniem octanów. Przykład 18 ilustruje wykonanie sposobu polegające na ograniczaniu kobaltu w reaktorze według tego sposobu.

Ograniczanie kobaltu w brzeczce fermentacyjnej może również zmniejszać szybkość przemian w cyklu Acetylo-CoA. Ponieważ kobalt uczestniczy w przeniesieniu grupy metylowej z cyklu THF do cyklu Acetylo-CoA, ograniczanie ilości kobaltu w brzeczce fermentacyjnej ogranicza też cykl THF poprzez uniemożliwianie takiego transferu. Ograniczenie kobaltu zmniejsza szybkość przemian w cyklu THF, co również pociąga za sobą zwiększenie stosunku NAD(P)H do NAD(P) i w ten sposób prowadzi do wytwarzania etanolu.

Sposób ten jest ponadto regulowany przez zapobieganie przystosowaniu się do niskich, ograniczających stężeń kobaltu. W znacznym stopniu podobnie jak przy unikaniu przystosowania do niskiePL 205 622 B1 go stężenia pantotenianu - utrzymuje się stałe stężenie kobaltu w czasie, podczas gdy na odpowiednim poziomie ustalane są jeden albo więcej spośród parametrów fermentacji (szybkość podawania gazu, szybkość podawania cieczy, szybkość mieszania, zawartość CO2 i cząstkowe ciśnienie H2). Unika się zasadniczych zmian w składnikach odżywczych, natomiast utrzymuje się na stosunkowo stałym poziomie stężenie w podawanej pożywce. Przykład takiego regulowania parametrów fermentacji dla określonej kultury bakteryjnej zilustrowano w Przykładzie 19.

Korzystnie, szlak biologiczny jest kontrolowany w taki sposób, że preferowane jest wytwarzanie etanolu i ograniczane jest wytwarzanie kwasu octowego - na drodze najpierw dostarczenia nadmiaru H2 do reaktora, a następnie przez ograniczenie kobaltu w pożywce, jak to opisano powyżej. W początkowym okresie pracy bioreaktora - ograniczający składnik pożywki ciekłej jakim jest kobalt - utrzymywany jest w nadmiarze, w celu uniknięcia przystosowania się bakterii do niskich stężeń pożywki, co mogłoby w rezultacie dać bardzo słabe funkcjonowanie kultury i zanik jej zdolności do wytwarzania stosunku produktów większego niż 1:1.

C. Dostarczanie H2 w nadmiarze

W jeszcze innym wykonaniu, sposób regulowania szlaków biologicznych w celu uprzywilejowania wytwarzania etanolu i ograniczenia wytwarzania kwasu octowego obejmuje podawanie nadmiaru H2 w gazie zasilającym albo ograniczanie składników gazowych zawierających węgiel, co powoduje nadmiar H2, który jest następnie wykorzystany przez szlak biologiczny. Korzystnie, gaz redukujący, H2, występuje w nadmiarze w stosunku do CO i ten nadmiar H2 powoduje, że bakterie wytwarzają wysoki stosunek etanolu do octanów w brzeczce fermentacyjnej. Jeśli stosunek H2 (wyrażonego w molach, w zasilają cym strumieniu gazu) do sumy podwojonej ilości zuż ytego CO (w molach w gazie) i potrojonej ilości zużytego CO2 (w molach w gazie) jest większy od 1, fermentor jest ograniczany przez węgiel. Korzystnie, ciśnienie cząstkowe H2 w gazie wylotowym jest korzystnie większe od 40,5 kPa (0,4 atm). Na koniec, stosunek ciśnienia cząstkowego H2 do ciśnienia cząstkowego CO2 musi być większy od 3,0 aby zapewnić, wystarczającą ilość H2 dla zużycia całości CO2. Jeśli cząstkowe ciśnienie CO2 jest większe od 10,1 kPa (0,1 atm), wówczas prawdopodobnie wzrost kultury został w pewien sposób ograniczony. Zobacz Przykład 20 ilustrujący ten sposób według wynalazku.

W począ tkowym okresie pracy bioreaktora - zastosowanie nadmiaru H2 jest bardziej korzystne niż ograniczanie pożywki, głównie z uwagi na to, że jest łatwiejsze do kontrolowania. Korzyścią wynikającą z zastosowania nadmiaru H2 jest uniknięcie wytwarzania kwasu octowego w nadmiarze, co mogłoby prowadzić do niskich stosunków produktu i potencjalnej inhibicji kwasem octowym, jak też i do przystosowania się bakterii do niskiego stężenia skł adników odż ywczych.

D. Dostarczanie monotlenku węgla w nadmiarze

Inny sposób manipulowania składnikami w sposobie według wynalazku obejmuje dostarczanie gazu redukującego, CO, w nadmiarze w substracie gazowym stosowanym w szlaku, co służy do bezpośredniego obniżenia potencjału redoks w brzeczce fermentacyjnej. Tak więc, według tego wykonania, do bioreaktora dostarczany jest gazowy substrat zawierający CO, gdzie ilość CO obecna w bioreaktorze jest większa niż ilość wymagana do utrzymania bakterii w stabilnym stężeniu w stanie ustalonym, w którym następowałoby całkowite zużycie dostarczonego CO. Dostarczanie nadmiaru CO jest sposobem uprzywilejowania wytwarzania etanolu względem wytwarzania kwasu octowego, gdy szybkość właściwa pochłaniania CO (wyrażona w milimolach CO na gram suchej masy komórek w reaktorze na minutę - albo mmol/g komórekminuta) jest większa od 0,3. Bardziej korzystnie, etap ten obejmuje szybkość właściwą pochłaniania CO większą niż 0,5. Oznacza to, że każda komórka średnio zużywa CO w swoim metabolizmie z szybkością co najmniej 0,3 mmola/gmn., albo, bardziej korzystnie, z szybkością co najmniej 0,5 mmola/gmn. Korzystnie, CO jest dostarczany z szybkością, przy której pochłanianie CO wynosi od 0,3 do 2 mmoli CO/gram suchej masy bakterii/ minutę. W innym wykonaniu CO jest dostarczany z szybkością od 0,5 do 1,5 mmola CO/gram suchej masy bakterii/minutę. W innym wykonaniu CO jest dostarczany z szybkością około 1 mmol CO/gram suchej masy bakterii/minutę. Przykład 24 ilustruje jedno wykonanie tego etapu sposobu według wynalazku.

Taka szybkość pochłaniania CO utrzymuje uprzywilejowane wytwarzanie etanolu względem wytwarzania octanów. Jeśli CO jest dostarczany na tyle szybko, że w brzeczce fermentacyjnej rozpuszczone są znaczące ilości CO z uwagi na ciśnienie gazu albo bardzo dobre przenikanie masy, wówczas brzeczka staje się bardziej zredukowana. Dostarczanie nadmiaru CO pociąga za sobą dwie dodatkowe korzyści: nadmiar CO może powodować szybsze zachodzenie cyklu przemian CO i, jeśli cykl Acetylo-CoA jest ograniczany w inny sposób i nie nadąża za cyklem CO, wówczas następuje gromadzenie się zredukowanej ferredoksyny. Tlenek węgla CO może też spowalniać etap 2 (wytwarzanie

PL 205 622 B1 kwasu octowego jako produktu pośredniego) w ogólnym trzyetapowym sposobie według wynalazku, na drodze inhibicji substratu. Ta zmniejszona szybkość etapu 2 w porównaniu z etapem 1 powoduje nadmiar NAD(P)H, co prowadzi do uprzywilejowania wytwarzania etanolu względem kwasu octowego.

Chociaż nadmiar CO może powodować zwiększenie wytwarzania etanolu przez bezpośrednie obniżanie potencjału redoks brzeczki fermentacyjnej, obecność nadmiaru CO także hamuje wzrost kultury poprzez inhibicję dehydrogenazy CO i, w ten sposób, hamuje pochłanianie H2. Obecność nadmiaru CO, niestety, daje też w wyniku słabą przemianę H2, co może nie być ekonomicznie korzystne. Konsekwencją długotrwałego działania w warunkach inhibicji substratem jest słabe pochłanianie H2. Powoduje to w rezultacie lizę komórek i konieczność ponownego uruchamiania reaktora. W przypadku, gdy ten sposób daje niezamierzoną inhibicję substratem tlenkiem węgla CO (obecność zbyt dużej ilości CO dla komórek w reaktorze) przy początkowym wzroście kultury lub później, wówczas szybkość podawania gazu i/albo szybkość mieszania są zmniejszane do momentu ustąpienia inhibicji substratu. Ilustrację jak dopasować szybkość podawania gazu oraz szybkość mieszania w celu uzyskania tego efektu przedstawiono w Przykładzie 21.

E. Dodatkowe etapy regulacyjne

Oprócz głównych sposobów zwiększania efektywności sposobu według wynalazku opisanych powyżej, sposób wytwarzania etanolu korzystnie obejmuje kilka innych sposobów.

1. Zwiększanie transferu masy

Jedno takie dodatkowe wykonanie dotyczy sposobu uzyskania transferu masy CO i H2 (z gazów zasilających do ciekłej brzeczki fermentacyjnej) szybszego niż zdolność bakterii do zużywania rozpuszczonego gazu. Na przykład, jeśli do bioreaktora zawierającego C. Ijungdahlii podawane są CO, CO2 i H2 i reaktor pracuje bez ograniczania składnikami odżywczymi (takimi jak pantotenian albo kobalt) albo obecnością nadmiaru H2, wówczas wzrost komórek jest ograniczany ilością gazu przeniesionego do fazy ciekłej i układ wytwarza kwas octowy jako produkt. Jeśli do kultury bakteryjnej podaje się niewielki nadmiar CO albo H2 w porównaniu z ilością wymaganą do wzrostu kultury, wówczas kultura bakteryjna wytwarza etanol. Jednakże, jeśli zbyt wiele gazu jest przenoszone do fazy ciekłej do zużywania przez bakterie, następuje inhibicja substratem, która może prowadzić do zaburzenia hodowli i obumarcia komórek. Tak więc istnieje bardzo wąski zakres działania przy nadmiarowym transferze masy. Przykład 22 służy jako ilustracja tego sposobu.

W odniesieniu do cyklu Acetylo-CoA należy stwierdzić, że aby wytworzony został nadmiar zredukowanej ferredoksyny, cykl przemian CO albo redukcja ferredoksyny przez hydrogenazę muszą zachodzić szybciej niż cykl Acetyl-CoA. Sposoby tu opisane limitują szybkość, z którą organizmy mogą spożytkować rozpuszczone gazy albo przez ograniczanie szybkości, z którą podstawowe składniki odżywcze, na przykład, pantotenian wapnia albo kobalt, albo inne substraty, takie jak gazowy CO2, są dostępne dla bakterii, albo też przez dostarczanie nadmiaru substratu (H2 albo CO) do kultury bakteryjnej.

Możliwe jest obliczenie teoretycznej szybkości transferu masy, która byłaby większa od szybkości zużywania substratu przez bakterie, nawet przy braku dodatkowych ograniczeń. Taka szybkość, gdy zostanie osiągnięta, będzie ograniczana przez naturalną szybkość wzrostu organizmu. Dlatego najbardziej wydajny wariant ma miejsce, gdy transfer masy (szybkość przepływu gazu albo szybkość mieszania) zachodzi z szybkością większą niż szybkość z jaką największe możliwe stężenie komórek może zużywać substrat bez żadnych ograniczeń. Będzie więc istniał bardzo wąski zakres operacyjny, ponieważ inhibicja substratem może szybko spowodować obumarcie komórek i powstawanie stężenia produktu ubocznego toksycznego dla hodowli.

2. Dostarczanie nadmiaru CO i H2

W innym wykonaniu sposobu według wynalazku stabilność w wytwarzaniu wysokich stężeń etanolu przy ograniczonym wytwarzaniu kwasu octowego osiąga się według sposobów, które ograniczają kobalt albo pantotenian wapnia, albo dostarczają dużych ilości H2 albo CO. Według takich sposobów, wraz z zużywaniem przez kulturę bakteryjną gazowych substratów CO, H2 i CO2 jako źródeł węgla i energii, CO i H2 dostarczane są w niewielkim nadmiarze. Niewielki nadmiar CO i H2 uzyskuje się przez osiąganie ustalonych parametrów roboczych i następnie stopniowe zwiększanie szybkości podawania gazu i/albo szybkości mieszania (w inkrementach mniejszych lub równych 10%) do momentu, gdy przemiana CO i H2 zacznie zmniejszać się. Jest to sposób uniknięcia ograniczenia transferu masy, które sprzyja wytwarzaniu kwasu octowego, oraz dostarczania nadmiaru zredukowanej ferredoksyny w celu redukowania NAD(P) do NAD(P)H i wytwarzania etanolu. Jeśli CO i H2 nie są dostarczone w niewielkim nadmiarze - następuje ograniczenie transferu masy i szlak przemian jest w równowadze. Daje to w wyniku niski stosunek etanolu do produktu octanowego (przy wysokich stęPL 205 622 B1 żeniach octanu). Wysokie stężenia octanu mogą ostatecznie doprowadzić do inhibicji kwasem octowym, która ogranicza zdolność bakterii do pochłaniania H2 i może w końcu prowadzić do zniszczenia hodowli bakteryjnej.

Sposoby unikania ograniczenia transferu masy obejmują zwiększanie szybkości mieszania, albo szybkości przepływu gazu, w celu transferu większej ilości CO i H2 do fazy ciekłej, aby w ten sposób odzyskać niewielki nadmiar CO i H2. Jeśli w wyniku ograniczenia transferu masy występuje inhibicja produktem, konieczne jest zwiększenie szybkości podawania cieczy, aby wyeliminować inhibicję kwasem octowym poprzez rozcieńczenie do niższego stężenia octanu. Ponieważ zwiększanie szybkości podawania pożywki zwiększyłoby liczbę μg pantotenianu albo kobaltu/g wytworzonych komórek, musi to być zrobione tylko na krótko albo nadmiarowy pantotenian albo kobalt muszą być usuwane przez odpowiednie dobranie ich stężenia w pożywce albo przez zwiększanie szybkości podawania wody.

3. Kontrolowanie inhibicji kwasem octowym

Gdy w sposobach opisanych powyżej inhibicja produktowa kwasem octowym może występować, gdy zbyt wiele cząsteczkowego kwasu octowego, to znaczy ponad 2 g/l nagromadzi się w bioreaktorze, aby możliwy był wzrost komórek i dalsza produkcja etanolu. Stosuje się wtedy inny sposób regulacji w celu uniknięcia zniszczenia kultury bakteryjnej. Jedna modyfikacja obejmuje zwiększanie, na krótki czas, szybkości podawania cieczy lub wody, w celu zmniejszenia stężenia inhibitora kwasu octowego, w fazie ciekłej do poniżej 2 g/l. Ilustrację tego sposobu dla określonej kultury bakteryjnej w reaktorze przedstawiono w Przykładzie 23.

4. Etap zawracania wody

Jeszcze inny ewentualny sposób utrzymania stabilnej kultury bakteryjnej, która wytwarza etanol jako jedyny produkt, bez wytwarzania kwasu octowego netto według bilansu, w sposobie według niniejszego wynalazku obejmuje dodawanie zawracanego strumienia wody z destylacji na powrót do reaktora fermentacyjnego (zobacz np. Przykład 15). Jak to zauważono wcześniej, zawracany strumień wody (zawierającej do 5 g/l octanu) korzystnie oznacza zawracanie wytworzonego octanu na powrót do reaktora, przez co w ostatecznym bilansie nie następuje wytwarzanie netto kwasu octowego. W ten sposób wytworzona zostaje równowaga pomiędzy etanolem i octanem w reaktorze. W rezultacie całość CO, CO2 i H2 dostarczonych do reaktora i przekształconych w produkty daje w wyniku wytwarzanie etanolu, z wyjątkiem tej części, która zostaje użyta do utrzymania hodowli bakteryjnej.

5. Zmniejszanie gęstości komórek

Jeszcze innym sposobem regulowania, mającym zastosowanie w sposobie według wynalazku, jest inicjowanie periodycznego albo ciągłego upustu komórek z bioreaktora w celu zmniejszenia stężenia komórek w bioreaktorze. Taka regulacja ma na celu zmniejszanie stężenia komórek do wartości mniejszej niż stabilne stężenie komórek w stanie ustalonym, przy którym komórki zużywają całość gazu redukującego albo substratów odżywczych w bioreaktorze. Dzięki temu, poprzez zmienianie gęstości komórek, wytwarzanie etanolu staje się uprzywilejowane w porównaniu z wytwarzaniem octanów w bioreaktorze - zobacz Przykład 25.

6. Dwustopniowy ciągły reaktor zbiornikowy z mieszadłem (dwustopniowy CSTR)

Jednym z problemów związanych z wytwarzaniem etanolu z ograniczaniem pożywką jest zdolność albo tendencja kultury do ostatecznej adaptacji do warunków ograniczających i niekontynuowanie wytwarzania etanolu po kilku miesiącach działania. Wówczas octany stają się dominującym produktem. To przystosowanie do niskiego stężenia ograniczających składników pożywki daje w wyniku kulturę bakteryjną, która wytwarza więcej kwasu octowego niż etanolu (stosunek etanolu do produktu octanowego równy 1,0 lub mniej) oraz daje niskie stężenia etanolu (czasami tak niskie jak 1 g/l). Adaptacja najprawdopodobniej występuje, gdy do kultury nie dostarcza się wystarczającej ilości składników odżywczych w czasie rozruchu, kiedy to szybkość wzrostu jest ważniejsza niż szybkość wytwarzania etanolu. Dodatkowo istnieje niebezpieczeństwo, że kultura może zostać przystosowana do niskich stężeń ograniczających składników pożywki w czasie pracy w stanie ustalonym, zwłaszcza kiedy stężenia ograniczających składników pożywki są zmniejszane w celu pozbycia się z układu octanów.

W celu uniknięcia takiej adaptacji podczas stosowania powyżej przedstawionych etapów ograniczania pantotenianem albo kobaltem, zamiast zezwalać na wzrost kultury z dostępnymi składnikami odżywczymi, co pociąga za sobą wspomniane wyżej niebezpieczeństwo, może zostać zastosowany inny wariant sposobu według wynalazku. Innym wariantem sposobu jest dwustopniowy układ CSTR, w którym znaczny wzrost kultury bakteryjnej zachodzi głównie w obrębie pierwszego stopnia na niewielkim nadmiarze ograniczających składników pożywki (możliwe jest wytwarzanie kwasu octowego), po którym znajduje się stopień produkcyjny, gdzie kultura bakteryjna pochodząca z pierwszego stop14

PL 205 622 B1 nia jest tutaj ograniczana ograniczającym składnikiem odżywczym i jest stosowana do wytwarzania wysokich stężeń etanolu. Ta modyfikacja umożliwia utrzymywanie stabilnej kultury, która nie ulega przystosowaniu do zmniejszonych stężeń pantotenianu albo kobaltu. Ta modyfikacja obejmuje utrzymanie działania dwustopniowego CSTR, w którym reaktor wzrostu (Stopień 1) służy do zasilania reaktora produkcyjnego (Stopień 2) gdzie ma miejsce większość produkcji etanolu. Reaktor wzrostu nie pracuje z etapami ograniczania składnikami odżywczymi opisanymi wyżej, więc kultura bakteryjna nie jest tak wrażliwa na przystosowanie się do warunków ograniczających.

Schematyczny diagram takiego dwustopniowego układu CSTR pokazano na Fig. 2 i następujący opis odnosi się do tego rysunku. Według tego wykonania Stopień Wzrostu pracuje przy czasie retencji cieczy (LRT) około 24 godzin. Do Stopnia Wzrostu CSTR 1 podaje się wystarczającą ilość pantotenianu albo kobaltu w pożywce 2, aby uzyskać zdrową kulturę (w Stopniu 1 może też zostać wytworzona pewna ilość kwasu octowego). Tak więc nadmiarowy kwas octowy zostaje wytworzony w reaktorze, ale towarzyszy temu zwiększona trwałość. Takie stężenie pantotenianu albo kobaltu przewyższa wartości normalnie podawane do pojedynczego CSTR stosowanego przy produkcji etanolu. Strumieniem gazowym zasilającym ten reaktor jest nieprzereagowany gaz 3 ze Stopnia Produkcyjnego 4, a zasilającym strumieniem ciekłym jest świeża pożywka 2. Stopień Wzrostu CSTR pracuje bez zawracania komórek. Celem Stopnia Wzrostu jest dostarczanie zdrowej kultury bakteryjnej do późniejszego wytwarzania etanolu, która nie ulega przystosowaniu do małych stężeń pantotenianu.

Reaktor Stopnia Produkcyjnego 4 pracuje przy nominalnym LRT równym poniżej 20 godzin. Do tego CSTR z zawracaniem komórek podaje się strumień zasilający świeżym gazem 5 i może tu wystąpić mały stopień przemiany (niska konwersja). Dostarczana jest tu także świeża pożywka 6, jak też strumień z kulturą bakteryjną 7 ze Stopnia Wzrostu. Do tego reaktora 4 podawana jest tylko minimalna ilość pantotenianu albo kobaltu, ponieważ dostępny jest nadmiar ze Stopnia Wzrostu. Strumień zawracania komórek 8 jest stosowany w tym reaktorze w celu uzyskania maksymalnej wydajności z komórek przesyłanych na powrót do reaktora 9. Wyjściowe stężenie etanolu w produkcie ciekłym 10 powinno być większe niż 20 g/l. Do cech dwustopniowego układu CSTR należy mały zakres zmian wywołanych przez przystosowanie do niskich stężeń pantotenianu albo kobaltu; całkowity LRT mniejszy lub równy 30 godzin; oczekiwana większa produktywność etanolu i wyższe stężenie etanolu niż z pojedynczego CSTR tej samej wielkości.

7. Modyfikacje stosowane w czasie rozruchu

Jeszcze inne korzystne sposoby stosowane w praktyce według niniejszego wynalazku obejmują wytwarzanie komórek w początkowym rozruchu bakteryjnej kultury fermentacyjnej. Rozruch bioreaktora zasilanego CO, CO2 i H2 w celu wytwarzania etanolu i kwasu octowego wykonuje się przez zaszczepienie szarży z kultury macierzystej (Przykład 11) albo przez zastosowanie jako zasilania kultury bakteryjnej ciągłego inokulum z istniejącego reaktora (Przykład 12). Jak zauważono wcześniej w dyskusji dotyczącej unikania przystosowania się kultury bakteryjnej do niskich stężeń pantotenianu albo kobalt, jest najbardziej pożądane, aby kultura była doprowadzona do wysokiego stężenia komórek przed ograniczaniem składnikami odżywczymi, z równoczesnym dostarczaniem nadmiaru H2 do kultury. Taki szybki rozruch pozwala uniknąć przystosowania się kultury i prowadzi do dobrych stosunków produktów (wysokie stężenia etanolu i niskie octanu). Jeśli szybki rozruch nie jest zastosowany, mogą wystąpić niskie stosunki produktów i kultura może przystosować się do niskiego stężenia składników odżywczych w fazie ciekłej oraz może być wymagane ponowne zaszczepienie reaktora.

Pracę reaktora rozpoczyna się od szarży fazy ciekłej (ciekła pożywka początkowo nie jest podawana w sposób ciągły do reaktora), przy niskich szybkościach mieszania (około 400-600 obrotów/min., w bioreaktorze laboratoryjnym New Brunswick Scientific Bioflo^®) oraz przy żądanym pH. Faza ciekła w reaktorze zawiera więc szarżę pożywki, zawierającą witaminy i sole, o nominalnym stężeniu ograniczającego składnika odżywczego, to jest albo pantotenianu wapnia albo kobaltu (przykładowo 20 μg/l pantotenianu albo 75 ppb kobaltu). Jeśli stosowana jest ciągła zaszczepka z istniejącego reaktora, prawdopodobnie periodyczna praca z szarżą fazy ciekłej nie jest potrzebna. W takim przypadku w trakcie rozruchu gaz podaje się powoli, w sposób ciągły. W przypadku idealnym, faza gazowa w czasie rozruchu powinna być wolna od CO2 i bogata w H2, natomiast szybkość podawania gazu oraz szybkość mieszania powinny być utrzymane na niskim poziomie aby uniknąć inhibicji tlenkiem węgla CO.

Przykładowa ogólna procedura rozruchowa do wytwarzania i utrzymania odpowiednich do wytwarzania na skalę przemysłową stężeń etanolu z CO, CO2 i H2 obejmuje trzy odrębne fazy: (a) początkowy rozruch, kiedy wytwarzanie komórek ma krytyczne znaczenie; (b) rozruch, kiedy szybkość

PL 205 622 B1 wytwarzania staje się krytyczna; i (c) praca w stanie ustalonym. Zasadniczo, początkowy rozruch charakteryzuje się zaszczepieniem szarży cieczy, zawierającej nominalną ilość ograniczającego składnika odżywczego, którym jest kobalt (75 ppb) albo pantotenian wapnia (20 μg/l), przy pożądanym pH (typowo 4,5-5,5). Aby ułatwić rozruch, szybkość podawania gazu i szybkość mieszania korzystnie są utrzymywane na niskim poziomie, natomiast H2 jest podawany w nadmiarze. Powodem wytwarzania etanolu w trakcie rozruchu jest nadmiar H2; ograniczanie składnikami odżywczymi występuje później. Tak więc nadmiarowe składniki odżywcze w fazie ciekłej są faktycznie obecne w trakcie rozruchu, aby uniknąć niepożądanego przystosowania kultury do niskich stężeń pożywki. W miarę jak fermentacja postępuje w ciągu kilku do kilkunastu godzin po zaszczepieniu, wytwarzany jest CO2 i zużywany H2. Obserwowane zmiany w zależności od szybkości mieszania wykazały, że szybkość mieszania powinna być nominalnie powoli zwiększana (może to być o 200-300 obrotów/min. w reaktorze laboratoryjnym, w ciągu 2-3 dni) aby uniknąć ograniczeń transferu masy.

Ten początek produkcji CO2 następuje znacznie szybciej w układach, w których zastosowano zaszczepianie ciągłe, a nie zaszczepianie periodycznej szarży z kultury macierzystej. Jednak jeśli szybkość mieszania zwiększana jest zbyt szybko, wówczas następuje inhibicja substratem CO. Procedura obejmująca obserwowanie konwersji H2 (albo obserwowanie wytwarzania CO2), przy jednoczesnym nominalnym zwiększaniu szybkości mieszania, stosunkowo szybko prowadzi do uzyskania docelowej szybkości mieszania. Wytwarzanie komórek, a nie tworzenie produktu, jest zdecydowanie najważniejsze podczas takiego zwiększania szybkości mieszania ciekłej periodycznej szarży z kulturą bakteryjną.

Po uzyskaniu docelowej szybkości mieszania (800-1000 obrotów/min. w laboratoryjnym reaktorze New Brunswick Scientific Bioflo^®) doprowadza się do ustalenia działania kultury do momentu potwierdzenia zużywania H2. Rozruch przechodzi w fazę, w której szybkość wytwarzania staje się ważna. Korzystne jest uzyskiwanie konwersji CO przekraczających 80% i wysokich cząstkowych ciśnień H2 w gazie wylotowym (co najmniej 55,7 kPa (0,55 atm)), aby zapewnić wytwarzanie etanolu z jednoczesnym ograniczaniem octanów i stężenia wolnego kwasu octowego. Następnie rozpoczyna się podawanie ciekłej pożywki (w przypadku układów z zaszczepianiem periodycznej szarży z kultury macierzystej) w celu zainicjowania ciągłego przepływu cieczy, a szybkość podawania gazu zostaje zwiększana w inkrementach 10%-owych, aż do osiągnięcia docelowej szybkości przepływu. H2 pozostaje w nadmiarze w celu uniknięcia nadmiernego wytwarzania kwasu octowego. W miarę wzrostu szybkości dostarczania gazu, składniki odżywcze w fazie ciekłej są ograniczane (pantotenian wapnia albo kobalt) i wynikiem takiego ograniczania jest niewielki spadek w konwersji H2, przy docelowej wielkości produkcji.

W trakcie pracy w stanie ustalonym osiąga się wytwarzanie 15-35 g/l etanolu i 0-5 g/l octanu. Na tym etapie konieczne są niewielkie zmiany dostosowujące w ograniczających składnikach odżywczych, w szybkości podawania cieczy i w szybkości podawania gazu - takie zmiany dokonywane są według wyboru przez specjalistę, w oparciu o wiedzę wynikającą ze znajomości stanu techniki, jak również z nauczania zawartego w obecnym wynalazku. Jeśli do sposobu wytwarzania etanolu dodane ma być zawracanie komórek, jest ono uruchomione właśnie w tym momencie, jednocześnie z dostosowaniem szybkości przepływu gazu (wzrost) i stężenia pożywki (zmniejszenie).

Powyżej opisane sposoby ciągłego wytwarzania etanolu i utrzymania jego wysokich stężeń przy małych stężeniach octanu jako produktu ubocznego, w stabilnych warunkach pracy układu, zwiększają wykorzystanie przedmiotowych bakterii w produkcji etanolu na skalę przemysłową. Sposoby przedstawione w zarysie powyżej przezwyciężają ograniczenia występujące przy wykorzystaniu bakterii do przemysłowego wytwarzania etanolu z CO, CO2 i H2. Korzystnie, według sposobu stosuje się bioreaktor pracujący w trybie ciągłym, chociaż stosuje się również sposoby fermentacji w oddzielnych szarżach albo w szarżach periodycznie zasilanych, jednak nie jest prawdopodobne, aby te metody były opłacalne przy wytwarzaniu etanolu w dużej skali.

Przedstawione dalej przykłady ilustrują różne aspekty, sposoby i etapy sposobów według niniejszego wynalazku. Te przykłady nie ograniczają wynalazku, którego zakres jest zawarty w załączonych zastrzeżeniach.

P r z y k ł a d 1. Przykładowy sposób według wynalazku

Gaz syntezowy lub odpadowy zawierający CO i/ lub CO2/H2 jest wprowadzany w sposób ciągły do bioreaktora zbiornikowego z mieszadłem zawierającego szczep C. Ijungdahlii, wraz z konwencjonalną pożywką ciekłą, zawierającą witaminy, śladowe metale i sole. Przykładową korzystną pożywkę przedstawiono w Tabeli 1 poniżej.

PL 205 622 B1

Podczas rozruchu z użyciem inokulum kultury wielkości 10% albo mniejszej, reaktor pracuje z pojedynczą szarżą fazy ciekłej, przy czym medium ciekłe nie jest podawane w sposób ciągły do reaktora. Tak więc faza ciekła w reaktorze zawiera szarżę pożywki o nominalnym stężeniu ograniczającego składnika odżywczego, pantotenianu wapnia albo kobaltu. Alternatywnie, może też być wykorzystywana bogata pożywka zawierająca ekstrakt z drożdży, tryptykazę albo inne złożone pożywki.

W idealnym przypadku, faza gazowa w trakcie rozruchu jest pozbawiona CO2 i zawiera nadmiar H2. Szybkość dopływu gazu i szybkość mieszania utrzymuje się na niskich poziomach (poniżej 500 obrotów/min. w bioreaktorze New Brunswick Scientific Bioflo^®), podając CO i H2 w niewielkim nadmiarze, ale jednocześnie unikając inhibicji substratem CO. W bioreaktorze fermentacyjnym New Brunswick Scientific Bioflo^® o pojemności jednego litra, służącym tu jako przykład, przy składzie gazu zasilającego: 63% H2, 32% CO i 5% CH4, szybkość mieszania w celu zapoczątkowania rozruchu wynosi 400 obrotów/min. a szybkość przepływu gazu 20 ml/min. Przyczyną wytwarzania etanolu w trakcie rozruchu jest nadmiar H2; ograniczanie składników odżywczych ma miejsce później. Tak więc nadmiarowe składniki odżywcze w cieczy (pantotenian, kobalt) są faktycznie obecne podczas rozruchu w celu uniknięcia niepożądanego przystosowania się kultury do niskiego poziomu składników odżywczych.

W czasie, gdy fermentacja postępuje przez kilka do kilkunastu godzin po zaszczepieniu, na drodze konwersji CO wytwarzany jest CO2, zaś H2 jest zużywany razem z CO2, co staje się sygnałem do nominalnego zwiększenia szybkości mieszania w celu uniknięcia ograniczenia transferu masy gazu. W bioreaktorze New Brunswick Scientific Bioflo^® CSTR gaz wychodzący składa się z: 25% CO, 67% H2, 2% CO2 i 6% CH4. Jeśli szybkość mieszania zostanie zwiększona zbyt szybko, występuje inhibicja substratem CO, o czym świadczy spadek stężenia metanu przy zwiększaniu szybkości mieszania. Tak więc, szybkość mieszania typowo może być zwiększana o 200 obrotów/min. w ciągu 24 godzin. Tę procedurę monitorowania wytwarzania CO2 (albo konwersji H2), przy jednoczesnym nominalnym zwiększaniu szybkości mieszania, prowadzi się stosunkowo szybko, aż do momentu uzyskania docelowej szybkości mieszania. Typowa docelowa szybkość mieszania w bioreaktorze fermentacyjnym New Brunswick Scientific Bioflo^® jest równa 900 obrotów/min. Podczas tego zwiększania szybkości mieszania w periodycznej szarży ciekłej kultury, zdecydowanie najważniejsze jest wytwarzanie komórek, a nie tworzenie produktu. W ten sposób uzyskuje się stężenia komórek około 1,5 g/l, podczas gdy typowe stężenia produktu wynoszą 10 g/l etanolu i 2 g/l octanu, w przypadku kultury w szarży periodycznej.

Gdy docelowa szybkość mieszania zostanie już osiągnięta, układ pozostawia się w celu wzrostu bakterii, do czasu osiągnięcia maksymalnego pochłaniania H2. Aby zapewnić wytwarzanie etanolu przy jednoczesnym ograniczaniu wytwarzania kwasu octowego korzystnie jest, gdy stężenia H2 na wylocie są bardzo wysokie (typowo > 60%). Następnie uruchomione zostaje zasilanie pożywką ciekłą (w przypadku układów z zaszczepianiem w pojedynczej szarży, z kultury macierzystej) w celu zainicjowania ciągłego przepływu cieczy, zaś szybkość przepływu gazu jest zwiększana do wartości docelowej. W laboratoryjnym bioreaktorze fermentacyjnym New Brunswick Scientific Bioflo^® szybkość zasilania cieczą wynosi typowo 0,5 ml/min., natomiast szybkość przepływu gazu jest zwiększana o 10% do 15% co 24 godziny, aż do osiągnięcia wartości docelowej 125 ml/min.

Ważne jest zapewnienie nadmiaru H2 w gazie zasilającym w celu uniknięcia produkcji nadmiaru kwasu octowego. W miarę zwiększania szybkości przepływu gazu zwiększa się produkcja komórek aż do czasu, gdy reaktor w końcu stanie się ograniczony pod względem składników odżywczych obecnych w fazie ciekłej (pantotenianu wapnia albo kobaltu), co wykazywane jest przez niewielki spadek konwersji H2, na etapie uzyskania docelowej wydajności. W bioreaktorze New Brunswick Scientific Bioflo^® CSTR objawia się to poprzez 10%-owy spadek konwersji H₂, przy docelowej wydajności 20 g/Ldoba.

Proces produkcji oraz układ reaktora są następnie utrzymywane w stanie ustalonym, któremu towarzyszy wytwarzanie 15 do 35 g/l etanolu i 0 do 5 g/l octanu jako produktów, przy czym tylko niezbyt często dokonuje się niewielkiego skorygowania ograniczających składników odżywczych, szybkości zasilania cieczą i szybkości podawania gazu. Typowe warunki stanu ustalonego w laboratoryjnym bioreaktorze fermentacyjnym New Brunswick Scientific Bioflo^® bez zawracania komórek są następujące: czas retencji gazu (szybkość przepływu gazu / objętość cieczy w reaktorze) wynosi 20 minut, czas retencji cieczy (szybkość przepływu cieczy / objętość cieczy w reaktorze) wynosi 30 godzin, oraz szybkość mieszania wynosi 900 obrotów/min., co daje konwersje CO równe 92% i konwersje H2 równe 60%, przy ograniczaniu pantotenianem.

PL 205 622 B1

W wykonaniu tego sposobu z dodanym do układu reaktora zawracaniem komórek, zawracanie wprowadza się właśnie na tym etapie, czemu towarzyszy dostosowanie szybkości gazu (wzrost) i stężenia składników odżywczych (zmniejszenie). W przypadku zastosowania zawracania komórek w New Brunswick Scientific Bioflo^® CSTR, czas retencji gazu zazwyczaj wynosi 8 minut, czas retencji cieczy wynosi 12 godzin, czas retencji komórek wynosi 40 godzin i szybkość mieszania wynosi 900 obrotów/min. Warunki te zazwyczaj dają konwersję CO równą 92% i konwersję H2 równą 50%, przy ograniczaniu pantotenianem.

P r z y k ł a d 2. Analiza próbek za pomocą chromatografii gazowej

Aby osiągnąć i/albo utrzymać odpowiednią wydajność i stosunek produktów, należy co pewien czas próbkę brzeczki fermentacyjnej z bioreaktora fermentacyjnego poddawać analizie. Z kultury w bioreaktorze pobiera się próbkę kultury większą niż 1,5 ml. Próbkę umieszcza się w probówce mikrowirówki i probówkę umieszcza się w wirówce Fisher Scientific Micro 14, wraz z balastem koniecznym do zrównoważenia. Próbkę poddaje się odwirowaniu przy 8000 obrotów/min., w ciągu 1,5 minuty. Próbkę 0,500 ml przesączu umieszcza się w fiolce 1,5 ml przeznaczonej do stosowania w aparatach do automatycznego pobierania próbek do chromatografii gazowej. Jako standard wewnętrzny stosuje się 0,500 ml próbkę zawierającą 5 g/l n-propanolu i 5% v/v 85%-owego kwasu fosforowego w wodzie demineralizowanej. Kwas fosforowy zapewnia całkowitą konwersję octanów do kwasu octowego, który jest wykrywalny za pomocą chromatografii gazowej.

Jeden μl tak przygotowanej próbki jest następnie nastrzykiwany za pomocą aparatu do automatycznego pobierania próbek na chromatograf gazowy Hewlett-Packard 5890, Serii II, wyposażony w krzemionkową kolumnę kapilarną 007 FFA Qaudrex, 25 m x 0,53 mm. Analizę prowadzi się stosując hel jako gaz nośny, w trybie rozdzielonego przepływu, z przepływem 66 ml/min i z przedmuchem injektora 7,93 ml/min. Ciśnienie na szczycie kolumny ustawione jest na 0,127 mPa (4 psig), co daje przepływ gazu nośnego na kolumnie 7 ml/min. Program temperaturowy jest: 75°C przez 0,2 minuty, wzrost do 190°C z szybkością 30°C/minutę, i termostatowanie w 190°C przez 5,17 minuty. Całkowity czas przebywania próbki w chromatografie wynosi 8 minut. Instrument jest kalibrowany na etanol (0-25 g/l), kwas octowy (0-25 g/l), n-butanol (0-5 g/l) i kwas masłowy (0-5 g/l). W kalibracji stosuje się pięć stężeń odczynników standardowych, przygotowanych z materiałów o czystości odczynnikowej (reagent grade). Jeśli próbka znajdzie się poza zakresem stężenia kalibracji (np. >>25 g/l etanolu), wówczas 0,250 ml tej próbki i 0,250 ml wody demineralizowanej umieszcza się w fiolce wraz z 0,500 ml wzorca wewnętrznego, a współczynnik rozcieńczenia uwzględnia się przy obliczaniu wyniku analizy.

P r z y k ł a d 3. Wytwarzanie kwasu w laboratoryjnym bioreaktorze CSTR z zawracaniem komórek _®

Prowadzono pracę laboratoryjnego bioreaktora fermentacyjnego New Brunswick Scientific Bioflo^® z zawracaniem komórek, stosując Clostridium Ijungdahlii, szczep ERI2, ATCC 55380, do produkcji kwasu octowego z CO, CO2 i H2. Gaz zasilający zawierał 40% H2, 50% CO i 10% N2, a czas retencji gazu w jednolitrowym reaktorze był równy 7,7 do 8,6 minuty. Medium ciekłe, zawierające witaminy, sole i pierwiastki śladowe było podawane z szybkością odpowiadającą czasowi retencji cieczy równym 2,6 do 2,9 godziny. Wartość pH wynosiła 5,1 do 5,2, szybkość mieszania była równa 1000 obrotów/min., zaś czas retencji komórek 40 godzin. W tych warunkach, które odpowiadały ograniczaniu transferu masy (a nie ograniczaniu składnikiem odżywczym), konwersja (stopień przemiany) CO wynosiła 94 do 98%, a konwersja H2 była równa 80 do 97%. Stężenie komórek wynosiło 4 do 8 g/l, octan został wytworzony w stężeniu 10 do 13 g/l. Etanol nie został wytworzony. Chociaż pracę reaktora prowadzono w warunkach ograniczania transferu masy (ograniczenia zdolnością transferu gazu do kultury bakteryjnej) i dlatego jako produkt wytworzono jedynie kwas octowy, to jednak parametry wytwarzania etanolu przez ograniczanie pantotenianowe, ograniczanie kobaltowe lub przez obecność nadmiaru H2 albo CO, były również monitorowane w celu porównania z wytwarzaniem etanolu jako głównego produktu.

Jak to pokazano w Tabeli 2, d-pantotenian Ca podawano na jednostkę wytworzonych komórek w ilości 1575 do 3150 mikrogramów na gram wytworzonych komórek ^g/g komórek wytworzonych). Podobnie, kobalt podawany na gram wytworzonych komórek użyto w ilości 1734 do 3468 ^g/g komórek wytworzonych). Właściwa szybkość pochłaniania CO wynosiła 0,35 do 0,61 mmola/g komórekminuta. Stosunek liczby podawanych moli H₂ do sumy podwojonej liczby moli CO, który uległ przemianie i potrojonej liczby moli CO2, który uległ przemianie, wynosił poniżej 0,46. Tak więc żaden z tych parametrów nie znajdował się w zakresie operacyjnym korzystnym do wytwarzania etanolu przez kulturę.

Wiadomo, że pantotenian i kobalt były podawane do powyższego reaktora w znacznym nadmiarze przy wytwarzaniu kwasu octowego, jako produktu w warunkach ograniczania transferu masy.

PL 205 622 B1

Znaczy to, że poziom pantotenianu i/albo kobaltu mogą być znacznie zmniejszone i, pomimo tego, nadal pozostaną na poziomie przewyższającym minimum wymagane do ograniczania pantotenianem albo kobaltem. Aby to zilustrować, medium podawane do jednolitrowego bioreaktora fermentacyjnego New Brunswick Scientific Bioflo^® zmieniano w kierunku znacznego obniżenia ilości dodawanego kobaltu, do poziomu tylko nieznacznie przewyższającego stężenie kobaltu przy ograniczaniu kobaltem. Reaktor ponownie zawierał C. Ijungdahlii, szczep ERI2, wytwarzający kwas octowy z CO, CO2 i H2. Podawany gaz zawierał 55% H2, 25% CO i 5% CH4 (gaz wzorcowy), a czas retencji gazu wynosił 7,5 do 8,0 minuty. Ciekłe medium zawierające sole, witaminy i pierwiastki śladowe podawano przy czasie retencji cieczy 3,0 do 3,5 godziny, zaś czas retencji komórek wynosił 40 godzin. Wartość pH wynosiła 5,0 do 5,3, szybkość mieszania 900 do 1000 obrotów/min. W tych warunkach konwersja CO wynosiła 95 do 99%, a konwersja H2 94 do 98%. Stężenie komórek było równe 2,5 do 4,0 g/l i octan był jedynym produktem utworzonym w stężeniu 10 do 14 g/l.

d-Pantotenian wapnia podawano do reaktora na gram komórek w ilości 2250 do 3600 mg pantotenianu/g wytworzonych komórek. Ilość kobaltu podawanego na jednostkę wytworzonych komórek zmniejszono do zakresu 62,0 do 99,2 μg kobaltu/g wytworzonych komórek. Właściwa szybkość pochłaniania CO wynosiła 0,325 do 0,4 mmola/g komórek-minuta. Stosunek podawanego H2 do sumy podwojonej ilości CO, który uległ przemianie i potrojonej ilości CO2, który uległ przemianie - wynosił 0,875.

P r z y k ł a d 4. Wytwarzanie etanolu w laboratoryjnych bioreaktorach CSTR, z ograniczaniem pantotenianem

Prowadzono pracę laboratoryjnego bioreaktora fermentacyjnego New Brunswick Scientific Bioflo^® II jako przepływowego CSTR (bez zawracania komórek), stosując C. Ijungdahlii, szczep C-01, ATCC 55988, do produkcji etanolu z CO, CO2 i H2, ograniczany pantotenianem. Gaz podawany do reaktora zawierał 63,3% H2, 31,4% CO i 5,3% C2H6 (gaz wzorcowy). Gaz podawano przy czasie retencji wynoszącym 27 minut. Ciekłe medium, zawierające nadmiar soli i pierwiastków śladowych oraz ograniczoną ilość pantotenianu, podawano do reaktora o pojemności 1,55 litra przy czasie retencji cieczy wynoszącym 31,4 godziny. Wartość pH wynosiła 4,6 do 4,7, a szybkość mieszania 650 obrotów/min. W tych warunkach operacyjnych konwersja CO wynosiła 98%, konwersja H2 83%, a stężenie komórek wynosiło 1,5 do 2,0 g/l. Etanol został wytworzony w stężeniu 15 do 19 g/l, zaś octan został wytworzony w stężeniu 1,5 g/l. Wydajność etanolu była w zakresie od 11,5 do 14,5 g/Ldoba.

W trakcie analizy parametrów wytwarzania etanolu obserwowano ograniczenie pantotenianem przy stosunku podawanego pantotenianu do wytworzonych komórek wynoszącej 17,7 do 23,6 μg pantotenianu/g wytworzonych komórek. Należy porównać ten stosunek z wielkościami: 2250 do 3600 μg pantotenianu/g wytworzonych komórek i 1575-3150 μg pantotenianu/g wytworzonych komórek, z Przykładu 3 dotyczącego wytwarzania kwasu. Kobalt podawano na jednostkę wytworzonych komórek w zakresie 5000 do 6000 μg kobaltu/g wytworzonych komórek, co jest poziomem nawet wyższym niż w Przykładzie 3 i zapewnia tu brak ograniczania kobaltem. Szybkość właściwa pochłaniania CO wynosiła 0,23 do 0,30 mmola/g komórekminuta. Stosunek podawanego H₂ do sumy podwojonej ilości CO, który uległ konwersji i potrojonej ilości CO2, który uległ konwersji wynosił 1,3, zaś cząstkowe ciśnienie H2 w gazie wylotowym wynosiło 0,55-0,64 atm. Jest możliwe, że albo nadmiar H2, albo ograniczona ilość pantotenianu spowodowały wytwarzanie etanolu.

Ograniczanie pantotenianem przy wytwarzaniu etanolu było też przedmiotem badania prowadzonego w innym laboratoryjnym reaktorze New Brunswick Scientific Bioflo^® II, którego pracę prowadzono w trybie z zawracaniem komórek, stosując C. Ijungdahlii, szczep C-01, ATCC 55988. Do tego reaktora podawano gaz zawierający 61,7% H2, 30,6% CO i 5,2% C2H6 (gaz wzorcowy) przy czasie retencji gazu równym 12,3 minuty. Ciekłą pożywkę zawierającą oprócz nadmiaru soli i pierwiastków śladowych ograniczoną ilość pantotenianu, podawano do reaktora o pojemności 2,4 litra, przy czasie retencji cieczy równym 24,8 godziny. Zawracanie komórek realizowano przez zastosowanie membrany z pustych włókien o średnicy porów 0,2 μm, zaś czas retencji komórek był równy 69 godzin. Wartość pH wynosiła 4,6, szybkość mieszania 650 obrotów/min. W tych warunkach konwersja CO była równa 90%, konwersja H2 53%, a stężenie komórek było równe 2,5 g/l. Stężenie etanolu wynosiło 18 g/l a stężenie octanu było 3 g/l. Wydajność etanolu była równa 17,4 g/Ldoba.

Analiza parametrów wytwarzania etanolu (Tabela 2) wykazała, że stosunek pantotenianu podawanego na jednostkę wytworzonych komórek był równy 8,08 μg pantotenianu/g wytworzonych komórek. Raz jeszcze, ograniczanie pantotenianem było zapewnione dzięki pracy bioreaktora przy poziomie pantotenianu znacznie niższym niż wymagany do wytwarzania octanu. Ilość kobaltu podawana na jednostkę wytworzonych komórek była równa 3960 μg kobaltu/g wytworzonych komórek. Szybkość

PL 205 622 B1 właściwa pochłaniania CO wynosiła 0,33 mmola/g komórekminuta. Stosunek podawanej ilości H₂ do sumy podwojonej ilości CO, który uległ konwersji i potrojonej ilości CO2, który uległ konwersji, wynosiła 1,14, zaś ciśnienie cząstkowe H2 w gazie wylotowym wynosiło 0,60-0,65 atm. Nadmiar H2 może być tu potencjalną przyczyną wytwarzania etanolu, jednakże wysoka zawartość CO2 w gazie wylotowym (0,14 atm) pokazuje, że wzrost był ograniczany pantotenianem.

W innym doświadczeniu, do szczepu ERI2 C. Ijungdahlii, podawano 1500 do 3600 μg pantotenianu/g komórek wytworzonych w trakcie wytwarzania kwasu octowego z CO, CO2 i H2, co stanowi warunki kiedy reaktor nie jest ograniczany pantotenianem (albo dowolnemu innym ograniczaniem, za wyjątkiem zdolności transferu gazu do kultury) - w strumieniu produktów nie stwierdzono obecności etanolu.

Podczas ograniczania pantotenianem wytwarzania etanolu z CO, CO2 i H2, do szczepu C-01 C. Ijungdahlii podawano 8-24 μg pantotenianu/g wytworzonych komórek, jednocześnie utrzymując w nadmiarze wszystkie pozostałe składniki odżywcze. W tych warunkach szczep C-01 wytworzył 15 do 19 g/l etanolu i 1,5 do 3,0 g/l octanu.

P r z y k ł a d 5. Wytwarzanie etanolu w laboratoryjnym bioreaktorze CSTR, przy ograniczaniu kobaltem

Prowadzono pracę laboratoryjnego bioreaktora fermentacyjnego New Brunswick Scientific Bioflo^® II jako przepływowego CSTR (bez zawracania komórek), stosując szczep C-01, ATCC 55988 C. Ijungdahlii do produkcji etanolu z CO, CO2 i H2, przy ograniczaniu kobaltem. Gaz podawany do reaktora zawierał 60% H2, 35% CO i 5% CH4 (gaz wzorcowy); gaz podawano przy czasie retencji wynoszącym 14 minut. Ciekłą pożywkę, zawierającą nadmiar soli, witamin i metali śladowych (z wyjątkiem kobaltu, który był pierwiastkiem ograniczającym), podawano do reaktora o pojemności 2,5 l przy czasie retencji cieczy wynoszącym 40 godzin. Wartość pH była równa 4,9, a szybkość mieszania 650 obrotów/min. W tych warunkach konwersja CO wynosiła 91%, podczas gdy konwersja H2 wahała się w przedziale od 20% do 80%, ale nominalnie (według typowej wartości średniej) wynosiła 55%. Etanol został wytworzony w stężeniu 26 g/l, octan był wytworzony w stężeniu 4 g/l, zaś stężenie komórek było równe 2,5 g/l. Wydajność etanolu wynosiła 15,6 g/Ldoba.

W trakcie analizy parametrów wytwarzania etanolu obserwowano stosunek podawanego pantotenianu do wytworzonych komórek, który był równy 15,2 μg pantotenianu/g wytworzonych komórek. Ten poziom był całkiem niewielki, na tyle, że uprzywilejowanie ograniczania kobaltem w porównaniu z ograniczaniem pantotenianem mogło nie być przesądzone. Ograniczanie kobaltem obserwowano podczas pracy reaktora przy 33,3 μg kobaltu/g wytworzonych komórek, co jest poziomem 100-krotnie mniejszym, niż stosowany w reaktorach pracujących bez ograniczania kobaltem. Stosunek ilości podawanego H2 do sumy podwojonej ilości CO, który uległ konwersji i potrojonej ilości CO2, który uległ konwersji wynosił 0,94. Szybkość właściwa pochłaniania CO wynosiła 0,37 mmola/g komórekminuta.

Ograniczanie kobaltem przy produkcji etanolu zostało też wykazane w CSTR, którego pracę prowadzono z zawracaniem komórek, stosując C. Ijungdahlii, szczep C-01, ATCC 55988. Doświadczenie to przeprowadzono w celu wykazania ograniczania kobaltem w obecności nadmiaru pantotenianu, przeciwnie niż to miało miejsce w przypadku poprzedniego reaktora opisanego w tym przykładzie. Do laboratoryjnego bioreaktora fermentacyjnego New Brunswick Scientific Bioflo^® 2000, z membraną z pustych włókien o średnicy porów 0,2 μm stosowaną do zawracania komórek, podawano gaz zawierający 60% H2, 35% CO i 5% CH4 (gaz wzorcowy) przy czasie retencji gazu równym 5 minut. Pożywkę ciekłą zawierającą nadmiar soli, witamin i pierwiastków śladowych (z wyjątkiem kobaltu, który jest czynnikiem ograniczającym), podawano do reaktora o pojemności 1,2 litra, przy czasie retencji cieczy równym 16 godzin. Wartość pH wynosiła 5,1, a szybkość mieszania 825 obrotów/min. Czas retencji komórek w tym CSTR z membraną z pustych włókien do zawracania komórek wynosił 40 godzin. W tych warunkach konwersja CO wyniosła 83%, konwersja H2 była 50%, a stężenie komórek było równe 4,2 g/l. Stężenie etanolu wynosiło 18 g/l a stężenie octanu 4 g/l. Wydajność etanolu była równa 27 g/Ldoba.

Odwołanie się do parametrów produkcji etanolu w tym reaktorze (Tabela 2) wykazuje, że stosunek podawanego pantotenianu na jednostkę wytworzonych komórek był równy 85,7 μg pantotenianu/g wytworzonych komórek, co jest poziomem 5,5-krotnie większym, niż to miało miejsce dla poprzedniego reaktora w tym przykładzie. Ograniczanie kobaltem obserwowano podczas pracy układu przy 47,6 μg kobaltu/g wytworzonych komórek. Stosunek podawanej ilości H₂ do sumy podwojonej ilości CO, który uległ konwersji i potrojonej ilości CO2, który uległ konwersji, wynosił 1,03, zaś ciśnienie cząstkowe H2 w gazie wylotowym wynosiło 10,7 kPa (0,60 atm). Również w tym przypadku nadmiar

PL 205 622 B1

H2 może być potencjalną przyczyną wytwarzania etanolu; jednakże wysoka zawartość CO2 w gazie wylotowym (10,1 kPa-15,2 kPa (0,1-0,15 atm)) pokazuje, że wzrost był ograniczany kobaltem. Szybkość właściwa pochłaniania CO wynosiła 0,50 mmola/g komórekminuta.

P r z y k ł a d 6. Wytwarzanie etanolu w laboratoryjnych bioreaktorach CSTR działających w obecności nadmiaru CO

Pracę wysokociśnieniowego reaktora typu AUTOKLAV™ (Buchi) prowadzono w trybie CSTR z cyrkulacją kultury bakteryjnej i zawracaniem komórek, stosując C. Ijungdahlii, szczep C-01, do wytwarzania etanolu z CO, CO2 i H2 w obecności nadmiaru CO, w czasie 50 godzin. Pracę reaktora prowadzono przy ciśnieniu 0,27 MPa (25 psig), zasilając reaktor gazem zawierającym 57% H2, 36% CO i 6% C2H6. Czas retencji gazu był zmienny, ale nominalnie wynosił 3 minuty. Ciekłą pożywkę zawierającą nadmiar soli, witaminy (włączając w to pantotenian) i metale śladowe podawano do reaktora o pojemności 600 ml, przy czasie retencji cieczy 8,2 godziny. Po przepuszczeniu odcieku z reaktora przez filtr z pustych włókien ceramicznych otrzymywano czas retencji komórek, który wynosił tu 18,5 godziny. Wartość pH była równa 4,5, szybkość mieszania 450 obrotów/min. i szybkość recyrkulacji cieczy 1,82 l/min. do 2,27 l/min. W tych warunkach konwersje (stopnie przemiany) gazów były zmienne, ale konwersja CO nominalnie wynosiła 72%, a konwersja H2 nominalnie była równa 12%. Stężenie komórek było równe 2,7 g/l. Etanol został wytworzony w stężeniu 9,9 g/l, a octan był wytworzony w stężeniu 2,6 g/l. Wydajność etanolu wynosiła 29,0 g/Ldoba.

Analiza parametrów wytwarzania etanolu wykazała, że stosunek podawanego pantotenianu do masy wytworzonych komórek był równy 97 μg pantotenianu/g wytworzonych komórek. Ten poziom jest dostatecznie wysoki do zapewnienia, że pantotenian nie był czynnikiem limitującym. Stosunek podawanego kobaltu do wytwarzania komórek wynosił 836 μg kobaltu/g wytworzonych komórek, co jest poziomem zapewniającym, że kobalt nie był czynnikiem ograniczającym. Stosunek ilości podawanego H2 do sumy podwojonej ilości CO, który uległ konwersji i potrojonej ilości CO2, który uległ konwersji wynosił 1,09, zaś ciśnienie cząstkowe H2 wynosiło 162 kPa (1,6 atm). Wysoka zawartość CO2 w gazie wylotowym (50,67 kPa (0,5 atm)) zapewnia, że nadmiar H2 nie spowodował wytwarzanie etanolu. Szybkość właściwa pochłaniania CO wynosiła 1,34 mmola/g komórekminuta, co jest poziomem zapewniającym, że nadmiar CO jest sposobem wytwarzania etanolu.

Technika polegająca na stosowaniu nadmiaru CO do produkcji etanolu zastała również zademonstrowana w innym doświadczeniu z C. Ijungdahlii, szczep C-01, w układzie reaktora AUTOKLAV™ (Buchi) - ponownie, z zawracaniem komórek i z cyrkulacją kultury bakteryjnej, w czasie 24 godzin. W tym doświadczeniu do reaktora 600 ml podawano gaz zawierający 15,8% H2, 36,5% CO, 38,4% N2 i 9,3% CO2, przy czasie retencji gazu 1,4 minuty. Ciśnienie w reaktorze utrzymywano na poziomie 0,376 MPa (40 psig). Pożywkę ciekłą zawierającą nadmiar soli, witamin i metali śladowych podawano przy czasie retencji cieczy równym 4,8 godziny, a czas retencji komórek, otrzymywanych z odcieku na filtrze z pustych włókien ceramicznych, wynosił 19,2 godziny. Wartość pH wynosiła 4,5, szybkość mieszania 1000 obrotów/min, zaś szybkość cyrkulacji cieczy 1,8 l do 2,27 l/min. W tych warunkach konwersja CO była 71,6%, a konwersja H2 była 11.8%. Stężenie komórek było 7.1 g/l, etanol został wytworzony w stężeniu 12,0 g/l, zaś octan został w stężeniu 2,7 g/l. Wydajność etanolu była równa 60 g/Ldoba.

Analiza parametrów wytwarzania etanolu (Tabela 2) wykazała, że stosunek pantotenianu do wytwarzania komórek był równy 294 μg pantotenianu/g wytworzonych komórek. Jest to poziom znacznie powyżej minimalnego poziomu wymaganego do spowodowania wytwarzania etanolu na skutek ograniczania pantotenianem. Stosunek podawanego kobaltu do wytwarzania komórek wynosił 735 μg kobaltu/g wytworzonych komórek, co, ponownie, jest poziomem zapewniającym, że kobalt był podawany w nadmiarze. Stosunek podawanego H2 do sumy podwojonej ilości CO, który uległ konwersji i potrojonej ilości CO2, który uległ konwersji wynosił 0,3. Szybkość pochłaniania CO wynosiła 0,67 mmola/g komórekminuta co, raz jeszcze, jest poziomem wskazującym, że nadmiar tlenku węgla CO może być stosowany jako sposób powodowania wytwarzania etanolu.

P r z y k ł a d 7. Wytwarzanie etanolu w obecności nadmiaru H2

Prowadzono pracę laboratoryjnego bioreaktora fermentacyjnego New Brunswick Scientific Bioflo^® w trybie przepływowego CSTR (bez zawracania komórek), stosując C. Ijungdahlii, szczep C-01, ATCC 55988, do produkcji etanolu z CO, CO2 i H2, w obecności nadmiaru H2. Gaz podawany do reaktora zawierał 77% H2, 19% CO i 4% CH4 (gaz wzorcowy). Gaz podawano przy czasie retencji wynoszącym 30 minut. Ciekłą pożywkę, zawierającą nadmiar soli, witamin i pierwiastków śladowych podawano do reaktora przy czasie retencji cieczy wynoszącym 36 godzin. Wartość pH wynosiła 5,0,

PL 205 622 B1 a szybkość mieszania 1000 obrotów/min. W tych warunkach operacyjnych konwersja CO wynosiła 97-99% i konwersja H2 była równa 60-80%. Stężenie komórek wynosiło 0,8 do 1,0 g/l, stężenie etanolu było równe 10 g/l, a stężenie octanu 3,3 g/l. Wydajność etanolu była równa 6,7 g/Ldoba.

Analiza parametrów wytwarzania etanolu wykazała stosunek podawanego pantotenianu do ilości wytwarzanych komórek równą 900-1125 μg pantotenianu/g wytworzonych komórek, co zapewnia, że obecny był nadmiar pantotenianu. Podobnie, stosunek podawanego kobaltu do ilości wytwarzanych komórek była 991-1239 μg kobaltu/g wytworzonych komórek co, również w tym przypadku, zapewnia obecność nadmiaru kobaltu. Szybkość właściwa pochłaniania CO była równa 0,28-0,35 mmola/g komórek/min, co jest poziomem, przy którym nadmiar CO nie powoduje wytwarzania etanolu. Stosunek ilości moli podawanego H2 do sumy podwojonej ilości moli CO, który uległ konwersji i potrojonej ilości moli CO2, który uległ konwersji był równy 1,96, co przekracza wartość 1,0, przy której istnieje nadmiar H2, więc mogło to być elementem kontrolującym wytwarzanie etanolu. Ciśnienie cząstkowe H2 w gazie wylotowym wynosiło 70,93 kPa-88,15 kPa (0,70-0,87 atm), a stosunek ciśnienia cząstkowego H2 do ciśnienia cząstkowego CO2 w gazie wylotowym był równy 65. Tak więc obecność nadmiaru H2 powodowała wytwarzanie etanolu w reaktorze.

W innym eksperymencie, wysokociśnieniowy reaktor typu AUTOKLAV™ (Buchi) pracował w trybie CSTR z cyrkulacją kultury bakteryjnej i zawracaniem komórek, z użyciem C. Ijungdahlii, szczep C-01, do wytwarzania etanolu z CO, CO2 i H2 w obecności nadmiaru H2. Gaz podawany do reaktora zawierał 81% H2, 16% CO i 3% CH4 (gaz wzorcowy), podawany przy czasie retencji gazu 2,21 minuty. Ciekłe medium zawierające nadmiar soli, witaminy i metale śladowe podawano do reaktora przy czasie retencji cieczy 8,97 godziny. Czas retencji komórek wynosił 22,7 godziny, pH było równe 4,5, zaś szybkość mieszania 800 obrotów/min. W tych warunkach operacyjnych konwersja CO wynosiła 91,5%, a konwersja H2 była równa 43.4%. Stężenie komórek było równe 5,5 g/l, zaś stężenie octanu 2,85 g/l. Wydajność etanolu wynosiła 215-240 g/Ldoba.

Analiza parametrów wytwarzania etanolu wykazała, że stosunek podawanego pantotenianu do ilości wytwarzanych komórek był równy 46 μg pantotenianu/g wytwarzanych komórek, co jest poziomem mogącym wskazywać na ograniczanie pantotenianem. Stosunek podawanego kobaltu do ilości wytwarzanych komórek był równy 460 μg/g wytwarzanych komórek, co jest poziomem zapewniającym, że kobalt nie był czynnikiem ograniczającym. Szybkość właściwa pochłaniania CO była równa 1,68 mmola/g komórekmin, co jest poziomem, który mógłby wskazywać, że obecny był nadmiar CO, gdyby nie fakt, że wysoka była szybkość pochłaniania H₂, równa 4,14 mmola/g komórekmin. Wskazuje to, że nie występowała inhibicja konwersji H2 substratem. Stosunek ilości moli podawanego H2 do sumy podwojonej ilości moli CO, który uległ konwersji i potrojonej ilości moli CO2, który uległ konwersji był równy 5,67, co znacznie przekracza wartość 1,0, wymaganą do stwierdzenia, że obecny był nadmiar H2. Ciśnienie cząstkowe H2 w gazie wylotowym wynosiło 264,65 kPa (2,61 atm), zaś stosunek cząstkowego ciśnienia H2 do cząstkowego ciśnienia CO2 w gazie wylotowym był równy 10,9. Tak więc reaktor wytwarzał etanol w wyniku obecności nadmiaru H2.

Podsumowanie porównania parametrów według sposobu oraz wyników dla Przykładów 3 do 7 przedstawiono w Tabeli 2 poniżej.

P r z y k ł a d 8. Zmiana składu produktów wytwarzanych przez szczepy ERI2, C-01 i PETC C. Ijungdahlii przez regulowanie za pomocą składu pożywki

Sposoby według obecnego wynalazku mogą być zastosowane do dowolnego szczepu C. Ijungdahlii. Wyniki doświadczeń polegających na regulowaniu składu pożywki, w których użyto szczepy ERI2, C-01 i PETC zostały przedstawione w Tabeli 3, poniżej. Celem tych doświadczeń było zademonstrowanie, że każdy z tych szczepów może przestawić się z wytwarzania kwasu octowego na wytwarzanie etanolu, i to jedynie na skutek regulowania składu pożywki. Tak więc, do kultury bakteryjnej podawano nadmiar składników odżywczych (włączając pantotenian i kobalt) w celu wytwarzania kwasu octowego jako produktu dominującego, a następnie ograniczano pantotenian albo kobalt aby wytwarzać jako produkt dominujący etanol. Należy podkreślić, że jedynym celem tych doświadczeń było wykazanie, że regulowanie składu pożywki może dać w wyniku zmianę składu produktów, dla każdego z tych szczepów. Dlatego też osiąganie wysokich stężeń produktu i wydajności nie było głównym celem tych doświadczeń.

W każdym z eksperymentów z różnymi kulturami prowadzono pracę reaktora jako przepływowego CSTR (bez zawracania komórek). Czas retencji gazu był nominalnie (według typowej wartości średniej) ustawiony na 50 minut, czas retencji cieczy był nominalnie ustawiony na 40 godzin, a szyb22

PL 205 622 B1 kość mieszania była nominalnie ustawiona na 1000 obrotów na minutę. Takie warunki zostały wybrane w celu umożliwienia porównania szczepów, a nie aby uzyskiwać wysokie wydajności.

Jak pokazano w Tabeli 3, szczep ERI2 poddano pięciu zmianom pożywki, co powodowało zmianę obserwowanych produktów w obydwie strony od kwasu octowego jako dominującego produktu do etanolu jako dominującego produktu. Wykazano użyteczność zarówno ograniczania pantotenianem jak i ograniczania kobaltem do wytwarzania etanolu przez ten szczep. Trzykrotnie zmieniano pracę szczepu C-01, stosując regulowanie składu pożywki i ponownie wykazano, że zarówno ograniczanie pantotenianem jak i ograniczanie kobaltem są mechanizmami wytwarzania etanolu. Pracę szczepu PETC zmieniono tylko jeden raz, z wytwarzaniem etanolu przez ograniczanie kobaltem. Każdy z tych szczepów wykazał wyższe stopnie konwersji H2 przy wytwarzaniu jako dominującego produktu kwasu octowego, a nie etanolu. Dzieje się tak ponieważ kwas octowy wytwarzany jest w warunkach ograniczania transferu masy (ograniczanie ilości gazu przenikającego do kultury bakteryjnej), podczas gdy etanol wytwarzany jest przy ograniczaniu składników odżywczych i dlatego też dostarczany jest nadmiar gazu, a to ma negatywny wpływ na konwersję gazu. Małe ilości octanu są zawsze obecne w strumieniu produktów gdy dominującym produktem jest etanol. Jednakże, gdy kwas octowy jest dominującym produktem, etanol zazwyczaj nie jest obecny w mierzalnych ilościach. Poprzez zmianę dominującego produktu, od etanolu do kwasu octowego - na drodze regulowania składu pożywki - wykazano, że bardzo trudne było pozbycie się wszelkich, nawet śladowych ilości etanolu. Zupełne usunięcie etanolu nastąpiło dopiero po kilku tygodniach nieprzerwanej pracy na pożywce zwiększającej produkcję kwasu octowego.

P r z y k ł a d 9. Działanie w trybie ustalonym, z zawracaniem komórek i bez zawracania

Ostatecznym celem handlowym wytwarzania etanolu z CO, CO2 i H2 jest osiągnięcie wysokich stężeń etanolu w stanie ustalonym, przy jednoczesnym otrzymywaniu wysokiego stosunku etanolu do octanu oraz wysokiej wydajności. Dane stanu ustalonego przy wytwarzaniu etanolu z gazu bogatego w CO, zawierającego 20% H2, 65% CO, 10% CO2 i 5% CH4, przy zastosowaniu szczepu C-01 C. Ijungdahlii, w przepływowym CSTR (bez zawracania komórek) pokazano w Tabeli 4. W tej tabeli GRT oznacza czas retencji gazu (stosunek objętości cieczy do szybkości przepływu gazu na wlocie), LRT oznacza czas retencji cieczy (stosunek objętości cieczy do szybkości przepływu cieczy), zaś XRT oznacza czas retencji komórek (średnia ilość czasu, którą komórki spędzają w reaktorze). Jak stwierdzono w Tabeli 4, uzyskiwano stężenia etanolu 17,5 do 33 g/l, a wydajność etanolu była w zakresie od 14,4 do 21,1 g/Ldoba.

Podobne wyniki przedstawiono dla produkcji etanolu z gazu mniej bogatego w CO. Gaz użyty w doświadczeniu stosującym C. Ijungahlii C-01 bez zawracania, dla którego rezultaty przedstawiono w Tabeli 5, zawierał 16% H2, 27% CO, 6% CO2, i 51% N2. W przypadku tego gazu uzyskano stężenia etanolu w zakresie od 11 do 26 g/l, przy 2,0 do 5,0 g/l octanu obecnego w charakterze produktu wtórnego. Wydajność etanolu była w zakresie 11,1 do 20,1 g/Ldoba. Stężenie komórek, przedstawione w Tabeli 5, wyznaczono na podstawie ciężaru suchych komórek.

Na koniec, w Tabeli 6 poniżej pokazane są dane stanu ustalonego dla konwersji gazu zawierającego 50% H2, 45% CO i 5% CH4 w reaktorze CSTR z zawracaniem komórek, z zastosowaniem C. Ijungdahlii 0-52 (ATCC Accession No. 55989). Uzyskano stężenia etanolu 18 do 23,5 g/l i stężenia octanu 3,0 do 5,7 g/l. Wydajność etanolu była w zakresie od 21,1 do 39,0 g/Ldoba.

P r z y k ł a d 10. Wysoka wydajność etanolu w ciśnieniowym reaktorze CSTR z zawracaniem komórek

Prowadzono pracę wysokociśnieniowego reaktora AUTOKLAV™ (Buchi) w trybie CSTR, z cyrkulacją kultury bakteryjnej i z zawracaniem komórek, stosując szczep C-01 C. Ijungdahlii do wytwarzania etanolu z CO, CO2 i H2. Pracę reaktora prowadzono przy ciśnieniu 0,307 MPa (30 psig); podawano gaz zawierający 62% H2, 31% CO i 5% C2H6. Czas retencji gazu wynosił 1,14 minuty (w przeliczeniu na ciśnienie atmosferyczne), co oznacza faktyczny czas retencji gazu równy 3,5 minuty Ciekłą pożywkę, zawierającą nadmiar soli, witamin i metali śladowych podawano do reaktora o pojemności 600 ml, przy czasie retencji cieczy 3,6 godziny. Wartość pH była równa 4,5, szybkość mieszania 825 obrotów/min. W tych warunkach stężenie komórek wynosiło 8 g/l, stopień przemiany CO był równy 90% i stopień przemiany H2 był równy 40%. Strumień produktów zawierał 20 g/l etanolu i 2,75 g/l octanu. Wydajność etanolu była równa 150 g/Ldoba.

W innym reaktorze wysokociśnieniowym AUTOKLAV™ (Buchi), którego pracę prowadzono w trybie CSTR z cyrkulacją kultury i z zawracaniem komórek, stosowano szczep C-01 C. Ijungdahlii, pod ciśnieniem ok. 6 atm (75 psig) i podawano syngaz zawierający 55% H2, 30% CO, 5% CH4 i 10%

PL 205 622 B1

CO2. Czas retencji gazu wynosił 1 minutę (w przeliczeniu na ciśnienie atmosferyczne) co odpowiada faktycznemu czasowi retencji gazu 6,0 minut. Ciekłą pożywkę, zawierającą nadmiar soli, witamin i metali śladowych podawano do reaktora przy czasie retencji cieczy równym 1,62 godziny. Czas retencji komórek wynosił 24 godziny, wartość pH była 4,5 i szybkość mieszania była równa 800 obrotów/min.. W tych warunkach stężenie komórek wynosiło 2,0 g/l, stopień przemiany CO był równy 95% i stopień przemiany H2 był równy 60%. Strumień produktów zawierał 25 g/l etanolu i 3 g/l octanu. Wydajność etanolu była równa 369 g/Ldoba.

P r z y k ł a d 11. Rozruch z macierzystej kultury bakteryjnej, w obecności nadmiaru H2

Rozruch z zastosowaniem inokulum szarży periodycznej, pobranej z kultury macierzystej, zapewnia zdrowe inokulum, wolne od zanieczyszczeń ale, jako procedura zaszczepiania, nie zawsze kończy się sukcesem z uwagi na występowanie tu raczej małej gęstości komórek, szczególnie gdy parametry sposobu, takie jak szybkość przepływu gazu i szybkość mieszania, są zwiększane zbyt gwałtownie zaraz po zaszczepieniu.

W tym przykładzie omawia się rozruch z zastosowaniem szarży periodycznej inokulum, pobranej z kultury macierzystej. W celu przygotowania kultur macierzystych do zaszczepiania reaktora, kultury C. Ijungdahlii, szczep C-01 (ATCC Accession No. 55988), namnażano w 150 ml butelkach na surowicę, w atmosferze CO, CO2 i H2, w bogatej pożywce zawierającej 1 g/l ekstraktu drożdży i 1 g/l tryptykazy, w roztworze soli i witamin. Zastosowano stężenie witamin w pożywce, odpowiadające zawartości 0,4 ml wodnego roztworu zawierającego 50,5 mg/l pantotenianu wapnia, 20,6 mg/l d-biotyny i 50,6 mg/l chlorowodorku tiaminy - w 1 litrze pożywki (0,4 ml/l). Butelki poddano inkubacji w 37°C, w inkubatorze z wytrząsarką. Kultury namnażano do uzyskania fazy wzrostu eksponencjalnego, co wyznaczano na podstawie inspekcji wizualnej. Przy każdym zaszczepieniu około 90 ml kultury macierzystej przenoszono z butelek na surowicę do 1 litra pożywki, co odpowiada 9% objętości zaszczepienia. Poniżej opisano zaszczepienie zakończone powodzeniem. W celu uzyskania powodzenia w zaszczepianiu, przedstawiona tutaj w ogólnym zarysie procedura może być powtórzona kilkakrotnie.

Przy uzyskaniu zaszczepienia zakończonego powodzeniem, 90 ml inokulum dodano do 1-litrowej szarży pożywki podstawowej (przedstawionej w Tabeli 1), zawierającej 0,4 ml/l witamin i soli (t = 0). Szybkość mieszania była równa 240 obrotów/min., wartość pH wynosiła 5,3, temperatura była równa 38,5°C, a czas retencji gazu (w przepływie ciągłym) wynosił 110 minut. Strumień gazu zasilającego zawierał 62% H2, 31% CO i 7% C2H6. Po 13 godzinach (t = 13 godz.) stwierdzono pewien stopień przemiany CO, a w czasie t = 23 godz. zwiększono szybkość mieszania z 240 do 300 obrotów/min. Czas retencji gazu został zmniejszony do 100 minut w czasie t = 27 godzin, a dalszego zmniejszenia czasu retencji gazu dokonano po czasie t = 46 godzin. Szybkość mieszania była też zwiększana w inkrementach po 100 obrotów/min. w czasie t = 28 godz., 59 godz., 72 godz. i 85 godz.

Po czasie t = 110 godzin układ działał przy czasie retencji gazu równym 80 minut i szybkości mieszania 600 obrotów/min. Stężenie komórek było równe 0,5 g/l, a stopień przemiany CO był równy 35%. Nadal nie było konwersji H2, ale nastąpiło nagromadzenie małych ilości etanolu i octanu (po ok. 1 g/l) w brzeczce kultury bakteryjnej w szarży periodycznej. Wysiłki czynione aż do tego momentu głównie miały na celu wzrost komórek w reaktorze.

W czasie t = 120 godzin rozpoczęto przepływ pożywki, przy zastosowaniu tych samych warunków jak dla pożywki podstawowej, z szybkością 0,4 ml/min. Następnie rozpoczęto działanie programu zwiększającego nominalne wartości szybkości przepływu gazu, szybkości mieszania i szybkości przepływu pożywki, podczas gdy jednocześnie starannie utrzymywano układ w warunkach nadmiaru H2. Po czasie t = 210 godzin stężenie etanolu było równe 17 g/l, stężenie octanu 1 g/l, stężenie komórek było 1,6 g/l, konwersja CO była bliska 100% i konwersja H2 była 90%. Produktywność etanolu osiągnęła 11,4 g/Ldoba.

Ponownie rozpoczęto działanie programu stopniowych wzrostów szybkości przepływu gazu. Równocześnie zwiększano ilości witamin (zobacz: Tabela 1) tak, aby doprowadzić szybkość dodawania witamin do 0,7 ml/l pożywki. W czasie t = 610 godz. reaktor wytwarzał 20 g/l etanolu i około 2 g/l octanu. Konwersja CO była bliska 100%, a konwersja H2 była równa 85%. Produktywność etanolu osiągnęła wartość 14 g/Ldoba.

P r z y k ł a d 12. Rozruch z zastosowaniem zaszczepki z już istniejącego reaktora CSTR

Rozruch reaktora CSTR z zastosowaniem ciągłej zaszczepki z już istniejącego CSTR jest znacznie szybszy i bardziej niezawodny niż rozruch z szarż w butelkach z kulturą macierzystą. Praca reaktora CSTR zawierającego czysty szczep C-01 C. Ijungdahlii (ATCC Accession No. 55988), który już niemal zaprzestał wytwarzania etanolu i wytwarzał jako produkty obecne w fazie ciekłej: 2-3 g/l

PL 205 622 B1 etanolu, 7-8 g/l octanu oraz około 0,3 g/l butanolu, została wznowiona z zastosowaniem ciągłego inokulum z istniejącego reaktora CSTR.

CSTR, z którego pobierano inokulum, wytwarzał około 17 g/l etanolu i 1-2 g/l octanu, podczas działania przy czasie retencji gazu równym 25 minut, czasie retencji cieczy równym 32 godziny, szybkości mieszania 650 obrotów/min., w temperaturze 38,5°C i przy pH 4,66. Stężenie komórek było równe 1,7 g/l, konwersja CO była bliska albo równa 100%, a konwersja H2 85%.

Rozpoczęto ciągłe dodawanie inokulum (t = 0) i jednocześnie zmniejszono szybkość mieszania do 500 obrotów/min., a także szybkość retencji gazu została ustawiona na 38 minut. Odpływ z reaktora produkcyjnego (0,5 ml/min.) służył jako inokulum ciągłe dla reaktora CSTR poddawanego zaszczepieniu, przy czym zaszczepianie ciągłe miało miejsce w ciągu kilku do kilkunastu godzin. W czasie t = 5 godzin (5 godzin po zapoczątkowaniu zaszczepiania ciągłego) zaobserwowano konwersję gazu i zwiększono szybkość mieszania do 700 obrotów/min. Ciągłe zaszczepianie przerwano po t = 28 godz. Konwersja gazu ulegała ciągłej poprawie, umożliwiając ciągły wzrost szybkości przepływu gazu (obniżenie czasów retencji gazu) oraz wzrost szybkości mieszania do 750 obrotów/min. W czasie t = 30 godz., konwersja CO była równa 95%, a konwersja H2 była równa 80%. Stężenie etanolu było 13 g/l, zaś stężenie octanu było 1,5 g/l i utrzymywało się na poziomie 1,4 g/l przez czas znacznie przewyższający 100 godzin. W tym czasie wydajność etanolu była 10 do 15 g/Ldoba.

P r z y k ł a d 13. Przywracanie normalnego trybu pracy po wystąpieniu ostrego zaburzenia pracy układu według sposobu

Praca reaktora CSTR z zawracaniem komórek, zawierającego szczep C-01 C. Ijungdahlii, zasilanego w sposób ciągły gazem i pożywką ciekłą oraz wytwarzającego 15-35 g/l etanolu i 0-5 g/l octanu w stanie ustalonym (np. Przykład 1) jest zaburzona na skutek nieprzewidzianych zmian warunków procesu, np. trudności mechanicznych w reaktorze. Zaburzenie układu reaktora może być albo niewielkie, jak krótki wzrost szybkości przepływu gazu, który powoduje krótkotrwałą inhibicję substratem, albo znaczne, takie jak długotrwały wzrost szybkości przepływu gazu, który ostatecznie prowadzi do zwiększonego wytwarzania kwasu octowego i ostrzejszej inhibicji cząsteczkowym kwasem octowym.

Krótkotrwałe zaburzenia są łatwe do skorygowania, poprzez zwykłe ponowne ustawienie zaburzonego parametru (na przykład, obniżenie przepływu gazu do jego początkowej wartości) i monitorowanie przebiegu pracy reaktora w celu upewnienia się, że zaburzenie nie spowodowało długotrwałych problemów.

Jednakże inhibicja kwasem octowym jest problemem poważniejszym. Jeśli w wyniku długotrwałej inhibicji substratem kultura wytwarza nadmiar cząsteczkowego kwasu octowego - należy najpierw wyeliminować problem, który doprowadził do nadmiaru kwasu octowego, taki jak dodanie nadmiaru składnika odżywczego, nagromadzenie się CO2 albo rozmaite problemy mechaniczne. Nadmiarowy kwas octowy, który szybko prowadzi do inhibicji produktem, jest następnie usuwany z układu przez zwiększanie szybkości przepływu cieczy aby wymyć z układu kwas octowy (i, niestety, etanol). Gdy już poziom octanu jest poniżej 3-5 g/l, szybkość przepływu cieczy jest ponownie ustawiana, a reaktor poddaje się ponownie albo nadmiarowi podawanego H2, albo ograniczaniu witaminami albo kobaltem (z zawracaniem komórek albo bez zawracania). Przywracanie reaktora do stanu normalnego obejmuje zmniejszanie szybkości przepływu gazu aby uniknąć inhibicji substratem i/albo szybkości mieszania, zanim nastąpi wymycie komórek i ich liza. Następnie szybkość mieszania oraz szybkość przepływu gazu są zwiększane, jak to opisano w Przykładzie 1.

Według jednego szczegółowego przykładu, reaktor CSTR z zawracaniem komórek, zawierający szczep C-01 C. Ijungdahlii, wytwarzający etanol i kwas octowy z CO, CO2 i H2, rozpoczął wytwarzanie kwasu octowego w odpowiedzi na pewien problem mechaniczny. Do reaktora 2100 ml podawano gaz zawierający 62% H2, 31% CO i 7% C2H6, przy czasie retencji gazu równym 15 minut, szybkości mieszania 600 obrotów/min. oraz przy pH równym 4,86. Czas retencji cieczy był równy 23 godziny, czas retencji komórek był równy 68 godzin. Roztwór witamin B (wodna mieszanina 50,5 mg/l pantotenianu wapnia, 20,6 mg/l d-biotyny i 50,6 mg/l chlorowodorku tiaminy) był obecny w ciekłej pożywce, zawierającej sole i witaminy w stężeniu 0,4 ml roztworu witamin w litrze pożywki (zobacz Tabela 2). Stężenie etanolu spadło do 7 g/l, natomiast stężenie octanu wzrosło do 7 g/l, co stanowi warunki, które ani nie odpowiadają stabilnemu prowadzeniu pracy reaktora, ani nie są ekonomiczne przy wytwarzaniu etanolu. Stężenie komórek było równe 2,4 g/l, konwersja CO wynosiła 85%, a konwersja H2 25%.

Strategia zastosowana do przywrócenia reaktora do stanu normalnego obejmowała początkowo bardzo znaczne zmniejszenie szybkości przepływu gazu podawanego do reaktora, po czym stopniowo przywracano poprzednie warunki pracy reaktora w obecności nadmiaru H2. Szybkości dopływu

PL 205 622 B1 cieczy do reaktora nie zmniejszano, aby uniknąć w tym przypadku inhibicji produktem, ponieważ stężenie octanu nie przekraczało bardzo znacznie dopuszczalnego poziomu. Zamiast tego, zezwolono na stopniowy spadek stężenia octanu do poziomu niepowodującego inhibicji, jednocześnie wprowadzono zmniejszoną szybkość przepływu gazu, a następnie prowadzono pracę reaktora w obecności nadmiaru H2. Szczegółowa procedura przywracania reaktora do stanu normalnego jest dyskutowana poniżej.

Zawracanie komórek zostało przerwane i szybkość przepływu gazu została bardzo znacznie zmniejszona (o 70%) do takiej, która odpowiadała czasowi retencji gazu równemu 62 minuty, podczas gdy jedynie w niewielkim stopniu dostosowano czas retencji cieczy z 23 do 30 godzin (t = 0). Stężenia witamin w medium nie zmieniono. Przy takiej zmianie w szybkości podawania gazu, konwersja CO wzrosła do 98%, a konwersja H2 wzrosła do 80%. Co ważniejsze, w układzie występował nadmiar H2, o czym świadczy zmniejszenie się ilości CO2 w gazie wylotowym z 19% do 5%. Wraz z początkiem występowania nadmiaru H2 stężenie octanu zmalało, natomiast stężenie etanolu wzrosło. Na przykład w czasie t = 66 godz. (66 godzin po zaprzestaniu zawracania komórek), stężenie octanu zmalało do 4 g/l, a stężenie etanolu wzrosło nieznacznie do 7,5 g/l.

Obecność nadmiaru H2 (oraz obniżone stężenie octanu) umożliwiło następnie zwiększanie szybkości podawania gazu, najpierw powoli, a następnie z większą szybkością. W czasie t = 215 godz. czas retencji gazu był równy 29 minut, stężenie etanolu 12 g/l, a stężenie octanu było równe 3 g/l. Wydajność etanolu wynosiła 8 g/Ldoba. CO₂ był obecny w gazie wylotowym na poziomie 6%, konwersja CO była równa 98%, a konwersja H2 była równa 80%. W czasie t = 315 godz. stężenie etanolu było równe 16 g/l, a stężenie octanu było 4 g/l, również przy dobrej konwersji gazu i przy czasie retencji gazu równym 20 minut. Wydajność etanolu wynosiła 11 g/Ldoba. W czasie t = 465 godz. stężenie etanolu osiągnęło 20 g/l, przy obecności 3,5-4 g/l towarzyszącego octanu. Wydajność etanolu była równa 16 g/Ldoba. Czas retencji gazu został obniżony do 16 minut, przy konwersjach CO i H₂ odpowiednio równych 95% i 73%. Warunki te utrzymywano w czasie prawie 200 godzin nieprzerwanej pracy reaktora, wykazując, że układ reaktora odzyskał zdolność do wytwarzania etanolu oraz zachował właściwie niezmienione poprzednie warunki działania.

P r z y k ł a d 14. Sposób wytwarzania etanolu przy dostarczaniu CO w nadmiarze

W celu wykazania przesunięcia od wytwarzania kwasu octowego do wytwarzania etanolu spowodowanego obecnością wysokich stężeń CO - wykonano proste doświadczenie w wysokociśnieniowym reaktorze zbiornikowym do pracy w trybie ciągłym, z mieszaniem i z zawracaniem komórek. Zanim wykonano to doświadczenie, prowadzono pracę reaktora, zawierającego szczep C-01 C. Ijungdahlii, pod ciśnieniem 0,238 MPa - 0,27 MPa (20-25 psig), podając gaz zawierający 57% H2, 36% CO i 7% C2H6. Czas retencji gazu był poniżej 2 minut, czas retencji cieczy był równy 38 godzin, czas retencji komórek był równy 28 godzin, szybkość mieszania 600 obrotów/min., przy temperaturze 38°C. W tych warunkach, konwersja CO była zmienna i średnio była równa 85%, a konwersja H2 była zmienna i średnio była równa 20%. Stężenie komórek było równe około 2,5 g/l i strumień produktów zawierał 9 g/l etanolu i 3 g/l octanu.

Jako pierwszy krok przygotowujący do doświadczenia, w celu zapewnienia, że nadmiar CO nie będzie obecny, zwiększono czas retencji gazu. Ciśnienie utrzymywano na poziomie 0,256 MPa 0,265 MPa (23-24 psig). Wartość pH śledzono wystarczająco długo, aby mieć pewność, że utrzymywała się ona stabilnie w przedziale operacyjnym 4,5-4,6. Do zwykle podawanego gazu o składzie 47% H2, 47% CO i 6% C2H6 domieszano czysty CO, przy czasie retencji gazu 2,3 minuty. Następnie wraz z upływem czasu monitorowano: wartość pH w reaktorze, skład gazów wylotowych i skład strumienia produktów.

Tabela 7 pokazuje składy produktu i zmiany pH w funkcji czasu po dodaniu do układu uzupełniającego CO. Po trzydziestu minutach od dodania CO, pH w reaktorze wzrosło do 5,25 i kultura bakteryjna dokonała przesunięcia z 1,5 4 g/l (0,0257 mola/l) octanu do 1,12 g/l (0,0243 mola/l) etanolu. Wzrost pH nastąpił w wyniku przemiany wolnego kwasu octowego w etanol. Tej zmianie towarzyszyło zmniejszenie konwersji CO z 91% do 71%. Po zmniejszeniu szybkości cyrkulacji kultury z 1,82 l/min. do 0,68 l/min., wartość pH w reaktorze spadła, ale stosunek stężenia etanolu do octanu pozostawał niezmieniony.

Pięćdziesiąt minut po wprowadzeniu CO stężenie etanolu było równe 11,29 g/l i stężenie octanu było równe 1,75 g/l. W tym czasie wyłączono dopływ nadmiarowego CO i stężenie etanolu oraz pH zaczęły spadać, zaś stężenie octanu zaczęło podnosić się. Zmniejszenie wartości pH nastąpiło wskutek konwersji etanolu do cząsteczkowego kwasu octowego. Przesunięcie od etanolu do kwasu octowego, spowodowane dostarczaniem nadmiaru CO, jest więc odwracalne.

PL 205 622 B1

P r z y k ł a d 15. Zawracanie wody w celu zminimalizowania wytwarzania octanu

Zawracanie wody z procesu na powrót do bioreaktora fermentacyjnego po destylacji prowadzonej w celu odzysku etanolu ma zasadnicze znaczenie do zminimalizowania wytwarzanego odcieku i do uzyskiwania maksymalnej wydajności etanolu z reaktora, a także do ograniczenia wytwarzania kwasu octowego. Destylacja okazała się być najbardziej ekonomicznym sposobem zatężania etanolu o stężeniu, 15-35 g/l otrzymywanego z reaktora, do etanolu 95%-owego. Następnie w celu dalszego zatężenia etanolu do pożądanego stężenia stosuje się adsorpcję na sitach molekularnych. W trakcie wykonania destylacji na szczycie kolumny wytwarzany jest 95% etanol/woda. Woda jest wytwarzana w czasie destylacji jako pozostałość podestylacyjna. Pozostałość podestylacyjna zawiera kwas octowy z reaktora wytworzony w czasie fermentacji (3-5 g/l octanu) i wszystkie składniki odżywcze niezużyte w czasie fermentacji albo nierozłożone przez energię cieplną w czasie destylacji, takie jak metale śladowe i inne minerały. Zawracanie składników odżywczych minimalizuje ilość odcieku wymagającego neutralizacji, jak też ilość składników odżywczych, które muszą następnie być dodane do bioreaktora fermentacyjnego. Zawracanie octanu zapobiega tworzeniu dalszych ilości kwasu octowego przez ustalanie równowagi pomiędzy etanolem i kwasem octowym. Tak więc w przypadku zastosowania zawracania wody nie zachodzi wytwarzanie kwasu octowego netto. Zawracanie ilości większych niż 3-5 g/l octanu może spowodować w reaktorze inhibicję kwasem octowym. Tak więc w wyniku zawracania wody zawierającej octan, substraty: CO, CO2 i H2 mogę być przeprowadzone w etanol, będący tu jedynym produktem.

Tabela 8 przedstawia wyniki fermentacji gazu zawierającego 50% CO, 45% H2 i 5% CH4 prowadzonej z zastosowaniem szczepu O-52 C. Ijungdahlii i z zawracaniem wody. Podczas tych doświadczeń przesącz uzyskany z sączenia na filtrze z pustych włókien, stosowanym w celu zawracania komórek, był przesyłany do destylacji. Po usunięciu etanolu, wodę odsączano na filtrze o średnicy porów 0,2 μm aby usunąć wszystkie wytrącone produkty uboczne. Ułamek wody zawracanej w porównaniu z całkowitą ilością wody (stosowanej jako medium) podawanej do reaktora w tych doświadczeniach był w zakresie 25-100%. Doświadczenie z 100%-owym zawracaniem wody trwało prawie 500 godzin albo około 20 czasów retencji cieczy. Jak to przedstawiono w wynikach odpowiadających 100%-owemu zawracaniu wody, nie doszło do wytworzenia kwasu octowego netto. Nawet doszło w końcu do zużycia małej ilości kwasu octowego. Produktywność etanolu była w zakresie 12 do 27 g/Ldoba.

P r z y k ł a d 16. Dwustopniowy układ CSTR z podawaniem pantotenianu do stopnia wzrostu

Odpowiednie podawanie pantotenianu do stopnia wzrostu jest zmienną, która musi być optymalizowana. Typowe wyniki uzyskane z Reaktora Stopnia Wzrostu z zastosowaniem C. Ijingdahlii, szczep C-01, opisano w Przykładzie 11 i 12, z wyjątkiem tego, że nieco więcej kwasu octowego będzie wytworzone w obecnym reaktorze ponieważ do Stopnia Wzrostu podaje się dodatkowe ilości pantotenianu albo kobaltu, w celu zapewnienia zdrowej i stabilnej kultury bakteryjnej. Użyto witaminy (roztwór wodny zawierający 50,5 mg/l pantotenianu wapnia, 20,6 mg/l d-biotyny i 50,6 mg/l chlorowodorku tiaminy) w stężeniu 0,7-0,8 ml/l medium. Do CSTR Stopnia Wytwarzania (reaktor z zawracaniem komórek) podaje się odciek z reaktora Stopnia Wzrostu i Stopnia Produkcyjnego CSTR następuje wytwarzanie etanolu jako produktu głównego. Stężenie pantotenianu podawanego do tego reaktora jest znacznie niższe niż w Stopniu Wzrostu, zaledwie 0,1-0,2 ml mieszanki witamin (roztwór wodny zawierający 50,5 mg/l pantotenianu wapnia, 20,6 mg/l d-biotyny i 50,6 mg/l chlorowodorku tiaminy)/l pożywki. Czas retencji gazu w tym Stopniu Produkcyjnym wynosił 11-30 minut, czas retencji cieczy około 20 godzin, czas retencji komórek był 30-50 godzin, zaś szybkość mieszania była równa 800-900 obrotów/min. Wartość pH była równa 5,0, a temperatura 38°C. Po uzyskaniu przez reaktor stanu ustalonego, czas retencji gazu utrzymywano na stałym poziomie równym 11 minut, czas retencji cieczy ustawiono na 19 godzin, czas retencji komórek był ustalony na poziomie 37 godzin, zaś szybkość mieszania wynosiła 900 obrotów/min. Konwersja CO średnio była równa 96% i konwersja H2 średnio była równa 60%. Stężenie etanolu ustaliło się na poziomie 25-30 g/l, przy octanie obecnym w ilości 3 g/l. Produktywność etanolu była równa 31,6-37,9 g/Ldoba.

P r z y k ł a d 17. Regulowanie parametrów fermentacji w celu uniknięcia przystosowania do niskiego ograniczającego stężenia pantotenianu wapnia

Przystosowania się kultury bakteryjnej w bioreaktorze fermentacyjnym do niskiego ograniczającego stężenia pantotenianu wapnia unika się poprzez regulowanie parametrów fermentacji (szybkości podawania gazu, szybkości podawania cieczy, szybkości mieszania, cząstkowego ciśnienia H2), przy jednoczesnym unikaniu większych zmian w składnikach odżywczych, a raczej utrzymując stosunkowo stałe stężenie podawanej pożywki, w sposób przedstawiony poniżej.

PL 205 622 B1

Podczas rozruchu laboratoryjnego reaktora CSTR New Brunswick Scientific Bioflo™ z C. Ijungdahlii, szczep C-01, podawano strumień ciekłej pożywki zawierający witaminy, śladowe minerały i sole potrzebne do odżywiania kultury. Stężenie pantotenianu w pożywce było równe 20 μg/l, co jest stężeniem, które, w połączeniu z małą szybkością podawania medium, zapewnia, że na gram wytworzonych komórek podawane jest więcej niż 100 μg pantotenianu wapnia (nadmiar pantotenianu), z uwagi na małą ilość wytwarzanych w bioreaktorze komórek. Podobnie, stężenie kobaltu w pożywce było równe 1 ppm, co jest stężeniem zapewniającym, że kobalt również jest obecny w nadmiarze. Natomiast większą niż 95% konwersję CO i większą niż 80% konwersję H2 osiągano na drodze: (a) utrzymywania ciśnienia cząstkowego H2 w gazie wylotowym na poziomie ponad 55,72 kPa (0,55 atm) przez podawanie gazu nie zawierającego CO2, zawierającego 63,3% H2, 31,4% CO i 5,3% C2H6 i w ten sposób uzyskiwanie wartości stosunku: H2 podawany/(2CO który uległ przemianie plus 3CO2 który uległ przemianie) większej od 1, a także (b) poprzez staranne regulowanie szybkości podawania gazu i szybkości mieszania. Na skutek uzyskiwania w miarę upływu czasu tych wysokich wartości konwersji, narasta stężenie komórek od początkowego poziomu bliskiego 0 g/l do około 1,5 g/l.

Ponieważ stężenie pantotenianu podczas takiego rozruchu utrzymywane jest na stałym poziomie, ilość μg pantotenianu na gram wytworzonych komórek stopniowo zmniejsza się, aż do momentu, gdy jest poniżej 15 μg pantotenianu/g wytworzonych komórek, co stanowi warunki prowadzące do ograniczania pantotenianem. Tak więc układ dorasta do ograniczania pantotenianem. Wysokie stosunki produktów etanol:octan uzyskuje się w trakcie rozruchu poprzez nadmiar H2. Alternatywnie, w początkowych etapach rozruchu zezwala się na wytworzenie się w reaktorze nadmiaru kwasu octowego, zaś stosunek produktów zostaje później poddany kontroli przez ograniczanie pantotenianem.

P r z y k ł a d 18. Ograniczanie kobaltu w reaktorze

Do kultury C. Ijungdahlii, szczep ERI2, podawano 62 do 3500 μg kobaltu/g komórek wytworzonych w reaktorze podczas wytwarzania kwasu octowego z CO, CO2 i H2, co stanowi rodzaj warunków, przy których reaktor nie był ograniczany kobaltem (ani nie ulegał żadnemu innemu ograniczaniu, z wyjątkiem zdolności transferu gazu do kultury bakteryjnej), przy czym nie wykryto etanolu w strumieniu produktów. Podczas ograniczania kobaltem wytwarzania etanolu z CO, CO2 i H2, do szczepu C-01 C. Ijungdahlii podawano 33 do 48 μg kobaltu/g wytworzonych komórek, jednocześnie utrzymując wszystkie pozostałe składniki odżywcze w nadmiarze. W tych warunkach szczep C-01 wytworzył 18 do 26 g/l etanolu i około 4 g/l octanu.

P r z y k ł a d 19. Unikanie przystosowania do niskiego ograniczającego stężenia kobaltu

Przystosowania się kultury bakteryjnej w bioreaktorze fermentacyjnym do niskiego ograniczającego stężenia kobaltu unika się poprzez regulowanie parametrów fermentacji (szybkości podawania gazu, szybkości podawania cieczy, szybkości mieszania, zawartości CO2), przy jednoczesnym unikaniu większych zmian w składnikach odżywczych, a raczej utrzymuje się stosunkowo stałe stężenie podawanej pożywki, według poniższego opisu.

Podczas rozruchu laboratoryjnego reaktora CSTR New Brunswick Scientific Bioflo™ z C. Ijungdahlii, szczep C-01, podawano strumień ciekłej pożywki zawierający witaminy, śladowe minerały i sole potrzebne do odżywiania kultury. Stężenie kobaltu w pożywce było rćwne75 ppb (części na miliard), co jest stężeniem, które, w połączeniu z małą szybkością podawania pożywki, zapewnia, że na gram wytworzonych komórek podawane jest więcej niż 50 μg kobaltu (nadmiar kobaltu), z uwagi na niewielkie wytwarzanie komórek w bioreaktorze. Podobnie, stężenie pantotenianu w pożywce było równe 20 μg/l, co jest stężeniem zapewniającym, że pantotenian również jest obecny w nadmiarze. Natomiast osiągano większą niż 95% konwersję CO i większą niż 80% konwersję H2 przez utrzymywanie ciśnienia cząstkowego H2 w gazie wylotowym na poziomie ponad 0,55 atm poprzez podawanie gazu nie zawierającego CO2 ale zawierającego duże ilości H2, a także przez staranne regulowanie szybkości podawania gazu i szybkości mieszania. Na skutek uzyskiwania w miarę upływu czasu tych wysokich wartości konwersji, narasta stężenie komórek od początkowego poziomu bliskiego 0 g/l do około 1,5 g/l. Ponieważ stężenie kobaltu podczas takiego rozruchu utrzymywane jest na stałym poziomie, ilość μg kobaltu na gram wytworzonych komórek stopniowo zmniejsza się, aż do momentu, gdy jest mniejsze niż 50 μg kobaltu/g wytworzonych komórek, co stanowi warunki prowadzące do ograniczania kobaltem. Tak więc układ dorasta do ograniczania kobaltem. Wysokie wydajności etanolu są uzyskiwane podczas rozruchu dzięki zastosowaniu nadmiaru podawanego H2. Alternatywnie, w początkowych etapach rozruchu zezwala się na wytworzenie się w reaktorze nadmiaru kwasu octowego, zaś stosunek produktów zostaje później poddany kontroli poprzez ograniczanie kobaltem.

PL 205 622 B1

P r z y k ł a d 20. Dostarczanie nadmiaru H2

Podczas pracy laboratoryjnego reaktora AUTOKLAV™ (Buchi) jako reaktora CSTR z recyrkulacją cieczy i zawracaniem komórek, bakterie C. Ijungdahlii pracowały przy nadmiarze witamin, śladowych minerałów i soli koniecznych do odżywienia kultury. Reaktor pracował w warunkach nadmiaru H2 w gazie podawanym, w takim stopniu, że stosunek liczby moli H2 podawanego do sumy podwojonej liczby moli CO, który uległ konwersji i potrojonej liczby moli CO2, który uległ konwersji był równy 5,67. Gdyby ten stosunek nie był większy od 1,0, nadmiar H2 nie mógłby zaistnieć w reaktorze i wytwarzanie etanolu spowodowane nadmiarem H2 nie mogłoby mieć miejsca. Ponadto, ciśnienie cząstkowe H2 w gazie wylotowym wynosiło 264,46 kPa (2,61 atm), co jest wartością przewyższającą wielkość 0,4 atm wymaganą przy wytwarzaniu etanolu na skutek nadmiaru H2. Wreszcie, stosunek ciśnienia cząstkowego H2 do ciśnienia cząstkowego CO2 w gazie wylotowym był równy 10,8 8, co jest poziomem większym od wartości 3,0, zapewniającej, że obecna jest ilość H2 wystarczająca do zużycia całości pierwiastka węgla będącego do dyspozycji. W tych warunkach reaktor wytworzył prawie 26 g/l etanolu i mniej niż 3 g/l octanu. Wydajność etanolu przewyższała 200 g/Ldoba. Jeśli którykolwiek z tych powyższych warunków nie jest spełniony, wówczas reaktor nie może wytwarzać etanolu na skutek obecności nadmiaru H2. Innym aspektem obfitości H2 jest, że prowadzi ona do dodatkowej ilości zredukowanej ferredoksyny powstającej w wyniku utlenienia H2 przez hydrogenazę.

P r z y k ł a d 21. Łagodzenie inhibicji substratem CO

Laboratoryjny CSTR New Brunswick Scientific Bioflo™ pracujący przy szybkości mieszania 800 obrotów/min. wykazuje stężenie CO na wylocie równe 10%, chociaż jego pracę uprzednio prowadzono z zaledwie 5% CO w gazach na wylocie. Poprzez zmniejszenie szybkości mieszania do 600 obrotów/min. powstrzymano inhibicję CO i stężenie CO na wylocie powróciło do 5%. Powoduje to zwiększone pochłanianie H2, co jest warunkiem koniecznym do efektywnego wykorzystania całości gazu podawanego do reaktora.

P r z y k ł a d 22. Transfer masy

Jako przykład nadmiarowego transferu masy prowadzącego do wytwarzania etanolu, rozważmy laboratoryjny reaktor CSTR z zawracaniem komórek, zawierający szczep ERI2 C. Ijungdahlii, działający bez ograniczania składnikami odżywczymi albo nadmiarem H2 albo CO w podawanym gazie. To znaczy, że pantotenian jest podawany w ilości większej niż 100 μg na gram wytworzonych komórek i kobalt jest podawany w ilości większej niż 100 μg na gram wytworzonych komórek. H₂ jest obecny w gazie wylotowym na poziomie około 20,27 kPa (0,2 atm), zaś szybkość właściwa pochłaniania CO jest mniejsza niż 0,3 mmola CO/g komórekmin. Szybkość mieszania jest równa 800 obrotów/min. W tych warunkach kultura wytwarza tylko kwas octowy (brak jest etanolu w strumieniu produktów). Jeśli szybkość mieszania zostanie szybko zwiększona do 900 obrotów/min., albo szybkość podawania gazu zostanie zwiększona o około 10%, wówczas w strumieniu produktów obserwuje się etanol, do czasu, gdy stężenie komórek wzrośnie w celu pochłaniania gazu albo do czasu, gdy kultura bakteryjna obumrze na skutek inhibicji substratem.

P r z y k ł a d 23. Kontrolowanie inhibicji wywołanej produktem - kwasem octowym

W laboratoryjnym reaktorze CSTR, który wytwarza 8 g/l kwasu octowego i 10 g/l etanolu, czas retencji cieczy zmniejszono z 24 godzin do 12 godzin na okres 36 godzin, co stanowiło próbę odmycia nadmiaru kwasu octowego z reaktora, który to nadmiar ogranicza zdolność kultury do wytwarzania większej ilości etanolu. Wszystkie pozostałe parametry operacyjne i warunki podawania pożywki utrzymano na stałym poziomie. Po tym czasie (36 godzin) czas retencji cieczy ponownie ustawiono na 24 godziny - w wyniku uzyskano strumień produktów zawierający 3 g/l octanu oraz 15 do 25 g/l etanolu. Konieczne jest przeprowadzenie kilku powtórzonych prób zmniejszania czasu retencji cieczy w celu zlikwidowania inhibicji produktem. Alternatywnie, w celu dopuszczenia kontroli nadmiarem H2 dodaje się H2 do strumienia podawanego gazu, ponieważ nadmiar CO2 może również prowadzić do uprzywilejowania wytwarzania kwasu octowego względem etanolu. Takie usprawnienia w sposobie zabezpieczają przed wytwarzaniem nadmiarowego kwasu octowego, i w ten sposób zabezpieczają przed niekorzystnym stosunkiem produktów i niską wydajnością etanolu. Następnie, powtarza się zastosowanie nadmiaru H2 w gazie podawanym do reaktora albo ograniczanie stężenia składnika odżywczego w fazie ciekłej.

P r z y k ł a d 24. Dostarczanie nadmiaru tlenku węgla Bakterie C. Ijungdahlii, szczep ERI2, którym podawano nadmiar pożywki (nadmiar pantotenianu i kobaltu) i przy braku dużych ilości H2 w podawanym gazie, wykazywały szybkość właściwą pochłaniania CO od 0,23 do 0,48 mmola/gmin., zaś w strumieniu produktów nie stwierdzono etanolu. Jednakże kiedy bakteriom C. Ijungdahlii, szczep

PL 205 622 B1

C-01, w podobny sposób dostarczano nadmiar pożywki, przy braku dużych ilości H2 w podawanym gazie ale w warunkach, w których nadmiar CO powodował wytwarzanie etanolu, właściwe pochłanianie CO było równe od 0,67 do 1,34 mmola/g-min. W tych warunkach kultura bakteryjna wytwarzała 9,9 do 12,0 g/l etanolu i 2,6 do 2,7 g/l octanu.

P r z y k ł a d 25. Kontrolowanie stosunku produktów upustem komórek

Fermentacja substratu gazowego (30% CO, 15% H2, 10% CO, 45% N2) ma miejsce w reaktorze CSTR (pH = 5,0, temperatura = 38°C, ciśnienie= 20 psig) z zastosowaniem bakterii C. Ijungdahlii, szczep C-01, z zawracaniem komórek (czas retencji komórek = 40 godzin i czas retencji cieczy = 6 godzin), zaś wzrost kultury nie jest ograniczony przez kobalt, pantotenian wapnia albo dowolny inny składnik odżywczy. Podczas wzrostu kultury, uzyskuje się taką gęstość komórek, przy której pochłanianie właściwe (mmole CO na gram suchych komórek na minutę) ma wartość poniżej 0,5 i wytwarzanie kwasu octowego jest uprzywilejowane w porównaniu z wytwarzaniem etanolu. Aby zapobiec takiej sytuacji, zwiększa się szybkość upustu komórek w celu uniknięcia zwiększenia gęstości komórek, tak, że stałe stężenie komórek jest zachowane na poziomie dostatecznie niskim do utrzymania pochłaniania właściwego powyżej 0,5 mmola CO na gram suchych komórek na minutę. W wyniku tych czynności czas retencji komórek ulega zmniejszeniu do wartości między 6 i 25 godzin.

T a b e l a 1. Poż ywka do wytwarzania etanolu

Składnik	Ilość na litr
2 g/l FeCl2-4H2O	10 ml
85% H3PO4	0,05 ml
Metale śladowe MPFNa	20 ml
(NH4)2HPO4	0,60 g
NH4CI	2,00 g
NaCl	0,20 g
KCl	0,15 g
MgCl2-6H2O	0,50 g
CaCl2-2H2O	0,20 g
Cysteina-HCl-^O	0,25 g
Roztwór witaminb	zmienna0

^a Metale Śladowe MPFN zawierają (w litrze roztworu): 10 ml 85% H₃PO₄, 0,10 g ZnSO₄-7H₂O, 0,03 g MnCl₂-4H₂O, 0,3 g H3BO3, 0,20 g CoCbO^O, 0,02 g CuCh^^O, 0,04 g NiChO^O, 0,03 g NaMoO4-2H2O, 2,00 g FeC^M^O, 0,01 g Na2SeO3 oraz 0,10 g Na2WO4-2H2O ^b Roztwór witamin zawiera 20,6 mg/l d-biotyny, 50,6 mg/l chlorowodorku tiaminy oraz 50,5 mg/l soli wapniowej kwasu dpantotenowego ^c Ilość waha się znacznie, od 0,3-0,5 ml przy zaszczepianiu, do 0,7-0,8 ml przy dużych szybkościach przepływu gazu.

T a b e l a 2. Porównanie podsumowujące parametry według sposobu oraz wyniki dla przykładowych metod regulowania

Przykład Nr	Mecha- nizm kontrolny	Stężenia produktów	Wydaj- ność etanolu [g/l-doba]	Dostarczony pantotenian ^g pantotenianu / g wytworzonych komórek]	Dostarczony kobalt ^g kobaltu/g wytworzonych komórek]	H2 Podany (2CO konw.+ 3CO2 konw.)	Ciśnienie cząstkowe H2 w gazie wylotowym kPa (atm)	Pochłanianie właściwe CO [mmol/g komórek-min]
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
		Eta- nol [g/l]	Octan [g/l]
3	Transfer masy	0	10-13	0	1575-3150	1734-3468	0,46	6,08-7,1 (0,06-0,07)	0,275-0,48

PL 205 622 B1 cd. tabeli 2

1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
3	Transfer masy	0	10-14	0	2250-3600	62-99	0,875	11,14-20,26 (0,11-0,20)	0,33-0,40
4	Pantote- nian	15-19	1,5	11.5 - 14.5	18-24	5000-6660	1,0 3	55,72-64,84 (0,55-0,64)	0,23-0,30
4	Pantote- nian	18	3	17,4	8,1	3960	1,14	60,79-65,86 (0,60-0,65)	0,33
5	Kobalt	26	4	15,6	15,2	33	0,94	63,83 (0,63)	0,37
5	Kobalt	18	4	27,0	85,7	47,6	1,03	60,79 (0,60)	0,50
6	Nadmiar CO	9,9	2,6	29,0	97	83,6	1,0 9	162,12 (1,6)	1,34
6	Nadmiar CO	12,0	2,7	60,0	294	735	0,30	60,79 (0,6)	0,67
7	Nadmiar H2	10,0	3,3	6,7	900-1125	991-1239	1,96	70,92-88,15 (0,7-0,87)	0,28-0,35
7	Nadmiar H2	25,96	2,85	215-240	46	460	5,67	264,45 (2,61)	1,68

T a b e l a 3. Podsumowanie przesunięcia składu produktów dla szczepów Clostridium Ijungdahlii

Szczep C. Ijungdahlii	Ograniczanie pożywki	Stężenie komórek* [g/l]	Konwersja gazu	Stężenie Produktu
CO	H2	Etanol	Octan
ERI2	Przyrost kwasu octowego	1,1	90	80	0	10
ERI2	Ograniczanie pantotenianem	0,3	88	20	2,5	0
ERI2	Przyrost kwasu octowego	0,55	90	85	1,0	5,5
ERI2	Ograniczanie pantotenianem	0,5	90	20	10	1,0
ERI2	Przyrost kwasu octowego	0,8	100	93	1	7
ERI2	Ograniczanie kobaltem	1,3	80	20	9	3
C-01	Przyrost kwasu octowego	1,2	96	90	1	8
C-01	Ograniczanie pantotenianem	0,8	60	30	4	0
C-01	Przyrost kwasu octowego	1,2	96	90	<1	9
C-01	Ograniczanie kobaltem	2,5	80	20	17	2
PETC	Przyrost kwasu octowego	0,8	65	55	2	10
PETC	Ograniczanie kobaltem	1,0	95	55	8	1

* Na podstawie ciężaru suchych komórek

T a b e l a 4. Dane stanu ustalonego dla konwersji gazu bogatego w CO do etanolu z zastosowaniem C. Ijungdahlii, szczep C-01

GRT [min.]	LRT [godz.]	Szybkość mieszania [Obr./min.]	Stężenie komórek* [g/l]	Konwersja gazu [%]	Produkty [g/l]	Produktywność etanolu [g/l-doba]
CO	H2	Etanol	Octan
1	2	3	4	5	6	7	8	9
13	32,4	700	2,44	91	57	21,6	3,9	16,0
11,93	25,7	750	2,51	92	54	20,6	3,6	19,2

PL 205 622 B1 cd. tabeli 4

1	2	3	4	5	6	7	8	9
12,67	25,6	750	2,60	93	61	18.7	4,7	17,6
10	24,5	750	2,75	92	43	20,4	6.1	20,0
11,54	23,8	750	2,65	92	40	20,4	5,3	20,6
12,10	23,8	750	2,77	88	18	21	3.1	21,1
13,8	23,8	750	2,70	90	25	18	2,5	18,2
12,7	23,8	750	2,70	92	35	20	3.8	20,2
13,3	24,0	800	2,70	85	10	17,5	5,0	17,5
14,81	31	750	2,50	92	30	25	2,5	19,4
16.9	31	750	3,60	90	18	23	3,0	17,8
18,5	33	750	2,60	94	50	24	3,5	17,5
17.2	34	750	2,50	91	40	24	3,5	16.9
18,5	34	750	2,30	95	63	23	4,0	16,2
19,2	40,6	750	2,70	94	50	28,5	4,0	17,4
19,0	55	750	2,70	94	20	33	4,0	14,4

* Na podstawie ciężaru suchych komórek

T a b e l a 5. Dane stanu ustalonego dla konwersji gazu zawierającego 27% CO, 16% H2, 51% N2 do etanolu, z zastosowaniem C. Ijungdahlii, szczep C-01. Bez zawracania komórek.

GRT [min.]	LRT [godz.]	Szybkość mieszania [obr/min.]	Stężenie komórek* [g/l]	Konwersja gazu [%]	Produkty [g/l]	Produktywność etanolu [g/l-doba]
CO	H2	Etanol	Octan
8,89	23.8	750	2,3	84	57	11	2,5	11,1
8,3	23,8	900	2,6	89	55	12	2,0	12,1
8,3	27,7	900	2,7	89	47	15	3,0	13,0
7,1	33,3	900	3,0	86	37	19	3,0	13,7
7,4	33,3	900	3,0	87	40	19.5	3,0	14,1
6,34	33,3	900	3,0	86	37	21	3,5	15,1
6,18	33,3	900	3,0	86	41	20,9	3.1	15,1
5,72	34,3	900	3,0	85	40	22,1	3.8	15,5
5,12	33	900	3,7	85	40	25,0	4,0	18,2
4,59	33	900	4,1	83	33	25	3,5	18,2
4,59	29	900	4,0	80	35	23	4,0	19,0
4,76	29	900	3,9	90	35	19	5,0	15,7
4,25	28	900	4,2	80	30	23	3,0	19,7
5,5	37	900	3,4	84	40	23	3,0	14,9
5,26	31	900	3,8	84	50	23	3,0	17,8
5,71	31	900	3,7	80	28	26	3,5	20,1
6,25	31	900	3,75	82	30	25,5	3,0	19,7
6,66	31	900	3,6	86	64	22	4,0	17,0

PL 205 622 B1

T a b e l a 6. Dane stanu ustalonego dla konwersji gazu zawierającego 50% H2, 45% CO i 5% CH4 do etanolu, z zastosowaniem izolatu szczepu O-52 w reaktorze CSTR, z zawracaniem komórek

GRT [min.]	XRT [godz.]	LRT [godz.]	Stężenie komórek* [g/l]	Konwersja gazu [%]	Produkty [g/l]	Produktywność etanolu [g/l-doba]
CO	H2	Etanol	Octan
12,5	46,4	23,2	3.8	96,3	81,2	20,4	4,4	21,1
9,7	43,2	17,3	4,9	86,7	49,9	21,1	3,5	29,3
9,2	43,2	17,3	4,6	89,4	64,5	20,5	5,1	28,4
7,5	43,2	17,3	5,0	81.8	42,1	22,2	3,7	30,8
9,2	49,4	17,3	4,6	85,3	52,1	21,1	4,4	29,3
8,4	46,0	16,1	4,5	85,2	61,4	20,8	5,1	31,0
6,8	54,3	16,3	4,7	84,7	57,7	23,4	5,7	34,5
7,2	54,3	16,3	4,0	83,1	55,2	19,0	4,4	28,0
7,4	54,3	16,3	5,0	86,6	66,7	21,9	5,5	32,2
6,4	55,6	16,7	5,6	83,3	53,1	23,5	4,9	33.8
6,2	41,6	14,5	5,7	82,5	55,0	20,1	5,0	33,3
6,0	41,6	14,5	6,0	82,5	50,0	21,5	3,0	35,6
6,0	34,2	12,0	5,7	84,0	56,0	19,5	4,5	39,0
5,7	34,2	12,0	5,7	81,0	45,0	18,0	4,5	36,0

* Na podstawie ciężaru suchych komórek

T a b e l a 7. Wyniki pH i analizy próbek ciekłych dla przesunięcia składu produktów od octanu do etanolu, w obecności nadmiaru CO

Czas	pH	Stężenie komórek* [g/l]	Etanol [g/l]	Octan [g/l]	Butanol [g/l]
0	4,69	2,4	10,3	3.1	0,3
30	5,28		11,4	1,5	0,3
35	5,28	2,4	11,6	1,6	0,3
50	4,98		11,3	1.8	0,3
80	4,73	2,4	10,9	2,9	0,3

* Na podstawie ciężaru suchych komórek

T a b e l a 8. Dane dla fermentacji gazu z zastosowaniem izolatu szczepu O-52, z zawracaniem wody i komórek

Czas [godz.]	Zawracanie wody [%]	Stężenie komórek [g/l]	Konwersja gazu	Produkty	Produktywność etanolu [g/l-doba]
CO [%]	H2 [%]	Etanol [g/l]	Octan [g/l]	Octan netto [g/l]
0-75	25	2,1	95	68	12	4	4	12
75-193	50	2,1	95	75	15	6	5	15
193-462	75	2,1	92	60	17	5	4	17
462-554	50	1,6	85	30	17^13	5	3	12-16
554-669	75	2,6	92	75	13^19	5	3	12-18
669-943	100	3,0	92	70	23	6	3	23
943-1087	100	3,0	92	60	23	6	0	23
1087-1232	100	2,7	92	60	23	6	0	23
1232-1375	100	3,0	91	60	27	6	-1	27
1375-1534	100	3,5	88	35	23	5	0	23

PL 205 622 B1

Claims (10)

1. Ciągły sposób wytwarzania etanolu w beztlenowej fermentacji bakteryjnej z substratu gazowego, zawierającego monotlenek węgla, polegający na hodowaniu w bioreaktorze fermentacyjnym bakterii Clostridium Ijungdahlii, zdolnej do wytwarzania etanolu w ciekłej pożywce, zawierającej pantotenian wapnia, przy pH poniżej 5,5, przy czym stężenie wolnego kwasu octowego w bioreaktorze jest mniejsze niż 5 g/l, a stosunek etanolu do octanu w beczce fermentacyjnej w bioreaktorze jest w zakresie od 1:1 do 20:1, znamienny tym, że pantotenian wapnia podaje się do bioreaktora fermentacyjnego w ilości 0,5 do 50 μg/g suchej masy komórek bakterii i w bioreaktorze utrzymuje się szybkość wychwytu monotlenku węgla co najmniej 0,5 mmola CO/g suchej masy komórek bakterii/minutę, uzyskując w ten sposób stabilny stan produkcji etanolu z produktywnością większą niż 10 g/l/doba.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że bioreaktor fermentacyjny obejmuje reaktor wzrostu, który podaje wytworzoną brzeczkę fermentacyjną do drugiego bioreaktora, w którym wytwarzana jest większość etanolu.

3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że dodatkowo obejmuje etapy usuwania brzeczki fermentacyjnej z bioreaktora, destylacji etanolu z brzeczki oraz odzyskiwania etanolu.

4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że dodatkowo obejmuje etap zawracania wody zawierającej octan z etapu destylacji na powrót do bioreaktora.

5. Sposób według zastrz. 1-4, znamienny tym, że bakterie Clostridium Ijungdahlii są wybrane ze szczepów PETC, ERI2, O-52 i C-01.

6. Sposób według zastrz. 1-5, znamienny tym, że substrat gazowy jest wybrany z (a) monotlenku węgla, (b) monotlenku węgla i wodoru, (c) monotlenku węgla, ditlenku węgla i wodoru oraz (d) któregokolwiek ze składników (a) do (c) z azotem lub metanem.

7. Sposób według zastrz. 1-6, znamienny tym, że dodatkowo obejmuje etap wybrany spośród następujących:

(a) zmienianie co najmniej jednego parametru wybranego z grupy obejmującej: skład pożywki, szybkość podawania pożywki, szybkość podawania wody, ciśnienie robocze, robocze pH, skład substratu gazowego, szybkość podawania gazu, szybkość mieszania brzeczki fermentacyjnej, stężenie produktu, gęstość komórek, inhibicja przez substrat oraz ich kombinacje;

(b) okresowe usuwanie komórek bakteryjnych z bioreaktora do uzyskania stężenia komórek mniejszego niż stężenie stabilne, przy którym bakterie zużywają całość gazu redukującego albo substratów odżywczych w bioreaktorze;

(c) zwiększanie szybkości podawania wody, gdy część obecnego w brzeczce fermentacyjnej octanu przypadająca na wolny kwas octowy przewyższa 2 g/l, zwiększając w ten sposób wszystkie niepożądane wzrosty stężenia wolnego kwasu octowego;

(d) zmniejszanie szybkości podawania substratu gazowego w celu zlikwidowania inhibicji przez substrat oraz utrzymania wydajności;

(e) zmniejszanie szybkości mieszania w celu zlikwidowania inhibicji przez substrat oraz utrzymania wydajności;

(f) dostarczanie do bioreaktora fermentacyjnego substratu gazowego z szybkością od 0,3 do 2 mmoli CO/gram suchych komórek bakteryjnych w bioreaktorze/ minutę;

(g) zwiększanie ilości CO obecnej w bioreaktorze, tak że ilość CO jest większa od ilości wymaganej do utrzymania bakterii w stabilnym stężeniu komórek bakteryjnych, przy którym zużywałyby one całość dostarczonego CO;

(h) utrzymanie CO obecnego w bioreaktorze w ilości, która utrzymuje wytwarzanie etanolu w przewadze nad wytwarzaniem octanu;

(i) podawanie do bioreaktora fermentacyjnego pożywki zawierającej dodatkowo kobalt, którego ilość w bioreaktorze jest utrzymywana w zakresie od 5 do 100 μg kobaltu/gram suchych komórek bakterii i (j) podnoszenie pH hodowli powyżej 4,5.

8. Sposób według zastrz. 1-7, znamienny tym, że dodatkowo obejmuje etap zapobiegania przystosowaniu się bakterii w bioreaktorze fermentacyjnym do ilości pantotenianu wapnia przez dostosowanie parametrów wybranych z grupy obejmującej szybkość podawania gazu, szybkość podawania cieczy, szybkość mieszania, szybkość podawania pożywki i ciśnienie cząstkowe wodoru.

9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że dodatkowo obejmuje dostarczanie nadmiaru redukującego gazu, którym jest wodór, do bioreaktora fermentacyjnego.

PL 205 622 B1

10. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że przeprowadza się etap (i) określony w zastrz. 7 i zapobiega si ę przystosowaniu się bakterii w bioreaktorze do ilości kobaltu przez utrzymywanie stałego stężenia kobaltu i dostosowanie parametrów wybranych z grupy obejmującej szybkość podawania gazu, szybkość podawania cieczy, szybkość mieszania, szybkość podawania pożywki i ciśnienie cząstkowe wodoru.