JP2002543843A - 変異体プロパンジオールデヒドロゲナーゼ - Google Patents
変異体プロパンジオールデヒドロゲナーゼInfo
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-
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
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- C12N1/205—Bacterial isolates
-
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- C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
- C12P7/18—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic polyhydric
-
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、変異体１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼおよび野生型微生物には通常は毒性のレベルである少なくとも１０５ｇ／ｌの１，３−プロパンジオールの濃度中で生育できる新規な微生物に関する。本発明は、変異体１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼを含む発現ベクターおよび宿主細胞並びに上記変異体１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼを含む細胞の使用を含む１，３−プロパンジオールの生産方法も提供する。
Description
【０００１】 本発明は、１，３−プロパンジオールに関して変更されたＫｍを有する変異体
１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼに関する。本発明は、１，３−プロ
パンジオールデヒドロゲナーゼの変異形態の核酸配列とアミノ酸配列を提供する
。本発明は、変異体１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼを含む発現ベク
ターおよび宿主細胞も提供する。 発明の背景 １，３−プロパンジオールは、ポリエステルファイバーの生産およびポリウレ
タンおよび環式化合物の製造において有力な利用性を有するモノマーである。１
，３−プロパンジオールの生産は１９９７年１１月１１日に発行された米国特許
第５，６８６，２７６号およびＷＯ９８／２１３４１に開示された。グルコース
からの１，３−プロパンジオールの生産のための一つの代表的な経路は以下の一
連の工程により達成することができる。グルコースが、解糖経路の酵素による一
連の工程において、ジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）と３−ホスホグリ
セルアルデヒド（３−ＰＧ）に変換される。次に、ＤＨＡＰのジヒドロキシアセ
トン（ＤＨＡ）への加水分解に続く還元によるか、またはＤＨＡＰのグリセロー
ル３−リン酸（Ｇ３Ｐ）への還元に続く加水分解の何れかによりグリセロールが
形成される。上記加水分解工程は、それらの基質に関して特異的または非特異的
であることが知られている幾多の細胞性ホスファターゼにより触媒され得るか、
または上記活性は組換えにより宿主細胞に導入され得る。上記還元工程は、ＮＡ
Ｄ+（またはＮＡＤＰ+）にリンクした宿主酵素により触媒され得るかまたは上記
活性は組換えにより宿主細胞に導入され得る。注目すべきは、ｄｈａレギュロン
が、等式３の可逆反応を触媒するグリセロールデヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．
１．１．６）を含むことである。
１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼに関する。本発明は、１，３−プロ
パンジオールデヒドロゲナーゼの変異形態の核酸配列とアミノ酸配列を提供する
。本発明は、変異体１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼを含む発現ベク
ターおよび宿主細胞も提供する。 発明の背景 １，３−プロパンジオールは、ポリエステルファイバーの生産およびポリウレ
タンおよび環式化合物の製造において有力な利用性を有するモノマーである。１
，３−プロパンジオールの生産は１９９７年１１月１１日に発行された米国特許
第５，６８６，２７６号およびＷＯ９８／２１３４１に開示された。グルコース
からの１，３−プロパンジオールの生産のための一つの代表的な経路は以下の一
連の工程により達成することができる。グルコースが、解糖経路の酵素による一
連の工程において、ジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）と３−ホスホグリ
セルアルデヒド（３−ＰＧ）に変換される。次に、ＤＨＡＰのジヒドロキシアセ
トン（ＤＨＡ）への加水分解に続く還元によるか、またはＤＨＡＰのグリセロー
ル３−リン酸（Ｇ３Ｐ）への還元に続く加水分解の何れかによりグリセロールが
形成される。上記加水分解工程は、それらの基質に関して特異的または非特異的
であることが知られている幾多の細胞性ホスファターゼにより触媒され得るか、
または上記活性は組換えにより宿主細胞に導入され得る。上記還元工程は、ＮＡ
Ｄ+（またはＮＡＤＰ+）にリンクした宿主酵素により触媒され得るかまたは上記
活性は組換えにより宿主細胞に導入され得る。注目すべきは、ｄｈａレギュロン
が、等式３の可逆反応を触媒するグリセロールデヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．
１．１．６）を含むことである。
【０００２】 グリセロール （反応） 3-HP ＋ H2O （等式１） 3-HP＋NADH＋H+ （反応） 1,3-プロパンジオール＋NAD+ (等式２) グリセロール＋NAD+ （反応） DHA＋NADH＋H+ （等式３） グリセロールは中間体３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド（３−ＨＰ）によ
り１，３−プロパンジオールに変換されることは、上で詳細に記載したとおりで
ある。中間体３−ＨＰは、宿主によりコードされ得るかまたは組換えにより宿主
へ導入され得るデヒドロゲナーゼ酵素によりグリセロールから生産される（等式
１）。このデヒドロゲナーゼは、グリセロールデヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．４．
２．１．３０）、ジオールデヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．１．２８）、ま
たはこの形質転換を触媒できるあらゆる他の酵素であり得る。グリセロールデヒ
ドロゲナーゼはｄｈａレギュロンによりコードされる。１，３−プロパンジオー
ルはＮＡＤ+（またはＮＡＤＰ+）リンクした宿主酵素により３−ＨＰ（等式２）
から生産されるかまたは上記活性が組換えにより宿主に導入され得る。１，３−
プロパンジオールの生産におけるこの最後の反応は、１，３−プロパンジオール
デヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．１．２０２）または他のアルコールデヒド
ロゲナーゼにより触媒され得る。
り１，３−プロパンジオールに変換されることは、上で詳細に記載したとおりで
ある。中間体３−ＨＰは、宿主によりコードされ得るかまたは組換えにより宿主
へ導入され得るデヒドロゲナーゼ酵素によりグリセロールから生産される（等式
１）。このデヒドロゲナーゼは、グリセロールデヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．４．
２．１．３０）、ジオールデヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．１．２８）、ま
たはこの形質転換を触媒できるあらゆる他の酵素であり得る。グリセロールデヒ
ドロゲナーゼはｄｈａレギュロンによりコードされる。１，３−プロパンジオー
ルはＮＡＤ+（またはＮＡＤＰ+）リンクした宿主酵素により３−ＨＰ（等式２）
から生産されるかまたは上記活性が組換えにより宿主に導入され得る。１，３−
プロパンジオールの生産におけるこの最後の反応は、１，３−プロパンジオール
デヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．１．２０２）または他のアルコールデヒド
ロゲナーゼにより触媒され得る。
【０００３】 Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ
ｆｒｅｕｎｄｉｉにおいては、グリセロールデヒドロゲナーゼ（ｄｈａＢ）、
１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ（ｄｈａＴ）、グリセロールデ
ヒドロゲナーゼ（ｄｈａＤ）、およびジヒドロキシアセトンキナーゼ（ｄｈａＫ
）の機能上リンクした活性をコードする遺伝子は、ｄｈａレギュロンに包含され
る。ＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒとＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ由来のｄｈａレギュロンは
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおいて発現されて、グリセロールを１，３
−プロパンジオールに変換することが示された。
ｆｒｅｕｎｄｉｉにおいては、グリセロールデヒドロゲナーゼ（ｄｈａＢ）、
１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ（ｄｈａＴ）、グリセロールデ
ヒドロゲナーゼ（ｄｈａＤ）、およびジヒドロキシアセトンキナーゼ（ｄｈａＫ
）の機能上リンクした活性をコードする遺伝子は、ｄｈａレギュロンに包含され
る。ＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒとＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ由来のｄｈａレギュロンは
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおいて発現されて、グリセロールを１，３
−プロパンジオールに変換することが示された。
【０００４】 当業界において開示された１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼの核酸
およびアミノ酸の配列は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＧｅ
ｎＢａｎｋ加盟番号Ｕ３０９０３（Ｗｉｌｌｉａｒ，１９９４，”Ｉｎｖｅｓｔ
ｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
１，３−ｐｒｏｐａｎｘｄｉｏｌ ｐａｔｈｗａｙ：Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚ
ａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｄｅｈ
ｙｄｒａｔａｓｅ ａｎｄ １，３−ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ ｏｘｉｄｏｒｅ
ｄｕｃｔａｓｅ”化学工学学位論文、ウイスコンシン−マジソン大学）；Ｃｉｔ
ｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉのＧｅｎＢａｎｋ加盟番号Ｕ０９７７１（
Ｄａｎｉｅｌ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ
１，３−ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｆｒｏｍ
Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅ ｆｒｅｕｎｄｉｉ：ｃｌｏｎｉｎｇ，ｓｅｑｕｅｎｃｉ
ｎｇ，ａｎｄ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｓｐ
ｏｎｄｉｎｇ ｇｅｎｅ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｊ．Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ．１７７：２１５１−２１５６）；およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕ
ｍ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍのＧｅｎＢａｎｋ加盟番号ＡＦ００６０３４（Ｌ
ｕｅｒｓ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｃｏｎｖｅｒｓｉ
ｏｎ ｔｏ １，３−ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ ｂｙ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ：ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ １，３−ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏ
ｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ．ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．
１５４：３３７−３４５）を含む。 発明の概要 本発明は、野生型Ｅ．ｂｌａｔｔａｅには通常毒性のレベルである少なくとも
１０５ｇ／ｌの１，３−プロパンジオールの存在下で生育できるＥ．ｂｌａｔｔ
ａｅの誘導体から単離された、変異体形態の１，３−プロパンジオールデヒドロ
ゲナーゼ（ＰＤＤ）の発見に関する。本発明は、よって、上記変異形態のＰＤＤ
が、通常は毒性のレベルの１，３−プロパンジオールに対してのＥ．ｂｌａｔｔ
ａｅの耐性に関連するとの発見に一部基づく。本発明は、この変異対ＰＤＤが１
，３−プロパンジオールとＮＡＤに関して変更されたＫｍを有するとの発見にも
一部基づく。
およびアミノ酸の配列は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＧｅ
ｎＢａｎｋ加盟番号Ｕ３０９０３（Ｗｉｌｌｉａｒ，１９９４，”Ｉｎｖｅｓｔ
ｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
１，３−ｐｒｏｐａｎｘｄｉｏｌ ｐａｔｈｗａｙ：Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚ
ａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｄｅｈ
ｙｄｒａｔａｓｅ ａｎｄ １，３−ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ ｏｘｉｄｏｒｅ
ｄｕｃｔａｓｅ”化学工学学位論文、ウイスコンシン−マジソン大学）；Ｃｉｔ
ｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉのＧｅｎＢａｎｋ加盟番号Ｕ０９７７１（
Ｄａｎｉｅｌ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ
１，３−ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｆｒｏｍ
Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅ ｆｒｅｕｎｄｉｉ：ｃｌｏｎｉｎｇ，ｓｅｑｕｅｎｃｉ
ｎｇ，ａｎｄ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｓｐ
ｏｎｄｉｎｇ ｇｅｎｅ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｊ．Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ．１７７：２１５１−２１５６）；およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕ
ｍ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍのＧｅｎＢａｎｋ加盟番号ＡＦ００６０３４（Ｌ
ｕｅｒｓ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｃｏｎｖｅｒｓｉ
ｏｎ ｔｏ １，３−ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ ｂｙ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ：ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ １，３−ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏ
ｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ．ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．
１５４：３３７−３４５）を含む。 発明の概要 本発明は、野生型Ｅ．ｂｌａｔｔａｅには通常毒性のレベルである少なくとも
１０５ｇ／ｌの１，３−プロパンジオールの存在下で生育できるＥ．ｂｌａｔｔ
ａｅの誘導体から単離された、変異体形態の１，３−プロパンジオールデヒドロ
ゲナーゼ（ＰＤＤ）の発見に関する。本発明は、よって、上記変異形態のＰＤＤ
が、通常は毒性のレベルの１，３−プロパンジオールに対してのＥ．ｂｌａｔｔ
ａｅの耐性に関連するとの発見に一部基づく。本発明は、この変異対ＰＤＤが１
，３−プロパンジオールとＮＡＤに関して変更されたＫｍを有するとの発見にも
一部基づく。
【０００５】 従って、本発明は、１，３−プロパンジオールに関して野生型ＰＤＤのＫｍを
超えるように増加する１，３−プロパンジオールのＫｍを有する変異体ＰＤＤを
提供する。一つの態様において、変異体ＰＤＤのＫｍは１，３−プロパンジオー
ルに関しての野生型ＰＤＤのＫの約３倍である。別の態様において、変異体ＰＤ
ＤはＥ．ｂｌａｔｔａｅのＡＴＣＣ加盟番号ＰＴＡ−９２から得ることができる
。
超えるように増加する１，３−プロパンジオールのＫｍを有する変異体ＰＤＤを
提供する。一つの態様において、変異体ＰＤＤのＫｍは１，３−プロパンジオー
ルに関しての野生型ＰＤＤのＫの約３倍である。別の態様において、変異体ＰＤ
ＤはＥ．ｂｌａｔｔａｅのＡＴＣＣ加盟番号ＰＴＡ−９２から得ることができる
。
【０００６】 本発明のさらに別の態様において、変異体ＰＤＤはＥ．ｂｌａｔｔａｅのＰＤ
Ｄにおける残基Ｈｉｓ１０５からＬｅｕに対応する変異を含み、図３に示すとお
りである。さらなる態様において、変異体ＰＤＤは配列番号２に示すアミノ酸を
含み、そして配列番号１に示す配列を有する核酸によりコードされる。
Ｄにおける残基Ｈｉｓ１０５からＬｅｕに対応する変異を含み、図３に示すとお
りである。さらなる態様において、変異体ＰＤＤは配列番号２に示すアミノ酸を
含み、そして配列番号１に示す配列を有する核酸によりコードされる。
【０００７】 本発明は、配列番号１に示す配列を有する単離された核酸を含む発現ベクター
および宿主細胞も提供する。一つの態様において、上記宿主細胞はＣｉｔｒｏｂ
ａｃｔｅｒ，Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ，Ｋｌｅｂｓ
ｉｅｌｌａ，Ａｅｒｏｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ，Ａｓｐ
ｅｒｇｉｌｌｕｓ，Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ，Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｐｉｃｈｉａ，Ｋｌｕｙ
ｖｅｒｏｍｙｃｅｓ，Ｃａｎｄｉｄａ，Ｈａｎｓｅｎｕｌａ，Ｄｅｂａｒｙｏｍ
ｙｃｅｓ，Ｍｕｃｏｒ，Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ，Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ，
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓを含む。
および宿主細胞も提供する。一つの態様において、上記宿主細胞はＣｉｔｒｏｂ
ａｃｔｅｒ，Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ，Ｋｌｅｂｓ
ｉｅｌｌａ，Ａｅｒｏｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ，Ａｓｐ
ｅｒｇｉｌｌｕｓ，Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ，Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｐｉｃｈｉａ，Ｋｌｕｙ
ｖｅｒｏｍｙｃｅｓ，Ｃａｎｄｉｄａ，Ｈａｎｓｅｎｕｌａ，Ｄｅｂａｒｙｏｍ
ｙｃｅｓ，Ｍｕｃｏｒ，Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ，Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ，
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓを含む。
【０００８】 さらなる側面において、本発明は、変異体ＰＤＤを含む微生物の使用を含む１
，３−プロパンジオールの生産法に関する。 ブダペスト条約下で寄託された微生物の記載 出願人は、特許手続のための微生物の寄託の国際承認に基づくブダペスト条約
の権限の下に、以下の生物の寄託を行った。
，３−プロパンジオールの生産法に関する。 ブダペスト条約下で寄託された微生物の記載 出願人は、特許手続のための微生物の寄託の国際承認に基づくブダペスト条約
の権限の下に、以下の生物の寄託を行った。
【０００９】 寄託確認照会 国際寄託呼称 寄託日 Escherichia blattae 33429誘導体 PTA-92 1999年５月19日 詳細な説明 用語「１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ」または「ＰＤＤ」（当業
界では「オキシドレダクターゼ」としても知られる）は、３−ヒドロキシプロピ
オンアルデヒドの１，３−プロパンジオールへの還元を触媒することができる酵
素に必須のポリペプチドを意味する。１，３−プロパンジオールデヒドロゲナー
ゼは、例えば、ｄｈａＴ遺伝子によりコードされるポリペプチドを含む。本発明
は、限定ではないが、Ｅ．ｂｌａｔｔａｅ，Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，Ｃ．ｆ
ｒｅｕｎｄｉｉ，Ｃ．Ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍを含むあらゆる源からの１，３
−プロパンジオールデヒドロゲナーゼを包含する。
界では「オキシドレダクターゼ」としても知られる）は、３−ヒドロキシプロピ
オンアルデヒドの１，３−プロパンジオールへの還元を触媒することができる酵
素に必須のポリペプチドを意味する。１，３−プロパンジオールデヒドロゲナー
ゼは、例えば、ｄｈａＴ遺伝子によりコードされるポリペプチドを含む。本発明
は、限定ではないが、Ｅ．ｂｌａｔｔａｅ，Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，Ｃ．ｆ
ｒｅｕｎｄｉｉ，Ｃ．Ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍを含むあらゆる源からの１，３
−プロパンジオールデヒドロゲナーゼを包含する。
【００１０】 本明細書にて使用されるとおり、用語「変異体（ｍｕｔａｎｔ）」または「変
異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）」は、微生物の核酸中に生じるあらゆる遺伝子の変化を
意味し、そして該微生物の表現型の変化を反映してもしなくてもよい。変異は、
単一の塩基対の変化、欠失または挿入を含んでよく；変異は多数の塩基対の変化
、欠失または挿入を含んでよく；変異はＤＮＡの大きな領域の変化を含んでもよ
く、例えば重複または倒置を通してである。変異体１，３−プロパンジオールデ
ヒドロゲナーゼのアミノ酸配列は、天然の１，３−プロパンジオールデヒドロゲ
ナーゼの一つまたは複数のアミノ酸の置換、失または挿入により前駆体１，３−
プロパンジオールデヒドロゲナーゼに由来し得る。遺伝子を修飾するための方法
（例えば、部位特異的オリゴヌクレオチド変異導入）は、当業界において記載さ
れた。
異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）」は、微生物の核酸中に生じるあらゆる遺伝子の変化を
意味し、そして該微生物の表現型の変化を反映してもしなくてもよい。変異は、
単一の塩基対の変化、欠失または挿入を含んでよく；変異は多数の塩基対の変化
、欠失または挿入を含んでよく；変異はＤＮＡの大きな領域の変化を含んでもよ
く、例えば重複または倒置を通してである。変異体１，３−プロパンジオールデ
ヒドロゲナーゼのアミノ酸配列は、天然の１，３−プロパンジオールデヒドロゲ
ナーゼの一つまたは複数のアミノ酸の置換、失または挿入により前駆体１，３−
プロパンジオールデヒドロゲナーゼに由来し得る。遺伝子を修飾するための方法
（例えば、部位特異的オリゴヌクレオチド変異導入）は、当業界において記載さ
れた。
【００１１】 本明細書にて使用される句「対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ）」は、
実施例３に例示された１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ間のアミノ酸
の関連性を意味する。本明細書にて論じられる特定の残基は、図３に示すＥ．ｂ
ｌａｔｔａｅのＧＥＢのＰＤＤに指定された番号を引用するアミノ酸残基数を意
味する。ＨｉｓからＬｅｕへの変異を図３の残基１０５に示す。図３は、様々な
微生物源からの１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼを計算法ＣＬＵＳＴ
ＡＬＷを用いて並置することができる。本発明は、図１または２に示されるＥ．
ｂｌａｔｔａｅのＰＤＤの変異、またはＡＴＣＣに寄託されて加盟番号ＰＴＡ−
９２を有するＥ．ｂｌａｔｔａｅに限定されないが、Ｅ．ｂｌａｔｔａｅ中の特
定の同定された残基に均等な位置のアミノ酸残基を含むＰＤＤｓ全てを包含する
。Ｅ．ｂｌａｔｔａｅのＰＤＤ中の残基の特定の残基または部分に相同（即ち、
一次構造または三次構造の何れかの位置に対応する）または類似のいずれかであ
れば、残基は均等である（即ち、化学的にかまたは構造上、結合するか（ｃｏｍ
ｂｉｎｅ）、反応するか（ｒｅａｃｔ）または相互作用する（ｉｎｔｅｒａｃｔ
）、同じかまたは類似の機能上の能力を有する）。
実施例３に例示された１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ間のアミノ酸
の関連性を意味する。本明細書にて論じられる特定の残基は、図３に示すＥ．ｂ
ｌａｔｔａｅのＧＥＢのＰＤＤに指定された番号を引用するアミノ酸残基数を意
味する。ＨｉｓからＬｅｕへの変異を図３の残基１０５に示す。図３は、様々な
微生物源からの１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼを計算法ＣＬＵＳＴ
ＡＬＷを用いて並置することができる。本発明は、図１または２に示されるＥ．
ｂｌａｔｔａｅのＰＤＤの変異、またはＡＴＣＣに寄託されて加盟番号ＰＴＡ−
９２を有するＥ．ｂｌａｔｔａｅに限定されないが、Ｅ．ｂｌａｔｔａｅ中の特
定の同定された残基に均等な位置のアミノ酸残基を含むＰＤＤｓ全てを包含する
。Ｅ．ｂｌａｔｔａｅのＰＤＤ中の残基の特定の残基または部分に相同（即ち、
一次構造または三次構造の何れかの位置に対応する）または類似のいずれかであ
れば、残基は均等である（即ち、化学的にかまたは構造上、結合するか（ｃｏｍ
ｂｉｎｅ）、反応するか（ｒｅａｃｔ）または相互作用する（ｉｎｔｅｒａｃｔ
）、同じかまたは類似の機能上の能力を有する）。
【００１２】 一次構造に関する相同性を確立するために、ＰＤＤのアミノ酸配列を、Ｅ．ｂ
ｌａｔｔａｅのＰＤＤ一次構造（図２に示す）、そして特に配列が公知の全ての
ＰＤＤｓに対して不変であることが知られている残基のセット（例えば、図３を
参照）と、直接比較する。本発明は、変異形態が１，３−プロパンジオールの活
性のＫｍを変更することができる限り、１，３−プロパンジオールデヒドロゲナ
ーゼの全ての源における均等残基の変化を包含する。好ましい態様において、変
異形態のＫｍは１，３−プロパンジオールに関して増加する。配列番号１の核酸
配列はＰＣＲ技術により得た。そのような技術は、しばしば、偶然にＰＣＲで生
じた配列エラーにより特徴付けられる。よって、本発明は、ＡＴＣＣ加盟番号Ｐ
ＴＡ−９２を有するＥ．ｂｌａｔｔａｅの１，３−プロパンジオールデヒドロゲ
ナーゼおよび１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼの他の微生物の源の中
の対応する変異を包含する。
ｌａｔｔａｅのＰＤＤ一次構造（図２に示す）、そして特に配列が公知の全ての
ＰＤＤｓに対して不変であることが知られている残基のセット（例えば、図３を
参照）と、直接比較する。本発明は、変異形態が１，３−プロパンジオールの活
性のＫｍを変更することができる限り、１，３−プロパンジオールデヒドロゲナ
ーゼの全ての源における均等残基の変化を包含する。好ましい態様において、変
異形態のＫｍは１，３−プロパンジオールに関して増加する。配列番号１の核酸
配列はＰＣＲ技術により得た。そのような技術は、しばしば、偶然にＰＣＲで生
じた配列エラーにより特徴付けられる。よって、本発明は、ＡＴＣＣ加盟番号Ｐ
ＴＡ−９２を有するＥ．ｂｌａｔｔａｅの１，３−プロパンジオールデヒドロゲ
ナーゼおよび１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼの他の微生物の源の中
の対応する変異を包含する。
【００１３】 用語「Ｋｍ」は酵素の基質に対する親和性を意味する。高いＫｍは低い親和性
を反映し；低いＫｍは高い親和性を反映する。 用語「炭素基質」および「炭素源」は、本発明の宿主生物により代謝されるこ
とができる炭素源、および特にモノサッカライド、オリゴサッカライド、ポリサ
ッカライド、そして炭素が一つの基質またはそれらの混合物からなるグループか
ら選択される炭素源を意味する。
を反映し；低いＫｍは高い親和性を反映する。 用語「炭素基質」および「炭素源」は、本発明の宿主生物により代謝されるこ
とができる炭素源、および特にモノサッカライド、オリゴサッカライド、ポリサ
ッカライド、そして炭素が一つの基質またはそれらの混合物からなるグループか
ら選択される炭素源を意味する。
【００１４】 用語「宿主細胞」または「宿主生物」は、外来または外因性の遺伝子を受容で
き、且つ活性な遺伝子産物を生成するようにそれらの遺伝子を発現させることが
できる微生物を意味する。
き、且つ活性な遺伝子産物を生成するようにそれらの遺伝子を発現させることが
できる微生物を意味する。
【００１５】 本明細書にて使用されるとおり、「核酸」は、ヌクレオチドまたはポリヌクレ
オチド配列、およびそれらの断片または部分、およびセンスあるいはアンチセン
ス鎖を表すかに拘わらず二本鎖または一本鎖であってよいゲノミックまたは合成
起原のＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。用語「天然」および「野生型」は、それ
自身の制御配列と共に自然界において見いだされる遺伝子を意味する。本明細書
にて使用されるとおり、「アミノ酸」はペプチドまたは蛋白質の配列またはその
部分を意味する。
オチド配列、およびそれらの断片または部分、およびセンスあるいはアンチセン
ス鎖を表すかに拘わらず二本鎖または一本鎖であってよいゲノミックまたは合成
起原のＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。用語「天然」および「野生型」は、それ
自身の制御配列と共に自然界において見いだされる遺伝子を意味する。本明細書
にて使用されるとおり、「アミノ酸」はペプチドまたは蛋白質の配列またはその
部分を意味する。
【００１６】 用語「発現」は、遺伝子産物の配列をコードする遺伝子からの遺伝子産物への
転写および翻訳を意味する。 用語「プラスミド」、「ベクター」、および「カセット」は、細胞の中心的な
代謝の一部にない遺伝子をしばしば有する染色体外要素を意味し、そして通常は
環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態である。そのような要素は、自律複製要素、ゲノム
組み込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列、直鎖または環状の一本鎖また
は二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡであってよく、多数のヌクレオチド配列を、プロモ
ーター断片および選択された遺伝子産物に関するＤＮＡを適切な３’非翻訳領域
と共に細胞に導入することができる唯一の構築物に、接合させるかまたは組換え
た、あらゆる源に由来してよい。「形質転換カセット」は、特定の宿主細胞の形
質転換を容易にさせる外来遺伝子に加えて、外来遺伝子を含み且つ要素を有する
特定のベクターを意味する。「発現カセット」は、外来宿主中でその遺伝子の増
強された発現を可能にする外来遺伝子に加えて、外来遺伝子を含み且つ要素を有
する特定のベクターを意味する。
転写および翻訳を意味する。 用語「プラスミド」、「ベクター」、および「カセット」は、細胞の中心的な
代謝の一部にない遺伝子をしばしば有する染色体外要素を意味し、そして通常は
環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態である。そのような要素は、自律複製要素、ゲノム
組み込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列、直鎖または環状の一本鎖また
は二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡであってよく、多数のヌクレオチド配列を、プロモ
ーター断片および選択された遺伝子産物に関するＤＮＡを適切な３’非翻訳領域
と共に細胞に導入することができる唯一の構築物に、接合させるかまたは組換え
た、あらゆる源に由来してよい。「形質転換カセット」は、特定の宿主細胞の形
質転換を容易にさせる外来遺伝子に加えて、外来遺伝子を含み且つ要素を有する
特定のベクターを意味する。「発現カセット」は、外来宿主中でその遺伝子の増
強された発現を可能にする外来遺伝子に加えて、外来遺伝子を含み且つ要素を有
する特定のベクターを意味する。
【００１７】 本明細書にて使用される用語「単離された」または「精製された」は、自然界
で付随する少なくとも一つの成分から取り出された核酸またはアミノ酸を意味す
る。 発明の詳細な説明 本発明は、１，３−プロパンジオールに関して増加したＫｍを有することによ
り特徴付けされる変異体１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ（ＰＤＤ）
に関する。
で付随する少なくとも一つの成分から取り出された核酸またはアミノ酸を意味す
る。 発明の詳細な説明 本発明は、１，３−プロパンジオールに関して増加したＫｍを有することによ
り特徴付けされる変異体１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ（ＰＤＤ）
に関する。
【００１８】 Ｉ．ＰＤＤ配列 配列番号１に示すポリヌクレオチド配列は、図３に示すとおり、残基１０５に
おいてＨｉｓからＬｅｕへの変異を有する１，３−プロパンジオールデヒドロゲ
ナーゼ（配列番号２）をコードする。当業者には理解されるとおり、遺伝子コー
ドの縮重のために、様々なポリヌクレオチドが配列番号２をコードし得る。本発
明は、そのようなポリヌクレオチド全てを包含する。本発明は、図３に示すとお
り、Ｅ．ｂｌａｔｔａｅの残基Ｈｉｓ １０５に対応する変異を含むＰＤＤをコ
ードする核酸を包含する。Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のＰＤＤに関する核酸
およびアミノ酸配列はＧｅｎＢａｎｋ加盟番号Ｕ３０９０３にて提供され；Ｃ．
ｆｒｅｕｎｄｉｉ由来のＰＤＤはＧｅｎＢａｎｋ加盟番号Ｕ０９７７１にて提供
され；そしてＣ．ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍに関してはＧｅｎＢａｎｋ加盟番号
ＡＦ０００３４にて提供される。本発明は、ＡＴＣＣ加盟番号ＰＴＡ−９２を有
するＥ．ｂｌａｔｔａｅから得ることができる変異ＰＤＤも包含する。
おいてＨｉｓからＬｅｕへの変異を有する１，３−プロパンジオールデヒドロゲ
ナーゼ（配列番号２）をコードする。当業者には理解されるとおり、遺伝子コー
ドの縮重のために、様々なポリヌクレオチドが配列番号２をコードし得る。本発
明は、そのようなポリヌクレオチド全てを包含する。本発明は、図３に示すとお
り、Ｅ．ｂｌａｔｔａｅの残基Ｈｉｓ １０５に対応する変異を含むＰＤＤをコ
ードする核酸を包含する。Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のＰＤＤに関する核酸
およびアミノ酸配列はＧｅｎＢａｎｋ加盟番号Ｕ３０９０３にて提供され；Ｃ．
ｆｒｅｕｎｄｉｉ由来のＰＤＤはＧｅｎＢａｎｋ加盟番号Ｕ０９７７１にて提供
され；そしてＣ．ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍに関してはＧｅｎＢａｎｋ加盟番号
ＡＦ０００３４にて提供される。本発明は、ＡＴＣＣ加盟番号ＰＴＡ−９２を有
するＥ．ｂｌａｔｔａｅから得ることができる変異ＰＤＤも包含する。
【００１９】 微生物のゲノムから所望の遺伝子を得るための方法は共通であり、そして分子
生物学の当業界においてよく知られている。例えば、上記遺伝子の配列が公知な
らば、適切なゲノミックライブラリーを制限エンドヌクレアーゼ消化により創製
してよく、そして所望の遺伝子配列に相補なプローブを用いて選抜してよい。上
記配列が単離されたなら、標準のプライマー指向性増幅方法、例えばポリメラー
ゼ鎖停止反応（ＰＣＲ）（Ｕ．Ｓ．４，６８３，２０２）を用いて増幅すること
により、適切なベクターを用いた形質転換のために適した量のＤＮＡを得てよい
。
生物学の当業界においてよく知られている。例えば、上記遺伝子の配列が公知な
らば、適切なゲノミックライブラリーを制限エンドヌクレアーゼ消化により創製
してよく、そして所望の遺伝子配列に相補なプローブを用いて選抜してよい。上
記配列が単離されたなら、標準のプライマー指向性増幅方法、例えばポリメラー
ゼ鎖停止反応（ＰＣＲ）（Ｕ．Ｓ．４，６８３，２０２）を用いて増幅すること
により、適切なベクターを用いた形質転換のために適した量のＤＮＡを得てよい
。
【００２０】 別法として、適切な細菌の宿主の形質転換のためのコスミッドベクターを用い
る方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｎｄ Ｅｄｉｔ
ｉｏｎ（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）
にうまくきさいされている。
る方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｎｄ Ｅｄｉｔ
ｉｏｎ（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）
にうまくきさいされている。
【００２１】 ＰＤＤ遺伝子内で変異を作成する方法は当業者に知られており、例えば、部位
特異的変異導入を含み、手法は１９８８年７月２６日発行の米国特許ＵＳ４７６
００２５に記載されている。
特異的変異導入を含み、手法は１９８８年７月２６日発行の米国特許ＵＳ４７６
００２５に記載されている。
【００２２】 ベクターおよび発現カセット 本発明は、変異体ＰＤＤ並びに１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼに
関連する他の蛋白質を適切な宿主細胞中にクローン化、形質転換および発現させ
るるのに適した、様々なベクターおよび形質転換および発現カセットを提供する
。適切なベクターは、用いられる細菌に適合性のものであることになる。適切な
ベクターは、例えば細菌、ウイルス（例えばバクテリオファージＴ７またはＭ１
３由来のファージ）、コスミッド、酵母または植物に由来し得る。そのようなベ
クターを得て、そして使用するためのプロトコルは当業界において知られている
（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ−ｖｏｌｕｍｅｓ１，２，３（Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，（１９８９））。
関連する他の蛋白質を適切な宿主細胞中にクローン化、形質転換および発現させ
るるのに適した、様々なベクターおよび形質転換および発現カセットを提供する
。適切なベクターは、用いられる細菌に適合性のものであることになる。適切な
ベクターは、例えば細菌、ウイルス（例えばバクテリオファージＴ７またはＭ１
３由来のファージ）、コスミッド、酵母または植物に由来し得る。そのようなベ
クターを得て、そして使用するためのプロトコルは当業界において知られている
（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ−ｖｏｌｕｍｅｓ１，２，３（Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，（１９８９））。
【００２３】 典型的には、上記ベクターまたはカセットは、問題の遺伝子の転写および翻訳
を指示する配列、選択可能なマーカー、および自律複製または染色体組み込みを
可能にする配列を含む。適切なベクターは、転写開始制御を収容する遺伝子の５
’領域と、転写停止を制御するＤＮＡ断片の３’領域を含む。両制御領域は、形
質転換された宿主細胞に相同な遺伝子に由来することがもっとも好ましいが、そ
のような制御領域は生産宿主として選択された特定の種にとって本来の遺伝子に
由来する必要がないことは認識されるはずである。
を指示する配列、選択可能なマーカー、および自律複製または染色体組み込みを
可能にする配列を含む。適切なベクターは、転写開始制御を収容する遺伝子の５
’領域と、転写停止を制御するＤＮＡ断片の３’領域を含む。両制御領域は、形
質転換された宿主細胞に相同な遺伝子に由来することがもっとも好ましいが、そ
のような制御領域は生産宿主として選択された特定の種にとって本来の遺伝子に
由来する必要がないことは認識されるはずである。
【００２４】 開始制御領域またはプロモーターは、所望の宿主細胞におけるＰＤＤの発現を
操縦するのに有用であり、多数存在して、当業者により熟知されている。理想的
には、これらの遺伝子を操縦することができるあらゆるプロモーターが本発明に
適しており、限定ではないが、ＣＹＣ１，ＨＩＳ３，ＧＡＬ１，ＧＡＬ１０，Ａ
ＤＨ１，ＰＧＫ，ＰＨＯ５，ＧＡＰＤＨ，ＡＤＣ１，ＴＲＰ１，ＵＲＡ３，ＬＥ
Ｕ２，ＥＮＯ，ＴＰＩ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓにおける発現に有用）；Ａ
ＯＸ１（Ｐｉｃｈｉａにおける発現に有用）；およびｌａｃ，ｔｒｐ，ＩＰＬ，
ＩＰＲ，Ｔ７，ｔａｃおよびｔｒｃ（Ｅ．ｃｏｌｉにける発現に有用）を含む。
操縦するのに有用であり、多数存在して、当業者により熟知されている。理想的
には、これらの遺伝子を操縦することができるあらゆるプロモーターが本発明に
適しており、限定ではないが、ＣＹＣ１，ＨＩＳ３，ＧＡＬ１，ＧＡＬ１０，Ａ
ＤＨ１，ＰＧＫ，ＰＨＯ５，ＧＡＰＤＨ，ＡＤＣ１，ＴＲＰ１，ＵＲＡ３，ＬＥ
Ｕ２，ＥＮＯ，ＴＰＩ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓにおける発現に有用）；Ａ
ＯＸ１（Ｐｉｃｈｉａにおける発現に有用）；およびｌａｃ，ｔｒｐ，ＩＰＬ，
ＩＰＲ，Ｔ７，ｔａｃおよびｔｒｃ（Ｅ．ｃｏｌｉにける発現に有用）を含む。
【００２５】 停止制御領域は、好ましい宿主にとって本来の様々な遺伝子に由来してもよい
。任意には、停止部位は必要なく、しかしながら、もしも含まれていれば最も好
ましい。
。任意には、停止部位は必要なく、しかしながら、もしも含まれていれば最も好
ましい。
【００２６】 本酵素の効果的な発現のためには、該酵素をコードするＤＮＡを、発現が適切
なメッセンジャーＲＮＡの形成をもたらすように、開始コドンを通して作動可能
なように、選択された発現制御領域に連結する。 適切な宿主の形質転換およびＰＤＤの発現 適切なカセットが構築されたなら、それらを使用することにより、適切な宿主
細胞を形質転換する。１，３−プロパンジオールの生産に必要な他の蛋白質とは
別々かまたは一緒に、変異体１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼを含む
カセットを宿主細胞に導入することは、公知の手法、例えば形質転換（例えば、
カルシウム透過化細胞、エレクトロポレーションを用いて）または組換えファー
ジウイルスを用いるトランスフェクション（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，
前記）により達成してよい。
なメッセンジャーＲＮＡの形成をもたらすように、開始コドンを通して作動可能
なように、選択された発現制御領域に連結する。 適切な宿主の形質転換およびＰＤＤの発現 適切なカセットが構築されたなら、それらを使用することにより、適切な宿主
細胞を形質転換する。１，３−プロパンジオールの生産に必要な他の蛋白質とは
別々かまたは一緒に、変異体１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼを含む
カセットを宿主細胞に導入することは、公知の手法、例えば形質転換（例えば、
カルシウム透過化細胞、エレクトロポレーションを用いて）または組換えファー
ジウイルスを用いるトランスフェクション（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，
前記）により達成してよい。
【００２７】 宿主細胞 １，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼの組換え生産のための適切な宿主
細胞は、原核または真核の何れであってもよく、そして活性な酵素を発現する宿
主細胞の能力によってのみ制限されることになる。好ましい宿主は、グリセロー
ルまたは１，３−プロパンジオールの生産に有用な典型的な宿主であり、例えば
、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ，Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕ
ｍ，Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ，Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕ
ｓ，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ，Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｓｃｈｉｚｏｓａ
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｐｉｃｈｉａ
，Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ，Ｃａｎｄｉｄａ，Ｈａｎｓｅｎｕｌａ，Ｄｅｂ
ａｒｙｏｍｙｃｅｓ，Ｍｕｃｏｒ，Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ，Ｍｅｔｈｙｌｏｂａ
ｃｔｅｒ，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ
，ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓである。本発明にお
いて最も好ましいのは、Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ種およびＳａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ種である。
細胞は、原核または真核の何れであってもよく、そして活性な酵素を発現する宿
主細胞の能力によってのみ制限されることになる。好ましい宿主は、グリセロー
ルまたは１，３−プロパンジオールの生産に有用な典型的な宿主であり、例えば
、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ，Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕ
ｍ，Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ，Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕ
ｓ，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ，Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｓｃｈｉｚｏｓａ
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｐｉｃｈｉａ
，Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ，Ｃａｎｄｉｄａ，Ｈａｎｓｅｎｕｌａ，Ｄｅｂ
ａｒｙｏｍｙｃｅｓ，Ｍｕｃｏｒ，Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ，Ｍｅｔｈｙｌｏｂａ
ｃｔｅｒ，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ
，ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓである。本発明にお
いて最も好ましいのは、Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ種およびＳａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ種である。
【００２８】 培地および炭素源 本発明における発酵培地は適切な炭素源を含まなければならない。適切な基質
は、限定ではないが、モノサッカライド、例えばグルコースおよびフルクトース
、オリゴサッカライド、例えばラクトースまたはシュークロース、ポリサッカラ
イド、例えば澱粉またはセルロース、またはそれらの混合物、および継続可能な
供給原料からの未精製の混合物、例えばチーズの乳清透過物（ｐｅｒｍｅａｔｅ
）、コーンスティープ（ｃｏｒｎｓｔｅｅｐ）リカー、サトウキビ糖蜜、および
大麦麦芽を含んでよい。さらに、炭素源は一炭素の基質、例えば二酸化炭素、ま
たはカギとなる生化学中間体への代謝変換が証明されたメタノールであってもよ
い。
は、限定ではないが、モノサッカライド、例えばグルコースおよびフルクトース
、オリゴサッカライド、例えばラクトースまたはシュークロース、ポリサッカラ
イド、例えば澱粉またはセルロース、またはそれらの混合物、および継続可能な
供給原料からの未精製の混合物、例えばチーズの乳清透過物（ｐｅｒｍｅａｔｅ
）、コーンスティープ（ｃｏｒｎｓｔｅｅｐ）リカー、サトウキビ糖蜜、および
大麦麦芽を含んでよい。さらに、炭素源は一炭素の基質、例えば二酸化炭素、ま
たはカギとなる生化学中間体への代謝変換が証明されたメタノールであってもよ
い。
【００２９】 好ましい炭素基質はモノサッカライド、オリゴサッカライド、ポリサッカライ
ド、および一炭素基質である。より好ましいのは、糖、例えばグルコース、フル
クトース、シュークロースおよび一炭素基質、例えばメタノールおよび二酸化炭
素である。もっとも好ましいのはグルコースである。
ド、および一炭素基質である。より好ましいのは、糖、例えばグルコース、フル
クトース、シュークロースおよび一炭素基質、例えばメタノールおよび二酸化炭
素である。もっとも好ましいのはグルコースである。
【００３０】 適切な炭素源に加えて、発酵培地は、当業者に知られており、培養物の生育お
よびグリセロール生産に必要な酵素経路の促進に適した、適切なミネラル、塩、
共因子、バッファーおよび他の成分を含まねばならない。Ｃｏ（ＩＩ）塩および
／またはビタミンＢ12またはその前駆体には、特定の注意を払う。
よびグリセロール生産に必要な酵素経路の促進に適した、適切なミネラル、塩、
共因子、バッファーおよび他の成分を含まねばならない。Ｃｏ（ＩＩ）塩および
／またはビタミンＢ12またはその前駆体には、特定の注意を払う。
【００３１】 培養条件： 典型的には、細胞を３０℃において適切な培地中で生育させる。本発明におい
て好ましい生育培地は、一般に市販されている調製培地、例えばＬｕｒｉａ Ｂ
ｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス、Ｓａｂｏｕｒａｕｄ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ（ＳＤ）
ブロスまたは酵母麦芽抽出物（ＹＭ）ブロスである。他に定義されたかまたは合
成の生育培地も使用してよく、そして特定の微生物の生育のための適切な培地は
、微生物学または発酵科学の当業者に知られている。直接または間接に異化産物
抑制を変調することが知られている薬剤、例えば環状アデノシン２’：３’−１
リン酸または環状アデノシン２’：５’−１リン酸の使用は、上記反応培地に取
り込んでもよい。同様に、グリセロール生産の増強を導く酵素活性を変調するこ
とが知られている薬剤（例えば、スルファイト、ビスルファイトおよびアルカリ
）の使用は、遺伝子操作と共にかあるいは別に使用してよい。
て好ましい生育培地は、一般に市販されている調製培地、例えばＬｕｒｉａ Ｂ
ｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス、Ｓａｂｏｕｒａｕｄ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ（ＳＤ）
ブロスまたは酵母麦芽抽出物（ＹＭ）ブロスである。他に定義されたかまたは合
成の生育培地も使用してよく、そして特定の微生物の生育のための適切な培地は
、微生物学または発酵科学の当業者に知られている。直接または間接に異化産物
抑制を変調することが知られている薬剤、例えば環状アデノシン２’：３’−１
リン酸または環状アデノシン２’：５’−１リン酸の使用は、上記反応培地に取
り込んでもよい。同様に、グリセロール生産の増強を導く酵素活性を変調するこ
とが知られている薬剤（例えば、スルファイト、ビスルファイトおよびアルカリ
）の使用は、遺伝子操作と共にかあるいは別に使用してよい。
【００３２】 発酵のための適切なｐＨ範囲はｐＨ５．０からｐＨ９．０であるが、ｐＨ６．
０が初期条件の範囲としては好ましい。 本発明を実施する様式および方法は以下の実施例に体する引用により当業者に
よりさらに完全に理解されるかもしれず、それらの実施例はいかなる様式におい
ても本発明または特許請求の範囲に制限することを意図されない。 実施例 実施例１は配列番号２に示す変異体ＰＤＤに付随する動力学上の変化を記載する
。 材料と方法 株−野生型ＡＴＣＣ３３４２９、変異体ＰＤＤのＡＴＣＣ加盟番号ＰＴＡ−９２
を含むＥ．ｂｌａｔｔａｅ。 生育−細胞は、複合培地中で、３０Ｃ ５００ｍｌにおいて２８００ｍｌ発酵バ
ッチ中で２２５ｒｐｍにて撹拌しながら２０時間生育させた。培地は、ＫＨ２Ｐ
Ｏ４，５．４ｇ／Ｌ；（ＮＨ４）２ＳＯ４，１．２ｇ／Ｌ；ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ
，０．４ｇ／Ｌ；酵母抽出物、２．０ｇ／Ｌ；トリプトン、２．０ｇ／Ｌ；およ
びグリセロール、９．２ｇ／Ｌを水道水中に含む。 抽出物の調製−嫌気条件を避けるために注意しながら細胞を遠心分離により回収
した。沈殿物は、５０ｍＭ ＫＣｌおよび１ｍＭ ＤＴＴを含む１００ｍｌのＴ
ｒｉｃｉｎｅ ｐＨ８．２に懸濁した。細胞はフレンチ細胞プレッシャーを通し
て破壊した。粗抽出物を、２０Ｋ Ｘ ｇで２０分間遠心分離してから、１００
Ｋ Ｘ ｇで１時間遠心分離することにより透明にして、高速上清（ＨＳＳ）画
分を生じさせた。 アッセイ−ＰＤＤに関するアッセイはＪｏｈｎｓｏｎ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，
１９８７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：２０５０−２０５４に記載された
とおりに実施した。 ＰＤＤの部分精製−ＨＳＳを１６ Ｘ １００ Ｐｏｒｏｓ ２０ＨＱカラム上
で分離させた。バッファーは、Ａは５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４であり、
１００ｕＭ ＭｎＣｌを含み、そしてＢは５００ｍＭ ＫＣｌを含むＡＴＣＣバ
ッファーである。カラムを１０ｍｌ／分にて負荷および展開した。勾配は１０Ｃ
Ｖ洗浄、１０ＣＶにて７０％Ｂまで直線勾配、そして１００％まで１ＣＶであっ
た。活性は勾配の極めて初期の画分において検出された。１ｍＭまで追加のＤＴ
Ｔを添加した後に、３３４２９株のプールされたカラム画分をアッセイのために
回収されたとおりに使用した。株ＧＥＢ０３１からの活性画分をプールして、Ｐ
Ｍ３０上で濃縮して、追加の１ｍＭ ＤＴＴの添加後に濃縮されたとおりに使用
した。 株 ＧＤ（Ｕ／ｍｇ） ＰＤＤ（Ｕ／ｍｇ） ＧＤ／ＰＤＤ比 ３３４２９ ０．６４ ０．２２ ２．９ ＧＥＢ０３１ ０．７９ ０．０８ ９．９ ＰＤＤ動力学−結果を以下に示す。 株 Ｋｍ（ｍＭプロパンジオール） Ｋｍ（ｕＭ ＮＡＤ） ３３４２９ ２８ ５７ 実施例２：Ｅ．ｂｌａｔｔａｅからの１，３−プロパンジオールデヒドロゲナー
ゼ遺伝子（ｄｈａＴ）のクローン化と配列決定 ｄｈａＴ遺伝子を、ＰＣＲにより、Ｅ．ｂｌａｔｔａｅのゲノミックＤＮＡか
ら、鋳型ＤＮＡとしてＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのｄｈａＴ配列に基づく合成プ
ライマー（プライマー１と２）を用いて５’末端にＸｂａＩ部位および３’末端
にＢａｍＨＩ部位を取り込んだ。生成物をｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ＴＯＰＯ
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にサブクローン化した。クローン化されたｄｈａＴ
を次に標準技術により配列決定した。
０が初期条件の範囲としては好ましい。 本発明を実施する様式および方法は以下の実施例に体する引用により当業者に
よりさらに完全に理解されるかもしれず、それらの実施例はいかなる様式におい
ても本発明または特許請求の範囲に制限することを意図されない。 実施例 実施例１は配列番号２に示す変異体ＰＤＤに付随する動力学上の変化を記載する
。 材料と方法 株−野生型ＡＴＣＣ３３４２９、変異体ＰＤＤのＡＴＣＣ加盟番号ＰＴＡ−９２
を含むＥ．ｂｌａｔｔａｅ。 生育−細胞は、複合培地中で、３０Ｃ ５００ｍｌにおいて２８００ｍｌ発酵バ
ッチ中で２２５ｒｐｍにて撹拌しながら２０時間生育させた。培地は、ＫＨ２Ｐ
Ｏ４，５．４ｇ／Ｌ；（ＮＨ４）２ＳＯ４，１．２ｇ／Ｌ；ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ
，０．４ｇ／Ｌ；酵母抽出物、２．０ｇ／Ｌ；トリプトン、２．０ｇ／Ｌ；およ
びグリセロール、９．２ｇ／Ｌを水道水中に含む。 抽出物の調製−嫌気条件を避けるために注意しながら細胞を遠心分離により回収
した。沈殿物は、５０ｍＭ ＫＣｌおよび１ｍＭ ＤＴＴを含む１００ｍｌのＴ
ｒｉｃｉｎｅ ｐＨ８．２に懸濁した。細胞はフレンチ細胞プレッシャーを通し
て破壊した。粗抽出物を、２０Ｋ Ｘ ｇで２０分間遠心分離してから、１００
Ｋ Ｘ ｇで１時間遠心分離することにより透明にして、高速上清（ＨＳＳ）画
分を生じさせた。 アッセイ−ＰＤＤに関するアッセイはＪｏｈｎｓｏｎ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，
１９８７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：２０５０−２０５４に記載された
とおりに実施した。 ＰＤＤの部分精製−ＨＳＳを１６ Ｘ １００ Ｐｏｒｏｓ ２０ＨＱカラム上
で分離させた。バッファーは、Ａは５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４であり、
１００ｕＭ ＭｎＣｌを含み、そしてＢは５００ｍＭ ＫＣｌを含むＡＴＣＣバ
ッファーである。カラムを１０ｍｌ／分にて負荷および展開した。勾配は１０Ｃ
Ｖ洗浄、１０ＣＶにて７０％Ｂまで直線勾配、そして１００％まで１ＣＶであっ
た。活性は勾配の極めて初期の画分において検出された。１ｍＭまで追加のＤＴ
Ｔを添加した後に、３３４２９株のプールされたカラム画分をアッセイのために
回収されたとおりに使用した。株ＧＥＢ０３１からの活性画分をプールして、Ｐ
Ｍ３０上で濃縮して、追加の１ｍＭ ＤＴＴの添加後に濃縮されたとおりに使用
した。 株 ＧＤ（Ｕ／ｍｇ） ＰＤＤ（Ｕ／ｍｇ） ＧＤ／ＰＤＤ比 ３３４２９ ０．６４ ０．２２ ２．９ ＧＥＢ０３１ ０．７９ ０．０８ ９．９ ＰＤＤ動力学−結果を以下に示す。 株 Ｋｍ（ｍＭプロパンジオール） Ｋｍ（ｕＭ ＮＡＤ） ３３４２９ ２８ ５７ 実施例２：Ｅ．ｂｌａｔｔａｅからの１，３−プロパンジオールデヒドロゲナー
ゼ遺伝子（ｄｈａＴ）のクローン化と配列決定 ｄｈａＴ遺伝子を、ＰＣＲにより、Ｅ．ｂｌａｔｔａｅのゲノミックＤＮＡか
ら、鋳型ＤＮＡとしてＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのｄｈａＴ配列に基づく合成プ
ライマー（プライマー１と２）を用いて５’末端にＸｂａＩ部位および３’末端
にＢａｍＨＩ部位を取り込んだ。生成物をｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ＴＯＰＯ
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にサブクローン化した。クローン化されたｄｈａＴ
を次に標準技術により配列決定した。
【００３３】 ＤＮＡ配列決定の結果を配列番号１および配列番号２として与える。 プライマー１ ５’ＴＣＴＧＡＴＡＣＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＡＡＴＧＣＣＴＧＧＣＧＧＡＡＡ
ＡＴ３’ プライマー２ ５’ＧＣＧＣＣＧＴＣＴＡＧＡＡＴＴＡＴＧＡＧＣＴＡＴＣＧＴＡＴＧＴＴＴＧ
ＡＴＴＡＴＣＴＧ３’ 当業者には容易に理解されるとおり、ＰＣＲ方法を通して生成された核酸配列
は不注意によるエラーを含んでいるかもしれない。本発明は、ＡＴＣＣ加盟番号
ＰＴＡ−９２を有するＥ．ｂｌａｔｔａｅから得ることができるＰＤＤをコード
する核酸も包含する。
ＡＴ３’ プライマー２ ５’ＧＣＧＣＣＧＴＣＴＡＧＡＡＴＴＡＴＧＡＧＣＴＡＴＣＧＴＡＴＧＴＴＴＧ
ＡＴＴＡＴＣＴＧ３’ 当業者には容易に理解されるとおり、ＰＣＲ方法を通して生成された核酸配列
は不注意によるエラーを含んでいるかもしれない。本発明は、ＡＴＣＣ加盟番号
ＰＴＡ−９２を有するＥ．ｂｌａｔｔａｅから得ることができるＰＤＤをコード
する核酸も包含する。
【００３４】 特許、特許出願、配列および刊行物を含む、本明細書中の全ての文献は、引用
により完全に本明細書に編入される。
により完全に本明細書に編入される。
【図１】 図１は、変異体１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ（ＰＤＤ）の核酸
配列（配列番号１）を提供する。
配列（配列番号１）を提供する。
【図２】 図２は、変異体１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ（ＰＤＤ）のアミ
ノ酸配列（配列番号１）を提供する。
ノ酸配列（配列番号１）を提供する。
【図３】 図３は、様々な微生物のＰＤＤのアミノ酸アラインメントを提供する。Ｅｂ
ＧＥＢＴはＡＴＣＣに寄託されたＥ．ｂｌａｔｔａｅ変異体ＰＤＤを表し、Ｅｂ
４２９ＴおよびＥｂ ９０７Ｔは野生型Ｅ．ｂｌａｔｔａｅ（ＡＴＣＣ加盟番
号３３４２９）を表し；ＫｐｎはＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
（ＧｅｎＢａｎｋ加盟番号Ｕ３０９０３）であり；ＣｆｕはＣｉｔｒｏｂａｃｔ
ｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ（ＧｅｎＢａｎｋ加盟番号Ｕ０９７７１）であり、そし
てＣｐａｓｔはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ（ＧｅｎＢ
ａｎｋ加盟番号ＡＦ００６０３４）である。
ＧＥＢＴはＡＴＣＣに寄託されたＥ．ｂｌａｔｔａｅ変異体ＰＤＤを表し、Ｅｂ
４２９ＴおよびＥｂ ９０７Ｔは野生型Ｅ．ｂｌａｔｔａｅ（ＡＴＣＣ加盟番
号３３４２９）を表し；ＫｐｎはＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
（ＧｅｎＢａｎｋ加盟番号Ｕ３０９０３）であり；ＣｆｕはＣｉｔｒｏｂａｃｔ
ｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ（ＧｅｎＢａｎｋ加盟番号Ｕ０９７７１）であり、そし
てＣｐａｓｔはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ（ＧｅｎＢ
ａｎｋ加盟番号ＡＦ００６０３４）である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 7/18 Ｃ１２Ｒ 1:66 //(Ｃ１２Ｎ 1/15 1:785 Ｃ１２Ｒ 1:66） Ｃ１２Ｒ 1:645 (Ｃ１２Ｎ 1/15 1:72 Ｃ１２Ｒ 1:785） Ｃ１２Ｒ 1:78 (Ｃ１２Ｎ 1/19 1:84 Ｃ１２Ｒ 1:645） Ｃ１２Ｒ 1:85 (Ｃ１２Ｎ 1/19 1:88 Ｃ１２Ｒ 1:72） Ｃ１２Ｒ 1:01 (Ｃ１２Ｎ 1/19 1:07 Ｃ１２Ｒ 1:78） Ｃ１２Ｒ 1:22 (Ｃ１２Ｎ 1/19 1:225 Ｃ１２Ｒ 1:84） Ｃ１２Ｒ 1:145 (Ｃ１２Ｎ 1/19 1:38 Ｃ１２Ｒ 1:85） Ｃ１２Ｒ 1:42 (Ｃ１２Ｎ 1/19 1:465 Ｃ１２Ｒ 1:88） Ｃ１２Ｒ 1:185 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:22） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:225） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:145） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:42） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:185） (Ｃ１２Ｐ 7/18 Ｃ１２Ｒ 1:185） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＺ，ＢＡ， ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，Ｃ Ｕ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ， ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，Ｌ Ｃ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ， ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，Ｓ Ｌ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 セリフォノバ，オルガ・ブイ アメリカ合衆国カリフォルニア州94024， ロス・アルトス，ホームステッド・コート 2240，アパートメント 214 Ｆターム(参考） 4B024 AA03 BA08 CA04 DA05 DA11 DA12 EA04 GA11 HA01 4B050 CC03 DD02 LL05 4B064 AC05 CA02 CA19 CA21 CC24 DA16 4B065 AA01X AA15X AA23X AA26X AA26Y AA29X AA30X AA41X AA46X AA50X AA60X AA66X AA73X AA76X AA77X AA79X AA82X AB01 BA01 CA05 CA28
Claims (19)
- 【請求項１】 対応する野生型１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼの
１，３−プロパンジオールに関するＫｍを超える、１，３−プロパンジオールに
関しての増加したＫｍを有する変異体１，３−プロパンジオールデヒドロゲナー
ゼ。 - 【請求項２】 増加したＫｍが野生型Ｋｍの約３倍である、請求項１記載の変
異体１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ。 - 【請求項３】 １，３−プロパンジオールに関して約８０ｍＭのＫｍを有する
、請求項１記載の変異体１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ。 - 【請求項４】 ＡＴＣＣ加盟番号ＰＴＡ−９２を有するＥ．ｂｌａｔｔａｅか
ら得ることができる、請求項１記載の変異体１，３−プロパンジオールデヒドロ
ゲナーゼ。 - 【請求項５】 図３に示すＥ．ｂｌａｔｔａｅ中の残基Ｈｉｓ１０５からＬｅ
ｕに対応する変異を有する、請求項１記載の変異体１，３−プロパンジオールデ
ヒドロゲナーゼ。 - 【請求項６】 配列番号２に示す配列を有するアミノ酸配列を含む、請求項１
記載の変異体１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ。 - 【請求項７】 配列番号２に示す配列を有する変異体１，３−プロパンジオー
ルデヒドロゲナーゼをコードする単離された核酸。 - 【請求項８】 配列番号１に示す配列を有する、請求項７記載の単離された核
酸。 - 【請求項９】 請求項７記載の単離された核酸を含む発現ベクター。
- 【請求項１０】 請求項９記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
- 【請求項１１】 Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ，Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ，Ｃｌ
ｏｓｔｒｉｄｉｕｍ，Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ，Ａｅｒｏｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｌａ
ｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ，Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓ，Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ，Ｐｉｃｈｉａ，Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ，Ｃａｎｄｉｄａ，Ｈａｎ
ｓｅｎｕｌａ，Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ，Ｍｕｃｏｒ，Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ
，Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌ
ａ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ，ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓを含む、請求項１０記載の宿主細胞。 - 【請求項１２】 変異体１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼが、図３
に示すＥ．ｂｌａｔｔａｅ中の残基Ｈｉｓ１０５からＬｅｕに対応する変異を有
する、請求項１０記載の宿主細胞。 - 【請求項１３】 変異体１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼが、配列
番号２に示す配列を有するアミノ酸配列を含む、請求項１０記載の宿主細胞。 - 【請求項１４】 工程： ｉ．対応する野生型１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼの１，３−プ
ロパンジオールに関するＫｍを超える、１，３−プロパンジオールに関しての増
加したＫｍを有する変異体１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼを含む微
生物を得るが、但し、該微生物はデヒドロゲナーゼ活性を発現することができる
少なくとも一つの遺伝子を含み、そして ｉｉ．上記微生物を炭素基質に接触させること からなる、微生物において１，３−プロパンジオールを生産する方法。 - 【請求項１５】 変異体１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼが、図３
に示すＥ．ｂｌａｔｔａｅ中の残基Ｈｉｓ１０５からＬｅｕに対応する変異を有
する、請求項１４記載の方法。 - 【請求項１６】 変異体１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼが、配列
番号２に示す配列を有するアミノ酸配列を含む、請求項１５記載の方法。 - 【請求項１７】 変異体１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼを、ＡＴ
ＣＣ加盟番号ＰＴＡ−９２を有するＥ．ｂｌａｔｔａｅから得ることができる、
請求項１４記載の方法。 - 【請求項１８】 微生物が、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ，Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔ
ｅｒ，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ，Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ，Ａｅｒｏｂａｃｉｌｌ
ｕｓ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ，Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ，Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｚｙｇｏｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｐｉｃｈｉａ，Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ，Ｃａｎｄｉｄ
ａ，Ｈａｎｓｅｎｕｌａ，Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ，Ｍｕｃｏｒ，Ｔｏｒｕｌ
ｏｐｓｉｓ，Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ，Ｓａｌｍ
ｏｎｅｌｌａ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ，ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＰｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓを含む、請求項１４記載の方法。 - 【請求項１９】 ＡＴＣＣ加盟番号ＰＴＡ−９２を有する単離された微生物。
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