DD149810A1 - Verfahren zur kultivierung von mikroorganismen - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kultivierung von Mikroorganismen auf CO&ind2!-H&ind2!-O&ind2!. Die Erfindung gehoert in das Gebiet der mikrobiologischen Eiweiszgewinnung und ist in die IPK C 12 B einzuordnen. Die Erfindung verfolgt das Ziel, ein Verfahren zu entwickeln, das eine stabile Prozeszfuehrung unter unsterilen Bedingungen zur Gewinnung eines eiweiszreichen Endproduktes ermoeglicht. Gleichzeitig soll eine technologisch optimale Variante fuer die Versorgung der Organismen mit der Kohlenstoff- und Stickstoffquelle erarbeitet werden. Diese Zielstellung wird erreicht, indem der Bakterienstamm HB 201- ZIMET 612 unter unsterilen Bedingungen bei einer Temperatur von 32 bis 34 Grad C und einem pH-Wert von 6,0 bis 6,5 unter Normaldruck oder erhoehtem Druck kultiviert wird. Der fuer das Wachstum notwendige Kohlenstoff und Stickstoff wird in Form von geloestem Ammoniumcarbonat kontinuierlich in den Fermentor dosiert.Durch diese Masznahme werden die Partialdruecke und damit die Geloest-Konzentrationen fuer H&ind2! und O&ind2! erhoeht und bessere Gasnutzungsgrade erreicht.Die Biomasse enthaelt bis zu 70% Rohprotein und alle lebenswichtigen Aminosaeuren.
Description
-A-
Titel
Verfahren zur Kultivierung von Mikroorganismen
Die Erfindung gehört in das Gebiet der mikrobiologischen Eiweißgewinnung, in die IPK C 12 b.
Die Erfindung kann eingesetzt werden in Anlagen, in denen gasförmige Kohlenwasserstoffe mit Hilfe von Bakterien mikrobiologisch umgesetzt werden·
Es sind bereits Verfahren bekannt zur Kultivierung von Mikroorganismen, insbesondere Bakterien, die auf CO2, H2 und Luft wachsen, wobei alle 3 Substrate in gasförmigem Zustand zugeführt werden. /Lafferty, R. M.; Veding, V.; Robra, K· H.; Schlegel, H. G.; "Permentationstechnik mit Knallgasbakterien", Dechema-Monographien 71 (1972), Nr. 1351 - 1369/.
Die angegebenen Begasungsverhältnisse liegen in den Bereichen von O2 : CO2 : H2 = 1 : 1 : 8 über 2:3:6 bis 2:1 : 7· Zur Biomasseproduktion werden hauptsächlich Mikroorganismen der Gattungen Hydrogenomonas oder Alkaligenes /Schlegel, M. G.; Lafferty, R. M.: "Hovel energy and carbon sources· Production of biomass from hydrogen and carbon dioxid"; Advan. Biochem. Eng. 1 (1970), 143 - 68/ sowie Mycobacteriumstämme /PR - PS Hr· 2062188; Inh» Nippon Oil Co./ eingesetzt·
Pur diese mesophilen Organismen werden optimale Temperaturen von 25 bis 35 0C /FR - PS Nr. 2062188 "Verfahren zur Gewinnung neuer Bakterien der Gattung Mycobacterium"/ sowie ein optimaler pH-Bereich von 6,8 bis 7,2 /Lafferty, R· M.; Moser, A. j Steiner, W·: "Die Gewinnung von Einzellerprotein unter Verwendung von Knallgasbakterien"; Schriftenreihe der GBP (Juni 1975) 1, S. 87 - 92/ angegeben.
Die Gase COp, 0«, Hp werden durch Hydrogenomonas in den Verhältnissen 1 : 1,2 : 4,5 bis 1 : 1,9 : 6,6 aufgenommen. /Ammann, E. C. B.; Reed, L« L.; Durichek, J. E. Jr.: "Gas consumption and growth rate of Hydrogenomonas eutropha in continuous culture"; Appl. Microbiol« 16 (1968), 822 26/· Es werden spezifische Yföchstumsraten von ,u = 0,4 b. für Hydrogenomonas angegeben /Keßler und Mitarbeiter; Mikrobiologija T. XLIV, 2, 1975, S. 219 - 223; Lafferty, R. M.; Veding, V·; Robra, K. M.; Schlegel, H. G.: "Fermentationstechnik mit Knallgasbakterien1·; Dechema-Monographien 71 (1972) Nr. 1351 - 1369/.
Alle diese Verfahren haben den Nachteil, daß sie die Kohlenstoff- und Energiequelle in gasförmigen Zustand einsetzen, was zu einer Herabsetzung der Eartialdrücke für Og und Hg und dementsprechend zu einer Verringerung der gelösten Mengen dieser schwerlöslichen Gase führt.
Ein weiterer Nachteil der bekannten Verfahren besteht darin, daß sie unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden müssen. Für eine technische Realisierung resultiert daraus ein hoher InvestitionskostenaufwaneU
Schließlich muß bei den beschriebenen Verfahren die Stickstof fversorgung der Organismen als ungünstig angesehen werden. Diese erfolgt über die Hahrlösungsdosierung oder die pH-Regelung mit wäßrigen Ammoniaklösungen. Falls eine Stickstoffverbindung über die Nährlösung in den Fermentor geführt wird, ergibt sich durch die pH-Regelung mit Lauge eine hohe Salzbelastung der Mikroorganismen.
Die Erfindung verfolgt das Ziel, ein Verfahren zu entwickeln, das eine stabile Prozeßführung unter unsterilen Bedingungen und einer optimalen Versorgung der Organismen mit der C- und ΪΓ-Quelle zur Gewinnung eines eiweißreichen Endproduktes ermöglicht.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, eine Produktionskultur zu selektieren und einzusetzen, die im un~ sterilen Prozeß stabil kultiviert werden kann· Desweiteren ist durch geeignete technologische Maßnahmen der Partialdruckanteil und damit die gelöste Menge der Komponenten Hp und 0« zu erhöhen, wodurch eine Vergrößerung des Gasnut zungsgrades erreicht wird,
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß ein besonders selektierter Stamm kontinuierlich auf einem COp-Hg-Luft-Gemisch bzw. auf einem Gemisch aus Hp und Luft bei Dosierung von (NBL)2CO^ und/oder ЛН.HCO^ in einer streng bilanzierten Nährlösung unter unsterilen Bedingungen kultiviert wird, wobei gleichzeitig durch die Verwendung von (1OL)2COo bzw· ГОдНСОо die Versorgung der Organismen mit Stickstoff abgedeckt sowie das Ausmaß der notwendigen pH-Regelung auf ein Minimum herabgesetzt werden. Der Stamm wurde aus Flußschlamm der Puhne (Hebenfluß der Elbe) über eine Anreicherungskultur isoliert. Die Anreicherungskultur wurde nach einem besonderen Selektionsprogramm im kontinuierlichen Prozeß gewonnen.
Der Stamm trägt die Bezeichnung HB 201 - ZIMEO? B 612 und wurde hinterlegt in der Hinterlegungsstelle der IMET-KuI-türenSammlung im Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften der DDR, 69 Jena, Beuthenbergstraße 11·
Die Kultivierung erfolgt mit einem Nährmedium folgender Zusammensetzung:
| H3Po4 | (80 %ig) | H2O | H2O | 0,027 | ml/1 |
| KH2PO4 | H2O | H2O | 0,035 | g/l | |
| MgSO4 . | 7 | H2O | H2O | 25 | mg/1 |
| CuSO4 · | 5 | H2O | 0,785 | mg/1 | |
| MhSO4 . | 4 | H2O | 1,825 | mg/1 | |
| PeCl2 . | 4 | H2O | 1,201 | mg/1 | |
| ZnCl2 | H2O | 0,322 | mg/1 | ||
| CoSO4 . | 7 | . 18 | 0,036 | mg/1 | |
| UiSO4 . | 7 | . 4 | 0,109 | mg/1 | |
| Al2(SO4 | >3 | ♦ 2 | 0,186 | mg/1 | |
| Ca(NO3) | 2 | 0,883 | mgA | ||
| Na2MoO4 | . 6 | 0,041 | mg/1 | ||
| H3BO3 | 1,286 | mgA | |||
| CrCl3 | 0,077 | mg/1 | |||
Diese Salze sind ausreichend für 1 g Biomassetrockensubstanz, zur Erlangung höherer Biomassekonzentrationen wird die Nährlösung proportional dem BiomasseZuwachs höher bilanziert· Die Versorgung der Organismen mit der C- und N-Quelle erfolgt über die Dosierung einer Lösung von (NH4)2C0o bzw. NH4HCO3, deren Konzentration entsprechend der Produktivität des Prozesses so eingestellt wird, daß das Organismenwachstum nicht limitiert wird.
Infolge des amphoteren Verhaltens einer wäßrigen Ammoniumcarbonatlösung bleibt der pH-Y/ert des Kultivierungsmediums innerhalb des für die Fermentation gewünschten Intervalles und eine pH-Regelung erübrigt sich weitgehend.
Der mittels konventioneller Selektionsmethoden aus der Anreicherungskultur selektierte Haupttyp, Stamm HB 201, wird charakterisiert durch:
Zellmorphologie:
Koloniemorphologie
Physiologisches Verhalten:
Bei dem Stamm HB 201 handelt es sich um schwach bis stark vibrioid gekrümmte bewegliche Stäbchen (zuweilen bis 11/2 Spiralwindungen bildend), deren Größe 0,5 bis 0,8 χ 1 bis 2,5 /um beträgt. Die Zellen treten oft als Diploformen auf und reagieren gramnegativ· An den Zellpolen befinden sich oft phasenkontrastoptisch dichter als das übrige Plasma erscheinende Einlagerungen, die nicht immer lipophil reagieren· Im Plasma befinden sich häufig lipophile Einlagerungen·
Fach 3 bis 5 Tagen der Bebrütung bei 30 bis 32 0C bilden sich cremefarbene bis hellbeige, kreisrunde, glattrandige, konvexe Kolonien mit feuchtglänzender Oberfläche und butterartig schmieriger Konsistenz von 0,5 bis 1 mm Durchmesser·
Da auf Peρton - Glukoseagar ein nur sehr geringes Wachstum erfolgt, beziehen sich die Angaben auf Mineralagar unter C02/H2/ Luft (bzw· Op)-Atmosphäre.
Der Stamm wächst autotroph auf Mineralmedien, wenn die Gasatmosphäre H2» CO2 und O2 bzw. Luft enthält. Perner kann er auf folgenden Substanzen als einziger Kohlenstoffquelle wachsen: Acetat, Succinat, Pyruvat, Malonat, Acetamid und Äthanol. Demgegenüber erfolgt auf folgenden C-Quellen (als einzige C-Quelle)
Taxonomische Einordnung:
Weitere Merkmale:
kein Wachstum: Glukose, Fruktose, Galaktose, Mannose, Cellobiose, Maltose, Rhamnose, D-Ribose, D-Xylose, Mannit, m-Inosit, L-Alanin, L-Valin, L-Tryptophan, L-Serin und Asparagin· Der Stamm reagierte katalasepositiv und oxidasenegativ«
Auf Grund einiger Merkmalskombinationen ist keine genaue Einordnung nach Berge? (1974) möglich. Am wahrscheinlichsten erscheint die Zuordnung zum Teil 6 (Spiral and Curved Bacteria).
pH-Bereich 5,5 bis 7,2, optimaler Bereich 6,0 bis 6,5, Temperaturbereich 28 bis 36 0C, optimaler Bereich 32 - 34 0C, Begasungsverhältnis CO2 : O2 : H2 = 1 : 1,86 : 5,56 bis 1 : 2,6
'2 * W2 7,78.
Die maximale Wachstumsrate des Mikroorganismus HB 201 beträgt /I013x = 0,18 h. · Unter unsterilen Bedingungen ist dieser Organismus im Temperaturbereich von 28 bis 36 0C, bevorzugt bei 32 bis 34 0C, bei einem pH-Wert im Bereich von 5,5 bis 7,2, bevorzugt 6,0 bis 6,5, sowie einem Druck von 1 bis 15 atm kontinuierlich bei Verweilzeiten bis minimal 5,5 h kultivierbar· Es ist eine schleimfreie Fermentation im unsterilen Prozeß möglich· Durch Absenken des pH-Wertes auf 5,5 wird eine fast vollständige Reinheit der Kultur erreicht (95 % des Haupttyps nach Zellzahl, entspricht > 95 % Biomasseanteil).
Die Begasung erfolgt mit Kohlendioxid-Wasserstoff-Luft-
H,
1 : 1,86 : 5,56 bis
Gemischen von COp : Op
1 : 2,6 : 7,78.
Die Nährlösung wird mit Leitungswasser angesetzt und mit Phosphorsäure auf einen pH-Wert von ^ 3 eingestellt.
Dabei werden die Konzentrationen der Bestandteile der Nährlösung so gewählt, daß das Uährsalzangebot stets der
aktuellen Biomassekonzentration entspricht bzw· nur unwesentlich davon abweicht. Das Endprodukt des Prozesses ist eine Trockensubstanz, die bis zu 70 % Rohprotein und alle lebenswichtigen Aminosäuren aufweist* An nachfolgenden Beispielen wird die Erfindung näher erläutert.
In einem Rührfermentor wird 1 kg vorgezüchtetes Impfmaterial der Kultur HB 201 - ZBiET B 612 mit einer Konzentration von 2 bis 3 g/l eingesetzt« Die Temperatur wird auf 34 0C und die Verweilzeit auf 10 h eingestellt. Das Medium wird mit Hg, CO2 und Luft in einem Verhältnis von CO2 : O2 : H2 1 : 1,86 : 5,56 begast.
Die Regelung des pH-Wertes erfolgt mit einer 1 %igen Ammoniaklösung; damit wird gleichzeitig die Stickstoff-Versorgung der Organismen gewährleistet. Die für das Wachstum notwendigen Nährsalze werden als einheitliche Nährlösung, die durch Zugabe von HCl auf einen pH-Wert von gebracht wird, in den Permentor dosiert· Hachdem die Biomasse auf eine Konzentration von ca· 4 g/l angewachsen ist, wird die Verweilzeit auf 6 h herabgesetzt. Die Nährlösung wird stets der aktuellen Biomassekonzentration angepaßt und für 0,5 g BTS/1 überbilanziert· Die Stickstoffkonzentration des Kulturmediums wird zwischen 50 und 150 mg/1 gehalten· Unter diesen Bedingungen werden im stabilen kontinuierlichen Prozeß Biomassekonzentrationen von 3,3 g/l entsprechend einer Produktivität von 0,55 g/l · h erzielt; der Rohproteingehalt der Biomasse beträgt 64,4 %.
In einem Rühr fermen tor wird 1 kg vorge züchte te s Impfmaterial der Kultur HB 201 - ZIMET B 612 mit einer Konzentration von 2 bis 3 g/l eingesetzt.
Die Temperatur wird auf 34 0C und die Verweilzeit auf 10 h eingestellt. Das Medium wird mit H2, CO« und Luft in einem Verhältnis von CO2 : O2 : H2 = 1 : 1,86 ι 5,56 begast. Die Regelung des pH-Wertes erfolgt mit einer 1 %igen Ammoniaklösung; damit wird gleichzeitig die Stickstoff-Versorgung der Organismen gewährleistet· Die für das Wachstum notwendigen Uährsalze werden als einheitliche nährlösung, die durch Zugabe von HCl auf einen pH-Wert von 3 gebracht wird, in den Permentor dosiert« Nachdem die Biomasse auf eine Konzentration von ca. 4 gA angewachsen ist, wird die Verweilzeit auf 6 h herabgesetzt· Die Nährlösung wird stets der aktuellen Biomasse angepaßt und für 0,5 g BTS/1 überbilanziert. Anschließend wird die CO2-Begasung abgestellt und eine (UHj)2C0o-Lösung in den Fermentor dosiert. Die Gesamtbegasungsintensität wird nicht verändert, der O2- und H2-Partialdruck wird auf Kosten des CO2 im stöchiome tr i sehen Verhältnis erhöht.
Die dosierte (UH,)2C03-Menge entspricht 900 mg/1 · h (berechnet als CO2),
Nach Einstellen eines pH-Wertes von 6,8 erübrigt sich eine zusätzliche pH-Regulierung und ΪΓ-Versorgung.
Unter diesen Bedingungen werden im stabilen kontinuierlichen Prozeß Biomassekonzentrationen von 3,7 g/l entsprechend einer Produktivität von 0,61 g/l · h erzielt; der Rohproteingehalt der Biomasse beträgt 62.5 %·
Claims (1)
- ErfindungsanspruchVerfahren zur Kultivierung von Bakterien auf CO2-H2 in Gegenwart einer wäßrigen Mineralsalzlösung und eines freien Sauerstoff enthaltenden Gases, dadurch gekennzeichnet, daß der Bakterienstamm HB 201 - ZIMET B 612 kontinuierlich unter vorzugsweise unsterilen Bedingungen kultiviert wird, wobei die C- und Η-Quelle in Porin einer wäßrigen Losung von (NH., )oC0o und/oder KH,HCO- in den Permentor dosiert wird.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| DD21954880A DD149810A1 (de) | 1980-03-10 | 1980-03-10 | Verfahren zur kultivierung von mikroorganismen |
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Publications (1)
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| DD149810A1 true DD149810A1 (de) | 1981-07-29 |
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| DD21954880A DD149810A1 (de) | 1980-03-10 | 1980-03-10 | Verfahren zur kultivierung von mikroorganismen |
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| DD (1) | DD149810A1 (de) |
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1980
- 1980-03-10 DD DD21954880A patent/DD149810A1/de not_active IP Right Cessation
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