KR20220061746A

KR20220061746A - 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제의 활성이 약화된 미생물 및 이를 이용한 3-히드록시프로피온산 제조방법

Info

Publication number: KR20220061746A
Application number: KR1020200148083A
Authority: KR
Inventors: 허인영; 성민경; 조정현; 김재형
Original assignee: 주식회사 엘지화학
Priority date: 2020-11-06
Filing date: 2020-11-06
Publication date: 2022-05-13

Abstract

본 출원은 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제의 활성이 약화된 미생물 및 이를 이용한 3-히드록시프로피온산 제조방법에 관한 것으로서, 일 예에 따른 미생물은 세포 생장에도 사용되는 포도당을 글리세롤을 생산하도록 변이되어, 3-HP 생산량의 생산량이 증가될 수 있고, 이를 이용하여 3-HP의 생산량을 증가시킬 수 있다.

Description

글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제의 활성이 약화된 미생물 및 이를 이용한 3-히드록시프로피온산 제조방법{Microorganism in which glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase activity is weakened and method for producing of 3-hydroxypropionic acid using the same}

본 출원은 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제의 활성이 약화된 미생물 및 이를 이용한 3-히드록시프로피온산 제조방법에 관한 것이다.

3-하이드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid, 3-HP)은 여러 화학공정에 사용되는 중요한 합성 중간체로, 3-HP를 전구체로 하여 합성되는 핵심 화합물로는 1,3-프로판디올, 아크릴릭 에시드(acrlici acid), 메틸 아크릴레이트(methyl acrylate), 아크릴아미드(acrylamide), 에틸 3-HP, 말로닉 에시드(malonic acid), 프로피로락톤(propiolactone) 및 아크릴로니트릴(acrylonitrile) 등이 있다. 또한, 3-HP는 2004년 US DOE(Department of Energy)에 의하여 바이오매스로부터 전환이 가능한 중요 고부가가치 화합물로 선정된 바 있을 정도로 경제적 가치가 우수하다.

3-HP는 에틸렌 사이아노하이드린, 베타-아이도프로피온산, 베타-브로모프로피온산, 베타-클로로프로피온산, 베타-프로피오락톤, 아크릴산 등을 중간체로 하여화학적 공정을 통해 생산될 수 있고, 글리세롤로부터 생물학적 공정을 통해 생산될수도 있다. 그러나 이러한 화학물질 대부분이 유독하며 발암성을 띠고, 높은 온도와 압력의 조건으로 대량의 에너지를 소모하며 다량으로 공해 물질을 배출하는 문제가 있다.

3-HP는 또한 미생물 발효를 통해 생산될 수 있다. 현재까지 대장균이나 크렙시엘라 뉴모니아 등을 이용한 3-HP 생산 공정이 연구되었으나, 생산성, 수율, 배지의 경제성 등의 측면에서 아직 상업적 수준에 이르지 못하고 있다. 현재까지 연구된 것들 중 대부분의 것들은 글리세롤을 기질로 하여 3-HP를 합성한 것들이고, 글리세롤 외에 포도당으로부터 3-HP를 생합성하는 기술에 대한 연구는 거의 이루어지지 않았으며, 포도당은 세포 생장에도 사용되어 3-HP 생산 수율이 저하되는 문제가 있다. 따라서, 포도당으로부터 3-HP를 생산할 수 있는 미생물 및 이를 이용한 3-HP 생산 방법에 대한 연구가 필요한 실정이다.

대한민국 공개특허 제10-2014-0003262호

일 예는 포도당으로부터 3-히드록시프로피온산의 생산능이 증가된 미생물 (예를 들면, 에스케리키아 속 미생물)을 제공한다.

일 예는 포도당으로부터 3-히드록시프로피온산의 생산 수율이 증가된 미생물 (예를 들면, 에스케리키아 속 미생물)을 제공한다.

다른 예는 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; GAPDH)의 활성이 약화된 미생물 (예를 들면, 에스케리키아 속 미생물)을 제공한다.

또 다른 예는 gapA 유전자가 gapN 유전자로 치환된, 미생물을 제공한다.

또 다른 예는 GAPDH 활성이 약화되고, 추가적으로 비인산화 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제 (Non-phosphorylating glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; GAPN)의 활성을 갖는 미생물을 제공한다.

다른 예는 상기 미생물을 포함하는, 3-히드록시프로피온산(3-Hydroxypropionic Acid) 생산용 조성물을 제공한다.

다른 예는 상기 미생물을 포도당 함유 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 3-히드록시프로피온산(3-Hydroxypropionic Acid)의 생산 방법을 제공한다.

본 출원은 포도당 (글루코스)으로부터 3-히드록시프로피온산의 생산능 (예를 들면, 포도당으로부터 3-히드록시프로피온산으로의 생산 수율)이 증가된 균주를 개발하는 것과 관련된 기술을 제공한다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 출원의 일 양상은

글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)의 활성이 약화된, 미생물 (예를 들면, 에스케리키아 (Escherichia) 속 미생물)을 제공하는 것일 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 출원의 또 다른 양상은

gapA 유전자가 gapN 유전자로 치환된, 미생물을 제공하는 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 미생물은 내재적 gapA 유전자가 스트렙토코쿠스 뮤탄스 유래의 gapN 유전자로 치환된 것일 수 있다.

일 예는 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)의 활성이 약화되고,

비인산화 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제 (Non-phosphorylating glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)를 포함하는 미생물을 제공하는 것일 수 있다.

상기 활성이 약화된 것은 숙주세포 (또는 숙주 미생물, 또는 모균주) 대비 활성이 약화된 것을 의미할 수 있다.

본 출원에서, “특정 효소 (또는 단백질)의 활성이 약화"되었다는 것은 세포 내에서 상기 단백질 또는 효소의 활성 정도가 야생형 균주 또는 변형 전의 미생물 (또는 변이가 도입되기 전의 미생물, 숙주세포, 숙주 미생물, 모균주)에 비하여 감소된 경우를 의미할 수 있다. 상기 약화는 효소 (또는 단백질)를 암호화하는 유전자의 변이 등으로 효소 자체의 활성이 본래 미생물이 가지고 있는 효소의 활성에 비해 감소한 경우와, 상기 효소 (또는 단백질)를 암호화하는 유전자의 전사 (transcription) 저해 및/또는 번역 (translation) 저해 등으로 상기 효소 (또는 단백질)의 발현 수준이 저하되어 세포 내에서 전체적인 효소 활성 정도가 야생형 균주 또는 변형 전의 균주에 비하여 낮은 경우, 이들의 조합 역시 포함하는 것을 의미할 수 있다. 또한, 본 출원에서, “특정 효소 (또는 단백질)가 불활성화”되었다는 것은, 상기 효소 (또는 단백질)를 암호화하는 유전자의 발현이 야생형 균주 또는 변형 전의 균주에 비하여 전혀 발현 되지 않거나, 발현이 되더라도 그 활성이 없는 상태를 의미할 수 있다. 또한 “특정 유전자가 불활성화”되었다는 것은 유전자에 의해 암호화되는 단백질의 불완전한 형태, 불완전화 활성을 갖는 형태, 절단 형태 (truncated form) 또는 단백질의 비형성을 포함한다. 불활성화는 하나 또는 그 이상의 유전자의 기능적 발현을 저해하는 것을 포함한다. 유전자 불활성화는 결실 (deletion), 단백질 코딩 서열의 파괴 (disruption), 삽입 (insertion), 추가(addition), 치환, 돌연변이 (mutation) 또는 종자 특이적인 유전자 침묵(seed-specific gene silencing) (예를 들면, RNAi)을 포함할 수 있다.

일 예에서, 특정 효소 (또는 단백질)의 활성 약화 및/또는 불활성화는, 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용으로 달성될 수 있다. 예를 들면, 상기 효소의 활성이 완전히 제거된 경우를 포함하여 상기 효소의 활성이 감소되도록 돌연변이된 유전자로 염색체상의 상기 효소를 암호화하는 유전자를 대체하는 방법; 상기 효소를 암호화하는 염색체상의 유전자의 발현 조절 서열 (예를 들면, 프로모터)에 변이를 도입하는 방법; 상기 효소를 암호화하는 유전자의 발현 조절 서열을 활성이 약하거나, 활성이 없는 서열로 교체하는 방법; 상기 효소를 암호화하는 염색체상의 유전자의 전체 또는 일부를 결실시키는 방법; 상기 염색체상의 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하여 상기 mRNA로부터 효소로의 번역을 저해하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 (예를 들면, 안티센스 RNA)를 도입하는 방법; 상기 효소를 암호화하는 유전자의 SD 서열 앞단에 SD 서열과 상보적인 서열을 인위적으로 부가하여 2차 구조물을 형성시켜 리보솜 (ribosome)의 부착이 불가능하게 만드는 방법 및 해당 서열의 ORF (open reading frame)의 3' 말단에 역전사 되도록 프로모터를 부가하는 RTE (Reverse transcription engineering) 방법 등이 있으며, 이들의 조합으로도 달성할 수 있다.

본 출원에서, 유전자 발현의 감소는 유전자의 발현량이 변이 전의 모균주 및/또는 야생형 균주의 발현량 보다 감소된 것을 의미하며, 발현이 완전히 저해되어 발현이 이루어지지 않은 경우를 포함한다. 미생물에서 발현을 감소시키고자 하는 경우에는 유전자 번역의 개시 코돈을 치환시켜 그 발현을 감소시키거나, 기존에 존재하는 유전자의 발현량이 감소하도록 유전공학적으로 조작할 수 있다. 발현 조절을 위하여 서열을 변형하는 방법은 상기 발현 조절 서열의 핵산 서열에 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현 조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 프로모터를 더욱 약한 프로모터로 교체하는 등의 방법으로써 수행할 수 있다. 상기 발현 조절서열은 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 암호화하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 발현을 감소시키는 유전자가 변이시키고자 하는 미생물 내에 존재하는 경우, 예를 들어, 상기 유전자의 발현을 작동시키는 고유의 프로모터(native promoter)를 약한 프로모터(weak promoter)로 치환하거나 혹은 변이를 도입함으로써 상기 유전자의 발현을 감소시킬 수 있다. 나아가, 기존 유전자의 전부 또는 일부를 결실시킴으로써 상기 유전자의 발현을 감소시킬 수 있다.

본 출원에서 “글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; GAPDH, G3PDH; EC 1.2.1.12)”는 전자 공여체/수용체로서 NAD+/NADH 쌍을 사용하여, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 (glyceraldehyde 3-phosphate; G3P)에서 1,3-바이포스포-D-글리세레이트 (1,3-bisphospho-D-glycerate; 1,3-BPG; E.C. 2.7.2.3)로의 가역적 전환을 촉매하는 효소를 의미할 수 있다. 1,3-BPG는 포스포글리세레이트 키나제 (phosphoglycerate kinase; PGK)에 의하여, 3-포스포글리세르산 (3-Phosphoglyceric acid; 3PG, 3PGA)로 가역적으로 전환될 수 있다. 일 예에서 GAPDH를 암호화하는 유전자는 gapA, gapB, gapC (예를 들면, 대장균, 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana)), GAPDH, GAPD, G3PD, GAPDHS (예를 들면, 호모 사피엔스 (Homo sapiens)), TDH1, TDH2, TDH3 (예를 들면, 사카로마이세스 세레비시아에), gap, gap2, gap3 (예를 들면, 미코박테리움 (Mycobacterium) 종, 노스톡 (Nostoc) 종)으로 지칭될 수 있다.

일 예에서, 상기 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; GAPDH)의 활성이 약화된 미생물은 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제 대신 비인산화 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제 (Non-phosphorylating glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; GAPN)를 포함하는 것일 수 있고, 예를 들면 내재적 gapA 유전자가 스트렙토코쿠스 뮤탄스 유래의 gapN 유전자로 치환된 것일 수 있다.

본 출원에서, “비인산화 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제 (Non-phosphorylating glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; GAPN; EC 1.2.1.9)”는 1,3-BPG를 통하여 진행되는 단계 없이 NADP+를 NADPH로 환원시켜 글리세르알데하이드-3-포스페이트 (G3P)에서 3-포스포글리세르산 (3PG)으로의 비가역적인 전환을 촉매하는 효소를 의미할 수 있다. 일 예에서, 상기 GAPN을 암호화하는 유전자는 gapN (예를 들면, 바실러스 속 (Bacillus sp.), 스트렙토코쿠스 속 (Streptococcus sp.), 클로스트리움 속 (Clostridium sp.) 유래), 및/또는 gapN1 (예를 들면, 클라미도모나스 속 (Chlamydomonas sp.) 유래)일 수 있다. 일 예에서 상기 gapN은 스트렙토코쿠스 뮤탄스 유래의 것 (EMBL Accession Nos. L38521)일 수 있다.

상기 비인산화 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제 (GAPN)의 활성을 갖는 미생물은, GAPN을 암호화하는 유전자; 이를 포함하는 발현 카세트; 상기 유전자 및/또는 상기 발현 카세트를 포함하는 벡터; 또는 이의 조합이 도입 (예를 들면, 형질전환)된 것일 수 있다.

일 예에 따른 미생물은 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제를 암호화하는 유전자가 결실되고, 외래의 비인산화 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제를 암호화하는 유전자 유전자; 이를 포함하는 발현 카세트; 상기 유전자 및/또는 상기 발현 카세트를 포함하는 벡터; 또는 이의 조합이 도입 (예를 들면, 형질전환)된 것일 수 있다. 일 예에 따른 미생물은 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제를 암호화하는 유전자 (예를 들면, gapA)가 비인산화 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제를 암호화하는 유전자 (예를 들면, gapN)로 치환된 것일 수 있다. 상기 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제를 암호화하는 유전자는 미생물에 내재적으로 존재하는 것일 수 있고 예를 들면, 대장균 유래의 gapA 유전자일 수 있다. 상기 외래의 비인산화 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제를 암호화하는 유전자는 스트렙토코쿠스 속 (예를 들면, 스트렙토코쿠스 뮤탄스 (Streptococcus mutans), 스트렙토코쿠스 아갈락티에 (Streptococcus agalactie)) 유래, 클로스트리움 유래 및/또는 바실러스 속 (예를 들면, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)) 유래의 gapN 유전자일 수 있다.

본 출원에서, "형질전환"은 유전자를 숙주 세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 발현시킬 수 있도록 하는 것이며, 형질전환된 유전자는 숙주 세포 내에서 발현될 수 있으면 숙주 세포의 염색체 내 삽입 또는 염색체 외에 위치하고 있는 것이든 제한하지 않고 포함될 수 있다. 또한, 상기 유전자는 표적 단백질을 암호화하는 DNA 및/또는 RNA를 포함한다. 상기 유전자는 숙주 미생물 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 그 도입되는 형태는 제한이 없다. 예를 들면, 상기 유전자는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주 미생물에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 유전자에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및/또는 번역 종결신호 등의 발현 조절 요소를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 유전자는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다.

본 출원에서, 형질전환시키는 방법은 유전자를 세포 내로 도입하는 방법이면 제한 없이 포함되며, 숙주 세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO₄) 침전, 염화칼슘(CaCl₂) 침전, 미세주입법(microinjection), 레트로바이러스 감염(retroviral infection), 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및/또는 초산 리튬-DMSO법 등이 사용될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 미생물(또는 재조합 세포)은 일 구체예에 따른 gapN 유전자 서열이 염색체 내에 통합된 것일 수 있다. 상동 재조합은 일 예에 따른 벡터의 사용과 함께, 벡터에 의해 세포 내로 전달되는 일 예에 따른 gapN 유전자 대한 염색체 상의 DNA 절편의 교환을 허용할 수 있다. 예를 들면, 일 예에 따른 미생물은 gapN 유전자가 염색체 내에서 천연 유전자 부위에서 천연(내재적) gapA 유전자에 대해 교환될 수 있거나 추가의 유전자 부위에 통합된 것일 수 있다.

본 출원에서, "프로모터"는 폴리머라제에 대한 결합 부위를 포함하고 프로모터 하위 유전자의 mRNA로의 전사 개시 활성을 가지는, 암호화 영역의 상위(upstream)의 비해독된 핵산서열, 즉, 폴리머라제가 결합하여 유전자의 전사를 개시하도록 하는 DNA 영역을 말하며, mRNA 전사 개시부위의 5' 부위에 위치할 수 있다.

본 출원에서, "벡터"는 숙주 세포로 염기의 클로닝 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 의미할 수 있다. 벡터는 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위(replicon)일 수 있다. "복제단위"란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제 가능한, 임의의 유전적 단위(예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 말한다.

상기 벡터는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질(예를 들면, 상기 GAPN)을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 암호화하는 유전자(또는 폴리뉴클레오티드)의 핵산 서열을 함유하는 DNA 제조물일 수 있다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 암호화하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.

본 출원에서, "작동 가능하게 연결"된 것은 상기 단백질을 암호화하는 유전자(또는 폴리뉴클레오티드)의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.

상기 벡터는 숙주 세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 예를 들면, 상기 벡터는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지일 수 있고, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, pWE15, M13, λEMBL3, λEMBL4, λFIXII, λDASHII, λZAPII, λgt10, λgt11, Charon4A, 및/또는 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pDZ 벡터, pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및/또는 pET계 등을 사용할 수 있다. 예를 들면, pCR2.1, pDC, pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, 및/또는 pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다.

일 예에서, 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내에 GAPDH를 암호화하는 유전자 (예를 들면, gapA)를 GAPN을 암호화하는 유전자 (예를 들면, gapN) 로 교체 (치환)시킬 수 있다. 상기 GAPN을 암호화하는 유전자 (또는 폴리뉴클레오티드)의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동 재조합(homologous recombination)에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커 (selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 폴리뉴클레오티드 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 변이형 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제 (selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.

일 예에서, 상기 미생물은 추가적으로 하기 (1) 내지 (5)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 효소의 활성이 강화된 것일 수 있다:

(1) 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로게나제 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase; GPD), (2) 글리세롤-3-포스페이트 포스파타제 (glycerol-3-phosphate phosphatase; GPP), (3) 글리세롤 디하이드라타제 (glycerol dehydratase), (4) 글리세롤 디하이드라타제 리액티바제 (glycerol dehydratase reactivase), 및 (5) 알데히드 디하이드로게나아제 (aldehyde dehydrogenase).

본 출원에서, “활성 강화" 또는 “활성이 강화된” 것이란, 단백질 자체의 활성이 새로 도입되거나 증대되어 본래 기능 이상의 효과를 도출하는 것을 포함할 뿐만 아니라, 내재적 유전자 활성의 증가, 내부 또는 외부 요인으로부터 내재적 유전자 증폭, 상기 유전자 발현의 억제 조절 인자의 결실, 유전자 카피수 증가, 외부로부터의 유전자 도입, 발현 조절 서열의 변형, 및/또는 프로모터 교체 또는 변형 및 유전자 내 돌연변이에 의한 효소 활성의 증가 등과 같은 조작이 이루어지기 전의 미생물이 가지는 활성에 비하여 조작이 이루어진 이후의 미생물이 가지고 있는 활성이 증가된 상태를 의미할 수 있다.

일 예에서, 단백질 (효소)의 활성이 강화되는 것은 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용으로 달성될 수 있다. 상기 효소의 활성을 강화 또는 증가시키는 방법은 당해 분야에서 잘 알려진 다양한 방법의 적용이 가능하다. 예를 들면, 이로 제한되는 것은 아니지만, 해당 효소 (또는 단백질)들을 암호화하는 염기서열을 포함하는 유전자 (폴리뉴클레오타이드)를 추가로 염색체에 삽입하는 방법, 상기 유전자 (폴리뉴클레오타이드)를 벡터 시스템에 도입하는 방법 등에 의하여 효소 (또는 단백질)들을 암호화하는 염기서열의 카피수를 증가시키는 방법, 유전자 (폴리뉴클레오타이드)를 발현시킬 수 있는 프로모터를 강한 프로모터로 교체하는 방법, 프로모터에 변이를 도입하는 방법이 포함될 수 있으며 유전자 변이에 의해 활성이 강한 효소 (또는 단백질)로 변이시키는 방법 등이 있다. 상기 유전자 (폴리뉴클레오타이드)의 숙주 세포 유전체 (염색체) 내 삽입하는 방법은 공지된 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있으며, 예를 들면, RNA-가이드 엔도뉴클레아제 시스템 (RNA-guided endonuclease ystem; 예를 들면, (a) RNA-가이드 엔도뉴클레아제 (예를 들면, Cas9 단백질 등), 이의 암호화 유전자, 또는 상기 유전자를 포함하는 벡터; 및 (b) 가이드 RNA (예를 들면, single guide RNA (sgRNA) 등), 이의 암호화 DNA, 또는 상기 DNA를 포함하는 벡터를 포함하는 혼합물 (예를 들면, RNA-가이드 엔도뉴클레아제 단백질과 가이드 RNA의 혼합물 등), 복합체 (예를 들면, 리보핵산 융합단백질 (RNP), 재조합 벡터 (예를 들면, RNA-가이드 엔도뉴클레아제 암호화 유전자 및 가이드 RNA 암호화 DNA를 포함하는 함께 포함하는 벡터 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상)을 사용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

일 예에 따른 미생물은 항시 발현 프로모터와 이와 작동 가능하게 연결된 유전자를 추가적으로 포함하여 상기 유전자가 암호화하는 단백질 (또는 효소)의 활성이 강화된 것일 수 있다. 상기 항시 발현 프로모터 (constitutive expression promoter)는 별도의 유도제 없이도 작동적으로 연결된 유전자의 발현을 유도할 수 있다. 일 예에서, 단백질 (또는 효소)의 활성을 강화시키는 것은 프로모터를 변이 또는 치환을 통해 네이티브 프로모터 (native promoter)에 비하여 강한 프로모터로 변이시킬 수 있다. 상기 내재적 효소의 프로모터 대신 염기치환 변이를 갖는 개량형 프로모터 또는 이종 프로모터가 연결될 수 있다.

일 예에서, 상기 미생물은 (i) 하기 (1) 내지 (5)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 유전자; (ii) 상기 선택된 1종 이상의 유전자를 포함하는 발현 카세트; 및/또는 (iii) 상기 선택된 1종 이상의 유전자 또는 상기 발현 카세트를 포함하는 벡터를 추가적으로 포함할 수 있다. 일 예에서, 하기 (1) 내지 (5)로 이루어진 군에서 선택된 유전자의 핵산 서열은 상기 미생물에 자연적으로 존재하지 않는 이종 서열 및/또는 동종 서열을 포함한다:

(1) 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로게나제 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase; GPD)를 암호화하는 유전자 (예를 들면, GPD1 유전자), (2) 글리세롤-3-포스페이트 포스파타제 (glycerol-3-phosphate phosphatase; GPP)를 암호화하는 유전자 (예를 들면, GPP2 유전자), (3) 글리세롤 디하이드라타제 (glycerol dehydratase)를 암호화하는 유전자 (예를 들면, dhaB 유전자), (4) 글리세롤 디하이드라타제 리액티바제 (glycerol dehydratase reactivase)를 암호화하는 유전자 (예를 들면, gdrAB 유전자), 및 (5) 알데히드 디하이드로게나아제 (aldehyde dehydrogenase)를 암호화하는 유전자 (예를 들면, aldH 유전자).

본 출원에서, "글리세롤-3-포스페이트 디하이드로게나제(glycerol-3-phosphate dehydrogenase: GPD)"는 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)에서 글리세롤-3-포스페이트 (G3P)로의 전환을 촉매화하는 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 의미할 수 있다. 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로게나제는 NADH, NADPH, 또는 FAD- 의존성일 수 있다. 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로게나제는 그 유래에 관계없이, DHAP 에서 G3P 로의 전환을 촉매하는 효소 활성을 가지는 효소라면 본원의 범주에 포함될 수 있고, 예를 들면, 이를 암호화하는 유전자는 GPD1 및/또는 GPD2일 수 있으며, 사카로미세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 유래일 수 있다.

본 출원에서, "글리세롤-3-포스페이트 포스파타제(glycerol-3-phosphate phosphatase: GPP)"는 글리세롤-3-포스페이트 (G3P)에서 글리세롤로의 전환을 촉매화하는 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 말한다. 글리세롤-3-포스페이트 포스파타제는 그 유래에 관계없이, G3P 에서 글리세롤로의 전환을 촉매하는 효소 활성을 가지는 효소라면 본원의 범주에 포함될 수 있고, 예를 들면, 이를 암호화하는 유전자는 GPP1 및/또는 GPP2일 수 있으며, 사카로미세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 유래일 수 있다.

본 출원에서, "글리세롤 디하이드라타제 (glycerol dehydratase)" 또는 "디올 디하이드라타제 (diol dehydratase)"는 글리세롤에서 3-히드록시프로피온알데히드 (3-HPA)로의 전환을 촉매화하는 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 의미할 수 있다. 글리세롤 디하이드라타제 또는 디올 디하이드라타제는 코엔자임 B12 의존성이거나 비의존성일수 있다. 상기 효소는, 크렙시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumoniae), 시트로박터 프레운디 (Citrobacter freundii), 클로스트리디움 파스튜리아늄 (Clostridium pasteurianum), 살모넬라 타이티무리움 (Salmonella typhimurium), 클렙시엘라 옥시토카 (Klebsiella oxytoca), 및/또는 클로스트리디움 부티리쿰 (Clostridium butyricum) 등의 유래일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 효소는, 그 유래에 관계없이, 글리세롤에서 3-히드록시프로피온알데히드 (3-HPA)로의 전환을 촉매하는 효소 활성을 가지는 효소라면 본원의 범주에 포함될 수 있고, 예를 들면, 이를 암호화하는 유전자는 dhaB 일 수 있다. 일 예에서, 상기 dhaB 은 크렙시엘라 뉴모니아 유래의 것 (EMBL Accession Nos. U30903.1)일 수 있다.

본 출원에서, "글리세롤 디하이드라타제 리액티바제 (glycerol dehydratase reactivase)"는 글리세롤 디하이드라타제가 작용하는 동안 비가역적으로 불활성화되는 것을 다시 활성화하여 촉매 활성을 유지시키는 작용을 하는 효소를 의미할 수 있다. 글리세롤 디하이드라타제 리액티바제로는 일반적으로 알려진 어느 것이라도 사용할 수 있으며, 예를 들어, 클랩시엘라 속 (Klebsiella sp.) (예를 들면, 크렙시엘라 뉴모니아), 시트로박터 속 (Citrobacter sp.), 락토바실러스 속 (Lactobacillus sp.), 살모넬라 속 (Salmonella sp.) 균주 등에서 유래할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 글리세롤 디하이드라타제 리액티바제는 DhaFG, GdrAB, DdrAB 등일 수 있으며, 예를 들면, 이를 암호화하는 유전자는 dhaFG, gdrAB, 및/또는 ddrAB 일 수 있다.

본 출원에서, "알데히드 디하이드로게나제 (aldehyde dehydrogenase)"는 알데히드를 카르복실산으로 전환시키는 효소로서, 3-히드록시프로피온알데히드(3-HPA)에서 3-히드록시프로피온산(3-HP)으로의 전환을 촉매화하는 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 의미할 수 있다. 알데히드 디하이드로게나제는 일반적으로 알려진 어느 것이라도 사용할 수 있으며, 예를 들면, 에스케리키아 속 (예를 들면, 에스케리키아 속 (예를 들면, 대장균) 등에서 유래할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 3-히드록시프로피온알데히드(3-HPA)에서 3-히드록시프로피온산(3-HP)으로의 전환을 촉매하는 효소 활성을 가지는 효소라면 본원의 범주에 포함될 수 있고, 예를 들면, 이를 암호화하는 유전자는 aldH 및/또는 puuC 등일 수 있다.

일 예에서, 상기 미생물은 GPD를 암호화하는 유전자 및 GPP를 암호화하는 유전자를 더 포함할 수 있으며, 예를 들면, 유도성 프로모터와 이에 작동 가능하게 각각 연결된 GPD를 암호화하는 유전자 및 GPP를 암호화하는 유전자를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 유도성 프로모터는 유도 물질의 첨가(처리)에 의하여 프로모터에 연결되 유전자의 발현을 유도하는 것일 수 있고, 유도성 프로모터를 이용하여 외래 유전자인 GPD 암호화 유전자 및 GPP를 암호화 유전자의 전사 시기를 조절할 수 있다. 일 예에 따르면 상기 유도성 프로모터는 BAD, LTTR, BAD, Trc, 및/또는 Tac일 수 있고, 유도성 프로모터가 BAD인 경우 유도물질이 L-아라비노스이고, 유도성 프로모터가 LTTR 인 경우 유도물질이 3-HP일 수 있다. 일 구체예에 따르면, 상기 미생물은 LTTR 프로모터와 작동적으로 연결된 GPD 유전자 및 GPP 유전자를 추가로 포함할 수 있다.

상기 BAD, LTTR, 및/또는 TAC 프로모터는 하기 표 1에 기재된 핵산 서열을 포함하거나 표 1에 기재된 핵산 서열로 이루어지는 것일 수 있다.

명칭	서열 (5’->3’)	서열번호
TAC	ttgacaattaatcatcggctcgtataatgtgt	서열번호 14
BAD	AAAGCCATGACAAAAACGCGTAACAAAAGTGTCTATAATCACGGCAGAAAAGTCCACATTGATTATTTGCACGGCGTCACACTTTGCTATGCCATAGCATTTTTATCCATAAGATTAGCGGATCCTACCTGACGCTTTTTATCGCAACTCTCTACTGTTTCTCCAT	서열번호 15
LTTR	GTCAGCCTCAGCGCACCTCGAATGTGCAAAAACGCAGACCATACTTGCACATCACCGCATTGAGTACATCAAAAATGCACTGTTAGGATCGATCCAGACAACAAAAAAGCCACA	서열번호 5

일 예에서 상기 유도성 프로모터가 도입된 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로게나제를 암호화하는 유전자와, 유도성 프로모터가 도입된 글리세롤-3-포스페이트 포스파타제를 암호화하는 유전자는, 각각 벡터 내에 클로닝되어 세포에 도입될 수 있다. 또는, 상기 두 유전자가 하나의 벡터 내에 클로닝되어 세포에 도입될 수 있다. 여기에서, 벡터는 개체의 세포 내에서 목적 단백질을 암호화하는 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말하며, 플라스미드, 바이러스 벡터, 박테리오파지 벡터, 코즈미드 벡터 등 다양한 형태의 벡터를 사용할 수 있다.

일 예에서, 상기 미생물은 글리세롤 디하이드라타제를 암호화하는 dhaB 유전자, 글리세롤 디하이드라타제 리액티바제를 암호화하는 gdrAB 유전자, 및 알데히드 디하이드로게나아제를 암호화하는 aldH 유전자를 더 포함할 수 있으며, 이에 의해 일 예에 따른 미생물은 dhaB, gdrAB, 및 aldH 유전자가 과발현되어 글리세롤 디하이드라타제, 글리세롤 디하이드라타제 리액티바제, 및 아라비노스 수송 단백질의 활성이 강화된 것일 수 있다. 일 예에 따른 미생물은 항시 발현 프로모터와 이와 작동 가능하게 연결된 dhaB, gdrAB, 및 aldH를 추가적으로 포함하는 것일 수 있다. 상기 항시 발현 프로모터(constitutive expression promoter)는 별도의 유도제 없이도 작동적으로 연결된 유전자의 발현을 유도할 수 있다. 상기 항시 발현 프로모터는 J23100, J23101, J23102, J23103, J23104, J23105, J23106, J23107, 및/또는 J23109 일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자가 3-HP 생산 목적 범위에서 필요에 따라 제한 없이 선택하여 사용할 수 있다. 일 구체예에 따르면, 상기 미생물은 J23101 프로모터와 작동적으로 연결된 dhaB 유전자 및 gdrAB 유전자와 J23100 프로모터와 작동적으로 연결된 aldH 유전자를 추가로 포함할 수 있다.

일 예에서, 항시 발현 프로모터가 도입된 글리세롤 디하이드라타제를 암호화하는 유전자, 항시 발현 프로모터가 도입된 글리세롤 디하이드라타제 리액티바제를 암호화하는 유전자, 및 항시 발현 프로모터가 도입된 아라비노스 수송 단백질를 암호화하는 유전자는 각각 벡터 내에 클로닝되어 세포에 도입될 수 있다. 또는, 상기 세 유전자가 하나의 벡터 내에 클로닝되어 세포에 도입될 수 있다. 벡터에 대한 것은 전술한 바와 같다.

일 예에서 상기 미생물은 추가적으로 하기 (1) 내지 (6)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 효소의 활성이 약화되거나 불활성화된 것일 수 있다:

(1) 1,3-프로판다이올 데하이드로지나아제(1,3-propanediol dehydrogenase);

(2) 글리세롤 키나아제(glycerol kinase);

(3) 아세테이트 키나아제(acetate kinase);

(4) 포스포트랜스아세틸라제(phosphotransacetylase, Phosphate Acetyltransferase)

(5) 락테이트 디하이드로게나제 (lactate dehydrogenase); 및

(6) 글리세롤 디하이드로게나제 (glycerol dehydrogenase).

일 구체예에서, 상기 미생물은 하기 (i) 내지 (v)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 유전자가 추가적으로 결실된 것일 수 있다:

(i) 1,3-프로판다이올 데하이드로지나아제 (1,3-propanediol dehydrogenase)를 암호화하는 yqhD 유전자, (ⅱ) 글리세롤 키나아제 (glycerol kinase)를 암호화하는 glpK 유전자, (ⅲ) 락테이트 디하이드로게나제 (lactate dehydrogenase)를 암호화하는 ldhA 유전자, (ⅳ) 아세테이트 키나아 제(acetate kinase)-포스포트랜스아세틸라제 (phosphotransacetylase)를 암호화하는 ackA-pta 유전자, 및/또는 (ⅴ) 글리세롤 디하이드로게나제 (glycerol dehydrogenase)를 암호화하는 gldA 유전자.

일 구체 예에서, 상기 미생물은 하기 (1) 내지 (3)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 특징을 추가적으로 포함할 수 있다:

(1) yqhD, glpK, ldhA, ack-pta, 및 gldA 유전자가 추가적으로 결실;

(2) 유도성 프로모터 및 이에 작동 가능하게 연결된 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로게나제 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase)를 암호화하는 GPD 유전자 및/또는 글리세롤-3-포스페이트 포스파타제 (glycerol-3-phosphate phosphatase)를 암호화하는 GPP 유전자를 추가적으로 포함; 및

(3) 항시성 프로모터 및 이에 작동 가능하게 연결된 글리세롤 디하이드라타제 (glycerol dehydratase)를 암호화하는 dhaB 유전자, 글리세롤 디하이드라타제 리액티바제 (glycerol dehydratase reactivase)를 암호화하는 gdrAB 유전자, 및/또는 알데히드 디하이드로게나제 (aldehyde dehydrogenase)를 암호화하는 aldH 유전자를 추가적으로 포함.

일 예에 따른 미생물은 (모균주 보다) 세포 생장이 억제 (감소, 저하)된 것일 수 있다. 글루코스는 세포 생장과 3HP 생산에 모두에 사용되므로, 세포 생장을 억제 (감소, 저하) 시킬 경우, 3HP 생산능이 증가할 수 있다.

본 출원에서, “미생물”은 단세포 박테리아를 포함하는 것일 수 있다.

일 예에서 상기 미생물은 에스케리키아 (Escherichia) 속 미생물일 수 있고,예를 들면, 대장균 (예를 들어, E.coli DH5a, E.coli JM101, E.coli K12, E.coli W3110, E.coli X1776, E.coli B 및 E.coli XL1-Blue)을 포함하는 에스케리키아 속일 수 있다.

일 예에 따른 미생물은 유기산을 합성하는 능력을 가질 수 있으며, 예를 들면, 3-하이드록시프로피온산 (3-Hydroxypropionic Acid)을 합성하는 능력 (또는 3-HP 생산능을 가질 수 있다. 일 예에 따른 미생물은 그 자체가 유기산 생산에 관여하는 유전자를 포함하여 유기산을 생산하거나, 유기산 생산능을 가지도록 또는 유기산 생산능이 강화되도록 유전적으로 조작된 균주일 수 있다. 상기 유기산의 생산은 균주 내에서 생산되는 것, 세포 내에서 생산되어 세포 외부로 분비되는 것, 또는 그 조합을 포함한다.

상기 3-히드록시프로피온산 (3-HP)은 젖산 (2-히드록시프로피온산)의 이성질체로서 고분자 코팅제의 가교제, 금속 윤활제, 섬유의 정전기 방지제 등으로 사용되고, 아크릴산, 1,3-프로판디올, 메틸아크릴레이트, 에틸 3-히드록시프로피온산, 말로닉산, 프로피온락톤, 아크로니트릴, 또는 아크릴아마이드 등 상업적으로 중요한 여러 화학물질로 전환될 수 있는 플랫폼 화합물이다. 3-HP는 글리세롤로부터 생물학적 공정을 통해 생산될 수 있다.

본 출원에서, “3-히드록시프로피온산 (3-HP) 생산능을 갖는다”는 것은 자연적으로 3-HP 생산능을 갖는 세포 및/또는 미생물, 또는 3-HP 생산능이 없는 모균주에 3-HP 생산능이 부여된 미생물을 의미한다. 일 예에 따른 변이가 도입됨으로써 상기 미생물이 3-HP 생산능을 갖는 경우 및/또는 3-HP 생산능을 갖지 않는 미생물에 일 예에 따른 변이가 도입됨으로써 상기 미생물이 3-HP 생산능을 갖게 되는 경우를 의미하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들면, 3-HP 생산능을 갖는 에스케리키아 속 미생물이란 천연형 미생물 자체 또는 3-HP 생산 기작과 관련된 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성을 강화시키거나 불활성시켜 향상된 3-HP 생산능을 가지게 된 에스케리키아 속 미생물을 의미할 수 있다.

일 예에서, 상기 미생물은 3-HP 생산능을 가지고 있거나 3-HP 생산능을 가지도록 유전적으로 조작된 균주일 수 있다. 상기 3-HP 의 생산은 균주 내에서 생산되는 것, 세포 내에서 생산되어 세포 외부로 분비되는 것, 또는 그 조합을 포함한다.

상기 미생물(또는 재조합 세포)은 재조합 전의 세포, 모균주, 및/또는 야생형 균주 보다 3-HP생산능이 증가(향상)된 것일 수 있다. 일 예에 따른 미생물은 재조합 전의 세포, 모균주(숙주 미생물), 및/또는 야생형 균주 보다 균주 생장 (또는 생장율) 대비 3-HP 생산능이 증가 (향상)된 것일 수 있다. 일 예에 따른 변이가 도입된 미생물은 동종의 비변형 미생물과 비교하여, 3-HP 생산이 증가된 것일 수 있다. 상기 비변형 미생물은 일 예에 따른 변이가 도입되지 않은 동종의 미생물 또는 도입되기 전의 미생물을 의미할 수 있다. 일 예에서, 3-HP의 생산능 (예를 들면, 포도당 대비 3-HP의 생산 수율, 포도당으로부터 3-HP 생산 수율)은 본 발명의 변이가 도입되지 않은 미생물 (모균주, 및/또는 숙주 미생물)보다 약 0.1% 이상, 약 1% 이상, 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 약 100% 이상, 200% 이상, 또는 300% 이상 증가된 것일 수 있다.

상기 미생물(또는 재조합 세포)는 추가적으로 3-HP 생산이 증가되도록 하는 변이를 포함할 수 있고, 상기 변이의 위치 및/또는 변이 대상이 되는 유전자 및/또는 단백질의 종류는 3-HP 생산이 증가되도록 하는 것이면 제한 없이 포함될 수 있다. 상기 미생물은 형질전환이 가능한 세포라면 제한 없이 사용 가능할 수 있다.

본 출원에서, 일 예에 따른 변이가 도입되기 전의 미생물을 일 예에 따른 변이가 도입되어 3-HP 생산능이 증가되거나 3-HP 생산능이 부여된 미생물과 구별하기 위하여, 일 예에 따른 변이가 도입되기 전의 미생물을 숙주 미생물(또는 모균주)로 표현할 수 있다.

또 다른 양상은 상기 미생물을 포도당 (글루코스) 함유 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 3-히드록시프로피온산(3-Hydroxypropionic Acid)의 생산 방법(제조 방법)을 제공한다.

일 예에 따른 생산 방법은 유도성 프로모터에 대한 유도물질을 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 유도물질 첨가에 의해, GPD 및/또는 GPP 발현이 유도될 수 있다. 일 예에서, 유도성 프로모터는 BAD, LTTR, 및/또는 TAC 일 수 있고, 유도성 프로모터가 BAD인 경우 유도물질이 L-아라비노스이고, 유도성 프로모터가 LTTR 인 경우 유도물질이 3-HP일 수 있고, 유도성 프로모터가 TAC일 경우 유도물질이 IPTG일 수 있으며, 유도성 프로모터에 대해서는 전술한 바와 같다.

일 예에서, 배양하는 단계는 배양 동안 B12를 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 생산 방법은 배양된 배지 또는 미생물에서 3-히드록시프로피온산을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 배양은 당업계에 알려진 적절한 배지와 배양 조건에 따라 이루어질 수 있고 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 하며, 통상의 기술자에 의해 적절하게 변형될 수 있다.

상기 배양 방법은 예를 들면, 회분식 배양 (batch culture), 연속식 배양 (continuous culture), 유가식 배양 (fed-batch culture), 또는 이들의 조합 배양을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

일 예에 따르면, 배지에 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함할 수 있고, 상기 재조합 세포를 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 온도 및/또는 pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 글루코스, 수크로스, 락토스, 프락토스, 말토스, 전분, 및/또는 셀룰로스와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 및/또는 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 및/또는 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 및/또는 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산 암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함될 수 있다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 사용될 수 있는 인의 공급원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 그 외에, 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 포함될 수 있다. 또한 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기 배지 또는 개별 성분은 배양과정에서 배양액에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

일 예에 따르면, 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 미생물 배양액에 적절한 방식으로 첨가하여 배양액의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 추가적으로, 배양액의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양액 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예, 공기)를 주입할 수 있다. 배양액의 온도는 20℃ 내지 45℃, 25℃ 내지 40℃, 또는 30℃ 내지 37℃일 수 있다. 배양기간은 유용물질(예를 들면, 3-HP)이 원하는 생산량으로 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 예를 들면, 10 내지 160 시간일 수 있다.

일 예에서, 상기 생산 방법은 배양된 배지 또는 미생물에서 3-히드록시프로피온산을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 배양된 미생물 (또는 재조합 세포) 및/또는 배양 배지에서 3-HP을 분리 및/또는 회수하는 단계는 배양방법에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지, 배양액, 또는 미생물로부터 목적하는 물질 (예를 들면, 3-HP)을 수집하는 것일 수 있다. 예를 들면, 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증방, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해 (예를 들면 암모늄 설페이트 침전), 및/또는 크로마토그래피 (예를 들면 이온 교환, 친화성, 소수성, 액체, 및 크기배제) 등의 방법을 사용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 배양 배지는 미생물 (또는 재조합 세포)를 배양한 배지를 의미할 수 있다.

일 예에서, 상기 3-HP 생산 방법은 3-HP를 정제하는 단계를 상기 분리 및/또는 회수하는 단계 이전, 동시, 또는 그 이후에 추가적으로 포함할 수 있다.

다른 양상은 상기 미생물을 포함하는, 3-히드록시프로피온산 (3-Hydroxypropionic Acid) 생산용 조성물을 제공한다.

다른 양상은 일 예에 따른 변이를 미생물에 도입 (예를 들면, 형질전환)시키는 단계를 포함하는, 상기 미생물의 3-HP 생산능 (또는 3-HP 생산 수율) 증가 방법 또는 상기 미생물에 3-HP 생산능을 부여하는 방법을 제공할 수 있다. 일 예에 따른 변이에 대한 것은 전술한 바와 같이, 효소 (또는 단백질) 활성의 약화, 불활성화, 및/또는 강화를 유도하는 것일 수 있다.

다른 양상은 상기 미생물을 배양한 배양물을 제공하는 것일 수 있다. 상기 배양물은 3-HP를 포함하는 것일 수 있다.

일 예에 따른 미생물은 세포 생장에도 사용되는 포도당을 글리세롤을 생산하도록 변이되어, 유입된 포도당 대비 3-HP 생산 수율이 증가될 수 있다.

본 발명은 하기 실시예를 들어 더욱 자세히 설명할 것이나, 하기 실시예로 권리범위가 한정되는 의도는 아니다.

실시예 1. 변이주 제작

실시예 1-1. pRSF-pLTTR-GPD-GPP 제작

사카로미세스 세레비지에 유래의 GPD1 및 GPP2 유전자는 하기 표 2의 서열번호 1과 2 또는 서열번호 3과 4의 프라이머 쌍을 각각 이용하여 PCR (95℃에서 2분 예비변성; 95℃에서 1분 변성, 55℃에서 30초 어닐링, 및 72℃에서 2분 신장을 28회 반복; 72℃에서 5분 최종신장; 4도로 유지하여 보관) 하였고, 각각 BamHI/SacI 과 KpnI/XhoI 제한효소 처리하여, LTTR 프로모터를 포함하는 pRSFDuet-1 벡터(Invitrogen)에 클로닝 하여, pRSF-pLTTR-GPD-GPP 을 포함하는 벡터 (이하, pRSF-pLTTR-GPD-GPP 벡터)를 제작하였다. 사용한 LTTR 프로모터의 서열은 하기 표 3에 기재하였다.

명칭	서열(5'->3')	서열번호
GPD1-F	CATCATCATGGATCCATAGCAGTAAGAAAGGAGCATCCATCatgagcgctgcggctg	서열번호 1
GPD1-R	CATCATCATGAGCTCtcaatcttcatgaaggtctaattcttcaatcatg	서열번호 2
GPP2-F	CATCATCATGGTACCACAGTTTTAGTAAAGGAGCATCAAAAatgggactcactacgaaaccg	서열번호 3
GPP2-R	catcatcatCTCGAGttaccatttcagcagatcgtctttgg	서열번호 4

명칭	서열(5'->3')	서열번호
LTTR	GTCAGCCTCAGCGCACCTCGAATGTGCAAAAACGCAGACCATACTTGCACATCACCGCATTGAGTACATCAAAAATGCACTGTTAGGATCGATCCAGACAACAAAAAAGCCACA	서열번호 5

실시예 1-2. pCDF_J23101_dhaB_gdrAB_J23100_aldH 제작

글리세롤 디하이드라타제를 코딩하는 유전자 (dhaB), 알데히드 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자 (aldH) 및 글리세롤 디하이드라타제 리액티바제를 코딩하는 유전자 (gdrAB)를 플라스미드 pCDF 에 클로닝하여 ‘pCDF_J23101_dhaB_gdrAB_J23100_aldH’ 를 제작하였다, 구체적으로, pCDFDuet-1 벡터의 프로모터 부분을 J23101과 J23100 프로모터로 치환하였다.

dhaB (약 2.7 kb; dhaB1, dhaB2, dhaB3) 및 gdrAB 유전자 (약 2.2 kb; gdrA, gdrB)는 크렙시엘라 뉴모니아의 염색체에서 하기 표 4의 서열번호 6과 7 또는 서열번호 8과 9의 프라이머 쌍 및 NEB Q5 DNA 폴리머라제를 이용해 NEB에서 제공하는 조건을 사용하여 증폭하였다:

명칭	서열(5'->3')	서열번호
dhaB-gdrA-F	GAATTCATGAAAAGATCAAAACGATTTGCAGTCCT	서열번호 6
dhaB-gdrA-R	AAGCTTGATCTCCCACTGACCAAAGCTGG	서열번호 7
gdrB-F	AAGCTTAGAGGGGGCCGTCATGTCGCTTTCACCGCCAG	서열번호 8
gdrB-R	CTTAAGTCAGTTTCTCTCACTTAACGGC	서열번호 9

크렙시엘라 뉴모니아의 염색체 상에 dhaB123와 gdrA 유전자가 나란히 위치해있어 같이 증폭하였고, gdrB는 dhaB123, gdrA와 반대 방향으로 위치해 있기 때문에 gdrB만 따로 증폭하였으며, 이 때 NEB Q5 DNA 폴리머라제를 이용하였으며, 조건은 NEB에서 제공하는 조건을 사용하였다. 그 후 dhaB123, gdrA 유전자는 제한 효소 EcoRI과 HindIII을, gdrB 유전자는 제한 효소 HindIII과 AflII을 이용하여 상기 벡터 내에서 J23101 프로모터 아래에 클로닝하였다. aldH는 J23100 프로모터 아래에 클로닝하였으며, E. coli K12 MG1655 chromosome으로부터 증폭하였고, 이 때 하기 표 5의 프라이머 및 NEB Q5 DNA 폴리머라제를 이용하였으며, 조건은 NEB에서 제공하는 조건을 사용하였다.

명칭	서열(5'->3')	서열번호
aldH-F	ggtaccatgaattttc atcatctggc	서열번호 10
aldH-R	catatgtcaggcctccaggcttat	서열번호 11

aldH는 제한효소 KpnⅠ과 NdeⅠ을 이용하여 상기 벡터의 J23100 프로모터 아래에 클로닝하였다. 이상의 클로닝을 통해 ‘pCDF_J23101_dhaB_gdrAB_J23100_aldH’ 를 포함하는 벡터를 제작하였다.

실시예 1-3. gapA 유전자를 gapN 유전자로 치환

gapA 유전자의 결실 및 gapN 유전자 삽입 과정은 Quick and Easy E. coli Gene Deletion Kit (from GENE BRIDGES)를 이용하여 수행하였다. 삽입을 원하는 유전자 서열과 염색체 상 결실을 원하는 부위의 유전자 특이적인 서열을 양 말단에 포함한 PCR 카세트를 얻고 이 결과물을 pRed/ET 플라스미드를 포함하고 있는 균주에 형질도입 하였다. 이후 재조합 관련 효소들이 발현될 수 있도록 온도 조건을 30℃에서 37℃로 변화시켜 재조합이 특정 유전자 위치에서 일어나 유전자 결실과 동시에 타켓 유전자를 삽입시키도록 하였다. 본 실시예에서 사용한 프라이머 서열은 하기 표 6에 기재하였다.

특정 유전자 부위에 재조합이 일어났는지를 확인하기 위해서 카나마이신 (Kanamycin) 저항성 유전자가 함께 삽입되었다. 재조합이 일어나 특정 유전자가 결실된 후 카나마이신 저항성 유전자 부분은 FLP Recombination을 통해 제거하였다. 708-FLP 플라스미드(CmR, Chloramphenicol Resistance)를 타겟 균주에 형질도입 시킨 후 재조합이 일어날 수 있도록 온도 조건을 30℃에서 37℃로 변화시켰고 카나마이신 저항성 유전자의 제거 완료 여부는 항생제를 첨가하지 않은 배지와 카나마이신 항생제를 첨가한 배지에 동일한 콜로니를 배양하여 카나마이신 저항성 유전자의 제거를 확인하였다.

명칭	서열(5'->3')	서열번호
gapN-F	ttttgtaattttacaggcaaccttttattcactaacaaatagctggtggaatatatgacaaaacaatataaaaattatg	서열번호 12
gapN-R	aaaaaagagcgaccgaagtcgctctttttagatcacagtgtcatctcaacTAATACGACTCACTATAGG	서열번호 13

실시예 1-4. 변이주 제작

Gene bridges 사의 Quick&easy e. coli gene deletion kit 사용하여, 제조사의 매뉴얼대로 W3110 (KCTC에서 구입) 균주에서 yqhD, glpK, ldhA, ackA-pta 및 gldA 유전자를 결실시킨 균주 W3110 (△yqhD, △glpK, △ldhA, △ackA-pta, △gldA) 를 제작하고,

상기 실시예 1-3의 방법과 같이, 상기 W3110 (△yqhD, △glpK, △ldhA, △ackA-pta, △gldA) 균주에서 대장균에 존재하는 gapA 유전자를 스트렙토코쿠스 뮤탄스 유래의 gapN 유전자로 치환시킨 W3110 (△yqhD, △glpK, △ldhA, △ackA-pta, △gldA)(△gapA::gapN) 균주를 제작하였다.

상기 W3110 (△yqhD, △glpK, △ldhA, △ackA-pta, △gldA) 균주 및 상기 W3110 (△yqhD, △glpK, △ldhA, △ackA-pta, △gldA)(△gapA::gapN) 균주 각각에 실시예 1-1 및 실시예 1-2에서 제작한 pRSF-pLTTR-GPD-GPP 벡터 및 pCDF_J23101_dhaB_gdrAB_J23100_aldH 벡터를 형질전환하였다. 구체적으로, 상기 균주를 각각 LB 플레이트 (1 리터당 10g 트립톤, 5g 효모 추출물, 10g NaCl, 15g agar 포함) 상에 평판도말하고 37℃ 에서 밤새 배양하였다. 배양한 단일 콜로니를 3 내지 5㎖ LB 액체배지 (배지 조성은 위와 동일하되 agar 를 포함하지 않음)에 접종하고 교반하면서 37℃ 에서 밤새 배양하였다. 다음날 아침 배양액을 LB 액체배지 0.05 리터에 1:100 으로 희석하고 OD ~0.5 가 될 때까지 3-6시간 배양하였다. 10 내지 15분간 얼음 위에서 식힌 후 4℃에서 4000rpm 으로 10분간 원심분리하여 세포를 수집하였다. 세포를 얼음으로 식힌 멸균 DI water 1 부피에 재현탁하여 세척하고 다시 4℃에서 4000rpm 으로 10분 간 원심분리하여 세포를 수집하였다. 수집한 세포는 다시 DI water 0.5 부피에 재현탁하여 세척하고 다시 4℃에서 4000rpm 으로 10분간 원심분리하여 세포를 수집하였다. 수집한 세포는 얼음으로 식힌 멸균 10% 글리세롤 1㎖ 에 재현탁하고, 개별 pre-chilled microfuge tube에 세포 분취량(aliquots)을 넣었다(0.1㎝의 갭 전기천공용 큐벳에서 형질전환 당 90 ul). salt-free DNA (pRSF-pLTTR-GPD-GPP 벡터 및 pCDF_J23101_dhaB_gdrAB_J23100_aldH 벡터)(1-5㎕)를 피펫팅하여 첨가한 후 혼합물 을 전처리된 전기천공용 큐벳(pre-chilled electroporation cuvette)에 옮겼다. 1.8kV 에서 전기천공하고 펄스 직후 상온의 LB 액체배지 1㎖ 을 세포에 첨가하고 37℃에서 1시간 배양하였다. 배양액은 카나마이신 및 스트렙토마이신이 포함된 LB 플레이트 상에 도말하고 과량의 액체가 건조/플레이트 내로 흡수되게 하였다. 플레이트를 거꾸로 하여 37℃에서 배양하였다. ‘W3110 (△yqhD, △glpK, △ldhA, △ackA-pta, △gldA) 균주’ 및 ‘W3110 (△yqhD, △glpK, △ldhA, △ackA-pta, △gldA)(△gapA::gapN) 균주’ 각각에 pRSF-pLTTR-GPD-GPP 벡터와 pCDF_J23101_dhaB_gdrAB_J23100_aldH 벡터가 도입된 균주 (이하, 대조군 및 (△gapA::gapN) 변이 균주라 명명함)를 제작하였다.

실시예 2. 3HP 생산양 측정

실시예 2-1. 플라스크 배양

플라스크 배양을 위해 상기 실시예에서 제조한 대조군 및 (△gapA::gapN) 변이 균주의 단일 콜로니를 LB (Luria Bertani; peptone 10 g/L, yeast extract 5 g/L, NaCl 5 g/L, pH 7.0) 배지 3㎖에 접종하고, 37℃, 250 rpm 조건에서 20시간 전배양 (seed culture) 하였다. 그 후 M9 배지 100㎖에 1% 접종하고, 카나마이신 및 스트렙토마이신, 2 %의 글루코스, 비타민 B12 1μM, 3HP 1g/L 과 함께 33℃에서 250 rpm에서 3일 동안 배양하였다. M9 배지는 1L당 Na₂HPO₄ 60g, KH₂PO₄ 30g, NaCl 5g, NH₄Cl 10g로 조성된 10X M9 salts (pH 7.4)와 1 M MgSO₄, 1 M CaCl₂ 용액을 따로 멸균하여 준비하고, 본 배양 시에 배지 1L 당 10X M9 salts 100㎖, 1M MgSO₄ 2㎖, 1M CaCl₂ 0.1㎖로 조성되도록 하였다.

3-HP의 생산량을 확인하기 위하여, 배양액 1㎖을 원심분리 (4000rpm, 10분) 후, 상등액을 0.45㎛ 크기의 필터를 사용하여 준비하였다. 그 후 HPLC(High-Performance Liquid Chromatography)를 이용하여 배양액 내 3-HP 생산량을 분석하여다. HPLC는 Aminex HPX-87H ion exclusion column (7.8 * 300 mm, 9㎛)을 사용하여 0.5 mM sulfuric acid (H₂SO₄)를 flow rate 0.4 mL/min 속도로 흘려주었고, column의 온도 35℃, detector 온도 35℃, injection 부피 5㎕, UV detector 210nm의 조건으로 수행하였다.

균주의 생장은 UV Spectrometer 를 이용하여 OD600에서 상기 균주 배양액의 흡광도를 측정한 값에 0.3을 곱하여 DCW (dry cell weight; 균체량) 값으로 계산하여 나타내었다. 대조군 및 (△gapA::gapN) 변이 균주의 3HP 수율 (투입한 포도당 대비 3HP 생산량의 비율; g/g)과 균체량 대비 3HP 생산량을 계산하여 하기 표 7에 나타내었다.

Strain	OD 600	3HP 수율 (g/g)	균체량 대비 3HP 생산량 (g/DCW)
대조군 (Control)	1.33	0.3	4.49
(△gapA::gapN) 변이 균주	0.47	0.39	4.82

상기 표 7에 나타난 바와 같이 대조군 대비 (△gapA::gapN) 변이 균주의 3HP 수율이 증가하였고, 균체량 대비 3HP 생산량이 증가하였으며, 이로부터, (△gapA::gapN) 변이 균주에서 대조군 대비 투입된 포도당이 세포 생장 보다 3HP 생산에 사용되어 3HP 수율을 증가시킨 것을 확인할 수 있었다.

실시예 2-2. 발효기 배양

상기 실시예 1에서 제조한 대조군 및 (△gapA::gapN) 변이 균주의 단일 콜로니를 LB 배지에 접종하여 37℃의 조건에서 18시간 동안 전배양 (Seed culture)하였다.

그 후 5L 발효기에서, 20g/L의 글루코스 및 25 mg/L 스트렙토마이신 및 50 mg/L 카나마이신이 포함된 변형된 MR 배지(MgSO₄ㆍ7H₂O 0.8 g/L, (NH₄)₂HPO₄ 4 g/L, KH₂PO₄ 6.67 g/L 및 Citrate 0.8 g/L 함유) 2L에 전배양액 (Seed culture) 150㎖을 플라스크에 접종하고, 35℃, 500 내지 900rpm, 1 내지 1.5vvm (DO stat: 20%), pH6.95 (NH₄(OH) 이용)의 조건으로 배양하였다. 20g/L 글루코스 소진 후에, 40.5 mL/hr의 속도로 Feeding Solution (글루코스 700g/L, MgSO4 15g/L, Trace metal 10㎖/1L, 10x MR salt 100㎖/1L, 25mg/L 스트렙토마이신, 및 50mg/L 카나마이신 포함)을 첨가하였고, 글루코스가 소진되면 100g/L의 3HP 10㎖, 5mM B12 10㎖ 첨가하여, 3HP 생산을 유도하였다.

그 후 상기 실시예 2-1의 방법과 같이 대조군 및 (△gapA::gapN) 변이 균주의 3HP 수율 (투입한 포도당 대비 3HP 생산량의 비율; g/g)과 균체량 대비 3HP 생산량을 계산하여 하기 표 8에 나타내었다.

Strain	DCW	3HP 수율 (g/g)	균체량 대비 3HP 생산량 (g/DCW)
대조군 (Control)	20.1	0.3	2.45
(△gapA::gapN) 변이 균주	9	0.55	3.3

표 8에 나타난 바와 같이, (△gapA::gapN) 변이 균주에서 포도당이 세포 생장 보다 3HP 생산에 사용되는 비율이 현저히 높아졌으며, (△gapA::gapN) 변이 균주의 3HP 생산 수율은 0.55g/g로 대조군 대비 생산 수율이 80% 이상 향상된 것을 확인할 수 있었다.

<110> LG CHEM, LTD. <120> Microorganism in which glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase activity is weakened and method for producing of 3-hydroxypropionic acid using the same <130> DPP20202090KR <160> 15 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GPD1-F <400> 1 catcatcatg gatccatagc agtaagaaag gagcatccat catgagcgct gcggctg 57 <210> 2 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GPD1-R <400> 2 catcatcatg agctctcaat cttcatgaag gtctaattct tcaatcatg 49 <210> 3 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GPP2-F <400> 3 catcatcatg gtaccacagt tttagtaaag gagcatcaaa aatgggactc actacgaaac 60 cg 62 <210> 4 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GPP2-R <400> 4 catcatcatc tcgagttacc atttcagcag atcgtctttg g 41 <210> 5 <211> 114 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LTTR <400> 5 gtcagcctca gcgcacctcg aatgtgcaaa aacgcagacc atacttgcac atcaccgcat 60 tgagtacatc aaaaatgcac tgttaggatc gatccagaca acaaaaaagc caca 114 <210> 6 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dhaB-gdrA-F <400> 6 gaattcatga aaagatcaaa acgatttgca gtcct 35 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dhaB-gdrA-R <400> 7 aagcttgatc tcccactgac caaagctgg 29 <210> 8 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gdrB-F <400> 8 aagcttagag ggggccgtca tgtcgctttc accgccag 38 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gdrB-R <400> 9 cttaagtcag tttctctcac ttaacggc 28 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aldH-F <400> 10 ggtaccatga attttcatca tctggc 26 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aldH-R <400> 11 catatgtcag gcctccaggc ttat 24 <210> 12 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gapN-F <400> 12 ttttgtaatt ttacaggcaa ccttttattc actaacaaat agctggtgga atatatgaca 60 aaacaatata aaaattatg 79 <210> 13 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gapN-R <400> 13 aaaaaagagc gaccgaagtc gctcttttta gatcacagtg tcatctcaac taatacgact 60 cactatagg 69 <210> 14 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TAC <400> 14 ttgacaatta atcatcggct cgtataatgt gt 32 <210> 15 <211> 166 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BAD <400> 15 aaagccatga caaaaacgcg taacaaaagt gtctataatc acggcagaaa agtccacatt 60 gattatttgc acggcgtcac actttgctat gccatagcat ttttatccat aagattagcg 120 gatcctacct gacgcttttt atcgcaactc tctactgttt ctccat 166

Claims

글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)의 활성이 약화된, 미생물.
제1항에 있어서, 내재적 gapA 유전자가 결실되고, 비인산화 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제를 암호화하는 gapN 유전자가 도입된, 미생물.
제1항에 있어서, 추가적으로 하기 (1) 내지 (5)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 효소의 활성이 강화된, 미생물:
(1) 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로게나제 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase; GPD), (2) 글리세롤-3-포스페이트 포스파타제 (glycerol-3-phosphate phosphatase; GPP), (3) 글리세롤 디하이드라타제 (glycerol dehydratase), (4) 글리세롤 디하이드라타제 리액티바제 (glycerol dehydratase reactivase), 및 (5) 알데히드 디하이드로게나아제 (aldehyde dehydrogenase).
제1항에 있어서, 추가적으로 하기 (1) 내지 (6)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 효소의 활성이 약화되거나 불활성화된, 미생물:
(1) 1,3-프로판다이올 디하이드로게나제 (1,3-propanediol dehydrogenase);
(2) 글리세롤 키나아제 (glycerol kinase);
(3) 아세테이트 키나아제 (acetate kinase);
(4) 포스포트랜스아세틸라제 (phosphotransacetylase);
(5) 락테이트 디하이드로게나제 (lactate dehydrogenase); 및
(6) 글리세롤 디하이드로게나제 (glycerol dehydrogenase).
제1항에 있어서, 상기 미생물은 에스케리키아 (Escherichia) 속 미생물인, 미생물.
제5항에 있어서, 상기 미생물은 대장균인, 미생물.
제1항에 있어서, 상기 미생물은 세포 생장이 억제된, 미생물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 3-히드록시프로피온산(3-Hydroxypropionic Acid) 생산능이 증가된, 미생물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 미생물을 포함하는, 3-히드록시프로피온산(3-Hydroxypropionic Acid) 생산용 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 미생물을 포도당 함유 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 3-히드록시프로피온산(3-Hydroxypropionic Acid)의 생산 방법.
제10항 있어서, 유도성 프로모터에 대한 유도물질을 첨가하는 단계를 추가로 포함하는, 생산 방법.
제10항에 있어서, 배양된 배지 또는 미생물에서 3-히드록시프로피온산을 회수하는 단계를 추가로 포함하는, 3-히드록시프로피온산(3-Hydroxypropionic Acid)의 생산 방법.