CZ369197A3

CZ369197A3 - Způsob pro získání acyloinů, k tomu vhodná pyruvátdekarboxyláza, jakož i její výroby a sekvence DNA pro toto kódujícího PDC-genu

Info

Publication number: CZ369197A3
Application number: CZ973691A
Authority: CZ
Inventors: Heike Bruhn; Martina Pohl; Katrin Mesch; Maria Regina Kula
Original assignee: Forschungszentrum Jülich GmbH; Heike Bruhn; Martina Pohl; Katrin Mesch; Maria Regina Kula
Priority date: 1995-05-26
Filing date: 1996-05-22
Publication date: 1998-02-18
Also published as: EP0828841A2; CA2222493A1; US6004789A; DE19523269C2; WO1996037620A2; JPH11505710A; IN186507B; WO1996037620A3; AU714414B2; CN1192244A; IN189539B; BR9608798A; KR19990021965A; DE19523269A1; CZ287619B6; AU5810296A

Description

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu pro získávání acyloinů enzymatickou přeměnou aketokarbonových kyselin a/nebo aldehydů za přítomnosti pyruvátdekarboxylázy (PDC) a zahrnuje k tomu vhodnou PDC a její výrobu a k tomu kódující (přepisující) PDC-gen.

Dosavadní stav techniky

Acyloiny případně α-hydroxyketony jsou sloučeniny s jedním opticky aktivním uhlíkovým atomem, které sehrávají významnou úlohu v syntéze komplexnějších sloučenin, jako zvláště (R) - (-) - fenylacetylkarbinolu (PAC), který má velký ekonomický význam pro výrobu efedrinu. Zde je zajímavý R-enantiomer, který se vytváří fermentativní přeměnou z pyruvátu za přítomnosti benzaldehydu pomocí Saccharomyces cerevisiae (DE-PS 548 459 z roku 1932).

Při této syntéze PAC pomocí kvasinkových buněk se na základě velkého počtu v kvasnicích existujících enzymů tvoří četné vedlejší produkty a růst buněk se inhibuje přítomností benzaldehydu.

Také z droždí izolovaná pyruvátdekarboxyláza (PDC) vede při této přeměně ke značným podílům k PAC isomerního 2-hydroxypropiofenonu.

Na tiamindifosfát- a Mg²⁺ - závislá PDC (E.C. 4.1.1.1) je široce rozšířená a nachází se v mnoha rostlinách, kvasinkách a houbách i v některých bakteriích. Katalyzuje neoxidativní dekarboxylaci pyruvátu na acetaldehyd a jako vedlejší reakce probíhá kondenzace acyloinů za vzniku α-hydroxyketonů, jak je zřejmé z obrázku 1.

Takováto enzymatická přeměna se také provádí tak, že se vychází z aldehydu místo z α-ketokarbonových kyselin a na kondenzační reakci se může také podílet dekarboxylaci vytvořený aldehyd jako kosubstrát při tvorbě homoacyloinů R-CHOH-CO-R', kde R = R'.

• · · · · ·

PDC byla již také izolována ze Zymomonas mobilis. Porovnání PDC izolované z droždí s PDC ze Zymomonas mobilis případně tvorby PAC za srovnatelných podmínek však přesto vykazovalo výrazně menší syntézní kapacitu PDC ze Zymomonas mobilis (S. Bringer-Meyer a H. Sahm, Biocatalysis 1 (1988) strana 321-331).

Nyní bylo překvapivě zjištěno, že cílenou geneticko-technologickou přeměnou genu PDC ze Zymomonas mobilis lze získat PDC se zlepšenou kapacitou syntézy pokud se týká tvorby PAC, která se navíc vyznačuje vysokou selektivitou pro tvorbu PAC ve srovnání s 2-hydroxypropiofenonem.

Podstata vynálezu

Způsob podle vynálezu uvedený v úvodu se v podstatě vyznačuje tím, že se jako PDC použije enzym, u kterého je tryptofanový zbytek v substrátovém kanálu vedoucím k aktivnímu centru nahrazen stéricky menším zbytkem aminokyseliny.

U stéricky menšího zbytku aminokyseliny se jedná zvláště o nějakou jednoduchou, zvláště alifatickou aminokyselinu, jako konkrétně o alanin, glycin, fenylalanin, leucin, isoleucin, arginin nebo histidin nebo také serin a threonin.

Geneticko-technologicky změněná nová PDC se získá výměnou pro tryptofan na pozici 392 kódujícího kodonu TGG na pozici 1174-1176 sekvence DNA PDC genu ze Zymomonas mobilis o sobě známým způsobem a expresí PDC v produkčním organismu, jako je zvláště Escherichia coli, ze kterého se PDC izoluje. Cílená mutace probíhá například pomocí polymerázové řetězové reakce při použití na straně 6 uvedeného primeru. Konstrukce expresního vektoru pBTac2 pro mutovanou PDC se prováděla tak, že se vycházelo z expresního vektoru pPDC E. coli enzymu divokého typu.

Získávání mutované PDC se provádí po sklizení a otevření buněk z hrubého extraktu chromatografickými metodami způsobem o sobě známým.

Přeměnou PDC podle vynálezu se její kapacita syntézy PAC zlepšuje o faktor 4. Toto zlepšení je výsledkem cíleného oslabení případně odstranění limitace přístupu k aktivnímu centru enzymu vedoucím substrátovým kanálem, čímž se usnadňuje přístup objemnější substrátové molekuly k aktivnímu centru a odchod vytvořeného produktu.

·· · r · ······

Analogická optimalizace se dosahuje obecné u tiamindifosfát- -závislých enzymů, které vykazují přístupovou limitaci - ať již stéricky nebo vlivy nabíjením podmíněného způsobu - do substrátového kanálu vedoucího k aktivnímu centru: analogickou přeměnou sekvence DNA pro enzym kódujícího genu, a sice prostřednictvím výměny přístup limitujícího kódujícího kodonu kodonem, který je kóduje pro zbytek aminokyseliny odstraňující přístupovou limitaci, se dosáhne značného zvýšení syntézní kapacity enzymu.

PDC získaná podle vynálezu je pro syntézu PAC mimořádně zajímavá, protože s její pomocí lze dosáhnout vysoké optické čistoty R - (-) - isomeru (»98 %) a dále PAC, která je provázena pouze malým procentem (2-3 %) 2hydroxypropiofenonu. Získání a izolace enzymu ze sklizeného mikroorganismu je možné relativné jednoduchým způsobem (ve srovnání s droždím).

Při enzymatické acyloinové kondenzaci prostřednictvím PDC lze použít jako substrát lineární a/nebo rozvětvené α-ketokarbonové kyseliny a jako substrát a/nebo kosubstrát aldehydy aromatické, cyklické, s dlouhým řetězcem a/nebo řetězcem rozvětveným. Jako příklad lze zde uvést benzaldehyd, cyklohexanaldehyd, furfurol, aldehyd skořicový, krotonaldehyd, pyruvát, 2ketomáselná kyselina, 2-ketopentanová kyselina, 2-keto-4-metylhexanová kyselina, 2-keto-4-metylpentanová kyselina, 2-keto-4,4-dimetylhexanová kyselina, 3-fenyl-2-keto-propanová kyselina.

Další zvláštnosti vynálezu vyplývají z patentových nároků a následujícího popisu podrobností provedení. Dále je vynález ilustrován pomocí obrázků jež jsou níže popsány.

Obrázek 1 znázorňuje reakční schéma pro PDC pro příklad pyruvát a benzaldehyd jako substrát a kosubstrát s hlavní cestou dekarboxylace a vedlejší reakce karboligázy s tvorbou PAC;

Obrázek 2 znázorňuje konstrukční schéma pro tvorbu expresního vektoru pPDC obsahujícího PDC ze Zymomonas mobilis.

Obrázek 3 znázorňuje schéma pro prostřednictvím alkoholdehydrogenázy optimalizované produkce PAC podle obrázku 1 prostřednictvím zachycení acetaldehydu.

• · · · · ·

Příklad provedení

Příklad

1. Výroba PDC-mutantu PDC-W392A

1.1 Konstrukce expresního vektoru pPDC

Pro expresi PDC ze Zymomonas mobilis byl zvolen vektor pBTac2 (Boehringer, Mannheim). Transkripce cizího genu je kontrolována silným tacpromotorem, hybridem z trp- a lacUV-promotoru s 11 násobnou případné 3 násobnou účinností rodičovských promotorů. Sekvence operátoru a oblast vazby ribozomu pocházejí z genu lacZ. Regulace transkripce se takto provádí lacrepresorem nadexpremierujícího (laciQ) bakteriálního kmene a je indukovatelná isopropyl-p-d--tiogalaktosidem (IPTG). Vektor obsahuje jednu rozeznávací sekvenci restrikční endonukleázy EcoRI, následovanou iniciačním kodonem ATG a dále pak dalšími restrikčními rozeznávacími sekvencemi (sites), takže tento vektor může být použit univerzálně k expresi genových sekvencí jak s a nebo také bez vlastního iniciačního kodonu.

Multiplenární klonovací místo následují silné ribozomální RNA transkripční terminátory rmB, aby se zaručilo kontrolovatelné přerušení transkripce. Jako výchozí materiál pro klonování genu PDC ze Zimomonas mobilis (ATCC 29191) byl k dispozici vektor pZY234B (G. Sprenger, Institut fůr Biotechnologie 2, KFA-Jůlich). Tento plazmid obsahuje 3.2 kb velký fragment DNA ze Zymomonas mobilis s úplným genem PDC včetně nekódujících regionů (obrázek 2). Aby se umožnila ligace kódovaných sekvencí v expresním vektoru, bylo potřebné zavést ve směru 5' iniciačního kodonu novou restrikční rozeznávací sekvencí. Optimální vzdálenost iniciačního kodonu od Shine-Dalgarnovy-sekvence vektoru zajišťuje ligaci genu na EcoRI-site vektoru pBTac2. Elegantní a prostou metodu k modifikaci sekvence DNA nabízí řetězová reakce polymerázy (PCR). Opakované cykly tepelné denaturace dvojité spirály DNA a enzymatická syntéza pomocí termostabilní polymerázy DNA umožňují exponenciální zesílení definovaných fragmentů DNA. Velikost a identita produktu je podmíněna východiskem (primerem) syntézy.

Jestliže primery obsahují modifikaci původní sekvence, například mutace, delece nebo také dodatkové báze (inzerce), budou tyto v důsledku toho k dispozici také v syntetickém fragmentu.

Touto metodou bylo zavedeno potřebné EcoRI-restrikční místo ve směru 5' iniciačního kodonu PDC genu, protože během oligonukleotidové syntézy byla na 5'-konci primeru komplementárního ke genu připojena rozeznávací sekvence enzymu. Protože některé endonukleázy mají silně snižující aktivitu pro restrikci koncových sekvencí, byly na ECoRI-site vzestupně zavedeny čtyři další báze.

Pro PCR většinou používaná taq-polymeráza neobsahuje žádnou 3'5'exonukleázovou aktivitu (proof-reading). Jí syntetizovaná sekvence je v důsledku toho ovlivněna statistickou mírou chyby. I když toto lze volbou vhodných reakčních podmínek udržet na velmi nepatrné míře 1/100.000, podmiňuje to také nezbytnost sekvencování zcela každého fragmentu, aby byla zajištěna integrita syntézy. Za tím účelem byl pro zesílení zvolen nikoli celý kódovaný region genu PDC (1712 bp), ale menší fragment (890 bp) od 5'-terminu až k jednotlivému restrikčnímu výchozímu místu (EcoRV) (obrázek 2).

Produkt PCR byl potlačen odpovídajícími restrikčními endonukleázami EcoRI a EcoRV.

Chybějící druhá část PDC genu byla získána restrikcí pomocí ECoRV a BamHI z plazmidu pZY134B, přičemž takto vzniklý fragment (1.2 kb) na konci 3' obsahuje ještě asi 350 bp netranslatované sekvence PDC genu. Oba fragmenty byly separovány preparativní elektroforézou v agarosovém gelu, izolovány a ligovány do EcoRI a BamHI linearizovaného, izolovaného pBTac2 (4.6 kb). Klonování se provádělo v E. coli JM 109, kmenem přexprimujím lac-represor.

1.2 Molekulárně biologické práce

Pro získání PDC mutované prostřednictvím výměny tryptofan/alanin v poloze 392 byl nejdříve u enzymu divokého typu existující kodon TGG (tryptofan) vyměněn za GCG (alanin) (výměna polohy 1174-1176 genu pyruvátdekarboxylázy ze Zymomonas mobilis). Zavedení cílené mutace se provádělo pomocí Ho a dalšími popsanou metodou podporovanou řetězovou polymezárovou reakcí ( N. Ho, H. D. Hunt, R. M. Horton, J. K. Pullen, L. R. Pease, Gene 77 (1989) strana 51).

Jako východisko byl k dispozici PDC gen ze Zymomonas mobilis v expresním vektoru pPDC E. coli (viz obrázek 2). Izolace DNA se prováděla standardními metodami (J. Sambroch, E. F. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning (1989) Sping Harbor Laboratory Press).

Jako chemický vzorec (templát) pro syntézu obou překrývajících jednotlivých fragmentů sloužil plazmid pPDC. Priméry (příměrové sekvence podle přílohy) byly použity v koncentraci 0,2 - 0,4 nM. Reakce se prováděla taq polymerázou (Biomasters, Kolín nad Rýnem) ve výrobcem udávaném reakčním pufru, plus 1,5 mM MgCI₂ a po 0,2 mM nukleotidu v Robo-Cycler (Stratgene) s následujícím teplotním programem: 2,5 minut 94° C pro denaturaci, potom 30 cyklů s 1,5 minutovou denaturaci při 94⁰ C, 1,2 minut temperování při 48⁰ C a 2 minutovém prodloužení při 72 ⁰ C, následované 10 minutami při 72 ⁰ C k dokončení reakce. Temperovací teplota se pohybovala mezi 48⁰ C a 56⁰ C, podle teoretické teploty tání použitého primeru. Teplota tání oligonukleotidů byla vypočtena na základě následujícího vzorce:

Tm = 2 * (A+T) + 3 * (C+G)

Fragmenty byly separovány elektroforeticky, izolovány, vysráženy pro koncentrování etanolem a opět zachyceny do tris-HCI-pufru, 10 mM, pH 7,4.

V druhé kombinované PCR bylo vždy použito jako templátu asi 50-100 ng překrývajících se fragmentů. Další reakční podmínky byly identické jako u první reakce. Volba teploty temperování se řídila podle teploty tání výsledného překryvného regionu fragmentů. Další manipulace (restrikce, izolace, ligace) pro nahrazení DNA divokého typu v expresním vektoru pPDC mutovanými fragmenty se prováděly standardními metodami (J. Sambrock, E. f. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning (1989) Spring Harbor Laboratory Press).

Sekvence použitých primerů

Číslování se vztahuje na 1. (5')-nukleotidovou PDC sekvenci s = smysl, as = antismysl (protismysl) Mutované báze jsou podtrženy.

Primer pro syntézu jednotlivého fragmentu 5'

PDC867S

CTACTCCACCACTGGTTGGACG

PDC1186as

GAGGATTGAAGGAGAGTCACC

Primer pro syntézu jednotlivého fragmentu 3'

PDC1159S

GAAACCGGTGACTCTGCGTTACAATGC

PBTAC453as

ATCTTCTCTCATCCGCCAAACA (tento primer je komplementární k vektorové sekvenci na konci 3' v návaznosti na PDC sekvenci PDC)

Primer pro syntézu fúzního fragmentu

PDC867s

CTACTCCACCACTGGTTGGAGG

PBTAC453as

ATCTTCTCTATCCGCCAAACA (tento primer je komplementární k vektorové sekvenci na konci 3' navazující na sekvenci PDC)

ATGAGTTATA TCTCAAGCAT ACAACCTGCT CTGAACTGCG AGCAGCCGTC TCGGTGGCGC CCGAACAACA CAAAACCGAC CCGCTGAAGC GTGATCAAAA TTGCAACATT TGTTCAATGA GAAACCCTGA CAGCAAGCTG ACGCTTTGGG CCAGAAGAAA TCCGGGCGTT CTCCTGTCTT CCTAAGAAAC TCGCTTCCCC AAGTTTCCAA GGTGAACTGA CGCAGAAATC TTATTGCTGA CCGAACGGTG GTCCGTTCCT ACATCCTCAT GCTCAGATGG CTATGGTTAC TCAAGAACTG GGTTATGACA ACTGGCAGAA TGATCGAATG TGGGGTAAGC CCTCTAG

CTGTCGGTAC CACTTCGCAG TTTGAACAAA GTTTCAGTGC GTTACCTACA CTATGCAGAA ACGACCACGC ŤATCACTATC GATTTACACC CTGCTCTTCG GCTTCCATGC CGAAGCCAGC AATTCATCGC CGCGCTGCTG CGGTGCAGTG ATGCCAATTA GAAAAGACGA CAACGACTAC TGGTTCTCGC AGCGTTCATC GAAAACCGGŤ AGAAAGCCGC GCCCGTCAGG AACCGGTGAC CTCGCGTTGA GCCGCCTTCG GGTTGGTGAT TTCGCCTGAA ACCATCGAAG GGATTATGCC GCGGTGCTGC GCTATCAAGG CTTCATCGGT GCGTTGCTGC

CTATTTAGCG TCGCGGGCGA AACATGGAGC AGAAGGTTAT GCGTTGGTGC AACCTTCCGG TGCTGGTCAT AGTTGGAAAT CCGGAAGAAG CGAGAAGAAG CCTGCGCCGC GACGAAGCAT CAACCGCGAC GTGCTGAAGA GCTACTATGG CATTGGTACC TGAAAGAAGC TCCACCACTG TGAACCGCGT TGAAAGACTA TCTTTGGACT TCCGGCTGAT TCGAAGCTCT TCTTGGTTCA ATATGAAATG GTTATGCCGT GGTTCCTTCC ACTGCCGGTT TTATGATCCA GGTCTGATGG TAAAGGCCTG TTGCTCTGGC CGTGAAGACT CGCCAACAGC

GAGCGGCTTG CTACAACCTC AGGTTTATTG

GCTCGTGCCA

GCTTTCCGCA

TTATCCTGAT GTGTTGCATC

GGCCAAGAAC ^z'CTCCGGCTAA

CCGGTTTATC

TCCTGGACCG

CCTTGAATGC

AAAGTTGCCG

AGCTGCTGTT

CTGCTGCCAA

TCATGGGGCG

CGATGCGGTT

GTTGGACGGA

TCTGTCGTTG

TCTGACCCGT

TCTTCAAATC

CCGAGTGCTC

TCTGACCCCG

ATGCTCAGCG

CAGTGGGGTC

CGGTGCTCCG

AGCTGACGGC

ATCATCTTCT TGATGGTCCG

AAGTGTTCAA

AAGGCTAAAA

AAACACCGAC

GCACTGAAGA CGTAAGCCTG

TCCAGATTGG GTCCTTCTTG CTGTAACGAA AAGGCGCAGC TTTGATGCTA CTCCGGTGCT ACGCTCTTGG ATCACGGCCG AATCGATCAC TCGAAATCGC GCAAGTGCAT AGCGGTTGAC TCCTCGTCGG AAATTCACCG GAGCTTCTTC AAGTCAGCTA ATCGCTCTGG TATCCCTGAT TCAACGGCAT TTGGCTCAGA CCTCAATGCA CGTTGGTCAA AACACGACGG CATGAAGCTC ACATTGGTTG GAACGTCGCA TCAGGAAGTT TGATCAATAA TACAACAACA CGGTAACGGT CCGGTGGCGA GGCCCAACCC ATTGGTCAAA TTAACAAGCT • · · · · * ···· ··· ··· ··· ·· «

1.2 Exprese a čištění

Prostřednictvím exprese modifikované DNA v buňkách E. coli byl obdržen enzym podle vynálezu (PDC-W392A). Mutovaný enzym (mutant) PDC-W392A byl exprimován podle následujícího postupu a vyčištěn z buněčného extraktu:

Buňky E.coli nesoucí expresní plazmid pro mutanty PDC-W392A byly v LB prostředí včetně 100 pg/ml ampicillinu fermentovány pro selekci. Prostředí bylo naočkováno předkulturami ve stacionární fázi růstu v poměru 1:50 a inkubováno při 37° C a 220 ot./min.

indukce exprese se prováděla při OD600 z 0.6 přidáním 1 mM IPTG. Mutant PDC byl za těchto podmínek přeexprimován 20 % rozpustného proteinu E. coli.

Pro výrobu postačujících množství enzymů byla provedena exprese jak je popsáno výše v 8 litrovém fementoru. Byla nastavena hodnota pH 7,0 a proud vzduchu 10 l/h. Rychlost míchání činila 200 ot./min. Pro zabránění nadměrné tvorbě pěny byl přidáván podle potřeby polypropylenglykol. Buňky byly po 3 hodinové expresi sklizeny pomocí chlazeného kontinuálního odstřeďování. Následovalo potom semletí skleněnými perličkami. Za tím účelem byla vytvořena 30 % buněčná suspenze v Mes/KOH-pufru, 50 mM, pH 6,5, včetně 5 mM MgCI₂ a 0,1 mM ThDP a použit dvojitý objem skleněných perliček (d = 0,3 mm). V závislosti na zpracovávaném objemu se provádělo rozpouštění v Eppendorfových nádobách v mlýně Retsch-Múhle nebo po vymrazení v dezintegrátoru S (maximální objem 80 ml). Mletí se provádělo 10 minut s maximálním výkonem. Suspenze se odstředila, skleněné perličky omyly pufrem a vyčištěná odstředěná kapalina se zfiltrovala (1 μηη). Vyčištění PDC mutantů se provádělo sloupcovou chromatografií následovně:

1. Chromatomatografie na iontoměničích s výměnou aniontů

Hrubý extrakt (asi 110 ml, cca 1.0 - 1.5 g proteinu) byl dělen na QSepharose Fast Flow (Pharmacia) 2.6 * 9.5 cm) s rychlostí toku 5 ml/min za použití zařízení pro rychlou kapalinovou chromatograf i i (FPLC firmy Pharmacia). Enzym se vymýval při použití lineárního gradientu NaCI (0 - 200 mM) v 10 mM Mes/KOH, pH 6,5, 2 mM MgCI₂, 1,0 mM ThDP, při 100 mM NaCI. Frakce obsahující cílový protein byly identifikovány testem účinnosti(viz níže).

2. Hydrofobní interakční chromatografie (HIC)

Spojené frakce byly upraveny na obsah síranu amonného s 50 % nasycením přídavkem určitého objemu nasyceného roztoku síranu amonného. Hydrofobní interakční chromatografie se prováděla na buthylsepharose (Pharmacia) (sloupec 5*8 cm) s rychlostí toku 2 ml/min. Materiál byl před naložením (ekvilibrován) uveden do rovnováhy pomocí 40 % síranu amonného v 50 mM Mes/KOH, 2 mM MgCI₂, 0,1 mM ThDP. Enzym se eluoval ve stejném pufru s klesajícím gradientem síranu amonného (40 - 0 %) při 24 %. Cílové frakce byly opět identifikovány pomocí testu aktivity (účinnosti) a spojeny (asi 160 ml).

3. Odsolení se provádělo Sephadexem G25 a přepufrováním na 50 mM Mes/KOH, 2 mM MgCI₂, 0,1 mM ThDP. Rychlost toku činila 20 ml/min. Poté byla provedena lyofilizace.

1.3 Test aktivity (dekarboxylační reakce)

Stanovení enzymatické aktivity bylo provedeno spojeným enzymatickým testem, přičemž se fotometricky sledovala oxidace NADH pomocným enzymem alkoholdehydrogenázou z droždí (E.C. 1.1.1.1). Reakční vsázka obsahovala 16,9 mM pyruvátu, 0,18 mM NADH a 10 U ADH v 50 mM Mes/KOH, pH 6,5, 20 mM MgSO₄, 1,5 mM ThDP. Enzymová jednotka PDC (1 U) odpovídá množství enzymu, které katalyzuje přeměnu 1 pmolu substrátu během jedné minuty při 30°C. Enzymatická aktivita se vypočte podle vzorce:

Δ E/min * V * f c(U/ml) = _______________________ ε *d * v • · · · · ·· • · · · ······ • · · · ·· ···· ··· ··· ··· ··· ε (NADH) = 6.3 I * mMol-1 * cm-1

V = celkový objem v = objem vzorku d = tlouštka vrstvy kyvety (1 cm)

Δ E/min = extinkční pokles za minutu f = zřeďovací faktor vzorku

2. Použití PDC-W392 A pro syntézu PAC

Získávání chirálních acyloinů se může provádět tak, že se vychází z aketokarbonové kyseliny případně aldehydu jako substrátu a dalšího aldehydu jako kosubstrátu pomocí PDC nebo mutantu PDC.

Jako příklad lze uvést následující použití:

Syntéza PAC vycházející z pyruvátu a benzaldehvdu

Syntézní vsázka obsahovala 40 mM pyruvátu, 70 mM benzaldehydu a 10 U/ml PDC-W392A v 50 mM Mes/KOH-pufru, 50 mM, pH 6,5, 20 mM MgSO₄, 1,5 mM ThDP. Reakce se prováděla hodinu při 37°C a vzniklá PAC (6,2 mM) se detekovala pomocí vysoceúčinné kapalinové chromatografie (HPLC).

Syntéza PAC vycházející z acetaldehydu a benzaldehvdu

Syntézní vsázka PAC obsahovala místo pyruvátu 40 mM acetaldehydu. Jinak se postupovalo jak je popsáno výše. Po jedné hodině vzniklo 3,7 mM PAC.

Syntéza PAC pomocí PDC-W392A ve spojeném 3-enzvmatickém systému

Enzymatická přeměna se prováděla podle obrázku 3. Použití alkoholdehydrogenázy (ADH) z droždí (E.C. 1.1.1.1) umožňuje kontinuální odstraňování acetaldehydu a tím podmíněnou inaktivaci PDC-W392A.

·· ····

Mravenčandehydrogenáza (FDH) z Candida boidinii (E.C. 1.2.1.2) slouží pro regeneraci NADH. Enzymatická syntéza PAC se prováděla v 20 ml Mes/KOHpufru, 50 mM, pH 6,5, 20 mM MgSO4, 1,5 mM ThDP.

Vsázka obsahovala:

1.3 U/ml PDC-W392A, 2 U/ml ADH, 2.5 U/ml FDH. Počáteční koncentrace pyruvátu činila 70 mM. Dále obsahovala vsázka 2 mM NADH a 200 mM mravenčanu. Po 120 minutách bylo znovu přidáno 0,7 ml 2,1 M roztoku pyruvátu a 0,125 ml 8 M roztoku mravenčanu sodného.

V důsledku enzymatické přeměny zvýšené pH bylo titrováno kyselinou mravenčí. Po 7 hodinách vzniklo 6.8 mM PAC.

Zpracování a analytika enzymatických reakčních produktů:

Oddělení reakčních produktů se provádělo pomocí preparativní vysoce účinné kapalinové chromatografie v obrácené fázy (reversed-phase HPLC). Jako stacionární fáze byl použit sloupec C8-MOS Hypersil, 250 x 4,6 mm. Eluce se prováděla za isokratických podmínek kyselinou octovou/acetonitrilem 0,5 %/12,5 % (obj/obj) s rychlostí toku 1,5 ml/min. Doby eluce za těchto podmínek činily: PAC 4,77 min a 2-hydroxypropiofenon 5,41 min. Přiřazení vzniklých enantiomerů jako R-(-)-PAC se provádělo polarimetricky podle normy z výroby PAC (Knoll AG).

Enantiomerový poměr PAC byl určen pomocí chirální plynové chromatografie jako » 98 %.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob získání pro tvorbu (R)-(-)-fenylacetylkarbinolu (I) v > 95 % enantiomerní čistotě s poměrem produktu (I) k 2-hydroxypropiofenonu > 95 % uschopnéné pyruvátdekarboxylázy (PDC) se specifickou účinností pokud se týká tvorby fenylacetylkarbinolu >1 U/mg, isolací z produčního organismu, vyznačující se tím, že se použije produkční organismus pro PDC kódující gen ze Zymomonas mobilis, v jehož sekvenci DNA je pro tryptofanový zbytek kódující kodon TGG v poloze 1174-1176 nahrazen kodonem, který kóduje pro aminokyselinový zbytek s omezeným vyplněním prostoru.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že kodon TGG je nahrazen kodonem, který kóduje pro prostý zbytek aminokyseliny.
3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že kodon TGG je nahrazen kodonem, který kóduje pro alifatický zbytek aminokyseliny.
4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že kodon TGG je nahrazen kodonem, který kóduje pro alaninový zbytek.
5. Pyruvátdekarboxyláza uschopnéná pro přeměnu pyruvátu za přítomnosti benzaldehydu na (R) - (-) - fenylacetylkarbinol v > 95 % enantiomerní čistotě s poměrem produktu (I) k 2-hydroxypropiofenonu > 95 % se specifickou aktivitou pokud se týká tvorby produktu >1 U/mg, získatelná podle některého z nároků 1 až 3, jejíž tryptofanový zbytek v poloze 392 je nahrazen zbytkem aminokyseliny o menší velikosti.
6. Pyruvátdekarboxyláza podle nároku 5, vyznačující se tím, že tryptofanový zbytek v poloze 392 je nahrazen alaninovým zbytkem.
7. Způsob enzymatického získávání acyloinů enzymatickou acyloinovou kondenzací α-ketokarbonových kyselin a/nebo aldehydů za přítomnosti PDC, vyznačující se tím, že se jako PDC použije enzym podle nároku 5 nebo 6.
8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že se provede acyloinová kondenzace vycházeje z α-ketokarbonové kyseliny za současné redukce nadbytečného aldehydu vytvořeného dekarboxylací pomocí alkoholdehydrogenázy a NADH.
9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že NAD vytvořená při přeměně in sítu se prostřednictvím mravenčandehydrogenázy regeneruje na NADH.
10. Sekvence DNA genu pro tiamindifosfát závislý enzym s limitováním přístupu v substrátovém kanálu vedoucím k aktivnímu centru, vyznačující se tím, že na místo kódujícího kodonu limitujícího přístup je zaveden kodon, který kóduje pro zbytek aminokyseliny odstraňující limitování přístupu.
11. Sekvence DNA podle nároku 10, vyznačující se DNA sekvencí genu PDC ze Zymomonas mobilis s jedním kodonem kódujícím pro zbytek aminokyseliny menší velikosti v poloze 1174-1176.
12. Sekvence DNA podle nároku 11, vyznačující se tím, že má v poloze 1174-1176 kodon kódující pro zbytek alifatické aminokyseliny.
13. Sekvence DNA podle nároku 12, vyznačující se tím, že má v poloze 1174-1176 kodon kódující pro alaninový zbytek.