CN116948997B - 一种烯烃还原酶突变体及其在制备(r)-4-丙基二氢呋喃-2(3h)-酮中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种烯烃还原酶突变体及其在制备(R)‑4‑丙基二氢呋喃‑2(3H)‑酮中的应用，属于酶工程和微生物工程技术领域。本发明的烯烃还原酶突变体通过将如SEQ ID NO.1所示出发氨基酸序列第247位脯氨酸突变为丙氨酸得到。本发明提供的制备方法中，由烯烃还原酶突变体催化，构建NAD(P)+/NAD(P)H辅酶循环系统，制备目标产物布瓦西坦中间体(R)‑4‑丙基二氢呋喃‑2(3H)‑酮，其产物的ee值达到99％以上，具有良好的工业应用潜力。
Description
技术领域
本发明涉及一种烯烃还原酶突变体及其在合成布瓦西坦中间体(R)-4-丙基二氢呋喃-2(3H)-酮中的应用，属于医药中间体合成领域。
背景技术
(R)-4-丙基二氢呋喃-2(3H)-酮是新型抗癫痫药物布瓦西坦的一个关键中间体。布瓦西坦(Brivaracetam)(化学名称为(S)-2-[(R)-2-氧代-4-丙基吡咯烷-1-基]丁酰胺)是左乙拉西坦的结构衍生物，为比利时优时比制药公司(UCB Pharma)开发的第三代抗癫痫药物，能与突触囊泡糖蛋白2A(SV2A)结合，亲和力较左乙拉西坦强15-20倍，有效地降低部分性癫痫发作的频率，主要用于16岁及以上患者的部分性癫痫发作的辅助治疗。布瓦西坦具有良好的市场预期，开发新的合成技术具有重要的经济价值和社会意义。
已报道的布瓦西坦的合成方法包括化学法不对称合成、化学法手性拆分、酶法手性拆分和酶法不对称合成。由于布瓦西坦存在两个手性中心，酶法不对称合成被认为是最具技术竞争优势的方法。近几年，酶法C＝C不对称加氢合成布瓦西坦中间体的方法被陆续报道。CN107604018A公开了一种以4-正丙基-2(5H)-呋喃酮为底物，在烯还原酶的作用下制备(R)-4-丙基二氢呋喃-2-酮的方法，但该方法中没有提供关键酶信息，因此实际生产效果暂未可知。CN111154735A公开了一种以烯酮还原酶为催化剂，使4-正丙基-2(5H)-呋喃酮还原为布瓦西坦中间体的方法，但该方法没有提供底物转化率，因此同样无法判断其实际生产效果。CN109852644A公开了一种以戊醛和乙醛酸为底物，经过一系列反应及部分醇脱氢酶的催化，得到(R)-4-丙基二氢呋喃-2-酮的方法。该方法操作复杂，且需要调节pH值获得最终产物，期间会产生大量不必要的废盐，不具有大规模工业化生产的价值。
发明内容
本发明针对上述现有技术中存在的问题，提供一种烯烃还原酶突变体用以催化底物制备布瓦西坦中间体(R)-4-丙基二氢呋喃-2(3H)-酮。
本发明的第一个目的是提供一种烯烃还原酶突变体，所述烯烃还原酶突变体是通过将如SEQ ID NO.1所示烯烃还原酶氨基酸序列的第247位脯氨酸突变为丙氨酸得到。
本发明的第二个目的是提供一种编码所述烯烃还原酶突变体的基因。
本发明的第三个目的是提供一种携带所述基因的重组表达载体。
进一步地，所述重组表达载体为pET-28a(+)质粒、pET-28b(+)质粒或pET-20b(+)质粒。
本发明的第四个目的是提供一种携带所述基因或所述重组表达载体的宿主细胞。
进一步地，所述宿主细胞为细菌、真菌、植物细胞或动物细胞。
优选地，所述重组细胞的宿主为大肠杆菌。
进一步地，所述烯烃还原酶突变体的制备方法，包括以下步骤：将上述重组细胞接种至发酵培养基中进行发酵，获得发酵液；将发酵液进行离心，收集菌体；将菌体进行破碎后离心，获得细胞破碎上清液；将细胞破碎上清液进行提取，获得所述烯烃还原酶突变体。
本发明的第五个目的是提供一种(R)-4-丙基二氢呋喃-2(3H)-酮的制备方法，包括将所述的烯烃还原酶突变体添加至含有底物的反应体系中进行反应，得到反应液；将反应液进行提取，获得(R)-4-丙基二氢呋喃-2(3H)-酮。
进一步地，所述反应体系是在NAD(P)+/NAD(P)H辅酶循环系统协同作用下进行。
进一步地，所述辅酶循环系统由葡萄糖和葡萄糖脱氢酶组成。
进一步地，所述反应体系底物为2-环戊烯酮、呋喃酮或4-丙基-2-(5H)-呋喃酮。
进一步地，所述反应的温度为20～40℃，pH值为7.0～9.0。
本发明的有益效果：
相比已报道的布瓦西坦中间体(R)-4-丙基二氢呋喃-2(3H)-酮的合成方法，本发明提供的烯烃还原酶突变体P247A，反应条件温和，酶催化活性高，底物转化率高，产物纯度高，解决了已有技术方案中反应体系中底物和产物抑制的问题，具有良好的工业化前景。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。其中所述室温为本领域常规室温，室温范围是20～40℃。
表达质粒pET28a购自上海Novagen公司。E.coli DH5α感受态细胞、E.coli BL21(DE3)感受态细胞、2×Taq PCR MasterMix、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒和DNA Marker均购自北京天根生化科技有限公司。限制性核酸内切酶NdeI和XhoI购自大连宝生物有限公司。
实施例1：烯烃还原酶野生型基因的克隆
根据Genbank收录的预测为Vanderwaltozyma polyspora基因序列(Genebank登录号：XP_001647443.1)为依据，设计PCR引物如下：
上游引物：
5'-GTGCCGCGCGGCAGCCATATGATGCCATTTGTAAAAGATTT-3'
下游引物：
5'-GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTAGTTTTTATCCCAACCCAT-3'
其中模板为Vanderwaltozyma polyspora的基因组DNA。
PCR体系为：2×Taq PCR MasterMix 10μL，上游引物和下游引物各1μL(0.3μmol/L)，DNA模板1μL(0.1μg)和去离子水7μL。
PCR扩增程序为：(1)95℃预变性3min；(2)94℃变性30s；(3)55℃退火30s；(4)72℃延伸1min；步骤(2)～(4)重复30个循环；(5)72℃继续延伸10min，冷却至4℃。
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物，获得一条完整的烯烃还原酶全长基因序列。该序列经DNA测序，全长1203bp，命名为VPOYE。所述基因核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。
将所得的烯烃还原酶野生型VPOYE全长基因序列进行3个碱基的突变，位置分别是烯烃还原酶野生型基因编码序列的第247位的脯氨酸突变为丙氨酸，得到的突变体基因序列如SEQ ID NO.3所示。
实施例2：烯烃还原酶重组质粒和重组表达转化体及突变体的制备
将实施例1所得的烯烃还原酶基因DNA片段及pET28a空质粒在37℃用限制性核酸内切酶NdeI和XhoI双酶处理2h，经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目标片段。将目标片段在T4 DNA连接酶的作用下，在4℃下连接过夜得到重组表达质粒pET28a-VPOYE。
将上述重组表达质粒转化到大肠埃希氏菌E.coli DH5α感受态细胞中，在含有卡那霉素的抗性平板上对阳性重组体进行筛选，挑取单克隆菌落，利用PCR的方法验证阳性克隆。培养重组菌，待质粒扩增后提取质粒，重新转化至大肠埃希氏菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，转化液涂布到含有卡那霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜，即获得阳性重组转化体大肠埃希氏菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-VPOYE，菌落PCR和基因测序验证阳性克隆。突变体质粒同样按上述方法进行转化。
实施例3：烯烃还原酶突变体的表达
将实施例2所得的重组大肠杆菌，接种至含卡那霉素的LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH＝7.0)中，37℃振荡培养过夜，按1％(v/v)的接种量接入装有100mL LB培养基的500mL三角瓶中，置于37℃、180rpm摇床振摇培养，当培养液的OD600达到0.6时，加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG作为诱导剂，25℃诱导12h后，将培养液离心，收集细胞，并用生理盐水洗涤两次，得静息细胞，冷冻干燥24h即可得冻干细胞，收集后4℃下保存。将所得的静息细胞悬浮于pH值7.0的缓冲液中，在冰浴中超声破碎，离心收集上清液，即为烯烃还原酶的粗酶液。所得粗酶液经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，烯烃还原酶以可溶的形式存在。
实施例4：烯烃还原酶野生型及突变体活力的测定
采用气相色谱法(GC)检测烯烃还原酶的活性及选择性，所使用的柱子为色谱柱Beta Dex-120(30m*0.25mm,0.25μm)，载气(N2):2.5mL/min；进样口温度：280℃；检测器温度：280℃；柱箱平衡时间程序，初始温度：50℃，保温3min；以10℃/min升温至100℃，保温3min；以20℃/min的速度升温至200℃，保温4min；分流比30：1。
其活力测定方法如下：于1mL反应体系中(100mM PBS，pH＝7.0)加入5mM的4-丙基-2-(5H)-呋喃酮，适量粗酶液，于气相检测产物峰面积的变化。纯酶蛋白浓度的测定是根据大多蛋白在280nm下有最大吸收峰，因此可以通过Nanodrop仪器直接获取浓度数据。纯化的蛋白浓缩除盐之后，利用网站https://web.expasy.org/protparam/查得蛋白的摩尔消光系数和蛋白分子量，将5μL纯酶液滴定在仪器上，根据摩尔消光系数和蛋白分子量设置读取蛋白浓度。蛋白依次稀释不同的倍数，验证在不同稀释倍数下测定结果均有良好的线性关系，即可获得纯酶的蛋白浓度。
在上述条件下，突变体活力按如下方法定义；每分钟产生1μmol(R)-4-丙基二氢呋喃-2(3H)-酮所需的酶量为1个酶活单位。
表1烯烃还原酶野生型及突变体活力
实施例5：烯烃还原酶野生型及突变体转化率的测定
采用气相色谱法(GC)来检测烯烃还原酶野生型及突变体对底物的转化率。所使用的柱子为色谱柱Beta Dex-120(30m*0.25mm,0.25μm)，载气(N2):2.5mL/min；进样口温度：280℃；检测器温度：280℃；柱箱平衡时间程序，初始温度：50℃，保温3min；以10℃/min升温至100℃，保温3min；以20℃/min升温至200℃，保温4min；分流比30：1。
其转化率测定方法如下：于1ml反应体系中(100mM PBS，pH＝7.0)加入浓度为0.63g/L的4-丙基-2-(5H)-呋喃酮，细胞湿重为5-10g/L的粗酶液，NAD(P)+/NAD(P)H辅酶循环系统，0.2mM NAD(P)+，过程控制pH值为6.0-8.0，温度为20～40℃，于24h后萃取样品，于气相检测底物峰面积的变化。
其烯烃还原酶野生型及突变体转化率按如下方法计算：转化率(％)＝[(S底物起始-S底物终止)*100％]/S底物起始
表2烯烃还原酶野生型及突变体转化率
实施例6：烯烃还原酶野生型及突变体底物类似物比活力测定
烯烃还原酶对不同底物比活力测定方法按实施例4方法进行测定，测定结果如表3所示，与野生型相比，P247A突变体对2-环戊烯酮和呋喃酮的催化活性都有一定程度的提升。
表3烯烃还原酶野生型及突变体对不同底物比活力
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种烯烃还原酶突变体，其特征在于：所述烯烃还原酶突变体通过将如SEQ ID NO.1所示出发氨基酸序列第247位脯氨酸突变为丙氨酸得到。
2.一种编码权利要求1所述烯烃还原酶突变体的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.一种包含权利要求2或3所述基因的重组表达载体。
5.一种表达权利要求1所述烯烃还原酶突变体的宿主细胞。
6.权利要求1所述烯烃还原酶突变体、权利要求2或3所述的基因、权利要求4所述的重组表达载体或权利要求5所述的宿主细胞在合成（R）-4-丙基二氢呋喃-2（3H）-酮中的应用。
7.一种合成（R）-4-丙基二氢呋喃-2（3H）-酮的方法，其特征在于，包括以下步骤：采用权利要求1所述的烯烃还原酶突变体或含有该突变体的表达系统进行催化转化。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：以4-丙基-2-（5H）-呋喃酮为底物。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：反应体系中还包括葡萄糖脱氢酶。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：反应的温度为20~40℃，pH值为7.0~9.0。
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