JPWO2008108466A1 - 改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ - Google Patents
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Abstract
Description
(1) 以下のアミノ酸配列I:
S-α1-α2-α3-α4-α5-α6-α7-α8-α9-α10-α11-α12-Y-α13-α14-A-R-α15(配列番号74)
(Sはセリン残基、Yはチロシン残基、Aはアラニン残基、Rはアルギニン残基を表し、α1〜α15はそれぞれ独立して同一の又は異なる任意のアミノ酸残基を表す。)
及び以下のアミノ酸配列II:
L-β16-R-L-β17-β18-β19-β20-E-β21(配列番号75)
(Lはロイシン残基、Rはアルギニン残基、Eはグルタミン酸残基を表し、β16〜β21はそれぞれ独立して同一の又は異なる任意のアミノ酸残基を表す。)
を含む野生型ハロヒドリンエポキシダーゼのアミノ酸配列に対して以下の(A)〜(D)より選択されるいずれか又は複数のアミノ酸変異が導入されたアミノ酸配列からなる、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ。
(A)開始アミノ酸残基(通常はメチオニン残基)より1残基C末端側のアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸変異
(B)α14残基が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸変異
(C)α15残基が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸変異
(D)β21残基が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸変異
S-α1-α2-α3-α4-α5-α6-α7-α8-α9-α10-α11-α12-Y-α13-α14-A-R-α15(配列番号74)
(Sはセリン残基、Yはチロシン残基、Aはアラニン残基、Rはアルギニン残基を表し、α1〜α15はそれぞれ独立して同一の又は異なる任意のアミノ酸残基を表す。)
及び以下のアミノ酸配列II:
L-β16-R-L-β17-β18-β19-β20-E-β21(配列番号75)
(Lはロイシン残基、Rはアルギニン残基、Eはグルタミン酸残基を表し、β16〜β21はそれぞれ独立して同一の又は異なる任意のアミノ酸残基を表す。)
を含む野生型ハロヒドリンエポキシダーゼのアミノ酸配列に対して以下の(E)〜(H)より選択されるいずれか又は複数のアミノ酸変異が導入されたアミノ酸配列からなる、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ。
(E)開始アミノ酸残基(通常はメチオニン残基)より1残基C末端側のアミノ酸残基がリジン又はアスパラギンに置換されたアミノ酸変異
(F)α14残基がアラニン、システイン又はセリンに置換されたアミノ酸変異
(G)α15残基がアラニン、セリン又はトリプトファンに置換されたアミノ酸変異
(H)β21残基がグルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、セリン、スレオニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン又はメチオニンに置換されたアミノ酸変異
上記(1)及び(2)に記載の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼにおいて、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼとしては、例えば、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属細菌又はマイコバクテリウム(Mycobacterium)属細菌由来のもの等が挙げられる。
上記(1)及び(2)に記載の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼとしては、例えば、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼのアミノ酸配列に対して以下の(i)〜(iii)より選択されるいずれか又は複数のアミノ酸変異が導入されたアミノ酸配列からなるもの等が挙げられる。
(i)開始アミノ酸残基より1残基C末端側のアミノ酸残基、α14残基、α15残基及びβ21残基以外のアミノ酸残基より選択される1個もしくは数個のアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸変異
(ii)開始アミノ酸残基より1残基C末端側のアミノ酸残基、アミノ酸配列Iに含まれるアミノ酸残基及びアミノ酸配列IIに含まれるアミノ酸残基以外のアミノ酸残基より選択される1個もしくは数個のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸変異
(iii)開始アミノ酸残基より2残基以上C末端側のアミノ酸残基からなる領域のうちアミノ酸配列I及びアミノ酸配列IIからなる領域以外の領域中に、1個もしくは数個の任意のアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸変異
(4) 上記(3)に記載の遺伝子を含む組換えベクター。
(5) 上記(4)に記載の組換えベクターを宿主に導入して得られる形質転換体又は形質導入体。
(6) 上記(5)に記載の形質転換体又は形質導入体を培養して得られる培養物。
(8) 上記(5)に記載の形質転換体又は形質導入体を培養し、得られる培養物から改良型ハロヒドリンエポキシダーゼを採取することを特徴とする、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼの製造方法。
(9) 上記(1)、(2)又は(7)に記載の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ、及び/又は上記(6)に記載の培養物を、1,3−ジハロ−2−プロパノールと接触させることによりエピハロヒドリンを生成させることを特徴とする、エピハロヒドリンの製造方法。
なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願2007-057854号明細書の全体を包含する。また、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
本発明において、「ハロヒドリンエポキシダーゼ活性」とは、1,3−ジハロ−2−プロパノールをエピハロヒドリンに変換する活性及びその逆反応を触媒する活性を意味する。1,3−ジハロ−2−プロパノールは、下記一般式(1)で示される化合物である。
ハロゲン原子としては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素が好ましく、塩素、臭素が特に好ましい。具体的には1,3−ジフルオロ−2−プロパノール、1,3−ジクロロ−2−プロパノール(以下、「DCP」と称することがある)、1,3−ジブロモ−2−プロパノール、1,3−ジヨード−2−プロパノール等が挙げられ、好ましくは、1,3−ジクロロ−2−プロパノール、1,3−ジブロモ−2−プロパノールである。
ハロゲン原子としては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素が好ましく、塩素、臭素が特に好ましい。具体的にはエピフルオロヒドリン、エピクロロヒドリン(以下、「ECH」と称することがある)、エピブロモヒドリン、エピヨードヒドリン等が挙げられ、特に好ましくはエピクロロヒドリン、エピブロモヒドリンである。
(II-1)野生型ハロヒドリンエポキシダーゼ
本発明における改良型ハロヒドリンエポキシダーゼは、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼ(特に好ましくは、グループBに分類されるもの)に変異(アミノ酸変異)を導入することによって改良したものあり、その由来は特に限定されるものではない。ここで、「野生型ハロヒドリンエポキシダーゼ」とは、自然界の生物より分離されうるハロヒドリンエポキシダーゼを指し、該酵素を構成するアミノ酸配列において、意図的又は非意図的なアミノ酸の欠失又は他のアミノ酸による置換もしくは挿入がなく、天然由来の属性を保持したままのハロヒドリンエポキシダーゼを意味する。
S-α1-α2-α3-α4-α5-α6-α7-α8-α9-α10-α11-α12-Y-α13-α14-A-R-α15 (配列番号74)
(Sはセリン残基、Yはチロシン残基、Aはアラニン残基、Rはアルギニン残基を表し、α1〜α15はそれぞれ独立して同一の又は異なる任意のアミノ酸残基を表す。)
及び以下のアミノ酸配列II(10アミノ酸残基):
L-β16-R-L-β17-β18-β19-β20-E-β21 (配列番号75)
(Lはロイシン残基、Rはアルギニン残基、Eはグルタミン酸残基を表し、β16〜β21はそれぞれ独立して同一の又は異なる任意のアミノ酸残基を表す。)
を含むアミノ酸配列からなる。野生型ハロヒドリンエポキシダーゼが、アミノ酸配列I及びアミノ酸配列IIを含むアミノ酸配列からなるものであるか否かは、公共の配列データベース、例えば、米国生物工学情報センター (NCBI; National Center for Biotechnology Information) により提供されるGenBankデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=protein)においてハロヒドリンエポキシダーゼとして登録されているものを検索し、該当したもののアミノ酸配列中に、上記アミノ酸配列I及びアミノ酸配列IIが含まれるか否かを調べればよい。必要に応じて、遺伝子情報解析用ソフトウェアを用いて行うことができる。また、公知文献で野生型ハロヒドリンエポキシダーゼアミノ酸配列について記載されているものがあればそれを参考にしてもよい。例えば、J. Bacteriology, 183 (17), 5058-5066, 2001に記載されている各種野生型ハロヒドリンエポキシダーゼアミノ酸配列のアラインメント情報を参考にすることで、アミノ酸配列I及びアミノ酸配列IIが含まれるか否か、及び全アミノ酸配列中のどの位置に含まれるかを知ることができる。なお、アミノ酸配列Iにおけるセリン残基、チロシン残基、アルギニン残基及びアラニン残基、ならびにアミノ酸配列IIにおけるロイシン残基、アルギニン残基及びグルタミン酸残基は、既知の各種野生型ハロヒドリンエポキシダーゼのアミノ酸配列において高度に保存されている。
グループAに分類されるハロヒドリンエポキシダーゼとしては、コリネバクテリウム属(Corynebacterium sp.)N-1074株由来のHheA(Biosci. Biotechnol. Biochem., 58 (8), 1451-1457, 1994)、アースロバクター属(Arthrobacter sp.)AD2株由来のHheAAD2(J. Bacteriology, 183 (17), 5058-5066, 2001)及びアースロバクター属(Arthrobacter sp.)PY1株由来のDeh-PY1(J. Health. Sci., 50 (6), 605-612, 2004)などが挙げられる。
グループBに分類されるハロヒドリンエポキシダーゼとしては、コリネバクテリウム属(Corynebacterium sp.)N-1074株由来のHheB(Biosci. Biotechnol. Biochem., 58 (8), 1451, 1994)、マイコバクテリウム属(Mycobacterium sp.)GP1株由来のHheBGP1(J. Bacteriology, 183 (17), 5058-5066, 2001)、アースロバクター エリシー(Arthrobacter erithii)H10a株由来のDehA(Enz. Microbiol. Technol., 22, 568-574, 1998)などが挙げられる。グループCに分類されるハロヒドリンエポキシダーゼとしては、アグロバクテリウム ラジオバクター(Agrobacterium radiobacter)DH094株由来のHheC(特開平10−210981号公報)、アグロバクテリウム ラジオバクター(Agrobacterium radiobacter)AD1株由来のHheC(J. Bacteriology, 183 (17), 5058-5066, 2001)、アグロバクテリウム チュメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)由来のHalB(Thesis (1996) University of Wales, Cardiff, United Kingdom)などが挙げられる。
なお、これらハロヒドリンエポキシダーゼのうち、アミノ酸配列が明らかにされているものについては、米国生物工学情報センター(NCBI; National Center for Biotechnology Information)により提供されるGenBankデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=protein)において、以下のAccession No.により登録されている。
「Accession No. AAK92100」:アースロバクター属(Arthrobacter sp.)AD2株由来のHheAAD2のアミノ酸配列
「Accession No. BAA14362」:コリネバクテリウム属(Corynebacterium sp.)N-1074株由来のHheBのアミノ酸配列
「Accession No. AAK73175」:マイコバクテリウム属(Mycobacterium sp.)GP1株由来のHheBGP1のアミノ酸配列
「Accession No. AAK92099」:アグロバクテリウム ラジオバクター(Agrobacterium radiobacter)AD1株由来のHheCのアミノ酸配列
「Accession No. AAD34609」:アグロバクテリウム チュメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens) 由来のHalBのアミノ酸配列
本発明における「改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ」は、主として遺伝子組換え技術を利用して、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼのアミノ酸配列に対して少なくとも1つのアミノ酸置換変異が導入されたアミノ酸配列からなるものであり、形質転換体あたりのハロヒドリンエポキシダーゼ活性、立体選択性、生成物阻害耐性、生成物蓄積能などが向上したハロヒドリンエポキシダーゼである。
本発明における改良型ハロヒドリンエポキシダーゼには、形質転換体あたりのハロヒドリンエポキシダーゼ活性が、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼよりも高いものが含まれる。ここで言う形質転換体あたりのハロヒドリンエポキシダーゼ活性の向上の本質的な原因としては、アミノ酸置換変異に起因するものであれば如何なるものでもよく、例えば、酵素タンパク質あたり比活性自体の向上、活性型コンフォメーション形成能の向上、形質転換体内における発現量増加、形質転換体内における酵素の安定性向上、対基質耐性の向上、生成物阻害感受性の低下などが挙げられる。
光学純度 ≒ 鏡像異性体過剰率=100×(|[R]-[S]|)/([R]+[S]) (%ee)
ここで、[R]及び[S]は試料中の鏡像異性体のそれぞれの濃度を示す。また、本発明において、「立体選択性」とは、ハロヒドリンエポキシダーゼが、基質から生成物を生成する際に、いずれか一方の鏡像異性体が生成する反応を優先的に触媒する性質を言う。
また、本発明における改良型ハロヒドリンエポキシダーゼには、基質1,3−ジハロ−2−プロパノール又はエピハロヒドリンから、エピハロヒドリン又は4−ハロ−3−ヒドロキシブチロニトリルを生成させる場合に、生成物を高濃度生成及び蓄積させることができるという属性を有するもの、すなわち生成物蓄積能が向上したものが含まれる。生成物蓄積能向上の本質的な原因としては、アミノ酸置換変異に起因するものであれば如何なるものでもよい。
(A)開始アミノ酸残基より1残基C末端側のアミノ酸残基が、他のアミノ酸に置換されたアミノ酸変異
(B)アミノ酸配列I中のα14残基が、他のアミノ酸に置換されたアミノ酸変異
(C)アミノ酸配列I中のα15残基が、他のアミノ酸に置換されたアミノ酸変異
(D)アミノ酸配列II中のβ21残基が、他のアミノ酸に置換されたアミノ酸変異
(E)開始アミノ酸残基(通常はメチオニン残基)より1残基C末端側のアミノ酸残基が、他のアミノ酸としてリジン又はアスパラギンに置換されたアミノ酸変異
(F)アミノ酸配列I中のα14残基が、他のアミノ酸としてアラニン、システイン又はセリンに置換されたアミノ酸変異
(G)アミノ酸配列I中のα15残基が、他のアミノ酸としてアラニン、セリン又はトリプトファンに置換されたアミノ酸変異
(H)アミノ酸配列II中のβ21残基が、他のアミノ酸としてグルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、セリン、スレオニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン又はメチオニンに置換されたアミノ酸変異
ここで、上記(E)〜(H)のアミノ酸変異は、それぞれ順に、前述した(A)〜(D)のアミノ酸変異の具体的態様を例示したもの(詳しくは「他のアミノ酸」の具体例を示したもの)である。
(F)141番目のアミノ酸残基(スレオニン残基)がアラニン、システイン又はセリンに置換されたアミノ酸変異
(G)144番目のアミノ酸残基(フェニルアラニン残基)がアラニン、セリン又はトリプトファンに置換されたアミノ酸変異
(H)207番目のアミノ酸残基(アスパラギン酸残基)がグルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、セリン、スレオニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン又はメチオニンに置換されたアミノ酸変異
(E)2番目のアミノ酸残基(アラニン残基)がリジン又はアスパラギンに置換されたアミノ酸変異
(F)133番目のアミノ酸残基(スレオニン残基)がアラニン、システイン又はセリンに置換されたアミノ酸変異
(G)136番目のアミノ酸残基(フェニルアラニン残基)がアラニン又はセリンに置換されたアミノ酸変異
(H)199番目のアミノ酸残基(アスパラギン酸残基)がグルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、セリン、スレオニン、イソロイシン又はチロシンに置換されたアミノ酸変異
(ii)開始アミノ酸残基より1残基C末端側のアミノ酸残基、アミノ酸配列Iに含まれるアミノ酸残基及びアミノ酸配列IIに含まれるアミノ酸残基以外のアミノ酸残基より選択される1個もしくは数個のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸変異
(iii)開始アミノ酸残基より2残基以上C末端側のアミノ酸残基からなる領域のうちアミノ酸配列I及びアミノ酸配列IIからなる領域以外の領域中に、1個もしくは数個の任意のアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸変異
なお、本発明において、アミノ酸の種類を3文字又は1文字のアルファベット表記で表すことがある。さらに、数字の前又は前後に、3文字又は1文字のアルファベットを配して表記することがあり、この場合は、アミノ酸残基の箇所及び置換前後のアミノ酸の種類を表す。すなわち、数字は、特に断りがない限り、上述したように、翻訳開始コドンによりコードされるアミノ酸残基(通常はメチオニン)を1番目と定義した場合に、何番目のアミノ酸残基であるかを示すものである。また、数字の前に表示した3文字又は1文字のアルファベットは、アミノ酸置換前のアミノ酸の3文字又は1文字表記を表し、数字の後に表示した3文字又は1文字のアルファベットは、アミノ酸置換が生じた場合の置換後のアミノ酸の3文字又は1文字表記を表すものとする。例えば、207番目のアスパラギン酸残基は「Asp207」又は「D207」と、207番目のアスパラギン酸残基がヒスチジンに置換された場合は「Asp207His」又は「D207H」と表記することがある。
(III-1)野生型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子
野生型ハロヒドリンエポキシダーゼのうち、その遺伝子配列(塩基配列)が明らかにされているものについては、米国生物工学情報センター (NCBI; National Center for Biotechnology Information) により提供されるGenBankデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide)において、以下のAccession No.により登録されている。
「Accession No. AF397297」:アースロバクター属(Arthrobacter sp.)AD2株由来のHheAAD2をコードする遺伝子の塩基配列
「Accession No. D90350」:コリネバクテリウム属(Corynebacterium sp.)N-1074株由来のHheBをコードする遺伝子の塩基配列
「Accession No. AY044094」:マイコバクテリウム属(Mycobacterium sp.)GP1株由来のHheBGP1をコードする遺伝子の塩基配列
「Accession No. AF397296」:アグロバクテリウム ラジオバクター(Agrobacterium radiobacter)AD1株由来のHheCをコードする遺伝子の塩基配列
「Accession No. AF149769」:アグロバクテリウム チュメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens) 由来のHalBをコードする遺伝子の塩基配列
本発明における改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子とは、(II-2)で述べた改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ酵素タンパク質をコードする遺伝子を意味する。本発明の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子とは、例えば、配列番号1又は配列番号2に示されるアミノ酸配列からなる野生型ハロヒドリンエポキシダーゼに対して前記(II-2)の(A)〜(D)より選択されるいずれか又は複数のアミノ酸変異が導入されたアミノ酸配列を有する改良型ハロヒドリンエポキシダーゼをコードする遺伝子であり、より好ましくは、前記(II-2)の(E)〜(H)より選択されるいずれか又は複数のアミノ酸変異が導入されたアミノ酸配列を有する改良型ハロヒドリンエポキシダーゼをコードする遺伝子である。野生型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子及び上記アミノ酸変異導入後のアミノ酸残基を構成する塩基配列は、形質転換体宿主において利用可能なコドンをコードするものであればよく、必ずしも由来生物ゲノムDNA上にコードされている野生型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子の塩基配列に限定されない。なお、前記(II-1)の野生型ハロヒドリンエポキシダーゼにおいて述べたHheB(1st)をコードする野生型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子であるHheB(1st)、及びHheB(2nd)をコードする野生型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子であるHheB(2nd)は、いずれも、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子を得るためのベースとなる野生型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子としても用いることができる。本発明における「改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子」のさらに具体的かつ好ましい態様としては、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼが、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するコリネバクテリウム属(Corynebacterium sp.)N-1074株由来のHheB(1st)である場合は、配列番号31〜43及び84〜87に示される塩基配列を有する改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子が挙げられる。また、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼが、配列番号2に示されるアミノ酸配列を有するコリネバクテリウム属(Corynebacterium sp.)N-1074株由来のHheB(2nd)である場合は、配列番号44〜56及び88〜91に示される塩基配列を有する改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子が挙げられる。
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))等を参照することができる。ハイブリダイズするDNAとしては、例えば、前記(II-2)の(A)〜(H)より選択されるいずれか又は複数のアミノ酸変異が導入されたアミノ酸配列をコードする塩基配列に対して、少なくとも40%以上、好ましくは60%、さらに好ましくは90%以上の同一性を有する塩基配列を含むDNA又はその部分断片が挙げられる。
(IV-1)組換えベクター
上記の方法によって得た本発明の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子を宿主で発現させるために、遺伝子の上流に転写プロモーターを、下流にターミネーターを挿入して発現カセットを構築し、このカセットを発現ベクターに挿入することができる。あるいは、当該改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子を導入する発現ベクターに転写プロモーターとターミネーターがすでに存在する場合には、発現カセットを構築することなく、ベクター中のプロモーターとターミネーターを利用してその間に当該変異遺伝子を挿入すればよい。ベクターに当該改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子を挿入するには、制限酵素を用いる方法、トポイソメラーゼを用いる方法等を利用することができる。また、挿入の際に必要であれば、適当なリンカーを付加してもよい。なお、本発明においては、このような組み込み操作を、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子の調製操作と兼ねて行うこともできる。すなわち、他のアミノ酸をコードする塩基配列に置換した塩基配列を有するプライマーを用い、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子がクローニングされた組換えベクターを鋳型としてPCRを行い、得られた増幅産物をベクターに組み込むことができる。
また、アミノ酸への翻訳にとって重要な塩基配列として、SD配列やKozak配列などのリボソーム結合配列が知られており、これらの配列を変異遺伝子の上流に挿入することもできる。原核生物を宿主に用いるときにはSD配列を、真核細胞を宿主に用いるときにはKozak配列をPCR法などにより付加してもよい。SD配列としては、大腸菌由来又は枯草菌由来の配列などが挙げられるが、大腸菌や枯草菌等の所望の宿主内で機能する配列であれば特に限定されるものではない。たとえば、16SリボゾームRNAの3'末端領域に相補的な配列が4塩基以上連続したコンセンサス配列をDNA合成により作製して利用してもよい。
一般に、ベクターには目的とする形質転換体を選別するための因子(選択マーカー)が含まれる。選択マーカーとしては、薬剤耐性遺伝子や栄養要求性相補遺伝子、資化性付与遺伝子などが挙げられ、目的や宿主に応じて選択されうる。例えば大腸菌で選択マーカーとして用いられる薬剤耐性遺伝子としては、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
本発明の組換えベクターを宿主に形質転換又は形質導入することで、形質転換体又は形質導入体(以下、これらをまとめて「形質転換体」という)を作製する。当該形質転換体も本発明の範囲に含まれる。
本発明において使用する宿主は、上記組換えベクターが導入された後、目的の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼを発現することができる限り特に限定されるものではない。宿主としては、例えば大腸菌、枯草菌、ロドコッカス属細菌などの細菌、酵母(Pichia、Saccharomyces)、カビ(Aspergillus)、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等が挙げられる。
本発明において、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼは、上記形質転換体を培養して得られる培養物自体として、又は培養物から採取することにより製造することができる。本発明において、「培養物」とは、培養液、培養液上清、細胞若しくは菌体、細胞若しくは菌体懸濁液、細胞若しくは菌体破砕液、粗酵素液及びこれらの処理物など、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼを生産する形質転換体を培養することによって得られるもの及びそれらに起因するもののいずれをも含む意味である。本発明の形質転換体を培養して得られる培養物は、本発明の範囲に含まれる。本発明の形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。目的の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼは、上記培養物中のいずれかに蓄積される。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、イソプロピル−β−D−チオガラクトシド(IPTG)で誘導可能なプロモーターを有する発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときには、IPTG等を培地に添加することができる。また、インドール酢酸(IAA)で誘導可能なtrpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときには、IAA等を培地に添加することができる。
形質転換体が植物細胞又は植物組織である場合は、培養は、通常の植物培養用培地、例えばMS基本培地、LS基本培地等を用いることにより行うことができる。培養方法は、通常の固体培養法、液体培養法のいずれをも採用することができる。
上記培養条件で培養すると、本発明の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼを上記培養物中、すなわち、培養液、培養上清、細胞、菌体、又は細胞若しくは菌体の破砕物の少なくともいずれかに蓄積させることができる。
高圧処理を行う場合、処理圧力は、菌体又は細胞からの改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ回収率が十分高いものであれば特に限定されないが、例えば、40〜150MPa程度の圧力で破砕を行うことができる。菌体又は細胞濃度も特に限定されないが、例えば、20%以下程度であればよい。必要に応じて、装置を直列に配置したり、複数ステージ構造の装置を用いたりすることにより、多段階処理を行い、破砕及び操作効率を向上させることも可能である。通常、処理圧力10MPaあたり2〜3℃の温度上昇が生じることから、必要に応じて冷却処理を行うことが好ましい。
衝突処理の場合、例えば、被破砕菌体又は細胞スラリーを予め噴霧急速凍結処理(凍結速度:例えば1分間当たり数千℃)などによって凍結微細粒子(例えば50μm以下)にしておき、これを高速(例えば約300m/s)の搬送ガスによって衝突板に衝突させることで菌体又は細胞を破砕することができる。
遠心分離操作は、前述の通り行うことができる。菌体又は細胞破砕残渣が微細であり、容易に沈降し難い場合は、必要に応じて、凝集剤を使用して残渣沈殿効率を上げることもできる。有機高分子凝集剤は、イオン性に基づけば、カチオン系凝集剤、アニオン系凝集剤、両性系凝集剤、ノニオン系凝集剤を挙げることができ、成分に基づけば、アクリル系、ポリエチレンイミン、縮合系ポリカチオン(ポリアミン)、ジメチルジアリルアンモニウムクロライド、キトサンなどを挙げることができるが、本発明において使用する凝集剤は、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ活性又は該活性回収率を低下させず、かつ、残渣分離効率を向上させることができるものであればいずれの凝集剤でもよい。アクリル系凝集剤の成分となるアクリル系水溶性モノマーとしては、例えば、アクリルアミド、アクリル酸ナトリウム、アクリルアミド2メチル−プロパンスルホン酸ナトリウム、ジメチルアミノエチル−メタクリレート、メタクリロイロキシエチル−トリメチルアンモニウム−クロライド、メタクリロイロキシエチル−ベンジルジメチル−アンモニウムクロライド、ジメチルアミノエチル−アクリレート、アクリロイロキシエチル−トリメチルアンモニウム−クロライド、ジメチルアミノプロピル−アクリルアミド、アクリルアミドプロピル−トリメチルアンモニウム−クロライド、ポリアミジン−クロライドなどが挙げられ、これらモノマーの単一重合物、多様な組成による共重合物又は高分子変性物がアクリル系凝集剤として挙げられる。特に代表的なカチオン系高分子凝集剤としては、ポリアミノアルキルメタアクリレート類,ポリアムノアルキルメタアクリレートとアクリルアミドの共重合物類,ポリアクリルアミドのマンニツヒ変性物類,ポリジメチルジアリルアンモニウム塩類,ポリビニルイミダゾリン類,ポリアクリルアミド類,アミン系重縮合物類などがあげられ、すでに多くの商品が市販されている。その主なものとしては,例えば,サンポリ−K-601,K-602(主成分ポリアミン,三共化成),クリフロツクLC-599(主成分:ポリアミン及びポリアミド,栗田工業),ハイモロツクM-166,M-566,M-966,(主成分:アクリルアミド変性物,協立有機工業),ユニフロツカ−UF-301,UF-304,UF-305,(主成分:ポリアクリルアミド,ユニチカ),UF-330,UF-340,(主成分:アミノメタアクリル酸エステル,ユニチカ),UF-505(主成分:ジシアンアミン,ユニチカ),リユーフロツクC-110(主成分:ポリアミン,大日本インキ化学),ピユリフロツクC-31(主成分:ポリアミン,ダウケミカル)が挙げられる。また、ダイヤニトリックス社(日本)製 K-400シリーズ、KM-200シリーズ、KM-1200シリーズ、KAM-200シリーズ、KD-200シリーズ、KP-000シリーズ、KP-100シリーズ、KP-200シリーズ、KP-300シリーズ、KP-500シリーズ、KP-1200シリーズ、KA-000シリーズ、KA-200シリーズ、KA-300シリーズ、KA-400シリーズ、KA-600シリーズ、KA-700シリーズ、KA-800シリーズなども挙げられる。これら凝集剤は単独で又は2種以上を併用して使用できる。本発明において使用する凝集剤は、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ活性又は該活性回収率を低下させず、かつ、残渣分離効率を向上させることができるものであれば上述のいずれの凝集剤でもよいが、具体的には、例えば、ダイヤニトリックス社(日本)製K-403B、K-408、K-415などが挙げられる。凝集剤の添加量としては、凝集剤の種類や菌体又は破砕液の液状によっても異なるが、例えば、破砕した微生物乾燥重量%濃度の1/200〜1/5の濃度、好ましくは1/100〜1/10濃度である。添加方法としては、例えば、凝集剤を予め水に溶解した後、菌体又は細胞破砕液に添加して少なくとも5分〜24時間、好ましくは30分〜10時間程度、静置又は撹拌すればよい。そのときの温度としては、例えば、0℃〜60℃、特に0℃〜50℃、さらに0℃〜40℃が好ましい。また、pHの調整が必要な場合には、適宜、無機塩終濃度が5〜200mMとなるよう添加して緩衝液化することもできるし、必要に応じて、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼを安定化する物質を添加してもよい。
形質転換体が植物細胞又は植物組織である場合は、セルラーゼ、ペクチナーゼ等の酵素を用いた細胞溶解処理、超音波破砕処理、磨砕処理等により細胞を破壊する。その後、必要であれば、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、各種クロマトグラフィー(例えばゲル濾過クロマトグラフィー(例えばSephadexカラム)、イオン交換クロマトグラフィー(例えばDEAE-Toyopearl)、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー(例えばbutyl Toyopearl)、陰イオンクロマトグラフィー(例えばMonoQカラム)等)、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中からハロヒドリンエポキシダーゼを単離精製することができる。単離したハロヒドリンエポキシダーゼは、上述の細胞又は菌体と同様に、適当な担体に保持し固定化酵素として使用することもできる。
また、本発明においては、上記改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子又は改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子を含む組換えベクターから改良型ハロヒドリンエポキシダーゼを採取することも可能である。すなわち、本発明においては、生細胞を全く使用することなく無細胞タンパク質合成系を採用して、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼを産生することが可能である。無細胞タンパク質合成系とは、細胞抽出液を用いて試験管などの人工容器内でタンパク質を合成する系である。なお、本発明において使用される無細胞タンパク質合成系には、DNAを鋳型としてRNAを合成する無細胞転写系も含まれる。この場合、上記の宿主に対応する生物は、下記の細胞抽出液の由来する生物に相当する。ここで、上記細胞抽出液は、真核細胞由来又は原核細胞由来の抽出液、例えば、小麦胚芽、大腸菌などの抽出液を使用することができる。なお、これらの細胞抽出液は濃縮されたものであっても濃縮されないものであってもよい。細胞抽出液は、例えば限外濾過、透析、ポリエチレングリコール(PEG)沈殿等によって得ることができる。さらに本発明において、無細胞タンパク質合成は、市販のキットを用いて行うこともできる。そのようなキットとしては、例えば試薬キットPROTEIOSTM(東洋紡)、TNTTM System(プロメガ)、合成装置のPG-MateTM(東洋紡)、RTS(ロシュ・ダイアグノスティクス)などが挙げられる。
上記のように無細胞タンパク質合成によって得られる改良型ハロヒドリンエポキシダーゼは、例えば前述のように適宜クロマトグラフィーを選択して、精製することができる。
上述のようにして製造された改良型ハロヒドリンエポキシダーゼは、酵素触媒として物質生産に利用することができる。すなわち、以下の(VI-1)〜(VI-3)に示す反応に供することができる。
本変換反応は、1,3−ジハロ−2−プロパノールを、上述の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ及び/又は上述の培養により得られる培養物と接触させることにより行うことができる。
基質である1,3−ジハロ−2−プロパノールは、前述した一般式(1)で示される化合物である。ハロゲン原子としては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素が好ましく、塩素、臭素が特に好ましい。具体的には1,3−ジフルオロ−2−プロパノール、1,3−ジクロロ−2−プロパノール、1,3−ジブロモ−2−プロパノール、1,3−ジヨード−2−プロパノール等が挙げられ、好ましくは、1,3−ジクロロ−2−プロパノール、1,3−ジブロモ−2−プロパノールである。
変換反応液中の基質濃度は、0.01〜15(W/V) %が好ましい。この範囲内であると酵素安定性の観点から好ましく、0.01〜10%が特に好ましい。基質は反応液に一括添加あるいは分割添加することができる。分割添加により基質濃度を一定にすることが蓄積性の観点から望ましい。
反応温度は、5〜50℃、反応pHは4〜10の範囲で行うことが好ましい。
反応温度は、より好ましくは10〜40℃である。反応pHは、より好ましくはpH6〜9である。反応時間は基質等の濃度、菌体濃度あるいはその他の反応条件等によって適時選択するが、1〜120時間で終了するように条件を設定するのが好ましい。尚、本反応においては、反応の進行に伴い生成する塩素イオンを反応系内から取り除くことにより、光学純度をより一層向上させることができる。この塩素イオンの除去は、硝酸銀等の添加によって行うことが好ましい。
反応液中に生成、蓄積したエピハロヒドリンは公知の方法を用いて採取及び精製することができる。例えば、酢酸エチルなどの溶媒で抽出を行い、減圧下に溶媒を除去することによりエピハロヒドリンのシロップを得ることができる。また、これらのシロップを減圧下に蒸留することによりさらに精製することもできる。
本変換反応は、1,3−ジハロ−2−プロパノールを、上述の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ及び/又は上述の培養により得られる培養物と接触させることにより行うことができる。
基質である1,3−ジハロ−2−プロパノールは、前述した一般式(1)で示される化合物であり、好ましくは1,3−ジクロロ−2−プロパノール、1,3−ジブロモ−2−プロパノール等である。
また、シアン化合物としては、シアン化水素、シアン化カリウム、シアン化ナトリウム、シアン酸又はアセトンシアンヒドリン等の反応液中に添加した際にシアンイオン(CN-)又はシアン化水素を生じる化合物又はその溶液を用いることができる。反応液中の基質濃度は、酵素安定性の観点から0.01〜15(W/V) %が好ましく、0.01〜10%が特に好ましい。
反応条件は、上記(VI-1)と同様に行うことができる。
反応液中に生成、蓄積した4−ハロ−3−ヒドロキシブチロニトリルは、公知の方法を用いて採取及び精製することができる。例えば、反応液から遠心分離等の方法を用いて菌体を除いた後、酢酸エチルなどの溶媒で抽出を行い、減圧下に溶媒を除去することにより4−ハロ−3−ヒドロキシブチロニトリルのシロップを得ることができる。また、これらのシロップを減圧下に蒸留することによりさらに精製することもできる。
本変換反応は、エピハロヒドリンを、上述の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ及び/又は上述の培養により得られる培養物と接触させることにより行う。
基質であるエピハロヒドリンは、前述した一般式(2)で示される化合物である。ハロゲン原子としては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素が好ましく、塩素、臭素が特に好ましい。具体的にはエピフルオロヒドリン、エピクロロヒドリン、エピブロモヒドリン、エピヨードヒドリン等が挙げられ、特に好ましくはエピクロロヒドリン、エピブロモヒドリンである。
また、シアン化合物はシアン化水素、シアン化カリウム、シアン化ナトリウム、シアン酸又はアセトンシアンヒドリン等の反応液中に添加した際にシアンイオン(CN-)又はシアン化水素を生じる化合物又はその溶液を用いることができる。
反応条件、採取及び精製方法は、上記(VI-2)と同様に行うことができる。
コリネバクテリウム属(Corynebacterium sp.)N-1074株由来の野生型ハロヒドリンエポキシダーゼであるHheB(2nd)において、翻訳開始コドンによりコードされるアミノ酸残基の1残基下流のアミノ酸残基(2番目のアミノ酸残基)がそれぞれリジン及びアスパラギンに置換された改良型ハロヒドリンエポキシダーゼを発現する発現プラスミド(発現ベクターpKK233-2)及び該発現プラスミドを含む改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ発現形質転換体を以下のように作製した。
まず、ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子HheB(2nd)をPCRにより増幅した。PCR反応液組成(全量50μl)は以下の表の通りとし、3系列調製した(3系列の違いは、センスプライマーが各々異なることである)。
DH-08:GGCCATGGCTAACGGAAGACTGGCAGGC(配列番号57:28ヌクレオチドからなり、その配列中に制限酵素NcoI認識部位(CCATGG)及びハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子HheB(2nd)の翻訳開始コドン以降を有し、2番目のアミノ酸に対応するコドンはGCTでアラニンをコードする)
DH-09:GATCATGAAAAACGGAAGACTGGCAGGCAAGCG(配列番号58:33ヌクレオチドからなり、その配列中に制限酵素BspHI認識部位(TCATGA)及びハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子HheB(2nd)の翻訳開始コドン以降を有し、2番目のアミノ酸に対応するコドンはAAAでリジンをコードする)
DH-07:CGCCTGCAGGCTACAACGACGACGAGCGCCTG (配列番号60:32ヌクレオチドからなり、その配列中に制限酵素Sse8387I兼PstI認識部位(CCTGCAGG)及びハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子HheB(2nd)終止コドン下流領域を有する)
調製した50μlのPCR反応液をそれぞれ以下の熱サイクル処理に供した。
pSTK001:2番目のアミノ酸残基がアラニン残基である野生型ハロヒドリンエポキシダーゼHheB(2nd)をコードする野生型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子が発現ベクターpKK233-2上にクローニングされている
pSTK002:2番目のアミノ酸残基(アラニン残基)がリジンに置換されている改良型ハロヒドリンエポキシダーゼHheB(2nd)をコードする改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子が発現ベクターpKK233-2上にクローニングされている
pSTK003:2番目のアミノ酸残基(アラニン残基)がアスパラギンに置換されている改良型ハロヒドリンエポキシダーゼHheB(2nd)をコードする改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子が発現ベクターpKK233-2上にクローニングされている
コリネバクテリウム属(Corynebacterium sp.)N-1074株由来の野生型ハロヒドリンエポキシダーゼであるHheB(2nd)において、開始アミノ酸残基より1残基C末端側のアミノ酸残基(2番目のアミノ酸残基)がそれぞれリジン及びアスパラギンに置換された改良型ハロヒドリンエポキシダーゼを発現する発現プラスミド(発現ベクターpTrc99A)及び該発現プラスミドを含む改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ発現形質転換体を作製した。作製は、実施例1(1)において用いる発現ベクターpkk233-2の代わりにpTrc99Aを用い、他は実施例1(1)と同様に行った。系列1のPCR増幅産物由来DNA断片がクローニングされたプラスミドをpSTT001と、系列2のPCR増幅由来DNA断片がクローニングされたプラスミドをpSTT002と、系列3のPCR増幅産物由来DNA断片がクローニングされたプラスミドをpSTT003と命名し、また、それらプラスミドを含む大腸菌JM109株形質転換体を、JM109/pSTT001、JM109/pSTT002及びJM109/pSTT003とそれぞれ命名した。
pSTT001:2番目のアミノ酸残基がアラニン残基である野生型ハロヒドリンエポキシダーゼHheB(2nd)をコードする野生型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子が発現ベクターpTrc99A上にクローニングされている
pSTT002:2番目のアミノ酸残基(アラニン残基)がリジンに置換されている改良型ハロヒドリンエポキシダーゼHheB(2nd)をコードする改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子が発現ベクターpTrc99A上にクローニングされている
pSTT003:2番目のアミノ酸残基(アラニン残基)がアスパラギンに置換されている改良型ハロヒドリンエポキシダーゼHheB(2nd)をコードする改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子が発現ベクターpTrc99A上にクローニングされている
実施例1(1)及び(2)で作製した形質転換体6株(JM109/pSTK001、JM109/pSTK002、JM109/pSTK003 、JM109/pSTT001、JM109/pSTT002、JM109/pSTT003)及び特公平5-317066号公報記載のJM109/pST111の計7株を、IPTG(イソプロピル-1-チオ-D-β-D-ガラクトシド)の評価を次のように行った。LBAmp培地をワッセルマン試験管に1mlずつ分注し、各試験管に、二次評価選抜株6株及びJM109/pST111のコロニーをそれぞれ植菌した。37℃、210rpmで約8時間培養した後、得られた各培養液100μlを、IPTGを終濃度として1mM含むLBAmp培地(500ml容三角フラスコ中の100ml)に植菌し、37℃、210rpmで24時間培養した。得られた培養液から遠心分離(3,700×g、10分間、4℃)により各菌体を回収し、20mM Tris-硫酸緩衝液(pH8.0)で洗浄した後、菌濃度が12.5gDC/Lとなるように同緩衝液に懸濁した。得られた菌体懸濁液の1mlを、超音波破砕機VP−15S(タイテック、日本)を用いて、出力コントロール4、DUTY CYCLE 40%、PULS、TIMER=Bモード10sの条件で氷冷しながら3分間破砕した。破砕した菌体懸濁液を遠心分離(23,000×g、5分間、4℃)に供し、上清を粗酵素液として採取した。得られた粗酵素液を、それぞれ破砕前の(菌体懸濁液時点での)菌濃度として6.25gDC/Lとなるよう、20mM Tris-硫酸緩衝液(pH8.0)で希釈した。希釈した各形質転換体由来の粗酵素液を等量のポリアクリルアミドゲル電気泳動用サンプルバッファー(0.1M Tris-HCl(pH6.8)、4%w/v SDS、12%v/vβメルカプトエタノール、20%v/vグリセロール、微量ブロモフェノールブルー)と混合し、5分間煮沸し変性処理を行った。10%ポリアクリルアミドゲルを作製し、変性処理済みサンプルを1レーンあたり5μlずつアプライし、電気泳動分析を行った(図1)。ハロヒドリンエポキシダーゼは30kDa強のバンドとして各々観察された(図1中の矢印)。野生型ハロヒドリンエポキシダーゼHheB(1st)を発現するJM109/pST111由来粗酵素液と比較して、同野生型ハロヒドリンエポキシダーゼHheB(2nd)を発現するJM109/pSTK001由来粗酵素液及びJM109/pSTT001由来粗酵素液は、発現量が増加していることが確認された(これは発現ベクターの違いによるものであると考えられる)。一方、JM109/pSTK001由来粗酵素液及びJM109/pSTT001由来粗酵素液と比較して、2番目のアミノ酸残基がアスパラギンに置換された改良型ハロヒドリンエポキシダーゼHheB(2nd)を発現するJM109/pSTK003由来粗酵素液及びJM109/pSTT003由来粗酵素液は、ぞれぞれさらに発現量が増加しており、また、2番目のアミノ酸残基がリジンに置換された改良型ハロヒドリンエポキシダーゼHheB(2nd)を発現するJM109/pSTK002由来粗酵素液及びJM109/pSTT002由来粗酵素液は、ぞれぞれさらに大幅に発現量が増加していることが確認された。
さらに有用な改良型ハロヒドリンエポキシダーゼを取得するため、エラー誘発PCRによりランダム変異が導入されたハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子変異体ライブラリーを作製し、該ライブラリーからの改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ及びその遺伝子のスクリーニングを行った。
実施例1(2)で作製したpSTT002を鋳型として用い、エラー誘発PCRによるハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子変異体ライブラリーの作製を次のように行った。以下の表の組成のPCR反応液を100μl調製した。
Trc-03:GGCTGAAAATCTTCTCTCATCCGCC(配列番号61:25ヌクレオチドからなり、pTrc99Aのマルチクローニングサイトの下流領域に対応する)
調製した100μlのPCR反応液を10μl×10本のPCR反応用チューブに分注した後、それぞれを以下の熱サイクル処理に供した。
実施例2(1)で作製したハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子変異体ライブラリーを用い、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼのスクリーニング(一次評価)を次のように行った。96ウェルプレート(ディープウェル)に、IPTGを終濃度として1mM含むLBAmp培地をウェルあたり500μlずつ分注し、各ウェルにハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子変異体ライブラリーのコロニーを植菌した。なお、96ウェル中1〜2個のウェルについては、評価の対照として用いるJM109/pSTT002コロニーを植菌した。37℃、800rpmで約16時間培養した後、得られた培養液のうち20μlを平型96ウェルプレートに分注した。遠心分離機(佐久間製作所50A-IVD)及びローター(佐久間製作所 HM-2HLS)を用い、平型96ウェルプレートを遠心分離(3000rpm、5分間、4℃)に供した。培養液上清を除去した後、評価用反応液1(400mM DCP、800mM (R)−CHBN、0.025% ブロモクレゾールパープル(BCP)、50mM Tris-硫酸(pH8))40μlを各ウェルに添加した。懸濁後、室温で静置し、反応液の呈色変化を経時的に観察し(ハロヒドリンエポキシダーゼ活性による塩化物イオンの生成に伴うpH低下により、BCPの色が紫から黄色に変化する)、対照であるJM109/pSTT002よりも有意に早く変色が見られた株を選抜した。約20,000株のコロニーについて該一次評価を行い、77株を選抜した。
実施例2(2)で選抜された一次評価選抜株77株について、次のように二次評価を行った。一次評価選抜株77株について、実施例2(2)と同様に、96ウェルプレート(ディープウェル)による培養を行った後、得られた各培養液につき(20μl、15μl、10μl、5μl)×2サンプルずつを平型96ウェルプレートに分注した。遠心分離機(佐久間製作所50A-IVD)及びローター(佐久間製作所 HM-2HLS)を用い、平型96ウェルプレートを遠心分離(3000rpm、5分間、4℃)に供した。培養液上清を除去した後、各培養液沈殿(菌体)につき、実施例2(2)記載の評価用反応液1及び評価用反応液2(400mM DCP、0.025% ブロモクレゾールパープル(BCP)、50mM Tris-硫酸(pH8))40μlを各ウェルに添加した。懸濁後、室温で静置し、反応液の呈色変化を経時的に観察し、評価用反応液1を添加した系で対照であるJM109/pSTT002よりも有意に早く変色が見られた株、及び各株について評価用反応液1添加系における呈色速度と評価用反応液2添加系における呈色速度の差が少ない株を選抜した。一次評価選抜株77株について該二次評価を行い、20株を選抜した。
実施例2(3)で選抜した二次評価選抜株20株について、各株が有するハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子の変異を解析した。実施例2(3)で得られた各株培養液から、Flexi Prep(GEヘルスケアバイオサイエンス)を用いてプラスミド回収し、キャピラリーDNAシーケンサーCEQ2000(ベックマン・コールター)を用い、添付のマニュアルに従って、各プラスミド中のハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子の塩基配列を解析した。その結果を表2に示した。
実施例2(3)で選抜され、実施例2(4)でそのハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子変異が確認された6株(JM109/pSTT002-V25I、JM109/pSTT002-H57R+Y87F、JM109/pSTT002-V75A、JM109/pSTT002-T133A、JM109/pSTT002-F136S 及びJM109/pSTT002-D199H)及び対照とするJM109/pSTT002の計7株について、次のように三次評価を行った。LBAmp培地をワッセルマン試験管に1mlずつ分注し、各試験管に、二次評価選抜株6株及びJM109/pSTT002のコロニーをそれぞれ植菌した。37℃、210rpmで約8時間培養した後、得られた各培養液100μlを、IPTGを終濃度として1mM含むLBAmp培地(500ml容三角フラスコ中の100ml)に植菌し、37℃、210rpmで16時間培養した。得られた各培養液100mlから遠心分離(3,700×g、10分間、4℃)により各菌体を回収し、20mM Tris-硫酸緩衝液(pH8.0)で洗浄した後、菌濃度が12.5gDC/Lとなるように同緩衝液に懸濁した。得られた菌体懸濁液を用いて、実施例1(3)記載の方法において反応液のDCP濃度を400mMとした反応液を用いた方法、及び実施例1(3)記載の方法において反応液のDCP濃度を400mMとし、かつ、(R)−CHBNを終濃度800mMとなるように添加した反応液を用いた方法により、(R)−CHBN非存在下及び(R)−CHBN存在下におけるハロヒドリンエポキシダーゼ活性(脱クロル活性)をそれぞれ測定した。1Uを上記各条件下でDCPから1分間あたり1μmol塩化物イオンの脱離する酵素量に相当するものと定義して活性測定に用いた各菌体懸濁液の活性を、該活性を活性測定に用いた各菌体懸濁液の液量で除することにより各菌体懸濁液の液活性を算出した。さらに、該液活性を菌濃度で除することによって各株の菌体比活性を算出した。その結果を表3に示した。
実施例2(5)で見出された改良型ハロヒドリンエポキシダーゼのうち、形質転換体あたりハロヒドリンエポキシダーゼ活性向上効果をもたらすアミノ酸変異箇所として、ハロヒドリンエポキシダーゼHheb(2nd)(配列番号2)の133番目のスレオニン残基(T133)、136番目のフェニルアラニン残基(F136)及び199番目のアスパラギン酸残基(D199)が見出された。これらの箇所のアミノ酸をランダムに変異させ、さらなる有用な改良型ハロヒドリンエポキシダーゼの取得を試みた。
T133、F136及びD199を20必須アミノ酸に変異させうるランダムプライマーとして、以下のものを作製した。
MDH-15:AGCGAAACGCGCNNNGCTGTAGGCCAGCG(配列番号63:29ヌクレオチドからなり、MDH-14の相補配列を有するアンチセンスプライマー)
MDH-17:ACCCGCGCTGAGCNNNACGCGCCGTGCTG(配列番号65:29ヌクレオチドからなり、MDH-16の相補配列を有するアンチセンスプライマー)
MDH-19:CGCGAGCAGCGCNNNCTCTCGGGCAGTCG(配列番号67:29ヌクレオチドからなり、MDH-18の相補配列を有するアンチセンスプライマー)
系列3はD199ランダム変異体の取得をそれぞれ目的とする)。
系列1:センスプライマーMDH-14、アンチセンスプライマーMDH-15
系列2:センスプライマーMDH-16、アンチセンスプライマーMDH-17
系列3:センスプライマーMDH-17、アンチセンスプライマーMDH-18
上記組成の各反応液について、以下の表の熱サイクル処理を行った。
実施例3(1)で作製したハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子部位特異的(T133、F136、D199)変異体ライブラリーから、さらなる有用な改良型ハロヒドリンエポキシダーゼのスクリーニングを行った。96ウェルプレート(ディープウェル)に、IPTGを終濃度として1mM含むLBAmp培地をウェルあたり500μlずつ分注し、実施例3(1)で作製したハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子部位特異的(T133、F136、D199)変異体ライブラリーの各系列につき200コロニーを、各ウェルに植菌した。なお、評価の対照として用いるJM109/pSTT002-T133A、JM109/pSTT002-F136S、JM109/pSTT002-D199H及びJM109/pSTT002を併せて植菌した。37℃、800rpmで約16時間培養した後、得られた培養液のうち20μlを平型96ウェルプレートに分注した。遠心分離機(佐久間製作所50A-IVD)及びローター(佐久間製作所 HM-2HLS)を用い、平型96ウェルプレートを遠心分離(3000rpm、5分間、4℃)に供した。培養液上清を除去した後、実施例2(2)記載の評価用反応液1及び評価用反応液3(200mM (S)-CHBN、0.025% ブロモクレゾールパープル(BCP)、50mM Tris-硫酸(pH8))40μlを各ウェルに添加した。懸濁後、室温で静置し、反応液の呈色変化を経時的に観察し、評価用反応液1を添加した系で対照であるJM109/pSTT002よりも有意に早く変色が見られた株、評価用反応液3を添加した系で対照であるJM109/pSTT002よりも有意に早く変色が見られた株、及び各株の評価用反応液1添加系における呈色速度と評価用反応液3添加系における呈色速度の比率が、対照であるJM109/pSTT002の該比率と異なる株を選抜した。各系列200コロニーについて該評価を行い、系列1(T133ランダム変異体ライブラリー)から7株、系列2(F136ランダム変異体ライブラリー)から7株、系列3(D199ランダム変異体ライブラリー)から19株を選抜した。
実施例3(2)で選抜した系列1(T133ランダム変異体ライブラリー)からの7株、系列2(F136ランダム変異体ライブラリー)からの7株、系列3(D199ランダム変異体ライブラリー)からの19株、計33株について、各株が有するハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子の変異を解析した。実施例3(2)で得られた各株培養液から、Flexi Prep(GEヘルスケアバイオサイエンス)を用いてプラスミド回収し、キャピラリーDNAシーケンサーCEQ2000(ベックマン・コールター)を用い、添付のマニュアルに従って、各プラスミド中のハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子の塩基配列を解析した。その結果を表4に示した。
実施例2及び実施例3で取得された改良型ハロヒドリンエポキシダーゼによって合成した(R)−CHBNの光学純度を調べるため、まず、各改良型ハロヒドリンエポキシダーゼを発現する形質転換体より粗酵素液を調製した。改良型ハロヒドリンエポキシダーゼを発現する15株の形質転換体株(JM109/pSTT002-T133A、JM109/pSTT002-T136C、JM109/pSTT002-T133S、JM109/pSTT002-F136A、JM109/pSTT002-F136S、JM109/pSTT002-F136W、JM109/pSTT002-D199Q、JM109/pSTT002-D199E、JM109/pSTT002-D199H、JM109/pSTT002-D199S、JM109/pSTT002-D199T、JM109/pSTT002-D199M、JM109/pSTT002-D199L、JM109/pSTT002-D199I、JM109/pSTT002-D199Y)及び対照とするJM109/pSTT002の計16株について、次のように三次評価を行った。LBAmp培地をワッセルマン試験管に1mlずつ分注し、各試験管に、二次評価選抜株15株及びJM109/pSTT002のコロニーをそれぞれ植菌した。37℃、210rpmで約8時間培養した後、得られた各培養液100μlを、IPTGを終濃度として1mM含むLBAmp培地(500ml容三角フラスコ中の100ml)に植菌し、37℃、210rpmで16時間培養した。得られた各培養液100mlから遠心分離(3,700×g、10分間、4℃)により各菌体を回収し、20mM Tris-硫酸緩衝液(pH8.0)で洗浄した後、菌濃度が12.5gDC/Lとなるように同緩衝液に懸濁した。得られた菌体懸濁液の3mlを、超音波破砕機VP−15S(タイテック、日本)を用いて、出力コントロール4、DUTY CYCLE 40%、PULS、TIMER=Bモード10sの条件で氷冷しながら10分間破砕した。破砕した菌体懸濁液を遠心分離(23,000×g、5分間、4℃)に供し、上清を粗酵素液として採取した。得られた各粗酵素液について、実施例1(3)記載の方法において反応液のDCP濃度を400mMとした反応液を用いた方法により、ハロヒドリンエポキシダーゼ活性(脱クロル活性)をそれぞれ測定した。1Uを上記各条件下でDCPから1分間あたり1μmol塩化物イオンの脱離する酵素量に相当するものと定義して活性測定に用いた各菌体懸濁液の活性を、該活性を活性測定に用いた各菌体懸濁液の液量で除することにより各菌体懸濁液の液活性を算出した。
後述する改良型ハロヒドリンエポキシダーゼによる(R)−CHBNの合成反応において実施する反応液中のDCP、ECH及びCHBN濃度分析及び生成CHBNの光学純度分析は、以下のように行った。
<反応液中のDCP、ECH及びCHBN濃度分析>
反応液中のDCP、ECH及びCHBN濃度分析は、逆相系HPLCにより行った。逆相系HPLC分析条件を下表に示す。
<生成CHBNの光学純度分析>
生成CHBNの光学純度分析は、CHBNをエステル化後、順相系HPLCにより行った。順相系HPLC分析条件を下表に示す。
実施例4(1)で調製した各改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ発現形質転換体由来粗酵素液を用い、シアン化カリウム存在下、DCPからのCHBN合成反応を行った。反応液基本組成は以下の表のようにし、反応スケールは2mlで行った。
また、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼを発現する形質転換体株JM109/pSTT002由来粗酵素液を用いて合成された(R)−CHBNの光学純度が91.6%eeであったのに対し、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼを発現する形質転換体株(JM109/pSTT002-T133A、JM109/pSTT002-T133C、JM109/pSTT002-D199Q、JM109/pSTT002-D199E、JM109/pSTT002-D199H、JM109/pSTT002-D199S、JM109/pSTT002-D199T、JM109/pSTT002-D199L、JM109/pSTT002-D199M、JM109/pSTT002-D199I 及びJM109/pSTT002-D199Y)由来粗酵素液を用いて合成された(R)−CHBNの光学純度は93.1%ee〜97.8%eeであり、これらの改良型ハロヒドリンエポキシダーゼにより合成される(R)−CHBNは、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼにより合成される(R)−CHBNよりも光学純度が高いことが確認された。従って、これらの改良型ハロヒドリンエポキシダーゼは、DCP及び/又は中間体ECHに対する立体選択性が向上していることが考えられた。
改良型ハロヒドリンエポキシダーゼを発現する形質転換体(ロドコッカス属細菌宿主)を作製し、該形質転換体の評価を行った。まず、特開2007−49932号記載の発現プラスミドpJHB057を鋳型として、ハロヒドリンエポキシダーゼHheB(1st)(配列番号1)の141番目のスレオニン残基のアラニンへの置換変異(T141A)、144番目のフェニルアラニン残基のセリンへの置換変異(F144S)及び207番目のアスパラギン酸残基のヒスチジンへの置換変異(D207H)がそれぞれ導入された改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ発現プラスミドを作製した。変異導入に用いるプライマーとして、以下のものを作製した。
MDH-06:AGCGAAACGCGCCGCGCTGTAGGCCAGCG(配列番号69:29ヌクレオチドからなり、MDH-05の相補配列を有するアンチセンスプライマー)
MDH-08:ACCCGCGCTGAGCGGAACGCGCCGTGCTG(配列番号71:29ヌクレオチドからなり、MDH-07の相補配列を有するアンチセンスプライマー)
MDH-10:CGCGAGCAGCGCGTGCTCTCGGGCAGTCG(配列番号73:29ヌクレオチドからなり、MDH-09の相補配列を有するアンチセンスプライマー)
系列1:センスプライマーMDH-05、アンチセンスプライマーMDH-06
系列2:センスプライマーMDH-07、アンチセンスプライマーMDH-08
系列3:センスプライマーMDH-09、アンチセンスプライマーMDH-10
上記組成の各反応液について、以下の表の熱サイクル処理を行った。
得られたpJHB057-T141A、pJHB057-F144S及びpJHB057-D207Hを用い、特開2007−49932号記載の方法により、ロドコッカス・ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous) J1株(受託番号「FERM BP-1478」)の形質転換を行った。得られたコロニーのプラスミドをそれぞれ確認し、3種の形質転換体J1/pJHB057-T141A、J1/pJHB057-F144S及びJ1/pJHB057-D207Hを得た。
実施例6(1)で得られた3種の形質転換体(J1/pJHB057-T141A、J1/pJHB057-F144S 及びJ1/pJHB057-D207H)の評価を次のように行った。該3株の形質転換体及び対照とするJ1/pJHB057の計4株を、それぞれGGPK培地(1.5% グルコース、1% グルタミン酸ナトリウム、0.1% バクトイーストエキス、0.05% K2HPO4、0.05% KH2PO4、0.05% MgSO4・7H2O、カナマイシン 50μg/ml、pH7.2)100mlに植菌し、30℃で72時間振盪培養した。得られた各培養液100mlから遠心分離(3,700×g、10分間、4℃)により各菌体を回収し、20mM Tris-硫酸緩衝液(pH8.0)で洗浄した後、菌濃度が12.5gDC/Lとなるように同緩衝液に懸濁した。得られた菌体懸濁液の3mlを、超音波破砕機VP−15S(タイテック、日本)を用いて、出力コントロール4、DUTY CYCLE 40%、PULS、TIMER=Bモード10sの条件で氷冷しながら10分間破砕した。破砕した菌体懸濁液を遠心分離(23,000×g、5分間、4℃)に供し、上清を粗酵素液として採取した。得られた各粗酵素液について、実施例1(3)記載の方法において反応液のDCP濃度を400mMとした反応液を用いた方法により、ハロヒドリンエポキシダーゼ活性(脱クロル活性)をそれぞれ測定した。1Uを上記各条件下でDCPから1分間あたり1μmol塩化物イオンの脱離する酵素量に相当するものと定義して活性測定に用いた各粗酵素液の活性を、該活性を活性測定に用いた各粗酵素液の液量で除することにより各粗酵素液の液活性を算出した。さらに、該液活性をタンパク濃度で除することによって各株のタンパクあたり比活性を算出した。タンパク濃度は、バイオラッドプロテインアッセイ(バイオラッド)を用いて測定した。その結果を表7に示した。
配列番号31〜56:変異DNA
配列番号57〜61:合成DNA
配列番号62:合成DNA
配列番号62:nはa、c、g又はtを表す(存在位置:15〜17)
配列番号63:合成DNA
配列番号63:nはa、c、g又はtを表す(存在位置:13〜15)
配列番号64:合成DNA
配列番号64:nはa、c、g又はtを表す(存在位置:14〜16)
配列番号65:合成DNA
配列番号65:nはa、c、g又はtを表す(存在位置:14〜16)
配列番号66:合成DNA
配列番号66:nはa、c、g又はtを表す(存在位置:15〜17)
配列番号67:合成DNA
配列番号67:nはa、c、g又はtを表す(存在位置:13〜15)
配列番号68〜73:合成DNA
配列番号74:Xaaは任意のアミノ酸残基を表す(存在位置:2〜13、15,16、19)
配列番号75:Xaaは任意のアミノ酸残基を表す(存在位置:2、5〜8、10)
配列番号76〜83:変異ペプチド
配列番号84〜91:変異DNA
Claims (14)
- 以下のアミノ酸配列I:
S-α1-α2-α3-α4-α5-α6-α7-α8-α9-α10-α11-α12-Y-α13-α14-A-R-α15 (配列番号74)
(Sはセリン残基、Yはチロシン残基、Aはアラニン残基、Rはアルギニン残基を表し、α1〜α15はそれぞれ独立して同一の又は異なる任意のアミノ酸残基を表す。)
及び以下のアミノ酸配列II:
L-β16-R-L-β17-β18-β19-β20-E-β21 (配列番号75)
(Lはロイシン残基、Rはアルギニン残基、Eはグルタミン酸残基を表し、β16〜β21はそれぞれ独立して同一の又は異なる任意のアミノ酸残基を表す。)
を含む野生型ハロヒドリンエポキシダーゼのアミノ酸配列に対して以下の(A)〜(D)より選択されるいずれか又は複数のアミノ酸変異が導入されたアミノ酸配列からなる、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ。
(A)開始アミノ酸残基より1残基C末端側のアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸変異
(B)α14残基が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸変異
(C)α15残基が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸変異
(D)β21残基が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸変異 - 以下のアミノ酸配列I:
S-α1-α2-α3-α4-α5-α6-α7-α8-α9-α10-α11-α12-Y-α13-α14-A-R-α15 (配列番号74)
(Sはセリン残基、Yはチロシン残基、Aはアラニン残基、Rはアルギニン残基を表し、α1〜α15はそれぞれ独立して同一の又は異なる任意のアミノ酸残基を表す。)
及び以下のアミノ酸配列II:
L-β16-R-L-β17-β18-β19-β20-E-β21 (配列番号75)
(Lはロイシン残基、Rはアルギニン残基、Eはグルタミン酸残基を表し、β16〜β21はそれぞれ独立して同一の又は異なる任意のアミノ酸残基を表す。)
を含む野生型ハロヒドリンエポキシダーゼのアミノ酸配列に対して以下の(E)〜(H)より選択されるいずれか又は複数のアミノ酸変異が導入されたアミノ酸配列からなる、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ。
(E)開始アミノ酸残基より1残基C末端側のアミノ酸残基がリジン又はアスパラギンに置換されたアミノ酸変異
(F)α14残基がアラニン、システイン又はセリンに置換されたアミノ酸変異
(G)α15残基がアラニン、セリン又はトリプトファンに置換されたアミノ酸変異
(H)β21残基がグルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、セリン、スレオニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン又はメチオニンに置換されたアミノ酸変異 - 前記野生型ハロヒドリンエポキシダーゼがグループBに分類されるものである、請求項1又は2記載の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ。
- 前記野生型ハロヒドリンエポキシダーゼが、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属細菌又はマイコバクテリウム(Mycobacterium)属細菌由来のものである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ。
- 前記野生型ハロヒドリンエポキシダーゼのアミノ酸配列が、配列番号1又は配列番号2に示されるアミノ酸配列である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ。
- 前記野生型ハロヒドリンエポキシダーゼのアミノ酸配列に対して以下の(i)〜(iii)より選択されるいずれか又は複数のアミノ酸変異が導入されたアミノ酸配列からなる、請求項1〜5いずれか1項に記載の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ。
(i)開始アミノ酸残基より1残基C末端側のアミノ酸残基、α14残基、α15残基及びβ21残基以外のアミノ酸残基より選択される1個もしくは数個のアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸変異
(ii)開始アミノ酸残基より1残基C末端側のアミノ酸残基、アミノ酸配列Iに含まれるアミノ酸残基及びアミノ酸配列IIに含まれるアミノ酸残基以外のアミノ酸残基より選択される1個もしくは数個のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸変異
(iii)開始アミノ酸残基より2残基以上C末端側のアミノ酸残基からなる領域のうちアミノ酸配列I及びアミノ酸配列IIからなる領域以外の領域中に、1個もしくは数個の任意のアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸変異 - 請求項1〜6のいずれか1項に記載の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼをコードする遺伝子。
- 請求項7記載の遺伝子を含む組換えベクター。
- 請求項8記載の組換えベクターを宿主に導入して得られる形質転換体又は形質導入体。
- 請求項9記載の形質転換体又は形質導入体を培養して得られる培養物。
- 請求項10記載の培養物から採取される改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ。
- 請求項9記載の形質転換体又は形質導入体を培養し、得られる培養物から改良型ハロヒドリンエポキシダーゼを採取することを特徴とする、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼの製造方法。
- 請求項1〜6及び11のいずれか1項に記載の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ及び/又は請求項10記載の培養物を、1,3−ジハロ−2−プロパノールと接触させることによりエピハロヒドリンを生成させることを特徴とする、エピハロヒドリンの製造方法。
- 請求項1〜6及び11のいずれか1項に記載の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ及び/又は請求項10記載の培養物を、シアン化合物存在下、1,3−ジハロ−2−プロパノール又はエピハロヒドリンと接触させることにより4−ハロ−3−ヒドロキシブチロニトリルを生成させることを特徴とする、4−ハロ−3−ヒドロキシブチロニトリルの製造方法。
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